Статистическая термодинамика связывания лигандов с ДНК и РНК

Нечипуренко, Юрий Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Статистическая термодинамика связывания лигандов с ДНК и РНК
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Статистическая термодинамика связывания лигандов с ДНК и РНК"

На правах рукописи

НЕЧИПУРЕНКО ЮРИЙДМИТРИЕВИЧ

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ТЕРМОДИНАМИКА СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ С ДНК И РНК

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта Российской Академии Наук

Научный консультант - доктор физико-математических наук, член-корреспондент РАН Георгий Валерианович Гурский

доктор физико-математических наук, профессор В В Смолянинов доктор физико-математических наук, профессор Д С Чернавский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Защита диссертации состоится "14" апреля 2005 года в 15 30 на заседании Диссертационного совета Д 501 001 96 по физико-математическим наукам при Московском I осударственном Университете им М В Ломоносова по адресу

119992 Москва, Ленгоры, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан «_» марта 2005

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор физико-математических наук

М А Лившиц

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из центральных задач молекулярной биологии. Существует несколько механизмов регуляции экспрессии генов, в которых регуляция осуществляется посредством обратимого связывания белков с ДНК или РНК. Такое связывание может быть описано в рамках представлений о физической адсорбции лигандов на матрицах нуклеиновых кислот. Матрицы нуклеиновых кислот (НК) в этом случае рассматриваются как адсорбенты, несущие решетки реакционных центров, на которых обратимым образом связываются молекулы лигандов. Адсорбция происходит посредством многоточечного связывания лигандов с реакционными центрами матриц. Сейчас можно считать установленным, что подобным образом с НК связывается целый ряд лигандов, в том числе олигонуклеотиды, антибиотики и биологически активные соединения различного происхождения. Однако многие характеристики такого связывания до сих пор неясны. В ряде случаев между лигандами существуют кооперативные взаимодействия, более того, показано, что в модельных системах связывание лиганда может влиять на конформационное состояние матриц НК и влияние это распространяется на участки матриц, отстоящие от места связывания (аллостерический эффект).

нескольких лигандов, позволили бы рассмотреть влияние адсорбции лигандов на состояние матрицы и другие явления, наблюдаемые в молекулярной биологии. Изучение таких моделей позволит анализировать изотермы адсорбции, диаграммы фут-принтинга и другие количественные характеристики, которые могут быть получены при исследованиях молекулярно-биологических систем

До настоящего времени применение теории адсорбции к связыванию лигандов с НК было эпизодическим Изучая связывание разных лигандов с матрицами НК, исследователи чаще всего пользовались одной моделью, в которой учитываются контактные кооперативные взаимодействия между ближайшими соседними адсорбированными лигандами, изредка предлагались новые модели, но ни систематического описания разных моделей адсорбции, ни сравнительного изучения их свойств до последнего времени в литературе не существовало По мере рассмотрения все более сложных систем возникали все более сложные модели адсорбции, но не существовало описания разных моделей с единой точки зрения Между тем, без такого описания трудно надеяться на то, что выбранная исследователем модель будет единственно возможной Исследователей интересует, как правило, не получение уравнений связывания и расчет изотерм адсорбции в рамках той или иной модели, а решение "обратной" задачи выбор модели адсорбции на основании количественных данных Однако решение этой задачи до настоящего времени было затруднено из-за отсутствия классификации моделей адсорбции

Цель работы и задачи исследования. Целью работы является развитие теории адсорбции лигандов на матрицах НК и применение ее для анализа молекулярно-биологических систем Для достижения этой цели необходимо формирование научного аппарата теории адсорбции, включающего "инвентаризацию" методов статистической механики и математических

подходов, используемых в данной области, описание терминологии и введение в рассмотрение широкого набора моделей адсорбции.

Задачами исследования являются:

1) Описание адсорбции лигандов на матрицах НК с единой точки зрения. Разработка методов анализа изотерм адсорбции.

2) Рассмотрение изотерм адсорбции разных видов. Анализ моделей адсорбции с дальними кооперативными взаимодействиями между лигандами.

3) Анализ моделей, в которых на матрицах связываются два разных лиганда и между лигандами существуют кооперативные взаимодействия.

4) Изучение специфического и неспецифического связывания лигандов на фрагментах ДНК.

5) Анализ явления, которое получило название «шум генетической экспрессии» (речь идет об экспериментах по изучению связыванию 1ас-репрессора в клетке Е.соК).

6) Разработка методов, позволяющих рассчитывать диаграммы фут-принтинга. Исследование связывания бис-нетропсина с фрагментом ДНК.

7) Изучение связывания с ДНК молекул, нейтрализующих заряды ДНК (на примере хитозана, связывание которого приводит к формированию жидкокристаллических дисперсий ДНК).

8) Моделирование явления координированной адсорбции (на примере образования наномостиков при связывании лигандов с матрицами ДНК в составе жидкокристаллической дисперсии).

9) Проведение классификации описанных нами и известных в литературе моделей адсорбции.

адсорбции и моделью адсорбции Показано, что этот метод позволяет различить модели, в которых взаимодействие между лигандами приводит к образованию ассоциатов произвольного размера и модели, в которых образуются димеры из связанных на матрице молекул лиганда Продемонстрирована возможность восстановления потенциала кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами

Рассмотрен ряд моделей, позволяющих описывать S-образный вид кривых связывания. Впервые проведена классификация моделей адсорбции, выделены разные типы кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами и описаны модели, учитывающие влияние связывания лигандов на матрицы НК

Построены алгоритмы, позволяющие рассчитывать вероятности специфичного связывания лиганда на разных местах молекулы ДНК с известной последовательностью пар оснований и сравнивать рассчитанные профили распределения лиганда с экспериментальными диаграммами фуг принтинга

Получены уравнения, описывающие связывание лигандов с матрицами НК для широкого класса моделей адсорбции Описаны и реализованы алгоритмы, позволяющие анализировать экспериментальные кривые связывания и оценивать геометрические и энергетические параметры модели адсорбции

При анализе адсорбционных систем мы рассчитывали не только средние значения числа адсорбированных на матрице лигандов, но и стандартные отклонения от средних значений Функция распределения дают более полную информацию о равновесном связывании лигандов с матрицами НК и позволяет более детально описать связывание Дисперсия среднего числа адсорбированных лигандов позволяет оценить «шум» процесса адсорбции Практическая ценность работы состоит в том, что на основании разработанных подходов удается получить информацию о характере

кооперативных эффектов в адсорбционной системе. Такие эффекты наблюдаются при связывании с ДНК как белковых факторов, регулирующих экспрессию генов, так и разного рода низкомолекулярных лигандов, в том числе лекарственных соединений. В работе развиты представления, позволяющие проводить анализ как модельных экспериментальных систем, так и реальных биологических систем. В работе продемонстрировано несколько примеров такого анализа. Показано, что шум генетической экспрессии, измеренный in vivo для Е coli, может быть обусловлен шумом процесса адсорбции.

Полученные в работе уравнения, описывающие кооперативное связывание двух разных лигандов с матрицами НК, применяются для описания адсорбции лигандов в модельных системах.

Проведен анализ расположения нуклеосом на фрагменте ДНК, показано, что такое расположение характеризуется определенной дисперсией.

На примере лекарственного соединения бис-нетропсина продемонстрирован расчет диаграммы фут-принтинга. Такой анализ может быть применен и к другим биологически активным соединениям: компьютерный фут-принтинг позволяет также предсказывать вероятности связывания лигандов, имеющих повышенное сродство к определенным последовательностям пар нуклеотидов на заданных фрагментах ДНК.

Изучено связывание молекул антибиотика дауномицина и ионов меди с матрицами НК в составе частиц жидкокристаллической дисперсии (ЖКД). В работах Ю.М. Евдокимова и соавторов показано, что в результате такого связывания образуются наномостики между молекулами ДНК, сближенными в составе ЖКД. Нам удалось описать образование таких мостиков в рамках модели координированной адсорбции. Анализ экспериментальных данных позволил оценить параметры образования наномостиков. Практическая ценность этих результатов значительна: в последнее время молекулярные конструкции широко используются в создании биосенсоров, и количественное

описание формирования таких структур открывает путь к конструированию биосенсоров.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Биофизика нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов» (Таллинн, 1981), 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Конгрессе европейских биохимических сообществ (Прага, 1984), Всесоюзном совещании «Конформационные изменения биополимеров в растворах» (Тбилиси, 1985), Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и функционированию генома (Тбилиси, 1987), Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1992), Симпозиуме «Математические теории биологических процессов» (Калининград, 1993), Совещании «Геном человека» (Черноголовка 1993), Международной конференции «Молекулярная биология на границе XXI века» (Москва 1994), Московском международном синергетическом форуме (Москва, 1996), Международных конференциях по биомолекулярной структуре и динамике (Олбани, 2001, 2003), П Всероссийском съезде биофизиков (Воронеж, 2004), 22-ом Международном биофизическом симпозиуме (Святой Стефан -Белград, 2004), Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2005), других конференциях и семинарах. Публикации. По материалам диссертации опубликованы 47 печатных работ в ведущих международных и отечественных научных журналах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав, и заключения. Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 60 рисунков и три таблицы.

Благодарности. Автор считает приятным долгом поблагодарить своего научного консультанта Г.В. Гурского, а также соавторов, студентов и аспирантов МГУ и персонально A.C. Заседателева, Ю.М. Евдокимова, Н.Г.Есипову, A.C. Крылова, С.А.Стрельцова, Бошко Йовановича и Александра Вольфа за полезные обсуждения и помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении изложены представления теории адсорбции в применении к изучению связывания лигандов с биополимерами. На Рис. 1 показаны основные этапы такого исследования.

Модель молекулы адсорбата (лиганда)

Физическая модель адсорбции:

а) модели взаимодействий лиганд-

матрица (схема связывания), лиганд-лиганд и матрица-матрица б) термодинамическое описание системы

Модель молекулы адсорбента (матрицы)

I I

Математическая модель адсорбции:

а) система соотношений, описывающих связывание (уравнения адсорбции)

б) решение системы уравнений в) исследование связи между свойствами физической модели адсорбции и поведением модельных кривых связывания г) развитие методов и критериев анализа кривых связывания

I !

Анализ данных, полученных из эксперимента, при помощи теории адсорбции:

а) выбор модели адсорбции б) сравнение величин, рассчитанных теоретически с величинами, полученными экспериментально

в) оценка параметров модели г) интерпретация экспериментальных данных

Первичные экспериментальные данные

Рис. 1. Схема, демонстрирующая взаимосвязи между отдельными этапами исследования связывания лигандов с матрицами НК при помощи теории физической адсорбции.

В процессе применения теории адсорбции к анализу реальных систем можно выделить несколько этапов: это построение схемы связывания (такая схема дает обобщенное представление о взаимодействии лиганда с матрицей), описание взаимодействий между адсорбированными лигандами и, наконец, получение уравнений, описывающих связывание. Совокупность таких уравнений формирует математическую модель адсорбции - и уже эти уравнения применяются для анализа кривых связывания, получаемых в эксперименте. Совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными при определенном наборе параметров модели, характеризующих связывание, может рассматриваться как свидетельство в пользу того, что модель адсорбции адекватна реальной ситуации. Заметим, что в последние годы наблюдается повышение интереса научного сообщества к проблемам теории адсорбции, однако сейчас нет обобщающего труда, в котором бы суммировались результаты, достигнутые в этой области. Монография А.А.Лопаткина «Теоретические основания физической адсорбции» вышла уже более 20 лет назад и в настоящее время ощущается необходимость заполнения «лакуны» в этой области знания.

Глава 1. Описание связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами

Теория адсорбции применялась в исследованиях связывания лигандов с НК от случая к случаю, и, несмотря на значительные успехи, которые были достигнуты в изучении связывания конкретных соединений с НК (например, были построены модели связывания с ДНК антибиотиков дистамицина А, нетропсина и хекста), сама теория адсорбции в этой области не получила систематического развития.

Основы применения теории адсорбции к изучению связывания лигандов с биополимерами были заложены в работах Крозерса (Cгotheгs, 1968) и Заседателева, Гурского и Волькенштейна (Заседателев и др , 1971 и Гурский и др , 1972) В этих работах в рамках решеточной модели адсорбции рассматривалось связывание на линейных полимерах лигандов, закрывающих при связывании Ь звеньев полимера В такой модели сложное, но периодическое поле вблизи поверхности матрицы-адсорбента заменяется дискретной, также периодической системой центров В одномерном случае реакционные центры образуют цепочку На Рис 2 а схематически показана адсорбция лиганда, который занимает при связывании два реакционных центра матрицы

Рис. 2. а Схема связывания лиганда с матрицей НК.

К - константа связывания лиганда с матрицей, в данном случае при связывании лиганд занимает Ь - 2 реакционных центра

Рис. 2. б Взаимодействия между адсорбированными лигандами.

Возможно притяжение или отталкивание между ближайшими соседними на матрице лигандами

На Рис 2 б схематически показаны взаимодействия между ближайшими соседними адсорбированными лигандами Такие взаимодействия описываются в общем случае потенциалом кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами

После построения решеточной модели адсорбции необходимо определиться, в рамках какой именно термодинамической системы будет рассматривается взаимодействие молекул НК с лигандами Обычно речь идет

об открытой системе, которая обозначается (р,р,Т)- здесь независимыми переменными являются химический потенциал лиганда в растворе Ц, давление р и температура Е(Хилл, 1956). Рассматривая в качестве системы матрицу с адсорбированными лигандами, которая находится в растворе при постоянном давлении и постоянной температуре, мы предполагаем, что эта система является открытой, в том смысле, что лиганды могут адсорбироваться на матрице и десорбироваться с нее: происходит обмен веществом с раствором, в котором находятся свободные молекулы, имеющие определенный химический потенциал.

Число моделей адсорбции, предложенных для описания связывания, относительно невелико. Можно сказать, что почти все они представляют собой вариации моделей, развитых в работах Крозерса и Гурского с соавторами. Существенной новацией можно признать модели, в которых рассматривается взаимодействие между матрицами, покрытыми лигандами. Модели такого рода развиты в работах Поршке (Porschke 1991), Ландо и Тэйфа (Lando D., TeifV., 2002) и Сгрельцова с соавторами (см., например, Streltsov S.A. et al 2003). Между тем, число математических подходов, позволяющих получать уравнения адсорбции, весьма велико. Десятки и сотни работ были посвящены получению уравнения адсорбции в рамках разных подходов для одних и тех же моделей адсорбции.

Наиболее полно и детально адсорбцию лигандов на матрицах НК можно описать с помощью функции распределения, введенной в применении к связыванию лигандов в работах Рейтера и Эпштейна (Reiter J., Epstein I.R., 1989). Недавно эта функция была подробно рассмотрена Поландом (Poland D., 2001), в случае некооперативного связывания она соответствует распределению Гаусса.

Глава 2. Функция распределения, описывающая связывание лигандов. Шум генетической экспрессии. Давление решеточного газа. Связывание хитозана с ДНК

2.1 Давление решеточного газа

Рассмотрим некооперативное связывание на матрице лиганда, закрывающего Ь расположенных подряд реакционных центров матрицы. Эти Ь центров мы будем называть связывающим местом лиганда на матрице. Предположим, что лиганд не может «свешиваться» с концов матрицы. Пусть матрица имеет N центров, и на ней адсорбировано q лигандов. При q» \ уравнение адсорбции хорошо известно (Заседателев и др., 1971):

~Кт

' 1 -гЬ

(1 -гЬ + г).

,1-П + г,

Здесь г -ц/N - заполнение матрицы лигандом, К - константа связывания лиганда со связывающим местом на матрице, т - концентрация свободного лиганда в растворе. Обозначим через Р вероятность обнаружить в последовательности из свободных центров и связанных лигандов свободный (не закрытый лигандом) центр:

Здесь г = щ/Ы- заполнение матрицы лигандом. Уравнение некооперативного связывания лиганда на матрице (1) можно записать в виде (СгоШеге, 1968):

Величина Р связана с большой статистической суммой следующим

соотношением:

Рассматриваемая система адсорбированных на матрице молекул эквивалентна решеточному газу. Можно ввести в рассмотрение "давление" такого газах (Хилл, 1960) с помощью соотношения:

Давление решеточного газа х имеет размерность энергии и связано с вероятностью обнаружить свободный (не закрытый лигандом) реакционный центр на матрице. Чем ниже такая вероятность, тем выше давление одномерного решеточного газа адсорбированных лигандов. При изменении длины матрицы на 1 центр такой газ совершит определенную работу. Если концы рассматриваемой матрицы ограничены белками, которые прочно связаны с ДНК, то при сдвиге одного из таких белков в системе произойдет изменение свободной энергии. Белки, ограничивающие матрицу ДНК по краям, можно сравнить со стенками, а саму матрицу - с одномерным сосудом, в котором заключен газ. Иными словами, система стремится к увеличению своего объема (в одномерном случае этот объем соответствует размеру матрицы). По мере добавления лигандов в раствор и увеличения К т, давление одномерного газа адсорбированных лигандов на "стенки" увеличивается. Это явление может быть использовано для регуляции генетической экспрессии, когда речь идет о включении и выключении целых хромосомных доменов, состоящих из участков ДНК, покрытых адсорбированными лигандами и ограниченных связанными молекулами белков.

*ЛГ=кГ1пЕ,

(5)

Из (4) в этом случае получаем:

х = -кТ1пР.

(6)

2.2 Связывание хитозана с ДНК

Некооперативное связывание лигандов с молекулами ДНК приводит к тому, что в растворе находятся в равновесии молекулы ДНК с разным числом адсорбированных лигандов. Для заданной концентрации свободного лиганда в растворе т такое равновесие характеризуется функцией распределения, которая описывает вероятность обнаружить в растворе молекулу ДНК с определенным числом адсорбированных лигандов. В случае, если в качестве лигандов выступают поликатионы, молекулы ДНК, на которых связано достаточное для нейтрализации зарядов на фосфатах число лигандов, могут претерпевать фазовый переход. Подобный переход может приводить к образованию жидкокристаллических дисперсий (ЖКД). Известно, что такие дисперсии образуются при связывании ДНК с хитозаном (Евдокимов и др., 2001).

Мы предприняли попытку теоретически описать адсорбцию хитозана на молекулах ДНК (имеющих размер несколько сотен пар нуклеотидов) в случае, когда хитозан рассматривается как протяженный лиганд, занимающий при связывании несколько десятков пар нуклеотидов ДНК.

Пусть при связывании на одной жесткой двухцепочечной молекуле ДНК (молекулярная масса которой не превышает 106 Да), некоторого «критического» числа лигандов , молекула ДНК становится способной к взаимодействию с другими молекулами ДНК, и это обеспечивает, в конечном счете, их переход в конденсированное состояние. Условимся называть далее состояние матрицы ДНК, на которой связано или более лигандов (то есть заряды которой компенсированы в достаточной степени) «измененным» состоянием или состоянием 2 (обозначая обычное состояние матрицы ДНК как состояние 1). По мере возрастания концентрации хитозана в растворе все

большее число молекул ДНК переходит в состояние 2, что делает возможным их взаимодействие и образование частиц ЖКД (Рис. 3).

Рис. 3. Состояния ДНК с разной степенью покрытия лигандом и конденсация комплексов ДНК-лиганд при достижении "критической" степени покрытия.

1 2 3

ДНК может существовать в трех состояниях: обычном - когда покрытие лигандом меньше критического значения (1), измененном - когда покрытие лигандом больше критического значения (2) и в составе холестерика (3), образованного соседними молекулами комплекса ДНК-лиганд.

Состояние 3 - это жидкокристаллическое состояние, легко обнаруживаемое по величине аномального оптического сигнала в спектре КД Чтобы рассчитать концентрацию молекул ДНК, находящихся в состоянии 2, надо найти вероятность того, что на матрице адсорбировано лигандов больше, чем С другой стороны, эта же величина равна вероятности обнаружить в растворе молекулу ДНК, на которой адсорбировано лигандов больше, чем

Обозначим через ^(фспО вероятность обнаружить в растворе молекулу ДНК с числом лигандов больше критического значения. Мы показали, что вычисляется с помощью соотношения:

Здесь Ф>(ф - функция распределения, соответствующая вероятности обнаружить в растворе молекулу ДНК с q адсорбированными лигандами-

Обозначим через С^ полную концентрацию лиганда в растворе Тогда

С„, =т + ^ЧФ(д)Си, (9)

где - концентрация матриц в растворе

Уравнения (7-9) позволяют рассчитать долю молекул ДНК, которые перешли в состояние 2, в зависимости от концентрации лиганда в растворе

На Рис. 4 показан пример того, как смещается функция распределения вдоль оси q по мере увеличения концентрации свободного лиганда т' все большее число молекул ДНК несет на себе число лигандов соответственно, возрастает величина

Рис. 4. Функции распределения, характеризующие связывание лиганда с молекулами ДНК для разных значений концентрации свободного лиганда в растворе.

ДНК имеет размер N = 800 пар оснований, лиганд покрывает при связывании 1 = 17 пар оснований Кривые 1,2 и 3 рассчитаны по формуле (8) для значений Кт, равных 0,01, 0,163, и 0,872, соответственно. Заштрихованная область соответствует доле молекул ДНК, на которых связано 38 или более лигандов (такие молекулы ДНК переходят в состояние 2, в соответствии с моделью, проиллюстрированной на рис 3)

В работе (Yevdokimov, Salyanov, 2003) были получены количественные данные о связывании хитозана с ДНК. Мы проанализировали кривые

связывания для молекул хитозана различной массы и показали, что все они могут быть описаны в рамках изложенной выше модели (см. Рис. 5).

Рис. 5. Экспериментальные и теоретические кривые, описывающие связывание молекул хитозана различной молекулярной массы с ДНК.

R - величина сигнала, нормированная на максимальное значение сигнала для измерений поглощения, концентрация хитозана в растворе, М -молекулярная масса хитозана. Непрерывными линиями показаны результаты теоретических расчетов соответствующих кривых для случая, когда молекула ДНК переходит в измененное состояние при степени покрытия ДНК хитозаном, равной а - 0,8, пунктиром показаны кривые, рассчитанные для а = 0,7.

2.3 Шум генетической экспрессии

В работе Еловица и соавторов (Elowitz M.B. et al 2002) благодаря специально сконструированной системе, в которой связывание /ас-репрессора определяло экспрессию репортерных генов, придающих клетке разный цвет, был определен шум генетической экспрессии. Такой шум возникает из-за того обстоятельства, что производство белков определяется в клетке одним геном, и, соответственно, процессами, происходящими на уровне единичных молекул ДНК и мРНК. Флуктуации активности репортерного гена могут быть обусловлены шумом адсорбционного процесса, соответствующего связыванию репрессора, который контролирует экспрессию этого гена.

В соответствии с данными Еловица и соавторов, в условиях, в которых проводился эксперимент, репрессор связан на операторном участке с вероятностью г = 0,97 Дисперсия этой вероятности равна:

Из этого соотношения в случае г = 0,97 следует ст =0,17. Иными словами, шум адсорбционного процесса, обусловленный статистическими свойствами связывания репрессора, составляет 17%. В тоже время шум генетической экспрессии по данным Еловица и соавторов, составляет 24%. Таким образом, шум адсорбционного процесса, соответствующего связыванию репрессора с операторным участком ДНК, составляет большую часть шума экспрессии.

Дисперсия связывания характерным образом зависит от концентрации свободных лигандов в растворе (см. Рис. 6, а также работу Бабаяна и соавторов (2001)) В случае, когда произведение константы связывания К на концентрацию свободного в растворе лиганда т равно единице, реализуется максимальная неопределенность: связывающее место может быть занято

в этом случае

Рис. 6. Зависимость заполнения одного места связывания лигандом от произведения концентрации свободного лиганда в растворе на константу связывания.

Кривая 1 показывает заполнение г матрицы лигандом единичной длины, кривая 2 - корень из дисперсии -в зависимости от произведения константы связывания на концентрацию свободного лиганда в растворе Кт Пунктирными линиями показаны значения величин г ± О N2 .

лигандом или свободно с равной вероятностью дисперсия максимальна: = 1/2.

Таким образом, мы можем предсказать увеличение шума генетической экспрессии при уменьшении константы связывания /ас-репрессора с /ас-оператором или уменьшении концентрации /ас-репрессора в растворе.

Глава 3. Асимптотический метод анализа кривых связывания. Неконтактные взаимодействия между адсорбированными лигандами

В рамках широкого класса моделей адсорбции, в которых учитываются кооперативные взаимодействия между адсорбированными молекулами лиганда и общим для которых является рассмотрение связывания с матрицей протяженного лиганда, уравнение изотермы адсорбции в представлении Скетчарда может быть записано в виде:

у(г) = - = КеКп(г), т

(10)

где - число связывающих мест, соответствующее модели, когда лиганд связывается с матрицей некооперативно (см. (1)):

- эффективная константа связывания (которая может тем или иным образом зависеть от г). Рассматривая асимптотику уравнения (10), обнаруживаем, что величина соответствующая ординате кривой связывания в представлении Скетчарда, при г —► 1/£ стремится к нулю, как

Это свойство изотерм адсорбции определяется базовыми свойствами модели адсорбции, которая описывает связывание протяженного лиганда. В более или менее широкой области заполнений

адсорбции, соответствующая кооперативному связыванию лиганда, будет подобна изотерме, соответствующей некооперативному связыванию лиганда той же длины Ь. Коэффициент этого подобия и размер области, где такое подобие сохраняется, несут информацию о кооперативных взаимодействиях между адсорбированными лигандами. Мы предложили применять для анализа модельных кривых следующее представление:

Я(г) = 1п-

(12)

т п(г) '

Здесь п(г) задается соотношением (11). В следующей главе будет показано, как это представление позволяет дискриминировать кривые, соответствующие разным моделям адсорбции.

3.2. Неконтактные взаимодействия между адсорбированными лигандами

Неконтактные взаимодействия между лигандами могут быть обусловлены изменениями конформации матрицы (см. Рис. 7). Известно, что

Рис. 7. Схема, иллюстрирующая аллостерический эффект ДНК.

Вверху схематически показана матрица ДНК. Каждая лунка соответствует одному реакционному центру пары оснований ДНК. Связывание первого лиганда на матрице (показан слева) происходит с константой К. В результате такого связывания участок матрицы переходит в возмущенное состояние. Связывание последующего лиганда на расстоянии меньше, чем 6 пар нуклеотидов, характеризуется константой К .

Внизу показан потенциал прямоугольной формы описывающий в этом случае взаимодействия между лигандами, адсорбированными на ДНК.

ряд лигандов при связывании может переводить участок молекулы ДНК в возмущенное состояние (так называемый «аллостерический эффект ДНК», обнаруженный в работах Крылова и соавторов и Крозерса и соавторов). Мы рассмотрели описание кооперативных взаимодействий такого рода с помощью потенциала взаимодействий в виде прямоугольной ямы (Кгу^ et а1., 1978).

Результаты расчетов изотерм адсорбции, соответствующих таким потенциалам, показаны на Рис. 8.

Рис. 8. Изотермы

адсорбции,

соответствующие

потенциалу в виде

прямоугольной

ямы.

Длина лиганда 1 = 5, константа связывания К = 1. 1 — изотерма, соответствующая некооперативному связыванию; кривые 2 — 5 рассчитаны в случае, когда потенциал, показанный на Рис. 7, имеет длину / = 20, а параметр кооперативности со — К'/К варьируется:

Каждая кривая близка к соответствующей изотерме, рассчитанной для некооперативного связывания лиганда с константой

Из Рис. 8 видно, что при г > 0,1 кривые, соответствующие кооперативному связыванию, не отличаются от изотерм некооперативного связывания с константами, соответствующими параметр кооперативности, определяется уравнением (10).

Глава 4. Контактные взаимодействия между адсорбированными лигандами

Рассмотрим ситуацию, когда на матрицах НК конкурентно связываются лиганды двух типов. Связываясь, лиганд типа а (а =1, 2) закрывает подряд Ьа мономерных центров матрицы так, что ни одно звено матрицы не может быть занято двумя молекулами лиганда. Эти Ьа центров мы называем связывающим местом лиганда а на матрице. Обозначим через,гаа концентрацию свободного лиганда а в растворе, га - заполнение матрицы лигандом а (число адсорбированных лигандов в расчете на одно звено матрицы). Если N >> Ь\ ¿2 (приближение бесконечной матрицы), уравнения адсорбции не будут зависеть от N Все величины, характеризующие матрицу с адсорбированными лигандами, удобно нормировать в этом случае на один центр матрицы Например, число адсорбированных лигандов на матрице г~ Г\ + число центров матрицы, не накрытых адсорбированными лигандами

Пусть Ка - константа связывания лиганда а с изолированным связывающим местом, при связывании на котором не образуется контактов с другими адсорбированными лигандами (Рис 9, а)

СО

Рис. 9. Связывание двух лигандов на матрице.

а. Лиганд а адсорбируется из раствора на изолированном связывающем месте матрицы. - длина лиганда.

б. Два лиганда адсорбированы так, что правый конец лиганда образует контакт с левым концом лиганда

Если центр матрицы, граничащий справа со связывающим местом лиганда занят левым концом лиганда то при связывании лиганда

образуется контакт между правым концом лиганда и левым концом лиганда Д (Рис. 9, б). Константа связывания лиганда а с таким местом равна КаСОар . Множитель Юа|) мы будем называть параметром кооперативных взаимодействий между лигандами находящимися в контакте

обозначает два ближайших соседних лиганда, адсорбированных так, что лиганд а предшествует лиганду

Имеется всего четыре параметра а> а р. описывающих контактные кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами- а>\\, (Оух, 0)21 И со22. Если при связывании лиганда а образуется два контакта - с адсорбированным слева лигандом /? и адсорбированным справа лигандом V (V =1, 2), то константа связывания равна Ка (0аУ

Обозначим через Урп число пар лигандов (/?, а), в которых правый конец лиганда р контактирует с левым концом лиганда а Число лигандов а, левый конец которых не контактирует с другими лигандами, равно (напомним, что нормированы на одно звено матрицы)

Условие химического равновесия для связывания лиганда а на изолированном связывающем месте записывается в виде

(Ги-Ла-Уга)(га-Уа]-Га2) га

= К(УР"а + \\-гх1л-г211). (13)

т.

Условие равновесия для связывания лиганда а с константой Кат^

^'а-КаЮра^Ь-Гт 'Г О4)

Здесь Р выражается при помощи (15)

Р-

МУ*! 'У)

1 -г,Ц-ггЬг

: (15)

где

Г^ГаА

ар

Уравнения (13) - (15) представляют собой систему из шести уравнений для шести неизвестных

4.2. Характер расположения лигандов на матрице

Введем в рассмотрение у^г) — число пар лигандов (а Д) таких, что лиганды аир разделяют г свободных звеньев полимера Тогда у„Д0)= Зависимости детально характеризуют расположение лигандов на полимере Эти зависимости можно найти следующим образом в случае число пар лигандов разделенных центром матрицы, в Р раз

отличается от

где Р — вероятность встретить свободный центр матрицы (см (15)) Если между адсорбированными лигандами существуют кооперативные взаимодействия, то в распределении пар лигандов по расстояниям (16) появится больцмановский множитель Для контактных кооперативных взаимодействий

(16)

УСф(1)=РУа$)/(Оа11

Из(16)следует

1п УаДО = 1п Уоф — 1п 0),ф + г 1п Р

4 3. Связывание лиганда, образующего два типа комплексов с матрицей

Многие лиганды при связывании с ДНК образуют два различных типа комплексов. Если эти комплексы имеют различную длину то при

заполнениях ДНК лигандом, близких к насыщающему значению г^, комплексы, имеющие большую длину, будут вытесняться. Это вытекает из того факта, что заполнение ДНК комплексом типа а имеет асимптотику:

Если Заметим, что суммарное заполнение

матрицы лигандом при возрастании концентрации свободного

лиганда в растворе не может убывать.

В случае на матрице сосуществуют оба типа

комплекса. Этот случай представляет особый интерес, потому что двойная спираль ДНК имеет ось симметрии второго порядка и два типа комплексов лиганда с ДНК могут быть обусловлены связыванием лиганда на матрице ДНК в двух альтернативных ориентациях. В этом случае возможны два способа упорядоченного расположения лигандов на ДНК, соответствующие двум различным типам кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами.

4.3.0. Кооперативные взаимодействия, приводящие к образованию цепочеквзаимодействующихлигандов

Рассмотрим случай, когда при связывании лиганда на матрице образуется один тип комплекса: г2 = О, У22 ~ Уч=У2\ = 0- Подставив в (13), (14) вместо получаем:

где ;г —заполнение полимера лигандом, у — число контактов между адсорбированными лигандами. Уравнения (18), (19) впервые получены Заседателевым и соавт. (1971).

В предыдущей главе мы показали, что при г —> гтах кооперативное связывание лиганда можно представить как некооперативное связывание лиганда той же длины, которое характеризуется некоторой эффективной константой К^.. Это означает, что при г —* гтгх уравнения (18), (19) можно представить в виде:

*Клф) (20)

Мы показали, что: п(г)

(21)

Степенная зависимость (21) обусловлена способностью лигандов образовывать цепочки из адсорбированных на матрице молекул. Такие цепочки мы назвали агрегатами, а соответствующие кооперативные взаимодействиями - агрегационными [9, 16]. На Рис. 10 приведены изотермы, соответствующие этому случаю.

Рис. 10 Изотермы адсорбции, соответствующие кооперативным взаимодействиям, приводящим к образованию цепочек из лигандов на матрице.

Изотермы адсорбции рассчитаны для лиганда длины ¿=5 1 — (0=1, некооперативное связывание;

Кривые 2' — 4' соответствуют кривым 2 — 4 в представлении Н(г)

4.3.6. Кооперативные взаимодействия, приводящие к образованию димеров из адсорбированныхлигандов

Пусть кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами возникают только в том случае, когда правый конец комплекса 1 приходит в контакт с левым концом комплекса 2: со^ — со, С0ц = СО22 ~ й>21 = 1 Подставив эти значения параметров в (13) - (15), получаем:

где у — у 12, т — концентрация свободного лиганда в растворе Изотермы, рассчитанные при помощи (23), показаны на Рис 11

Рис. 11. Изотермы

адсорбции,

соответствующие

кооперативным

взаимодействиям,

которые приводят

к образованию

димеров из

адсорбированных

лигандов

Рассматривается случай (0\ \ = (Оц — й>22 = !> 012 = ЮО. Лиганд образует при связывании с ДНК два комплекса, имеющих одинаковую длину L = 5. Изотермы рассчитаны при помощи (23) для различных отношений констант связывания 1 — К\!Кг = 1, 2 — К]/К2 = 0,1,3—К\/К2 =0. Кривые 1', 2 соответствуют изотермам 1,2 в представлении Н(г)

При любых значениях К\ и Kj вид изотермы (23) резко отличается от вида кривой (18), (19), соответствующей кооперативным взаимодействиям агрегационного типа

В случае К\ = К2 при г —» 1/ L из (23) получаем y-Wft>/2I(V&> +1) (24)

У = 1/2Z. соответствует полностью упорядоченному расположению адсорбированных лигандов, когда комплексы 1 -го и 2-го типов чередуются Такая упорядоченность обеспечивает максимально возможное число взаимодействующих лигандов Для уравнений адсорбции (23) при г —* 1/L повышение ATcff за счет кооперативных взаимодействий между лигандами мало (~Vco) Это обусловлено тем, что на матрице не образуются длинные цепочки, все ближайшие соседние молекулы в которых взаимодействуют между собой Образуются «димеры» - пары взаимодействующих лигандов, таких, что комплекс 1-го типа предшествует комплексу 2-го типа По виду изотермы адсорбции можно определить тип кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами

Заметим, что уравнения, полученные в этой главе, были использованы в ряде работ по анализу связывания лигандов с ДНК (Круглова и соавторы, 1990 - 2005) Вывод этих уравнений с помощью разных методов был повторен также в работах Вольфе и Михана (Wolfe A R , Meehan T, 1992) и Торральба с соавторами (Torralba A S et al, 2001)

Глава 5. Анализ распределения лигандов, адсорбированных на гомополимерных и гетерополимерых матрицах

Метод фут-принтинга позволяет получать информацию о расположении белков и биологически активных лигандов на фрагментах НК Анализ такой информации затруднен в том случае, если белок может занимать много альтернативных мест связывания на НК и в суммарную картину вносит вклад

множество различно расположенных белков на фрагменте ГОС. Тогда следует учитывать статистические факторы, обусловленные конкуренцией мест связывания за молекулу белка.

Особый интерес представляет тот случай, когда рассматривается расположение гистоновых октамеров на ДНК. Большое число подчас противоречивых экспериментальных работ было посвящено проблеме фазировки расположения гистоновых октамеров на ДНК. Определенная упорядоченность расположения октамеров на ДНК будет наблюдаться и в том случае, когда сами октамеры неспецифичны к последовательности нуклеотидов, а фазировка обусловлена специальными регуляторными белками, которые, связываясь на ДНК, создают граничные условия для расположения октамеров. Благодаря таким стерическим условиям будет наблюдаться периодичность в расположении октамеров на некотором расстоянии от адсорбированного регуляторного белка.

Мы построили алгоритм, позволяющий предсказывать расположение лигандов на ДНК. Промоделирована ситуация, когда эксперимент по анализу расположения белков на ДНК проводится в растворе, однако общие принципы анализа расположения белков в ситуации, когда на одном фрагменте ДНК может быть связано разное число молекул белка, могут быть применены и для анализа расположения белков на ДНК in vivo.

5.1. Расчет диаграмм фут-принтинга для связывания лигандов на гомополимерных матрицах

Рассмотрим модель некооперативного связывания лиганда, который занимает подряд L центров матрицы длиной N. Обозначим через P(i) вероятность того, что i-е место связывания занято адсорбированной молекулой лиганда, т.е. лиганд закрывает с (г - L + 1) -го по i-й центр матрицы. Тогда из каждых 100 молекул ДНК, находящихся в растворе, в среднем у 100

Р(г) такое место занято лигандом. Обозначим через Щ}) вероятность того, что 1-Й центр матрицы не закрыт лигандом.

В растворе сосуществуют молекулы ДНК с различным числом адсорбированных лигандов, и сами величины вероятностей будут принимать разные значения в зависимости от того, сколько молекул лиганда адсорбировано на молекуле ДНК, для которой мы измеряем эти величины. Из-за этого появляется неопределенность в значениях Р(г) и Мерой такой неопределенности выступают дисперсии этих значений.

Пусть Рч(г) — вероятность того, что г ^ место связывания занято лигандом при условии, что на ДНК адсорбировано ровно q лигандов. Вероятностные картины расположения адсорбированных лигандов на ДНК ^(0 для каждого q назовем модами. Обозначим через /\Дг) вероятность того, что центр матрицы не закрыт лигандом в ситуации, когда на матрице адсорбировано лигандов.

Просуммировав все моды с учетом их статистического веса, можно получить вероятностную картину распределения связанных лигандов на ДНК при заданной концентрации свободных лигандов в растворе т:

Р{ 0 = |>ВД0. (27)

Центр матрицы может быть либо свободным, либо занятым: + + = (28)

Принимая во внимание вес каждого комплекса в растворе (8), вероятность того, что данное звено полимера свободно, равна:

Рассмотрим на примере, как получается суммарная картина распределения Р{(). Пусть длина ДНК N=40 парам нуклеотидов и белок закрывает при связывании Ь= 8 пар нуклеотидов. Тогда при максимальном заполнении ДНК белком на ДНК будет связано д^ ~ [N/1.] = 5 белков. При некоторой концентрации белка в растворе будут встречаться молекулы ДНК без адсорбированных белков, с одним, двумя,..., и пятью адсорбированными белками, вероятность встретить молекулу ДНК с q белками равна величине Ф(<]) (Рис. 12, а) Молекуле ДНК с q адсорбированными лигандами будет соответствовать определенная картина вероятностей расположения белков рд(1) (Рис. 12, б). Суммарная, или усредненная, картина вероятностей расположения белков на ДНК получается в результате суммирования отдельных картин, или мод, Р(1) для каждого из таких фрагментов.

Рис. 12. Анализ расположения на матрице длиной 40 пар нуклеотидов белков, закрывающих при связывании Ь = 8 пар нуклеотидов.

Рассматривается случай Кт ~ 1:

а — в растворе встречаются матрицы без адсорбированных белков, с одним, двумя, тремя, четырьмя и пятью белками ^ -1 - 5 соответственно). Ф(д) — вероятность обнаружить в растворе матрицу с q адсорбированными белками;

б — вероятности связывания белка на -м месте связывания матрицы для каждой из таких матриц

в — вероятность адсорбции белка на г-М месте связывания, полученная суммированием вероятностей Ря{1) с учетом их статистических весов Ф(д). Справа — вероятность Р(I), слева — Р{1) ± V <т2/>(/). 30

Суммируя информацию, полученную с помощью расчетного фут-принтинга, можно представить, как расположены белки на одном отдельно взятом фрагменте ДНК. Это принципиально важно, потому что регуляция генетической активности происходит именно на уровне одной молекулы ДНК.

5.2. Расчет вероятности связывания лиганда с ДНК, несущей заданную последовательность пар нуклеотидов

Конструирование и синтез ДНК - связывающих лигандов, способных узнавать заданную последовательность нуклеотидов и избирательно воздействовать на экспрессию генов, является одним из интенсивно развивающихся направлений молекулярной биологии. Синтетические лиганды могут связываться с разными последовательностями ДНК. Некоторые лиганды могут избирательно влиять на экспрессию гена в культуре клеток (Dickinson et al 1998). Небольшие молекулы лигандов, специфично связывающиеся с определенными последовательностями ДНК, могут стать инструментом влияния на экспрессию генов.

Физико-химические методы обычно позволяют определять среднее число молекул белка, адсорбированных на фрагменте ДНК, как функцию от концентрации свободного белка в растворе. Метод фут-принтинга дает возможность получить детальную информацию о связывании лиганда, определить вероятности связывания лиганда с разными участками фрагмента ДНК. Здесь мы продемонстрируем применение количественного анализа экспериментальных данных о локализации молекулы бис-нетропсина на местах связывания фрагмента ДНК с известной последовательностью пар оснований. Мы получим соотношения, позволяющие рассчитывать вероятности связывания бис-нетропсина с различными местами связывания.

Антивирусные антибиотики нетропсин и дистамицин А были первыми лигандами, для которых установлено специфическое связывание с АТ-кластерами в малом желобке ДНК (Заседателев и др., 1976). С помощью методов рентгеноструктурного анализа и ЯМР - спектроскопии было показано, что данные антибиотики связываются по малой бороздке ДНК в местах расположения четырех или пяти сблоченных АТ - пар. Для повышения специфичности связывания в ряде работ, выполненных под руководством Г.В. Гурского, были синтезированы димерные производные нетропсина и проведены эксперименты по связыванию таких лигандов с ДНК. Было показано, что тип димерного соединения, по стехиометрии связывания соответствующий ковалентному связыванию двух молекул нетропсина в ориентации «хвост-к-хвосту» коротким линкером с остатком платины, (далее - бис-нетропсин), обладает преимущественным сродством к псевдосимметричной последовательности 5'-ТТТТАААА-3'.

5.2.О.Связывание бис-нетропсина с ДНК

Короткие 8 членные ДНК-олигонуклеотиды, содержащие симметричные последовательности: 5'-ТТТТАААА-3' и 5'-ААААТТТТ-3', имеют различные константы связывания с бис-нетропсином. Данные по связыванию бис-нетропсина с двумя различными олигонуклеотидами:

5'_СОТТТТААААСО-3' (I) и 5'-СОААААТТТТСО-3'(П) при анализе кривых титрования показывают, что константа связывания бис-нетропсина с олигонуклеотидом (I) в четыре раза больше, чем с (П).

Здесь мы рассмотрим описанную в первой части этой главы модель адсорбции с определенными модификациями. Пронумеруем пары оснований ДНК от 1 до N, тогда первое место связывания представляет непрерывную последовательность из первых Ь пар, второе место связывания начинается со второй пары и заканчивается Ь + 1 и т.д. Обозначим через К(1) константу

химического равновесия для связывания лиганда на месте, начинающемся с 1 -L + 1 и заканчивающемся (-0Й парой. Как и прежде,. Р{Г) - вероятность того, что такое место связывания занято лигандом, - вероятность того, что 1-ая пара оснований не занята лигандом.

5.2.6. Расчет вероятностей связывания бис-нетропсина с ДНК

Заметим, что константы связывания бис-нетропсина с несколькими последовательностями известны благодаря измерениям, проведенным ранее (ОгокИоувку 8.Ь. & а1, 1998):

Кх (ПТТАААА) =4 10 7М-1, ^2(ААААТТТТ) -107 М"1, (30)

^ Кг (ТТТТСАААА) = 106 М'1.

Назовем места связывания, соответствующие данным участкам ДНК, «сильными». Будем считать, что все прочие места связывания характеризуются «усредненной» константой связывания К.

Для «разнородного» места связывания АТАТССАТАТ (четко выраженная полоса фут-принтинга: отсутствие связывания, см. ниже), численное значение Кт должно быть много меньше 1, поскольку число ОС пар, отделяющих АТ блоки здесь больше, чем у «сильного» места связывания Мы приняли значение для усредненной константы равным К — 5 105.

Все термодинамические характеристики системы можно рассчитать, если известно выражение для большой статистической суммы системы Для расчета большой статистической суммы системы в случае, когда лиганд связывается на полимере неспецифично и (или) специфично, можно использовать метод рекуррентных соотношений.

Рекуррентные соотношения для описания некооперативного связывания протяженных лигандов на гомо- и гетерополимере были получены в работе (Гурский и соавт, 1972)

При специфическом связывании на гетерополимере К(1) зависит от нуклеотидной последовательности в участке ДНК, занимаемом лигандом

Вероятность того, что г-е место ДНК занято лигандом, можно рассчитать с помощью стандартного соотношения

Р(1) ~ д ЩЩт) (32)

Дисперсия, или мера отклонения величины вероятности от среднего значения -ом месте связывания

(33)

Мы рассчитали величины для описанных выше значений

констант Величины дают информацию, которую можно сравнить с данными, получаемыми при помощи метода фут-принтинга Действительно, рассмотрим связывание белка-агента, способного расщеплять фосфорно-эфирные связи, с фрагментом ДНК, на котором адсорбированы молекулы лиганда Если агент может расщеплять связи между соседними свободными нуклеотидами и концентрация его выбрана столь низкой, что наблюдается не более одного разрыва на фрагмент ДНК, число таких разрывов будет пропорционально вероятности того, что соседние нуклеотиды, с которыми взаимодействует агент, являются свободными в комплексе фрагмента ДНК с адсорбированными лигандами Если разрыв происходит между нуклеотидами, то среднее число однотяжевых цепей длиной I нуклеотидов, получаемых после денатурации ДНК, пропорционально вероятности того, что 1-я пара оснований в комплексе ДНК с лигандом была свободна Сравнение распределения олигонуклеотидов по длинам с теоретическим распределением /""(г) позволяет проверить применимость используемой модели

для описания связывания лиганда с фрагментом ДНК и оценить константы,

характеризующие взаимодеиствия лиганда с индивидуальными местами связывания на ДНК. Данное сравнение выполнено на Рис.13

Рис.13 Зависимость вероятности обнаружить ¡-ю пару оснований ДНК не закрытой адсорбированным лигавдом F(i) от номера пары оснований /.

Приведены графики для различных концентраций лиганда, изображенных квадратами (т = 0.125 треугольниками (ш = 0 25 |хМ), кружками|(т = 0.5 цМ), сплошной линией (т = 1 цМ). Ниже показан снимок фут-принтинга также для различных концентраций бис-нетропсина. Дорожка 1 соответствует свободной ДНК; 2 соответствует связыванию по пуринам; 3,8 - продукты расщепления ДНКазой 1 свободной ДНК; 4-7 соответствует расщеплению ДНКазой 1 при связанном бис-нетропсине в концентрации 1, 0.5, 0.25 и 0.125 цМ соответственно.

Заметим, что значения вероятностей связывания на отдельных участках ДНК демонстрирует профили распределения, хорошо известные нам по анализу связывания на гомополимере (Рис. 12). Действительно, три "сильных" места связывания разбивают ДНК на четыре отдельных части. В каждой такой части наблюдается профиль вероятности, соответствующий гомополимерному связыванию с характерными максимумами по краям и периодической структурой, затухающей в центре фрагмента. Дело в том, что лиганды, связанные на "сильных" местах размечают в рамках нашей модели границы фрагментов, которые ведут себя независимо. С точки зрения нашей модели неважно, ограничен ли фрагмент прочно связанным лигандом или концом, с которого нельзя "свешиваться" - в обоих случаях действуют одинаковые граничные условия.

Предложенный нами метод позволяет, основываясь на информации о константах связывания лиганда с отдельными местами ДНК, произвести количественный расчет вероятностей связывания лиганда с молекулой ДНК, несущей заданную последовательность нуклеотидов. Этот метод можно назвать методом "расчетного фут-принтинга", его применение для анализа данных по связыванию лигандов позволяет расширить возможности применения экспериментального фут-принтинга для количественного анализа адсорбции биологически активных соединений на ДНК.

Глава 6. Термодинамические модели, описывающие образование «мостиков» между молекулами нуклеиновых кислот в жидких кристаллах

Мы рассмотрели связывание лигандов с частицами жидкокристаллической дисперсии (ЖКД), образованные из молекул НК длиной 1000 пар нуклеотидов. В одной частице дисперсии находятся примерно десять тысяч молекул НК, эти молекулы упорядочены; расстояние

между соседними молекулами составляет около 30 ангстрем. При упорядочении молекул НК появляется возможность пространственной «фазировки» пар соседних молекул НК, что используется для «молекулярного конструирования». Молекулярное конструирование - это создание на основании молекул НК трехмерных конструкций с регулируемыми свойствами (Евдокимов и соавт., 2003). Такие конструкции представляют собой частицы ЖКД, в которых соседние молекулы НК «сшиты» при помощи «наномостиков». «Наномостиком» мы будем называть полимерный хелатный комплекс, состоящий из чередующихся ионов меди и молекул антибиотика антрациклинового ряда - дауномицина (ДАУ). За образованием мостиков между молекулами НК, фиксированными в структуре холестерической ЖКД, можно следить при помощи метода кругового дихроизма (КД). Хромофоры молекул ДАУ в мостиках упорядочены определенным образом, а система мостиков в целом образует структуру, обладающую собственной оптической активностью, которая проявляется в виде аномальной полосы в спектре КД.

Ниже рассмотрен ряд моделей наномостиков и показано, что примерно с одинаковым успехом можно количественно описать экспериментальные данные в рамках трех разных вариантов модели адсорбции.

6.1. Модель адсорбции

Пусть в растворе при постоянном давлении и постоянной температуре находятся в равновесии частицы ЖКД, состоящие из молекул НК, на которых адсорбированы молекулы ДАУ и ионы меди, а также свободные молекулы ДАУ и свободные ионы меди.

Рассмотрим один квазинематический слой частицы ЖКД в качестве адсорбента. Предположим, что все пары ближайших соседних молекул НК, которые расположены параллельно друг другу в таком слое, лежат друг

относительно друга таким образом, что их можно назвать "фазированными" (см. [35]). В этом случае между каждой парой ближайших соседних молекул может образоваться один мостик на виток (Рис. 14).

С точки зрения теории адсорбции один квазинематический слой, который образуют молекулы НК, можно рассмотреть как набор эквивалентных матриц, каждая из которых состоит из двух решеток реакционных центров. Один полный виток НК можно представить в рамках решетки как один реакционный центр, и две ближайших соседних молекулы НК составляют матрицу реакционных центров (Рис. 14, а и б).

Рис. 14 Схемы связывания, описывающие образование мостиков между молекулами НК.

а. Показаны мостики между ближайшими соседними молекулами НК, расположенными в одной плоскости.

б. Две ближайшие соседние молекулы НК образуют матрицу для связывания лигандов. Один реакционный центр (кружок на рисунке) соответствует одному периоду НК.

в. Возможные структуры мостиков между двумя молекулами НК. Кружками показаны реакционные центры, прямоугольниками -молекулы ДАУ, четырехугольными звездочками - ионы меди. Возможно три варианта образования «мостика» (I, II, Ш).

Матрица реакционных центров является удобной моделью адсорбента, позволяющей свести задачу о связывании молекул ДАУ и ионов меди на плоскости к рассмотрению одномерной адсорбции. Заметим, что матрица в

а шш

□ а □

□ □ а

I I ш

этом случае не является простой цепочкой реакционных центров и не сводится к линейному полимеру. Такая матрица составляется из двух молекул ДНК: между сближенными поверхностями двух молекул ДНК в процессе координированной адсорбции появляется мостик. Координированная адсорбция возникает в ситуации, когда реакционные центры, принадлежащие разным молекулам адсорбента и служащие центрами связывания лиганда сближены и расположены определенным регулярным образом.

Один реакционный центр способен связывать молекулу ДАУ или ион меди и может служить основанием мостика. Каждые две соседние молекулы НК формируют одну такую матрицу. Пусть каждая матрица имеет N стерически возможных мест связывания с ДАУ (т.е. N - число реакционных центров). Существуют три разных варианта образования "мостика" в рамках вышеизложенной модели адсорбции (Рис. 14 в).

I. Мостик начинается и заканчивается молекулами ДАУ, связанными с НК - тогда он будет состоять из п молекул ДАУ и п - 1 ионов меди (п > 1 ).

II. Мостик начинается и заканчивается ионами меди, связанными с НК: тогда он состоит из п молекул ДАУ и п + 1 ионов меди (п > 1 ).

III. Мостик начинается ионом меди и заканчивается молекулой ДАУ, тогда он содержит п молекул ДАУ и п ионов меди.

Рассмотрим первый вариант, который следует из гипотетической молекулярной модели образования мостиков, предложенной Евдокимовым и соавторами (УеуёоЫтоу Уи.М. й а1 1996).

Пусть - свободная энергия взаимодействия молекулы ДАУ с реакционным центром НК, константа связывания ДАУ с одним реакционным центром равна . Предположим, что энергия взаимодействия

ДАУ с реакционным центром НК не зависит от того, входит ли эта молекула в состав мостика или связана отдельно. Обозначим посредством свободную

энергию взаимодействия молекулы ДАУ с ионом меди в мостике Тогда образование "мостика" между двумя реакционными центрами НК будет характеризоваться константой равновесия

К, = ехр(-2&У+(в-1)А*)).

Пусть между реакционными центрами рассматриваемой матрицы (Рис. 14 а) образовано Q мостиков - и по q молекул ДАУ связано еще на каждой из составляющих матрицу молекул НК. Тот факт, что на каждой нити реакционных центров связано по одинаковому числу молекул ДАУ, следует из симметрии системы. Заметим, что каждая из молекул НК входит в две соседних матрицы, так что в сумме на каждой молекуле НК адсорбировано по 2 q молекул ДАУ. Следуя подходу Скэтчарда, можно написать уравнение для изменения свободной энергии системы в реакции образования Q мостиков и связывания 2 q молекул ДАУ. Приравнивая к нулю вариацию свободной энергии по переменным Q и q, можно прийти к уравнениям следующего вида (для первого варианта - когда в мостик входит п молекул ДАУ и п -1 ионов меди):

Здесь - степень заполнения одной нити реакционных центров

молекулами ДАУ, Я = Q/N- степень заполнения матрицы мостиками, свободные концентрации молекул ДАУ и ионов меди в растворе соответственно, Кц = ехр (- Д/).

Уравнения (34, 35) позволяют рассчитывать кривые связывания: зная энергию связывания ДАУ с НК и энергию образования координационных связей между молекулами ДАУ и ионами меди в мостике для любого набора концентраций свободных молекул ДАУ и свободных ионов меди в растворе, можно рассчитать значения заполнений матрицы НК мостиками и молекулами ДАУ.

г = К0С/( \-r-R),

Д(1 - Л)-*, С/С.""1 (1-г-Л)2,

(34)

(35)

6.2. Анализ экспериментальных данных

Экспериментальные данные образования мостиков на поли (И) х поли (Ц), полученные в работе [36], были проанализированы при помощи каждого из трех вариантов модели образования мостиков. Решение уравнений (34, 35) и подобных им уравнений для других вариантов образования мостиков осуществлялось численно. Определялась сумма отклонений экспериментальных заполнений НК мостиками от соответствующих им теоретических значений. Расчеты проводились для трех наборов значений суммарной концентрации Со , соответствующих семейству, состоящему из трех экспериментальных кривых Паре значений энергии (А/, А^) для каждог о П соответствовало свое семейство теоретических кривых.

Результаты расчетов приведены на Рис. 15 для I варианта модели. Если в мостике больше двух молекул ДАУ, все три варианта модели адсорбции примерно с одинаковым успехом описывают экспериментальные кривые.

Рис. 15. Экспериментальные и теоретические кривые, описывающие возрастание степени заполнения поли(И) X поли(Ц) мостиками при добавлении ионов меди в раствор, содержащий ЖКД поли (И) х поли (Ц).

Экспериментальные данные показаны в относительных единицах. По оси X - концентрация ионов меди в растворе, по оси У - степень заполнения реакционных центров мостиками. Эксперименты проводились при трех значениях концентрации дауномицина в растворе 9, 15.6 и 27.8 (дМ (данные показаны посредством А, □ И •. соответственно). Теоретические 1фивые (непрерывные линии) рассчитаны при и=4 и значениях энергий А/= 10,9 КГ Лg =И0,3 ЯТ ДЛЯ указанных выше значений концентрации дауномицина в растворе при помощи соотношений (34,35).

Глава 7. Классификация моделей адсорбции

Применение теории адсорбции к широкому классу экспериментальных ситуаций, которое было проведено в данной работе, позволяет не только описать широкий круг данных по связыванию лигандов с ДНК и РНК, но и предложить две классификации моделей адсорбции. В первой классификации рассматриваются типы взаимодействий между лигандами, во второй - типы изменений в матрицах, происходящих при связывании лигандов. Таким образом, эти две классификации дополняют друг друга. Первая классификация представлена на Рис. 16.

Первый признак, по которому мы можем разделить модели адсорбции на два больших класса, заключается в том, рассматриваются ли в модели кооперативные (антикооперативные) взаимодействия между адсорбированными по соседству на матрице лигандами (Рис. 16 а) или же рассматривается взаимодействие лиганда непосредственно с лигандом, уже связанным на матрице (Рис. 16 б). Заметим, что сам механизм взаимодействий между лигандами в классификации не рассматривается, как не важны и конкретные черты молекулярной модели комплекса лиганда с матрицей НК. Очевидно, что в зависимости от того, может ли каждый последующий лиганд связываться только на матрице или же он способен связываться «поверх» уже связанного на матрице лиганда, изменяется такая важная характеристика адсорбции, как насыщающий уровень заполнения матрицы лигандом.

Когда лиганд может связываться непосредственно не только с матрицей, но и с лигандом, уже адсорбированным на матрице, наблюдается не "горизонтальное" (вдоль матрицы), а "вертикальное" (перпендикулярно матрице) взаимодействие между лигандами. Заметим, что эта ситуация весьма распространена: например, антибиотики дистамицин А, нетропсин и их производные связываются в малой бороздке ДНК в виде "шпильки", или "сэндвича", димеров или тримеров (на Рис. 16 такой вариант соответствует

Взаимодействия межзу адсорбированными лигандами

(влияние связывания лигандов на матрицы не учитывается)

оНИБЗоНо оойсхххйооо

Рис. 16. Классификация моделей адсорбции, описывающих взаимодействия меяеду адсорбированными лигандами.

Вверху показана схема классификации, внизу (I и П) - два примера расположения лигандов на матрице, соответствующие пунктам з) и и) этой классификации.

случаю и)). С другой стороны, ситуация образования мостиков между молекулами НК в составе жидкокристаллической дисперсии, которая подробно описана в Главе 6, тоже находит место в этой схеме: мостики можно рассматривать как комплексы, составленные из лигандов разного типа (на схеме такой вариант соответствует случаю к)).

Кооперативные взаимодействия, как они определяются в рамках подхода Заседателева, Гурского и Волькенштейна (1971), когда речь идет о взаимодействии между ближайшими соседними адсорбированными лигандами, соответствуют на Рис. 16 ситуации а), которая имеет несколько "конечных" вариантов - в), ж), з). Все эти случаи подробно рассмотрены в Главах 3 и 4. На нижней части Рис. 16 проиллюстрированы два варианта взаимодействий между лигандами, соответствующих случаям з) и и) нашей классификации.

Мы рассмотрели также ряд биологических примеров, в которых показано, как кооперативные взаимодействия между адсорбированными белками влияют на регуляцию экспрессии генов и структурную организацию хроматина. В работе Бергруна и Сауэра (Berggrun А., Sauer R.T., 2001) показано, что кооперативные взаимодействия играют принципиально важную роль при узнавании репрессором Mnt операторов в бактериофаге Р22, в работе Рудника и Брунсмы (Rudnick J., Bruinsma R., 1999) развиты представления о связывании с ДНК белков, которые создают при связывании локальные изгибы в ДНК. Такие изгибы приводят к появлению кооперативных взаимодействий между адсорбированными белками.

Заметим, что наша классификация в свернутой, простейшей форме была предложена впервые еще в середине 1980-х годов в серии публикаций в журналах «Биофизика» и "Молекулярная биология". Эта классификация родилась из наблюдений над экспериментальными системами, в которых изучалось связывание лекарственных веществ и искусственно

сконструированных биологически активных соединений с ДНК Анализ изотерм адсорбции показал, что разного рода кооперативным взаимодействиям соответствуют, вообще говоря, разные формы изотерм адсорбции Встал вопрос о том, как можно на основании кривой связывания сделать вывод о типе модели адсорбции и оценить параметры кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами Классификация кооперативных взаимодействий представляется необходимым этапом решения этой задачи

Заключение

Нами впервые в наиболее полном виде изложена совокупность методов и подходов статистической термодинамики, позволяющих описывать и анализировать биологические системы, в которых изучается связывание лигандов с нуклеиновыми кислотами как in vitro, так и in vivo В диссертации показано на ряде примеров, как такие подходы «работают», какие характерные черты модели адсорбции и параметры связывания они позволяют оценить Развитые нами методы анализа данных дают в руки исследователя разнообразный теоретический "инструментарий", позволяющий анализировать как реальные биологические системы, так и модельные системы, в которых изучается связывание лигандов с нуклеиновыми кислотами Такой инструментарий насущно необходим, так как исследователь решает обычно так называемую «обратную задачу» - но изотермам адсорбции восстанавливает основные свойства модели связывания

По мере получения все более точных количественных характеристик связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами возникает возможность моделировать как процессы регуляции генетической активности, так и процессы взаимодействия лекарственных соединений с ДНК и нуклеопротеиновыми комплексами

Теория адсорбции на протяжении более тридцати лет своего применения к биологическим системам накопила уже достаточно опыта, чтобы выступить в этой области в роли самостоятельной дисциплины. Эта дисциплина выработала свой язык, который позволяет сформулировать такие фундаментальные проблемы биологии, как регуляция генетической экспрессии в рамках представлений статистической физики. С другой стороны, применение теории адсорбции к анализу экспериментальных данных позволяет связать наблюдаемые величины с модельными свойствами молекулярно-биологических систем: оценить энергии взаимодействия лигандов с нуклеиновыми кислотами, энергии взаимодействия между адсорбированными лигандами и т.п. Описание реальных систем при помощи теории адсорбции дает возможность как предсказывать их поведение при изменении внешних условий, так и уточнять черты моделей адсорбции. Без применения теории адсорбции невозможно сейчас представить эффективное решение и таких прикладных задач, как испытание лекарственных соединений и создание биосенсоров.

В диссертации не только показано, как можно применять теорию адсорбции к широкому классу фундаментальных и прикладных задач молекулярной биофизики, но и продемонстрировано, что в настоящее время такое применение должно иметь черты системности. Хорошо изученные сейчас отдельные примеры связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами следует рассматривать как части более общей системы знания: статистической термодинамики связывания лигандов с ДНК и РНК, построению которой и посвящена данная работа.

выводы

1) Предложен метод анализа изотерм адсорбции, основанный на исследовании поведения кривых связывания при заполнении матрицы ДНК лигандом, близком к насыщающему уровню Показано, что этот метод позволяет различить системы, в которых взаимодействие между лигандами приводит к образованию ассоциатов произвольного размера и системы, в которых образуются димеры из связанных на матрице молекул лиганда.

2) Впервые проведен анализ кооперативных эффектов при связывании двух различных лигандов с ДНК. Показано, что модель адсорбции в этом случае приводит к математическим задачам, аналогичным задаче подсчета числа состояний в одномерной модели Изинга для решеточного газа частиц с взаимодействием. Получены точные уравнения и развиты алгоритмы, позволяющие рассчитывать изотермы адсорбции, характеризующие связывание двух различных лигандов.

3) Получены соотношения, позволяющие рассчитывать диаграммы футпринтинга для комплексов протяженного лиганда, способного связываться избирательно с определенными последовательностями ДНК. Экспериментальные и теоретически рассчитанные профили распределения связанного лиганда на ДНК хорошо согласуются друг с другом.

4) Проведен анализ кооперативных эффектов, обусловленных взаимодействиями между молекулами ДНК, возникающими при достижении критической степени заполнения ДНК лигандом Рассчитаны функции распределения связанного лиганда на различных молекулах ДНК, характеризующие термодинамическое равновесие в системе. Развитые

алгоритмы и уравнения были использованы для определения термодинамических параметров связывания хитозана с ДНК.

5) Получены уравнения для описания координированной адсорбции лигандов на матрицах нуклеиновых кислот в составе жидкокристаллических дисперсий. Показано, что эти уравнения хорошо описывают образование хелатных мостиков между молекулами РНК в частицах жидкокристаллических дисперсий. Определены термодинамические параметры, характеризующие образование мостиков.

6) Показано, что в трехкомпонентной системе, содержащей ДНК и два лиганда, значительно различающихся по величине сродства к ДНК, возникают специфические граничные эффекты, обусловленные одномерным давлением «решеточного газа» адсорбированных лигандов, имеющих более низкое сродство к ДНК.

7) Развитые представления применены для анализа целого ряда экспериментальных систем, в которых измеряются количественные характеристики связывания лигандов с ДНК in vitro и in vivo. Показано, что шум процесса генетической экспрессии, измеренный экспериментально in vivo, может быть обусловлен шумом процесса адсорбции регуляторного белка с промотором репортерного гена.

Список публикаций

1. Нечипуренко Ю.Д., Заседателев A.C., Гурский Г В. Теория одномерной адсорбции на гомополимере Учет различных ориентации молекул лиганда. Биофизика 1979 Т24 С 351-361

2. Нечипуренко Ю.Д. Термодинамические параметры, характеризующие взаимодействие между молекулами лиганда, адсорбированными на полимере Биофизика. 1982 Т 27 С 391-398

3. Nechipurenko Yu.D. Determination from binding isotherms of thermodynamic parameters characterizing interactions between ligand molecules bound DNA.Studia Biphus 1982 V87 P 217-218

4 Streltsov SA, Khorlin A.A., Surovaya A.N, Gursky G.V., Zasedatelev A.S., Nechipurenko Yu.D., Zhuze A.L., Gottikh В P Ohgo-L-valin binds preferentially to GC-regions on DNA. Stadia Biophys 1982 V87 P 189-190

5. Surovaya A.N., Streltsov SA , Khorlin A A , Gursky G.V., Nechipurenko Yu.D., Zasedatelev A.S , Zhuze A.L., Gottikh B.P Specific binding interactions between DNA and oligopeptides which model the recognition sites of regulatory proteins. Studia Biophys 1982 V 87 P 191-192

6. Nechipurenko Yu D., Bourd S В Theoretical model for binding of ligands to ribosome. Europ Journal ofBiochemistry 1983 V135 P 469-470

7. Куханова М.К., Бурд СБ., Викторова Л.С , Нечипуренко Ю.Д, Готтих Б П., Краевский А.А Взаимодействие субстратов и субстратоподобных ингибиторов с пептидилтрансферазным центром рибосом Escherichia Coll. Мол. биология 1984 Т 18 С 691-703

8 Нечипуренко Ю.Д, Заседателев А С , Гурский Г В Кооперативные взаимодействия при связывании протяженных лигандов с ДНК. 1 Неконтактные кооперативные взаимодействия. Мол биология 1984 Т 18 С 798 - 812

9. Нечипуренко Ю Д. Кооперативные взаимодействия при связывании протяженных лигандов с ДНК. П. Контактные кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами. Мол биология 1984 Т 18 С 10661079

10. Нечипуренко Ю.Д., Крылов А С , Заседателев А С , Гурский Г В. Взаимодействия между аналогами антибиотика Дистамицина А, адсорбированными на ДНК. Мол биология 1984 Т18 С 332-342

11. Нечипуренко Ю.Д. Связывание малых молекул с нуклеиновыми кислотами, имеющими третичную структуру. Биофизика 1985 Т 30 С 231232

12. Нечипуренко Ю.Д., Волькенштейн М В Употребление синонимичных кодонов на границах двутяжевых участков во вторичной структуре м РНК Доклады Академии Наук СССР 1985 Т 282 С 721-724

13. Нечипуренко Ю.Д., Гурский Г.В Анализ связывания белков и антибиотиков с фрагментами ДНК Доклады Академии Наук СССР 1985 Т281 С 213-216.

14. Скамров A.B., Рыбалкин И.Н, Бибилашвили Р.Ш., Готтих Б П., Гроховский С.Л., Нечипуренко Ю.Д., Заседателев A.C., Гурский Г В., Жузе А.Л., Хорлин А.А Специфическая защита ДНК дистамицином А, нетропсином, и биснетропсином от действия ДНКазы 1 Мол биология 1985 Т 17 С177-195

15. Нечипуренко Ю.Д., Волькенштейн М.В. Анализ расположения нуклеосом на сателлитной ДНК. Доклады Академии Наук СССР 1986 Т286 С 216-220.

16. Nechipurenko Yu.D., Gursky G.V. Cooperative effects on binding of proteins to DNA. Biophysical Chemistry 1986 V24 P 195-209

17. Нечипуренко Ю.Д. Антикооперативные взаимодействия между ближайшими соседними хроматосомами Биофизика 1988 Т 33 С 580-583

18. Сприжицкий Ю.А., Нечипуренко Ю.Д., Александров A.A., Волькенштейн М.В. Закономерности сблоченности нуклеотидов в кодирующих и некодирующих последовательностях ДНК из различных организмов. Мол биология 1988 Т22 С 338-356

19. Чуриков H.A., Чернов Б.К Голова Ю.Б., Нечипуренко Ю.Д. Параллельные ДНК - возможность существования Доклады Академии Наук СССР 1988 Т303 С 1254-1258

20. Sprizhitsky YuA., Nechipurenko Yu.D., Alexandrov A A., Volkenstein M.V. Statistical analysis ofnucleotide runs in coding and noncoding DNA sequences. J Biomol Struct andDynam 1988 V6 P 345-358

21. Tchurikov N.A., Chernov B.K., Golova Yu В., Nechipurenko Yu D. Parallel DNA: generation of a duplex between two Drosophila sequences in vitro. FEBSLetters 1989 V257 P 415-418

22. Йованович Б, Нечипуренко Ю. Д Анализ распределения лигандов, адсорбированных на фрагментах ДНК Мол биология 1990 Т 24 С 478-486

23. Ахрем А.А , Ландо Д Ю., Шпаковский А Г , Нечипуренко Ю.Д., Арутюнян С.Г. Влияние взаимодействия дальнего порядка между адсорбированными лигандами на переход спираль-клубок ДНК. Мол биология 1990 Т 24 С 649-656

24. Чуриков H.A., Нечипуренко Ю.Д. Параллельные комплиментарные последовательности в природной ДНК: гипотеза параллельного биосинтеза Доклады Академии Наук СССР 1991 Т 318 С 1233-J238

25. Чжу-Цзин-Дэ, Ли Минь-Гань, Сюй Лю-Джун, Чжу Цзе-Цин, Ху Цзю-Юнь, Гу Минь-Мин, Сюи Яо-Лян, Чжан Лань-Пин, Хуань И-Ци, Б К.Чернов, Ю Д Нечипуренко, Н А Чуриков Основные характеристики параллельной двойной спирали ДНК по данным сканирующей туннельной микроскопии. Доклады Академии Наук СССР 1991 Т 317 С 1250-1253

26. Jing-de Zhu, Min-qian Li, Liu-zhong Xiu, Jiu-qing Zhu, Ju Hu, Min-ming Gu, Yao-liang Xu, Lan-ping Zhang, Ze-qi Huang, В К Chernov, Yu D Nechipurenko and N.A. Tchurikov. Parallel stranded DNA under the scanning tunnelling microscope. BBA 1992 V1115 P 239-242

27. Нечипуренко Ю.Д., Попов H В , Исаев М.А , Шабалина С А, Матвеева O.B. Модель множественных контактов, описывающая взаимодействие сайтов рРНК с мРНК Биофизика 1995 Т 40 С 1208-1213

28. Стрельцов С.А., Бородина М.В., Нечипуренко Ю Д., Семенов Т.Е Тривалин индуцирует образование гомо- и гетеро- квадруплексных структур ДНК. Биофизика 1997 Т42 С 378-388

29. Стрельцов CA., Нечипуренко Ю.Д Определение константы димеризации дансилгидразидатривалина в растворе Биоорганическая химия 1999 Т25 С 584-590

30. Нечипуренко Ю.Д., Стрельцов С А , Михейкин А Л Новая физическая интерпретация S-образных кривых- конкуренция между разными типами связывания лиганда с ДНК. Биофизика 2000 Т 45 С1044-1048

31. Стрельцов С А , Михейкин А Л , Нечипуренко Ю Д Взаимодействие топотекана - ингибитора ДНК-топоизомеразы 1 с двунитевьши полидезоксирибонулеотидами Мол биология 2001 Т35 С 442-450

32. Nechipurenko Yu.D., Mikheikin A L , Streltsov S A , Zasedatelev A. S., and I.R. Nabiev I.R. Mixed mode of ligand-DNA binding results in S-shaped binding curves. J Biomol Struct andDynam 2001 V18 P 703-708

33. Mikheikin A.L., Nechipurenko Yu.D., Zasedatelev A S , Streltsov SA Competition Between Different Ligand-DNA Complexes Produced S-shaped Binding Curves J Biomol Struct andDynam 2001 V 18 P 913

34. Streltsov SA , Mikheikin A L , Nechipurenko Yu D Interaction of DNA Molecules in the Presence of DNA Topoisomerase I Inhibitor Topotecan J Biomol Struct andDynam 2001 V 18 P 914-915

35. Нечипуренко Ю.Д., Стрельцов С.А. и Евдокимов Ю М Термодинамическая модель образования мостиков между нуклеиновыми кислотами в жидком кристалле. Биофизика 2001 Т 46 С 428-435

36. Нечипуренко Ю.Д, Захаров М А , Салянов В И и Евдокимов Ю.М. «Мостиковые» структуры между молекулами нуклеиновых кислот, фиксированными в структуре жидкого кристалла. Биофизика 2002 Т 47 С 600-606

37. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Нечипуренко Ю Д., Скуридин С.Г., Захаров М.А., Спенер Ф., Палумбо М. Молекулярные конструкции (суперструктуры) на основе двухцепочечных нуклеиновых кислот Мол биология 2003 Т 37 С 340-355

38. Нечипуренко Ю.Д., Рябоконь В.Ф , Семенов С В , Евдокимов Ю.М. Термодинамические модели образования «мостиков» между молекулами нуклеиновых кислот в жидких кристаллах Биофизика 2003 Т48 С 802-811

39. Нечипуренко Ю.Д., Вольф A.M., Евдокимов Ю М. Функция распределения, описывающая связывание протяженных лигандов с молекулами ДНК. Возможное применение для случая конденсации ДНК. Биофизика 2003 Т 48, С 635-643

40. Нечипуренко Ю.Д., Гурский Г.В. Термодинамические модели связывания лигандов с ДНК. Биофизика 2003 Т48 С 773-796.

41 Нечипуренко Ю.Д., Вольф А.М, Гурский Г В Статистические флуктуации в процессах регуляции генов: рассмотрение с точки зрения статистической механики. Биофизика 2003 Т 48. С 986-997

42 Streltsov S.A, Oleinikov V А , Ermichov М A., Mochalov K.E., Sukhanova A.V., Nechipurenko Yu.D., Grokhovsky S.L., Zhuze A.L., Pluot M., Nabiev I.R. Interaction of clinically important human DNA topoisomerase I poison topotecan with double stranded DNA Biopolymers 2003 V 72 P 442-454

43. Nechipurenko Yu. D., WolfA. M., Salyanov V. I., Yevdokimov Yu. M. Model of Formation of Liquid-Crystalline Dispersions in the Process of the DNA-Chitosan Binding. J Biomol Struct Dynam 2003 V 20 P 887

44. Riabokon V.F., Nechipurenko Yu.D, Semenov S V, Yevdokimov Yu.M The thermodynamic models describing the formation of "bridges" between nuclear acids in liquid crystal dispersions. J Biomol Struct Dynam 2003 V 20 P 886

46. Нечипуренко Ю.Д., Вольф А М., Салянов В И, Евдокимов Ю.М Равновесная адсорбция лигандов на молекулах ДНК (на примере хитозана). ЖЭТФ 2004 Т 125 С 103-111

46. Евдокимов Ю.М., Салянов В И, Крылов А С , Нечипуренко Ю.Д, Вольф A.M. Формирование жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-хитозан) в условиях объемного заполнения Биофизика 2004 Т 49 С 789-799.

47. Рябоконь В.Ф, Нечипуренко Ю.Д., Гурский Г В. Количественные методы анализа диаграмм фут-принтинга для комплекса лиганда с ДНК с известной последовательностью Доклады Академии Наук 2004, Т 398, С 832837.

Напечатано с готового оригинал макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 21 02 2005 г Формат 60x90 1/16 Уел печ л 2,0 Тираж 100 экз Заказ 074 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Oi.ûif

S84

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Нечипуренко, Юрий Дмитриевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ПОДХОДЫ К ОПИСАНИЮ РАВНОВЕСНОГО СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

ГЛАВА 2. ФУНКЦИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ, ОПИСЫВАЮЩАЯ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ. ШУМ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ. ДАВЛЕНИЕ РЕШЕТОЧНОГО ГАЗА. СВЯЗЫВАНИЕ ХИТОЗАНА С ДНК

ГЛАВА 3. КООПЕРАТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АДСОРБИРОВАННЫМИ ЛИГ АНДАМИ. АСИМПТОТИЧЕСКИЙ МЕТОД АНАЛИЗА КРИВЫХ СВЯЗЫВАНИЯ

ГЛАВА 4. КОНТАКТНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АДСОРБИРОВАННЫМИ ЛИГ АНДАМИ

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИГАНДОВ, СВЯЗАННЫХ НА МАТРИЦАХ СПЕЦИФИЧНО И НЕСПЕЦИФИЧНО

ГЛАВА 6. ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ, ОПИСЫВАЮЩИЕ ОБРАЗОВАНИЕ «МОСТИКОВ» МЕЖДУ МОЛЕКУЛАМИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ЖИДКИХ КРИСТАЛЛАХ

ГЛАВА 7. КЛАССИФИКАЦИЯ МОДЕЛЕЙ АДСОРБЦИИ, ОПИСЫВАЮЩИХ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ С

НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Статистическая термодинамика связывания лигандов с ДНК и РНК"

Постановка проблемы и ее актуальность. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из центральных задач молекулярной биологии. Существует несколько механизмов регуляции экспрессии генов, в которых регуляция осуществляется посредством обратимого связывания белков с ДНК или РНК. Такое связывание может быть описано в рамках представлений о физической адсорбции лигандов на матрицах нуклеиновых кислот. Матрицы нуклеиновых кислот (НК) в этом случае рассматриваются как адсорбенты, несущие решетки реакционных центров, на которых обратимым образом связываются молекулы лигандов. Адсорбция происходит посредством многоточечного связывания лигандов с реакционными центрами матриц. Сейчас можно считать установленным, что подобным образом с НК связывается целый ряд лигандов, в том числе олигонуклеотиды, антибиотики и биологически активные соединения различного происхождения. Однако многие характеристики такого связывания до сих пор неясны. В ряде случаев между лигандами существуют кооперативные взаимодействия, более того, показано, что в модельных системах связывание лигандов может влиять на конформационное состояние матриц НК и влияние это распространяется на участки матриц, отстоящие от места связывания (аллостерический эффект).

Процессы регуляции экспрессии генов включают в себя координированное связывание разных лигандов. В живой клетке ДНК покрыта лигандами разных типов, и связывание одних лигандов может влиять на связывание других (например, при связывании один лиганд может закрывать целый участок матрицы, делая его недоступным для других молекул лиганда). Все эти свойства связывания необходимо моделировать: в экспериментах используются модельные системы, которые позволяют выяснить определенные свойства изучаемых объектов, и в теории необходимо сформулировать ряд моделей, которые могли бы описать связывание нескольких лигандов, позволили бы рассмотреть влияние адсорбции лигандов на состояние матрицы и другие явления, наблюдаемые в молекулярной биологии. Изучение таких моделей позволит анализировать изотермы адсорбции, диаграммы фут-принтинга и другие количественные характеристики, которые могут быть получены при исследованиях молекулярно-биологических систем.

До настоящего времени применение теории адсорбции к связыванию лигандов с НК было эпизодическим. Изучая связывание разных лигандов с матрицами НК, исследователи чаще всего пользовались одной моделью, в которой учитываются контактные кооперативные взаимодействия между ближайшими соседними адсорбированными лигандами, изредка предлагались новые модели, но ни систематического описания разных моделей адсорбции, ни сравнительного изучения их свойств до последнего времени в литературе не существовало. По мере рассмотрения все более сложных систем возникали более сложные модели адсорбции, но не существовало описания разных моделей с единой точки зрения. Между тем, без такого описания трудно надеяться на то, что выбранная исследователем модель будет единственно возможной. Исследователей интересует, как правило, не получение уравнений связывания и расчет изотерм адсорбции в рамках той или иной модели, а решение "обратной" задачи: выбор модели адсорбции на основании количественных данных. Однако решение этой задачи до настоящего времени было затруднено из-за отсутствия классификации моделей адсорбции.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы является развитие теории адсорбции лигандов на матрицах НК и применение ее для анализа молекулярно-биологических систем. Для достижения этой цели необходимо формирование научного аппарата теории адсорбции, включающего "инвентаризацию" методов статистической механики и математических подходов, используемых в данной области, описание терминологии и введение в рассмотрение широкого набора моделей адсорбции.

Задачами исследования являются:

4) Изучение специфического и неспецифического связывания лигандов на фрагментах ДНК.

5) Анализ явления, которое получило название «шум генетической экспрессии» (речь идет об экспериментах по изучению связывания lac-репрессора в клетке E.coli).

9) Проведение классификации описанных нами и известных в литературе моделей адсорбции.

Научная новизна. В работе впервые введен в рассмотрение целый ряд новых моделей адсорбции. Впервые разработан метод, позволяющий анализировать изотермы адсорбции для широкого класса кооперативных систем. Применение этого метода позволило установить соответствие между формой изотермы адсорбции и моделью адсорбции. Показано, что этот метод позволяет различить модели, в которых взаимодействие между лигандами приводит к образованию ассоциатов произвольного размера и модели, в которых образуются димеры из связанных на матрице молекул лиганда. Продемонстрирована возможность восстановления потенциала кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами.

Получены уравнения, описывающие связывание лигандов с матрицами НК для широкого класса моделей адсорбции. Описаны и реализованы алгоритмы, позволяющие анализировать экспериментальные кривые связывания и оценивать геометрические и энергетические параметры модели адсорбции.

При анализе адсорбционных систем мы рассчитывали не только средние значения числа адсорбированных на матрице лигандов, но и стандартные отклонения от средних значений. Функция распределения дает более полную информацию о равновесном связывании лигандов с матрицами НК и позволяет более детально описать связывание. Дисперсия среднего числа адсорбированных лигандов позволяет оценить «шум» процесса адсорбции. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании разработанных подходов удается получить информацию о характере кооперативных эффектов в адсорбционной системе. Такие эффекты наблюдаются при связывании с ДНК как белковых факторов, регулирующих экспрессию генов, так и разного рода низкомолекулярных лигандов, в том числе лекарственных соединений. В работе развиты представления, позволяющие проводить анализ как модельных экспериментальных систем, так и реальных биологических систем. В работе продемонстрировано несколько примеров такого анализа. Показано, что шум генетической экспрессии, измеренный in vivo для E.coli, может быть обусловлен шумом процесса адсорбции.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 47 печатных работ в ведущих международных и отечественных научных журналах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав и заключения. Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 60 рисунков и три таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Нечипуренко, Юрий Дмитриевич

выводы

1) Предложен метод анализа изотерм адсорбции, основанный на исследовании поведения кривых связывания при заполнении матрицы ДНК лигандом, близком к насыщающему уровню. Показано, что этот метод позволяет различить системы, в которых взаимодействие между лигандами приводит к образованию ассоциатов произвольного размера и системы, в которых образуются димеры из связанных на матрице молекул лиганда.

4) Проведен анализ кооперативных эффектов, обусловленных взаимодействиями между молекулами ДНК, возникающими при достижении критической степени заполнения ДНК лигандом. Рассчитаны функции распределения связанного лиганда на различных молекулах ДНК, характеризующие термодинамическое равновесие в системе. Развитые алгоритмы и уравнения были использованы для определения термодинамических параметров связывания хитозана с ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе связывание регуляторных белков и биологически активных соединений с нуклеиновыми кислотами рассматривается как процесс физической адсорбции. Молекулы нуклеиновых кислот в таком процессе выступают в качестве матриц. В клетке с молекулами ДНК и РНК связывается большое число различных соединений, и при таком связывании на матрицах НК может "задействоваться" одновременно несколько систем реакционных центров. Мы рассмотрели здесь как конкуренцию лигандов за одни и те же связывающие места, так и координацию при связывании лигандов на одной или двух системах реакционных центров.

Сложность реальной ситуации затрудняется еще и тем, что матрица представляет собой трехмерный объект, и полная система реакционных центров на матрице может не укладываться в одномерную или даже двумерную схему. Несмотря на это, применение теории адсорбции для описания связывания лигандов с НК позволяет продуктивно решать практические задачи анализа связывания с НК ряда биологически активных веществ: восстанавливать на основании анализа изотерм адсорбции как геометрические, так и энергетические параметры связывания. Здесь мы показали, как можно проводить такой анализ на примере связывания с ДНК молекул хитозана.

По-видимому, первым примером плодотворного применения теории адсорбции в молекулярной биофизике можно назвать анализ связывания с ДНК антибиотиков дистамицина А и нетропсина, который был проведен в работах Заседателева и соавторов [25, 26]. По сути, только на основании изотерм адсорбции Заседателевым была предложена молекулярная модель комплекса дистамицина А с ДНК, которая была подтверждена позже при помощи рентгеноструктурного анализа. Исходя из этой модели, мы смогли детально проанализировать связывание с различными ДНК молекул дистамицина А и его производных, имеющих практическое применение в медицине. В результате такого анализа был обнаружен целый ряд любопытных эффектов, касающихся кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами. В частности, нами был подробно описан «аллостерический эффект» ДНК, заключающийся во влиянии связывания лиганда на конформационное состояние молекулы ДНК не только в месте связывания, но и на удалении на расстояния в несколько витков от такого места. Мы показали, что наряду с кооперативными взаимодействиями между адсорбированными молекулами дистамицина А существуют антикооперативные взаимодействия, и характер таких взаимодействий зависит как от расстояний между молекулами, так и от AT состава ДНК [117].

Плодотворность применения теории адсорбции для описания биологических систем в целом обусловлена, с одной стороны, участием ведущих специалистов в области статистической физики в решении задач, связанных с биополимерами, а с другой, привлечением внимания со стороны молекулярных биологов и биофизиков к теории адсорбции. Однако, несмотря на существенные достижения в этой области, до последнего времени в отечественной и мировой литературе не существовало крупных обзорных работ, в которых с единой точкой зрения рассматривались бы сотни и тысячи примеров применения теории адсорбции к описанию взаимодействия лигандов с НК. Не существует ни современных руководств, ни монографий, в которых бы излагались подходы к описанию взаимодействия лигандов с НК. Такие подходы были изложены более 20 лет назад в отдельных главах учебника по молекулярной биофизике М.В. Волькенштейна [150] и руководства по биофизической химии Кантора и Шиммеля [25] (можно ответить также монографию Ваймана и Гилла (Wyman J., Gill S.J.) [151], однако в ней рассматриваются более общие вопросы описания связывания лигандов с макромолекулами).

За последние годы вышло немало работ, в которых содержится описание систем, где связывание лигандов с матрицами НК происходит по новым схемам, не известным ранее. Развиты новые модели адсорбции, получены уравнения связывания. Здесь такие модели впервые изложены системно: с единой точки зрения, в рамках общего подхода.

Нами впервые в наиболее полном виде изложена совокупность методов и подходов статистической термодинамики, позволяющих описывать и анализировать биологические системы, в которых изучается связывание лигандов с нуклеиновыми кислотами как in vitro, так и in vivo. Нами также было показано на ряде примеров, как такие подходы «работают», какие параметры связывания они позволяют оценить. Развитые нами методы анализа данных дают в руки исследователя разнообразный теоретический "инструментарий", позволяющий анализировать как реальные биологические системы, так и модельные системы, в которых изучается связывание лигандов с нуклеиновыми кислотами.

Такой инструментарий насущно необходим, так как исследователь решает обычно так называемую «обратную задачу» - по изотермам адсорбции восстанавливает основные свойства модели связывания. Разного рода модели, как мы показали в этой работе, могут приводить к похожим кривым - но все же в ряде случаев удается связать между собой характеристические черты модели адсорбции и вид соответствующих кривых связывания.

Теория адсорбции на протяжении более тридцати лет своего применения к биологическим системам накопила уже достаточно опыта, чтобы выступить в этой области в роли самостоятельной дисциплины. Эта дисциплина выработала свой язык, который позволяет сформулировать такие фундаментальные проблемы биологии, как регуляция генетической экспрессии в рамках представлений статистической физики. С другой стороны, применение теории адсорбции к анализу экспериментальных данных позволяет связать наблюдаемые величины с модельными свойствами молекулярно-биологических систем: определять энергии взаимодействия лигандов с нуклеиновыми кислотами, энергии взаимодействия между адсорбированными лигандами и т.п. Описание реальных систем при помощи теории адсорбции дает возможность как предсказывать их поведение при изменении внешних условий, так и уточнять черты моделей адсорбции. Без применения теории адсорбции невозможно сейчас представить эффективное решение и таких прикладных задач, как испытание лекарственных соединений и создание биосенсоров.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Нечипуренко, Юрий Дмитриевич, Москва

1. Hill T.L. Some statistical problems concerning linear macromolecules. // J. Polymer Sci. 1957. V. 23. P. 549-562.

2. Crothers D. Calculation of binding isotherms for heterogeneous polymers. // Biopolymers. 1968. V.6. P.575-584.

3. Заседателев A.C., Гурский Г.В. и Волъкенштейн М.В. Теория одномерной адсорбции. 1. Адсорбция малых молекул на гомополимере. // Мол. биология. 1971.Т.5. С.245-490.

4. Гурский Г.В., Заседателев А. С. и Волъкенштейн М.В. Теория одномерной адсорбции. П. Адсорбция малых молекул на гетерополимере. // Мол. биология. 1972. Т.6. С.479 489.

5. Гурский Г.В., Туманян В.Г., Заседателев А. С., Жузе А.Л., Гроховский С.Л., Готтих Г.П. Код, управляющий специфическим связыванием белков с ДНК и структура стереоспецифических участков регуляторных белков. // Мол. биология. 1975. Т. 9. С. 635-651.

6. Гурский Г.В., Заседателев А. С. Точные соотношения, описывающие связывание регуляторных белков и других решеточных лигандов на двухспиральных полинуклеотидах // Биофизика. 1978. Т. 23. С. 932-946.

7. Гурский Г.В., Заседателев А. С. //В кн. Итоги науки и техники. Сер. Молекулярная биология. М. ВИНИИТИ, 1982, с. 190-237.

8. Gursky G.V., ZasedatelevA.S. Thermodynamic and stereochemical aspects of binding interactions between sequence-specific ligands and DNA // Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol. 1984. V. 5, P. 53-139.

9. Zimm B.H., Bragg J.K. II J. Chem. Phys. 1959. V. 31. P.526.

10. Веденов A.A., Дыхне A.M., Франк-Каменецкий АД., Франк-Каменецкий МД. К теории перехода спираль-клубок в ДНК. // Мол. биология. 1967. Т.1. С.313-319.

11. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Семенов В.И., Соляное В.И., Лорткипанидзе Г.Б. Стабилизация оптических свойств частицхолестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК. // Биофизика 1998. Т.43. С.240-252.

12. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.I., Zakharov M.A. A novel type of microscopic size chip based on double-stranded nucleic acids // Lab on a Chip. 2001. V.l, P.35-41.

13. Евдокимов Ю.М., Соляное В.И., Семенов С.В., Ильина А.В., Варламов В.П. II Мол. биология. 2002. Т. 36. С. 532-541.

14. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.I. Liquid crystalline dispersions of complexes formed by chitosan with double-stranded nucleic acids. // Liquid Crystals. 2003.V.30. N.9. P. 1057-1074.

15. Евдокимов Ю.М., Соляное В.И., Нечипуренко Ю.Д., Скуридин С.Г., Захаров М.А., Спенер Ф., Палумбо М. Молекулярные конструкции (суперструктуры) на основе двухцепочечных нуклеиновых кислот. // Мол. биология. 2003. Т. 37. С. 340-355.

16. Magee W.S., Gibbs J.H., Zimm В.Н. Theory of helix-coil transitions involving complementary poly- and oligo- nucleotides I the compete binding case // Bfopolymers. 1963. V.l. P. 133-143.

17. LattS.A., Sober L.H. Protein-nucleic acid interactions. Oligopeptide-polyribonucleotide binding studies // Biochemistry. 1967. V.6. P.3293-3306.

18. McGhee J.D. and von Hippel P.H. Theoretical Aspects of DNA-Protein Interactions: Co-operative and Non-co-operative Binding of Large Ligands to a One-dimensional Homogeneous Lattice. // J. Mol. Biol. 1974. V.86. P.469-489.

19. Hill A. V. The possible effects of the aggregation of the molecules of the molecules of hemoglobin on the dissociation curves. // J. Physiol. (London) 1910, V. 40. P. iv-vii.

20. Scatchard G. The attractions of proteins for small molecules and ions. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1949. V.l5. P.660-672.

21. Нечипуренко Ю.Д., Гурский Г.В. Анализ связывания белков и антибиотиков с фрагментами ДНК. //ДАН СССР. 1985. Т.281. С. 213-216.

22. Лопаткин А.А. Теоретические основания физической адсорбции. М. МГУ 1983.

23. Poland D. Ligand binding distributions in nucleic acids. // Biopolymers. 2001.V.58. P. 477-490.

24. Кантор Ч, Шиммел П. Биофизическая химия М., Мир, 1984.

25. Zasedatelev A.S., Gursky G.V., Zimmer Ch., Thrum H. Binding of netropsin to DNA and synthetic polynucleotides. // Mol. Biol. Reports. 1974. V.l. P. 337-342.

26. Корка M.L., Yoon С., Goodsell D., Pjura P., Dickerson R.E. The molecular origin of DNA-drug specificity in netropsin and distamycin. // PNAS. 1985. V. 82. P.1376-1380.

27. Hill T. L.H Statistical Mechanics. McGraw-Hill. N.Y. 1956. Статистическая механика. M. 1960.

28. Lifson S. Partition function of linear-chain molecules // J. Chem. Phys. 1964. V.40. P.3705-3710.

29. Schellman J.A. Sequence generating functions. // "Molecular structure and dynamics", ed. M. Balaban. 1980. P. 245-265.

30. Hill T.L. Thermodynamics of Small Systems. Dover, New York. 1994.

31. Hill T.L. Perspective: nanothermodynamics. Nano Letters. 2001. V.l. P.l 11112.

32. Hill T.L. A different approach to nanothermodynamics. // Nano Letters. 2001. V.l. P.273-275.

33. Базаров И.П., Николаев П.Н. Анатолий Александрович Власов. М., МГУ, 1999.

34. BlumenfeldL.A., GrosbergA.Yu, TikhonovA.N. Fluctuations and mass-action law breakdown in statistical thermodynamics of small systems. // J. Chem. Phys. 1991. V.95. P. 7541-7547.

35. Schellman J.A. Macromolecular Binding. // Biopolymers. 1975. V.14. P.999-1018.

36. Schwarz G. On the analysis of linear binding effects associated with curved Scatchard plot // Biophys. Chem. 1977. V.6 P.65-76.

37. Schwarz G., Stankovsky S. Linear cooperative binding of large ligands involving mutual exclusion of different binding modes. // Biophys. Chemistry. 1979. V.10. P.173-181.

38. Schwarz G.A universal thermodynamic approach to analyze biomolecular binding experiments. // Biophys Chem. 2000. V.86 P. 119-129.

39. Epstein I.R. Cooperative and Non-Cooperative Binding of Large Ligands to a Finite One-dimensional Lattice. A Model for Ligand-Oligonucleotide Interactions. // Biophys. Chemistry. 1978. V.8. P. 327-339.

40. Chen Y.D., Maxwell A., Westerhoff H.V. II J. Mol. Biol. 1986. V.190. P. 211214.

41. ReiterJ., Epstein I.R. Bimodality in the cooperative binding of ligands to molecules with miltiple binding sites. // J. Phys. Chem. 1987. V.91. P.4813-4820.

42. ReiterJ., Epstein I.R. Cooperative lattice ligand binding: approximate Gaussian binding distribution. // Biophys. Chem. 1989. V.33. P. 1-9.

43. Wolfe A.R. Meehan T. Use of binding site neighbor-effect parameters to evaluate the interactions between adjacent ligand on a linear lattice. Effects on ligand-lattice association // J. Mol. Biol. 1992. V. 223, P. 1063-1087.

44. Lohman T.M. Mascotti D.P. Thermodynamics of ligand-nucleic acids interactions. // Methods in Enzymology. 1992. V. 212. P. 400-424.

45. Evans J. W. Random and cooperative sequential adsorption. .//Rev. Mod. Phys. 1993. V. 65. P.l281-1329.

46. Krapivsky P.L., Bennaim E. Collective of adsorption-desorption processes. // J. Chem. Phys. 1994. V. 100. P. 6778-6782.

47. SaroffH.A. Energetics of protein-DNA interactions an exact calculation for binding of ligands to a lattice of overlapping sites. // Biopolymers. 1995. V.36. P.121-134.

48. DiCera E., Kong Y. Theory of multivalent binding in one and two-dimensional lattices. // Biophys. Chem. 1996. V. 61 P. 107-124.

49. Kong Y. Ligand binding on ladder lattices. // Biophys. Chem. 1999. V.81. P. 7-21.

50. Torralba A.S. Colmenarejo G. Montero F. Sequence distribution and intercooperativity detection for two ligands simultaneously binding to DNA. // Biopolymers. 2001. V. 58. P. 562-576.

51. Tsodikov O.V., HolbrookJ.A., Shkel I.A., et al. Analytic binding isotherms describing competitive interactions of a protein ligand with specific and nonspecific sites on the same DNA oligomer. // Biophys. J. 2001. V.81. P. 19601969.

52. Lando D., TeifV. И J. Biomol. Struct. & Dynamics. 2000. V.17. P.903-911.

53. TeifV.B., Haroutiunian S.G., Vorob'ev V.I., et al. Short-range interactions and size of ligands bound to DNA strongly influence adsorptive phase transition caused by long-range interactions. // J. Biomol. Struct, and Dynam. 2002. V.19. P.1093-1100.

54. Poland D. Ligand binding distributions in biopolymers. // J. Chem. Phys.2000. V. 113. P. 4774-4784.

55. Сибирцев B.C., Гарабаджиу A.B., Иванов С.Д. //Биоорганическая химия.2001. Т. 27. С. 57-65.

56. Бабаян Ю., Аракелян В., Потикян Г., Казарян А. II Биофизика. 2001. Т.46. С.1003-1005.

57. Ising E. IIZ. Physik 1925. V.31. P.253.

58. Steiner R.F. //Journ. Chem. Phys. 1954. V.22. P. 1458-1459.

59. Watson J.D. and CrickF.H.C. //Nature. 1953. V. 171. P. 737-738.

60. Gursky G.V., Tumanyan V.G. Zasedatelev A.S., ZhuzeA.L., Grokhovsky S.L., and Gottikh B.P I/ Mol. Biol. Report. 1976, V.2, P.413-425.

61. Гурский F.B., Туманян Г.В., Заседателев А. С., Жузе A.JI., Гроховский C.JI. и Fommux Б.П. II Мол. биология, 1975, Т.9, С.635-651.

62. Livshitz М.А., Gursky G. V., Zasedatelev А. М, Volkenstein М. V. II Nucleic Acids Res. 1979. V.6. P.2217 -2236.

63. Gursky G. V., Zasedatelev A.S., Zhuze A.L., Khorlin A.A., Grokhovsky S.L., Streltsov SA., Surovaya A.N., Nikitin A.M., Krylov A.S., Retchinsky V.O., Beabealashvili R.S. and Gottikh B.P Л Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983. V.47. P.367-378.

64. Лейнсоо T.A., Николаев B.A., Гроховский C.JI., Стрельцов C.A., Заседателев А. С., Жузе A.JI. Рурский F.B.// Мол. биология. 1988. Т. 22. С. 159-175.

65. Лейнсоо Т.А., Николаев В.А., Гроховский С.Л., Сидорова Н.Ю., Стрельцов С.А., Заседателев А. С., Жузе А.Л., Суровая А.Н., Рурский F.B II Мол. биология. 1989. Т.23. С. 1616-1637.

66. Сидорова Н.Ю. Николаев В.А. Жузе А.Л., Суровая А.Н. Рурский Г.В II Мол. биология. 1991. Т.25. С. 706-717.

67. Гроховский СЛ., Николаев В.А., Сидорова Н.Ю., Зубарев В.Е., Заседателев А.С., Жузе А.Л., Чернов Б.К., Гурский Г.В. //Мол. биология. 1992. Т.26. С. 1313-1292.

68. Gursky G. V., Surovaya A.N., Kurochkin A. V., Chernov B.K., Volkov S.K., Kirpichnikov M.P. //J. Biomol. Struct. Dyn. 1992. V.10. P. 15-33.

69. Николаев B.A., Суровая A.H., Сидорова Н.Ю., Гроховский С.Л., Заседателев А.С., Гурский Г.В., Жузе А.Л. // Мол. биология. 1993. Т. 27. С. 192-210.

70. Суровая А.Н., Гроховский С.Л., Брусов Р.В., Лысое Ю.П., Жузе АЛ., Гурский Г.В. //Мол. биология. 1994. Т.28. С. 1383-1399.

71. Zasedatelev A.S., Borodulin V.B., Grokhovsky S.L., Nikitin A.M., Salmanova D.V., ZhuzeA.L., Gursky G.V., Shafer R.H./I FEBS Lett. 1995. V.375. P. 304-306.

72. Хохлов Д.Н., Брусов P.B., Гроховский СЛ., Николаев В.А., Писъменский В.Ф., Жузе А.Л., Гурский Г.В // Мол. биология. 1995. Т. 29. С.354-364.

73. Nikolaev V.A., Grokhovsky S.L, Surovaya A.N., Leinsoo T.A., Sidorova N.Yu., Zasedatelev A. S., Zhuze A.L., Strahan G.A., Shafer R.H., Gursky G.V. //J. Biomol. Struct. Dyn. 1996. V.14. P. 31-47.

74. Surovaya A.N., Burckhardt G., Grokhovsky S.L., Birch-Pirschfeld E., Gursky G.V., Zimmer C. //J. Biomol. Struct. Dyn. 1997. V. 14. P.595-606.

75. Grokhovsky S.L., Surovaya A.N., Burckhardt G. et al. //FEBS Lett. 1998. V.439. P. 346-350.

76. Суровая A.H., Николаев B.A., Гроховский СЛ. и др. II Мол. биология. 1999. Т.ЗЗ. С. 483-490.

77. Суровая А.Н., Гроховский СЛ., Писъменский В.Ф. и др. II Мол. биология. 1999. Т.ЗЗ, С. 611-619.

78. Surovaya A.N., Burckhardt G., Grokhovsky S.L, et al. II J. Biomol. Struct. Dyn. 2001. V. 18. P. 689-701.

79. Суровая A.H., Гроховский СЛ., Буркхарт Г. и др. II Мол. биология. 2002. Т.36. С. 901-911.

80. Marques М.А., Doss R.M., Foister S., Dervan P.В. Expanding the repertoire of heterocycle ring pairs for programmable minor groove DNA recognition. //

81. J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126 P.10339-10349.

82. Fechter E.J., OlenyukB., Dervan P.В. Design of a sequence-specific DNA bisintercalator. // Angew Chem Int Ed Engl. 2004. V. 43. P. 3591-3594.

83. Zhang Q, Dwyer T.J., Tsui V., Case D.A., ChoJ., Dervan P.B., Wemmer D.E. NMR structure of a cyclic polyamide-DNA complex. // J Am Chem Soc. 2004. V.126, P. 7958-7966.

84. Nguyen-Hackley D.H., Ramm E., Taylor C.M., JoungJ.K., Dervan P.B., Pabo C.O. Allosteric inhibition of zinc-finger binding in the major groove of DNA by minor-groove binding ligands. // Biochemistry. 2004. V.43. P. 3880-3890.

85. Krylov A.S., Grokhovsky S.L., Zasedatelev A.S., Zhuze A.L., Gursky G.V., Gottikh B.P. II Nucleic Acids. Res. 1978. V.6. P.289.

86. Livolant, F., Leforestier, A. II Prog. Polymer Sci. 1996. V.21. P. 1115-1164.

87. Sikorav J.-L., Church, G.M. //J. Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 1085-1108.

88. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты M., 1978.

89. Hogan М., Dattagupta N., Crothers D.M. II Nature. 1979.V.278. P.521-524.

90. Dattagupta N., Hogan M., Crothers D.M. Interaction of netropsin and distamycin with deoxyribonucleic acid: electric dichroism study //Biochemistry. 1980. V.19.P. 5998-6005.

91. Marquet R., Houssier C., Fredericq E. И Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 825. P. 365-374.

92. Flock, S., Labarbe R., Houssier С. II J. Biomol. Struct. & Dynamics. 1995. V.13.P. 87.

93. Manning G. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides // Q. Rev. Biophys. 1978. V. 11.P.2.

94. Rousina I. Bloomfield, V.A. II J. Phys. Chem. 1996. V.l00. P.4292.

95. Porschke D. Nature of protamine-DNA complexes. A special type of ligand binding cooperativity. // J. Mol. Biol. 1991. V.222, P. 423-433.

96. Porschke D. Dynamics of DNA condensation. // Biochemistry. 1984. V.23. P.4821-4828.

97. Lando D., TeifV. И J. Biomol. Struct. & Dynamics. 2002. V.20, P.215-222.

98. Нечипуренко Ю.Д. Термодинамические параметры, характеризующие взаимодействия между молекулами лиганда, адсорбированными на полимере. // Биофизика. 1982. Т. 27. С. 391-398.

99. Нечипуренко Ю.Д., Заседателев А.С., Гурский Г.В. II Кооперативные взаимодействия при связывании протяженных лигандов с ДНК. 1 Неконтактные кооперативные взаимодействия. //Мол. биология 1984. Т. 18. С. 798-812.

100. Нечипуренко Ю. Д. Кооперативные взаимодействия при связывании протяженных лигандов с ДНК. П. Контактные кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами. // Мол. биология. 1984. Т. 18. С. 1066-1079.

101. Йованович Б., Нечипуренко Ю. Д. Анализ распределения лигандов, адсорбированных на фрагментах ДНК. // Мол. биология. 1990. Т.24. С.478-486.

102. Полторак О.М., Шайтан К.В. Адсорбционное равновесие на энергетически неоднородной поверхности и дискретные функции распределения.//Вестник Московского Университета 1976. №4. С.387-401.

103. Elowitz М.В., Levine A.J., Siggia E.D., Swain P.S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell//Science. 2002. V. 297. P. 1183-1186.

104. Нечипуренко Ю.Д., Вольф A.M., Гурский Г.В. Статистические флуктуации в процессах регуляции генов: рассмотрение с точки зрения статистической механики. // Биофизика. 2003. Т. 48. С. 986-997.

105. Arakelyan КВ., ВаЪауап Yu., Potikyan G. Determination of constant rates of adsorption of ligand on DNA: Analysis of correlation functions // J. of Biomol. Struct. Dyn. 2000. V.18. P.231-235.

106. Arakelyan V.B., Haroutiunianyan S.G., Arakelyan H. V., Haroutiunianyan T.S. Adsorption of Ligands on macromolecules in the fluctuating medium // J. of Biomol. Struct. Dyn. 2002. V.20. P.135-139.

107. Нечипуренко Ю.Д., Вольф A.M., Евдокимов Ю.М. Функция распределения, описывающая связывание протяженных лигандов с молекулами ДНК. Возможное применение для случая конденсации ДНК. // Биофизика. 2003. Т. 48, С. 635-643.

108. Нечипуренко Ю.Д., Вольф A.M., Соляное В.И., Евдокимов Ю.М. Равновесная адсорбция лигандов на молекулах ДНК (на примере хитозана). // ЖЭТФ. 2004. Т. 125. С. 103-111.

109. Melnikov S.M., Sergeev V.G., Yoshikawa К. II J. Am. Chem. Soc. 1995. V.l 17. P. 9951-9956.

110. Нечипуренко Ю.Д., Гурский Г.В. Термодинамические модели связывания лигандов с ДНК. // Биофизика. 2003. Т.48. С. 773-796.

111. Klein G., Prigogine I. II Physica. 1958. V.19. P. 74-89.

112. Winkle R.A., Krugh T.L. //Nucl. Acids. Res. 1981. V.9. P.3175-3186.

113. Genest D., Wahle P. И Biochimie. 1981. V.63. P. 561-564.

114. Нечипуренко Ю.Д., Крылов А. С., Заседателев А.С., Гурский Г.В. Взаимодействия между аналогами антибиотика дистамицина А, адсорбированными на ДНК. // Мол. биология. 1984. Т. 18. С. 332 342.

115. Bauer W., VinogradL. И J. Mol. Biol., 1968, V. 33, P. 141.

116. Hsieh Т., Wang J. С. И Biochemistry 1975 V. 14, P. 527.

117. BresloffJ. L., Crothers D.M. Equilibrium studies of ethidium-polynucleotide interactions // Biochemistry, 1981, V. 20, P. 3547.

118. Тенфорд Ч. Физическая химия полимеров. М.: Химия, 1975, С. 595.

119. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. II Биофизика. 1989. Т.34. С.28-33.

120. Нечипуренко ЮД. Связывание малых молекул с нуклеиновыми кислотами, имеющими третичную структуру. // Биофизика. 1985. Т. 30. С. 231-232.

121. Rushbrooke G.S., Ursell H.D. II Proc. Cambr. Phil. Soc. 1948, V. 44, P. 263271.

122. MonodJ., WimanJ., Changeux J.-P. //J .Mol. Biol. 1965, V.12, P. 88.

123. Круглова Е.Б. II Мол. биология. 1990. Т. 24. С. 514-523.

124. Круглова Е.Б. II Мол. биология. 1991. Т. 25. С. 60-69.

125. Круглова Е.Б. II Биофизика. 1994. Т. 39. С. 280-288.

126. Нечипуренко Ю.Д., Волъкенштейн М.В. Анализ расположения нуклеосом на сателлитной ДНК. //ДАН СССР. 1986. Т.286. С. 216-220.

127. Нечипуренко Ю.Д. Антикооперативные взаимодействия между ближайшими соседними хроматосомами. // Биофизика. 1988. Т.ЗЗ. С.580-583.

128. KornbergR. //Nature. 1981. V.292. Р.579-580.

129. Kornberg R.D., Stryer L. //Nucleic Acids Res. 1988. V.16. P.6677-6688.

130. Trauger J.W., Baird E.E., Dervan P.B. Recognition of DNA by designed ligands at subnanomolecular concentrations. // Nature. 1996. V.382. P. 559-561.

131. Swalley S.E., Eldon E., Baird E.E., Dervan P.B. Recognition of a 5' (A,T)GGG(A,T)2-3' sequence in the minor groove of DNA by eight-ring hairpin polyamide. //J.Am.Chem.Soc. 1997. V.119. P. 6953-6961.

132. Dickinson L.A., Gulizia R.J., Trauger J.W., Baird E.E., Mosier D.E., Gottesfeld J.M., Dervan P.B. Anti-repression of RNA Polymerase II Transcription by Pyrrol-Imidazole Polyamides. // PNAS USA. 1998. V.95. P. 1280-1289.

133. Coll M., Frederick C.A., Wang A.H.-J, Rich A. A bifurcated hydrogen bonded conformation in the d (AT) base pairs of the DNA dodecamer d(CGCAAATTTGCG) and its complex with distamycin. // PNAS USA 1987. V.84. P. 8385-8389.

134. Klevit R.E., Wemmer D.E. and Reid B.R. II Biochemistry. 1986. V.25. P.3296-3303.

135. Khorlin A.A., Krylov A.S., Grokhovsky S.L., Zhuze A.L., Zasedatelev A.S., Gursky G.V. andGottikh B.P. //FEBS Lett. 1980. V.118. P. 311-314.

136. Shafer R.H. DNA bis-intercalation: Theoretical calculation of binding curves // Biopolymers 1980. V.19. P.419-430.

137. Нечипуренко Ю.Д., Стрельцов СЛ., Михейкин A.JI. Новая физическая интерпретация S-образных кривых: конкуренция между разными типами связывания лиганда с ДНК. // Биофизика. 2000. Т.45. С. 1044-1048.

138. Nechipurenko Yu.D., Mikheikin A.L., Streltsov S.A., Zasedatelev A. S., and I.R. Nabiev I.R. Mixed mode of ligand-DNA binding results in S-shaped binding curves. //J. Biomol. Struct, and Dynam. 2001. V.18. P. 703-708.

139. Нечипуренко Ю.Д., Стрельцов C.A. и Евдокимов Ю.М. Термодинамическая модель образования мостиков между нуклеиновыми кислотами в жидком кристалле. // Биофизика. 2001. Т. 46. С. 428-435.

140. Нечипуренко Ю.Д., Захаров М.А., Соляное В.И. и Евдокимов Ю.М. «Мостиковые» структуры между молекулами нуклеиновых кислот, фиксированными в структуре жидкого кристалла. // Биофизика. 2002. Т. 47. С. 600-606.

141. Нечипуренко Ю.Д., Рябоконъ В.Ф., Семенов С.В., Евдокимов Ю.М. Термодинамические модели образования «мостиков» между молекулами нуклеиновых кислот в жидких кристаллах. // Биофизика. 2003. Т.48. С. 802811.

142. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.I., Spener F., Palumbo M. II Internat. J. Biol. Macromol. 1996. V.19, P.247.

143. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.I., Buligin L.V., Dembo A.T., Gedig E., Spener F., Palumbo M./f J. Biomol. Struct, and Dynam. 1997. V.15. P. 97-105.

144. Евдокимов Ю.М., Соляное В.И., Крылов А.С., Нечипуренко Ю.Д., Вольф A.M. Формирование жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-хитозан) в условиях объемного заполнения. // Биофизика. 2004. Т. 49. С. 789799.

145. Рябоконъ В.Ф., Нечипуренко Ю.Д., Гурский Г.В. Количественные методы анализа диаграмм фут-принтинга для комплекса лиганда с ДНК с известной последовательностью. //ДАН 2004, Т. 398, С. 832-837.

146. Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика М. 1975.

147. WymanJ., Gill S.J. Binding and linkage. Mill Valley, California 1990.

148. Hill A. V. The combination of hemoglobin with oxygen and with carbon monoxide. II Biochemistry J. 1913 V. 7. P. 471-480.

149. Бородулин В.Б., Михейкин A.JI., Гроховский C.JI., Никитин A.M., Салманова Д.В., ЖузеА.Л., Гурский Г.В., Шафер Р., Заседателев А. С. II Молекулярная биология, 1996, Т. 30, С. 661-665.

150. RudnickJ., Bruinsma R. DNA-Protein Cooperative Binding through Variable-Range Elastic Coupling // Biophys J. 1999, V.76, P. 1725-1733

151. Hagerman P.G. Investigation of the flexibility of DNA using transient electric birefringence//Biopolymers 1981 V.20, P. 1503-1535.

152. Kam Z, Borochev N., Eisenberg H. Dependence of laser light backscattering of DNA on NaCl concentration // Biopolymers 1981. V.20, P.2671-2690.

153. Goodsell D.S., Dickerson R.E. Bending and curvature calculations in B-DNA. //NAR, 1994, V.22, P.5497-5503.

154. Miller J.A., Widom J. Collaborative competition mechanism for gene activation in vivo//Mol Cell Biol. 2003 V.23. P. 1623-1632.

155. Berggrun A., Sauer R.T. Contributions of distinct quaternary contacts to cooperative operator binding by Mnt repressor// PNAS 2001, V. 98, P. 23012305.

156. Власов А.А. Нелокальная статистическая механика М. 1978.

Информация о работе

Нечипуренко, Юрий Дмитриевич
доктора физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Статистическая термодинамика связывания лигандов с ДНК и РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы