Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот при помощи биологически значимых факторов

Скуридин, Сергей Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот при помощи биологически значимых факторов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот при помощи биологически значимых факторов"

На правах рукописи

РГБ ОД

СКУРИДИН Сергея Геннадьевич

1 8 ЯН9 2000

УПРАВЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИЕЙ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ ПОМОЩ БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ФАКТОРОВ

Специальность: 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1999

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской Академии наук

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Евдокимов Ю.М.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор, чл.-корр. РАН доктор химических, наук,

профессор доктор химических наук, профессор

Хохлов А.Р.

Готтих Б.П.

Рочев В.Я.

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Запита состоится п3 " ф?&/>Я 2000 года в ~ на заседании Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117964, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан деи-а^и) 1999

года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

ЕОЖ, I О

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что двухиепочечные молекулы ДНК в составе биологических объектов (вирусы, хромосомы) находятся в компактном, плотноупакованном состоянии, для которого характерна, прежде всего, высокая (достигающая S0 %) локальная концентрация ДНК и высокая степень пространственной упорядоченности. Еще одной важной особенностью пространственной укладки молекул (или сегментов) ДНК в составе биологических объектов является ее высокая лабильность, выражающаяся в способности быстро и обратимо менять степень компактности и характер упорядочения молекул (или сегментов) ДНК в зависимости от функционального состояния клетки.

Исследование конкретных особенностей упаковки молекул ДНК в биологических объектах было, и остается до настоящего времени, проблемой, не имеющей однозначного решения. Это обусловлено как сложностью структуры биологических объектов, так и недостаточным совершенством методов исследования. Возможное решение этой актуальной проблемы молекулярной биологии заключается в создании модельных систем, отражающих основные черты пространственной упаковки молекул ДНК в составе биологических объектов. Одной из таких модельных систем, привлекающих в последние годы внимание не только молекулярных биологов, но и специалистов других областей науки, являются жидкие кристаллы, образующиеся как при концентрировании растворов ДНК, так и при фазовом исключении молекул ДНК. Выбор жидкокристаллических Фаз ДНК в качестве модельной системы обусловлен тем, что, несмотря на высокую концентрацию ДНК в таких фазах, для молекул ДНК в их составе характерна не только высокая степень структурной упорядоченности, но и молекулярная подвижность, т.е. свойства, присущие реальным структурам ДНК in vivo.

Наличие информации об условиях образования, типах и свойствах жидкокристаллических фаз ДНК позволило приступить к следующему этапу изучения этой молельной системы, а именно, к исследованию жидкокристаллических дисперсий ДНК. Целесообразность такого перехода продиктована тем, что биологические объекты такие, как вирусы и хромосомы, представляют собой, по существу, дисперсные системы, для которых, помимо перечисленных выше особенностей, ха-

рактерен еще и микроскопический размер. Исследование жидкокристаллических дисперсий ДНК представляется более перспективным как с молекулярно-биологическои, так и физико-химических точек зрения. Эта модель важна потому, что она позволяет выявить влияние ряда факторов (например, ионного состава среды, наличия в ней полимеров биологического происхождения и биологически активных соединений и т.д. ), в значительной степени определявших организацию и устойчивость живых систем. Следовательно, настоящая работа, находясь на стыке молекулярной биологии и физической химии биополимеров, позволяет сделать еще один шаг к более глубокому пониманию механизмов и роли факторов, определяющих и регулирующих характер упаковки двухцепочечных молекул 1или сегментов) ДНК в составе биологических объектов.

Цель работы- Цель настоящей работы состояла в детальном изучении условий образования и свойств жидкокристаллических дисперсий, формируемых в результате фазового исключения линейных двухцепочечных молекул ДНК из водно-солевых растворов, содержащих нейтральный полимер - полиэтиленгликоль (ПЭГ), и в результате конденсации ДНК в водно-солевах растворах под действием поликатионов, а также в исследовании возможности управления характером упаковки молекул нуклеиновых кислот в частицах дисперсий.

Основные задачи исследования. В задачи исследования входило:

1. определить условия образования дисперсий линейных двухцепочечных молекул ДНК в растворителях, различающихся по структуре и свойствам, и исследовать свойства этих дисперсий;

2. установить тип (типы) упаковки молекул ДНК в частицах дисперсий;

3. проанализировать роль факторов, способных влиять на оптические свойства жидкокристаллических дисперсий ДНК;

4. исследовать возможность управления пространственной упаковкой молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий:

- в результате модификации структуры молекул ДНК;

- в результате изменения катионного состава, температуры и свойств растворителя;

- при помощи биологически активных соединений.

5. оценить вероятность использования жидкокристаллических дисперсий ДНК в качестве основы для создания аналитических систем

(биосенсоров), предназначенных для определения биологически активных соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки.

Научная новизна работы. При выполнении настоящей работы получен ряд новых, приоритетных результатов.

Впервые показано, что при определенных условиях пространственная упаковка молекул ДНК в частицах дисперсий, образующихся при фазовом исключении, аналогична упаковке молекул ДНК в холес-терических жидких кристаллах, т.е. доказано существование холес-терических жидкокристаллических дисперсий двухцепочечной ДНК.

Впервые установлено, что изменение структурных параметров двухцепочечных молекул ДНК при действии химических агентов или физических факторов приводит к тому, что из модифицированных молекул ДНК формируются жидкокристаллические дисперсии, обладающие организацией пространственной структуры, отличающейся от холесте-рической. Формирование жидкокристаллических дисперсии ДНК разного типа отмечено также при изменении диэлектрической постоянной, ка-тионного состава и температуры водно-солевого раствора ПЭГ.

На примере жидкокристаллических дисперсий, сформированных из комплексов (ДНК-поликатион), впервые продемонстрировано, что характером пространственной упаковки молекул ДНК можно управлять при помоши низких концентрации биологически активных соединений.

Впервые показано, что холестермческие жидкокристаллические дисперсии ДНК и жидкокристаллические дисперсии комплексов (ДНК-поликатион) можно использовать в практических целях для создания аналитических систем (биосенсоров), предназначенных для определения разных классов биологически активных соединений, различающихся как по своей химической природе, так и по механизму взаимодействия с генетическим материалом клетки.

Практическая ценность работы. Обнаруженная в настоящей работе зависимость степени компактности и характера пространственной упаковки молекул ДНК от катионного состава растворителя имеет важное значение для понимания механизмов регуляции функциональной активности хромосом в условиях изменения ионного состава внутриклеточной среды.

Установленные в работе факторы управления пространственной организации жидкокристаллических дисперсий ДНК следует учитывать

при описании свойств жидкокристаллических структур, образуемых молекулами других биополимеров, в частности, белками и полисахаридами ,

Жидкокристаллические дисперсии ДНК можно рассматривать в качестве простой и удобной модельной системы, позволяющей исследовать роль факторов и природу движущих сил, определяющих особенности организации третичной структуры двухцепочечных молекул ДНК in vivo. Это обстоятельство необходимо учитывать при формировании представления о жидкокристаллической упаковке молекул (или сегментов ) ДНК не только в головках бактериофагов и хромосомах простейших, но и в хромосомах эукариот.

"Отклик" пространственной структуры жидкокристаллических дисперсий ДНК и жидкокристаллических дисперсий комплексов !ДНК-поликатион ) в ответ на действие химических агентов и физических факторов использован при конструировании биодатчиков (Патент РФ N 2032695, Патент РФ N 2107280, Патент РФ N 2123008), позволяющих детектировать наличие в среде биологически активных соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки. Тем самым, сделаны первые практические ваги в новом направлении аналитической биотехнологии, а именно, в области создания полифункциональных биодатчиков на основе жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот.

Апробация работы- Результаты работы докладывались на различных международных, всесоюзных и всероссийских съездах, конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и семинарах, в том числе: на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на XXII Съезде ФЕБО (Стокгольм, 1993), на II Съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международном конгрессе "Взаимодействия нуклеиновых кислот" (Падуя, 1987), на I и III Международных конгрессах по биосенсорам (Сингапур, 1990; Новый Орлеан, 1994), на V Конгрессе европейского общества фотобиологов (Мар-бург, 1993), на IX Международной конференции по жидким кристаллам (Бангалор, 1982), на IV и V Конференциях социалистических стран по жидким кристаллам (Тбилиси, 1981; Одесса, 1983), на II Международной конференции "Молекулярная электроника и биокомпыоторы" (Москва, 1989), на III Конференции Италия-СССР по физике жидких кристаллов и лангмюровских пленок (Катания, 1990), на vn Между-

народной конференции Тетероциклы и биоорганическая химия" 5Сантьяго-де-Кампостелла, 1993), на XVI Международной конференции по фотохимии ¡Ванкувер, 1893!, на IV и V Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981; 1984), на VI Всесоюзной конференции "Жидкие кристаллы и их практическое использование" (Чернигов, 1988), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1990), на Международном симпозиуме "Биомолекулярные структуры и взаимодействия" (Бангалор, 1984), на Международном симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ (Пушино, 1985!, на I и II Всесоозных и III Всероссийском симпозиумах "Жидкокристаллические полимеры" (Суздаль, 1982, 1937; Черноголовка, 1995), на VI Всесоюзном симпозиуме "Конформационные изменения биополимеров в растворах" (Тбилиси. 1985), на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993), на Международном рабочем совещании СНГ-Германия по биосенсорам (Мюнстер, 1993), на Международном совещании по химии гидрогелей (Прага, 1995), на V Всесоюзном рабочем совещании "Жидкокристаллическое состояние в биологических системах и их моделях" (Пущино, 1986), на I Всесоюзном совещании по лиотропным жидким кристаллам (Иваново, 1990), на Международном семинаре "Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов" (Пущино, 1985).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатных работы в ведущих международных и отечественных научных журналах.

Структура и объем диссертации, диссертация изложена на 321 странице, включавших 87 рисунков, 8 таблиц и список цитированной литературы, содержащий '243 ссылки. Она состоит из введения, десяти глав и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении изложены цели и задачи проведенного исследования.

Глава I. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФАЗЫ ДИК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ

В этой главе рассмотрены имевшиеся в литературе данные, полученные при изучении свойств жидкокристаллических фаз, образующихся при концентрировании растворов ДНК. Линейные, двухцепочеч-ные, жесткие, оптически активные молекулы ДНК низкой молекулярной массы (< 1 х 10ь) образуют в концентрированных растворах 'С'ДНК > 100 мг/мл) жидкокристаллические фазы, обладающие структурным полиморфизмом. При переходе молекул ДНК из изотропного в жидкокристаллическое состояние параметры их вторичной структуры (в частности, принадлежность к В-семейству) не меняются. Холесте-рические жидкие кристаллы ДНК, шаг спиральной структуры которых составляет ~ 2,4-2,5 мкм, обладают аномальной оптической активностью, проявляемой в спектре КД в виде интенсивной отрицательной полосы, расположенной в области поглощения азотистых оснований (кмакс ~ 290 нм!> 0тРиЦательнь!й знак аномальной полосы показывает, что правоспиралъные молекулы ДНК образуют холестерические жидкие кристаллы с левой закруткой пространственной хслестеричвс-скоп спирали. Концентрация ДНК в жидкокристаллических фазах сопоставима с ее концентрацией в головках бактериофагов и хромосомах простейших и составляет ~ 160-450 мг/мл. Перечисленные свойства свидетельствуют о том, что холестерические жидкие кристаллы ДНК обладают рядом особенностей, присущих реальным компактным структурам ДНК ln vivo, в частности, хромосомам простейших. Это обстоятельство послужило основанием для предположения (Livolant F., 1984) о возможности использования лиотропных жидких кристаллов ДНК в качестве модельной системы, отражающей основные черты пространственной организации молекул ДНК в составе биологических объектов.

Глава II. ВЛИЯНИЕ БИОГЕННЫХ ПОЛИКАТИОНОВ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, АГРЕГАТНОЕ СОСТОЯНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДНК

В этой главе, на примере биогенных полиаминов (спермидина и спермина], рассмотрены литературные данные, характеризующие неко-

торне свойства поликатионов и их влияние на характер упорядочения линейных двухцепочечных молекул ДНК в водно-солевых растворах. Молекулы поликатионов образуют с двухцепочечной ДНК как внутри-, так и межмолекулярные комплексы, нейтрализуя отрицательно заря-ленные фосфатные группы этой макромолекулы. Молекулы ДНК в составе комплекса (ДНК-поликатион) сохраняют параметры вторичной структуры, характерные для линейной B-формы ДНК. Согласно теоретическим расчетам и экспериментальным данным, поликатионы, молекулы которых содержат три и более положительных заряда, способны экранировать 89-90% отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК и обеспечивать тем самым степень нейтрализации ДНК, необходимую для ее конденсации в водно-солевом растворе. Эффективность образования разных типов жидкокристаллических фаз комплексов (ДНК-поликатион ) зависит как от концентрации ДНК и природы поликатиона, так и от ионной силы и pH раствора. Способность комплексов (ДНК-поликатион ) образовывать разные типы жидких кристаллов играет важную роль в регуляции биологической активности ДНК in vivo, ускоряя или ингибируя процессы, протекающие с участием этой макромолекулы. При этом, наибольшая биологическая активность ДНК отмечена в тех случаях, когда молекулы комплексов (ДНК-поликатион) образуют холестерическую жидкокристаллическую фазу (Baeza I., 1992; Pelta J., 1996), Не исключено, что это явление имеет общебиологическое значение.

Глава III- ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФАЗЫ ДНК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ

В этой главе приведены имеющиеся в литературе данные, характеризующие физико-химические свойства ПЭГ и его растворов. Водно-солевые растворы ПЭГ используют в качестве компонентов двухфазных систем, обеспечивающих возможность разделения частиц и молекул биологического происхождения (Альбертсон П.-О., 1974). Меняя концентрацию ПЭГ, можно управлять в экспериментально контролируемых условиях молекулярной структурой и свойствами (в частности, вязкостью, диэлектрической постоянной, осмотическим давлением, поверхностным натяжением, полярностью и т.п.! его растворов. Это обстоятельство определило выбор ПЭГ в качестве полимера, водно-

солевые растворы которого можно использовать для выяснения роли растворителя в процессе формирования жидкокристаллических фаз ДНК iLerman L.S. , 1971; Evdokimov Yu.M., 1972). Меняя свойства ПЭГ-содержащего раствора, можно управлять характером упаковки молекул ДНК в образуемых ими жидкокристаллических фазах. Это означает, что данная модельная система является перспективной, поскольку она позволяет получать более полную информацию о влиянии структуры и свойств растворителя на особенности формирования третичной структуры ДНК.

Глава IV- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В этой главе приведены характеристики препаратов ДНК и других реагентов, а также описаны использованные в работе методики.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава V. УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ И СВОЙСТВА ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИИ ДНК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ

V.1. Условия образования дисперсий ДНК в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля

На рис. 1 приведена схема формирования дисперсий в результате фазового исключения линейных двухцепочечных молекул ДНК из водно-солевых растворов ПЭГ.

Для образования дисперсии ДНК необходимо соблюдение ряда "граничных" условий.

1. Длина 1Ы молекул ДНК должна быть не ниже 100-150 пар оснований 11/Ъ >10; Б - диаметр ДНК), а концентрация ДНК в исходном водно-солевом растворе должна быть не выше 100 мкг/мл.

Существование "нижнего" предела молекулярной массы ДНК обусловлено тем, что короткие фрагменты ДНК (длиной менее 50 пар оснований ) не конденсируются в ПЭГ-содержащих Еодно-солевых растворах, а "верхнего" предела концентрации ДНК - тем, что при Сщ,, превышающей 100 мкг/мл, конденсация ДНК приводит к беспорядочной

Водно-солевой раствор ДНК: V, С~ис(0); Ц/ГС, рН, ГГ.

СМЕШЕНИЕ

Дисперсия ДНК:

V = 2 У0; Сд„к= У* Сянк (0); Срэг= У2 Спэг (0); ц/ГС, рН, Я1.

Рис. 1 Схема формирования дисперсия ДНК в ПЭГ-содержащих водно-солевых растворах.

агрегации.

2. Молекулы ДНК должны иметь регулярную вторичную структуру, степень нативности которой зависит, в частности, от температуры (20°С ^ Т°С < Т ДНК) и рН (5,5 < рН < 8,5) исходных водно-солевых растворов ДНК и ПЭГ.

Необходимость выполнения данного условия продиктована тем, что только нативные двухцепочечные молекулы ДНК образуют жидкокристаллические фазы.

3. Молекулярная масса ПЭГ (ММПЭГ) до лама лежать в пределах 1 ООО « ММг,Эр « 40000, а концентрация ПЭГ (СПЭГ5 в ИСХ°ДН0М

водно-солевом растворе - в пределах -ё С^р « 600 мг/мл.

1СПЭГ ~ "кРитическая" концентрация ПЭГ, соответствующая началу образования дисперсии ДНК.)

При фиксированной ионной сила исходных водно-солевых раст-

кр.

воров ДНК и ПЭГ величина Спэг связана с молекулярной массой ПЭГ:

чем выше молекулярная масса ПЭГ, тем меньше значение Су-

кр.

шествование зависимости между ^пЭГ и молекулярной массой ПЭГ отражает тот факт, что образование дисперсии ДНк. происходит в условиях смены режимов свойств раствора ПЭГ, т.е. в условиях возникновения дальнодействующих флуктуация в растворах ПЭГ, обусловленных формированием флуктуационной полимерной сетки.

4. При данном катионном составе исходных водно-солевых растворов ДНК и ПЭГ ионная сила (д) этих растворов должна превышать некоторое "критическое" значение д > ). дкр' -"критическая" ионная сила, соответствующая (при фиксированной молекулярной массе и концентрации ПЭГ) началу образования дисперсии ДНК: чем выше ионная сила исходных водно-солевых растворов

кр.

ДНК и ПЭГ, тем ниже величина Сдзр-

Таким образом, приведенная на рис. 1 схема формирования дисперсий ДНК позволяет управлять в широких экспериментально контролируемых пределах свойствами растворов ДНК и ПЭГ. Это означает, что использование данной схемы позволяет получать существенную информацию о влиянии свойств растворителя и молекул ДНК на свойства формируемой дисперсии,

4.2. Некоторые параметры частиц дисперсий ДНК, образующихся в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля

Образование дисперсии ДНК регистрировали при помощи разных методов, в частности, по появлению "кажущейся" оптической плотности (А ) в спектре поглощения ДНК в области длин волн, превыша-

Г.

юших 320 ны, в которой ни ДНК, ни ПЭГ не обладают заметным собственным поглощением. Появление "кажущейся" оптической плотности обусловлено рассеянием падающего излучения на частицах дисперсии ДНК.

Оценка диаметра (В) частиц дисперсии ДНК, основанная на применении уравнения А„ = К-\~пр в котором показатель степени п -

величина, связанная при определенных условиях с размером рассеивающих частиц, показала, что среднее значение величины Б при

СДНЬ" —* 0 составляет ~ 2700 А.

Средний диаметр частиц, рассчитанный на основании данных

корреляционной спектроскопии, составляет 5000-10000 А, Отличие между величинами D, полученными разными методами, является вполне допустимым, поскольку оценки размера частиц дисперсии ДНК были проведены с учетом специфики использованных методов при разных концентрациях ДНК.

Следует добавить, что вопрос о морфологии и размере частиц дисперсий ДНК. образующихся в водно-солевых растворах ПЭГ, оставался дискуссионным вплоть до последнего времени. Однако, в 1999 г. при помоши атомной силовой микроскопии было показано, что они действительно имеют форму, близкую к сферической, а их диа-

о о

метр меняется от 3000 до 7000 А, составляя в среднем около 5000 А (Евдокимов, 1999!. Этот результат хорошо согласуется с размером частиц дисперсий ДНК, определенным нами выше.

Величина коэффициента седиментации частиц дисперсии ДНК сос-

rt _1 -Э

тавляет ~ 14,3 х 10 х 10 с при СдНК —0.

Оценка молекулярной массы частиц дисперсии ДНК, основанная на приведенных выше результатах, показывает, что молекулярная масса одной частицы близка к 5 х 1010. Поскольку средняя молекулярная масса молекул ДНК, использованных для формирования дисперсии, составляла 0,? х 10 , можно считать, что в состав одной

4 •}

частицы дисперсии ДНК входят ~ 10-10 молекул ДНК.

Таким образом, сочетание результатов, полученных при помощи разных методов, свидетельствует о том, что молекулы ДНК образуют в ПЭГ-содержаших водно-солевых растворах дисперсии, средний диа-

метр частиц которых при Сдщ —" 0 составляет ~ 3000-5000 А; в состав одной частицы входят ~ 104-10J молекул ДНК.

Учитывая микроскопический размер частиц, образуемых молекулами ДНК, a priori нельзя утверждать, что они имеют жидкокристаллическую природу. Это связано с существованием "размерного эффекта", особенно заметного в случае жидких кристаллов (AdamczyK А., 1989), при котором упаковка молекул ДНК, в частицах дисперсии может отличаться от упаковки, характерной для жидких кристаллов ДНК. Вопрос о том, каким образом упакованы молекулы ДНК в частицах дисперсии становится актуальным.

Поскольку к началу работы прямые методы изучения молекулярной организации частей малого размера отсутствовали, для установления способа упаковки молекул ДНК нами совместно с В,А.Беляковым 1 Институт теоретической физики им, Л.Д.Ландау РАН! был использован теоретический расчет спектров Кд на основании предположения о наиболее вероятной модели упакоЕки молекул ДНК е частицах дисперсии и сопоставлении полученных теоретических результатов с экспериментально наблюдаемыми спектрами КД дисперсий ДНК. Основные положения (Ве1уакоу , 1996) предложенного подхода кратко изложены ниже.

1. Считается, что частицы дисперсий, образуемые линейными

молекулами ДНК низкой молекулярной массы 1< 1 х 10 ), представляют собой сферы диаметром Б, для которых, в силу жесткости двухце-почечной структуры молекул ДНК, характерно жидкокристаллическое упорядочение.

2. Дисперсии ДНК рассматриваются как поликристаллические объекты с произвольной ориентацией в пространстве индивидуальных частиц, имеющих собственное поглощение в УФ-области спектра, обусловленное наличием в составе молекул ДНК азотистых оснований,

3. Теоретический расчет принимает во внимание приведенные выие экспериментальные и литературные данные, а именно:

- размер частиц дисперсии ДНК составляет несколько тысяч ангстрем;

- каждая частица дисперсии обладает холестерической структурой, характеризуемой шагом Р, составляющим около нескольких микрон, и диэлектрической анизотропией 6, которая содержит резонансные составляющие на полосе поглощения азотистых оснований.

С учетом перечисленных выше положений было получено аналитическое выражение для коэффициентов прохождения р;! волн с левой Я) и правой !В) круговыми поляризациями. Пользуясь значениями этих коэффициентов при разных длинах волн, спектры КД дисперсий ДНК были рассчитаны теоретически.

'/-3- Теоретически рассчитанные и экспериментально наблюдаемые спектры КД дисперсия ДНК

На рис. 2 приведен рассчитанный теоретически спектр КД дисперсии ДНК. Видно, что в спектре КД присутствует интенсивная полоса, расположенная в области поглощения азотистых основании (хромофоров) ДНК = 270 нм). Эта полоса, так же как и по-

лоса в экспериментальном спектре КД тонкого слоя холестерической жидкокристаллической фазы ДНК '.Зрайа С.Р., 1988), имеет отрицательный знак и по своей форме аналогична форме полосы поглощения ДНК.

200 250 300 350 А,нм

Рис. 2 Теоретически рассчитанный спектр КД холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК.

ДА = А^ - А^ в мм; 1 мм = 2,5 х 10~5о.е.;

ДНК

10 мкг/мл; Г. = 1 см.

Таким образом, результаты теоретических расчетов свидетельствуют о том, что молекулы ДНК низкой молекулярной массы, в принципе, могут сформировать холестерический жидкий кристалл микроскопического размера. Следовательно, в случае образования в ПЗГ-содержащем водно-солевом растворе жидкокристаллической дисперсии ДНК, имеющей холестерическую структуру, следует ожидать появления з спектре КД интенсивной полосы.

Действительно, образование дисперсии в результате фазового

220 260 300 340 Л, им

Рис. 3 Спектры КД дисперсии ДНК, сформированной в ПЭГ-содержашем водно-солевом растворе (кривая 1), и водно-солевого раствора линейной двухцепочечнои Б-формы ДНК (кривая 2).

1 - правая ордината:

СПЭГ = 170 мг^мл' молекулярная масса ПЭГ 4000, 0,3 М МаС1 + 10"" м На-фосфатный буфер;

2 - левая ордината:

0,3 М ЫаС1 + 10~2 М На-фосфатный буфер.

исключения ДНК из водно-солевого раствора ПЭГ кр.

1 '"ПЭГ < *"ПЭГ ^ мг/мл' сопровождается появлением в спектре КД аномальной отрицательной полосы (рис. 3, кривая 1!, амплитуда которой во много раз превышает амплитуду полосы в спектре КД водно-солевого раствора линейной В-формы ДНК (рис. 3, кривая 2!. В полном соответствии с предсказанием теории, аномальная полоса распо-

ложека з области поглощения азотистых оснований ДНК, форма »той полосы аналогична форме полосы поглощения ДНК, а ее максимум смещен в область больших длин волн ~ 270-280 нм). Сочетание

мйКС .

отмеченных выше особенностей дает основание считать, что аномальная полоса, наблюдаемая в экспериментальном спектре КД, отражает холестерическии способ упаковки, реализуемый молекулами ДНК в частицах дисперсии.

На рис. 4 сопоставлены рассчитанные теоретически спектры КД холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК, имеющих левую (кривая 1! и правую (кривая 2) закрутку холестерической спирали. Изменение направления холестерической упаковки молекул ДНК в частицах жидкокристаллической дисперсии приводит к изменению отрицательного знака полосы на положительный; при этом форма спектра КД

А, нм

Рис. 4 Теоретически рассчитанные спектры КД холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК, имеющих леву» (кривая 1 ) и правую (кривая 2 ) закрутку холестерической спирали.

АА = А^ ~ Ag в мм; 1 мм = 2,5 х iü~J o.e.;

"ДНК = мкг/мл;

L = 1 см.

не меняется. Справедливость этого предсказания теории подтверждают экспериментальные данные, согласно которым в спектрах КД дисперсий, сформированных из правоспиральных синтетических двухцепо-чечных полинуклеотидов поли(с1А-с1Т> х поли(йА-йТ) и поли(<Ш х поли (ЙТ). имеющих одинаковую молекулярную массу, наблюдаются интенсивные и практически равные по амплитуде полосы разного знака. Учитывая проведенное выше рассмотрение причин появления аномалъ-

ной полосы в спектрах КД холестеричеекмх жидкокристаллических дисперсий ДНК, это означает, что из молекул поли(аА-йТ) х по-ли(йА-йТ> и поли(йА) х поли!йТ ) образуются холестерические жидкокристаллические дисперсии,, имеющие, соответственно, левую и правую закрутку холестерической спирали. Этот результат показывает, что небольшие изменения в структуре двухцепочечных молекул ДНК оказываются достаточными для того, чтобы левос-пиральная упаковка молекул в частицах жидкокристаллической дисперсии сменилась на правоспиральную.

Результаты теоретических расчетов свидетельствуют также о том, что в случае холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК имеет место "размерный эффект". Эффект состоит в том, что если диаметр частиц жидкокристаллической дисперсии ДНК составляет

- 500 А, то амплитуда аномальной полосы в спектре КД уменьшается настолько, что ее уже нельзя отличить от величины амплитуды полосы в спектре КД, характерном для изотропного водно-солевого раствора линейных молекул ДНК !рис. 3, кривая 2). Это означает, что факт образования холестерической жидкокристаллической дисперсии

ДНК, частицы которой имеют диаметр ~ 500 А, невозможно зарегистрировать при помоши КД-спектроскопии. Аналогичная ситуация имеет место в том случае, когда величина шага холестерической структуры жидкокристаллической дисперсии ДНК превышает ~ 30 мкм.

Таким образом, приведенные выше результаты теоретических расчетов и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что описанная выше схема конденсации нуклеиновых кислот (рис, 1) обеспечивает при соблюдении "граничных" условии формирование жидкокристаллических дисперсий, в частицах которых молекулы ДНК реализуют свое потенциальное стремление к холестерическому способу упаковки.

ЧЛ. Оценка параметра порядка молекул поли(Х) х поли(С), образующих холестерическую жидкокристаллическую дисперсию

Поскольку для биологических объектов характерна достаточно высокая стабильность в широком интервале условий, возникает вопрос об устойчивости холестерической структуры жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот по отношению к

внешним воздействиям. В качестве такоя характеристики используют параметр дальнего ориентационнсго порядка (3), аналитическое выражение которого имеет следующий вид:

(Зсой2вг, - 1 )

3 = -2--; 1 1

где: 8 - угол между длинной осью молекулы и направлением "директора" квазинематического слоя.

На примере холестерической жидкокристаллической дисперсии молекул двухцепочечного синтетического полирибонуклеотида поли(1) х поли*С>, для оценки величины 3 была применена методика, основанная на определении температурной зависимости амплитуды аномальной полосы в спектре КД (Прохоров В.В., 1985). Оценка показала, что параметр порядка молекул поли(1) х поли(С) составляет приблизительно 0,8. Полученный результат, во-первых, показывает, что молекулы двухцепочечных нуклеиновых кислот упаковываются в частицах холестерических жидкокристаллических дисперсий практически параллельно друг другу и, несмотря на флуктуации, стремятся ориентировать свои длинные оси преимущественно в одном направлении в любой момент времени. Во-вторых, высокое значение параметра порядка свидетельствует также о том, что холестерическая структура жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот обладает высокой стабильностью в широком интервале условий и холестерический способ упаковки двухцепочечных нуклеиновых кислот сохраняется вплоть до их денатурации.

У-5. Кинетика формирования холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК

Для выяснения кинетических деталей механизма холестерическо-го упорядочения молекул ДНК в частицах дисперсий использовали метод их формирования, исключавший перемешивание водно-солевых растворов ДНК и ПЭГ (Скуридин С.Г., 1985).

Показано, что процесс формирования холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК., происходящий в ПЭГ-содержашем

растворе после нейтрализации отрицательных зарядов фосфатных групп ДНК противоионами, описывается в рамках уравнения Колмого-ва-Аврами и является, как минимум, двухстадийным. На первой стадии происходит образование жидкокристаллической дисперсии ДНК, не обладающей аномальной оптической активностью. Эта стадия может быть следствием двух причин. Во-первых, она может отражать формирование частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии,

диаметр которых не превышает 500 к, вследствие чего, согласно приведенным выше теоретическим оценкам, их аномальные оптические свойства еще нельзя зарегистрировать при помощи КД-спектроскопия. Во-вторых, эта стадия может отражать образование нематической жидкокристаллической дисперсии ДНК, не обладающей в силу своей структурной организации аномальной оптической активностью. Вторая стадия связана либо с увеличением размера частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, либо со спиральной закруткой слоев при дальнейшем сближении соседних молекул ДНК. Эта стадия сопровождается формированием холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, для которой характерно наличие интенсивной отрицательной полосы в спектре КД.

Тот факт, что кинетические параметры, характеризующие образование жидкокристаллических дисперсий из молекул поли(йА) х поли! dT) и поли(йА-<Ш х поли(йА-йТ), имеющих, как было отмечено выше, разные знаки интенсивных полос в спектрах КД, практически не отличаются, показывает, что формирование холестерических жидкокристаллических дисперсий, различающихся направлением пространственной закрутки холестерической спирали, происходит по весьма близким механизмам,

4.6. Стабилизация оптических свойств частиц холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК

Изучение оптических свойств жидкокристаллических дисперсий ДНК показало, что при концентрациях ПЭГ, превышающих 180 мг/мл, аномальная полоса в спектре КД уменьшается и при СПЭГ 220-240 мг/мл ее амплитуда становится уже близкой к нулю, хотя дисперсии ДНК, рассеивающие УФ-иэлучение, в этих условиях по-прежнему образуются.

ОщьА

Рис. 5 Зависимость от среднего расстояния между осями

молекул ДНК , А) в образуемых ими жидкокрис-

таллических фазах.

Для выяснения причин исчезновения аномальной оптической активности в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий ДНК их оптические свойства были сопоставлены с величинами брэгговских рефлексов (<%рэгг'' характерных для жидкокристаллических фаз, сформированных в результате концентрирования частиц жидкокристаллических дисперсий ДНК при помоши низкоскоростного центрифугирования. Поскольку увеличение концентрации ПЭГ в растворе эквивалентно увеличению его осмотического давления, данные рентгеногра-

фического анализа представлены в координатах 1®П (П, дин/см -

осмотическое давление» - (А) (рис. 5). Стрелками на оси

ординат рис. 5 показаны нижняя = 95 мг/мл) и верхняя

1СПЗГ = 220 мг/мл) границы области концентраций ПЭГ, в которой из молекул ДНК формируются холестерические жидкокристаллические дис-

Персии, обладающие аномальной оптической активностью. Если учесть, что для возникновения аномальной оптической активности требуется не только высокая локальная концентрация ДНК, но и пространственное спиральное расположение этих молекул, то можно сказать, что аномальная оптическая активность у жидкокристаллических дисперсий ДНК возникает только при определенных свойствах растворителя, в частности, при определенном его осмотическом давлении. Весьма вероятно, что "узнавание" соседних молекул ДНК, еопровож-

даемое их закруткой, начинается на расстояниях, близких к 45 А, поскольку рис. 5 показывает, что именно при таких расстояниях у дисперсий ДНК появляется аномальная оптическая активность.

Рис. 5 показывает, что при осмотическом давлении растворите-7 2

ля ~ 10 дин/см (1§П ~ 7) наблюдается изменение характера зависимости 1®П от В11Г(. . Судя по рентгенографическим данным, при малых расстояниях < 30 А) молекулы ДНК в составе жидкокристаллических фаз, а, следовательно, и в частицах жидкокристаллических дисперсий, находятся в упорядоченном состоянии, однако эти дисперсии не обладают аномальной оптической активностью. Этот результат показывает, что в частицах дисперсии вместо холестеричес-кой возникает нематическая или гексагональная упаковка.

Таким образом, при практически монотонном увеличении осмотического давления растворителя, сопровождающем увеличение концентрации ПЭГ в растворе, происходит не только фазовое исключение молекул ДНК, но и смена механизма их пространственной упаковки. Из этого вывода следует принципиально важное заключение, а именно , открывается возможность для изменения характера упаковки соседних молекул нуклеиновой кислоты в частицах уже сформированной жидкокристаллической дисперсии, в частности, для перехода типа "гексагональная упаковка —► холестерическая упаковка".

Приведенные в этой главе диссертации данные позволяют сделать вывод, согласно которому структурная организация частиц дисперсий ДНК в целом аналогична структуре жидкокристаллических фаз ДНК. Это означает, что на уровне жидкокристаллических дисперсий ДНК должно проявляться действие тех же факторов, которые управляют структурой лиотропных жидких кристаллов. Следовательно, можно ожидать, что, меняя свойства растворителя или свойства молекул ДНК, мояио управлять пространственной укладкой молекул ДНК в час-

тицах жидкокристаллических дисперсия.

Считывая тот факт, что характер упаковки молекул ДНК в жидкокристаллических дисперсиях определяется в момент "узнавания" молекул ДНК, можно высказать предположение о двух принципиальных способах управления характером пространственной упаковки молекул ДНК. Согласно первому способу, характером упакоЕки молекул ДНК можно управлять в результате изменения параметров вторичной структуры двухцепочечных молекул ДНК до их конденсации. Согласно второму способу, характером упаковки молекул ДНК можно управлять после их конденсации в тех случаях, когда образующаяся дисперсия характеризуется упорядоченной упаковкой соседних молекул ДНК, отличающейся от холестерической,

Глава 71. УПРАВЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ УКЛАДКОЙ МОЛЕКУЛ ДНК В ЧАСТИЦАХ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИИ

VI.1. Возможность изменения пространственной укладки молекул полимеров в лиотролных зшдких кристаллах: теория

Согласно теории (0г1роу М.А., 1985), угол спиральной закрутки (а) квазинематических слоев холестерического жидкого кристалла зависит от соотношения между диэлектрической постоянной растворителя и, соответственно, продольной и поперечной компонентами диэлектрической проницаемости молекул полимера, а также температуры раствора. Это соотношение в общем виде можно представить как:

а - А.Г(еп/Бт; ех/ет) - КТВ 12)

где: ет - диэлектрическая постоянная растворителя; е,, и е - соответственно, продольная и поперечная компоненты диэлектрической проницаемости молекулы полимера;

Т - температура.

Выражение (2) позволяет сделать следующий вывод: если зафиксировать значения любых двух из трех упомянутых выше параметров <е ; е,, и ех; Т), то изменение величины третьего параметра может не только обратить при достижении им некоторого "критического"

значения угол а в нуль, но и заставит его поменять свои знак. Это означает, что в зависимости от условий из одних и тех же молекул можно сформировать два типа холестериков, различавшихся знаком угла а (а < 0 или а > 0), а, следовательно, и направлением пространственной спиральной закрутки, и нематик (« - 0).

Таким образом, в случае лиотропных жидких кристаллов полимеров, в том числе и ДНК, имеется принципиальная возможность для реализации перехода холестерик(_! —^ нематик —холестерик( + ), т.е. свойствами жидких кристаллов можно управлять при помощи относительно простых факторов. Если принять представление о существовании холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК, то выводы теории можно проверить экспериментально.

VI.2. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсии ДНК в результате изменения диэлектрической постоянной растворителя

На рис. 6 приведена зависимость амплитуды полосы в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий ДНК, сформированных в водко-со-левых растворах ПЭГ, от объемной концентрации изопропанола. В соответствии с предсказанием теории, изменение диэлектрической постоянной (ет) водно-солевого раствора ПЭГ сопровождается изменением знака аномальной полосы в спектре КД с отрицательного на положительный. Смена знака полосы в спектре КД происходит при объемной концентрации изопропанола, превышающей 20 %.

Оценка величины диэлектрической постоянной растворителя, соответствующей условиям, при которых амплитуда полосы в спектре КД жидкокристаллической дисперсии ДНК обращается в нуль {"критическое" значение = £„ , показала, что величина е_ лежит в поедена к ш

лах от 60 до 67.

Можно утверждать, что при величине в пределах от 80 до 60 из правоспиральных молекул ДНК можно сформировать жидкокристаллические дисперсии с левой закруткой холестерической спирали, для которых характерен спектр КД, имеющий интенсивную отрицательную полосу; при величине е , близкой к 60, из молекул ДНК будет формироваться жидкокристаллическая дисперсия, не обладающая аномальной оптической активностью; при величине е ниже 60 из правоепи-

лл £ ¿.

об.%

Рис. 6 Зависимость амплитуды полосы !Дб270! в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий ДНК, сформированных в водно-солевых растворах ПЭГ, от объемной концентрации изопропанола.

С'ПЭГ = 150 мг/'мл,

мол. масса ПЭГ 4000; 0,3 М ИаС1 + 10~2 М Ыа-фос-фатный буфер.

ральных молекул ДНК будут формироваться жидкокристаллические дисперсии ДНК с правой закруткой холестерической спирали, характеризуемые спектром КД с интенсивной положительной полосой. Смена знака полосы в спектре КД жидкокристаллических дисперсий ДНК отражает смену направления закрутки их пространственной структуры.

Таким образом, приведенные в этом разделе диссертации данные свидетельствуют о том, что направление пространственной спиральной закрутки жидкокристаллических дисперсий ДНК в водно-солевых растворах ПЭГ зависит так я®, как и в случае лиотропных жидких кристаллов полимеров в органических растворителях, от диэлектрической постоянной раствора.

VI.3. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий поли(I) х поли< С) при помощи температура

Нагревание жидкокристаллической дисперсии полиИ) х поли(С),

с&овмированной при определенных условиях •Спог = 170 ыг/мл. молекулярная масса ЯЭГ 4000; 1,3 Ы НаСЛ * 10 М На-фоефатный буфер!, приводит, в соответствии с выражением (2), к смене знака интенсивной полосы в спектре КД с отрицательного на положительный, причем амплитуда этой полосы при некоторой "критической" температуре (Т.., ; Т.._ < Т_,- полиЯ) х поли(О) обоашается в нуль.

4- лр. 11Д. ' • '

Наличие одномерного порядка в сочетании с анизотропией оптических свойств тонких слоев жидкокристаллической фазы поли(1) х поли(С) и наличием интенсивных полос разного знака в спектрах КД при температурах выше к ниже "критической" дают основание считать, что холестерические жидкокристаллические фазы, а, следовательно, и жидкокристаллические дисперсии правоспиральных молекул поли(1) х поли(С), образующиеся в этих условиях, различаются направлением пространственной спиральной закрутки.

VI-4. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий ДНК при помощи биологически активных соединении

Направленное изменение структурных параметров двухцепочечных молекул ДНК, т.е. изменение соотношения Е(|/е , при взаимодействии с противоопухолевым антибиотиком антрациклиновой группы -дауномицином, сопровождается изменением знака интенсивной полосы в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий, формируемых при стандартных условиях из молекул комплексов (ДНК-дауномицин), с отрицательного на положительный.

Приведенные в этом разделе диссертации данные поляризационной микроскопии показывают, что в области концентраций дауномици-на - 8 х 10 М величина шага спиральной структуры холестерика комплекса (ДНК-дауномицин) "стремится" в бесконечность. В области концентраций дауномицина, находящихся справа и слева от этой концентрации, из молекул комплексов (ДНК-дауномицин! формируются холестерические жидкие кристаллы, характеризуемые аномальной оптической активностью разного знака, т.е. из молекул комплексов (ДНК-дауномицин) можно сформировать два типа холестерических жидких кристаллов (жидкокристаллических дисперсии), различающихся направлением пространственной спиральной закрутки, и нематические

лидкие кристаллы (ждкокристаллические дисперсии).

Следовательно, изменение структурных параметров ЛНК при взаимодействии с биологически активными соединениями может выступать в качестве фактора управления пространственной структурой жидких кристаллов и жидкокристаллических дисперсий, хотя вопрос о тонких деталях такого управления остается открытым.

Таким образом, данные, приведенные в разделах VI.2.-VI.4. диссертации, свидетельствуют о том, что диэлектрические свойства растворителя и молекул ДНК, а также температура, являются факторами, определяющими способ пространственной укладки молекул ДНК не только в жидких кристаллах, но и в частицах жидкокристаллических дисперсий. Можно ожидать поэтому, что модификация азотистых оснований под действием химических агентов или физических факторов окажется достаточной для изменения аномальной оптической активности жидкокристаллических дисперсий, формируемых из модифицированных молекул ДНК.

VI.5. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий ДНК при помоши химических агентов и физических факторов

На рис. 7А спектр КД холестерической жидкокристаллической дисперсии исходных молекул ДНК (кривая 1 ) сопоставлен со спектрами КД жидкокристаллических дисперсий, сформированных из молекул ДНК, обработанных цис-дихлородиамминплатиной (II! (цис-РЫ II ); кривые 2-4). По мере увеличения степени связывания цис-Р1:(11) с азотистыми основаниями ДНК амплитуда интенсивной полосы в спектре КД, характеризующая исходную холестерическую дисперсию ДНК (кривая 1), уменьшается (кривые 2-3) и при г^. = 0,1 интенсивная полоса в спектре КД отсутствует (кривая 4).

Зависимость, приведенная на рис. 7Б, показывает, что связывание одного атома Р1; приблизительно на 100 пар оснований ДНК оказывается достаточным для нарушения оптических свойств холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, т.е. пространственная организация жидкокристаллических дисперсий ДНК легко "откликается" в ответ на незначительную степень их модификации.

Исчезновение интенсивной полосы в спектре КД жидкокристалли-

£Е

-20

-W -fff

-ffff

а. _

v/ ~ 1 1 1 -1-1-1 _1_ lí-ljl

Рис. 7 А-

140 200 J20 Л, мм

Спектры КД жидкокристаллических дисперсий, сформированных в ПЭГ-содержадах водно-солевых растворах из исходных (1) и модифицированных цис-РгШ) молекул ДНК (2-4).

1 - г

rt = 0,01;

= 0;

3 - rt = 0,03; 4 - = 0,1 . Зависимость относительной амплитуды отрицательной полосы в спектре КД = 270 нм) жидкокристаллических дисперсий ДНК, образованных в ПЭГ-содержа-щих водно-солевых растворах из модифицированных цис-PtfII> молекул ДНК, от величины rt.

молекулярная масса ПЭГ 4000; 0,5 М NaC104. rt - отношение молярной концентрации цис-PtdI) к молярной концентрации нуклеотидов ДНК в растворе.

СПЭГ = иг/ил,

ческой дисперсии, происходящее при модификации молекул ДНК, может быть следствием, как минимум, двух причин. Во-первых, как было показано выше, изменение структурных параметров ДНК может сопровождаться такими .изменениями диэлектрических свойств этих моле-

кул, при котором вместо ходестерическоя может образоваться нема-тическая жидкокристаллическая дисперсия ДНК. Во-вторых, не исклв-чено, что модификация молекул ДНК приводит к такому изменению их свойств, при котором из молекул ДНК начинают формироваться "неклассические" жидкие кристаллы (Хохлов А.Р., 1986).

Анализ особенностей кривых рассеяния рентгеновских лучей на жидкокристаллических фазах, образованных из исходных и модифицированных цис-Р1;( II1 молекул ДНК, свидетельствует о том, что степень упорядочения молекул ДНК в образующихся фазах уменьшается по мере увеличения степени их модификации при сохранении общего упорядоченного характера укладки молекул ДНК в жидкокристаллических фазах (дисперсиях).

На рис. 8А приведена текстура тонкого слоя жидкокристаллической фазы, образованной из исходных молекул ДНК (естественный свет). Наличие текстуры "отпечатков пальцев" свидетельствует о том, что молекулы исходной ДНК образуют холестерическую жидкокристаллическую фазу. Величина шага спиральной структуры холесте-рика составляет 2,7-3,0 мкм. Модификация азотистых оснований ДНК под действием цис-Р1'И) сопровождается уменьшением шага формируемых из них холестерических жидких кристаллов. В частности, при г^ = 0,01 величина Р составляет не 2,7-3,0 мкм, как в случае исходных молекул ДНК, а 1,5-1,9 мкм. Более глубокая модификация азотистых оснований цис-РКИ) (г^ = 0,1) приводит к образованию жидкокристаллической фазы ДНК, для которой характерна текстура, названная нами "капельной" (рис, 8Б) ("капельная" текстура не обнаруживает никакой оптической анизотропии при ее наблюдении между скрещенными николями; фаза оптически изотропна).

Наличие текстуры, наблюдаемой только в естественном свете, показывает, что молекулы ДНК образуют необычную жидкокристаллическую фазу, а, следовательно, и амдкокристаллическую дисперсию, свойства которой существенно отличаются от свойств классических жидких кристаллов: холестерических или нематических.

Аналогичный "уход" интенсивной полосы в спектре КД жидкокристаллических дисперсий ДНК отмечен при модификации структуры ДНК в результате образования тиминовых димеров под действием УФ-излучения, а также при фотохимической модификации ДНК в результате комбинировнного действия УФ~облучения и гипофосфита

Рис. в Оптические текстуры тонких слоев 30 мкм) жидкокристаллических фаз, сформированных в ПЭГ-содержащем водно-солевом растворе из исходных (А) и модифицированных цис-Р-ИП) (Б) молекул ДНК.

(Естественный свет) А - текстура "отпечатков пальцев", г^ = О; Б - "капельная" текстура, гъ = 0,1.

Отметка на рисунке соответствует 10 мкм. СПЭГ = ^^ мг,/мл' молекулярная масса ПЭГ 4000; 0,3 М МаС104.

натрия.

Возможность управления укладкой молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсии при изменении структурных параметров ДНК или свойств растворителя делает эти дисперсии привлекательными с биологической точки зрения.

Поскольку жизнедеятельность клетки зависит от ионного гомео-стаза внутриклеточной среды, определяемого содержанием таких

ионов, как К+, Na4", Са^ и др., представляло интерес иссле-

довать влияние ионного состава растворителя на эффективность образования и свойства жидко кристаллических дисперсий двухцепочеч-ных молекул ДНК.

VI-б. Влияние катионного состава растворителя на эффективность образования жидкокристаллических дисперсий ДНК и характер упаковки молекул ДНК в частицах этих дисперсий

Приведенные в этом разделе диссертации данные, характеризующие эффективность образования жидкокристаллических дисперсий ДНК в ПЭГ-содерзкащих растворах хлоридов щелочных металлов, свидетельствуют о том, что с наибольшей эффективность» этот процесс происходит (при Фиксированной концентрации ПЭГ) в растворе НаС1. По аналогии с высаливанием молекул полифосфатов из растворов солей щелочных металлов (Strauss U.P., 1958), полученный результат можно объяснить, как следствие характерной для ионов Na+ высокой эффективности экранировки отрицательно заряженных фосфатных групп, способствующей несовместимости полинуклеотидной цепи ДНК, с растворителем.

При фиксированной концентрации ПЭГ переход молекул ДНК из изотропного в жидкокристаллическое состояние можно осуществить в результате изменения катионного состава растворителя без изменения общей концентрации катиона в растворе. Показано, что замена ионов К на ионы Na (К —Na ) приводит к образованию холесте-рической жидкокристаллической дисперсии ДНК, обладающей аномальной оптической активностью, тогда как обратная замена (Ма+ —»- К+> сопровождается переходом молекул ДНК из жидкокристаллического в изотропное состояние.

Таким образом, меняя катионный состав растворителя, можно управлять процессом перехода молекул ДНК из изотропного в жидкокристаллическое состояние и, наоборот, из гшдкокристаллического в изотропное.

Сопоставление данных, характеризующих эффективность образования жидкокристаллических дисперсий ДНК в ПЗГ-соде.ржаших растворах NaCl и MgCl9, выявило значительные отличия между ''критически-

+ 0 +

ми" концентрациями ионов На и М^ , необходимыми для перехода молекул ДНК из изотропного в жидкокристаллическое состояние. При фиксированной концентрации ПЭГ (например, при С^г = 170 мг/мл; ^ПЭГ "критические" концентрации НаС1 и М§С12 составляют,

соответственно, 0,15 и 0,003 М, Этот результат свидетельствует о том, что в ПЭГ-содержащэм растворе экранировка отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК ионами осуществляется более эффективно, чем в случае ионов На1".

Неожиданной особенностью жидкокристаллических дисперсий ДНК, образующихся в М§С12-содерасаших растворах ПЭГ, оказалось наличие в их спектрах КД не отрицательной, а положительной аномальной полосы. Разный знак полос в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий ДНК, сформированных в НаС1- и М£»С19-со держащих растворах ПЭГ, дает основание считать, что характер взаимодействия между молекулами ДНК, нейтрализованными, соответственно, ионами Иа и различен. Такое различие оказывается достаточным условием для формирования двух семейств жидкокристаллических дисперсий ДНК, различающихся знаком аномальной оптической активности, т.е. направлением закрутки холестерической спирали.

В диссертации показано, что направление закрутки холестери-

ческой спирали определяется соотношением между ионами Ыа и М® ,

присутствующими в ПЭГ-содержашем растворе. При соотношении +■ о+

Иа /Мег > 4 образуются жидкокристаллические дисперсии ДНК, для которых характерна левая, а при соотношении На Мдг < 4 - правая закрутка холестерическои спирали.

+ 9+

Таким образом, меняя соотношение На /Ы§ в растворе, можно управлять характером пространственной укладки молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий.

Глава VII. "ПЕГ-ПОДОБНАЯ СИТУАЦИЯ" В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

В этой главе приведены литературные данные, свидетельствующие о том, что образование компактной формы ДНК, предшествующее формированию зрелой фаговой частицы в клетках бактерий, имеет много общего с формированием жидкокристаллических дисперсий ДНК. В клетках Е.соН водорастворимые полипептиды, не образующие ком-

плексы с ДНК, создают условия, аналогичные условиям, при которых в водно-солевом растворе ПЭГ происходит фазовое исключение молекул ДНК. Именно такая ситуация была названа "ПЭГ-подобной" ("PEGlike situation"; Laermnll U.K., 1974).

Глава VIII. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФАЗЫ И ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ДИСПЕРСИИ КОМПЛЕКСОВ ДНК С СИНТЕТИЧЕСКИМИ И ПРИРОДНЫМИ ПОЛИКАТИОНАМИ

VIII.1. Условия образования и свойства жидкокристаллических фаз и жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) в водно-солевых растворах

В этом разделе диссертации приведены экспериментальные данные о конденсации молекул ДНК в водно-солевых растворах в результате притяжения между молекулами ДНК, фосфатные группы которых нейтрализованы поликатионом - поликонидином.

Средний диаметр частиц дисперсия комплекса (ДНК-поликонидин)

составляет ~ 6000 А.

Между ионной силой раствора и концентрацией поликонидина, необходимой для конденсации ДНК, имеется определенная связь. С ростом концентрации NaCl содержание линейной формы ДНК в супер-натанте, полученном в результате низкоскоростного центрифугирования водно-солевых растворов дисперсий комплексов ( ДНК-поликонидин ), сформированных при разных концентрациях NaCl, увеличивается, и при > 0,55 M оно составляет ~ 100 %, т.е. комплекс 1ДНК-поликонидин) не образуется.

Теория (Shlndler Т., 1997) поедсказывает существование "кри-

кр.

тической" концентрации соли "-0,56 M), при которой силы

отталкивания между молекулами ДНК и поликатиона преобладают над силами их взаимного притяжения. В этих условиях комплекс (ДНК-поликатион! диссоциирует. Экспериментальное значение величины "критической" концентрации NaCl, определенное нами 0,55 М), хорошо кр.

согласуется с предсказанной теоретически.

Предполагая возможность изменения расстояния между молекулами ДНК и поликатиона, можно ожидать разной плотности упаковки мо-

лекул ДНК в фазах комплексов IДНК-поликонидин), сформированных при разных концентрациях НаС1. Данные рентгенографического анализа Фаз комплексов (ДНК-поликонидин) показывают, что в области СМаП от 0,35 до 0,3 м величина ¡%рЗГГ меняется в пределах от

25,5 до 26,1 А, При концентрации МаС1, превышающей 0,4 М, величи-

на <%рЭГГ резко возрастает и при СМаС1 = 0,5 М составляет 35,1 А.

Таким образом, концентрация ЫаС1 выступает в качестве фактора, регулирующего расстояние между молекулами ДНК и поликонидина, влияя на плотность упаковки молекул ДНК в фазах и дисперсиях комплексов (ДНК-поликонидинI.

Весовая концентрация ДНК в фазе комплекса !ДНК-поликонидин) уменьшается от ~ 428 мг/мл (0,15 М МаС1) до ~ 226 иг/ил (0,5 М МаС1). Сопоставление этих данных с фазовыми диаграммами, отражающими полиморфизм жидкокристаллических фаз линейных, несвязанных в комплексы ДНК (П\ю1ап1 Р., 1996; РойцогШк Е., 1996!, позволяет предположить, что и в нашем случае разные концентрации ДНК в фазах комплексов (ДНК-поликонидин! соответствуют разным типам жидкокристаллических фаз (дисперсий): в пределах 0,15 М « < 0,4 М существует гексагональная жидкокристалли-

ческая фаза (дисперсия), а при 0,4 М $ сМаС1 < °'55 М - холесте-ричеекая жидкокристаллическая фаза (дисперсия). Последняя фаза (дисперсия) в силу особенностей пространственной организации должна обладать аномальной оптической активностью.

Действительно, при 0,4 М ^ °>55 М в спектрах КД

жидкокристаллических дисперсии комплексов (ДНК-поликонидин) присутствует интенсивная отрицательная полоса (рис. 9), Появление интенсивной отрицательной полосы в спектре КД доказывает образование жидкокристаллической холестерической структуры дисперсии комплекса (ДНК-поликонидин). Аналогичная ситуация имеет место в присутствии другого синтетического поликатиона - 2,5-ионена, химическая структура которого отличается от химической структуры поликонидина.

Согласно высказанному предположению, увеличение ионной силы раствора сопровождается уменьшением временем жизни молекул поликонидина вблизи поверхности ДНК. Это приводит к тому, что эффективность связывания соседних молекул ДНК молекулами поликонидина уменьшается, расстояние между молекулами ДНК увеличивается и

[ №С1 ], М

Рис. 9 Зависимость максимальной амплитуда отрицательной макс.

полосы ) в спектрах КД жидкокристаллических

дисперсий комплексов (ДНК-поликонидин), сформированных в растворах с разным содержанием МаС1, от концентрации ЫаС1.

у них появляется возможность реализовать свое потенциальное стремление к холестерической упаковке. Такой механизм возникновения холестерического жидкокристаллического состояния ДНК может реализовываться в узком интервале условий, определяемом как структурой ДНК и поликатиона, так и ионной силой и катионным составом растворителя, что может иметь важное биологическое значение.

Таким образом, приведенные в этом разделе диссертации данные свидетельствуют о полиморфизме жидкокристаллических фаз и жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион), образующихся в условиях, отвечающих осмотическому давлению водных

растворов NaCl

VIII.2. Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-полмкатион) при помовд биологически активных соединений

Жидкокристаллический характер упаковки молекул комплексов (ДНК-поликонидинÍ в частицах дисперсий, сформированных при CNar'l < 0,4 в сочетании с отсутствием у них аномальной оптической активности послужили основанием для постановки опытов по управлению характером упаковки молекул ДНК в частицах этих дисперсий под действием биологически активных соединений.

Для этого жидкокристаллическая дисперсия, сформированная в водно-солевом растворе умеренной ионной силы (при < 0,4 М)

из молекул комплексов (ДНК-поликатион), была помещена в полимер-содержащий растворитель, "задающий" за счет своего осмотического

давления другое (большее, чем 30 к) расстояние между соседними молекулами ДНК. В этих условиях между двумя ее возможными структурными (а, следовательно, и оптическими) состояними возникает "конфликт". С одной стороны, жесткие оптически активные молекулы ДНК стремятся в данном растворителе перейти в холестерическое жидкокристаллическое состояние, для которого характерна аномальная оптическая активность. С другой стороны, наличие поликатионовых "сшиеок" препятствует этому переходу. Поэтому, жидкокристаллическая дисперсия комплексов (ДНК-поликатион), помещенная в по-лимерсодержащии растворитель, не обладает аномальной оптической активностью. Это означает, что "удаление" тем или иным способом молекул поликатиона (в том числе и образующих межмолекулярные "сшивки") из состава комплекса íДНК-поликатион) должно привести к увеличению расстояния между соседними молекулами ДНК, а, следовательно, к пространственной перестройке.

"Удаление" молекул поликатиона, образующего как внутри-, так и мезшолекулярные комплексы с ДНК, из состава комплекса (ДНК-поликатион) вызывали при помощи полианиона, способного конкурировать с молекулами ДНК за молекулы поликатиона. В качестве полианиона использовали гепарин - природный полианион, способный к образованию комплексов со многими белковыми и синтетическими

sx. Ш

-2

- -20

- -¿0

- -60

-80

240 260 280 300 320

Л. нм

Рис. 10 Спектры КД водно-солевых (О Л О М НаС1! растворов ДНК, (кривая 1) и комплекса (ДНК-поликонидин) (кривая 2, г = 0,91), а также их ПЗГ-содержашх водно-солевых

1СПЗГ = 170 мг/мл> 0,225 М МаС1) растворов до (соответственно, кривые 3, 4) и после (соответственно, кривые 5, 5! обработки гепарином. Кривые 1 и 2 - левая ордината. Массовое соотношение гепа-рин/поликонидин = 0,998. Величина г - отношение молярной концентрации положительно заряженных групп молекул по-ликоиидина к молярной концентрации отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК.

соединениями поликатионной природы. Кроме того, поликонидин обладает ярко выраженным антагонизмом к гепарину (Ефимов B.C., 1962) и конкурирует с молекулами ДНК при образовании комплекса с поликонидином,

В соответствии с высказанной выше гипотезой, сформированная в водно-солевом (0,15 М НаС1) растворе жидкокристаллическая дисперсия комплекса (ДНК-поликонидин) была помещена в водно-солевой раствор ПЭГ 'СПЭГ = мг/мл) и обработана гепарином.

На рис. 10 приведены спектры КД водно-солевых растворов ДНК (кривая 1) и жидкокристаллическои дисперсии комплекса (ДНК-поликонидин i (кривая 2), а также их ПЗГ-содержащих водно-солевых растворов до (соответственно, кривые 3 и 4) и после (соответственно, кривые 5 и 6) обработки гепарином. Жидкокристаллическая дисперсия комплекса (ДНК-поликонидин) не обладает аномальной оптической активностью как в водно-солевом (кривая 2), так и в ПЭГ-содержащем (кривая 4) растворе. Обработка гепарином жидкокристал-

20, градусы

Рис. 11 Кривые малоуглового рассеяния рентгеновских лучей на жидкокристаллической фазе комплекса (ДНК - поликонидик• (г = 0,91 ) до (кривая 1 } и после (кривая 3) обработки гепарином (массовое соотношение гепарин/по-ликонидин = 0,998). Кривая 2 - кривая рассеяния рентгеновских лучей на холес-терической жидкокристаллической фазе ДНК.

лической дисперсии комплекса (ДНК-лоликонидин) в условиях водно-солевого раствора ПЭГ сопровождается появлением интенсивной отрицательной полосы в спектре КД (рис. 10, кривая 6), амплитуда которой близка по своей величине к амплитуде отрицательной полосы, характерной для холестерической жидкокристаллической дисперсии несвязанных в комплекс молекул ДНК (кривая 3). Следует отметить, что добавление гепарина в раствор ПЭГ, содержащий частицы холестерической жидкокристаллической дисперсии, сформированной из исходных линейных молекул ДНК, не влияет на ее аномальные оптические свойства (ср. кривые 3 и 5 на рис. 10). Увеличение амплитуды полосы в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса (ДНК-поликонидин) после добавления гепарина свидетельствует о том, что пространственная организация молекул ДНК в ее частицах меняется.

Действительно, рис. 11 свидетельствует о том, что в присутствии гепарина наблюдается не только смещение положения максимума на кривой рассеяния в сторону меньших углов (среднее расстояние

между молекулами ДНК, характеризуемое величиной йср„гг, увеличивается от 26,74 до 32,93 А), но и ее уширекие (ср. кривые 1 и 3 на рис. 11). При этом, кривая 3 практически не отличается от приведенной на рис. И, в качестве контроля, кривой рассеяния рентгеновских лучей на холестерической жидкокристаллической Фазе ДНК (кривая 2). Изменения рентгенографических параметров жидкокристаллической фазы комплекса (ДНК-поликонидин> доказывает перестройку ее структурной организации под действием гепарина. В пользу этого вывода свидетельствуют также оптические текстуры тонких слоев жидкокристаллической фазы комплекса (ДНК-поликони-дин) до и после ее обработки гепарином (рис. 12): вместо "неспецифической" текстуры (А) наблюдается текстура "отпечатков пальцев" (Б), характерная для холестерических жидких кристаллов.

Таким образом, обработка Физиологически важным полианионом -гепарином частиц жидкокристаллической дисперсии, сформированной из молекул комплекса (ДНК-поликонидин), сопровождаемая "удалением" части молекул поликонидина из состава исходного комплекса, индуцирует в условиях ПЗГ-содержаиего раствора перестроение пространственной организации молекул ДНК в частицах дисперсии.

Важный вывод, следующий из приведенных выше данных, состоит в том, что характером пространственной упаковки молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий можно управлять при помощи биологически активных соединений.

Развивая гипотезу о возможности управления пространственной укладкой молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) при помощи биологически активных соединений, был реализован еще один подход к такому управлению. Этот подход основан на добавлении в полимерсодержащий раствор жидкокристаллической дисперсии комплекса (ДНК-поликатион) биологически активного соединения, способного вызывать не конкурентное связывание молекул поликатиона, а их разрушение.

При реализации этого подхода интерес представляют природные поликатионы, в частности, стеллины - небольшие, богатые основными аминокислотами ядерные белки (протамины) из гонад севрюги (Ас1регшег stellatus), химическая структура и физико-химические свойства которых хорошо изучены (Рыбин В.К., 1979). Протамины легко разрушаются при ферментативном гидролизе под действием

л.

Рис- 12 Наблюдаемые в поляризованном свете оптические текстуры тонких слоев (~ 20 мкм) жидкокристаллической фазы комплекса (ЖК-поликонидин 1 (г = 0,91) до (А) и после (Б) обработки гепарином (массовое соотношение гепарин/поликонидин = 0.998).

СПЭГ = 170 МГ/,МЛ' молекулярная масса ПЭГ 4000: 0,225 М NaCl + Ю-2 М Ыа-фосфатный буфер. Отметка на рисунке соответствует 10 мкм.

гидролитических ферментов. Кроме того, протамины, связываясь с ДНК и образуя межмолекулярные "сшивки", участвуют ln vivo в формировании пространственной организации хроматина половых клеток. И, наконец, в водно-солевых растворах умеренной ионной силы

се Ш

270 310 350 о 50 100 150

Х.ны В Р Е М Я, МИН

Рис. 13

А. Спектры КД жидкокристаллической дисперсии, сформированной из комплекса ¡ДНК-стеллин В) (г = 0,6) до (кривая 1) и после (кривая 2) обработки трипсином. Б. Зависимость амплитуды полосы в спектре КД = 275 нм) жидкокристаллической дисперсии комплекса (ДНК-стеллин В) (г = 0,6) от времени обработки трипсином.

"трипсин "•'

2-С = 10"1* М;

трипсин . '

С = 10 14 М. "рипсин

Стрипсин = М;

3 - СтРипсин = 10 * г.„,„ = 170 мг/мл, молекулярная масса ПЭГ 4000;

5 х 10 М Ыа-фосфатный буфер.

'ПЭГ 0,225 М ИаС1

Величина г - отношение молярной концентрации остатков основных аминокислот в структуре стеллина В к молярной концентрации нуклеотидов ДНК.

(ц < 0,15) протамины, в частности, стеллины А и В, вызывают конденсацию ДНК, приводящую к образованию жидкокристаллических дисперсий, не обладающих аномальной оптической активностью (Зкиг1<Ип З.С., 1996).

В соответствии с высказанным предположением, сформированная

в водно-солевом ¡0,15 М НаС1) растворе жидкокристаллическая дисперсия комплекса (ДНК-стеллин В) была помещена в водно-солевой раствор ПЭГ (Спэг = 170 мг/мл) и обработана гидролитическим ферментом - трипсином.

На рис. 13А сопоставлены спектры КД этой дисперсии до ¡кривая 1) и после (кривая 2) добавления фермента. Видно, что в ПЗГ-содержащем растворе интенсивная полоса в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса (ДНК-стеллин В) отсутствует. После добавления трипсина в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса (ДНК-стеллин В) появляется интенсивная отрицательная полоса (рис. 13А, кривая 2). Появление этой полосы свидетельствует о разрушении стеллиновых "сшивок" и об изменении пространственной упаковки молекул ДНК, приводящем к возникновению холесте-рической жидкокристаллической упаковки ДНК в частицах дисперсии. Вывод о перестройке структуры жидкокристаллической дисперсии комплекса (ДНК-стеллин В) подтверждается также данными рентгенографического анализа и поляризационной микроскопии.

Следует отметить (рис. 13Б), что перестроение пространственной организации жидкокристаллических дисперсий, сформированных из

молекул комплекса (ДНК-стеллин В), начинается при малой концен--14

трации трипсина (-- Ю М),

Такое перестроение вызывается действием и других гидролитических ферментов таких, как а-химотрипсин, проназа Р, папаин и тромбин.

Таким образом, полиэтиленгликоль или упаковка молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсии комплексов (ДНК-поликатион ) не оказывают ингибирующего действия на биологически активные соединения, "мишенью" которых являются молекулы поликатионов, входящие в состав комплексов (ДНК-поликатион!, и не препятствуют протеканию химических и биохимических реакций, происходящих с участием этих веществ, что позволяет управлять характером пространственной организации жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) при помощи биологически активных соединений.

Глава IX. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ДНК В СОСТАВЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

В этой главе проанализированы литературные данные, доказывавшие тот факт, что молекулы ДНК в составе биологических объектов (ДНК~содержащие вирусы, хромосомы) находятся в компактном (конденсированном), плоткоупакованном состоянии. Согласно опенкам разных авторов, локальная концентраций ДНК в этих условиях может достигать десятков и даже сотен мг/мл. Помимо высокой локальной концентрации, конденсированное состояние ДНК характеризуется высокой степень» упорядоченности, выявляемой при помощи рентгенографического анализа, а также в результате изучения ультратонких срезов головок бактериофагов и хромосом при помощи электронного микроскопа.

Наличие специфических молекулярных узоров на ультратонких срезах хромосом простейших в сочетании с наличием аномальной оптической активности хроматина, выделенного из головок сперматозоидов, свидетельствует о том, что в тех случаях, когда молекула (молекулы) ДНК практически не связана с белками, ее анизотропные свойства обеспечивает упаковку, аналогичную упаковке молекул ДНК в холестерических жидких кристаллах. Показано также, что молекулы ДНК, упаковываясь в головках некоторых бактериофагов, образуют

жидкокристаллические структуры нематического типа.

Приведенные данные положены в основу формирования представления о жидкокристаллической организации генетического материала некоторых организмов (Wagner Т.Е., 1977; Livolant F., 1984;

Kellenberger Е., 1987; Rill R.L., 1989). Это представление является весьма важным, поскольку оно позволяет утверждать, что

жидкокристаллические дисперсии ДНК, размер частиц которых сопоставим с микроскопическим размером вирусов и хромосом, можно рассматривать в качестве простой и удобной модельной системы, позволяющей исследовать m vitro особенности конденсированного состояния молекул ДНК in vivo.

Глава X. АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ (БИОСЕНСОРЫ) НА ОСНОВЕ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИИ ДНК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИИ

Х.1. Общие принципы создания и функционирования биосенсоров

В этом разделе диссертации кратко изложено представление о биосенсорах и перечислены некоторые потенциальные чувствительные элементы и преобразователи, которые можно использовать при их конструировании. Описаны два основных функциональных типа биосенсоров - "аффинные биосенсоры" и "ферментные электроды", а также принципы создания и функционирования биодатчиков на основе одно-цепочечных нуклеиновых кислот. Приведены примеры практического применения оиосенсоров на основе одноцепочечной ДНК для диагностики наследственных заболеваний, анализа неизвестных нуклеотид-ных последовательностей, а также для обнаружения некоторых патогенных вирусов и микроорганизмов в физиологических жидкостях человека и животных.

Х.2. Биодатчики на основе холестерических жидкокристаллических дисперсии ДНК

В этом разделе диссертации показано, что интенсивная полоса в спектре КД холестерических жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-окрашенное соединение) выступает в качестве аналитического критерия, позволяющего не только детектировать наличие окрашенного соединения в растворе и оценить его концентрацию, но и установить способ расположения этого соединения на молекуле ДНК. Это означает, что, в принципе, холеетерические жидкокристаллические дисперсии ДНК могут быть использованы в качестве полифункциональных биодатчиков при создании биосенсоров, ориентированных на определение соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки.

Принцип действия таких биодатчиков состоит в следующем.

1. Азотистые основания молекул ДНК, образующих холестеричее-кую жидкокристаллическую дисперсию, "узнают" биологически активные соединения и специфически "адресуют" их в определенные места

ка поверхности молекул ДНК. "фиксированных" за счет высокого осмотического давления водно-солевого раствора ПЭГ в структуре этой дисперсии.

2. Образование комплекса iДНК-биологически активное соединение) сопровождается появлением "первичного" оптического сигнала.

3. Пространственная структура холестерика многократно усиливает генерируемый в системе "первичный" оптический сигнал, возникавший при действии биологически активного соединения на ДНК.

4. В случае окрашенных биологически активных соединений детектируемый сигнал "проявляется" в еидэ интенсивной полосы (полос ! в спектре КД, расположенной в области поглощения окрашенного соединения. Эта полоса позволяет не только обнаружить наличие биологически активного соединения и определить его концентрацию, но и установить способ расположения этого соединения на молекуле ДНК.

На примере митоксантрона - противоопухолевого соединения ан-трахиноновой группы - разработан и запатентован экспресс-метод определения его концентрации в плазме и в цельной крови.

Минимальная концентрация митоксантрона, определяемая в про-

бе, составляет ~ 5 х 10 М, что соответствует его реальному уровню в периферической крови онкологических больных

— 7 —fi

(10 -10 М), терапия которых связана с применением этого препарата (Palumbo М., 1993). Время проведения одного анализа ~ 15-20 минут и для его проведения нет необходимости привлекать высококвалифицированный персонал.

Таким образом, биодатчики на основе холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК в сочетании с КД-детектором оптического сигнала позволят быстро и просто определять наличие биологически активных соединений, образующих прочные комплексы с ДНК.

Х.З. Биодатчики на основе жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион)

В этом разделе диссертации приведены данные, свидетельствующие о возможности определения биологически активных соединения, вызывающих конкурентное вытеснение молекул поликатиона из состава

комплекса (ДНК-поликатион).

На основании полученных данных разработан и запатентован способ определения гепарина, Показано, что минимальная концентрация гепарина, определяемая в анализируемой пробе в соответствии с предложенным регламентом, составляет ~ 0,4-0,5 мкг/мл.

Х.4. Синтетические полимерные матриксы, содержащие холестерические жидкокристаллические дисперсии ДНК

В этом разделе диссертации приведены данные, свидетельствующие о возможности иммобилизации (псевдокапсулированияг холестери-ческих жидкокристаллических дисперсий ДНК в синтетические полимерные матриксы (гидрогели) с сохранением характерных для них аномальных оптических свойств.

Синтетические полимерные матриксы получали при помоши двух методов.

Согласно первому методу, иммобилизацию холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК осуществляли в результате полимеризации гидрофильного мономера - акриламида, вводимого в предварительно сформированную холестерическую жидкокристаллическую дисперсию ДНК,. Полученный в результате полимеризации гель содержал частицы жидкокристаллической дисперсии, причем их аномальные оптические свойства сохранялись. Однако, полученные при помоши этого метода гели имели низкую прозрачность (по-видимому, из-за несовместимости ПЭГ и полиакриламида) и лимитированное время хранения.

Согласно другому подходу (Казанский К.С., 1996), гидрогели, содержащие частицы холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, получали способом, в котором полимеризационно-способный ПЭГ (метакрилатные макромономеры ПЭГ) использовали сначала для фазового исключения ДНК, приводящего к образованию холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, а затем полимеризовали с образованием пленки (гидрогеля I. Иммобилизация частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК в гидрогеле в результате полимеризации не влияет существенным образом на величину аномальной отрицательной полосы в спектре КД.

Полученные на основе модифицированного ПЭГ гидрогели являют-

оя оптически изотропными, характеризуются высоком прозрачностью и сохраняют при соблюдении не очень жестких условий хранения (влажность , температура) неизменной характерную для холестерических жидкокристаллических дисперсии ДНК аномальную оптическую активность, по крайней мере, в течение нескольких месяцев после их приготовления.

Сохранение специфических оптических свойств холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК в сочетании с привлекательными физико-химическими свойствами полученных гидрогелей показывает, что эти гидрогели могут быть использованы в качестве рациональной основы для создания полифункциональных жидкокристаллических биодатчиков "пленочного типа".

ВЫВОДЫ

1. При соблюдении "граничных" условий таких, как молекулярная масса, концентрация ДНК и ПЭГ, ионная сила, катионный состав и рН растворителя, в результате фазового исключения (конденсации) из водно-солевых растворов ПЭГ линейные двухцепочечные молекулы ДНК образуют дисперсии.

2- В результате сопоставления экспериментально наблюдаемого спектра КД дисперсии ДНК со спектром КД, характерным для тонкого слоя холестерической жидкокристаллической фазы ДНК, а также с теоретически рассчитанными спектрами КД холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК, установлено, что пространственная упаковка молекул ДНК в частицах дисперсии аналогична упаковке молекул ДНК в холестерических жидких кристаллах.

3. Пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот можно управлять в результате изменения диэлектрической постоянной (от 80 до 40 ед.), осмотического давления (от 10ь до 10' дин/см") или температуры (от 20°С до 30°С) ПЭГ-содерзкащего раствора, формируя жидкокристаллические дисперсии, структура которых аналогична структуре либо холестерических, либо нематических жидких кристаллов ДНК.

4. Продемонстрирована возможность реализации деух принципиально разных способов управления характером пространственной упаковки молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий.

4а. Пространственной упаковкой можно управлять, меняя исходные параметры вторичной структуры двухцепочечных молекул ДНК до их конденсации.

Показано, что в зависимости от степени модификации молекул ДНК при действии цис-Р^П) или УФ-облучения можно сформировать не только холестерические жидкокристаллические дисперсии с разным шагом пространственной спиральной закрутки, но и жидкокристаллические дисперсии, свойства которых отличаются от свойств, характерных для классических (холестерических или нематических) жидких кристаллов двухцепочечных нуклеиновых кислот.

4о. Пространственной упаковкой молекул ДНК можно управлять после их конденсации в тех случаях, когда образующаяся жидкокристаллическая дисперсия характеризуется упорядоченной упаковкой соседних молекул ДНК, отличающейся от холестерическон.

Показано, что пространственной структурой жидкокристаллической дисперсии, сформированной из молекул ДНК, предварительно связанных в комплекс с поликонидином, можно управлять при помоши гепарина, вызывающего диссоциацию комплекса (ДНК-поликонидин). Этот процесс сопровождается исчезновением "неспецифической" упаковки молекул ДНК и "восстановлением" холестерическон структуры, характерной для исходных, несвязанных в комплекс, молекул ДНК.

Установлено также, что пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий, сформированных из молекул ДНК, предварительно связанных в комплекс со стеллином В, можно управлять в результате добавления трипсина, вызывающего ферментативный гидролиз молекул стеллина В в составе комплекса (ДНК-стеллин В). В этом случае также имеет место "восстановление" холестерической структуры ДНК.

-хи

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Скуридин, Сергей Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава I. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФАЗЫ ДНК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ

РАСТВОРАХ.

Глава II. БИОГЕННЫЕ ПОЛИАМИНЫ, АГРЕГАТНОЕ СОСТОЯНИЕ И

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДНК

Глава III. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФАЗЫ ДНК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ

РАСТВОРАХ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ

III Л. Некоторые свойства водных растворов полиэтиленгликоля.

111.2. Рентгенографический анализ жидкокристаллических фаз линейных двухцепочечных молекул ДНК, образующихся в водно-солевых растворах поли-этиленгликоля.

111.3. Оптические текстуры и спектры КД тонких слоев жидкокристаллических фаз линейных двухцепочечных молекул ДНК, образующихся в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV.1. Характеристика препаратов ДНК и синтетических полинуклеотидов

IV. 2. Характеристика препаратов полиэтиленгликоля 91 IV- 3. Формирование жидкокристаллических дисперсий ДНК и синтетических полинуклеотидов в ПЭГсодержащих водно-солевых растворах

IV. 4. Формирование жидкокристаллических дисперсий ДНК в водно-солевых растворах ПЭГ, содержащих изопропанол.

IV. 5. Формирование жидкокристаллических дисперсий из молекул ДНК, модифицированных цис-дихлородиамминплатиной(II)

IV. б. Формирование жидкокристаллических дисперсий из молекул комплексов (ДНК-дауномицин) . 98 IV. 7. Формирование жидкокристаллических дисперсий из молекул ДНК, предварительно подвергнутых

УФ-облучению

IV. 8. Регистрация спектров поглощения и кругового дихроизма.

IV. 9. Размер частиц жидкокристаллических дисперсий

IV.10. Приготовление образцов жидкокристаллических фаз ДНК для рентгенографического анализа и поляризационной микроскопии

IV.11. Теоретический расчет спектров кругового дихроизма жидкокристаллических дисперсий ДНК . 104 IV.12. Формирование жидкокристаллических дисперсий и жидкокристаллических фаз комплексов ДНК с синтетическими поликатионами.

IV.13. Характеристика препаратов гепарина

IV-14. Формирование жидкокристаллических дисперсий и жидкокристаллических фаз комплексов ДНК с протаминами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.ИЗ

Глава V. УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ И СВОЙСТВА ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИЙ ДНК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ

7. 1. Условия образования дисперсий ДНК в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля

V. 2. Некоторые параметры частиц дисперсий ДНК, образующихся в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля

V. 3. Теоретически рассчитанные и экспериментально наблюдаемые спектры КД дисперсий ДНК

V. 4. Оценка параметра порядка молекул поли(И) х полис Ц), образующих холестерическую жидкокристаллическую дисперсию.

V. 5. Кинетика формирования холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК.

7. 6. Факторы стабилизации оптических свойств частиц холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК.

Глава 71. УПРАВЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ УКЛАДКОЙ МОЛЕКУЛ

ДНК В ЧАСТИЦАХ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИЙ

VI.1. Возможность изменения пространственной укладки молекул полимеров в лиотропных жидких кристаллах: (теория).

VI.2. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий ДНК в результате изменения диэлектрической постоянной растворителя

VI-3. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий ДНК при помощи биологически активных соединений

VI-4. Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий поли(И) х поли(Ц) при помощи температуры.

VI-5- Управление пространственной структурой жидкокристаллических дисперсий ДНК при помощи химических агентов и физических факторов

VI.5.1. Оптические свойства жидкокристаллических дисперсий, сформированных из молекул ДНК, модифицированных цис-дихлородиамминплатиной( II ) . . 175 VI.5.2- Фотохимическая модификация азотистых оснований и оптические свойства жидкокристаллических дисперсий ДНК.

VI.5.3. Возможные причины исчезновения аномальной оптической активности жидкокристаллических дисперсий ДНК при модификации азотистых оснований.

VI.6. Влияние ионного состава растворителя на эффективность образования жидкокристаллических дисперсий ДНК и характер упаковки молекул ДНК в частицах этих дисперсий

Глава VII. " ПЭГ-ПОДОБНАЯ СИТУАЦИЯ " В БИОЛОГИЧЕСКИХ

СИСТЕМАХ.

VIII.1. Условия образования и свойства жидкокристаллических фаз и жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион), сформированных в водно-солевых растворах

VIII.2. Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) при помощи биологически активных соединений

Глава IX. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ДНК В СОСТАВЕ

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Глава X. АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ (БИОСЕНСОРЫ) НА ОСНОВЕ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИИ ДНК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ . . 252 X.1. Общие принципы создания и функционирования биосенсоров.

Х.2. Биодатчики на основе холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК.

Х.З. Биодатчики на основе жидкокристаллических дисперсий комплексов ÍДНК-поликатион) . 275 Х.4. Синтетические полимерные матриксы, содержащие холестерические жидкокристаллические дисперсии ДНК

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ДОВ - дисперсия оптического вращения КД - круговой дихроизм НК - нуклеиновая кислота ПЭГ - полиэтиленгликоль Т-модель - термодинамическая модель комплекса {ДНК-поликатион) Э-модель - электростатическая модель комплекса (ДНК-поликатион) цис-Р1;(11) - цис-дихлородиамминплатина(II)

А-762 - 3,6-ди(о-диметиламинопропиламидо)-4,5-диокси-9,10-антрацендион гидрохлорид

ВБ - бисантрен, 9,10-антрацендикарбоксальдегид-бис-[(4,5-дигидрокси-1Н-имидазол-2-ил )гидразин 1 дигидрохлорид

МХ - митоксантрон, 1,4-бис-((6-окси-1,4-диазогекеил1-5,8-диокси-9,10-антрацендион ] дигидрохлорид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот при помощи биологически значимых факторов"

Двухцепочечные молекулы ДНК в составе биологических объектов (ДНК-содержащие вирусы, хромосомы про- и эукариотов) находятся в компактном, плотно упакованном состоянии. Согласно оценкам разных авторов, локальная концентрация ДНК в этих условиях может достигать десятков и даже сотен мг/мл [1-43. Помимо высокой локальной концентрации, супрамолекулярная организация ДНК в составе биологических объектов характеризуется высокой степенью пространственной упорядоченности, выявляемой при помоши рентгенографического анализа [5-7 3, а также в результате изучения ультратонких срезов хромосом и головок бактериофагов при помощи электронного микроскопа с последующей реконструкцией модели укладки ДНК, основанной на анализе полученных электронно-микроскопических фотографий [8-10 3.

Наличие исчерченности (специфических молекулярных узоров) на ультратонких срезах хромосом простейших [8,9 3, в сочетании с наличием аномальной оптической активности, зарегистрированной в спектре КД хроматина, выделенного из головок сперматозоидов [11,12 3, свидетельствует о том, что в тех случаях, когда молекулы ДНК практически не связаны с белками, анизотропные свойства ДНК обеспечивают упорядоченную упаковку жидкокристаллического типа, которая характерна для холестерических жидких кристаллов полимеров.

Еще одной важной особенностью пространственной укладки молекул (или сегментов) ДНК в составе биологических объектов является ее высокая лабильность, выражающаяся в способности быстро и обратимо менять степень компактности и характер упорядочения молекул (или сегментов) ДНК в зависимости от функционального состояния клетки.

Изучение особенностей состояния ДНК в вирусах и хромосомах интересно как с физико-химической, так и с биологической точек зрения. С физико-химической точки зрения такое исследование интересно потому, что оно позволяет определить, во-первых, природу и движущие силы, определяющие упаковку большого объема генетического материала, заключенного в молекулах ДНК, в малом объеме биологического объекта, и, во-вторых, установить тип упаковки молекул (или сегментов) ДНК в образуемых ими in vivo компактных структурах, С биологической точки зрения такое исследование позволяет выяснить факторы, которые влияют на характер упаковки, и установить возможную связь межцу характером пространственной упаковки ДНК и биологической активностью этой макромолекулы. До последнего времени однозначные ответы на эти вопросы не были получены.

Исследование структурной организации ДНК непосредственно в клетке представляет собой трудную задачу. В литературе имеются два предположения, касающихся механизма упаковки генетического материала. Согласно первому из них £13 1» в клетке имеется некий \ специфический "фактор конденсации", обеспечивающий механическую I укладку генетического материала в клеточном ядре. Согласно второму предположению C14J, на определенной стадии клеточного цикла в клетке создаются такие физико-химические условия, которые обеспечивают спонтанную упорядоченную упаковку молекул ДНК. Если исходить из второй гипотезы, то вполне оправданной кажется постановка вопроса о том, можно ли создать модель, отражающую основные черты пространственной организации молекул ДНК in vivo.

1 ñ

В последние годы поиск ответа на этот вопрос стал привлекать внимание не только молекулярных биологов, но и специалистов из других областей науки; в частности, повышенный интерес к изучению состояния молекул ДНК в составе биологических объектов отмечен у специалистов, занимающихся как в нашей стране, так и за рубежом исследованием лиотропных жидкокристаллических фаз, образуемых молекулами биополимеров в условиях, моделирующих внутриклеточные.

Исследования in vitro проводятся на нескольких модельных системах, две из которых получили наибольшее распространение. Первая модельная система - жидкокристаллические фазы ДНК, возникающие спонтанно в водных растворах солей щелочных металлов умеренной или высокой ионной силы при достижении в них некоторой "критической" концентрации ДНК [15,16 3. Вторая модельная система - жидкие кристаллы, образующиеся при фазовом исключении ДНК из водно-солевых растворов некоторых нейтральных полимеров, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ) [17-20 3.

Кроме двух отмеченных выше модельных систем, жидкокристаллические фазы ДНК образуются в присутствии детергентов [213 или этанола [22-23 3, а также в результате конденсации ДНК при помощи соединений поликатионной природы (биогенные полиамины [243, полиаминокислоты [253, гистоновые белки [26 3 ).

В настоящей работе сделана попытка не только выяснения механизмов и роли факторов, определяющих и регулирующих характер упаковки двухцепочечных молекул (или сегментов) ДНК в составе биологических объектов, но и использования уникального сочетания физико-химических свойств, присущих молекулам этого биополимера и их жидким кристаллам, для решения конкретных прикладных задач, и в частности, задач практического здравоохранения и медицины.

Цель настоящей работы состояла в изучении условий образования и свойств жидкокристаллических дисперсий ДНК, получаемых при помощи двух принципиально разных способов конденсации линейных двухцепочечных молекул ДНК низкой с молекулярной массы (< 1 х 10 ): а), в результате фазового исключения молекул ДНК из полимер-содержащих водно-солевых растворов и б), в результате нейтрализации отрицательно заряженных молекул ДНК положительно заряженными противоионами в водно-солевых растворах переменной ионной силы.

Автор защищает три основных, имеющих фундаментальное значение, положения.

1. Образование разных типов жидкокристаллических дисперсий ДНК в водно-солевых растворах, содержащих нейтральный полимер -полиэтиленгликоль, и в водно-солевых растворах переменной ионной силы в присутствии природных и синтетических соединений поликатионной природы.

2. Два принципиально разных способа управления характером пространственной упаковки молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий: а), в результате изменения исходных параметров вторичной структуры двухцепочечных молекул ДНК до их конденсации; б). при помощи гидролитических ферментов и гепарина после конденсации молекул ДНК в тех случаях, когда образующаяся жидкокристаллическая дисперсия характеризуется упорядоченной упаковкой соседних молекул ДНК, отличающейся от холестерической,

3. Использование холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК и жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) в качестве основы для создания новых типов полифункциональных биодатчиков, предназначенных для определения различных классов биологически активных соединений, представляющих интерес с практической точки зрения.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Скуридин, Сергей Геннадьевич

выводы

2. В результате сопоставления экспериментально наблюдаемого спектра КД дисперсии ДНК со спектром КД, характерным для тонкого слоя холестерической жидкокристаллической фазы ДНК, а также с теоретически рассчитанными спектрами КД холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК, установлено, что пространственная упаковка молекул ДНК в частицах дисперсии аналогична упаковке молекул ДНК в холестерических жидких кристаллах.

3- Пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот можно управлять в результате изменения диэлектрической постоянной (от 80 до 40 ед.),

Т 2 осмотического давления (от 10 до 10 дин/см ) или температуры (от 20°С до 80°С) ПЭГ-содержащего раствора, формируя жидкокристаллические дисперсии, структура которых аналогична структуре либо холестерических, либо нематических жидких кристаллов ДНК.

4- Продемонстрирована возможность реализации двух принципиально разных способов управления характером пространственной упаковки молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий.

Показано, что в зависимости от степени модификации молекул ДНК при действии цис-РКП) или УФ-облучения можно сформировать не только холестерические жидкокристаллические дисперсии с разным шагом пространственной спиральной закрутки, но и жидкокристаллические дисперсии, свойства которых отличаются от свойств, характерных для классических (холестерических или нематических) жидких кристаллов двухцепочечных нуклеиновых кислот.

46. Пространственной упаковкой молекул ДНК можно управлять после их конденсации в тех случаях, когда образующаяся жидкокристаллическая дисперсия характеризуется упорядоченной упаковкой соседних молекул ДНК, отличающейся от холестерической.

Показано, что пространственной структурой жидкокристаллической дисперсии, сформированной из молекул ДНК, предварительно связанных в комплекс с поликонидином, можно управлять при помощи гепарина, вызывающего диссоциацию комплекса (ДНК-поликонидин). Этот процесс сопровождается исчезновением "неспецифической" упаковки молекул ДНК и "восстановлением" холестерической структуры, характерной для исходных, несвязанных в комплекс, молекул ДНК.

5. Обнаружено, что в водно-солевых растворах молекулы ДНК, взаимодействуя с положительно заряженными молекулами поликониди-на, образуют жидкокристаллические дисперсии, в частицах которых реализуются разные способы упаковки комплексов (ДНК-поликони-дин). Показано, что в этих условиях характером упаковки можно управлять, меняя концентрацию ЫаС1: в пределах 0,15 М ^ сиас1 < М существует гексагональная жидкокристаллическая дисперсия, а при 0,4 М « С^аС1 < 0,55 М - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия. б- Обоснована возможность использования холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК и жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) в качестве чувствительных элементов (биодатчиков ) биосенсорных устройств.

На примере митоксантрона - противоопухолевого соединения антрахиноновой группы, разработан экспресс-метод его определения в плазме и цельной крови, основанный на применении холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК. Минимальная концентрация митоксантрона, определяемая в анализируемой пробе, составляет - 5 х 10"Т М.

Разработан новый способ определения гепарина, основанный на использовании жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-по-ликонидин). Минимальная концентрация гепарина, определяемая в анализируемой пробе, составляют - 0,4-0,5 мкг/мл.

7. На основе метакрилатных макромономеров ПЭГ получены гидрогели, содержащие в своем составе холестерические жидкокристаллические дисперсии ДНК. Такие гидрогели могут быть использованы для создания полифункциональных жидкокристаллических биодатчиков пленочного типа"

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Скуридин, Сергей Геннадьевич, Москва

1. Kellenberger Е. The compactness of cellular plasmas;1. particular, chromatin compactness in relation to function. -Trends Biochem. Scl., 1987, v. 12, 3, p. 105-107,

2. Kellenberger E. About organisation of condensed and decondensed non-eukaryotic DNA and the concept of vegetative DNA. Biophys. Chem., 1988, v. 29, 1, p. 51-62.

3. Спитковский Д.М. Анализ надмолекулярной организации хроматина в норме и при патологии. Вест. Акад. мед. наук СССР, 1973, 1, с. 29-37.

4. Earnshaw W.C., Harrison S.C. DNA arrangement in isometric phage heads. Nature, 1977, v. 268, 5621, p. 598-602.

5. Black L.W., Newcomb W.W., Boring J.W., Brown J.C. Ion etching of bacteriophage T4: support for a spiral-fold model of packaged DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v. 82, 23,p. 7960-7964.

6. Serwer P. Arrangement of double-stranded DNA packaged in bacteriophage caps ids. (An alternative model) J. Mol. Biol., 1986, v. 190, 3, p. 509-512.

7. Rill R.L., Livolant F., Aldrich H.C., Davidson M.W. Electron microscopy of liquid crystalline DNA: direct evidence for cholesteric-like organization of DNA in dinoflagellatechromosomes. Chromosoma (Berl.), 1989, v. 98, 4, p. 280-286.

8. Livolant F. Ordered phases of BNA in vivo and in vitro. -Physica, 1991, v. A 176, 1, p. 117-137.

9. Lepault J., Bubochet J., Basehong W., Kellenberger E. Organization of double-stranded BNA in bacteriophages: a study by cryo-electron microscopy of vitrified samples. EMBO J., 1987,v. 6, 5, p. 1507-1512.

10. Wagner T.E., Mann B.R., Vincent R.C. The role of disulfide reduction in chromatin release from equine sperm. -J. Exp. Zoo 1., 1974, v. 189, 1, p. 387-393.

11. Sipski M.L., Wagner T.E. Probing BNA quaternary ordering with circular dichroism spectroscopy: studies of equine sperm chromosomal fibres. Blopolymers, 1977, v. 16, 3, p. 573-582.

12. Kellenberger E. Vegetative bacteriophages and the maturation of virus particles. in: Adv. Virus Res., New York: Academic Press, 1961, v. 8, p. 2-57.

13. Laemli U.K., Paulson J.K., Hitchins V. Maturation of the head of bacteriophage T4. V. A possible BNA-packing mechanism: in vitro cleavage of the head proteins and the structure of the core of the polyhead. J. Supramol. Struct., 1974, v. 2,p. 276-301.

14. Robinson C. Liquid crystalline structures in polypeptide solutions. Tetrahedron, 1961, v. 13, 1-3, p. 219-234.

15. Livolant F., Leforestier A. Condensed phases of BNA: structures and phase transitions. in: Prog. Polym. Sci. London: Elsevier Science Ltd, 1996, v. 21, p. 1115-1164.

16. Lerman L.S. A transition to a compact form of BNA in polymer solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971, v. 68, 8,p. 1886-1890.

17. Maniatis T., Venable J.H., Lerman L.S. The structure of ¥ DNA. J. Mol. Biol., 1974, v. 84, 1, p. 37-64.

18. Evdokimov Yu.M., Platonov A.L., Tikhonenko A.S., Varshavsky Ya.M. A compact form of double-stranded DNA in solution. FEBS Lett., 1972, v. 23, 2, p. 180-184.

19. Yevdokimov Yu.M., Skuridin S.G., Salyanov V.l. The liquid crystalline phases of double-stranded nucleic acids in vitro and in vivo. Liquid Cryst., 1988, v. 3, 11, p. 1443-1459.

20. Ghirlando R., Wachtel E.J., Arad T., Minsky A. DNA packaging induced by micellar aggregates: a novel in vitro DNA condensation system. Biochemistry, 1992, v. 31, 31,p. 7110-7119.

21. Cheng S.-M., Mohr S.C. Condensed states of nucleic acids.1.. Effects of molecular size, base composition, and presence of intercalating dyes on the f-transition of DNA. Biopolymers, 1975, v. 14, 3, p. 663-674.

22. Huey R., Mohr S.C. Condensed state of nucleic acids.

23. I. ?(+) and conformational transitions of DNA induced by ethanol and salt. Biopolymers, 1981, v. 20, 12, p. 2533-2552.

24. Sikorav J.-L., Pelta J., Livolant F. A liquid crystalline phase in spermidine-condensed DNA. Biophys. J., 1994, v. 67, 4, p. 1387-1392.

25. Shapiro J.T., Leng M., Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acid polylysin complexes. Structure and nucleotide specificity. - Biochemistry, 1969, v. 8, 8, p. 3219-3232.

26. Leforestier A., Livolant F. Liquid crystalline ordering of nucleosome core particles under macromolecular crowdingconditions: evidence for a discotic columnar hexagonal phase. -Biophys. J., 1997, v. 73, 4, p. 1771-1776.

27. Iizuka E. Some new finding in the liquid crystals of sodium salt of deoxyribonucleic acid. Polym. J., 1977, v. 9, 2, p. 173-180.

28. Potaman V.N., Alexeev D.G., Skuratovskli I.Ya., Rabinovich A.Z., Shlyakhtenko L.S. Study of DNA films by the CD, X-ray and polarization microscopy techniques. Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, 1, p. 55-64.

29. Вендорф Дж. Жидкокристаллический порядок в полимерах. М.: Мир, 1981, с. 14-56.

30. Сонин А.С. Введение в физику жидких кристаллов. М.: Наука, 1983, с. 3-313.

31. Hagerman P. Flexibility of DNA. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1988, v. 17, p. 265-286.

32. Flory P.J. Phase equilibria in solutions of rod-like particles. Proc. Roy. Soc. A, 1956, v. 234, 1, p. 73-89.

33. Livolant F. Cholesteric organization of DNA in vivo and in vitro. Eur. J. Cell Biol., 1984, v. 33, 2, p. 300-311.

34. Livolant F. Cholesteric liquid crystalline phases given by three helical biological polymers: DNA, PBLG and xanthan.

35. A comparative analysis of their textures. J, Phys. (France), 1986, v. 47, 9, p. 1605-1616.

36. Strzelecka Т., Rill R.L. Solid-state 31P NMR studies of DNA liquid crystalline phases. The Isotropic to cholesteric transition. J. Amer. Chem. Soc., 1987, v. 109, 15, p. 4513-4518.

37. Rill R.L., Hilllard P.R., Levy G.C. Spontaneous ordering of DNA. J. Biol. Chem., 1983, v. 258, 1, p. 250-256.

38. Brandes R., Kearns D.R. Magnetic ordering of DNA liquid crystals. Biochemistry, 1986, v. 25, 20, p. 5890-5895.

39. Rill R.L. Liquid crystalline phases in concentrated solutions of Na+ DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, v. 83, 2, p. 342-346.

40. Livolant F., Bouligand Y. Liquid crystalline phases given by helical biological polymers (DNA, PBLG and xanthan). Columnar textures. J. Phys. (France), 1986, v. 47, 10, p. 1813-1827.

41. Livolant F. Precholesteric liquid crystalline states of DNA. J. Phys. (France), 1987, v. 48, 6, p. 1051-1066.

42. Livolant F., Maestre M.F. Circular dichroism microscopy of compact forms of DNA and chromatin in vivo and in vitro: choiesteric liquid crystalline phases of DNA and singledinoflagellate nuclei. Biochemistry, 1988, v. 27, 8, p. 3056-3068.

43. Strzelecka T.E., Davidson M.W., Rill R.L. Multiple liquid crystal phases of DNA at high concentrations. Nature, 1988,v. 331, 6155, p. 457-460.

44. Livolant F. Lines in liquid crystalline phases ofbiopolymers. J. Phys. (France), 1989, v. 50, 13, p. 1729-1741.

45. Livolant F., Levelut A.M., Doucet J., Benoit J.P. The highly concentrated liquid crystalline phase of DNA is columnar hexagonal. Nature, 1989, v. 339, 6227, p. 724-726.

46. Strzelecka T.E., Rill R.L. Phase transitions of concentrated DNA solutions in low concentrations of 1 : 1 supporting electrolyte. Biopolymers, 1990, v. 30, 1/2, p. 57-71.

47. Van Winkle D.H., Davidson M.W., Wan-Xu Chen, Rill R.L.

48. Cholesterin helical pitch of near persistence length DNA. -Macromolecules, 1990, v. 23, 18, p. 4140-4148.

49. Livolant F. Supramolecular organization of double-stranded DNA molecules in the columnar hexagonal liquid crystalline phase. J. Mol. Biol., 1991, v. 218, 1, p. 165-181.

50. Rill R.L., Strzelecka Т.Е., Davidson M.W.,

51. Van Winkle D.H. Ordered phases in concentrated DNA solutions. -Physica, 1991, v. A 176, 1, p. 87-116.

52. Leforestler A., Livolant F. Supramolecular ordering of DNA in the cholesteric liquid crystalline phase:an ultrastructural study. Biophys. J., 1993, v. 65, 1, p. 56-72.

53. Leforestler A., Livolant F. DNA liquid crystalline blue phases. Electron microscopy evidence and biological Implications. Liquid Cryst., 1994, v. 17, 5, p. 651-658.

54. Merchant K., Rill R.L. Isotropic to anisotropic phase transition of extremely long DNA in an aquous saline solution. -Macromolecules, 1994, v. 27, 9, p. 2365-2370.

55. Demus D., Richter L. Textures of Liquid Crystals. Leipzig: VEB, Deutscher Verlag fur Grundstoffindustrie, 1978, p. 3-219.

56. Spada G.P., Brigldi P., Gottarelli G. The determination of the handedness of cholesteric superhelices formed by DNA fragments. J. Chem. Soc., Chem. Cornmun., 1988, 14, p. 953-954.

57. Беляков В.А., Сонин A.C. Оптика холестерических жидких кристаллов. М.: Наука, 1982, с. 5-347.

58. Saeva F.D. Cholesteric liquid crystal-induced circular dlchroism. in: Liquid Crystals. The Fourth State of Matter.

59. New York: M.Dekker, 1979, p. 249-271.

60. Евдокимов Ю.М. Жидкокристаллические дисперсии нуклеиновых кислот. Изв. АН СССР (сер. физическая), 1991, т. 55, 9,с. 1804-1816.

61. Gottarelli G., Spada G.P. Application of CD to the study of some cholesteric mesophases, in: Circular Bichroism: Principles and Applications (Nakanishi K., Berova N.,

62. Woody R.W., eds.). New York: VCH, 1994, p. 105-119.

63. Livolant F. Cholesteric organization of DNA in the stallion sperm head. Tissue Cell., 1984, v. 16, 4, p. 535-555.

64. Хорст А. Молекулярные основы патогенеза болезней. М.: Медицина, 1982, с. 90-103.

65. Suau P., Subiгana J.A, X-ray diffaction studies of nucleoprotamine structure. J. Mol. Biol., 1977, v. 117, 4, p. 909-926.

66. Wolffe A. Chromatin. Structure and Function. 2-nd ed. London: Academic Press, 1995, p. 1-299.

67. Ames B.N., Bubin B.T. The role of polyamines in the neutralization of bacteriophage deoxyribonucleic acid. J. Biol. Chem., 1960, v. 235, 3, p. 769-775.

68. Tabor H., Tabor C.W., Rosental S.H. The biochemistry of polyamines: spermidine and spermine. Annu. Rev. Biochem., 1961, v. 30, p. 579-604.

69. Tabor C.W., Tabor H. 1,4-diamlnobutane (putrescine), spermidine and spermine. Annu. Rev. Biochem., 1976, v. 45, p. 285-306.

70. Walker P.R., Sikorska M., Whitfield J.F. Polyamine metabolism in regenerating livers from normal and hypocalcemlcrats. J. Cell. Physiol., 1978, v. 94, 1, p. 87-91.

71. Hurwitz C., Rosano C.L. The intracellular concentration of bound and unbound magnesium ions in Escherichia coli.

72. J. Biol. Chem., 1967, v. 242, 16, p. 3719-3722.

73. Takeda Y. Polyamines and protein synthesis. I. The shifto+in optimal concentration of Mg by polyamines in the MS2 phage RNA-directed polypeptide synthesis. Blochlm. Biophys. Acta, 1969, v. 179, 1, p. 232-234.

74. Atkins J.F., Lewis J.В., Anderson C.W., Gesterland R.F. Enhanced differential synthesis of proteins in mammalian cell-free system by addition of polyamines. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, 14, p. 5688-5695.

75. Baeza I., Ibanez M., Santiago J.C., Argue Но C., Wong C., Oro J. Diffusion of Mn2+ ions into liposomes mediated by phosphatidate and monitored by the activation of an encapsulated enzymatic system. J. Mol. Evol., 1990, v. 31, 6, p. 453-461.

76. Shuber F. Influence of polyamines on membrane functions. Biochem. J., 1989, v. 260, 1, p. 1-10.

77. Griffith J.D. Visualization of prokaryotic DNA in regularly condensed chromatin-like fiber. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, 2, p. 563-567.

78. Кафиани К.А., Маленков Г.Г. Роль ионного гомеостаза клетки в явлениях роста и развития. Успехи соврем, биол., 1976, т. 81, 3, с. 445-463.

79. Hafner E.W., Tabor C.W., Tabor Н. Mutants of Escherichia coll that do not contain 1,4-dlaminobutane (putrescine) or spermidine. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, 24, p. 12419-12426.

80. Pegg A.E. Recent advances in the biochemistry ofpolyamines in eukaryotes. Biochem. J., 1986, v. 234, 2, p. 249-262.

81. Herbst E.J., Tanguay R.B. The interaction of polyamines with nucleic acids. in: Progress in Molecular and Subcellular Biology (Hahn F.E., eds), v. 2. New York: Academic Press, 1971, p. 166-180.

82. Mandel M. The interaction of spermine and native deoxyribonucleic acid. J. Mol. Biol., 1962, v. 5, 4,p. 435-441.

83. Hirschman S.Z., Leng M., Felsenfeld G. Interaction of spermine and BNA. Biopolymers, 1967, v. 5, 2, p. 227-233.

84. Andreasson B., Nordenskiold L., Shultz J. Interactions of spermidine and methylspermidine with DNA studied by nuclear magnetic resonance selfdiffusion measurements. Biophys. J., 1996, v. 70, 6, p. 2847-2856.

85. Iitaka Y., Huse Y. The crystal structure of spermine phosphate hexahydrate. Acta Cryst., 1965, v. 18, 1, p. 110-121.

86. Tsuboi M. On the melting temperature of nucleic acid in solution. Bull. Chern. Soc. Jpn, 1964, v. 37, 7, p. 1514-1522.

87. Langridge R., Marvin B.A., Seeds W. , Hooper C.W., Wilson H.R., Wilkins M.H.F., Hamilton L.B. The molecular configuration of deoxyribonucleic acid. II. Molecular models and their fourier transforms. J. Mol. Biol., 1960, v. 2, 1, p. 38-64.

88. Liquori A.M., Constantino L., Crescenzi V., Elia V., Giglio E., Puliti R., Be Santis Savino M., Vitagliano V. Complexes between DNA and polyamines: a molecular model. -J. Mol. Biol., 1967, v. 24, 1, p. 113-122.

89. Suwalsky M., Traub W., Shmueli U., Subirana J.A. An X-raystudy of the interaction of DNA with spermine. J. Mol. Biol., 1969, v. 42, 2, p. 363-373.

90. Heby 0., Agrell I. Observations on the affinity between polyamines and nucleic acids. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1971, v. 352, 1, p. 29-38.

91. Agrell I., Heby 0. Interaction between spermine and histons at nucleoprotein formation. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1971, v. 352, 1, p. 39-42.

92. Lee S.H., Felsenfeld G. Solubility of complexes of polynucleotides with spermine. Nature, 1960, v. 188, 4747, p. 301-302.

93. Osland A., Kleppe K. Polyamine induced aggregation of DNA. Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, 3, p. 685-695.

94. Boclan E., Rosiek 0., Ziernba-Zoltowska B. Post-irradiation treatment of human lymphocytes with spermidine reduces frequency of chromatid breaks. Bull. Acad. Pol. Sci., 1978, v. 26, 9, p. 639-643.

95. Johnson H.G., Bach M.K. The antimutagenlc action of polyamines: suppression of the mutagenic action of an E.Coli mutator gene and of 2-aminopurine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, v. 55, 6, p. 1453-1456.

96. Tabor C.W., Tabor H. Polyamines. Annu. Rev. Biochem., 1984, v. 53, p. 749-790.

97. Tlkchonenko T.I., Glushakova S.E., Kislina O.S., Grodnltskaya N.A., Manykin A.A., Naroditsky B.S. Transfer of condensed viral DNA into eukaryotic cells usingproteoliposomes. Gene, 1988, v. 63, 2, p. 321-330.

98. Baeza I., Garigllo P., Rangel L.M., Chavez P.,

99. Cervantes L., Arguello C. Electron microscopy and biochemical properties of polyamine-compacted DNA. Biochemistry, 1987, v. 26, 20, p. 6387-6392.

100. Gosule L.C., Schellmari J.A. Compact form of DNA induced by spermidine. Nature, 1976, v. 259, 554, p. 333-335.

101. Gosule L.C., Schellman J.A. DNA condensation with polyamines. I. Spectroscopic studies. J. Mol. Biol., 1978, v. 121, 3, p. 311-326.

102. Chattoraj D.K., Gosule L.C., Schellman J.A. DNA condensation with polyamines. II. Electron microscopic studies. J. Mol. Biol., 1978, v. 121, 3, p. 327-337.

103. Allison S.A., Herr J.С., Schurr J.M. Structure of viral <x29 DNA condensed by simple triamines: light-scattering and electron microscopy study. Biopolymers, 1981, v. 20, 3,p. 469-488.

104. Bloomfield V. Condensation of DNA by multivalent cations considerations on mechanism, Blopolymers, 1991, v. 31, 13,p. 1471-1481.

105. Сиволоб A.B., Храпунов C.M. Теоретическое рассмотрение механизмов компактизации ДНК поликатионами. Биофизика, т. 34, 1, с. 28-33.

106. Wilson R.W., Bloomfield V.A. Counterion-induced condensation of deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1979, v. 18, 11, p. 2192-2196.

107. Wldom J., Baldwin R.L. Cation-induced toroidal condensation of DNA: studies with Co3+(NH3>g. J. Mol. Biol., 1980, v. 144, 4, p. 431-453.

108. Baeza I., Ibanez M., Wong C., Chavez P., Gariglio P.,

109. Oro J. Possible preblotlc significance of polyamines in the condensation, protection, encapsulation, and biological properties of DNA, Orig. Life Evol. Blosph., 1991-92, v. 21, 4, p. 225-242.

110. Jay B.G., Gilbert W. Basic protein enhances the incorporation of DNA into lipid vesicles: model for the formation of primordial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84,7, p. 1978-1980.

111. Szelei J., Duda E. Entrapment of high-molecular-mass DNA molecules in liposomes for the genetic transformation of animal cells. Biochem. J., 1989, v. 259, 2, p. 549-553.

112. Becker M., Misselwitz R., Damaschun H., Damaschun G., Zirver D. Spermine-DNA complexes build up metastable structures. Small-angle X-ray scattering and circular dichroism studies. -Nucl. Acids Res., 1979, v. 7, 5, p. 1297-1309.

113. Schellman J.A., Parthasarathy N. X-ray diffraction studies on cation-collapsed DNA. J. Mol. Biol., 1984, v. 175, 3, p. 313-329.

114. Rau D.C., Parsegian V.A. Direct measurement of the intermolecular forces between counterion-condensed DNA double helices. Biophys. J., 1992, v. 61, 1, p. 246-259.

115. Damaschun G, Damaschun H., Misselwitz R., Zirver D., Muller J.J., Zalenskaya I.A., Vorob'ev V.I., Pyatigorskaya T.L. Supramolecular organization of condensed DNA with and without simple order. Stud, biophys., 1986, v. 112, 2-3, p. 127-137.

116. Pelta J., Livolant F., Slkorav J.-L. DNA aggregation induced by polyamines and cobalthexamine. J. Biol. Chem., 1996, v. 271, 10, p. 5656-5662.

117. Pelta J., Durand D., Doucet J., Llvolant F. DNA mesophases induced by spermidine: structural properties arid biological implications. Biophys. J., 1996, v. 71, 1, p. 48-63.

118. Raspaud E., Olvera de la Cruz M., Slkorav J.-L., Livolant F. Precipitation of BNA by polyamines: a polyelectrolyte behavior. Biophys. J., 1998, v. 74, 1, p. 381-393.

119. Durand D., Doucet J., Livolant F. A study of the structure of highly concentrated phases of DNA by X-ray diffraction. J. Phys. (France), 1992, v. 2, 7, p. 1769-1783.

120. Липосомы в биологических системах. М.: Медицина, 1983, с. 5-384.

121. ИЗ. Лима-де-Фариа А. Эволюция без отбора. (Автоэволюция формы и функции.) М.: Мир, 1991, с. 8-455.

122. Евдокимов Ю.М. Лиотропные жидкие кристаллы двухцепочечных нуклеиновых кислот. Автореф. дис. на соискание ученой степени доктора хим. наук. М.: МГУ им. М.В.Ломоносова, Химический факультет, 1991, с. 53.

123. Дымент О.Н., Казанский К.С., Мирошников A.M. Гликоли и другие производные окисей этилена и пропилена. М.: Химия, 1976, с. 3-373.

124. Phillips И.О., Marcinkowsky А.Е., Sachs S.B., Kraus К.А. Properties of organic-water mixtures. II. Self diffusion coefficient of Na+ in polyethylene glycol water mixtures at 25° C. - J. Phys. Chem., 1977, v. 81, 7, p. 679-682.

125. Malcolm G.N., Rowllnson J.S. The thermodynamic properties of aqueous solutions of polyethylene glycol, polypropylene glycol and dioxane. Trans. Faraday Soc,, 1957, v. 53, p. 921-931.

126. Казанский К.С., Дубровский С.А., Антощенко Н.В.

127. Характеристики и структура полиэтиленоксидных гидрогелей, получаемых через макромономеры. Высокомолекул. соединения А, 1997, т. 39, 5, с. 816-824.

128. Bailey F.E., Callard R.W. Some properties of polyiethylene oxide) in aqueous solution. J. Appl. Polym. Scl., 1959, v. 1,1, p. 56-62.

129. Погребняк В.Г., Торяник И.А. Изучение физико-химических свойств водных растворов полиэтиленоксидов. В кн.: Физическая гидродинамика. Киев, Виша школа, 1977, с. 104-111.

130. Погребняк В.Г., Торяник И.А. Вязкость растворов полимеров, Высокомолекул. соединения А, 1979, т. 21, 4, с. 902-906.

131. Погребняк В.Г., Иванюта Ю.Ф., Погребняк Л.А., Наумчук Н.В. Вязкость и диаграммы состояния растворов полиэтиленоксида. Изв. высш. учеб. заведений. Химия и химич. технол., 1986, т. 29, 1, с. 92-96.

132. Liu К.-J., Parsons J.L. Solvent effects on the preferred conformation of polyfethylene glycol). Macromolecules, 1969,v. 2, 5, p. 525-533.

133. Schick M.J. Effect of temperature on critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics and micelle formation. J. Phys. Chem., 1963, v. 67, 9, p. 1796-1799.

134. Баран А.А., Соломенцева И.М., Манк В.В., Куриленко О.Д. 0 роли фактора сольватации в стабилизации дисперсных систем, содержащих водо-растворимые полимеры. Докл. Акад. наук СССР, 1972, т. 207, 2, с. 363-366.

135. Arnold К., Herrmann A., Pratsсh L,, Gawrisch К. The dielectric properties of aqueous solutions ofpoly(ethylene glycol) and their influence on membrane structure. Blochim. Biophys. Acta, 1985, v. 815, 3, p. 515-518.

136. Arnold K., Herrmann A., Gawrisch K., Pratsch L. Water-mediated effects of PEG on membrane properties and fusion. in: Molecular Mechanisms of Membrane Fusion. New York: Plenum Press, 1987, p. 127-145.

137. Herrmann A., Pratsch L., Arnold K., Lassman G. Effect of polyiethylene glycol) on the polarity of aqueous solutions and on the structure of vesicle membranes. Biochlm. Biophys. Acta, 1983, v. 733, 1, p. 87-94.

138. Альбертсон П.-О. Разделение клеточных частиц и макромолекул. М.: Мир, 1974, с. 3-381.

139. Топчиева И.Н. Применение полиэтиленгликоля в биологии. -Успехи химии, 1980, т. 69, 3, с. 495-517.

140. Evdokimov Yu.M., Pyatigorskaya T.L., Polyvtsev O.F., Aklmenko N.M., Kadykov V.A., Tsvankin В.Ya., Varshavsky Ya.M.

141. A comparative X-ray diffraction and circular dichroism study of BNA compact particules formed in water-salt solutions, containing polyiethylene glycol). Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, 9, p. 2353-2366.

142. Большой энциклопедический словарь. Химия. 2-е изд. М.: Большая Российская энциклопедия, 1998, с. 181.

143. Skuridin S.G., Damaschun H., Damaschun G.,

144. Yevdokimov Yu.M., Misselwitz R. Polymer condensed DNA: a study by small-angle X-ray scattering, intermediate-angle X-ray scattering, and cicular dichroitic spectroscopy. Stud, biophys., 1986, v. 112, 2-3, p. 139-150.

145. Skuridin S., Badaev N., Dembo A.T., Lortkipanidze G.В., Yevdokimov Yu.M. Two types of temperature induced transitions of polyil) x poly(C) liquid crystals. Liquid Cryst., 1988, v. 3, 1, p. 51-62.

146. Скуридин С.Г., Дембо А.Т., Осипов M.А., Дамашун X., Дамашун Г., Евдокимов Ю.М. "Компенсированная" структура жидкокристаллических микрофаз нуклеиновых кислот. Докл. Акад. наук СССР, 1985, т. 285, 3, с. 713-716.

147. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Акименко Н.М. Жидкокристаллические микрофазы низкомолекулярных двухцепочечных нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов. -Высокомолекул. соединения А, 1984, т. 26, 11, с. 2403-2410.

148. Brian A.A., Frisch H.L., Lerman L.S. Thermodynamics and equilibrium sedimentation analysis of the close approach of DNA molecules and a molecular transitions. Biopolymers, 1981,v. 20, 6, p. 1305-1328.

149. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Дембо А.Т., Шраго М.И., Ханина Л.А. Оптические свойства жидкокристаллических микрофаз вводно-органических растворах, Кристаллография, 1986, т. 31, 4, с. 736-741.

150. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Бадаев Н.С. Доказательство образования двух типов жидкокристаллических микрофаз молекул ДНК низкой молекулярной массы в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля. Докл. Акад. наук СССР, 1986, т. 286, 4,с. 997-1000.

151. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г. Псевдокапсулированные жидкие кристаллы нуклеиновых кислот. Докл. Акад. наук СССР, 1988, т. 303, 1, с. 232-235.

152. Папков С.П., Куличихин В.Г. Жидкокристаллическое состояние полимеров. М.: Наука, 1977, с. 6-240.

153. Samulski T.V., Samulski Е.Т. Van-der-Waals-Lifshitz forces In lyotropic polypeptide liquid crystals.

154. J. Chem, Phys., 1977, v. 67, 2, p. 824-830.

155. Oslpov M.A. Molecular theory of solvent effect on cholesteric ordering1 in lyotropic polypeptide liquid crystals. -Chem. Phys., 1985, v. 96, 2, p. 259-269.

156. Torbet J., В1Capua E. Supercoiled BNA is interwound in liquid crystalline solutions. EMBO J., 1989, v. 8, 13,p. 4351-4356.

157. Салянов В.И., Прасолов B.C., Палумбо М., Евдокимов Ю.М. Аномальная оптическая активность, индуцируемая при конденсацииразных пространственных форм двухцепочечных кольцевых ДНК. -Биофизика, 1989, т. 33, 1, с. 20-27.

158. Салянов В.И. Жидкокристаллические дисперсии суперспиральных ДНК. Изв. АН СССР (сер. "физическая"), 1991, т. 55, 9, с. 1825-1827.

159. Salyanov V.I., Bembo А.Т., Yevdoklmov Yu.M. Liquid crystalline phases of circular superhelical plasmid BNA and their modification by the action of nuclease enzymes. Liquid Cryst., 1991, v. 9, 9, p. 229-238.

160. Салянов В.И., Палумбо М., Евдокимов Ю.М, Ферментативное расщепление суперспиральной ДНК в условиях ее жидкокристаллической упаковки. Молекуляр. биология., 1992,т. 26, 5, с. 1036-1046.

161. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Лаврентьев П.И. Жидкие кристаллы и жидкокристаллические дисперсии кольцевой ДНК. Изв. АН СССР (сер. "физическая"), 1995, т. 59, 3, с . 117-130.

162. Adamczyk A. Phase transitions in freely suspended srnectic droplets. Cotton-Mouton technique, architecture of droplets and formation of nematoides. Mol. Cryst. Liq. Cryst., 1989, v. 170, 1, p. 53-69.

163. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol., 1961, v. 3, 2, p. 208-218.

164. Loening U.E. The fractionation of high-molecular-weight ribonucleic acid by polyacrylamide-gel electrophoresis. -Blochem. J., 1967, v. 102, 1, p. 251-257.

165. Parsegian V.A., Rand R.P., Fuller N.L., Rau B.C. Osmotic-stress for the direct measurement of iritermolecular forces.

166. Methods Enzymo1., 1986, v. 127, p. 400-416.

167. Даниэль Ф., Олберти P. Физическая химия. M.: Мир, 1978, с. 355.

168. Вундерлих Б. Физика макромолекул. М,: Мир, 1979, т. 2, с. 178.

169. Handbook of chemistry and physics. P 2. 37-th ed. Cleveland, Ohaio: Chem. Rubb. Publ., 1955, p. 2326.

170. Вайнбергер А., Проскауэр Э., Риддик Д., Туппс Э. Органические растворители. М.: изд-во иностр. лит-ры, 1958, с. 45.

171. Kleinwachter V. Spectrophotometry study of binding of els- and traris-dichlorodiammineplatinum( II) to adenine and its derivatives. Stud, biophys., 1972, v. 33, 3, p. 201-210.

172. Gabbay E.J., Grier В., Flngerle R.E., Reimer R., Levy R., Pearce S.W., Wilson W.B. Interaction specificity of theanthracyclines with deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1976, v. 15, 10, p. 2062-2070.

173. Слоним И.Я. Определение размера частиц по светорассеянию. Оптика и спектроскопия, 1960, т. 8, 1, с. 98-108.

174. Фихман Б.А. Рассеяние взвесей бактерий в видимой области спектра. Биофизика, 1963, т. 8, 3, с. 380-384.

175. Пьюзи П.Н. Диффузия макромолекул. В кн.: Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. М.: Наука, 1973,с. 386-441.

176. Бреслер С.Е., Ерусалимский Б.Л. Физика и химия макромолекул. М.-Л.: Наука, 1965, с. 126.

177. Bloomfield V.A., Crothers В.М., Tinoko I. Physical Chemistry of Nucleic Acids. New York: Harper and Row, 1974, p. 222.

178. Podgornlc R., Strey H.H., Rau B.C., Parseglan V.A. Watching molecules crowd: BNA double helices under osmotic-stress. Biophys. Chem., 1995, v. 57, 1, p. 111-121.

179. Дунина В.В., Рухадзе Е.Г., Потапов В.М. Получение и исследование оптически активных веществ. М.: изд-во МГУ, 1979, с. 37-72.

180. Некрасов A.B., Берестецкая Т.З., Ефимов B.C., Чернова О.В. Синтез и антигепариновые свойства четвертичных аммонийных солей монодисперсных олигомеров конидина. -Хим.-фармацевт, ж., 1982, 10, с. (1211) 59-И215) 63.

181. Ефимов B.C., Серединин С.Б., Чернова О.В., Гришин В.Л., Берестецкая Т.З., Некрасов A.B. Выведение из организма и распределение по органам синтетических поликатионов на основе конидина. Хим.-фармацевт, ж., 1983, 1, с. 55-59.

182. Юликова Е.П., Рыбин В.К., Силаев А.Б. Первичная структура стеллина А. Биоорган, химия, 1979, т. 5, 1, с. 5-10.

183. Юликова Е.П., Рыбин В.К., Силаев А.Б. Первичная структура стеллина В. Химия природн, соедин., 1979, 5, с. 700-704.

184. Флори П. Статистическая механика цепных молекул. М.: Мир, 1971, с. 196-199.

185. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Мчедлишвили Б.В.,

186. Быков В.А., Спенер Ф., Палумбо М. Молекулярное конструирование на основе двухцепочечных нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов для создания интегрального биодатчика. -Сенсорные системы, 1999, т. 13, 1, с. 82-91.

187. Евдокимов Ю.М., Пятигорская Т.Л., Акименко Н.М., Варшавский Я.М. Компактная форма ДНК в растворе. IV. Влияние дефектности вторичной структуры на укладку двухцепочечных молекул

188. ДНК в компактных частицах. Молекуляр. биология, 1975, т. 9, 6, с. 879-866.

189. Браун Г., Уолкен Дж, Жидкие кристаллы и биологические структуры. М.: Мир, 1982, с. 5-198.

190. Чандрасекар С, Жидкие кристаллы. М.: Мир, 1980, с. 51.

191. Абдуллин А.З., Безбородов B.C., Минько А.А.,

192. Рачкевич B.C. Текстурообразование и структурная упорядоченность в жидких кристаллах. Минск: изд-во Университетское, 1987, с. 3-175.

193. Прохоров В.В., Кизель В.А. Круговой дихроизм в области поглощения голубых фаз и холестерических жидких кристаллов. -Кристаллография, 1985, т. 30, 5, с. 958-960.

194. Де Же В. Физические свойства жидкокристаллических веществ. М.: Мир, 1982, с. 3-148.

195. Cowley A.C., Fuller N.L., Rand R.P., Parsegian V.A. Measurement of repulsive forces between charged phospholipid bilayers. Biochemistry, 1978, v. 17, 15, p. 3163-3168.

196. Rau. B.C., Parsegian V.A. Direct measurement of the iritermolecular forces between counter ion-condensed DNA double-helices. Blophys. J., 1992, v. 61, 1, p. 246-259.

197. Podgornik R., Rau B.C., Parsegian V.A. Parametrization of direct and soft sterlc-undulatory forces between DNA doublehelical polyelectrolytes in solutions of several different anions and cations. Biophys. J., 1994, v. 66, 4, p. 962-971.

198. Rau D.C., Lee В., Parseglan V.A. Measurement of the repulsive force between polyelectrolyte molecules in ionic solution: Hydration forces between parallel BNA double helices. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, 5, p. 2621-2625.

199. Evdokimov Yu.M., Pyatigorskaya T.L., Kadikov Y.A., Polyvtsev O.F., Doscocll J., Koudelka J., Varshavsky Ya.M.

200. A compact form of double-stranded RNA in solution containing poly(ethyleneglycol). Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, 6, p. 1533-1547.

201. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Семенов С.В.,

202. Салянов В.И., Лорткипанидзе Г.Б. Стабилизация оптических свойств частиц холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК. -Биофизика, 1998, т. 43, 2, с. 240-252.

203. Горелик М.В. Химия антрахинонов. М.: Химия, 1983, с. 3-296.

204. Lippard S.J. Chemistry and molecular biology of platinum anticancer drugs. Pure and Apll. Chem., 1987, v. 59, 6,p. 731-742.

205. Lippard S.J. Platinum, gold and other metal chemotherapeutical agents. ACS Symposium (ser. 209), 1983, p. 5-311.

206. Wang S.Y. Photochemistry and Photobiology of Nucleic-Acids. v. I-II. New York, Academic Press, 1976.

207. Хомутов A.P., Яковлев Д.Ю., Хомутов P.M. Новая реакция 2,4-дикетопиримидимов. Биоорган, химия, 1990, т. 16, 3,с. 427-429.

208. Ныркова И.А., Хохлов А.Р. Жидкокристаллическое упорядочение в растворах полиэлектролитов. Биофизика, 1986, т. 31, 5, с. 771-776.

209. Вайнштейн Б.К. Дифракция рентгеновых лучей на цепных молекулах. М.: Наука, 1963, с. 184-240.

210. Kornyshev A., Leikln S. Theory of interaction between helical molecules. J. Chem. Phys., 1997, v. 107, 9,p. 3656-3674.

211. Салянов В.И., Евдокимов Ю.М. Нарушение "однородности" спиральной поверхности двухцепочечных ДНК и образование жидкокристаллических дисперсий. Докл. Акад. наук, 1999, т. 368, 5, с. 1-3.

212. Strauss U.P., Wineman P.L. Molecular dimensions and interactions of long-chain polyphosphate in sodium bromide solutions. J. Amer. Chem. Soc., 1958, v. 80, 10, p. 2366-2371,

213. Manning G.S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with application to the electrostatic properties of polynucleotides. Quart. Revs Biophys., 1978, v. 11, 2,p. 179-246.

214. Subirana J.A., Vives J.L. The precipitation of BNA by spermine. Biopolymers, 1981, v. 20, 10, p. 2281-2283.

215. Marx K.A., Ruben G.C. Studies of BNA organization in hydrated spermldlne-condensed BNA toruses and spermidine-BNAfibres. J. Biomol. Struct. Bynam., 1984, v. 1, 5, p. 1109-1132.

216. Zimmerman S.B., Minton A.P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Armu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1993, v. 22, p. 27-65.

217. Schindler Т., Nordmeier E. The stability of polyelectrolyte complexes of calf-thymus DNA and synthetic polycations: theoretical and experimental investigations. -Macromol. Chem. Phys., 1997, v. 198, 5, p. 1943-1972.

218. Kenworthy A.K., Hristova K., Needham В., Mcintosh T.J. Range and magnitude of the steric pressure between bllayers containing phospholipids with covalently attached polyfethylene glycol). Biophys. J., 1995, v. 68, 5, p. 1921-1936.

219. Машковский М.Д. Лекарственные средства (пособие для врачей). 12-е изд. М.: Медицина, 1993, т. 2, с. 79.

220. Skurldin S.G., Hall J., Turner A.P.F., Yevdokimov Yu.M. Restructuring space ordering of (BNA-protamine) complexes in liquid crystalline dispersions under proteolytic enzyme treatment, Liquid Cryst., 1995, v. 19, 5, p. 595-602.

221. Bas N.K., Barker C. Mitotic chromosome condensation in the sperm nucleus during postfertilizatlon maturation division in urechis eggs. J. Cell Biol., 1976, v. 68, 1, p. 155-159.

222. Marushige Y., Marushige K. Enzymatic unpacking of bull sperm chromatin. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 403, 1,p. 180-191.

223. Hohn T. Packaging of genomes in bacteriophages:a comparison of ssRNA bacteriophages and dsBNA bacteriophages. -Phil. Trans. Roy. Soc. London B, 1976, v. 276, 1, p. 143-150.

224. Earnshaw W., Casjens S., Harrison S.C. Assembly of thehead of bacteriophage P22: X-ray diffraction from heads, proheads and related structures. J. Mol. Biol., 1976, v. 104, 2, p. 387-410.

225. Bellus H., Worcel A. Electron microscopic visualization of the folded chromosome of Escherichia coll. J. Mol. Biol., 1974, v. 82, 1, p. 107-109.

226. Golomb H.M., Bahr G.F. Electron microscopy of human interphase nuclei. Determination of total dry mass and DNA-packing ratio. Chromosoma (Berl.), 1974, v. 46, 3,p. 233-245.

227. Kavenoff R., Bowen B.C. On the organization of BNA in isolated bacterial chromosomes. Stadler Symp., University of Missouri, 1977, v. 9, p. 159-168.

228. Tlnoko I., Bustarnante C., Maestre M.F. The optical activity of nucleic acids and their aggregates. Annu. Rev. Blophys. Bioeng., 1980, v. 9, 1, p. 107-141.

229. Дембо А.Т., Добров E.H., Леднев В.В., Тихоненко Т.И., Фейгин Л.А. Об упаковке ДНК внутри головок бактериофагов Д~, Т2 и Сд. Биофизика, 1965, т. 10, 3, с. 404-407.

230. North А.С.Т., Rich A, X-ray diffraction studies of bacterial viruses. Nature, 1961, v. 191, 4795, p. 1242-1245.

231. Bram S., Rls H. On the structure of nucleohistone. -J. Mol. Biol., 1971, v. 55, 3, p. 325-336.

232. Subirana J.A., Martinez A.B. Model studies of chromatin structure based on X-ray diffraction data. Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, 11, p. 3025-3042,

233. Wilkins M.H.F., Zubay G., Wilson H.R. X-ray diffraction studies of the molecular structure of nucleohistone andchromosomes. J. Mol. Biol., 1959, v, 1, 2, p. 179-185.

234. Klimenko S.M., Tikchonenko T.I., Andreev Y.M. Packing- of BNA in the head of bacteriophage T2. J. Mol. Biol., 1967,v. 23, 3, p. 523-533.

235. Tikchonenko T.I. Conformation of viral nucleic acids in situ. Adv. Virus Res., 1969, v. 15, p. 201-209.

236. Richards K.E., Williams R.C., Calendar R. Mode of BNA packing within bacteriophage heads. J. Mol. Biol., 1973, v. 78, 2, p. 255-259.

237. Maestre M.F., Tinoko I., Jr. Optical rotatory dispersion of viruses. J. Mol. Biol., 1967, v. 23, 3, p. 323-335.

238. Тяглов Б.В., Крылов В.Н., Плотникова Т.Г., Минаев В.Е., Пермогоров В.И. Некоторые физико-химические свойства бактериофага qcKZ. Молекуляр. биология, 1980, т. 14, 5,с. 1019-1022.

239. Clark L.C., Jr., Lyons С. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann. N.Y, Acad. Sci., 1962, v. 102, 1, p. 29-45.

240. Биосенсоры: основы и приложения. Под ред. Э.Тернера, И.Карубе и Дж.Уилсона. М.: Мир, 1992, с. 5-614.

241. Евдокимов Ю.М., Бундин B.C., Островский М.А. Биосенсоры и сенсорная биология. Сенсорные системы, 1997, т. 11, 4,с. 374-387.

242. Bowris М.Е.А., Kobayashi 3., Karube I. New BNA technology and the BNA biosensor. Anal. Lett., 1987, v, 20, 12,p. 1897-1927.

243. Millan K.M., Saraulo A., Mikkelsen S.R. Voltammetric BNA biosensor for cystic fibrosis based on modified carbon pasteelectrode. Anal. Chem., 1994, v. 66, 18, p. 2943-2948.

244. Gebhart C.J., Ward G.E., Murtaugh M.P. Species-specific cloned DNA probes for the identification of Campylobacterhyointestinalis. J. Clin. Microbiol., 1989, v. 27, 12, p. 2717-2723.

245. Matthews J.A., Kricka L.J. Analytical strategies for the use of DNA probes. Anal. Biochem., 1986, v. 169, 1, p. 1-25.

246. Трухан Э.М. Биосенсоры в системе оперативной оценки пригодности среды обитания. Сенсорные системы, 1998, т. 12, 1, с. 135-144.

247. Yevdokimov Yu.M., Salyanov Y.I., Palumbo M. Liquid crystalline state of DNA molecules complexed with biologically active compounds. Mol. Cryst. Liq. Cryst., 1985, v. 131, 3-4, p. 285-297.

248. Молекулярные основы действия антибиотиков. М.: Мир, 1975, с. 5-500.

249. Nicoletto М.О., Padrini R., Ferrazzi E., Nascimben 0., Visona E., Tumolo S., Palumbo M., Costa L., Vinante 0., Monfardini S., Florentino M.V. Phase I-II intraperitoneal mltoxantrone in advanced pretreated ovarian cancer. Eur. J.

250. Cancer, 1993, v. 29A, 9, p.1242-1248.

251. Shindo Y., Ohmi Y. Problems of CD spectrometers. 3. Critical comments on liquid crystal induced circular dichroism, J. Amer. Chem. Sos., 1985, v. 107, 1, p. 91-97.

252. Выражаю глубокую благодарность научному консультанту работы проф. Ю.М.Евдокимову за постоянную помощь и поддержку в организации исследований, а также полезные советы при обсуждении результатов.

253. Благодарю А.Г.Габибова, Л.В.Григорову, С.Н.Кочеткова, О.Н. и И.С.Кулаевых, Г.Б.Лорткипанидзе, В.С.Прасолова, В.О.Речинского, К.Т.Турпаева и А.Р.Хомутова за дружеское расположение, которое поддерживало меня на всех этапах работы.

Информация о работе

Скуридин, Сергей Геннадьевич
доктора биологических наук
Москва, 1999
ВАК 03.00.03

Диссертация

Управление пространственной организацией жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот при помощи биологически значимых факторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы