Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохемилюминесценция лейкоцитов крови сельскохозяйственных животных в оценке их функционального состояния

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биохемилюминесценция лейкоцитов крови сельскохозяйственных животных в оценке их функционального состояния"

ЖНИСТЕРСГВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСЗСР

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫХ ВДЙЦИНСКИЛ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БАРАКОВ Александр Валерьевич

БИСХЕтОМйНЕСЦЕИЦИЯ ЛЕЙКОЦИТОЗ КРСШ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ животных В ОЦЕНКЕ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО состояния

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена на кафедре биофизики Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К.И. Скрябина

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.И. Журавлев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук O.A. Азизова кандидат биологических наук С.Л. Зубкова

Ведущее учережцение - »¡псковский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "...." ......... 1992 г.

в "...." часов на заседании специализированного совета К.084.14,04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: II7869, г. ¡Лосква, ул. Островитянова, I

С диссертацией мотоо ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан "____" ......... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

доцент й.В. Буромский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из проявлений функциональной активности иммунокомпетентных клеток является их активация, представляющая собой линейную последовательность определенных этапов, начиная от контакта клетки со стимулирующим агентом и, заканчивал комплексом Оиохишческих процессов, получивших в литературе название " дыхательного взрыва " С Howes K.M., Steele R.H.» 197t; Babior» 1978; Johnston, 1978; Mauel , 1983 ; Ерин A.H. и др., 1983; Ля-шенко В.А. и др., 1988 ).

Как известно, одним из результатов феномена " дыхательного взрыва " является хемилюминесценция клеток, возникающая при их стимуляции ИЛИ воздействии на них ( Allen , 1972; De Chatelet , 1982; Aaderseo , 1973 ; Saieshig , 1987 ).

Именно с этим связано широкое применение хемилюминесцентного метода в медико - биологических исследованиях для изучения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, и, в частности, мо-нонуклеаров ( Земсков В.М. и др., 1983; Коркина Л.Г., Величковский Б.Т., 1989; Маянский А.Н. и др., 1989; Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989 ).

Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению явления хемилюминесценции при активации мононуклеаров крови многие аспекты данного явления окончательно не выяснены.

Во многом это определяется тем, что в большинстве предыдущих исследований функциональная активность стимулированных мононуклеаров рассматривалась как отдельно взятый критерий, оторванный от патологического процесса С Астафьев Д.Г. и др., 1989; Семенкова Г.Н. и .др., 1990 ). Работ, рассматривающих функциональную активное^ мононуклеаров крови вместе с изменениями происходящими в иммунной системе, например, при приобретенных иммунодефицитах, что могло бы

служить адекватной моделью цля изучения цитофизических закономерностей активации мононуклеаров, в доступной нам литературе обнаружено недостаточно ( Candido et al., 1983 ; Коркина Л.Г. и др., 1985 ).

В связи с этим актуальными представляются исследования функциональной активности стимулированных мононуклеаров периферической крови проведенные как на модельной системе, гак и в реальных условиях, отражающих изменения функционального состояния клеток, в частности, при поражении животных онковирусной инфекцией.

Цель работы.Исследование кинетики и механизма генерации активных форм кислорода мононуклеараш крови животных и выявление основных факторов определяющих взаимосвязь хемилюминесценции клеток с их функциональной активностью в процессе стимуляции.

Исходя из этого определены следующие задачи исследования:

1. Оценить чувствительность и рабочие характеристики кафедрального люминометра; провести сравнение с зарубежными и отечественными аналогами.

2. Определить интенсивность спонтанной, собственной и активированной хемилюминесценции лимфоцитов и моноцитов крови сельскохозяйстве ных и лабораторных животных. Провести анализ влияния на интенсив ность хемилюминесценции процедуры подготовки клеточных суспензий

к исследованию, возрастных и индивидуальных особенностей животных.

3. Изучить особенности механизма генерации активных форм кислорода ыононуклеарами крови сельскохозяйственных животных.

4. Исследовать характер взаимосвязи хемилюминесценции клеток с их функциональной активностью.

Научная новизна. Благодаря использованию экспериментальной установки зафиксирована спонтанная хемилюминесценция мононуклеаров кро-

ви сельскохозяйственных животных.Показана связь между сверхслабым свечением сыворотки крови и активированной ХД мононуклеаров, стимулированных £ГА ( фитогемагглютинином ).Проведено сравнение хемилюминесценции клеток трех видов животных - коров, крыс и баранов. По лучены данные о генерации активных форм кислорода моно-нуклеарами, выделенными из крови здоровых и инфицированных онковирусом коров.Уточнены механизмы собственной и активированной ХЛ моноцитов и лимфоцитов.Интенсивность свечения клеток как спонтанного, так и стимулированного определена количественно и выражена в абсолютных единицах ( квант/(с

Теоретическая и практическая значимость работы. Измерение спонтанного свечения клеток дает нам возможность пользоваться следующей классификацией рассмотренных типов хешлюминесценций:

1. Спонтанная ХЛ - свечение клеток при отсутствии в системе индукторов ( стимуляторов ) дыхательного взрыва типа зимозан, латекс, лектины и т.д., и активаторов типа люминол, люцигенин.

2. Собственная ХЛ - свечение клеток при введении в систему индукторов дыхательного взрыва.

3. Активированная ХЛ - свечение клеток при введении в систему активаторов типа лиминол и др., без каких-либо дальнейших воздействий на систему.

4. Активированная стимулированная ХЛ - свечение клеток при введении в систему как индуктора, так и активатора.

Кроме того, полученные данные позволяют расширить представление о механизме хемялюминесценции мононуклеаров крови животных. Наиболее вероятно, что хемилюминесценция мононуклеаров отражает функциональную активность клеток, в частности, активность каскада мембранных ферментов, связанных с рецепторным аппаратом клеток. Обобщение результатов работы цает возможность более полно

уяснить роль кислородных радикалов в системе межклеточной кооперации.

Летоцы диссертационной работы решением Ученого совета биологического факультета ¿ВА включены в методические указания для студентов биологического факультета "Методы регистрации свобод-норадикального окисления липидов в сыворотке, плазме и мембранах клеток кропи", раздел II, ГЛ. 2.2., л!ВА, 1989; внедрены в практику учебного процесса на кафедре биофизики и физики..Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций по теме: " Квантовая биология " на кафедре биофизики и физики ¡©А.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на заседании Московского общества испытателей природы ( 1988 г., г. Москва ), на Всесоюзной научной конференции " Актуальные проблемы ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации животноводства " ( 1989 г., г. ¿¿осква ), на Всесоюзной школе - семинаре " Био - гермо - хемилюминесценция " ( 1990 г., г. Суздаль ).

Структура и обгем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, включает 18 рисунков, 9 таблиц и список литературы из 141 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовались белые крысы порода Вистар, а также коровы черно-пестрой породы в возрасте 4-7 дет и бараны романовской породы в возрасте 2-3 лег.

S соответствии с целью исследования коровы были разбиты на две ■руппы:

1. Здоровые по клиническим признакам, с отрицательным результатом серологического анализа

2. Инфицированные вирусом лейкоза, что оценивалось на основами данных клинических и серологических исследований.

Материалом исследования служили мононуклеары, выделенные из лериферической крови короз, крыс и баранов на градиенте плотности, а также сыворотка и плазма крови.

Исследования проводили на экспериментальном хемилюмино метре, собранном из стандартных блоков.

Мононуклеары из крови животных выделяли по модифицированному методу Во'ут ( 1968 ), реакцию иммунодиффузии проводили по методике Бурбы Л.Г. ( 1933 ); подготовку суспензии лимфоциты/моноциты и регистрацию активированной ХЛ проводили по методике Чуча-лина А.Г., Коркиной Л.Г. и др. ( 1987 ); измерение спонтанного сверхслабого свечения сыворотки крови и спонтанной ХЛ клеточной взвеси осуществляли по методике Тарусова Б.Н. и др. ( 196I ), Макарова С.Н. С 1979 ); регистрацию инициированной перекисью водорода хемилюминесценции по методу Попова A.A., Тарусова Б.Н. ( 1965 ), Серкиза Я.И. и др. ( 1984 ).

применением стандартного пакета статистических программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ Биохемилюминесценция мононуклеяров крови сельскохозяйственных животных и ее механизм В процессе исследований мы рассматривали несколько типов хемилю-

Полученные данные обрабатывались на компьютере IBM

- б -

минесценций изучаемой суспензии клеток:

1. Спонтанную ХЛ - свечение клеток, отражающее исходное состояние метаболических процессов в клетке, в частности, ПОЛ мембран.

2. Активированную ХЛ - свечение клеток при введении в систему активатора, но в отсутствие каких-либо индукторов, что давало возможность учитывать влияние люминола на окислительный метаболизм клеток.

3. , Собственного ХЛ - свечение клеток при введении в систему индукторов дыхательного взрыва, но в отсутствие активаторов, что позволяло оценить взаимодействие индуктора с рецепторным аппаратом клеток и активность мембранных ферментов.

4. Активированную стимулированную ХЛ - свечение клеток при введении в систему как активатора, так и индуктора, таким образом, оценивали не только вне - , но и внутриклеточные процессы ХЛ.

Анализ уровня спонтанного свечения суспензии кононуклеаров здоровых коров показал, что среднее значение интенсивности ХЛ составляет < 1,04 - 0,09 ) х Ю3 квант/(с 41П, при диапазоне колебаний ( 0,5 + 2 ) х Ю3 квант/( с Распределение относительных частот по уровням свечения характеризуется наличием основного максимума, совпадающего в пределах доверительного интервала со значением математического ожидания уровня свечения мононуклеарной суспензии крови коров данной группы.

Среднее значение активированной лтаминолом ХЛ мононуклеаров здоровых коров составило ( 5,46 - 0,74 ) х 10^ квант/(с 4^), при диапазоне колебаний 10*^+ 10^ квантДс 4'(Г) .Увеличение интенсивности ХЛ связано с процессами внутриклеточного окисления люминола.Интересно, что если спонтанная ХЛ практически не отражает ви-

цовые особенности клеток, то введение в систему люминола приводит к увеличению интенсивности активированной ХЛ в ряду: бараны - крысы - коровы ( табл. 2 ).

Таблица 2

Видовые особенности хемилюминесценции мононуклеаров животных, х 10^ квант/(с

Виды животных

корова

крыса

баран

Число исследований

18 20 3

Спонтанная ХЛ

0,104-0,009 0,106-0,018 0,01

Активированная люминолом ХЛ

5,46 ± 0,74 1,21 ± 0,19 0,93 ± 0,01

изменения показателей достоверны ( р 0,0а ) Также, цля группы здоровых коров установлено среднее значение уровня собственной ХЛ - ( 3,22 - 0,71 ) х 10^ квант/(с 4ТГ), при диапазоне колебаний - ( 1,08 ~ 6,07 ) х 10^ квант/(с 4*f). Анализ распределения уровней относительных частот свечения в этой группе тавотных характеризуется пологим плечом в области ( 2,5-5-4,5 ) х 10^ кванг/(с Ali) ( рис. I ).Интенсивность свечения возрастала в ряду: бараны - крысы - коровы.Интерес вызывает то, что интенсивность собственного свечения моноцитарно-лимфоцитарной взвеси кро- ' ви коров ниже, чем интенсивность активированной люминолом ХЛ этой же взвеси.Вероятно, это вызвано тем, что при изучении собственной ХЛ суспензии клеток з качестве индуктора использовали фитогемагглю-тинин ( ФГА ), являющийся мембраноактивным агентом, в то время как люминол мог проникать в фагосомы моноцитов и участвовать в

°i«=rUi-U UU'ül _

5 Ii й Л fe ü » - ,, я ,, .г

yfKiv»* с£»чгши tOOOiA/c a э a ,

' yjx*»n. 10000

а б

Рис. I. Распределение относительных частот собственного ( а ) и активированного ( б ) свечения мононуклеаров крови

коров

в окислительных процессах внутри клеток.

Интенсивность активированной стимулированной ХЛ для группы здоровых коров при введении в систему зимозана составляла - ( 2,05 - 0,18 ) х 10^ квант/(с 4"i).Анализ распрецеления уровней относительных частот свечения характеризуется максимумом в области ( I, * 2,6 ) х 10® квант/(с ( рис. I ).Кроме того, интенсивность активированной стимулированной ХЛ при введении в клеточную систему различных стимуляторов отражает видовые особенности клеток и возрастает в ряду: бараны - коровы - крысы ( табл. 3 )<

Хемилюминесценция, вызванная зимозаном практически на порядок больше, чем ХЛ, вызванная ФГА ( р 0,05 ), что связано с фагоцитированием зимозана моноцитами и генерированием активных форм кисло}.» да внутри клеток.Интерес вызывает изменение видового ряда возрастания интенсивности ХЛ, что, возможно, связано с содержанием примеси гранулоцитов в выделенной фракции ляи$оциru/моноциты из

I

нрлрн К.РЫС, ;

Таблица 3

Видовые особенности активированной ХЛ мононуклеаров - крови при введении различных индукторов, х 10® квант/(с 4ii).

Виды животных Количество Зимозан ФГА

исследований ( 10 мкг/мл ) (3,5 миг/мл )

корова 18 2,05 - 0,18 0,Г7±0,03

крыса 20 6,71 ± 0,32 0,55 - 0,0I

баран 8 1,69 ± 0,09

р<0,05

Для изучения особенностей механизма генерации активных форм кислорода мононуклсарной взвесью исследовали влияние ингибиторов, блокирующих различные АФК и ферменты: аскорбат ингибирует супероксид - анион ( 0S ) ( Cheson , Т975; Kraut , 1980 ; Владимиров iO.A., Шерстнев ¡vLilr, 1989 ), маннит - гидроксильный радикал ( WO- ) ( Bors , 1986; Владимиров Ю.А., I98V ), гидрохинон и гис-тидин - синглетный кислород ( 0г ) ( corey et al., I98r>; Владимиров ¡O.A., Шерстнев Л.П., 1989 ), таурин - гипохлорит ( ) ( Welch , 1987; Gyllenhomraar , 1987; Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989 ), азид натрия - гемсодержащие ферменты, включая миело-пероксидазу и каталазу ( Бахов Н.И. и др., 1987; Giitsburg , 1987 ). Как видно из рис. 2., при добавлении к суспензии клеток вместе с зимозаном 10 мА1 аскорбата, который предположительно выполняет роль перехватчика Ог , интенсивность собственной ХЛ не только не уменьшилась по сравнению с контролем, но и увели-

чилась на 30 + 35 %. В то время как ингибирование активированной ХЛ клеток, стимулированных эимозаном было почти 100

Получение таких результатов, на наш взгляд, связано с тем, что аскорбат предотвращает связывание активных форм кислорода с люминолом и, таким образом, предотвращает его превращение в аминофталат, который, как известно, нестабилен и спонтанно ре-лаксируег в исходное состояние, что сопровождается ХЛ. Таким образом, аскорбат является специфическим перехватчиком АФК, выполняющим свои антирадикальные функции только в присутствии лю-минола.

Тем неменее, даже учитывая полученные цанные, приходится констатировать, что при стимуляции мононуклеаров эимозаном образуются практически все активные формы кислорода: 0z ) НО' //г0а ) 0} , которые в той или иной степени принимают участие в генерации люминолзависимой хемялюминесценции.

В наших исследованиях маннит, являющийся перехватчиком гиц-роксильного радикала ( НО- введенный в систему вместе с эимозаном, в концентрации I мМ, крайне незначительно ингибиро-вал собственную хемилюминесценцию мононуклеарноЛ взвеси, выделенной из периферической крови животных. При исследовании акгивиро- ' ванной хемилтоминесценции лимфоцитов и моноцитов кропи, стимулированных эимозаном в присутствии маннита ( I мМ ), интенсивность хемилюыинесцентного ответа снижалась на 70 + 7а %.

Исходя из полученных результатов необходимо подчеркнуть, что по всей видимости, гидроксильный радикал ( НО' ) Н9 иг_

я

ъ

3

ж «

2 а «з з

юо

70

50

ЗО

Ю О

ж ъ»

ТАУРИН

ЮнН

нАнниг |нН

Рис.2. Ьлиянив ид имтгнсывнссть

• ХА, СТиМУАиРОвАННОи зим о-ЗАНОН АСиКОЦИТАРНОЙ

взвеси различны* ингибиторов

¡1

1

I 1

I

1

ш

гиспилим ЮмМ

лзча натрия

юг.

□

СОЫЯЬШАЯ )

|Д1ПибЦРОВАН-НАЯ ХЛ. ,

АСКОР6АТ

10 мн

рает существенной роли в собственной ХЛ лимфоцитарно - моноцитар-> ной суспензии клеток,выделенной из крови коров.

Гидрохинон,являющийся тушителем синглетного кислорода ( 0г >, в концентрации I мкМ ингибировал собственную ХЛ клеточной суспензии на 90 95 % и увеличивал интенсивность активированной ХЛ стимулированных зимозаном клеток на 40 -г 45 %.Это свидетельствует о том, что ги дрохинон скорее веего перехватывает вг-^-пр-яше с'гулы промежуточных продуктов ПОЛ мембран, которые вносят значительный вклад в собственную ХЛ. Гистидин, предположительно являющийся перехватчиком 0г в концентрации 10 м/1 в наших экспериментах снижал на 80 ■} 85 % интенсивность собственной ХЛ, и на 50 ■* 55 % интенсивность активированной стимулированной ХЛ лимфоцитарно-моно-цитарноц взеси.В качестве индуктора дыхательного взрыва клеток в обоих случаях использовали зимозан.Полученные результаты позволяют говорить о существенной роли синглетного кислорода в собственной ХЛ.

В наших опытах ингибитор миелопероксицазы ( лШО ) азид натрия в концентрации I м/Л тушил собственную ХЛ мононуклеарной суспензии клеток крови коров и крыс практически полностью, и снижгл интенси' ность активированной ХЛ стимулированных зимозаном клеток на 50 * * 60 Добавление таурина, соединения инактивирующего

его- в концентрации 10 мМ снижало интенсивность собственной ХЛ на 40 4 45 % и активированной ХЛ стимулированных зимозаном ( 10 мг/мл ) клеток на 65 4 75 %.

Таким образом, реакции с участием МП0 ответственны за значител: ную часть суммарной интенсивности собственной ХЛ лимфоцитарно -моноцитарной суспензии клеток выделенной из крови коров, и механи. активированной стимулированной ХЛ клеток тоже во многом определяется реакциями катализируемыми миелопероксицазой.

йполедоп.чяио хемилюминдсценпик мононуклеапных клеток здоровых и инфипировачных зирусом лейкоза тивотных

9 постановке эксперимента ш исходили из того,что функциональная активность клеток находится в прямой зависимости от состояния организма или иммунной системы.Поя тому в качестве опытных были выбраны коровы, сыворотка крови которых давала выраженай положительный результат реакциии иммунодиффузии.Такие животные считаются инфицированными вирусом лейкоза крупного рогатого скота, и отличаются от нормальных резким снижением иммунного статуса организма.

Для этой группы ксроп зарегистрировано среднее значение спонтанной ХЛ - ( 0,011 ± 0,0012 ) х 10 квант/Сс активированной -( 0,26 ± 0,05 ) х 10 квант/Сс 41Г); собственной - £ О, II - 0,02 ) х 10 квант/Сс 4<Г*); активированной ХЛ стимулированных клеток -( 0,19 ^ 0,06 ) х 10 квант/Сс 4"10.Анализируя соотношение интенсив ностей ХЛ в экспериментальных группах животных отмечаем, что спонтанная ХЛ суспензии клеток здоровых и больных животных почти одинаковы; значения активированной различаются в 2 раза; собственной в 3 и активированной ХЛ стимулированных клеток более чем в 10 раз С табл. 4 ).

Таблица 4

Интенсивность хемилюминесценции ыононунл|аров крови здоровых и инфицированных животных, х 10 квант/Сс 4<5Г)

Животные Число Спонтанная Собственная Актив. Активир.

• исследований ХЛ ХЛ ХЛ стимулир.

и

здоровые 18 0,01*0,009 0,32*0,07 0,55-0,07 1,69*0,25

инфицированные

вирусом лейкоза 18 0,01*0,001 0,11*0,02 0,26*0,05 0,19*0,06

р4.0,05 - различия между группами достоверны

Вместе с тем, для суспензия клеток данной группы животных харшгте; но увеличение интенсивности ХЛ. в ряду: спонтанная -г собственная -г-~ активированная стимулированная т активированная.

Таким образом, снижение генерации АФК моноцитами и лимфоцитами а следовательно и их функциональной активности - признак, характеризующий состояние иммунной системы инфицированных вирусом лейкоза животных.

Взаимосвязь хемилюиинесценции клеток и спонтанного сверхслабого свечения сыворотки крови здоровых и инфицированных вирусом лейкоза животных

Для группы инфицированных коров установлено среднее значение

а

интенсивности ХЛ сыворотки крови - ( 4,37 - 0,71 ) х 10 кванг/(С 410.Свечение было длительным, непрерывным и характеризовалось од ним максимумом.С увеличением температуры сыворотки крови интенсив ность ХЛ возрастала и при 54 С достигала - ( 10,8 £ 1,76 ) х К)3 квант/(с 4

Соотношение интенеивностей сверхслабого свечения сыворотки кро ви здоровых и инфицированных вирусом лейкоза животных показывает, что ХЛ сыворотки крови контрольных коров выше, чем инфицированных ( табл. 5 ).

Таблица 5

Зависимость спонтанной хемилюминесцснции сыворотки крови животных от температуры, х 10 квант/Сс 4 10

Животные Количество 37°С 43°С 54°С исследований

здоровые 18 6,4 ±1,44 М,0±2,14 17,1±2 инфицированные

вирусом лейкоза 18 4,37±0,71 5,57+1,63 Ю,8±1

р^.0,01

Во всех случаях наличие лейкозного процесса сопровождалось однотипным изменением интенсивности ХЛ - ее снижением.Очевидно, более низкий, уровень свечения сыворотки крови лейкозных коров обусловлен снижением интенсивности ПОЛ, что аналогично ранее полученным результатам при развитии злокачественных опухолей у человека и лабораторных животных ( Куравлев,Тарусов.Есакова,1963; Иванов, Тарусов,1970; Бурлакова и др.,1975 ).Снижение скорости ПОЛ, по всей видимости, означает уменьшение концентрации вторичных продуктов пероксицации липицов сыворотки крови, в частности,гидроперекисей, предположительно играющих роль предстимуляторов мононуклеаров ( Клебанов, 1988 ).

Таким образом, снижение интенсивности Х-Д сыворотки крови должно на наш взгляд, сопровождаться падением интенсивности ХЛ суспензии лимфоцита-моноцигьг.Это хорошо подтверждает опыт проведенный на 20 контрольных и инфицированных животных.В каждой группе рассматривалась зависимость интенсивности ХЛ суспензии лимфоцитов и моноцитов от уровня свечения сыворотки крови.Оказалось, что снижение уровня ХЛ мононуклеаров сопровождается падением интенсивности сверхслабого свечения сыворотки крови.Для контрольных животных коэффициент корреляции составил £ = 0,7,' для инфицировнных 0,92.Полученные коэффициенты демонстрируют? достаточно большие внутри^рупповые взаимосвязи интенсивности X"1 клеток и уровня свечения сыворотки крови коров.Чтобы получить представление об общей картине зависимости данные двух изучаемых групп свели воедино ( рис.3 ).

' Построенный график четко отражает взаимосвязь между свечением взвеси клеток и сыворотки крови: чем меньше уровень свечения сыворотки крови животного, тем меньше интенсивность ХЛ мононуклеаров ( Ъ » 0,8 ).Проявилась и качественная сторона взаимной связи: более низкие показатели уровня свечения сыворотки крови и суспен-

интенсивность спонтанного свечения сыворотки крови, х 10 (квант/(с4чП!

Рис.3.. Зависимость интенсивности активированной хемилюми-несценции стимулированных ФГА ( 3,5 мг/мл ) моно-нуклеаров от уровня спонтанного свечения сыворотки крови ( * - здоровые; • - лейкозчые животные ).

зии клеток крови приходятся на долю коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Конечно, было бы неправомерно утверждать, что практически всегда уменьшение уровня ХЛ мононуклеаров сопровождается снижением интенсивности свечения сыворотки крови, тем неменее высокая степень связи между этими показателями в группе здоровых животных позволяет предположить универсальность этой зависимости.

Исследование инициированной НЕ0г хемилюминесцонцшт плазмы крови животных

Проведенные исследования показали, что кинетические кривые, от-

ражаащие параметры ХЛ плазмы крови, как у больных, так и у здоровых коров качественно не различаются.Однако, имеются значительные количественные различия.Так, амплитуда начальной вспышки ( )

у здоровых керов больше, чем у инфицированных, а свегосумма реакции за 5 мин. ) у опытных животных почти в 2 раза ниже, чем в контроле.Амплитуда конечной вспышки ( -Га ) в обеих группах животных практически совпадала ( табл. 6 ).

Таблица 6

Параметры инициированной НД хемилюминесценции плазмы крови коров, х 10 ( квантДс 4^))

Животные Количество Амплитуда Амплитуда Амплитуда

исследований начальной вспышки конечной светосум/ы ( Гх ) вспышки за 5 мин.

(Тг ) (£]>)

здоровые 18 10,77*0,68 0,24*0,18 2,57*0,16

тфицирп пан-1ые вирусом

чейкоза 18 6'0б-±0,63 0,24*0,06 1,76±0,25

Так как ил разлагается в реакции Фентона с образованием гид-роксильного радикала ( Н0г ), который взаимодействует с липицаки и запускает процессы ПОЛ, то величина ХЛ плазмы крови прямо пропорциональна степени резистентности липидов к окислению и обратно про-юрциональна активности антиоксидантов в исследуемых пробах.

Таким образом, липи.ды плазмы крови инфицированных вирусом лсП-<оза животных менее подвержены процессу перекисного окисления.

Все это подчеркивает возможность того, что интенсивность ХЛ моно-<уклеаров, а значит и генерация ими активных форм кислорода нахо-ЩГСЯ В ТОСНОЙ сплпи с интпнсишюсть» процосспп ПОЛ протокчхщлк » сыворотке и плазме крови.

ВЫВОДЕ

1. Показано наличие спонтанной, собственной и активированной хе милюминесценции мононуклеаров, выделенных из крови крупного рога того скота.

2. Показано, чго средний уровень: I) спонтанной хемилюминесцет

мононуклеаров,выделенных на градиенте плотности ^иколл-вегчпгр^!'

6

из крови здоровых коров ( с = 10 /мл ) при рН = '/,4 и температур

О э

3? С составляет - ( 1,04 ± 0Р98 ) х 1СГ кванг/(с ; 2) собственной хемилюминесценции мононуклеаров при использовании в качестве инпуктора ФГА ( 3,5 мг/мл ) - ( 0,32 £ 0,07 ) х 105 кван'1 (с 43) активированной хемилюминесценции мононуклеаров, ста мулированных ФГА С 3,5 мг/мл ), концентрация люминола 0,6 мМ, -( 1,68 ± 0,25 ) х Ю5 к вант/(с ).

3. Установлено трехкратное уменьшение собственной и десятикоать активированной хемилюминесценции стимулированной ФГА ( 3,5 мг/мл взвеси мононуклеаров, выделенной из крови коров ( с = 10 /мл ), инфицированных вирусом лейкоза, по сравнению с уровнем свечения мононуклеаров контрольных животных.

4. Показано снижение интенсивности спонтанной хемилюминесценции сыворотки крови ( V = 2 мл;^ = 37 С ) у инфицированных вирусом лейкоза коров.

5. Обнаружено, что снижение интенсивности активированной хемилга минесценции стимулированных £>ГА ( 3,5 мг/мл ) мононуклеаров, пол ченных из крови лейкозных животных, как правило, сопровождается падением уровня сверхслабого свечения сыворотки крови этих живот ных ( V = 2 мл; | = 37°С ).

6. Показано, что собственная хемилюминесценция стимулированных

зякозаном ( 10 мг/мл ) мононуклеаров периферической крови животных в большой степени обусловлена ыиелпперпхеицазнпй реакцией. /'. Отмечено, что пру. активированной хемилютнссценции стимулированных зимозаном ( Ю мг/мл ) мононуклеаров периферической крови животных образуются практически все виды активных форм кислорода. 8. В эксперимента:: обнаружены различия в интенсивности индуциро-_ '„¡г--:5 иерг>кс;гум1 вг ;орода хемилюминесценции плазмы крови здоровых и инфицированных вирусом лейкоза коров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Журавлев А.И., Мяльдзин А.Р., Баранов A.B. Методы регистрации свобоцнорацикального окисления липицов в сыворотке, плазме и мембранах клеток крови. // Методические указания, i., MBA. - 1989. -с. 9 - 12.

2.Макаров С.Н., Баранов A.B. Хемилюминесцентные критерии фагоцитирующих и иммунологически активных клеток крови. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции " Актуальные проблемы ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации животноводства". Ж., MBA. - 1990.

- с. 49 - ¿0.

3. Баранов A.B. Биохемилюминесценция лимфоцитов коров при стимуляции опсонизированным зшозалоы. // Проблемы ветеринарной биологии. Сб. науч. тр., MBA. М., 1990. - с. 52 - 53.

4. Баранов A.B. Соотношение интенсивносгей спонтанной и индуцированной люминолзависимой биохемилюминесценции лейкоцитов. // Тезисы докладов Всесоюзной школы - семинара " Био - термо - хемилюминес-ценция". М.р ПИК ВИНИТИ. - 1990. - с. 69.

Зак.^у Тир. ß/f ЦНИИТЭИтяжмаш