Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Уровни структурной организации полинуклеотидных индукторов интерферона

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Уровни структурной организации полинуклеотидных индукторов интерферона"

г

На правах рукописи

ТИМКОВСКИЙ Андрей Леонидович

УРОВНИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫХ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

/

Санкт-Петербург 1995

«

Работа выполнена в лаборатории биополимеров Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН.

Научный консультант: действительный член РАЕН, член-корр.

РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ершов Ф.И.

Официальные ойпоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Френкель С. Я.,

доктор биологических наук, профессор Завильгельский Г.Б.,

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Гайцхоки B.C.

Ведущая организация: физический факультет Санкт-Петербургского

государственного университета .

Защита диссертации состоится Ж X* и час.

на заседании диссертационного Совета Д 063.38.23 по адресу: Санкт-Петербург, Политехническая ул., д. 29, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технического университета.

Автореферат разослан X/ 1991 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

0.Л.Власова

- 3 -

авда ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Комплексы комплементарных синтетических полирибонуклеотидов представляют собой специфический тип нуклеиновых кислот, структура которых до сих пор систематически не описана. Тем не менее,эти комплексы по многим причинам являются объектами повышенного интереса со стороны исследователей различной специализации. Во-первых, молекулярная биология и в особенности биофизика рассматривают их как модельные аналоги природных нуклеиновых кислот к пытаются с их помощью установить молекулярные механизмы хранения и "реализации генетической информации. Во-вторых, полирибонуклеотид-ные комплексы являются индукторами интерферона (ИФН), и изучение их структурных особенностей в этом качестве необходимо д- л расшифровки молекулярных механизмов их взаимодействия с чувствительными клетками и выработки этого защитного регуляторного белка. Наконец, в-третьих, эти комплексы - индукторы ИФН являются перспективными лекарственными противовирусными препаратами. Имеются данные, позволяющие рассчитывать на эффективное подавление ими размножения вируса иммунодефицита человека. Выяснение их структуры позволяет получать максимально активные соединения и решать технологические проблемы их промышленного производства Таким образом, проблема структурной организации полирибонуклеотидных комплексов - индукторов ИФН является актуальной для целого ряда направлений современной биологии, биофизики и медицины.

Цель и задачи исследования.

Основная цель исследования - систематизация структурного описания макромоле (с/л комплексов комплементарных полирибонуклеотидов и выделение ключевых структурных параметров с установлением их вклада в биологическую активность. Кроме того, целью работы было обоснование применения комплексов - индукторов ИФН разного нукле-отидного состава.

Поставленная цель достигнута путем решения конкретных задач: критического анализа накопленного многими исследователями фактического материала, экспериментального исследования зависимости характеристик полинуклеотидных комплексов и их биологической активности от различных структурных параметров, установления иерархии этих параметров и разработки биофизических методов якопрес сного анализа элементов тонкой внутримолекулярной структуры комг,

лексов. Основное внимание при таком рассмотрении уделено принципиальным структурным отличиям этих макромолекулярных образований от природных нуклеиновых кислот - двунитевых РНК и ДНК.

Научная новизна и значимость работы.

В представленной работе впервые предложена концепция структурной организации полинуклеотидных комплексов - индукторов ИФН с выделением' нескольких последовательных уровней структуры с различной значимостью. Для комплексов комплементарных полинуклеоти-дов как специфического типа нуклеиновых кислот впервые сформулировано и обосновано понятие третичной структуры.

Впервые всесторонне изучена структура комплекса полирибогуани-лата с полирибоцитидилагом, установлены специфические особенности этого комплекса в сравнении с комплексами других комплементарных полирибонуклеотидов.

Также впервые установлен ключевой структурный мотив, определяющий степень структурной упорядоченности полирибонуклеотидных комплексов, уровень их биологической активности и макроскопические характеристики их растворов, - наличие локальных внутримолекулярных дефектов структуры.

Впервые для количественного определения внутримолекулярных дефектов полинуклеотидных комплексов применены биофизические методы, использовавшиеся ранее только для анализа макроскопических глобальных различий в структуре нуклеиновых кислот. В результате получен набор чувствительных методов, обеспечивающий экспрессный анализ тонкой структуры полинуклеотидных комплексов.

Практическая значимость работы.

Итоги данной работы, систематизирующей описание структуры полинуклеотидных индукторов ИФН и вводящей оптимальные методы ее исследования, позволяют расширить реальный набор перспективных препаратов и увеличивают возможности целенаправленного выбора индукторов, оптимальных для данного типа клеток, биологического вида и вирусологической ситуации. Всестороннее сравнительное изучение полинуклеотидных индукторов различного состава показало, что комплекс поли(Г)-поли(Ц) обладает целым рядом преимуществ перед другими полинуклеотидными индукторами. Результаты работы явились обоснованием длл наработки и полного доклинического изучения отечественного препарата "Лолигуацил" - стерильной лекарственной Формы комплекса поли(Г)-поли(Ц) и создания технологии его промыш-

ленного производства. Разработан лабораторный метод получения стерильной лекарственной формы полигуацила. В 1988-1990 гг. была начата совместная работа с НПО "Биолар" и ПО "Латвбиофарм" (г.Олайне, Латвия) по промышленному внедрению методов синтеза по-яирибонуклеотидов и получения полигуацила. Результаты работы поз -воляют ожидать, что полигуацил и семейство его структурных модификаций способны преодолеть сложившиеся субъективные ограничения в применении индукторов ИФН и обеспечить гибкое и многостороннее использование индукции эндогенного ИФН для целей здравоохранения.

Порядок выполнения работы.

Работа выполнялась в соответствии с открытым планом научно-исследовательских работ ЛИЯФ АН СССР - ПИ® РАН, а также как часть нескольких научно-исследовательских программ пс комплексна л проблеме "Индукторы интерферона" в соответствии с координационными планами Академии наук и Академии медицинских наук, Государственной программы "Физико-химические основы биологии и биотехнологии" и Комплексной программы "Фундаментальные науки - медицине" (шифр проблемы 04.04.Об).

Автор выражает глубокую признательность наиболее активным соисполнителям работы: сотрудникам лаборатории биополимеров ОМРБ ПИ® РАН М.А.Суржик и Е.А.Глазунову, выполнивши.! совместно с автором большой объем экспериментальной работы; сотрудникам ОМРБ А.Л.Качурину, Н.Г.Никаноровой и А.Г.Свердлову; руководителю и сотрудникам группы синтеза полинуклеотидов ИБС РАН Н.С.Сидоровой, Э.М.Коган, Г.А.Платоновой и Н.Г.Наумович-Дятловсй, предложившим и разработавшим ряд методов химической модификации полирибонуклео-тидов и гомогенного ферментативного синтеза некоторых полириСо-нуклеотидных сополимеров; докторам медицинских наук Ji.М.Вильнеру и О.А.Аксенову, а также всем соавторам исследований.

Апробация работы.

Итоги работы докладывались на XII Менделеевском съезде по общей и прикладной х^мии (Москва, 1981), Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биооргэпической химии в создании новых лекарственных веществ" (Рига, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), 14 Международном симпозиуме Соп?-ч ииптпй и прикладной химии пс химии природных соединений (Познань, 1384), VII Международном Симпозиуме СМЕА "Biophy.~ic3 of Nucióle Acids and Protein?" (Брно, 1935).

По тем« диссертации опубликованы 54 работы, из них основное содержание диссертации отражено в 38 публикациях.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, аналитического раздела, методического раздела, основного раздела, посвященного экспериментальному исследованию полинуклеотидных индукторов интерферона, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация содержит 16!5 страниц основного текста, 23 таблицы, 36 рисунков и список цитируемой литературы из 1В4 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дается общая информация об И® и их индукторах, сформулированы цель и задачи исследования, обоснована актуальность работы, показаны новизна и практическая ценность работы, приведены сведения о ее апробации, о порядке выполнения работы, ее участниках и соавторах.

В аналитическом разделе подробно рассмотрены и оценены общепринятые взгляды на структуру и механизм действия полинуклеотидных индукторов ИФН. Показано, что,несмотря на огромный объем мировой научной литературы по полирибонуклеотидным комплексам - индукторам ИФН. в ней преобладает феноменологический подход и практически отсутствует системное описание и исследование структуры этого класса модельных нуклеиновых кислот. Продемонстрирована недостаточность структурных критериев, признававшихся доселе ключевыми во влиянии на биологическую активность индукторов. На основании этого анализа обоснована стратегия работы, построенная на необходимости последовательного выделения и рассмотрения различных уровней структурной организации полинуклеотидных комплексов -индукторов ИФН.

В разделе "Экспериментальное исследование структурной организации полинуклеотидных индукторов интерферона" излагаются результаты собственных исследований автора.

В первой части этого раздела исследован вклад первичной структуры в биологическую активность индукторов. Для этого было выполнено максимально корректное сопоставление биологической активности базовых полинуклеотидных комплексов различного нуклеотидного ссстава, а также получены комплексы с минорными нуклеотидными модификациями. Все эксперименты выполнены на препаратах, кото-

рые были приготовлены из полирибонуклеотидов, синтезированных в идентичных условиях из очищенных нуклеозид-5'-дифосфатов; все комплексы перед биологическими испытаниями были охарактеризованы не только по спектральным характеристикам, покрывающим полноту комплексообразования, но и по молекулярно-массоным распределениям. Глобальной заменой нуклеотидного состава в данной работе назван переход' от одного базового комплекса к другому при сравнительном изучении различных видов их биологической активности. Эти базовые комплексы - известные поли (А)-поли (У), поли(Г)-поли(Ц) и поли (И) -полиЩ). Кроме этого, производились минорные вставки различных других нуклеотидов либо в пуриновую, либо в пиримидиновую нить комплексов. Основные результаты сопоставления различных видов биологической активности комплексов суммированы в т,\бл. 1, где эта активность выражена в относительных единицах.

Для расшифровки некоторых позиций табл. 1 ряд дачных приведен в более подробном виде (табл. 2 и 3, рис. 1-3). Все комплексы обнаружили параллелизм в ИФН-индуцирующей и противовирусной активности в каждой из экспериментальных систем; поли(А)-поли(У) в опытах на животных был существенно менее активен, чем другие комплексы,- что соответствует литературным данным; поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)-поли(Ц) весьма близки по защитной активности у животных и в культурах фибробдастов эмбрионов кур (ФЭК); в то же время разительные различия в их активности наблюдаются в культурах других клеток - почки кролика, фибробластов мыши и человека; у них также существенно различается динамика накопления индуцированного ИФН у животных.

Главное различие между этими комплексами - в токсичности: комплекс поли(Г)-поли(Ц) не просто значительно менее токсичен - он не облддал присущей комплексу поли(И)-поли(Ц) токсичностью для инфицированных животных, увеличение молекулярного веса полинукле-отидных цепей и противовирусной активности не сопровождалось у него возрастанием токсичности; при всем том он намного более устойчив, чем поли(И)*поли(Ц), к нуклеазам крови обезьян и человека. Сопоставление деструкции комплексов при контакте с сывороткой крови обезьян приведено на рис. 2. Близкие данные получены с сывороткой крови человека (рис. 3), где поли(Г)-поли(Ц) еще более устойчив и не разрушается даже п течение 3 суток.

Наконец, важный блок данных получен при варьировании нуклео-

- е -

1аблица 1. Относительная биологическая активность базовых комплексов и их нуклеотидных модификаций

Иуклеотидный состав комплексов И-Ц Г-Ц А-У (Г,И) -ц

Период максимальной продукции ИФН у мышей, ч 4-6 18-24 4-6 4-24

Максимальный титр ИФН 1 0,8-1 0,2-0,5 1-1,5

Противовирусная активность в организме -мышей 1 1-1,5 0,5-0,7 1,2-2

Противовирусная активность в клетках эмбрионов кур 1 0,5-1 - 2-5

Противовирусная активность в клетках почки кролика 1 0,01 - 1

Острая токсичность 1 0 - 0,1-0.2

Хроническая токсичность 1 0,1-0,2 - 0,3-0,4

Токсичность для инфицированных животных 1 0 - 0,1-0,2

Устойчивость в крови приматов <0,1 1 - 0,7-0,9

Радиозащитная активность • 1 1,1-1,3 - -

Рис. 1. Сравнение противовирусной активности поли(Г)-поли(Ц) (кривая 1) и поли(И)-поли(Ц) (кривая 2) в фибробла-стах куриных эмбрионов в присутствии ДЭАЭ-декстрана.

IIо оси абсцисс - концентрация комплексов (мет/мл); по оси ординат - титр ВВЭЛ ПдБОЕ/мл). ■

тидного состава комплексов - в первую очередь,при синтезе гибридной пуриновой нити с объединением в ней гуанозина и инозина. Полученные комплексы поли(Г.И)-поли(Ц) в динамике индуцированного интерфероногенеза сочетают в себе особенности поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)-поли(Ц) и индуцируют в организме мышей образование значи-

Таблица 2. Противовирусная и интерферон-индуцирующая активность полирибонуклеотидных комплексов в организме мышей

Число ин- Число выжив- Титр интерферона0

Препарат® фицирован- ших мышейь (ед/мл) через:

ных мышей абс. 7. 6 ч 18-20 Ч

Поли(И)-поли(Ц) 32 13 40,6 320 20

Поли(Г)-поли(Ц) 32 19 59,3 20 320

Поли(Г,И)-поли(Ц) 32 31 96,8 320 >640

Плацебо 32 О 0 <20 <20

Таблица 3. Острая токсичность комплексов поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)-поли(Ц). при внутрибрюшинном (в/б) и внутривенном 'в/в) введении белым мышам

Доза, мг/кг Поли(И) ПОЛИ(Ц) Поли(Г) поли(Ц)

в/б , В/Б в/б в/в

число мышей 7. гибели ЧИСЛО мышей 7. "гибели число мышей 7. гибели число мышей 7. гибели

в в в в

группе группе группе группе

6,2 12,5 25,0 50,0 100,0 200,0 4 4 5 25 ЕЮ 100 25 25 25 25 0 40 72 100 4 4 4 0 0 0 20 20 20 20 11 0 0 0 0 0

ЛД50. мг/кг: 40.0 15.8 > 100 > 200

тельных количеств более длительно циркулирующего интерферона. Представленные данные показывают, что возможен подбор оптимального соотношения Г:И в пуриновой нити, при котором комплекс с таким комбинированным нуклеотидным составом в сравнении с обоими базовыми комплексами индуцирует наибольшее суммарное количество ИФН. в наибольшей степени защищает мышей от инфекции вирусом клешевого энцефалита, а в культурах клетск человека и обезьяны имеет более высокую ИФН-индуцирующую и противовирусную активность, токсичность поли(Г,И)•поли(10 существенно ниже, чем у поли(И)-поли(Ц),

Рис. 2. Изменение оптической плотности кислого-растворимой фракции при инкубации комплексов в смеси с сыворопсой крови обезьян при 37° (усреднены результаты 2 независи-' мых опытов);

1 - ПОЛИ(И)-ПОЛИ(Ц), 248 нм;

2 - ПОЛИ(Г)-Пбли(Ц), 270 нм;

3 - поли(Г,И)-поли(Ц) N 2, 270 нм. Аь - ОП в данный момент времени, До - начальная ОП.

Рис. 3. Кинетика накопления кис; лоторастворимой фракции при контакте поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)• поли(Ц) с сывороткой крови человека.

1 - поли(И)-поли(Ц); Zi - поли(Г) -поли(Ц) традиционный; 3 - поли(Г)-поли(Ц) матричный.

а степень ее снижения пропорциональна увеличению соотношения Г:И. Таким образом, активность поли(Г,И)-поли(Ц) в определенных биологических системах может быть близка к активности поли(И)-поли(Ц), но из-за значительно меньшей токсичности они могут иметь более высокий химиогерапевтический индекс. Следовательно, путем вариации нуклеотидного состава при синтезе полинуклеотидов-сополиме-ров возможно получение "гибридных" комплексов, сочетающих в себе достоинства препаратов с различной первичной структурой.

Приведенные данные частично соответствуют утвердившемуся в литературе мнению, что нуклеотидный состав двунитевых РНК - природных или синтетических - не играет особой роли и важно лишь, чтобы имелась двунитевая полинуклеотидная структура в определенной пространственной конформации, сохраняющая определенную устойчивость в условиях испытаний. Однако подробное их рассмотрение выявляет более сложную картину. Прежде всего, опровергается давно сложившееся в литературе мнение о непременной связи токсичности с био-

•^кГ

—|—I—»

2ча гЧ кИ.ч

логической активностью полтеуклеотидных индукторов КФН. Крипеден-ные дачные еще раз подтвест^аот значительно более высокую токсичность поди (И) -полиЩ) пс сравнения с поли (Г) -поли(Д) прл их практически одинаковой гаактной активности в оптимальных длл этого условиях и показывают необходимость проверки токсического действия на зараженных животных при отборе яндутетороз КФН для кляпхчв-ского исследования и применения. Токсичность поли01)-поли(Ю связана, очевидно, с наличием з его составе минорного основания -гипоксантина. Очевидно также, что для проявления токсичности гипоксантина необходима именно двутштевая структура, т.к. введение белым мышам эквивалентных смертельной дозе комплекса количеств поли(И) не приводило к их гибели.

Мы мажем предположить, что высокая устойчивость поли(Г)-поли (Ц) объясняется большей стабильностью пар Г-Ц и, следовательно, большей устойчивостью его двунитевых участков. Как видно, она не может служить Объяснением нивкой токсичности этого комплекса, ко зато позволила рассчитывать на более высокую, чем у поли(И)-поли (Щ, активность в организме приматов и человека. Это также было подтверждено нашими исследованиями.'

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о некотором значении в ряде биологических процессов первичной структуры индукторов ИФН. Различия в их кушгеотидном состсве кзгут сказываться в эффективности их действия в определенных системах клеток, в динамике продукции интерферона у животных, з скорости разрушения индукторов нуклеазами крови животных и человека, в степени токсических проявлений. Далее будет показано, что ряд аффектов первичной структ''~>ы может быть объяснен различиями в структурной организации индукторов на уровнях более еысоксго порядка. Однако токсические различия пока не находят такого структурного объяснения. Поэтому не исключено, что ряд воспринимающих молекулярно-клеточных систем оказывается чувствительным к линейно упорядоченной "буквенной" информации на уровне одной нити и4такое взаимодействие вносит модулирующий вклад в проявления биологической активности полинуклеотидных индукторов ИФН.

Выявленные на этой стадии работы преимущества комплекса поли (Г) -поли (Ц) позволили рассматривать его как перспективный противовирусный препарат медицинского назначения и планировать исследование и применение его как противовирусного лекарственного

препарата с профилактическим и в ряде случаев с терапевтическим потенциалом. На основании итогов этого комплексного изучения, в лаборатории биополимеров было осуществлена широкая программа разработки технологии синтеза полирибонуклеотидов с применением.иммобилизованных ферментов и получения на их основе лекарственной формы препарата под названием "Полигуацил". Лабораторная наработка полигуацила в лекарственной форме была доведена до 12-15 г в год. В 1984-89 гг. нами была обеспечена наработка препарата для проведения полной программы его доклинических токсико-фармаколо-гическкх испытаний в НИИ технологии и безопасности лекарственных средств (г. Купавна), а также начальных этапов клинических испытаний. Итоги отражены в соответствующих отчетах и публикациях.

Наконец, создание промышленного производства полигуацила было включено в программу работ ГКНТ по проблеме. 0.43.01 на 1986-1990 гг., в соответствии с которой в 1987-1989 гг. была начата передача наших лабораторных разработок для внедрения в промышленное производство в НПО "Биолар" РАН и ПО "Латвбиофарм" (г. Олайне, Латвия). Препарат "Полигуацил" включен в справочник "Противовирусные средства", содержащий сведения о лекарственных препаратах, употребляемых в медицинской практике или находящихся на завершающих стадиях клинической апробации.

■ Вторичная структура. Для нуклеиновых кислот под Еторичной структурой подразумевается ассоциация полинуклеотидных тяжей, фиксируемая водородными связями между гетероциклическими основаниями и гидрофобными межплоскостными взаимодействиями. Известное определение активного индуктора ИФН как двунитевой структуры в определенной пространственной конформашш оставляет неясным, какова критическая длина узнаваемого меточными рецепторами участка, имеющего активную структуру. Косвенную информацию о линейных параметрах вторичной структуры дают эксперименты по изучению зависимости активности полинуклеотидных комплексов от молекулярной массы исходных полинуклеотидов. Более точные оценки получены при раомыкании непрерывности двунитевой структуры вставками нексупле-!/ентарных оснований. Данные для некоторых комплексов, в осксеном для лоли(й)-поли(Ц), имеются в литературе. Наши данные для зависимости активности поли(Г)-поли(Ц) от молекулярных мае; поли(Г) и пел;:(II), определённых с помощью седиментацконного анализа и гель-лГО^атсгра.!''.''.!. су.то.пго1-аны на рис. 4 в отксдит^Л: н-;х д-дичинах.

Относительная биологическая активность поли(Г)•поли(Ц)

Рис. 4. Суммарные данные по зависимости1 биологической активности поли(Г)•поли СЦ) в различных экспериментальных системах от молекулярной массы поли(Г) и поли(Ц; В каждой серии экспериментов активность различных препаратов поли(Г)-поли(Ц) отнесена к максимальной в серии, принятой за единицу.

100 200 300 Мол. масса поли(Г)103 Да

При достаточно высокой молекулярной массе одной из нитей активность приблизительно пропорциональна молекулярной массе комплементарной нити при ее изменении от 30 тыс. до 150-200 тыс. Да. Предельно высокая активность комплексов обеспечивается при молекулярной массе обеих нитей не ниже 200-300 тыс. Да. Критической является область значений молекулярной массы полинуклеотидов вблизи 100 тыс. Да (около 300 нуклеотидов). Более точные оценки получены нами 'при введении в пуриновую или в пиримидиновую нить поли(Г)-поли(Ц) с различной частотой аденозина, размыкающего непрерывность упорядоченной водородными связями и межплоскостными взаимодействиями вторичной структуры. Здесь максимальная активность сохранялась при длине монотонного гомополимерного участка не менее 90-100 нуклеотидов.

Результаты проведенных далее измерений молекулярной массы комплексов оказались краше важными - они показали, что их молекулярная масса была значительно больше арифметической суммы молекулярных масс пары комплементарных нитей. Так, пол. луклеотиды с молекулярной массой каждого СОО-ЗОО тыс. Да образуют комплексы с' молекулярной массой не 500-600 тыс. Да, как можно Оыло ожидать, а не менее 2-3 млн Да. Это означает, что практически каклая макромолекула комплекса образуется при одновременном гадима-кистии нескольких комплементарных полинукдеотидных «"П^й. л .та- »••1и •••»и имеют Слизкую длину. Отот факт и рлг.пгши л щ носах критической

«

длины, полученных двумя методами, заставляют обратить более пристальное внимание на особенности процесса формирования вторичной структуру комплексов комплементарных полинуклеотидов.

Плавквв;» под* (Г).

Давно известно-, что по„та(Г) образует собственную вторичную структуру, скорее ссего,4-нитевую. Степень ее формирования«и стабильность зависят, как было показано нами ранее, от наличия б поли (Г) белковых и солевых примесей. Наличие таких примесей обычно не стандартизуется и не указывается для коммерческих препаратов полинуклеотидов, особенно в зарубежных фирмах. Это крайне затрудняет интерпретацию экспериментальных результатов, полученных с коммерческими полинуклеогздами. Поэтому нами было заново проверено кгличие вторичной структуры у' стандартно синтезирование."? и очищенной ноли(Г). О ее прочности свидетельствует наблюдавшееся нами кооперативное высокотемпературное плавление поди(Г) и его зависимость ог ионной силы раствора (рис. 5):

Ркс. 5. Профили тепловой денатурации поли(Г) (концентрация 10 М)-

при ионной силе раствора |i: 1 - 0,02; 2 - 0,05; 3 - 0,1.

Как это сказывается на формировании комплекса поли(Г)-поли(Ц)?

Особенности кинетики взаимодействия поли(Г) с поли(Ц).

Для определения кинетики взаимодействия поли(Г) с поли(Ц) нами была применена дифференциальная спектрофотометр™.по методу 4 кювет. Кинетика изменения оптической плотности смеси при 280 нм относительно суммы оптических плотностей растворов поли(Г), и поли (Ц) приведена на рис. 6а.

Это - намного белее медленный процесс, чем взаимодействие других пар комплементарных полинуклеотидов. Для завершения образования комплекса требуется несколько часов, тогда как полк(И)-по-лиЩ) образуется в течение десятков секунд. Попытки применить различные способы линеаризации кинетической кривой показали, что она очень точно линеаризуется лишь в обратных координатах с абс-цлссой 1/Т7Г, где t - время (рис. 66). Экстраполяция прямой к пре-

ттгтш»

Рис. 6. Кинетлка образования комплекса поли(Г)-поли(Ц) при 20е в~0,005 М Na-фосфатном буфере, pH 7,4 в присутствии 0,1 М NaCl; суммарная концентрация полинуклеотидов 10~4 М;, а - динамика изменения оптической плотности при.280 нм, б - анаморфоза кинетической кривой.

дельному значению изменения А280 дает величину интервала полного взаимодействия - 7,3 час. Очевидно, что такая особенность этой пары полинуклеотидов связана с вторичной структурой поли(Г).

Обнаруженная зависимость хода реакции от времени в степени 1/2 привела нас к предположению о наличии лимитирующей диффузионной стадии во взаимодействии поли(Г) и Поли(Ц). По-видимому, речь может идти о взаимной диффузии сегментов полинуклеотидных цепей, обеспечивающей согласованное постепенное разворачивание плотно упакованной многонитевой поли(Г) и переход ее в комплекс с поли (Ц). Таким образом, здесь имеет место процесс, который можно было бы назвать диффузионной перекристаллизацией. Пользуясь уравнением Эйнштейна для нестационарной диффузии х2 = 2Dt, можно оценить порядок величины коэффициента диффузии D. Если подставить для х величину порядка длины полинуклеотидной цепи или ее эффективного участка, т.е. х = 1-2-105 Да = 0,5-1-Ю-"6 см, а для времени t = 1 ч = 3,6-Ю3 с, получаем D = 0,3-1,4-Ю-14 см2/с. По попядку величины это чрезвычайно близко к измеренным экспериментально значениям коэффициента диффузии макромолекул в упругих средах.

Указанные выше специфические особенности поли(Г) позволяют предполагать, что даже при завершившемся в целом образовании комплекса с поли(Ц) некоторые наиболее прочные участки вторичной структуры поли(Г) остаются неразрушенными и неспареннимн с по-ли(Ц). Мы оценили среднее количество таких участков, обрабатывая комплекс поли(Г)-поли(Ц) РНКазой А и регистрируя накоплено Фраг-

ментов поли(Ц) с помощью гель-хроматогра^и на сефздексе 6-50: В некоторых препаратах комплекса до 51 поли-чД) было доступно действию РНКазы, т.е. не спарено с поли(Г). Естественно, что при эк-вимолярном соотношении взятых для комплекса полимеров это эквивалентно участим поли(Г), исключенным из взаимодействия.

Если верно, что структура полинуклеотидных комплексов усложнена, то должны существовать режимы воздействия на нее, приводящие и к изменениям в биологической активности. К действительно, нам удалось продемонстрировать эффект некоторых таких режимов.

Термоактипация поли(Г) подн(Д).

Известно, что вторичная структура нуклеиновых кислот - это в основном относится к ДНК - динамична и способна к флуктуационной диссоциации и реассоциации. Фон Хнппель и Франк-Каменецкий применяют термин "дышащая структура". Мы попытались создать условия, облегчающие преобразование вторичной структуры комплекса поли (Г) -поли(Ц).

В представляемой работе проведено исследование процесса термоактивации комплекса поли(Г)-поли(Ц). Результаты, приведенные на рис. 7, не только подтверждают вывод о ¡информационной молекулярной перестройке, но и показывают, что у комплекса поли(Г)-поли(Ц), в п'ервую очередь, а также, по-видимому, и у комплексов иного состава механизм явления должен быть более сложным, чем это предполагалось другими авторами. Противовирусная активность ряда препаратов комплекса поли(Г)•поли(Ц), полученных в условиях, способствовавших стабилизации собственной структуры поли(Г), значительно повышалась после прогревания при 100°. В частности, это наблюдалось в случае пчительного хранения входного раствора поли (Г).

Рис. 7. Зависимость степени связывания с сефарозой 2В и биологической активности поли(Г) -поли(Ц) с длительности прогрева. По осям ординат: связывание с сефарозой(£, 1); относительная противовирусная активность СА/А0, С) и титр 1КН Со^-ИЕ/мл, 3).

Оптимальным оказался прогреЕ в течение 10 мим, при продолжении прогрева активность вновь снижалась. При этом было обнаружено другое ватаое явление - на начальных стадиях процесса термоактивации комплекс интенсивно адсорбировался агарозой. Видно, что адсорбция максимальна после прогрева в течение 2 мин, т.е. еще до заметного увеличения биологии .юкой активности. К моменту достижения наибольшей активности (10 мин прогрева) адсорбция комплекса практически исчезала. Поскольку известно, что сорбция нуклеиновых кислот агарозой осуществляется за счет гидрофобного взаимодействия с ней неспаренных пурин:вых оснований, можно говорить о том, что термоактивация является результатом достаточно сложного процесса, заключающегося в конформационной перестройке молекул комплекса, проходящей в несколько этапов.

Как было показано нами, в молекулах поли(Г)-поли(Ц), полученного при эквимолярном соотношении полй(Г) и поли(Ц), некоторое количество поли(Ю может не участвовать в образовании комплекса. Это можно объяснить только тем, что эквивалентное количество по-ли(Г) сохраняет прочную вторичную структуру и исключается из взаимодействия с поли(Ц). По-видимому,' вначале происходит плавление остаточных участков свободной поли(Г). Затем уже происходит перестройка комплекса путем частичного взаимного скольжения нитей, свободные до этого участки поли(Г) вовлекаются в образование дву-нитевой структуры, и регулярность комплекса повышается. Избыточный прогрев чреват термодеструкцией и термохимическими изменениями нуклеозидов, что снова снижает активность. В заключение отметим, что препараты поли(Г)-поли(Ц) с исходно высокой активностью и отсутствием признаков агрегации не обнаруживают при прогреве ни повышения активности, ни связывания с агарозой.

Нестедюметрические соотношения полинуклеотидов при

получении комплексов.

Еще одна примененная намй процедура заключалась в приготовлении комплексов поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)-поли(Ц) в широком диапазоне соотношений комплементарных полинуклеотидов. Рис. 8 показывает, что максимальное подавление размножения вируса после обработки клеток такими комплексами соответствует, наряду с эквимо-лярным соотношением, некоторому избытку поли(Ц). Противовирусная активность, близкая к максимальной, обнаруживается у образцов с молярным соотношением полиП1)/поли(Ц) или поли (Г) 'пали ПО пт

40/60 до 20/80. При этом спектрофотометрия (фелзенфельдовские кривые смешения) дает стехиометрию комплексов - 1:1. Представленные данные свидетельствуют о том, что избыток пиримидиновой нити способствует, по-видимому, существенному увеличению степени упорядоченности вторичной структуры образующихся комплексов.

Рис. 8. Противовирусная активность комплексов поли(Г)•поли (Ц) (а) и поли(И)-поли(Ц) (б), полученных при различных соотной' ниях комплементарных полирибонуклеотидов. .

Приведенные результаты позволяют утверждать, что в сравнении с природными нуклиновыми кислотами ком,пьексы синтетических комплементарных полирибонуклеотидов обладают своеобразной структурой, геометрически организованной совершенно иным образом. Эта их особенность до сих пор не привлекала внимания исследователей. Единственное, что упоминается - это наличие однонитевых разрывов при взаимодействии комплементарных цепей существенно разной длины и локаньных микропетель пр" нарушениях двойной спирали из-за вставок некомплементарных нуклеозидов.

Естественно считать, что полинуклеотидные комплексы - частный случай интерполимерных комплексов вообще комплементарных гомопо-лпм-ров. Такие комплексы синтетических полиэлектролитос интенсив-нг' и ••учалась сколок акад. В. А.Кабанова. Однако специфический мас-

штаб и регулярность межнуклеотидных расстояний, энергия взаимодействия между комплементарными основаниями, устойчивость поли-нуклеотидных комплексов придают им существенное своеобразие, которое до сих пор не учитывалось.

Предполагаемые модели взаимодействия комплементарных гомополи-рибонуклеотидов представлены на рис. 9. В отличие от комплементарных нитей в природных ДНК и РНК, где их взаимное расположение фиксируется генетически заданной последовательностью нуклеотидов, для полинуклеотидов с монотонными нуклеотидными последовательностями такая фиксация отсутствует, и взаимодействие может начаться сразу в нескольких точках и при любом смещении цепей друг относи-

Рис. 9. Схема образования макромолекулы комплекса несколькими молекулами комплементарных гомополирибонуклеотидов (схематически указаны водородные связи между комплементарными гетероциклическими основаниями). а - стандартные комплементарные пары; б - поли(Г) и поли(Ц).

тельно друга (рис. 9а). Это справедливо для комплексов разного состава, причем даже для того случая, когда длина комплементарных цепей примерно одинакова. Поэтому на начальных стадиях взаимодействия в комплексообразование вовлекается не вся полинуклеотидная цепь. Свободные концы цепей принимают на себя из раствора новые комплементарные им цепи. Так образуются не только однонитевые разрывы, но и разветвления. В результате всех этих событий формируется достаточно сложное макромолекулярное образование, "состыкованное" из нескольких полинуклеотидных цепей. Ситуация дополнительно усложняется еще и полидисперсностью синтетических полинук-леотидов, получаемых Ферментативной поликонденсацией. Для пары же поли(Г) и поли(Ч), учитывая способность поли(Г) образовывать мно-гонитевую структуру, мы вынуждены еще усложнить схему (рис. 96). Здесь плотно упакованные цепи поли(Г) схематически изображены прямоугольниками. Комплекс поли(И)-поли(Ц) ближе ко второму варианту модели, т.к. поли(И) также образует многонитевую структуру.

На основании результатов молекулярно-весового анализа комплексов и в соответствии с представленной схемой, нами еще в 1973 г. было высказано предположение, что не вся молекула комплекса, а лишь большая или меньшая ее часть находится в активной информации, и для индукции интерферона достаточно наличия в ее составе хотя бы одного двунитевого участка необходимого размера. Для комплексов иного нуклеотидного состава эта идея была выдвинута другими авторами позднее.

Введение понятия третичной структуры для комплексов комплементарных полинуклеотидов. , Приведенные выше свидетельства специфических ' особенностей структуры комплексов комплементарных полинуклеотидов, существенно отличающейся по пространственной геометрии от структуры природных двунитевых нуклеиновых кислот, и полученные экспериментальные доказательства-возможности упорядочения структуры полинуклеотидных индукторов ИФН заставляют сделать вывод, что рассмотрение только двух уровней структурной организации - первичной и вторичной структуры - недостаточно для структурного описания этого типа нуклеиновых кислот. Мы приходим к необходимости ввести для более полного и точного описания этого класса нуклеиновых кислот новое для них понятие Т|ю™ч1шй_структуры, т.е. рассматривать следующий уровень более высокого порядка.

-- 21 -

Определение третичной структуры.

В приложении к данному типу макромолекул - комплексам комплементарных гомололинуклеотидов - определение третичной структуры должно, по-видимому, иметь следующую формулировку: это набор дву-нитевых участков с упорядоченной вторичной структурой, разобщенных областями ее нарушения, т.е. локальными внутримолекулярными дефектами. Все типы дефектоз содержат неспаренные гетероциклические основания. Это определение третичной структуры менее строго, а сама она выглядит менее упорядоченной, чем у других классов биополимеров - в первую очередь, белков. Однако выше было показано, что процессы взаимодействия полирибонуклеотидов - гомополимеров, получаемых ферментативным биосинтезом, вообще значительно менее упорядочены. Тем не менее, мы вынуждены обратиться к третичной структуре, ибо два предшествующих уровня не описывают всех структурных коллизий. Наиболее важным элементом выглядят разветвления, неизбежность которых вытекает из отсутствия строгой фиксации положения комплементарных нитей друг относительно друга. Это приводит к принципиальным затруднениям в исправлении внутримолекулярных дефектов простым взаимным скольжонием нитей - например, при отжиге комплексов.

Для полинуклеотидных комплексов понятие о третичной структуре введено нами впервые, да и для ДНК и РНК оно обычно не употребляется. Принципиальное значение введенного представления о третичной структуре состоит не только в том, что возможно наиболее полное и всестороннее структурное описание специфического класса нуклеиновых кислот. Выделенные уровни структурной организации мы можем теперь сопоставлять по их функциональному значению, т.е. по вкладу в запись и реализацию структурной информации для индукции интерферона и противовирусной резистентности. И тогда оказывается, что третичная структура ограничивает реализацию информации, представленной участками с регулярной вторичной структурой. При этом степень развитости третичной структуры соответствует количеству локальных внутримолекулярных лефектов, и именно количество таких дефектов определяет эффективность использования специфической информации. Для наиболее полного ее использования необходима минимизация количества дефектов.

Выделение уровней структурной организации и рассмотрение третичной структуры позволяют объяснить целый ряд имеющихся в лито-

ратуре экспериментальных данных (в основном работы Бе С1егсч). К ним относится прежде всего блок работ по термоактиьации полинук-леотидных индукторов ИФН. Именно с позиции третичной структуры можно понять различный вклад параметров пуриновых и пиримидиновых нитей в биологическую активность комплексов и результаты опытов с раздельным внесением комплементарных полинуклеотидов в культуры клеток и объяснить ряд аномалий в поведении комплексов - например, падение активности комплекса поли(И)-поли(Ц) при очень большой длине комплементарных полинуклеотидов и ее возрастание при деструкции молекул комплекса ультразвуком. Приведенные в работе литературные (раздел Р..2.2) и собственные экспериментальные данные (раздел 4.2.2) показывают, что третичную структуру можно считать общим признаком комплексов различного нуклеотидного состава, однако для комплексов с участием поли(Г) - в первую очередь базового поли(Г)-поли(Ц) - вероятность ее формирования максимальна.

В качестве одного из прямых доказательств предложенной модели приведем электронные микрофотографии в белковом монослое комплекса поли(Г)-поли(Ц) (рис. 10а). Еще одним доказательством "от противного" служат результаты применения принципиально иного способа получения комплекса'- матричного биосинтеза. •

Матричный синтез поли(Г)-поли(Ц).

Мы ожидали, что специфика матрице-зависимого синтеза поможет избежать структурных неопределенностей, неизбежно возникающих, при смешении полидисперсных комплементарных гомополимеров. Для этого' мы применили синтез нити поли(Г) из ГТФ на матрице поли(Ц) с помощью бактериальной РНК-полимеразы. По уровню и кинетике включения 14С из ГТФ в кислотонерастворимую полимерную фракцию были определены условия осуществления наиболее полного синтеза нити поли(Г). Показано, что реакция проходит эффективно при концентрации поли(Ц) 0,15 мМ и 10-кратном молярном избытке ГТФ. Повышение концентрации поли(Ц) вплоть до уравнивания ее с концентрацией ГТФ (1,5 мМ) резко снижает эффективность реакции. Подсчет количества вошедшего в состав полимера ГМФ по включению радиоактивной метки показывает, что оно практически равно количеству матрицы поли(Ц), т.е. имеет место полное прочтение матрицы. Продукт реакции был очищен фенольной депротеинизацией, спиртовым осаждением и диализом; его освобождение от других компонентов реакции проверено с помощью Уф-спектроскопии, гель-хроматографии и аффинной сорбции

(см. ниже); по противовирусной активности в культурах ФЭК он не только не уступал комплексу «пол;,'(И)-поли(Ц), но значительно превосходил его. При электронномикроскопическом исследовании в белковом монослое продукт реакции быглядит аналогично двунитевой РНК или ДНК (рис. 105). Видно, что степень разветвлекности и агрегация в этом препарате минимальны в сравнении с комплексом по-ли(Г)'Поли(Ц), полученным традиционным методом смешения комплементарных полинуклеотядов (рис. 10а).. Все это свидетельствовало, что продукт ферментативной полимеризации ГТФ на матрице поли(Ц) представляет собой комплекс поди(Г)-поли(Ц) с максимальной степенью структурной упорядоченности. Помимо доказательства предложенной структурной модели, этот результат позволил получить молекулярный стандарт комплекса для применения его в качестве эталона в методах количественного анализа структуры комплексов.

Наиболее веские доказательства предложенной модели были бы получены, если бы мы научились измерять количество внутримолекулярных дефектов и продемонстрировали возможность направленного изменения их содержания. . Этому посвящен заключительный этап экспериментальной части диссертации.

Разработка и экспериментальная оценка методов количественного детектирования внутримолекулярных дефектов. В области молекулярной биологии и биофизики,' посБященной структуре нуклеиновых кислот, известно достаточно большое количество методов, позволяющих количественно тестировать макроскопические конформационные переходы в ДНК, РНК и синтетических полинук-леогидах. МЫ| оценили их применимость в нашем случае - для измерения количества локальных дефектов и сопоставления близких по этому параметру комплексов. Применимость большинства методов была проверена и отвергнута прямыми экспериментами. Среди них спектроскопические методы оказались недостаточно чувствительными, а регистрация тонкой структуры кривых плавления и вообще самих кривых плавления оказалась невозможной для комплексов семейства по-ли(Г1•поли(Ц) из-за их аномально высокой точки плавления. В итоге такой работы мы отобрали небольшое число методов, которые в таком применении были использованы впервые.

1. Аффинная сорбция. , Бв'з:е было указако, что обычные сорбционные методы недостаточно чувствительны для анализа внутримолекулярных дефектов поликукл<-'о-

, " > ( '

VKJIUM"^ f с-*.-.

imkh :

л

./.■'-"я »

. -Vi

Рис. 10. Злектронномикроскопическая фотография комплексов поли(Г)-поли(Ц): а) комплекс получен при 20° в 0,005 М Na-фосфатном буфере, pH 7,5 в присутствии 0,1 М NaCl; б) очищенный продукт матричного РНК-полкмеразного биосинтеза.

тидных комплексов. Известно, что аффинная сорбция, основанная на биоспецифическом взаимодействии сорбата с сорбентом, имеет намного более высокую чувствительность. Для анализа структуры комплексов поли(Г)-поли(Ц) - продуктов матричного синтеза и традиционных комплексов, а также для очистки тех и других от избытка неиспользованной матрицы и дефектных молекул с участками свободной по-ли(Ц) был разработан метод аффинной сорбции на поли(Г), иммобилизованной на микроволокнистой целлюлозе. ■ В диссертации приведены экспериментальные результаты, доказывающие, что предложенный метод позволяет анализировать структуру комплексов и выделять из их препаратов наиболее регулярную часть. Попутно мы показали, что при использовании некоторых партий коммерческой РНК-полимеразы с недостатком сигма-субъединицы считывание матрицы поли(Ц) при синтезе поли(Г) проходит неполностью и незавершенность синтеза в этих случаях связана с подавлением элонгации нити поли(Г) и с появлением "неполных комплексов", а не с подавлением инициации, приводящим к сохранению некоторого количества неиспользованных молекул поли(Ц).

2. Электрохимический анализ.

Электрохимический анализ высокополимерных нуклеиновых кислот сравнительно недавно вошел в набор методов исследования их. структуры. Он основан на электроактивности гетероциклических оснований - электровосстановлении аденина и цитозина на ртутном электроде и электроокислении гуанина и аденина на графитном электроде. Было показано, что изменение величины тока восстановления или окисления, регистрируемое методами вольтамперометрии или полярографии, а следовательно, изменение количества электроактивных оснований в молекулах ДНК и комплексах синтетических полинуклеоти-дое соответствует макроскопическим кооперативным структурным переходам в этих биополимерах. В конце 70-х и начале 80-х гг. электрохимические методы были с успехом применены для анализа де-натурационных и предденатурационных состояний нуклеиновых кислот. Поскольку, в принципе, электрохимический анализ должен быть чувст-твителен к наличию в структуре нуклеиновых кислот отдельных не-спаренных оснований или их коротких протяженностей, он был предложен нами для анализа тонкой структуры полинуклеотидных дуплексов разл;:-:ксго состава. Эта часть работы была выполнена по программе со?местных исследований с лабораторией физики биопслимерсЕ

- 26 -

Института биофизики Чешской Академии наук (г. Брно). а. Дифференциальная импульсная полярография

(ДИП) на ртутном капельном электроде. Пик ДИП поли(Ц) при потенциале -1,4 В (концентрация поли(Ц) -2-1СГ4 М в 0,3 М СзСГи 0,05 М Иа-фосфатном буфере, рН 6,8) приведен на рис. 11 (кривая 1). Контрольные измерения показали, что высота этого пика пропорциональна концентрации поли(Ц) в очень широком диапазоне. На этом основании естественным было ожидать, что величина пика при -1,4 В в ходе ДИП комплексов поли(Г)-по-ли(Ц) может служить мерой незавершенности комплексообразования, т.е.-количества поли(Ц), не взаимодействовавшей с поли(Г). Действительно, было обнаружено, что при взаимодействии поли(Г) с по-ли(Ц) при 20° в течение достаточно длительного времени (12-16 ч) при рН 6,8 в присутствии 0,05 М МаС1 на кривой ДИП регистрируется значительный сигнал (рис. 11, кривая 4). Поскольку еще при исследованиях ДНК было показано, что Езйимсдействие с комплементарными гуанинами ингибирует злектроактивность цит^зиное, этот сигнал соответствует полярографичесютму восстановлению однонитевых, неспа-ренных с поли(Г), участков поли(Ц). В данном случае высота пика соответствует отсутствию взаимодействия с комплементарными гуанинами у 53% остатков цитозина в поли(Ц). Если же аналогичную экви-молярную смесь поли(Г) и поли(Ц) инкубировали при 100° в течение

Р«с.__11. ДИП поли(Ц) и ее комплексов с поли(Г). 1 - 2-10"4 М поли (Ц) ; ■ 2 - 4-10"4 М поли(Г)'Поли (Ц); 3- 4-Ю-4 М поли (Г) 'Поли (Ц) с добавлением к комплексу избытка 4-10"6 М поли(Ц). 4 -4-10 4 М поли(Г)-поли(Ц), образование комплекса в течение 15 ч при 20° в 10"3 М ^-фосфатном буфере рН 6,8 с 0,05_М МаС1; 5 - тот же комплекс (4-10 4М) после дополнительного прогрева при 100° в тсче-чн" ,г1_мин и медленного охлаждения О - матричный поли(Г)мю-■'ннЦ) Н-КУ4,М).

Потенцнал. В

5 мин в 0,005 М Na-фосфатном буфере, pH 7,4 в присутствии 0,1 М Na31, с последующим медленным'охлаждением до 25°, пик ДИП в этом случае был существенно меньше (кривая 2) и соответствовал уже только 1,5% остатков цитозина в поли(Ц), неспаренных с остатками гугашна в поли(Г). Такой же эффект наблюдался, если поли(Г)-по-ли(Ц), образованный при 20°, после этого прогреть при 100° (крива? 5). Наконец, ДИП не обнаруживает никакого сигнала свободных цитогинов в поли(Г)•поли(Ц), полученном матричным синтезом с по-мспр>ю РНК-полимеразы в соответствии с разделом 4.3.3 диссертации (кривая 6). Для незавершенного матричного синтеза и для комплексов, полученных при избытке поли(Ц), величина сигнала соответствует количеству свободной поли(Ц). После взаимодействия таких незавершенных комплексов с поли(Г)-целлюлозой сигнал исчезает.

Возможности полярографического метода были сопоставлены со спектрофотометрией в УФ области и было показано, что радикальные различия в степени комплексообразования сопровождаются не слишком яркими различиями в спектрах поглощения; при небольших несовершенствах комплексов их спектры поглощения почти идентичны; в то же время ДИП в этих случаях является гораздо более чувствительным и точны методом.

С. Дифференциальная импульсная вольтамперометрия на графитном электроде.

Метод ДИП пригоден для детектирования дефектов, содержащих свободные цитозины, только если комплексы не были получены с заведомым избытком поли(Ц), как это было описано в разделе 4.2.2. При избытке поли(Ц) сигнал ДИП не будет давать никакой информации о внутримолекулярных неспаренных участках. В то же время повышенная биологическая активность и стабильность таких комплексов делает особенно интересным анализ упорядоченности их структуры. Для этой цели был использован другой электрохимический метод, осно-заккый на окислении пуриновых оснований на графитном электроде, а именно, дифференциальная импульсная вольтамперометрия (ДИВ). Для электрода в нем используется пиролизованный графит с шероховатой поверхностью. Было известно, что при увеличении жесткости и регу-ляр! ости вторичной структуры ДНК способность оснований к окислению падает, т.к. поверхность электрода становится для них намного м<»нее доступной. Для анализа структуры комплекса поли (Г) ■ полк(Ц) •л ою модифик-ишй (рис. 1") метод применен впервые. Вкачаю был

/

проведен анализ поли(Г) и сополимера поли(Г.И). Оба полинуклеоти-да обнаруживают на вольтамперной характеристике пик при потенциале 0,93 В, соответствующий электроокислению гуанина (кривые 1 и 2). Поли(Г.И) при соотношении Г:И, равном в данном случае 7:3, дает еще плечо при потенциале вблизи 1,28 В, что соответствует электроокислению гипоксантина. Важно отметить, что высоты пиков окисления гуанина для обоих полимеров идентичны, хотя поли(Г,И)

Рис, 12. Дифференциальные импульсные вольтамперные характеристики полинуклеотидов на графитном электроде в 0,2 М N3-3461316 рН 6,45.

1 - 3-Ю-4 М поли(Г);

2 - 3-Ю"4 М поли (Г, И).

3 - 6-10"4 М поли(Г)-поли(Ц),

соотношение полимеров 1:1;

4 - то же при соотношении по-

линуклеотидов 1:1,5; 5- 6-11Г4 М поли(Г,И)•поли (Ц) .

содержит примерно в полтора раза меньше остатков гуанина, чем по-ли(Г). сто, по-видимому, является прямым следствием формирования более прочной вторичной структуры поли(Г) и исключения значительного числа гуаниновых оснований из контакта с электродом.

Далее был выполнен анализ комплекса поли(Г)-поли(Щ, полученного при 100° (прогрев 5 мин. и медленное охлаждение' из смесей с соотношением поли(Г):поли(Ц), равным 1:1 и 1:1,5 (кривые 3 и 4). Высота пика при 0,93 В оказалась почти втрое меньшей у комплекса с соотношением 1:1,5. Избыточное количество поли(Ц), добавленное дй соотношения 1:1,5 при 25° к готовому комплексу с соотношением 1:1. почти не уменьшало высоту пика. Это значит, что снижение высоты пика для комплекса с соотношением 1:1,5 нельзя объяснить конкуренцией между избыточной поли(Ц) и комплексом полиТ)-по-ли(Ц) аа адсорбцию на электроде. Следовательно, снйжение тока окисления объясняется образованием более жесткой и упорядоченной структуры комплекса при избытке поли(Ц), которая при таких уело-' виях ориентирует, растягивает молекулы поли(Г) в ходе взаимодействия. В комплексе же с соотношением 1:1 большее количество сег-

мечтав поли(Г) сохраняет недиссоциированную вторичную структуру и не образует водородные связи с поли(Ц). Это является прямым экспериментальным подтверждением предположений, высказанных в соответствующем разделе 4.2.2 диссертации на основании результатов измерений биологической активности.

Для комплексов поли(Г.И) с поли(Ц) при их соотношении 1:1 пик при 0,93 В приблизительно в 5 раз ниже, чем для поли(Г)-поли(Ц) с соотношением 1:1 (кривая 5). В то же время содержание гуаниновых оснований в сополимере всего лишь в 1,6 раза ниже, чем в поли(Г), '¿»то заставляет сделать вывод, что поли (Г, И) -поли(Ц) имеет более жесткую, упорядоченную структуру, с меньшим числом внутримолекулярных дефектов, чем поли(Г)•поли(Ц). Этот вывод полностью соответствует и данным ДИП. Таким образом, оба метода показывают, что включение в нить поли(Г) некоторого количества нуклеозидов -инози-ча ослабляет, по-видимому, вторичную структуру пуриновой нити и повышают общую регулярность структуры комплексе!. Этот вывод полностью согласуется • с данными о повышении противовирусной активности таких комплексов в культурах клеток (раздел 4.1).

Ряд наших последующих экспериментов показал, что применимость электрохимических методов определения внутримолекулярных локальных дефектов имеет некоторые ограничения. При работе с очень высокомолекулярными полинуклеотидами возникают затруднения во взаимодействии полинуклеотидных цепей с поверхностью электрода.' По-вид>:мому. образующаяся в растворе пространственная макромолеку-ляр^ая сетка затрудняет миграцию участков поли(Ц) и препятствует ее гзаимодействию с ртутным электродом. Поэтому мы применили еще одия метод, который,в принципе,должен быть менее чувствительным к параметрам раствора, так как основан на использовании низкомоле-ку^чрного лиганда, диффузия которого не должна меняться при образовании сетчатых структур у растворенных полимеров.

5. Измерение флуоресценции ионов ТЬ3+.

Еыл известен метод количественного измерения степени денатурации ДНК по флуоресценции ионов ТЬ3+, способных связываться со своСодними гуаниновыми основаниями, не вовлеченными в систему водородных связей с комплементарными цитозинами. При этом исследователи не ставили задачу сопоставления препаратов ДНК с небольшими конформацизнными различиями. Тем более интересно было применить указанный метод для сравнения препаратов комплекса по-

л^(Г)-поли(Ц) с достоверными, но не очень значительными различиями в упорядоченности их структуры. Результаты приведены в таЗл.4.

В полном соответствии с известными данными, метод фиксир/ет 80-кратное различие во флуоресценции ТЬ3+ при его связывании с нативяой и денатурированной ДНК. Еще больше флуоресценция при реакции ТЬ3+ с чистой поли(Г) - в 4 раза выше, чем в случае денагу-рированной ДНК. Эта величина соответствует тому, что молярное содержание гуанина в ДНК тимуса теленка - около 257. от валового нуклеотидного состава. Этот набор измеренных значений показыв. иет диапазон чувствительности данного метода. Остальные графы показывают различия во флуоресценции для комплексов поли(Г)-поли(1), отличающихся по степени упорядоченности структуры. В диссертаим приведены результаты измерений биологической активности, коррелирующие с данными флуоресцентного анализа.

Таблица 4. Результаты измерений флуоресценции ионов ТЬ3+ в комплексе с поли (Г), ДНК и препаратами поли(Г)-поли(Ц). Примечания. Измерения флуоресценции ТЬ3+ проводили при X = 546 нм, концентрация препаратов в кювете -8 мкг'/мл, возбуждение флуоресценции при X = 290 нм. За 1С0Х принята интенсивность с чистой поли(Г).

Итак, полученные результаты показывают, что набор биофизических методов количественного тестирования неспаренных гетероцик-ли<еских оснований, использующий электрохимические и флуоресцентные эффекты, обеспечивает измерение количества внутримолекулярных дефектов структуры комплекса поли(Г)-лоли(Ц) и семейства родственных ему комплексов, для которых поли(Г)-поли(Ц) является прототипом. Следовательно, эти методы дают возможность проведении быстрого и объективного контроля структуры комплексов комплементарных полирибонуклеотидов, в том числе в процессах их промышленного производства. Результаты их применения дают структурное объяснение- наблюдавшимся нами различиям в биологической активности комплексов разного состава. Более того, е дополнение к полученным

Препараты Относительная интенсивность флуоресценции, %

поли(Г) 100

ДНК нативная 0,3

ДНК денатурированная 26,2

поли(Г)-поли(Ц) 8959 2,1

поли(Г)-поли(Ц) 8961 0,08

поли(Г)-поли(Ц) 8963 4,1

рглее данным биологических испытаний, которые могут считаться лишь косвенными доказательствами, предложенные методы непосредственно доказывают принципиальную возможность регуляризации структуры комплексов и подбора таких оптимальных режимов приготовления, которые обеспечивают их максимальную структурную упорядоченность .

Завершает диссертацию раздел "Обоснование необходимости применения полинуклеотидных индукторов ИФН и стратегия их выбора в конкретных ситуациях".

вывода

1. Впервые предложена последовательная концепция нескольких' молекулярных уровней структурной организации полинукдеотидных индукторов интерферона и сопоставлен их вклад в биологическую активность. Для комплексов комплементарных полинуклеотидов как для специфического типа нуклеиновых кислот впервые сформулировано и обосновано понятие третичной структуры. Установлено, что содержание локальных внутримолекулярных дефектов структуры определяет степень структурной упорядоченности полирибонуклеотидных комплексов, уровень их биологической активности и макроскопические характеристики их растворов.

2. При исследовании вклада первичной структуры удалось выявить как. эффект собственно первичной структуры, связанный с распознаванием клеточными системами линейной нуклеотидной информации, так и влияние первичной структуры на степень формирования внутримолекулярных структурных дефектов и третичной структуры. Это исследование осуществлено как путем полной замены нуклеотидного состава, та* и введением минорных нуклеотидных вариаций.

3. Экспериментально установлено, что комплекс поли(Г)-полиСШ обладает наиболее развитой третичной структурой среди других полинукдеотидных комплексов из-за прочной вторичной структуры поли^1), элементы которой могут сохраняться в составе комплекса у которая является причиной аномально медленного взаимодействия полис;1) с поли(Ц). Для описания их взаимодействия постулирован молекулярный механизм, названный диффузионной перекристаллизацией.

■1. Доказано, что, несмотря на усложненность структуры, по-ли(Г)-поли(Ц) обладает рядом существенных преимуществ по срахн"-,

с другими полинуклеотидными комплексами. Осуществлена обсир-кал программа исследования этого активного и малотоксичного :н;о-

тивовирусного прёпарата, под названием "Полигуацил", вплоть до начальных стадий клинических испытаний.

5. Биофизические метсды, чувствительные к глобальным изменениям конформации нуклеиновых кислот, включающие полярографический и флуоресцентный анализ,' впервые применены для количественного определения локальных внутримолекулярных дефектов структуры noiи-нуклеотидных комплексов; для этой цели разработан также метод аффинной сорбции; в качестве эталонного препарата синтезирован молекулярный стандарт комплекса поли(Г)-поли(Ц) с максимальной степенью структурной упорядоченности; получены экспериментальные доказательства принципиальной возможности повышения регулярности структуры различных полинуклеотидных комплексов.

6. Полученные результаты являются методологической основой целенаправленного синтеза и исследования полинуклеотидных индукторов интерферона и их выбора в зависимости от конкретных условий испытаний и применения.

Список работ, опубликовании по теме диссертации:

1. Аксенов O.A., Тимковский А.Л., Агеева О.Н., Когак Э.М., Врес-лер С.Е., Смородинцев A.A., Тихомирова-Сидорова Н.С. Интерфе-

. роногенная и антивирусная активность двунитевого комплекс,! полирибогуаниловой и полирибоцитип"ловой кислот. //Вопросы вирусол. 1973. Т. 18, N 3, С. 345-350.

2. Тимковский А.Л., Аксенов O.A., Бреслер С.Е., Когак Э.М., Смородинцев A.A. , Тихомирова-Сидорова Н.С. Молекулярно-весовые характеристики комплекса поли(Г)-поли(Ц) и их связь с антивирусной и интерфероногенной активностью. //Вопросы вирусол. 1973. Т. 18, N 3. С. 350-355.

3. Novokhatsky A.S., Ershov F.I., Tlmkovsky A.L., Bresler S.E., Kogan E.M., Tlkhomlrova-Sldorova N.S. Double-stranded complex of polyguanyllc and. polycytldyllc acids and its antiviral activity In tissue culture. //Acta virol. 1975. V. 19, N 2. P. 121-129.

4. Вильнер Л.М., Бродская Л.М.. Коган Э.М., Тимковский А.Л., Мирошниченко Т.Л., Тихомирова-Сидорова Н.С. Сравнительная противовирусная и интерфероногенная активность различных комплексов гетеро- и гомополирибонуклеотидов. //Антибиотики. 1976. Т. 21. N 9. С. 842--840.

5. Скуркович C.B., Ольшанская H.B., Еремкина Е.И., Архипова H.A. Клинова Э.Т., Крохина М.А., Колпикова Л.А., Сидорова Н.С., Коган Э.М., Наумович Н.Г., Бреслер С.Е., Тимковский А.Л., Сапганик Р.И., Закабунин А.И. Получение интерферон-содержащей донорской плазмы и изучение ее лечебных свойств при Herpes zoster. //Проблемы гематол. и перелив, крови. 1977. Т.22, №.4. С.49-51.

5. Вильнер л.м., Бродская Л.М., Коган Э.М., Тимкоеский А.Л., Сидорова Н.С. Противовирусная и интерфероногенная активность синтетических комплексов гомополинуклеотидов и комплексов rovo- и гетерополинуклеотидов. //Вестник АМН СССР. 1977'. N 5. С. 64-70.

7. Вильнер Л.М., Тимковский А.Л., Тихомирова-Сидорова Н.С. Биологическая активность и структурные особенности полинуклео-тидных интерфероногенов. . "Итоги науки и техники", серия "Вирусология". ВИНИТИ, Москва. 1977. Т. 6. С. 114-159.

В. Смородинцев A.A., Аксенов O.A., Константинова И.К-., Вильнер Л.М., Тюфанов A.B., Тимковский А.Л., Бреслер С.Е., Коган Э.М., Тихомирова-Сидорова Н.С. Сравнительное исследование токсичности поли(Г)-поли(Ц) и поли(И)-поли(Ц) на различных объектах. //Вопросы вирусол. 1978. Т. 23, N 2. С. 201-206.

9. Новохатский A.C., Коган Э.М., Тимковский А.Л. Противовирусная активность комплексов, полученных при различных соотношениях комплементарных гомополирибонуклеотидов. //Антибиотики. 1978. Т. 23, N 5. С. 406-411.

10. Аксенов O.A., Бреслер С.Е., Закабунин А.И., Коган Э.М., Райт В. К., Салганик Р.И., Сидорова Н.С., Смородинцев A.A., Тимковский А.Л. Лабораторное и клиническое исследование биологической активности комплекса поли(Г)•поли(Ц). //Вопросы вирусол. 1978. Т. 23, N 4. С. 466-470.

11. Сидорова Н.С., Архипова Н.А., Бреслер С.Е., Закабунин А.И., Коган Э.М., Наумович Н.Г., Ольшанская Н.В., Салганик Р.И., Скуркович C.B., Тимковский А.Л. Использование интерфероноген-яого препарата поли (Г) -по/ :(Ц) для обогащения плазмы крови доноров интерфероном и для лечения герпеса Зостер. //В сб. "Целенаправленный поиск противораковых и противовирусных препаратов". -Изд. "Зинатне", Рига. 1978. С. 267-273.

12. :3kurkovich S.V., Arkhlpova N.A., Olshanskaya N.V., Eremkina i. I., Krokhina M.A., Kllnova E.G., Kolpikova L.A., Sldorova U.S., Kogan E.M., Naumovich N.G., Bresler S.E., Tlmkovski A.L., Salganik R.I., Zakabunin A.I., Makhonova L.A., Majakova S.A., Leschynskaya E.V. Interferon-containlng plasma: the oreparatlon for treatment of viral Infections. //Blomediclne. 1978. V. 29, N 7. P. 227-228.

13. вильнер Л.М., Тимковский А.Л., Коган Э.М., Наумович Н.Г., Зродская Л.М., Чернышев В.И., Тихомирова-Сидорова Н.С. Гидролиз и инактивация двунитевых полирибонуклеотидоэ сывороткой срови обезьян. //Вопросы вирусол. 1979. Т.24, N 2. С.181-185.

14. Коган Э.М., Наумович Н.Г., Платонова Г.А., Сидорова U.C., '•¡реслер С.Е., Тимковский А.Л., Вильнер Л.М., Тюфанов A.B. .Двунитевый полирибонуклеотидный комплекс, обладающий интерфс-роногенной и противовирусной активностью, и способ его получе -

- 34 -

ния. //Авторское свид. ОХР. 09.04.1979. N 677408.

15. Коган Э.М., Платонова Г. А., Сидорова Н.С., Тимковский А.Л., Ереслер С.Е., Аксенов О.А., Смородинцев А.А. Способ термоактивации двунитевых полинуклеотидных комплексов. //Авторе.сое свид. СССР. 15.10.1979. N 713871. Бюлл. изобрет. 1980. N 5.

16. Вильнер Л.М., Коган Э.М., Тимковский А.Л., Тюфанов А.В., <&и-ногенова Е.В., Платонова Г.А., Сидорова Н.С. Влияние различных полирибонуклеотидных интерфероногенов на острую и латентную виусную инфекцией мышей. //Вопросы вирусол. 1980. Т. 25. №.1. С. 67-71.

17. Тимковский А.Л. Структурная организация полинуклеотидных индукторов интерферона. //В сб. "Индукторы интерферона". Иг д. "Зинатне", Рита. 1981. С. 52-65.

18. Вильнер Л.М., Тимковский А.Л., Коган Э.М.. Тихомирова-Сидорова Н.С. Действие поли(Г)-поли(Ц) и полиСИ)-поли(Я) на инфицированных животных. Там же. С. 74-77.

19. Махонова Л.А., Архипова Н.А., МаяковаС.А., КрохинаМ.А., Газрилова И.Е., Еремкина Е.И., Клинова Э.Г., Тимковский А.Л. Применение интерферонсодержащей донорской плазмы у детей в остром периоде острого лейкоза. //Проблемы гематол. перелив, крови. 1981. Т. 26. N 1. С. 16-19.

20. Сидорова Н.С., Бреслер С.Е., Коган Э.М.. Тимковский А.Л., Наумович Н.Г., Платонова Г.А. Синтез и исследование индукторов интерферона на основе полигуаниловой кислоты. XII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Рефераты докладов и сообщений. Изд. "Наука", Москва. 1981. С. 148-149.

21. Л.М.Вильнер, З.М.Коган, Г.А.Платонова, Тихомирова-Сидорога Н.С., Тимковский А.Л. О модификации комплекса поли(Г)-поли(Ю

. включением аденозина в пуриновую нить. Антибиотики. 1982. Т.27. » I. С. 54-57.

22. Тимковский А.Л., Коган Э.М., Аксенов О.А., Платонова Г.А., Тихомирова-Сидорова Н.С., Бреслер С.Е. Термоактивация по-ли(Г)•поли(Ц): описание эффекта и его предполагаемый механизм. //Вопросы вирусол. 1982. Т. 27. N 2. С. 92-96.

23. Сидорова Н.С., Бреслер С.Е., Вильнер Л.М., Коган Э.М., Тимковский А.Л. Полинуклеотидный индуктор интерферона "Полигуа-цил". //Всесоюзный симпозиум "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных веществ". Тезисы докладов Рига. 1982. С. 148.

24. С.Е.Бреслер, А.Л.Тимковский. Соотношение вторичной и третич ной структуры для индукторов интерферона - комплексов комплементарных полирибонуклеотидов. //Труды I Всесоюзного биофизического съезда. Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва. 1982. С. 48.

25. Тимковский А.Л., Ершов Ф.И. Итоги изучения полирибонуклеотид-ного комплекса поли(Г)-1голи(Ц). //В сб. "Индукторы интерферона". Ин-т вирусологии им. Д.И.Ивановского. Москва. 1982.

С. 51-55.

26. Brabec V.. Tlmkovsky A.L. Electrochemistry of double-stranded, complexes of synthetic polyribonucleotides having interfero-nogenic arid antiviral activity. //General Physiol. Biophvs. 1983. V. 2, N 6. P. 487-497.

I t

27. Вильнер Л.M., Лашкевич В.А., Тихомирова-Сидорова H.С., Когач Э. М., Тимковский А.Л. Комбинированный противовирусный эффект синтетических полирибонуклестидных интерфероногенов к специфических противовирусных антител при арбсвирусных инфекциях, //вопросы вирусол. 1984. Т. 29. N 3. С. 334-337.

28. Sidorova N.S., Kogan Е.М., Naumovich N.G., Platonova G.А., Vilner L.M., Timkovsky A.L. Structural parameters determining the biological activity of poly(G)-polyCC) and its modifications. //IUPAC 14th International Symposium on the Chemistry of Natural Products. Poznan. Abstracts. 1984. P. 665.

29. Вильнер Л.М., Платонова -Г. A., Когач Э.М., Сидорова H.С., Тим-ковский А.Л. Оценка размера непрерывного участка поли(Г), необходимого для биологической активности комплекса поли(Г)-полиса). //Вопросы вирусол. 1985. Т. 30. N 3. С. 337-340.

30. Kogan Е.М., Sidorova N.S., Timkovsky A.L., Brabec V. Investigation of the interaction of copolymers poly(G,A) with mercury electrode. //Vil CMEA Symposium "Biophysics of Nucleic Acids and Proteins. Abstracts. Brno. 1985. P. 18.

31. Вильнер Л.M., Коган Э.М., Наумович Н.Г., Сидорова Н.С., Глазунов Е.А., Тимковский А.Л. Зависимость противовирусной активности комплекса поли(Г)-поли(Ц) от размера непрерывных участков поли(Ц). //Вопр. вирусол. 1983. Т.33, N3. С.331-335.

32.. Суржик М. А., Вильнер Л.М., Качурин А.Л., Тимковский А.Л. Мат' ричный синтез комплекса поли(Г)-поли(Ц) с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coll. Исследование физико-химических свойств и биологической активности продукта реакции. //'Препринт ЛИ®. 1989. N.1555. С. 1-18.

33. Никанорова Н.Г., Тимковский А.Л., Свердлов А.Г. Повышение устойчивости организма к рентгеновым лучам и нейтронам под влиянием интерфероногенов. //"Гарантия качества лучевой терапии". Сб. научных трудов НИИМР АМН СССР. Обнинск. 1991.

С.106-108.

34. Суржик М.А., Дятлова Н.Г., Глазунов Е.А., Тимковский А.Л., Власов Г.П., Кожевникова Н.Ю. Устойчивость природных и синтетических полирибонуклеотидных индукторов интерферона к рибо-нуклеазам человеческой крови. //Антибиотики и химиотер. 1992. Т. 37. N 1. С. 21-23.

35. Surzhik M.A., Timkovsky A.L. Affinity sorption analysis of the structure of poly(G)-poly(C) complex obtained by means of template-dependent synthesis. //Биополимеры и клетка. 1093. T. 9. N 3. С. 23-27.

36. Тимковский А.Л., • Балцарова 3., Брабец В. Изучение свойств растворов индуктора интерферона поли(Г)-поли(И) с помощью электрохимического и флуоресцентного методов. //Препринт ПИЯФ. 1993. N. 1908. С. 1-17.

37. Тимковский А.Л., Балцарова 3., Брабец В. Анализ дефектов структуры комплекса полиСО-поли(С). //Молек. биология. 1994. Т. 28. N.5. С. 1028-1034.

38. Аксенов О.А., Мурина Е.А., Коган Э.М., Платонова Г.А.. Сидорова Н.С., Тимковский А.Л. Биологическая активность комплекса поли(Г)-поли(Ц), модифицированного соединении» лвучгал'чтг.'й платины. //Вопросы вирусол. 1995. Т. 40. N.2. п. sn s<i.