Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультразвуковое исследование иммуноглобулинов и иммунологических реакций в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ультразвуковое исследование иммуноглобулинов и иммунологических реакций в растворе"

(18 -1 Я Э

/

российская академия наук институт теоретической и экспериментальной биофизики

На правах рукописи удк 534.22, 577.27

приев або иосифович

ультразвуковое исследование иммуноглобулинов и иммунологических реакции в растворе

03.00. 02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

пушино 1993

Работа выполнена в лаборатории биофизической акустики Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители:

Доктор физ.-нат. наук профессор А.П.Сарвазян

Доктор химических наук профессор Б.Б.Дзантиев

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук профессор Ф. И.Атауллаханов

Доктор биологических наук профессор В.Б.Акопян

Ведущая организация:

Хинический факультет Московского Государственного Университета

Зашита диссертации состоится

Vй

ветг

1993 Г.

в часов на заседании Специализированного совета Д -200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН С142292, Пущино. Московская область ИТЭБЭ

С диссертацией можно ознакониться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан^б^; <ЖЛ^Л99г г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических нау

П.А.Нелипович

. -М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальной задачей молекулярной иммунологии является выяснение механизма взаимодействия антитела с антигеном и передачи информации о связывании антигена из FaS-фрагмента молекулы антитела через несколько структурных доменов в F0-фрагмент. Существует мнение (Pecht,l983 . Zavodszky, 1981, 19£3), что передача информации на большие расстояния в антителах связана с "дыхательным" движением глобулы молекулы, вызванным кооперативным разрывом и восстановлением внутримолекулярных взаимодействий в процессе теплового движения атомов. Информацию о динамических свойствах и устойчивости системы можно получить из определения флуктуаций ее макроскопических термодинамических параметров. Так, в частности, по величине сжимаемости J5 - -(l/VH Sv/ бР), определяемой из измерений скорости распространения ультразвука и плотности (fi = 1 /р\)г), можно непосредственно судить о тепловых флуктуациях объема 6Ч и внутримолекулярной подвижности молекулы антитела и её комплекса с антигеном ( 5V = j)TkVT, где к - постоянная Больцмана, V - объем, Т -. температура, Р - давление ).

Важным аспектом, определявши дальнейшее развитие иммунологии и иммунологических методов исследования, является разработка новых физико-химических методов детекции реакции взаимодействия антиген-антитело, отличающихся экспрессностью, чувствительностью, возможностью' проведения анализа без выделения очищенных антигенов и антител. Одним из таких методов является акустический , основанный на прецизионных измерениях скорости распространения ультразвуковых волн. Метод характеризуется широким интервалом определягмых концентраций вещества, возможностью с одинаковым успехом анализировать как чистые, так и мутные (окрашенные) биологические жидкости, полной автоматизацией анализа.

Цель работы. Используя акустический метод, изучить характер конформационных перестроек в антителах после связывания антигена, выяснить роль внутримолекулярной подвижности антител в их функционировании и разработать основные принципы акустической детекции в различных вариантах иммуноанализа.

Основные задачи: определение объемно-упругих свойств антител; изучение влияния различных физико-химических факторов (температуры, рН ) и специфического связывания с антигенами на упругие свойства антител й их Fab-фрагментов; разработка меа?дических подходов акустической детекции реакции антиген-антитело прямым и иммуноферментным способом.

Научная новизна. Определены инкременты скорости распространения и коэффициента поглощения ультразвука, а также кажущаяся сжимаемость молекул ДО ряда животных и оценен вклад основных составляющих этих параметров. Изучено ■ влияние температуры и рН среды на акустические и упругие свойства ДО. Оценены изменения внутримолекулярной подвижности антител при образовании растворимых иммунных комплексов и нерастворимого надмолекулярного агрегата. Изучена роль конформационных перестроек в антителах, вызванных связыванием с антигеном и гаптеном. Показана возможность количественного определения антигенов по регистрации скорости ультразвука при иммунохимических взаимодействиях. Определены основные принципы акустической детекции ферментативных реакций и показана возможность использования акустического способа для регистрации результатов гомогенного иммуноферментного анализа.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты могут послужить основой для широкого использования акустического метода в молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии. Разработаны методики количественного определения антигенов и активности ферментов по регистрации скорости ультразвука, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и экспрессностью, которые внедрены в Самаркандском медицинском институте.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино. 1985), на Международном симпозиуме "Ультразвук в биологии и медицине" УБИОМЕД-Ш (Айзенах, ГДР, 1986), УБИОМЕЛ-У11Г (Прага, ЧССР, 1989), на 5 Есесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1986), на II Международной школе-конференции молодых ученых социалистических стран "Молекулярные основы биотехнологии" (Пущино, 1987), на конференции "Молодые ученые и специалисты - ускорению социально-экономического развития" (Самарканд, 1988), на Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Москва, 1990).

По результатам диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения (две главы), выводов и списка литературы (186 источников). Работа содержит 6 таблиц й 30 рисунков. Материалы изложены на 127 страницах машинописного текста.

Материалы и методы. В работе были исследованы IgG кролика, козла, быка и мыши; инсулин свиньи и мышиные моноклональные антитела к нему; 2,4-динитрофениллизин (ДНФ-лизин), свиные антитела к ДНФ-лизину и их Fae~фрагменты; L-аспарагиназа, ot-амилаза и глобулиновые фракции антисыворотки к этим ферментам; конъюгаты зстрадиол-амилаза, тестостерон-амилаза и антискворотки к этим гормонам; субтилизин, щелочная протеаза, глюкоамилаза, ot-амилаза, химотрипсин, аргиназа, уреаза, дезоксирибонуклеаза, креатинкиназа, фосфолипаза С, алкогольдегидрогеназа.

Очистку препаратов IgG из сывороток проводили осаждением сульфатом аммония с последующей гель-хроматографией и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Проверку чистоты препаратов проводили дискэлектрофорезом.

Антисыворотки против ферментов были получены иммунизацией кроликов очищенными препаратами в смеси с полным адъювантом Фрейда. Антительную активность глобулиновых фракций контролировали методом двойной диффузии в гель. Fab -фрагменты антител были получены ограниченным протеолизом папаином. Синтез конъюгатов «-амилазы с гормонами проводился методом смешанных ангидридов.

Измерения плотности растворов проводили с помощью резонаторного денсиметра фирмы "Anton Paar" ДМА-60/ДМА-601.

Скорость распространения и коэффициент поглощения ультразвука в исследуемых растворах измеряли акустическим дифференциальным интерферометром постоянной длины РАДА-2, разработанным Сарвазяном А.П. и Шэстимировым В. Н. (1986).

Дополнительный контроль кинетики иммунологических реакций проводился разработанными нами иммуноэлектродами, представляющими собой платиновую проволоку с хлорсеребрянным покрытием на поверхности которой иммобилизованы антитела или антигены.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Анализ экспериментальных исследований связи структуры антител с их биологическими функциями показал, что для выяснения роли и характера конформационных перестроек в антителах при их функционировании необходимо дальнейшее исследование структурных, гидратационных и особенно динамических свойств антител. Преимущество акустических исследований заключается в том, что они позволяют в рамках одного метода изучить характер изменений внутримолекулярной подвижности не только при связывании антигена Tab - фрагментами антител или интактными моноклональными

антителами, но также при образовании крупных агрегатов "поливалентный антиген - антитело", обладающих способностью индуцировать эффекторные функции антител. Однако, для правильной интерпретации результатов необходимо в первую очередь получить данные об акстических и упругих характеристиках иммуноглобулинов и их связи с физико-химическими свойствами данных белков.

Акустические и объемно-упругие свойства иммуноглобулинов в водных растворах. Влияние рН и температуры среды на акустические характеристики иммуноглобулинов. Для характеристики акустических и объемно-упругих свойств да использовали концентрационные инкременты скорости распространения (10 , коэффициента поглощения ультразвука (оО и плотности растворов (р) : А - (1)-и0)/и0С; В - (р-р0)/роС; ^ " I й-с^/о^С, где С -концентрация растворенного вещества, а индекс "о" означает, что соответствующая величина относится к растворителю. Полученные значения представлены в таблице I. В таблице также приведены рассчитанные из экспериментальных данных величины кажущихся удельных объемов и адиабатических сжимаемостей 0К молекул да. вычисляли по

формуле: рЧ - 1/р-В, а для расчета фК использовали формулу, справедливую для разбавленных растворов: рК - /(1/р0-2(В-А)).

Значения акустических и объемно-упругих свойств да кролика, козла, быка и мыши одинаковы с точностью до погрешности измерения и, следовательно, небольшие и локальные структурные различия да

Таблица 1.

Концентрационные инкременты А- (11-и0)/и0С, В» (р-р0)/р0С, В- Са-а^/ОоС, кажущиеся объемы фУ и адиабатические сжиаемости фК молекул да некоторых животных в 0,01 М фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,15 М ЫаС!, при температуре 25 °С.

Источник да А ДО"3 см3/г в до"3 сма/г 0 смэ/г ^у.ю"3 см3/г фКДО"3 см3/г-бар

кролик 197+4 264±3 67±4 739±3 3. 6±0. 6

козел 194 263 71 740 4,0

бык 192 268 65 735 3,7

мышь 195 260 67 743 4,2

среднее значение 195±4 263+3 68±4 739+3 3,9+0,6

этих животных в количестве дисульфидных связей не проявляются существенно в акустических характеристиках. Из изученных раннее глобулярных белков, молекулы ДО имеют одно из яаиболыпих значений величины А, что указывает на Еысокую степень доступности полипептидной цепи молекулы растворителю. Полученное высокое значение величины А характерно для глобулярных белков с молекулярным весом 20000-25000. Поэтому можно предположить, что объемно-упругие свойства молекул ДО определяются в основном на уровне доменов и их можно представить в виде набора независимых глобулярных доменов с массами 20000-25000.

Инкремент скорости ультразвука белка при нейтральных значениях рН определяется в основном следующими факторами: собственной сжимаемостью растворенной молекулы Кт , изменением сжимаемости растворителя в гидратной оболочке биополимера , кажущимся объемом молекулы: А-А^ -А™ +Ар , где А/,-/К|,/2£0, Ащ-Ки/гРо и Ар-фУ-1/2р0 . Основные составляющие инкремента скорости ультразвука молекул ДО имеют следующие значения: А„—0.125+0,015 см /г, Аь-0,080+0,015 см /г, Ар-0,240+0.005 см /г.

При кислых и щелочных значениях рН' становтся существенным и вклад релаксационных процессов в величину инкремента скорости ультразвука (Аг ), обусловленный тем, что при распространении ультразвуковой волны в растворе биополимеров происходит изменение объема системы за счет нарушения термодинамического равновесия реакции переноса протона мевду ионизируемым!! карбоксильными или амино- группами и водой:

1?-С00~ +■ Н30+ .К Я-СООН + Н20 (1)

!?-[<Нз + ОН" ^ й-МНг + Н20 (2)

где (¡1 и - константы скорости прямой и обратной реакции.

Оценка релаксационного вклада проведена из данных по рН зависимости коэффициента поглощения ультразвука (рис. 1). В щелочной области величина Аг составляет 167., а в кислой -4£ от наблюдаемого изменения инкремента скорости ультразвука (рис. 2).

Анализ результатов показал, что при закислении раствора до рН 3 наблюдаются конформационные изменения в молекуле ДО, сопровождающиеся уменьшением собственной сжимаемости глобулы на 6-7 %.. Дальнейшее закисление приводит к значительной ассоциации молекул ДО. Денатурационные изменения в молекулах ДО в щелочной области наступают при рН 11.

рН-независимая составляющая коэффициента ' поглощения ультразвука ( д а/С) отражает общую структурную организацию

рн

Рис. 1. Зависимость коэффициента поглощения ультразвука на длину волны в растворе молекул ад от рН среды. 1- экспериментальная кривая, полученная при температуре 25 "С И 0,15 М МаС1 (С - 4.0 мг/см3 ), 2 - теоретическая кривая, рассчитанная для " химической реакции с одним временем релаксации.

Рис.2. Зависимость изменений инкремента скорости ультразвука молекул ад от рН среды при 25 °С:

1- экспериментальная кривая, полученная при 0,01 М N301.

2- экспериментальная кривая, полученная при 0,15 М N301. Пунктирной линией показаны значения д А после учета релаксационного вклада в скорость ультразвука.

А, см3/г

0.15 -1-1->-

15 25 35 45

Рис.3. Зависимость величины инкремента скорости ультразвука молекул ад от температуры: 1 - ад при 0,01 М N301 рН 7,4; 2 - ад при 0,15 М N301 рН 7,4.

глобулярного белка и для молекул [^в составляет 68+4 смэ/г, тогда как среднее значение сЯ/С для белков на данной частоте составляет 82±11 см3/г (.Кгеткаи, 1984). рН-зависимая часть поглощения ультразвука для молекул может быть описана

уравнением для химической реакции с одним временем релаксации.

Дополнительную информацию о характере гидратации биополимеров можно получить из температурной зависимости инкремента скорости ультразвука этих молекул. Анализ зависимости акустических свойств и ряда других белков от температуры показал, что температурный коэффициент инкремента скорости ультразвука С лА/лТ) коррелирует со степенью гидрофобности поверхности белков и по данным параметрам исследованные белки располагаются в ряд: рибонуклеаза, лизоцим, альбумин. Для аА/аТ составляет -(1,60+0,05)10~3 см3/г-град ( рис.3).

Изменение объемно-упругих свойств моно- и поликлональных антител при связывании антигенов и гаптенов. В таблице 2 представлены данные по объемно-упругим свойствам свободных и связанных моноклональных антител двух типов, отличающихся между собой константами связывания инсулина (5-109 и 5-1010 М-1, соответственно), а также приведены результаты оценки гидратационного эффекта и изменений свойств глобул для реакции инсулин - моноклональные антитела. При расчетах принимали, что объемно-упругие свойства моноклональных антител изменяются в той же степени, что и всего иммунного комплекса.

Анализ полученных результатов показал, что при образовании комплекса "антитела - инсулин" происходят конформационные перестройки в антителах, приводящие к уменьшению собственной сжимаемости их глобул на (1.1+0. 3) 10 еи (0.8+0. З)106см3/г-бар для моноклональных антител первого и второго типа, соответственно.

Акустические и денсиметрические исследования Рав -фрагментов кроличьих антител и их связывания с с*-амилазой показали, что при взаимодействии с антигеном Гав -фрагменты антител претерпевают конформационные изменения, сравнимые с изменениями в растворимых комплексах "инсулин - моноклональное антитело".

Результаты исследования изменений скорости ультразвука и плотности растворов в процессе реакции преципитации на примере системы: амилаза-антитела представлены на рис 4 и в таблице 3. Наибольшие изменения величины А наблюдались при эквимолярном соотношении иммунореагентов и составляли 15-20 %. Величина ¡¡>К преципитирующих антител при связывании поливалентного антигена переходи г из области положительных значений (3. 6+0. 6)10"6 см3/г-

Таблица 2

Объемно-упругие свойства двух типов моноклональных антител к инсулину и их изменение при взаимодействии с антигеном.

Белок 1 ! А, 10~3 I В, 10~3 1 фУ, 10"3 ! <рк, ю-6

1 ! см3/г ! см3/г ! см3/г ! см3/г- бар

мон Ат 1 типа

Свободные антитела 193±4 2б1±4 742±4 4. 3+0. 7

Связанные антитела 203±5 2б1±5 742±5 3. 4±0. 9

мон Ат 2 типа

Свободные антитела 190±4 260±4 743±4 4. 6±0. 7

Связанные антитела 196*5 260±5 743±5 4. 0±0. 9

Реакция ! ¿А, Ю-3 ! ьВ, Ю-3 ! 10"3 ! ^К, 10~6

1 см3/г 1 1 смэ/г ! см3/г ! см3/г•бар

мон Ат 1 типа

Общий эффект взаи-

модействия АГ-Ат 10*1 0*1 0+1 -0.9*0.2

Гидратационный эф-

фект взаимодействия -3+1 — — 0.2*0.1

Изменение упругих

свойств глобулы 13±2 — — -1.1*0. 3

мон Ат 2 типа

Общий эффект взаи-

модействия Аг-Ат 6*1 0±1 0±1 -0. 6*0. 3

Гидратационный эф-

фект взаимодействия -3±1 — — 0. 2*0.1

Изменение упругих

свойств глобулы 9*2 — -0. 8*0.3

бар в отрицательную область (-1. 9*1. 3)10"6 см3/г- Сар. То есть иммунореагенты, находящиеся в составе преципитата, претерпевает изменения объемно-упругих свойств в 8-10 раз превышающие изменения в растворимых комплексах.

Изменения величины А в ходе 40 минут реакции (дА^0) при различных соотношениях иммунореагентов хорошо коррелируют с количеством образующегося преципитата, определенного гравиметрическим методом. Коэффициент парной корреляции составил 0.95. Следовательно, образование малых растворимых комплексов в

Таблица 3

Объемно-упругие свойства антител к а-амилазе и их изменение при взаимодействии с антигеном.

Белок ! А, 10~3 ! В,..-10~3 ! <рУ, 10"? ! фК, 10"6

! см3/г ! смэ/г ! см3/г ! см3/г-бар

Свободные антитела 197+ 4 264+3 739+3 -3.6+0.5

Связанные антитела 255±10 268+5 735+5 -1.9+1.3

Реакция ! дА, 10~3 ! дВ, 10"3 ! ю"3 ! дфК, 10 6

! см3/г ! смэ/г ! смэ/г ! см3/г- бар

Общий эффект взаимодействия Аг-Ат 58±5 Гидратационный эффект взаимодействия 5±1

Изменение упругих

свойств глобулы 63±7

4±2 -4+2 -5.5±0.7

— — 0.5±0.1

— — -6.0±0.8

Л А 40

Рис. 4. Изменение скорости ультразвука за 40 мин. иммунологической реакции ( ¿А¿,о) и количество преципитата, образующегося в ходе реакции "амилаза - антитела" при различных соотношениях Аг: Ат

[ альфа— омилоза ] / [ Ат]

зонах избытка антител или антигена дает незначительный вклад в общее изменение величины дА^ при реакции преципитации.

Таким образом, результаты показали, что взаимодействие антител с антигеном не ограничивается локальными перестройками в активных центрах антител или изменениями угла между Гав- и Гс-фрагментами антител, а также как и реакция "фермент-субстрат (ингибитор)" приводит к изменению всей совокупности внутримолекулярных

взаимодействий. Уменьшение флуктуации объема молекул антител при связывании антигена составляет 13+5 смэ/моль Сот 220±20 до 20?±25 см3/моль). Образование преципитата приводит к еще большему падению собственной сжимаемости антител. Величина йК^Кщ в этом случае составляет 0.6+0.1, что соответствует снижению амплитуд флуктуация объема и координат атомов на 5У = 138±37 см3/моль и 0.17±0. 04 А, соответственно.

Полученные результаты указывают на важную роль внутримолекулярной подвижности антител в их функционировании и согласуется с аллостерической моделью влияния антигена на антитело. Нарушение динамического равновесия коллективных тепловых флуктуаций в антителах при связывании антигена, усиленное в несколько раз образованием преципитата, может способствовать запуску зффекторных функций антител.

Результаты исследований взаимодействия антител к ДНФ-лизину с галтенами подтверждают наличие конформационных изменений в антителах, индуцированных гаптенами. При этом показано, что эти конформационные изменения приводят к самоассоциации молекул да. Полученные результаты позволяют предположить, что конформационные изменения, происходящие в молекулах да после связывания гаптенов способствуют не только лучшему связыванию с гаптенами, но и увеличению склоности молекул да к самоассоциации, необходимой для активации системы комплемента и ряда других зффекторных функций антител.

Разработка методических подходов акустической детекции иммунологических реакций в растворе Прямые методы определения антигенов. При разработке прямых (безмаркерных) иммунохимических методог определения антигенов путем регистрации скорости ультразвука в качестве объектов исследования использовали системы "инсулин - моноклональные антитела" и "амилаза - глобулиновая фракция антител". Первый метод заключается в регистрации изменения скорости ультразвука на начальной стадии реакции Аг-Ат, описываемой только уравнением:

Аг + Ат Аг-Ат (3)

Второй метод предполагает использование в анализе последующей стадии реакции, в ходе которой образуется преципитат:

Аг-Ат + (Аг)п + (Ат)т-АГ;.А^ (4)

Возможность прямого акустического определения количества антигена в растворе показана на системе "инсулин - моноклональные антитела" по регистрации разности значений скорости ультразвука в двух акустических ячейках после дифференциального титрования их

пробой с антигеном. Одна из ячеек содержала раствор антител, другая - только буферный раствор. Нижний предел определения инсулина составил 1.3-10"6 М (8 мкг/мл). Время анализа 3 минуты.

Прямой акустический метод анализа инсулина уступает по чувствительности известным в настоящее время методам определения

-10 -9

инсулина (радиоиммунный анализ - 10 М, твердофазный ИФА- 10 М). Вместе с тем он имеет несомненные преимущества, связанные с экспрессностью анализа Эти преимущества могут позволить найти новому методу практическое применение в контроле технологии производства инсулина.

Л II, мм/с

Рис.5. Калибровочный график определения инсулина. Время анализа 5 минут. Концентрация мон. антител 3-10"6 м.

10 20 [ инсулин] ,мкг/мл

Повышение чувствительности определения антигенов предствляется возможным путем использования в анализе поликлонаяьных антител, так как стадия преципитации сопровождается изменениями скорости ультразвука в 8-10 раз большими, чем при образовании растворимых иммунных комплексов. Вместе с тем, реакция преципитации протекает достаточно медленно, поэтому ее удобнее регистрировать не по разности значений скорости ультразвука в рабочей и опорной ячейках,, а по кинетике изменения скорости ультразвука в одной ячейке. Это позволяет снизить требования к точности и идентичности заливок проб в акустические ячейки.

На примере а-амилазы показана возможность количественного определения поливалентных антигенов по регистрации начальной скорости определения поливалентных антигенов по регистрации начальной скорости кинетики реакции преципитации с бивалентными антителами. Нижний предел определения амилазы составил 1.1-10"& М (1.1 мкг/мл). Время анализа 12 минут. (Рис.6).

Таким образом, акустический метод позволяет выявлять антигены в концентрациях 1 мкг/мл в присутствии посторонних белков за время анализа 12 мин. Вместе с тем. описанный метод, как и все остальные, основанные на формировании крупномолекулярных

1

15

Рис. 6. Калибровочные графики определения а-амилазы:

.'О

1- 0.1 М трис-НС1, рН 7.6;

2- 0.1 М трис-НС1, рН 7.6, 5 мкг/мл ВС А. 3- 0.1 К трио-НС!, рН 7. 6, 2 % ПЭГ-6000.

о

ю

?0

5П

40

[ сльфа- амилаза ] , мкг /мл

агрегатов, из-за отсутствия точной стехиометрии реакции преципитации подвержен влиянию различных факторов: активность антител, рН, ионная сила раствора, соотношение реагентов и др. Эти ограничения заставляют искать другие подходы к регистрации иммунологических рекций, не связанных с реакцией преципитации. В связи с этим дальнейшие исследования были связаны с разработкой иммуноферментного анализа с акустической детекцией.

Гомогенный иммуноферментный анализ с акустической детекцией. Преимущества акустического метода, связанные с возможностью анализа сложных многокомпонентных биологических жидкостей, в наибольшей степени могут проявиться в регистрации результатов гомогенного иммуноферментного анализа, основанного на модуляции антителами активности фермента-маркера и сочетающего в себе высокую чувствительность, экспрессность и простоту анализа. Однако, к настоящему времени измерения скорости ультразвука в растворе не использовались для количественного определения ферментов по их активности. Поэтому предварительно были изучены методические аспекты регистрации активности ферментов по скорости ультразвука.

Методика акустического определения активности ферментов. Предложен способ количественного определения ферментов по регистрации кинетики скорости ультразвука в ходе ферментативной реакции. Способ апробирован для определения 14 ферментов. Особенностью всех калибровочных кривых является широкий диапазон определяемых концентраций (3-4 порядка). Некоторые результаты представлены в табл. 4. Из всех исследованных ферментов с наиоольшей чувствительностью регистрируются амилаза (0.4 нг/мл), уреаза (4 нг/мл) и протеаза (5 нг/мл).

Таблица 4.

'Чувствительность регистрации активности ферментов акустическим методом за 15 мин. при 37 °С

Фермент Реакция Число .

оборотов "Субстрата в минуту CMVr

Предел чувствительности, нг/мл

ос-Амилаз а Катализ эндогидро- 60000 0.105

(3.2.1.1) лиза 1,4-а-глюко-зидных связей в полисахаридах.

Уреаза Мочевина + НгО - 9000000 0.241 (3.5.1.5) - С0г + 2NH3.

Щелочная Неспецифический 2100 0.135

протеаза гидролиз всех (3.4.21.15) белков.

Субтилизин Неспецифический 1800 0.143

(3. 4. 21.14) гидролиз всех белков.

а-Химо- Предпочтительно 1500 0.143

трипсин расщепляет при (3.4.21.1) Tyr-,Trp-,Phe-, Креатинки- АТФ + креатин = 25000 наза = АДФ + фосфо-

(2.7.3.2) креатин

0. 4

4

5

10

15

Параметрами определяющими чувствительность акустической детекции ферментативных реакций являются скорость реакции (число оборотов) и акустический эффект реакции. В реакциях с низкомолекулярными субстратами акустический эффект определяется изменением гидратации и других видов межмолекулярных взаимодействий. В реакциях с высокомолекулярными субстратами добавляется еще и эффект, связанный с изменением собственной сжимаемости субстрата. Потеря компактной структуры высокомолекулярных биополимеров приводит к увеличению акустического эффекта соответствующих реакций. В наибольшей степени данный эффект проявляется при гидролизе крахмала и казеина, когда внутри-глобулярные взаимодействия заменяются на гидратационные.

Эффективным способом повышения чувствительности акустического определения ферментов представляется использование сопряженных ферментативных реакций. На модельной системе последовательного гидролиза аргинина аргиназой и уреазой показано, что при детекции сопряженных реакций вклады в скорость ультразвука всех ферментативных реакций аддитивны.

Определение эстрадиола и_тестостерона_гомогенным

иммуноферментным анализом. Изучение возможности акустической

детекции в гомогеном иммуноферментном анализе проводили на

количественном определении эстрадиола и тестостерона, являющихся

основными мужским и женским половыми гормонами. В качестве

фермента-маркера была Еыбрана а-амилаза, определяемая за 15 минут

— 12.

реакции с чувствительностью 0.4 нг/мл (3-10 М). Важным свойством амилазы необходимым для гомогенного ИФА является возможность модуляции активности фермента антителами и их Рой-фрагментами. Ингибирование активности амилазы достигает 92 и 70 %, соответственно. Модуляция ферментативной активности амилазы основана не только на стерическом исключении высокомолекулярного субстрата, но также и на индукции антителами изменений конформации активного центра фермента.

Предложенный метод позволяет определять тестостерон и эстрадиол в диапазонах концентраций 0.1-3.0 нг/мл и 0.3-9.5 нг/мл соответственно (рис.7,8). Время анализа составило 15 мин. Таким образом, метод дает возможность определять гормоны в диапазоне концентраций, сбответствующем их содержанию в крови и позволяет более чем на порядок сократить время анализа по сравнению с общепринятыми твердофазными методами.

Рис. 7. Калибровочный график ЙФА тестостерона. Рис. 8. Калибровочный график эстрадиола:

- 15 -ВЫВОДЫ.

1. Определены инкремент скорости распространения ультразвука, коэффициент поглощения ультразвука, а также кажущаяся сжимаемость и объем молекул ГдЭ. Оценен вклад собственной сжимаемости и гидратации в эти параметры и изучено влияние температуры и рН раствора на акустические и объемно-упругие свойства молекул

2. Установлено, что при образовании растворимых иммунных комплексов наблюдается достоверное снижение кажущейся сжимаемости антител. При образовании крупных нерастворимых агрегатов изменения сжимаемости могут быть в 8-10 раз больше. Предполагается, что падение сжимаемости антител при связывании антигенов обусловлено снижением амплитуд тепловых флуктуаций объема молекул и может способствовать запуску эффекторных функций антител.

3. На модели 2,4-ДНФ-лизина показано, что конформационые перестройки в антителах, индуцированные связыванием о гаптеном, могут приводить к увеличению способности молекул к самоассоциации. При взаимодействии РаЬ-фрагментов антител с гаптеном аналогичный процесс отсутствует.

4. Впервые показана эффективность использования в качестве ферментов-маркеров в гомогенном иммуноферментном анализе с акустической детекцией ферментов, гидролизирующих высокомолекулярные субстраты с высоким значением собственной сжимаемости. Использование амилазы в качестве фермента-маркера апробировано для определения стероидных гормонов (эстрадиола и тестостерона).

5. Разработан новый комплекс методических подходов для иммуно-химического экспресс-анализа биологически важных молекул в сложных многокомпонентных растворах по регистрации скорости распространения ультразвука. Методы обладают высокой чувствительностью (10"&-10"х0М), экспрессностью (15 мин.) и специфичностью.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шильников Г. К , Приев-А. И. "Акустические свойства иммуноглобулинов в водных растворах и акустическое проявление иммунохимиче-скических реакций". В сб."Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках": Тез. докл. симп. с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ. Пупино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1985, с. 64-65.

2. Авт. свид. N 1273805 (СССР)."Способ изготовления иммуноэлектро-дов. " Ивницкий Д. М., Приев А. и., Еяаев М. Ф., Кашкин А. П. Опубл. 30.11.86. Бюл. N 44.

3. Ивницкий Д. М., Юлаев М. Ф. , Приев А. И. , Кашкин А. а , Богдонова Т. Я. "Исследование иммунологических реакций с помощью иммуноэлектро-

дов": Тез. докл. 5 Всесоюзн. биохим. съезда, Москва, Наука, 1986, т. 3, с. 14.

4. Ивницкий Д. М. , Приев А. И., Шильников Г. В. "Ультразвуковая вело-симетрия растворов иммуноглобулинов", Акустический журнал, 1987, Т. 33, N 4, с. 670-674.

5. Приев А. И. , Шильников Г. В., Демчева М. В. "Исследование конфор-мационных перестроек в антителах, вызванных взаимодействием с антигеном" В сб. "Молекулярные основы биотехнологии": Тез. докл. П Международной шк. -конф'. молодых ученых соц. стран. Пущино, НЦБИ АН СССР, 1987, с. 40-41.

6. Приев А. И., Ивницкий Д. М. , Дзантиев Б. Б " Быстрое определение инсулина и антител к нему". В сб. "Эндокринная система организма и вредные факторы внешней среды": Тез. докл. Ш Всесоюзн. конф. Ленинград, 1987, с. 189.

7. Шильников Г. Е , Приев А. И. "Исследование взаимодействия антитело -гаптен с помощью измерений скорости распространения ультразвука" Биофизика, 1988, т. 33, вып. 4, с. 572-575.

8. Приев А. И. "Изменение объемно-упругих свойств раствора в ходе реакции взаимодействия амилазы со специфическими антителами и их Fei-фрагментами". В сб. "Молодые ученые и специалисты - ускорению социально-экономического развития", Самарканд, СамМИ, 1988, с.96.

9. Приев А. И. .Шильников Г. В. "Исследование рН зависимости коэффициента поглощения и скорости распространения ультразвука в растворах иммуноглобулинов", Акустический ж.,1990, т. 36,N 4, с. 551-554.

10. Приев А. И. , Сарвазян А. П. , Дзантиев Б. Б. , Жердев А. В., ' Чередникова Т. В. "Изменение сжимаемости при взаимодействии антигена с моно- и поликлональными антителами", Мол. биол. 1990, т. 24, N 3, с. 572-576.

11. Приев А. И. , Кердев А. В. , Морева И. Ю. "Быстрое определение антигенов и антител в биологических жидкостях акустическим методом" В сб. "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии": Москва, НЦМД МЗ СССР, 1990, с.76-82.

12. Приев А. И., Сарвазян А. П. , Дзантиев Б. Б. "Акустометрический иммуноанализ" В сб. "Итоги науки и техники", Серия Биотехнология. Москва, ВИНИТИ, 1991, т. 24, с. 172-194.

13. Шильников Г. Е , Приев А. И., Ахмедов А. И. "Объемно-упругие свойства водных растворов некоторых углеводов", Биофизика, 1991, т. 36, Вып. 1, с. 53-57.

14. Priev А. I. , Shilnikov 6. V. , Dzantiev В. В. "Ultrasonic ve loci -metry in the investigation of interaction of monoclonal antibodies with insulin". In: Abstracts of UBIOMED YII Symposium "Ultrâ-sound in Biology and Medicine", Halle, 1986, p. 152.

15. Sarvazyan A. P. , Shilnikov G. V. , Priev A. I. "Ultrasound in investigation of immunochemical reactions", J. Ultrasound Med. 1988, .v. 7, n. 10, p. 135.

16. Sarvazyan A. P. , Shilnikov G. V. , Priev A. I. "Ultrasonic study of immunochemical system and reactions", In Proceedings of IEEE Ultrasonics Symposium, Chicago, 1988, p.919-922.

17. Priev A. I. , Shilnikov G. V. "Compressibilities of immunoglobulins in solutions". In: Abstracts of UBIOMED YIII Symposium "Ultrasound in Biology and Kfedicine",Brno, 1989, p. 8.

18. Заявка 4937593/13 с приорететои 18.04.91 г. "Способ акустического определения активности фермента или количества субстрата в никрообъенах" Сарвазян А.П.. Приев А. И. . Шильников Г. В.

19. Заявка 4937595/13 с приорететои '18.04.91 г. "Способ количественного определения гаптенов" Шильников Г.В., Приев А.И.. Сарвазян А.П.. Дзантиев Б. Б.

1.12.92 г. Зак.5254Р Тир.125 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринт? в ОНТЛ ПНЦ РАН