Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, биохимические свойства и применение препарата аллогенный иммуноглобулин-С

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, биохимические свойства и применение препарата аллогенный иммуноглобулин-С"

V1 о ун

2 2 МАЙ №

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ ПАТОЛОГИИ, ФАРМАКОЛОГИИ И ТЕРАПИИ

На правах рукописи СИДОРЕНКО СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА АЛЛОГЕННЫЙ ИММУНОГЛОБУЛИН-С

03.00.04,- 0иохиш1я

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОРОНЯ 1995

Работа выпол&еяа в лаборатории июфоОиодогия и вирусологии Всероооийокого научно-иоОледовательокого ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии и во Воероооийо-кои государственном научно-иооледовательоком инотитуте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МСХ и продовольотвия Российской Федерации.

Научный руководители:

Заслуженный деятель науки Роосийокой Федерации, действительный член Нью-Йоркской академии наук США,доктор биологических наук, профессор А.П.Простяков

Доктор ветеринарных наук, профеооор Л.Г.Вахаа

Официальные оппоненты)

Доктор биологических наук, профеооор Н.В.Палии .

Доктор ветеринарных наук, профеооор А.М.Амуфрмш

Ведущая организация!

Воероооийокий научно-исследователь окий и технологический институт риологичеокой промышленности

Защита диооертации ооотоитоя " и года

в часов на ваоедании дюоертационного оовета

Д.020.ВБ.01 при Всероссийском научно-иосшедсвательоном ветеринарном инотитуте патологии, фармакологии и терапии по ад-реоеу: 394087, г.Воронеж, ул.Ломоносова, 114-0.

С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке инотитута.

Автореферат разослан " ^-спЛ юзб г.

Учений секретарь опециажюираванного совета

в.н. словодашк

ОВЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. АКТУЛЖЛНЛЪ ТЕШ. в крупных специализированных свиноводческих хозяйствах острой проблемой являются желудочно-кишечные болезни новорожденных поросят, протекающие по типу смешанных или ассоциированных инфекций и возникавшие, как правило, на фоне нарушения технологии кормления и содержания супоросных овиноматок, (Г.Ф.Корошолов, 1082; А.Г.Шахов О ооавт., 1082; А.И.Водожии, Ю.К.Субботин, 1088;

A.Я.Пустовар, 1901 г., В.П.Урван о ооавт. 1001; и др.)

Одной иа причин возникновения и широкого распространения

диарей является гипогаммаглобуминемия у поросят, воледотвие несвоевременного и недостаточного поступления иммуноглобулинов о молозивом и молоком матери (А.И.Луценко идр., 1079;

B.Д.Наотенко и др., 108Б; А.И.Оразбекова, 1001).

Для профк ютики желудочно-кишечных болезней поросят и терапии больных животных предложено большое количество биологических и химиотерапевтических препаратов (В.А.Антипов о ооавт. 1070, 1080; В.И.Леоных о ооавт., 1080; В.П.Урбан, 1083, 1001; Ы.А.Сидоров 1083, 1080; В.А.АНТИПОВ 1087; В.И.Моргунов 1002), применение которых в значительной отепе-ни снижает заболеваемость и падеж молодняка.

Однако, 1 условиях специализированных* хозяйств, где превалируют смешанные или ассоциированные инфекции, они не всегда даст желаемый результат.

В связи о атим возникает необходимость разработки универсальных средотв профилактики и терапии желудочно-кишечных болезней поросят. В борьбе о ними на первый план выступает изыскание средств, опоообных модулировать уровень иммунологической оопротивляемооти организма.

Для этой цеди рекомендовано применение гипериммунных

сывороток, препаратов неопецифичеоких гамма- и политлобули-вов (В.П.Урбан, 1964; А.И.Луценно о ооавт., 1979), аллоген-ных иммунных сывороток свиней (Н.Х.Засепокий, 1984; А.П.Простяков с соавт., 1995). На наш взгляд в уоловиях сложной эпизоотической ситуации па желудочно-кишечным болезням поросят, осоОенно при наличии у них иммунодефицита перспективным в борьбе о ними являетоя адлогенный иммуноглобу-лин-С, который получают ив сывороток крови овиней конкретного хозяйства и используют для лечебно-профилактических целей в втом же хоэяйотве. Наличие в аллогенном иммуноглобулине-С антител, адекватных вирусно-бактериальному фону свгатоводчео-кого хозяйства, позволяет применять его, не ожидая окончательных результатов диагностических исследований.

1.2. ЦШЬ М ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью наотоящей работы явилось получение аллогенного иммуноглобулина овиней о использованием полиэтиленгликоля-116 и изучение его лечебно- профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях новорожденных поросят в опецилизоваронных свиноводческих хозяйствах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить оледующие задачи:

1. разработать методику фракционирования аллогенного иммуноглобул1ша-С о помощью полиэтиденгликоля-11Б.

2. Изучить биохимические, биологические и серологические свойства аллогенного иммуноглобулина-С.

3. Совместно о ветеринарными специалистами изучить лечебно-профилактическую эффективность аллогенного иммуногло-Оулина-С при желудочно-кишечных заболеваниях поросят различной этиологии.

\

4. Разработать нормативно-техническую документацию по изготовлению и применение аллогенного иммуноглобулина овиней (АИГ-(С)).

1.8. НАГМАЯ НОВЮНА. Впервые проведена сравнительная оценка методов фракционирования белков сыворотки крови риванолом и полиэтиленгликолем. Показаны преимущества использования для препаративного выделения Оета- и гамма-фракций глобулинов полиэтиленгликоля (ПЭГ) о молекулярной маооой ВООО + 1000 Д. В овязи о втим определены оптимальные условия фракционирования иммуноглобулинов из сыворотки крови свиней (аллогенного) и разработана промышленная.технология изготовления препарата аллогенного иммуноглобулина из сыворотки свиней (АИГ-(С)).

Научены Ои-«"мичеокие, физикохимичеекке и оерологичео-кие овойства прьларата. Определены величины основных показа-' телей качества АКТ-(С), которые легли в оонову методов контроля при крупномасштабном производстве этого препарата. Выдвинуты теоретические предпосылки об иммунобиологическом действии АИГ-(С) при компенсации иммунодефицита у порооят раннего возраста как оредотва повышения их резистентности.

1.4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработал я предложен технологический регламент изготовления и контроля препарата ЛИГ-(С).

Даны практические рекомендации по применена] препарата ЛИГ-(С) для профилактики и лечения смешанных болезней.

1.6. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ШНЕДОВШЙ. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация по изготовления и применению аллогенного иммуноглобулина свиней (АНГ-(С)).

Основные научные положения диооертации, выносимые на защиту:

1. Нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению АИГ-(С), утвержденная Депортаментом ветеринарии Минсельхозпрода Роосийокой Федерации (1003).

2. Биохимические, биологичеокие я серологические овойо-тва АИГ-(С).

3. Лечебно-профилактическая эффективность аллогенного иммуноглобулина свиней при желудочно-кишечных болезнях поро-оят раннего возраста различной этиологии.

1.В. АПРОБАЦИЯ РАБОГШ. Материалы диооертации доложены на научно-технической конференции "Профилактика и лечение болезней молодняка сельскохозяйственных животных" (г.Воронеж, 1991); на Ученой совете в ВГНКИ ветпрепаратов (г.Москва, 1902-1093'гг.); 1 Воероосийокой научной конференции "Иммунодефицит сельскохозяйственных животных" (г.Москва, 1996 г).

1.7. ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диооертации опубликованы в в статьях.

1.8. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 139 отраницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные исследования, обсуждение, выводы и практические предложения, спиоок литературы.

Работа иллюстрирована 14 таблицами и 2 рисунками. Спиоок литературы включает в оебя 147 источников, в том числе 111 -отечественных и 37 иностранных авторов. Приложение на 30 страницах.

г. МАТЕРИАЛ! N МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории микробиологии и вирусологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии и во Всероссийском Государственном научно-исследовательском институте контроля, отрандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МСХ и продовольствия РФ в 1990-1004 гг.

В качеотве исходного сырья использовали аллогенную иммунную сыворотку крови от клинически здоровых свиноматок и животных из группы откорма, из хозяйства МХП "Победа", МХП "Начало" и ГПЗ "Масловский" Воронежской области.

Из полученных сывороток готовили аллогенный иммуногло-' булин-С о помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ-11Б) по методике, предложенной А.П.Простяковым (1088) для получения глобулинов из сыворотки крови 'крупного рогатого скота. Препарат проверяли на стерильность я безвредность. В полученных аллогеняых сыворотках и иммуноглобулинах определяли общий белок рефрактометрически (А.А.Кудрявцев, 1062), белковые фракции - методом Олла и Махкорда а модификации С.А. Карпюка (1962), а также классы иммуноглобулинов (О, М и А) на анализаторе белков "Арраи" фирмы "Веошан" (США) и по методу Манчини. Кроме того, в аллогеняых иммуноглобулинах-С определяли остаточное содержание ПЗГ-115 по методу Хидена, рН среды препарата о помощью рН-иетра и содержание хлористого натрия.

В каждой серии сыворотки и препарата определяли наличие антител в РА к антигенам из сальмонелл, бордетелл, эшэрихий.

- в -

паотервлл, стафилококков, в РТГА к гриппозному и парагриппов ному, в РСК- к хлаыидийному антигенам и в РН- к корона-, рота- и внтеровируоам в первичной и перевиваемой культурах клеток. Первичную культуру клеток почки вмСрионов свиньи (ПЭС) получали в лаборатории микробиологии и вирусологии по общепринятой методике в вирусологической практике (А.К.Шуб-ладзе и др., 1054; В.А.Сергеев, 1060, 1070).

Перевиваемые культуры клеток: СПЭВ (свиная почка вмбри-она ветеринарная) получена из ВИЭВ (г.Москва) и ПСК-ЭО (почка сибирокого горного козерога) из ВНИИЗЖ (г.Вламидир).

В опытах иопольвовали взроолых овиней и порооят крупной Оелой породы.

Взрослые свиньи обоего пола в вограоте 1,6-3 лет, о массой тела 160-200 кг средне» упитанности.

Поросята в возрасте от 0 часов до 1 месяца, о массой тела 1,0-7,0 кг средней и нижесредней упитанности.

Всего в опыте было использовано 070 животных. Рационы кормления были однообразными, несбалансированные* по кальцгао, фосфору, витаминам, микроэлементам, иногда имел меото дефицит переваримого бедка.

Тип кормления: сухой, концентрированный корм о размером чаотиц 2-3 мм. Подкормку поросят осуществляли на 10-12 дни после опороса, водопой вволю.

Животных содержали группами (8-10 голов) в отанках, Оузвыгульно, в типовых помещениях. Микроклиматические уоло-вия содержания порооят не всегда отвечали зоогигиеническим нормам.

Для исключения случайных результатов опыты проведены в нескольких повторностях.

Изучение влияния иммуноглобулина на морфологические и биохимические показатели крови и общую неспецифическую резистентность организма проведено на 110 клинически здоровых и 40 больных желудочно-кишечными заболеваниями поросятах.

Количество гемоглобина в крови определяли с помощью гемометра (калориметра простейшего устройства). Содержание эритроцитов и лейкоцитов определяли при помощи камеры Горяе-ва.

При определении фагоцитарного индекса (ФИ), характеризующего интенсивность фагоцитоза, проводили подсчет числа фагоцитированных микробов в расчете на один лейкоцит (Э.Н.Шляхов, 1977); определение бактерицидной активности сыворотки крови '-«водили по методу О.В.Смирновой и Т.А.Кузьминой (1966), ¿изоцимную активность - по К.А.Каграмановой и З.В.Ермольевой (1966), комплементарную активность - по О.В.Бухарину (1974) Определение Т- и В- лимфоцитов велось по методу спонтанного роэеткообразования в периферической крови. "

Для проведения бактериологических исследований использовали кровь из сердца, пораженные участки кишечника, легких, почек, печени, бронхиальные, оредостенные и мезентери-альные лимфатические узлы.

Патологический мзтериал исследовали не позднее 4-в часов после взятия. Посевы патологичеокого материала проводили на ША, скошенный в пробирки, и МПБ.

Диагностические исследования проводили ветеринарные специалисты.

Статистическая обработка полученных данных проведена общепринятыми методами (Е.К.Меркурьева, 1964).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОВСТНИШЦХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Получение и характеристика аллогенного иммуноглобулина-С

Для изготовления аллогеняого иммуноглобулина-С использовали аллогенную сыворотку свиней, консервированную путем добавления к ней БХ-го раотвора фенола до конечной концентрации ее 0,61. Перед фракционированием сыворотку крови фильтровали через два слоя марли.

Профильтрованную сыворотку загружали в емкость из нержавеющей стали, оборудованной мешалкой. Измеряли и доводили рН сыровотки до 7,В - 8,б". Корректировку рН проводили при помощи IX раствора соляной кислоты или едкого натра. Затем в сыворотку добавляли 7-ЗХ подиэтиленгликоля-Пб (ПЗГ-115).

После растворения ПУГ-115 при постоянном перемешивании (15-40 мин) выпадали хлопья белка.

Для отделения осадка глобулинов смесь сыворотки о ПЗГ-116 оставляли на 24 часа в холодильнике при + 4° С, при атом взвесь белка оседала. После чего надосадочную жидкость сшивали, а осадок собирали и взвешивали.

Полученную белковую пасту растворяли в физиологическом растворе хлористого натрия. Полученную смесь сливали в емкость из нержавеющей стали. В растворе определяли рефрактометрически (по шкале определения белка в сыворотке) содержание белка и доводили его до 10-11Х физраствором.

Раствор глобулина фильтровали через мезгу. Мезгу делали

различной плотнооти: "белая" мезга-размоченная в диотиллиро-ванной воде и измельченная в виде кашицы белая фильтровальная бумага; "оеро-белая" мезга - размоченная и измельченная белая фильтровальная бумага и асбестовые пластины "ф" в соотношении 1:1. Наименее плотная "белая" мезга.

Фильтрацию через мезгу проводили на нутч-фильтрах. При этом на оетку нутч-фильтра клали лист фильтровальной бумаги, на который помещали мезгу. После этого под вакуумом удаляли избыток воды.

После фильтрации через мезгу раотвор белка фильтровали на наборных многорамных фильтрах (фильтрах Сальникова) последовательно через плаотины "ф", а затем пластины "О©". Перед каждой из фильтрации следили, чтобы рН была в пределах 6,8-7,2. Расчитывали выход готового препарата от исходного объема сыворотки.

В опытах использовали 6 серий аллогенной имунной сыворотки свиней (АИС-(С)), из которых получены 6 серий иммуноглобулинов (АИГ- (С) )•. Из 2-х серий АИС-(С) был получен алло-генный иммуноглобулин -С двумя опоообами (риваноловым и ПЭГ-методом).

Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что в шести сериях аллогенной сыворотки оодержаниё общего белка по рефрактометру составляет - 75,0 - 86,0 г/л. Все серии сывороток по процентному содержанию белковых фракций и классов иммуноглобулинов существенно не отличались друг от друга.

Основная масса иммуноглобулинов в сыворотке принадлежала классу О и составляла около трех тысяч мг/Х. Содержание иммуноглобулина класса М, было в 2,6 - 6,0 раз меньше, а количество иммуноглобулина класса А было незначительным.

Таблица 1

Характеристика аллогенных иммунных сывороток свиней, использованных для приготовления аллогенного нмуноглобулина-С (МЕГ-С)

I I I Количество общ.

I NN 1 Номер I белка (г/л) i пп 1 серий I 1 АКТ I

I i

(Белковые фракции сывороток (I)I

1------------------------------1-

1Алъбум1/-глоб. 1^-глоб. 1^глэб. 1

Содержание классов иымуногло-1 булинав (мг/Z)

Is G

i

Iff M 1 и A I

1 1 78,0 37,В 13,8 16,0 28,5 3018,0 570,0 <40,0

2. 2 7Б.0 40,0 18,5 17,0 24,5 2262,0 918,0 <40,0

3. 3 88,0 37,1 18,4 19,0 23,6 2862,0 842,0 <40,0

4. 4 73,0 39,0 18,6 17,0 25,5 2790,0 818,0 <40,0

6. I CP 77,0 38,0 17,0 19,0 26,0 2958,0 888,0 <40,0

8. 2 С* 83,0 39,0 17,6 18,0 25,5 3060,0 808,0 <40,0

Ы * и 78,0+4,0 39+1,3 13,2+1,2 17,6+0,8 2820,0+234 <40,0

25,2+0,7

880,0+72

О I

i

Биохимическая характеристика аыогенных иммуноглобулинов свиней (ЛИГ- (С))

I NN ] Номер! Кол-во I Кол-во I I Выход I Белковые фракшш (Z) 1 Классы глобулинов (ыгХ) 1

I пп (серий!общего! ПЭГ I рН I АИГ-С I-------------- ------------------------------------

1 1ИГС-А1белка I (Г) I I (г/л) 1Альбул1с/-глоб1/-хлоб1/глоб! 1г Б I 1ц М I Ij к I

I 1 I(г/л) lit I ' i I I i I 1 I

1 1 101,0 2 7,6 4.0 0 0 45,0 55,0 3252,0 570,0 <40,0

2 la 6,1 0 7,5 - 0 0 0 26,0 1852.0 <20,0 <40,0

3 3 102,0 2,3 7.6 4.6 0 0 45,0 55,0 3864.0 648,0 <40,0

4 За 7,4 0 7.5 - 0 0 0 25.0 1048,0 <20,0 <40,0

5 4 107,0 2,4 7.6 4.1 0 0 40,0 60.0 3290,0 610,0 <40,0

В lcp 101,0 2,3 7.5 4.4 0 0 40,0 60.0 3700,0 604,0 <40,0

7 2сж 09,0 2,0 7,55 4.3 0 Q 45,0 55.0 3607,0 611,0 <40,0

U+M 101,0+3,0 7.Б+Р.1

2,2+0,2 4,3+0,2

При осаждении аллогенных иммуноглобулинов-С ПЭГ-методом установлено, что из 100 литров оыворотки при деконтации ка-досадочной жидкости оотаетоя в ооадке 4,8-6,6 кг белковой пасты, что составляет выход 4,3+2 г/л сыворотки. Растворяя последнюю физраствором до содержания бедка 10-111, можно получить 2,8-3,3 литра аллогенных иммуноглобулинов-С. Такие иммуноглобулины пооле фильтрации содержали 101,0 ± 3,0 г/л белка, 2,2+0,2Х полиэтиленгликоля-116, хлористого натра 0,81 и рН 7,6+0,1. В полученном иммуноглобулине-С обнаружены бета- (30-401) и гамма-глобулины (60-652).

При Изучении состава аллогенных иммуноглобулинов-С, полученных ПЗГ-методом, установлено, что основную массу их составляли клаоо Э (75-80Х), который связан о гамма-глобули-новой фракцией оыворотки крови овиней, и иммуноглобулин класса М (20-252), связанный о бета-глобулиновой фракцией сыворотки. Иммуноглобулины, полученные риваноловым методом (серии 1а и За) из аллогенных сывороток серий 1 и 3, содержали гамма-глобулиновую фракцию, состоящую из 0 клаоса иммуноглобулинов. Причем, риваяоловый метод позволил определить, что и класс иммуноглобулинов свиней связан о бета-глобулиновой фракцией сыворотки крови и о помощью его можно получить 50-662 от всех иммуноглобулинов.

Содержание иммуноглобулинов класса А в аллогенных сыворотках, так и в полученных из них иммуноглобулинах обоими методами было веотма низким, так же как и иммуноглобулинов класса м, полученных риваноловым методом.

При исследовании аллогенных сывороток овиней в разлив-

шх иммунологических реакциях было установлено, что они содержат антитела к эшерихиоэкому, сальмонеллезному, пастэрел-леэному, стафилококковому, Оорделлезному, гриппозному, знте-ровирусному, корона-, рото- и парвовирусному антигенам. Антитела к хламидийному и аденовирусному антигенам в РСК, а также к парагриппозному антигену 1 и 2 типов в реакции пассивной гемагглютинации обнаружены не были. Титры антител к различным видам антигенов у животных каждого хозяйства были различными и зависели от давности проведенной вакцинации и переболевания животного, силы антигенного раздражения, иммунологической реактивности организма.

В полученных иммуноглобулинах нами также обнаружены антитела к указанным антигенам, но в титрах в 2-4 раза, превышающих таковые в аллогенных сыворотках овиней.

Таблица 3

Величины основных показателей качества АИГ-(С)

П о к а з а т е'л и' 1 Характеристика и нормы

1 1 2

1. Внешний вид жидкость

2. Цвет от светло-желтого до

светло-коричневого

3. Запах специфический

4. Наличие механических

примесей,плесени,неразвиваю-

щихся хлопьев, осадка не допускается

1 Г 2

В. рН - в пределах 7,0-7,в

в. Массовая доля белка, г/л 100+10,0

7. Массовая доля фракций бета+гамма глобулинов, X

не менее 06,0

8. Маооовая доля полизтиленгликоля,

X, не более 3,0

0| Стерильнооть должен быть стерильным

г »

В таблице 3 представлены ооновные показатели и их величины, характеризующие каяеотво препарата АИГ-С, получаемого по предложенной вами технологии.

Полученные результаты овидэтельотвуют о том, что ПЗГ-метод получения аллагешшх иммуноглобулинов-С является аффективным и технологичны* опоообом фракционирования глобулинов, а полученные препараты, очевидно, могут обладать как профилактическим, так и лечебными свойствами при оальмовел-лезе, паотереллезе, зшерихиозе, бордетеллеве и отафилакокко-ве.

Что касается вируоных инфекций, то иммуноглобулины, содержащие вируснейтрализирующие антитела в низких титрах могут обладать лишь незначительным профилактическим действиям.

- IB -

3.2. Профилактика желудочно-кишечных заболеваний порооят о помощьс аллогенного иммунхглобулина -С

Изучение профилактической эффективности одних и тех жз серий иммуноглобулинов проводили оовместно о ветеринарными опециалиотами в ряде экспериментов. В первой серии опытов отрабатывали дозу аллогенного иммуноглобулина-С, обеспечива-пцуо оптимальный аффект при профилактике желудочно-кишечных заболеваний, вызываемых бактериальными х вируоными агентами.

Для атой цели, методом аналогов било подобрано 13 групп поросят в возрасте в часов по 50 голов в каждой группе мао-оой тела от 1,0 до 1,3 кг.

ЛИГ-(С) и ЛИС-(С) вводили внутримышечно i первые в часов жизни и спуотя 14 дней 1 дозах 0,3; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; В,О мл/кг масаы тела. За животными вели клиническое наблюдение в течение месяца и регистрировали количество заболевших х выздоровевших порооят, общее оостяние, прироот маооы тела х т.д. ' | *

Установлено, что при двукратном введении ЛИГ-(С) оптимальной дозой препарата валяется объем 0,6-1,0 мл/кг маооы тела. Такая доза аллогенного иммуногобулхна овиней обеспечивает профилактику желудочно- кишечных болезней привитых порооят до месячного возраста в ООХ, сохранность - в 04-001 случаев.

При применении оптимальной дозы АИС-(С) (базовый вариант) , равной б мл/кг, сохранность порооят-оосунов оостаяхяла 04Х, профилактическая зффективнооть - 80S.

Следует отметить, что инъекции иммунопрепаратов в сравнении о контролем не оказывали существенного влияния на увеличение содержания иммуноглобулинов клзссоь В, М и А. Так, содержание иммуноглобулина В у поросят-сосунов на 5 день после введения АИГ-(С) и АИС-(С) было соответственно 1480+168 И АИС-(С)-1400 мг/Х) в контроле - 1380+197 мгХ), а иммуноглобулин класса М - 230+23 мгХ и 248+17 мгХ (в контроле 218+11мгХ). Как показано выше, количество иммуноглобулина класса А, в аллогеиных сыворотках и глобулинах был низким, а у подсосных поросят всех групп его содержание было относительно выооким 313+39 мгХ (опытная группа) и 301+35 мгх (базовый вариант) и 296+31 мл/гХ (контроль).

Следовательно, иммуноглобулин класоа А поросята получали главным образом о молозивом матери.

Таким образом, внутримышечное введение аллогенного им-муноглоблулина в объеме 0,6 или 1,0 мл/кг массы тела обеспечивало профилактику желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов до 30-дневного возраста в 90Х случаев.

Выяснив оптимальную дозу при внутримышечном введении АИГ-(С) мы приступили к изучению профилактической эффективности при комбинированном (пероральном и внутримышечном) его введении о сокращением сроков между индуктивной и продуктивной фазами с 14 до 2-5 дней.

С этой целью в тех же хозяйствах, где уже была изучена этиологическая структура инфекционных желудочно-кишечных болезней, было сформировано методом аналогов 12 групп по Ю -50 поросят-сосунов в возрасте до одних суток с массой тела 1 - 1,3 кг.

Инъецировали препараты АИГ-(С) и АИС-(С) в дозах 0,6,

1,0, 2,0, 3,0 и 6,0 мл/кг, массы тела. Новорожденных поросят контрольной группы обрабатывали антибиотиками тётрациклино-вого ряда, активными в отношении выделенной эшерихии коли.

От пяти животных каждой группы до введения препаратов и на 7,14, 21 и 28 дней брали кровь для проведения гематологических и иммунобиохимических исследований.

Установлено, что заболеваемость животных двукратно обработанных АИГ-(С) перорально в объеме от 0,6 до 6,0 мл/кг составляла 20 - 302, а практическая эффективность доститада-70 - 802 и практически не зависела от величины введенной дозы препарата. Гибель поросят в этих группах составила около 102, а сохранность достигала примерно 002 при среднесуточном приросте массы тела от 170 до 193,3 г.

Аналогичные результаты получены и при двукратном перо-ральном приу-чении аллогенной иммунной сыворотки свиней в дозе Б,0 млЛ." маосы тела о интервалом 16 дней. Однако, прирост массы тела в этом случае бил ниже (168,8 г) и равнялся приросту у животных контрольной группы.

В контрольной группе поросят, где использовали антибиотики тетрациклинового ряда, заболеваемость животных составила около Б52, о гибелью приблизительно 332. Сохранность поросят составила 672 против 90-982 при использовании иммуноп-репаратов.

Введение аллогенного иммуноглобулина-(С) оказало благоприятное влияние на показатели крови клинически здоровых животных. Под действием препарата происходило увеличение содержания эритроцитов, гемоглобина, нормализация количества лейкоцитов, повышалась бактерицидная и комплементарная активность сыворотки крови, и фагоцитарная активность лейкоци-

тоа.

Применение аллогенного иммуноглобулин-С благоприятно оказалось и на протеинограмме сшвороток крови поросят, об втом свидетельствовало увеличение содержания общего белка и гаммаглобулинов.

3.3. Лечение желудочно-кишечных болезней поросят о помощью аллогенвого иммунноглобудина-С

Эти опыты проводилиоь при непосредственном участии ветеринарных специалистов. Для изучения лечебной эффективности аллогенвого иммуноглоубилна-С в трех хозяйствах, где от взрослых овиней подучены аллогенкые сыворотки и соответственно из них иммуноглобулины, было подобрано 0 групп поро-сят-оооунов в возрасте 3-5 дней о массой тела 1,3 - 1,5 кг, имеющих раотройства функций желудочно-кишечного тракта. Диагноз и этиологии болезни устанавливали на основании результатов изучения эпизоотической обстановки, клинического, бактериологического, вирусологического и серологического исследований.

Поросят первой и второй групп лечили путем ежедневного внутримышечного введения в течение трех дней подряд. Вводили АИГ-(С) в дозах 0,0 я 1,0 мл/кг массы тела.

Поросятам третьей, четвертой, пятой и шеотой групп на протяжении четырех дней подряд инъецировали внутримышечно АХГ-(С) соответственно в дозах 1,0 2,0 3,0 и 5,0 мл/кг масоы тела.

Животным 7 и 8 групп инъецировали внутримышечно алло-геннуо иммунную сыворотку свиней соответственно 4 и 3 дня

подряд по 8,0 ил/кг массы тела.

Поросят в-ой группы (контроль) лечили антибиотиками твтрациклинового ряда а соответствии о наставлением по их применению из расчета 16 тыс.ЕД кг/ массы тела.

От б животных каждой группы брали кровь перед началом лечения и спустя 7,14,21 и 28 дней для проведения гематологических, биохимичеоких и серологических исследований. В точение 30 дней за подопытными животными вели клиническое наблюдение, учитывая падеж, выздоровление и скорооть роста.

Полученные данные показывают, что лечебная эффективность аллогенного иммуноглобулина-С при внутримышечной инъекции в течение трех дней подряд в дозе 0,6 - 1,0 мл/кг массы тела соотавила 84 - 001 , а при введении тем же методом в течение четырех дней подряд в дозах 1-8,0 мл/кг массы тела 80 - 03,4Х. Прирост масоы тела оостааяя соответственно 220-224 г.

Аллогенная иммунная сыворотка (базовый вариант) при 3-4-х кратном внутримышечном введении больным поросятам в дозе 5,0 мл/ кг массы тела обеспечивала также выраженный л е-чебный эффект (85 - 86,8Х).

Сравнивая эти данные о контролем (0 группа), оледует отметить, что иммуноглобулины к аллогвяные оывороткя превоо-ходят по эффективности антибиотики на 16 - 16Х. За период опыта среднесуточный прирост маосы тела поросят а контрольной группе в среднем оказался на 30 г меньше, чем при применении АИР-(С) и АИС-(С). Все это позволяет считать, что ал-логешше иммуноглобулины свиней (АИГ-(С)) я аллогенные сыворотки свиней (АИС-(С)) является эффективными препаратами для лечения желудочно-кишечных болезней поросят.

После 3-4-Кратной обработки иммунопрепаратами у Сольных поросят отмечали снижение титров антител к эиерихиям и сальмонеллам.

У животных опытных групп наблюдали увеличение количества гемоглобина с 35,0 + 1,4 Д° 121,2 + 4.5 г/л, эритроцитов о 5,3 + 1,3 до 7,1 + 2,3 млн/мл, лейкоцитов с 12,6 + 1,2 до 17,4 + 1,в тыс/мл. Отмечено повышение бактерицидной и лиэо-цимной активности сыворотки крови.

Принимая во внимание полученные экспериментальные данные, мы научили терапевтическую эффективность аллогенного иммуноглобулина-С в комбинации с антибиотиками и левамиэо-лом.

С этой целью АИГ-(С) смешивали с антибиотиками тэтра-циклинового ряда из расчета на 0,5 мл иммуноглобулина 50-тыо. МЕ тетрациклина (50 мг) или 7,5 мг левамизола на 0,5 мл АИГ-(С) (глобомиэол).

Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что гло-бомизол и левамизол оказывают как и АИГ-(С), стимулирующее 'действие на организм и способствуют ускорению выздоровления животных по сравнению о контролем (лечение тетрахлоридом). Выздоровление животных происходило на 8-10 дни, с момента начала лечения. Среднесуточный прирост массы тела наибольшим был в группах, где лечение осуществляли глебомизолом (253-260) г, н&сколько меньше (240-253 г) у животных, которых лечили левамизолом и АИГ-(С).

Установлено так*е, что аллогенкый иммуноглобулин-С в комбинации о антибиотиком при введении в течение 4 дней по терапевтической эффективности вьете на 7,32 по сравнению с 3-х.кратным применением и на 8,ЗХ выше, чем при введении

АИС-(С) с антибиотиком в течение 3 дней. Аналогичные данные получены и при применении ЛИГ-(С) о левамкзолом, где терапевтическая эффективность препарата достигла ОБХ.

Введение иммуноглобулинов-С, левамизоэд и тетрахлорида в отдельности дает терапевтический эффект, на 5-202 ниже.

Следовательно, АКТ-(С) освмеотно о левамиэолом или антиботиком при 3-4 кратном ежедневном введении способствует выздоровлению порооят, отрадающих рздтройствами функции желудочно-кишечного тракта, в 0Б-06Х.

При анализе крови животных на. содержание Т- и В- лимфоцитом установлено, что у животных., атрадаюшда гастроэнтеритами, количество Т-лимфоцитов на.3-1ОХ ниже, чем у здоровых животных, а через 14 дней о момеяда,начала лечения указанными препарата». • количество Т- и,-. Ц- лимфоцитов увеличилось и содержание их приблизилось к уровни клинически здоровых поросят. Однако, к 20 дню, когда,адавотные были клинически здоровы, количество Т- и В- лим&рцктоя у поросят, подвергнутых лечению, увеличилось'(50-бОХЛтлимфоцитов и до 6Х В-лимфоцитов) и было несколько ниже, ч^м а контроле.

Таким образом, для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней поросят сложной этиологии целесообразно применять ЛИГ-(С) в сочетании о антиботиками и левамизолом.

3.3. Влияние аллогенного иимуноглобулина на неспецифическую резистентнооть новорожденных поросят

Введение АИГ-(С) оказывало блогаприятнов влияние на протеюгограмму сывороток крови поросят, сопровождающееся

увеличением содержания общего белка (о 6,6 до 7,1Х), альбуминов (с 10.6 до 28,БХ), альфа и гамма-глобулинов (с 16,9 до 10,6 и 30,0 до 35,2 соответственно). Аналогичные, результаты получены и при применении неспецифического иммуноглобулина- С, глобимиаола и АИС-(С).

Менее выраженное влияние на указанные показатели оказали антибиотики и девамизол.

Анализ показателей бактерицидной, комплементарной и ли-аоцимной активности сывороток крови поросят, которым алло-генкый иммуноглобулин-С введен о профилактической или лечебной целями, показывает, что бактерицидная активность повышается о 1БХ на 7-ой до БОХ - на 28 день, лизоцимная- соответственно о ЗХ до 8Х - на 28 день. Аналогичные изменения названных показателей сыворотки крови отмечено и при применении А/С-(С), неспецифического глобулина и глобомизола.

При введении в организм поросят антибиотиков, левамигола динамика бактерицидной, лигоцимной и комплементарной активности сходна о таковой, что и при введении иммуноглобулинов, но менее выражена.

Сравнивая показатели крови контрольных (не обработанных) животных и поросят, которым вводили АИГ-(С) с профилактической целыз, видно, что количество эритроцитов и гемоглобина у контрольных поросят несколько ниже, чем у животных опытной группы, а сдвиг лейкоцитарной формулы вправо у поросят обеих групп завершается одновременно к концу третьей недели.

Введение аллогенного иммуноглобулина-С о профилактической целью способствовало также увеличению к 30 дню жизни фагоцитарного числа на 18Х и фагоцитарного индекса - на 21,ЗХ

(в контроле увеличение составило соответственно яа 8,4 и 8,IX).

Данные по влиянию аллогенкого иммуноглобулина-С на морфологические и иммунобиохимичеокие -показатели крови Сольных порооят-сосунов показали, что применение препарата сопровождается увеличением в крови содержания гемоглобина на 16 и вритроцитов - на 23,2Х. Одновременно повышались фагоцитарная активность лейкоцитов на Б.2Х, фагоцитарное чиоло - на 76,ЗХ и фагоцитарный индеко - на 07,ОХ. Фагоцитарная активность лейкоцитов у животных, подвергнутых лечению аллогэнным иммуноглобулином- с, к 21 - 28 дню жизни достигла 04-100Х, при фагоцитарном индексе 8,3 - 0,70. Эти данные свидетельствуют о том, что поросята, подвергшиеся лечению аллогенным иммуноглобулином- С, имеют выраженную иммунореактивность.

Аналогичные изменения в крови поросят происходили при использовании аллогенной оыворотки, антибиотиков, глобомиэо-ла и левамизола. Однако, антибиотики и левамизоя оказывали менее выраженное влияние на морфологические показатели крови и бактерицидную, комплементарную и дизоцимную активнооть сывороток, чем аллогенная иммуная сыворотка, глойомизол и нео-пецифический иммуноглобулин.

Таким образом, аллогенный иммуноглобулин-С обладает профилактическим и лечебным свойствами при желудочно-кишечных заболеваниях поросят, вызываемых ассоциацией микроорганизмов. Применение новорожденным поросятам аллогенного иммуноглобулина- С о антибиотиками и левамизолом одновременно парентеральным и пероралышм методами повышают эффективность аллогенного иммуноглобулина-С при лечении и профилактике желудочно-кишечных болезней.

Препараты обладает способностью повышать неопецифичес-кух> резистентность у поросят-сосунов и отъемышей.

ВЫВОДЫ

1. Определены оптимальные условия фракционирования им-муноактивных белков (бета- и гамма-глобулинов) сыворотки крови свиней полиэтилекгликолем марки ПЭГ-116 с М.М. 6000 + 1000 Д. На этой основе разработана технология изготовления препарата аллогенный иммуноглобулин овиней (АКТ-(С)). Исходным сырьем для этого служит аллогенная иммунная сыворотка этого вида животных.

2. Насыщение сыворотки крови овиней ПЭГ-116 до 8-ОХ обеспечивает осаждение не менее 052 бета- и гамма- фракций глобулинов, включающих в овей состав основную массу В и М классов иммуноглобулинов, причем класс М связан о бета-, а 8 -гамма-фракциями.

3. Парентеральное или пероральное применение АИГ-(С) новорожденным поросятам, в дозе 0,6-1,0 мл на 1 кг массы те. ла животного в 062 случаев предохраняет их от гибели и в 932

- от заболевания гастроэнтеритами вярусно-бактериальной этиологии.

4. Применено АИГ-(С) порооятам1-6 дневного возраста 3-4 кратко в течение 7 дней обеспечивает повышение неспецифической резистентности и иммунореактивности организма, выражаю-шкейся в повышении содержания общего белка, глобулинов усиление бактерицидной, лизоцимной активности, сдвига лейкоцитарной формулы вправо, увеличение числа Т- и Е- лейкоцитов, фагоцитарного числа и его индекса. Эти явления свэдетельст-

вуют о том, что при иммунодефицитном ооотоянии порооят раннего воэраота ЛИГ-(С) может служить средством• компенсации иммунодефицита.

6. Смешанное применение ЛИГ-(С) о девамиэодом и антибиотиками в течение 3-4 дней подряд в доэе 0,6-1,0 ил/кг в 7,6 мг/кг левомизола или 100 мг/кг тетрахлорида обеспечивает выздоравление больных гастроэнтеритами порооят в 96-96Х олу-чаев.

6. В результате исследований определен опектр показателей и их величин, характеризующих качеотво препарата ЛИГ-(С), которые легли в основу при разработке нормативно-технической документации на этот препарат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДКНЕНХЯ

В резу."ътате проведенных иооледоваяий для внедрения в производство рекомендуется Нормативно- техническая документация по изготовлению, контролю и применению аллогенного иммуноглобулина- С (АИГ-(С)), утвержденная Депортаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации (1993).

СПИСОК НАУЧШХ РАВ0ГГ, ОПУБЛИКОВАННЫХ DO ТВЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лесных В.И., Чайка С.И., Шаедковская Е.В., Положенно Э.Г, Зуев Н.П., Сидоренко C.B. Лечебная и профилактическая эффективность иммуноглобулина-с при желудочно-кишечных бо-

лезнях поросят// СО.науч.трудов "Актуальные проблемы ветеринарии в борьбе о незаразными болезнями животных", Воронеж,

1000.-С.В8-71.

2. Лесных В.И., Першина С.И., Положенно Э.Г., Зуев Н.П. Сидоренко C.B. Профилактика и терапия желудочно-кишечных болезней поросят о применением аллогенного иммуноглобулина-С (АИГ-С)// Тез.докл.науч.-техн.конф. "Профилактика и лечение болезней молодняка сельскохозяйственных животных"/ Воронеж,

1001, С.45.

3. Шахов А.Г., Сидоренко C.B. и др. Терапия и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней поросят о применением аллогенного иммуноглобулина-С// Приотендовый материал, Воронеж, 1001, 13 о.

4. Лесных В.И., Полженко Э.Г., Сергеев Г.И., Сидоренко C.B. Опыт применения аллогенного иммуноглоубилан -С для профилактики и дгчения желудочно-кишечных болезней новорожденных поросят// Тех.докл.науч.произ.конф..ВНИВИПФиТ, 1001.

Б. Сидоренко C.B. Сварнительная характеристика иммуноглобулинов сывороток овиней, полученных разными методами// Сб.науч.трудов "Важнейшие итоги по изучении заболеваний оелькохоэяйотвенных животных незаразной этиологии, их профилактики и лечение", Воронеж, 1002.-С.105-108.

в. Лесных В.И., Положение Э.Г., Першина С.И. Сидоренко C.B. Гаотроэнтероколиты свиней, классификация и диагностика// Об.научи.трудов "Важнейшие итоги по изучении заболеваний сельскохозяйственных животных незаразной этиологии, их профилактика и лечение", Воронеж, 1002.-С.10-14.