Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктурное и морфометрическое исследование печени крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии циклофосфана

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктурное и морфометрическое исследование печени крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии циклофосфана"

На правах рукописи

Кунц Татьяна Анатольевна

УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ И МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕЧЕНИ КРЫС С КАРЦИНОСАРКОМОЙ WALKER 256 ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЦИКЛОФОСФАНА

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00506048»

Новосибирск - 2013

005060489

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Минздрава России.

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ефремов Анатолий Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук,

Бгатова Наталья Петровна

заведующая лабораторией ультраструктурных исследований ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН

Колдышева Елена Владимировна

ведущий научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии ФГБУ «НИИ региональной патологии и патомор-фологии» СО РАМН

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН (Новосибирск)

2013 г. в час.

Защита диссертации состоится на заседании Совета по защите докторских ^кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «» /¿¿¿¿^^^ 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций * Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 ЛГ доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема опухолевого роста является предметом исследования специалистов многих отраслей науки, в том числе гистологии, молекулярной биологии, онкологии. Во всем мире регистрируется неуклонный рост заболеваемости - даже в экономически развитых странах злокачественные опухоли занимают третье место в общей структуре смертности (Чиссов В.И. идр., 2011; JemalA.etal., 2010). Среди ведущих методов лечения, наряду с хирургическим и лучевым, в клинической онкологии широко применяют цитотоксическую химиотерапию (Shewach D.S. et al., 2009; Nussbaumer S. et al., 2011). Лечебный эффект цитостатиков основан на их способности подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (Kaufmann S.H. et al., 2000; Beauparlant P. et al., 2003; Lövborg H. et al., 2004; Meng X.W. et al., 2005; Nelius T. et al., 2011).

Разработаны препараты, характеризующиеся высокой противоопухолевой эффективностью в эксперименте, но не всегда обеспечивающие успешное лечение (Davidson А. et al., 1997; Yamauchi К. et al., 2008). Это связано с резистентностью опухолей к химиотерапевтическим агентам, низкой селективностью действия препаратов, а также побочными эффектами химиотерапии, наиболее выраженными при применении высоких доз цитостатиков (Thurston D.E. et al., 2007; Nelius Т. et al., 2011).

При проведении химиотерапии организм испытывает воздействие факторов паранеопластической интоксикации и лекарственных препаратов. Печень как главный орган детоксикации осуществляет биотрансформацию и обезвреживание ксенобиотиков (Parkinson А. et al., 1996; Desmeules J. et al., 1999; Plaa G.L. et al., 2001), однако некоторые их метаболиты характеризуются еще большей токсичностью и наряду с антиопухолевым оказывают выраженный системный эффект (Thurston D.E. et al., 2007). Это требует продолжительных промежутков между курсами для восстановления быстрообновляющихся и других клеточных популяций организма (Kerbel R.S. et al., 2004).

Повреждение сосудов опухоли при введении цитотоксических препаратов происходит посредством различных механизмов (Hansen S.W. et al., 1990; Doll D.C. et al., 1992; Soultati A. et al., 2012). Данный подход базируется на следующих положениях: во-первых, дозы, необходимые для дезорганизации клеток эндотелия сосудов опухоли, гораздо ниже тех, которые необходимы для деградации трансформированных клеток (Belotti D. et al., 1996; Vacca A. et al., 1999). Во-вторых, химиотерапев-тический препарат модифицирует функции эндотелиальных клеток, не вызывая их деструкции (Clements M.K. et al., 1999). Кроме того, в отличие от опухолевых клеток, эндотелиоциты не приобретают устойчивости к цитотоксическим агентам (Boehxn Т. et. al., 1997; Kerbel R.S. et al., 2004).

Интенсивный поиск путей преодоления негативного побочного действия цитостатиков привел к разработке новой стратегии терапии, осно-

ванной на их антиангиогенном действии при использовании в малых дозах (Miller K.D. et al., 2001). Одновременно с развитием целенаправленной терапии на опухолевый ангиогенез происходил поиск новых способов применения цитостатиков с целью снижения их токсичности и повышения эффективности. Одним из них стал метрономный режим химиотерапии, который позволяет контролировать развитие опухоли на продвинутых стадиях (Kerbel R.S. et al., 2004; Shiraga E. et al., 2008). Этот подход подразумевает предпочтительное ингибирование активности эндотелиальных клеток в растущем сосудистом русле опухоли. Таким образом, на применение цитостатиков в режиме метрономной терапии возлагают большие надежды и включают в схемы лечения ряда онкологических заболеваний в комбинации с другими методами противоопухолевой терапии (Nelius Т. et al., 2011).

Для исследования механизмов опухолевого роста и разработки противоопухолевой терапии широко используют экспериментальные модели, например, карциносаркому Walker 256 (W256) (Rettori О. et al., 1995; Buffon A. et al., 2006; Perroud A.P.A.S., et al., 2006; Guimaraes F. et al., 2010). При этом недостаточно исследованы паренхиматозно-стро-мальные взаимоотношения в печени при карциносаркоме, в частности, эндотелиально-паренхиматозные, определяющие гематотканевый обмен в динамике спонтанного развития опухоли, а также при однократном корригирующем воздействии низкой дозы широко применяемого в клинике цитостатического препарата циклофосфана. Кроме того, не изучены стереотипные и специфические структурные реакции клеточных популяций печени в динамике альтерации и особенно регенерации в условиях системного опухолевого и низкодозового однократного цитостатического воздействия.

Цель исследования - изучить морфофункциональные изменения печени крыс Wistar при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и однократном воздействии низкой дозы циклофосфана.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное ультраструктурное исследование клеточных популяций печени крыс Wistar в динамике спонтанного развитая карциносаркомы Walker 256 и в условиях однократного введения низкой дозы циклофосфана.

2. Изучить структурную плотность паренхиматозного и стромального компаргментов печени экспериментальных животных в динамике спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и в условиях однократного введения низкой дозы циклофосфана.

3. Изучить паренхиматозно-васкулярные взаимоотношения в печени и особенности ремоделирования кровеносного и лимфатического отделов микроциркуляции.

4. Оценить эффект однократной низкой дозы (25 мг/кг) циклофосфана на процессы метастазирования карциносаркомы Walker 256 в печени.

Научная новизна. Впервые с помощью электронно-микроскопического и морфометрического анализа исследованы структурные изменения паренхимы и стромы печени крыс-самцов Wistar при инокуляции карциносаркомы Walker 256 и однократном воздействии низкой дозы циклофосфана (25 мг/кг), что позволило выявить спектр стереотипных и специфических тканевых, клеточных и внутриклеточных изменений.

Впервые показано, что спонтанный рост опухоли Walker 256 у экспериментальных животных характеризуется резким увеличением ядерно-цитоплазматическош соотношения гепатоцитов на 5-е сут с последующим снижением, достоверно превышая показатель контрольной группы. После введения циклофосфана максимальное уменьшение ядерно-цитоплазма-тического отношения гепатоцитов отмечено на 7-е сут, что обусловлено митотическим делением двуядерных гепатоцитов.

Впервые описаны ультраструктурные эквиваленты паранеопластиче-ского поражения печени в динамике спонтанного роста карциносаркомы Walker 256: нарушения биосинтетической, метаболической и желчевыво-дящей функции гепатоцитов, сопровождающиеся парциальной и тотальной цитодеструкцией; при этом показатели холестаза прямо коррелировали с опухолевой инфильтрацией печени и структурной плотностью метастазов.

Впервые получены динамические морфометрические показатели сосудистой системы печеночной дольки при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256: достоверное увеличение структурной плотности синусоидов на 65,23%, 72,31% и 51,69% на 5-е, 7-е и 14-е сут соответственно (р<0,05), обусловленное нарастающими обтурационными и тромботическими поражениями микрососудов с развитием геморрагии на 14-е сут эксперимента. Введение циклофосфана на 5-е сут в дозе 25 мг/ кг тормозило опухолевую инвазию, уменьшало выраженность застойных явлений микроциркуляции с достоверным снижением объемной плотности синусоидов на 30% на 3-й (р<0,05) и на 27% на 7-е (р<0,05) сут после воздействия препарата с увеличением биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов на 3-й сут. К 14-м сут эффекты циклофосфана нивелировались.

Впервые сделан акцент на морфометрических показателях лимфатического компартмента печеночной долыш: установлено возрастание структурной плотности лимфатических пространств Малла, в наибольшей степени выраженное на 5-е сут (в 2 раза, р<0,05) роста карциносаркомы Walker 256, прямо коррелирующее с обтурационными изменениями сосудов портальных трактов и синусоидов. Временный корригирующий эффект циклофосфана зарегистрирован через 3-е сут: значимое уменьшение площади пространств Малла (на 49%, р<0,05).

Впервые представлены ультраструктурные маркеры компенсаторных и регенераторных реакций паренхимы на 3-й и 7-е сут после введения циклофосфана: комплексы внутриклеточной регенерации, индукция липолиза, гиперплазия элементов гладкой цитоплазматической сети, свидетельству-

ющие об активации биосинтетической и дезинтоксикационной функциях гепатоцитов. Выявлены адаптивные перестройки цитолемм гепатоцитов в условиях токсического поражения печени: увеличение числа микроворсинок на синусоидальном и желчевыводящем полюсах гепатоцитов и формирование замыкательных пластинок на латеральных плазмалеммах.

В целом, на модели однократного введения низкой дозы цитостатика при развитии опухоли продемонстрирована ведущая роль внутриклеточной регенерации эндотелиальных клеток синусоидов для регенерации печени: индукция биосинтетической и пиноцитозной активности эндоте-лиоцитов опережала восстановление ультраструктуры гепатоцитов, что подчеркивает значимость васкулярно-паренхиматозных взаимодействий.

Теоретическая и практическая значимость. Проведено комплексное изучение структурных эквивалентов противоопухолевой активности низкой дозы циклофосфана в условиях системного опухолевого процесса с поражением печени с позиций клеточной биологии. Полученные данные продемонстрировали клеточные и ультраструктурные механизмы сочетан-ного опухолевого и низкодозового цитостатического воздействия на печень экспериментальных животных. Цитотоксический эффект опухолевого воздействия карциносаркомы Walker 256 модулируется цитостатическим эффектом циклофосфана, и в условиях торможения метастатической активности развивается транзиторная регенераторная реакция паренхимы -увеличение количества полиплоидных и двуядерных гепатоцитов. Кроме того, временный противоопухолевый эффект низкой дозы циклофосфана обладает цитопротекторным потенциалом и индуцирует метаболические и регенераторные процессы в клеточных популяциях паренхимы и стромы печени животных-опухоленосителей, что может иметь важное значение для дальнейших исследований с целью разработки схем противоопухолевой терапии.

Внедрение. Результаты исследования стромального и паренхиматозного компартмента печени при прогрессии опухоли и воздействия циклофосфана внедрены в курс лекций и практических занятий по общей патологической анатомии в разделах «Гепатиты», «Медикаментозные поражения печени», «Компенсаторно-приспособительные реакции». Результаты исследования динамики структурных преобразований в печени на фоне спонтанного развития опухолевого процесса внедрены на кафедре онкологии в курс лекций в разделе «Опухоли. Паранеопластический синдром» в ГБОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Министерства здравоохранения РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При инокуляции карциносаркомы Walker 256 крысам-самцам Wistar с помощью электронно-микроскопического и морфометрического анализа паренхимы и стромы печени продемонстрировано прогрессирующее нарушение биосинтетической, метаболической и желчевыводящей функции гепатоцитов с транзиторным увеличением ядерно-цитоплазматического

соотношения. Структурная плотность междольковых желчных протоков может рассматриваться как маркер выраженности опухолевой инфильтрации печени.

2. Однократное воздействие низкой дозы циклофосфана (25 мг/кг) на 5-е сут спонтанного развития опухоли временно (в период 3 - 7-е сут после введения препарата) индуцировало биосинтетическую и пиноци-тозную активность эндотелиоцитов, которая опережала внутриклеточную регенерацию гепатоцитов.

3. Однократное введение низкой дозы цитостатика при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 приводило к транзиторному ремо-делированию кровеносной и лимфатической системы печеночной дольки; корригирующий эффект связан с дренажной функцией лимфатических пространств Малла.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на выездной научной сессии, посвященной 80-летию С. У. Джумабаева (Узбекистан,

2008); 7-й научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск,

2009); на Евразийском симпозиуме «Проблемы саногенного и патогенного эффектов эндо- и экзоэкологическош воздействия на внутреннюю среду организма» (Бишкек, 2009); на VII международной конференции «Гемо-реология и микроциркуляция» (Ярославль, 2009); на 15-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2010); конференции врачей Татарстана (Казань, 2010); на V симпозиуме с международным участием «Проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям Севера» (Сыктывкар, 2010); на IX российско-германском научно-практическом форуме им. Р.Коха и И.И.Мечникова (Новосибирск, 2010); на X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новогород, 2011); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2011,2012); на П Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2011); на международной научно-практической конференции «Научные исследования и их практическое применение. Современное состояние и пути развития '2011» (Одесса, 2011); Joint Meeting of the European Society for Microcirculation and the German Society of Microcirculation and Vascular Biology (Munich, 2011); на Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств» (Харьков, 2012); на 86-й Всероссийской студенческой научной конференции памяти академика АН РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 2012); на 18-й Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 2012), совместном заседании сотрудников кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии, кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии и центральной научно-исследовательской ла-

боратории ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 24 работы, из них 6 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертаций, 1 статья в коллективной монографии и 17 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 162 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 70 рисунками (диаграммы, микрофото- и электронограммы). Список цитированной литературы включает 388 источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная модель. В работе использовали 49 половозрелых крыс-самцов Wistar массой тела 180 - 200 г. Животных содержали на стандартном световом режиме и рационе со свободным доступом к пище и воде. Для моделирования злокачественного роста использовали культуру перевиваемой карциносаркомы Walker 256, предоставленную лабораторией физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Суспензию клеток опухоли вводили крысам в мышцу задней части бедра в дозе 1 х 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl (Хегай И.И. и др., 2008).

На 5-е сут с момента перевивки, когда объем солидного опухолевого узла достигал 2,51±0,42 см3, животных разделяли на группы, после чего вводили циклофосфан («Биохимик», г. Саранск, Россия) внутрибрю-шинно однократно из расчета 25 мг/кг в 0,1 мл изотонического раствора NaCl. Животных выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом, иссекали и взвешивали печень. Материал для исследования забирали в различные временные точки: у животных-опухоленосителей (п=21) — на 5-е, 7-е и 14-е сут после трансплантации опухолевых клеток; у опухоленосителей после введения цитостатика (п=21) - на 3-й, 7-е и 14-е сут после воздействия. Группу контроля составили интакгные животные (п=7), которым одновременно с опытными внутрибрюшинно однократно вводили физиологический раствор.

Методы светооптичсского исследования. Образцы печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина при комнатной температуре, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в смесь воска и парафина. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином (Саркисов Д.С., Перов Д.С., 1996). Светооптическое исследование и морфометрический анализ проводили в микроскопах Micros MS300A (Austria) и Micromed (Россия). Микрофотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Baumer

optronic CX13c, измерения объектов проводили с помощью программ ВидеоТест-Морфология (Россия) и Image J 1.42q (NIH, USA).

Стереологический анализ клеточных элементов и мнкроцирку-ляторного русла печеночной дольки. Морфометрический анализ осуществляли с использованием окулярной сетки из 25 и 100 точек (Автан-дилов Г.Г. и др., 1990) при увеличении в 1000 раз. На тестовой площади (6,4х 104 мкм2) подсчитывали объемную плотность (Vv) цитоплазмы и ядер гепатоцитов, синусоидных капилляров и суммарно клеток синусоидов, объемную плотность (Vv) гепатоцитов с дистрофическими и некротическими изменениями; оценивали численную плотность (Nai) гепатоцитов, диплокариоцитов и клеток синусоидов.

На основании первичных стереологических параметров вычисляли ядерно-цитоплазматическое соотношение, индекс васкуляризации, представляющий собой отношение объемной плотности синусоидов к объемной плотности паренхимы Vvican/Vvnap, отношение суммарного количества двуядерных гепатоцитов к общему числу гепатоцитов Nai дк/Nai гц и суммарного количества синусоидных клеток к общему числу гепатоцитов Naj CK/Nai гц.

Морфометрический анализ артернально-венозной системы, пространств Малла и холангиол. На единицу площади (1,16x10s мкм2) подсчитывали объемную плотность (Vv) и численную плотность (N^) сосудов печени, с помощью окуляр-микрометра измеряли диаметр поддольковых и центральных вен, междольковых артерий и вен, желчных протоков портальных трактов; вычисляли площадь лимфатических пространств Малла. Подсчеты проводили при увеличении в 400 раз.

Оценку интенсивности метастазирования ткани печени проводили по нескольким параметрам: число метастатических поражений в тестовой площади (1,16х105мкм2), площадь метастазов (SMer), частота метастазирования (4M), % - отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе и индекс ингибирования метастазирования (%): (АКВК-АВ)/АКВК *100%, где Ак - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, Вк - среднее число метастазов у животных контрольной группы, В - среднее число метастазов у животных опытной группы (Архипов С. А. и др., 1984).

Электронно-микроскопическое исследование. Образцы печени размером 1 мм3 фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 М фосфатном буфере Миллонига (pH 7,4) при комнатной температуре в течение 2 ч, промывали 15 мин в охлажденном буфере Миллонига, затем дополнительно фиксировали на льду в 1 % растворе четырехокиси осмия на том же буфере в течение 1 ч. После дегидратации в серии спиртов возрастающей концентрации образцы заключали в эпон-812. Наультратоме LKB-8800 получали полутонкие (1 мкм) и ультратонкие (35-45 нм) срезы. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата при 40°С в течение 40

мин и цитратом свинца при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 20 мин. Контрастированные срезы напыляли слоем углерода в вакууме и исследовали в электронном микроскопе JEM-1 OOS при ускоряющем напряжении 80 кВт.

Статистическую обработку результатов проводили с вычислением средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (т). Значимость различий средних арифметических величин определяли с помощью t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уит-ни. Различия между значениями сравниваемых параметров расценивали как статистически значимые при достижении уровня статистической значимости, равного 0,05 (р<0,05). Для оценки степени связи между изучаемыми количественными показателями определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г), при этом достоверность всех указанных корреляционных связей оценивали при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические изменения печени крыс Wistar в условиях спонтанного развития карциносаркомы Walker 256. На 5-е сут после трансплантации опухолевых клеток в печеночной дольке на первый план выступали нарушения кровообращения с неравномерным расширением просветов синусоидов, с их обструкцией сладжированными эритроцитами, а также дилатацией междольковых и, реже, центральных вен. В паренхиме печени формировались очаги липидно-белковой дистрофии и некробиоза гепатоцитов, в наибольшей степени выраженные в перицентральной зоне долек.

В портальных трактах локализовались одиночные опухолевые клетки, которые мигрировали по синусоидам в паренхиму, формируя в половине случаев одиночные перипортальные скопления. Клеточная инфильтрация портальных трактов, преимущественно лимфоцитарная, в виде цепочек распространявшаяся через пограничную пластинку в паренхиму, была приурочена преимущественно к опухолевым клеткам. В перипорпгальных трактах иногда были видны скопления тучных клеток. Обращало на себя внимание значительное расширение лимфатических пространств Малла.

Через 7 сут развития W256 нарастала опухолевая инфильтрация печени с формированием внутридольковых метастазов, что сопровождалось усилением дистрофических и некробиотических изменений паренхиматозных клеток печени; ядра гепатоцитов имели признаки пикноза, кариолизиса и кариорексиса. Поражение гепатоцитов распространялось на всю печеночную дольку, сопровождаясь появлением фокальных некрозов.

Нарушения микроциркуляции нарастали: проявления сладж-синдрома и застоя крови в междольковых артериях и центральных венах, дила-тация центральных и поддольковых вен и расширение лимфатических коллекторов. Перицентрально и отчасти центролобулярно выявлялась

агрегация эритроцитов, тромбоцитов и гранулоцитов, способствовавшая обструкции синусоидов. По расширенным межклеточным пространствам и лимфатическим сосудам происходила интенсивная миграция лимфоид-ных элементов в другие компартменты печеночных долек. Как и в группе на 5-е сут развития W256, через 7 сут наблюдения в зонах сосудов портальных трактов отмечались скопления клеток лимфоидного ряда, часто с образованием лимфоидных агрегатов.

На 14-е сут после трансплантации клеток W256 в паренхиме долек нарастала площадь опухолевой инфильтрации, усугублялись нарушения крово- и лимфообращения в печеночной дольке, сопровождающиеся плазморрагиями и иногда геморрагиями. Отмечалась очаговая деструкция стенок междольковых вен в области триад, что объединяло их с лимфатическими пространствами Малла. Расширение пространств Малла сочеталось с инфильтрацией клетками лимфоидного ряда. Изменение архитектоники долек было обусловлено увеличением зон некроза и дистрофии гепатоцитов, расположенных перицентрально и отчасти центро-лобулярно, наблюдалось разрушение пограничной пластинки. Клетки, в основном лимфоциты, в меньшей степени - макрофаги и фибробласты, инфильтрировали строму портальных трактов и перипортальные зоны, но не имели тенденции к распространению вглубь паренхимы долек.

Морфологические изменения печени крыс с карциносаркомой Walker256 после однократного воздействия низкой дозы циклофосфа-на. Через 3 сут после введения циклофосфана при сохранении общей структуры долек печень крыс-опухоленосителей характеризовалась умеренной неравномерной дилатацией синусоидов с обнаружением в них скоплений эритроцитов и мононуклеаров. Отмечалось уменьшение выраженности эритроцитарной агрегации по сравнению с группой животных, не получавших щшюфосфан. Наблюдалось расширение центральных, поддоль-ковых и портальных вен. Небольшая часть гепатоцитов перипортальных и центролобулярных зон печеночных долек подвергалась дистрофии и некрозу, однако в остальных гепатоцитах отмечалось нарастание базофи-лии цитоплазмы. Уменьшался отек лимфатических пространств Малла, сопровождающийся снижением лимфоидной инфильтрации портальных трактов. Заметно редуцировалась опухолевая инфильтрация долек.

Через 7 сут после введения циклофосфана сохранялись гемодина-мические нарушения с преобладанием баллонообразного расширения синусоидов во всех печеночных дольках, дилатацией и полнокровием центральных и поддольковых вен, спазмированием междольковых вен и артерий, пролиферацией дуктальных эпителиоцитов. В части портальных трактов уменьшалась выраженность интерстициального отека, в другой части - на фоне расширения лимфатических коллекторов возобновлялась клеточная инфильтрация. В перипортальных зонах печеночных долек обнаруживались лимфоидные агрегаты с присутствием эозинофилов и тучных клеток. В синусоидах встречались одиночные клетки карциносаркомы.

Дистрофические и некробиотические изменения клеток паренхимы локализовались как в перипортальных, так и в перицентральных зонах долек.

Через 14 сут после воздействия циклофосфаном в печени усугублялись признаки микроциркуляторных нарушений: неравномерное расширение синусоидов с формированием эритроцитарных агрегатов, повреждение эндотелиальной выстилки и появление свежих диффузных геморрагий. Зоны дистрофии и некроза гепатоцитов располагались в перипортальных и перицентральных областях долек. В области триад наблюдалась выраженная инфильтрация лимфоидными клетками и клетками карциносаркомы W256, которые формировали единичные конгломераты с привлечением лимфоцитов. В целом, отмечалось нарастание воспалительно-клеточной инфильтрации, в значительной мере определяющей активность патологического процесса. Часто клетки инфильтрата имели отчетливую тенденцию проникать в паренхиму, что могло быть причиной повреждения перипортальных гепатоцитов по типу ступенчатых некрозов.

Динамика морфометрических показателей в печени крыс Wistar в условиях спонтанного развития карциносаркомы Walker 256. У животных на 5-е, 7-е и 14-е сут спонтанного роста карциносаркомы W256 достоверно увеличивалось ядерно-цитоплазматическое соотношение гепатоцитов (на 60, 50 и 29% соответственно), что обусловлено возрастанием объемной плотности ядер и уменьшением объемной плотности цитоплазмы (табл. 1) и могло отражать процессы полиплоидии и/или существенное увеличение количества двуядерных клеток, максимально на 7-е сут (в 1,6 раза).

Среднее значение объемной плотности дистрофически измененных гепатоцитов достоверно возрастало по мере прогрессирования карциносаркомы W256 (на 15, 25 и 35%, р<0,05) через 5,7 и 14 сут роста опухоли соответственно. Аналогичная динамика наблюдалась для показателя объемной плотности некротически измененных гепатоцитов, который был выше контрольного значения на 9,12 и 23% (р<0,05).

Изменения микрососудистого русла печени на 5-е, 7-е и 14-е сут развития карциносаркомы W256 характеризовались увеличением диаметра поддольковых(на 8,9 и 14%, р<0,05) и центральных вен (на 12,12 и 17%, р<0,05). Достоверное увеличение площади лимфатических пространств Малла, максимальное на 5-е сут (в 2 раза), свидетельствовало об интер-стициальном отеке. Увеличение показателей поверхностной плотности холангиол (на 12, 15 и 28%, р<0,05), отражающее холестатическое поражение печени, прямо коррелировало (г = +0,2, +0,03 и +0,46 на 5-е, 7-е и 14-е сут соответственно) с вариациями параметров метастатической инвазии (рис. 1).

Динамика морфометрических показателей печени крыс с карци-посаркомой Walker 256 после однократного введения циклофосфана.

Воздействие циклофосфана привело к повышению объемной плотности цитоплазмы гепатоцитов (табл. 2) на 3-й, 7-е и 14-е сут после введения

Таблица 1. Морфометрический анализ печени крыс Wistar при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 (M±m)

Показатель Контроль Время после инокуляции карциносаркомы W256

5 сут 7 сут 14 сут

Объемная плотность (мм3/см3):

цитоплазмы ГепаТО- ЦИТОВ, Ууцит 0,67±0,01 0,54±0,01* 0,56±0,01* 0,59±0,01*л

ядер гепатоцитов, Уу ял 0,14±0,01 0,17±0,01* 0,17±0,01* 0Д6±0,0Г

паренхимы, Уу пар 0,80±0,01 0,71±0,01* 0,73±0,01* 0,75±0,0Г

дистрофически измененных гепатоцитов, Уудисто 0,01 ±0,01 0,15±0,0Г 0,24±0,01*А 0,35±0,0ГЛ

некротически измененных гепатоцитов, Уу некГ1 0,01 ±0,01 0,09±0,0Г 0,12±0,01*А 0,23±0,01*л

синусоидов,Уукш 0,13±0,01 0,21±0,01* 0,22±0,01* 0,20±0,01 *л

клеток синусоидов, У„ ск 0,07±0,01 0,08±0,01 0,05±0,01*л 0,05±0,01

Численная плотность:

гепатоцитов, Nai гц 21,64±0,28 23,54±0,35* 24,87±0,28*л 21,56±0,23л

диплокариоцитов, Nai дк 1,24±0,10 1,89±0,12* 2,01±0,11* 1,74±0,13*

клеток синусоидов, Nai ск 8,46±0,31 11,07±0,29* 9,40±0,24*л 9,77±0,26*

V /V v V ЯД ' v V цит 0,22±0,01 0,35±0,02* 0,33±0,02" 0,28±0,02*

N /N • 14 ai дк 1 ^ ш гц 0,06±0,01 0,08±0,01 0,08±0,0Г 0,08±0,01*

V /V ¥ V кап' v V пар 0,17±0,01 0,32±0,02* 0,33±0,02* 0,28±0,02*л

Nai ск/^ai гц 0,40±0,02 0,48±0,01* 0,38±0,0Г 0,46±0,01*л

Примечание. Уу - объемная плотность структур (% от объема цитоплазмы); N3, - численная плотность структур (число в тестовой площади); * - р<0,05 по сравнению с контролем,Л - р<0,05 по сравнению с предыдущим сроком.

Конт- : 5 сут 7 сут 14 cyr | 3 сут 7 сут 14 сут роль | Walker 256 i Walker 256 + циклофосфан

Рис. 1. Результаты исследования сосудов и холангиол печени (М±т). Примечание: D - диаметр; пдв - поддольковые вены, цв - центральные вены, мжп - меж-дольковые желчные протоки; Vv мет- объемная плотность метастазов.

Таблица 2. Морфометрический анализ печени крыс Wistar с карциносар-комой Walker 256 после воздействия циклофосфана (Mini)

Показатель Контроль Время после введения циклофосфана

3 сут 7 сут 14 сут

Объемная плотность (мм3/см3):

цитоплазмы ГеПаТО-ЦИТОВ,Ууцит 0,67±0,01 0,62±0,01* 0,70±0,01*л 0,64±0,01*л

ядер гепатоцитов, УУЯД 0,14±0,01 0,16±0,01* о,1з±о,ог 0,15±0,01л

паренхимы, V,, пар 0,80±0,01 0,78±0,0Г 0,82±0,01л 0,79±0,01л

дистрофически измененных гепатоцитов, 0,01±0,01 0,15±0,0Г 0,24±0,01*л 0,30±0,01*л

некротически измененных гепатоцитов, „еко 0,01±0,01 0,13±0,01* 0,16±0,01*л 0,20±0,01*л

синусоидов, Уугап 0,13±0,01 0,15±0,01* 0,14±0,01л 0,17±0,01*л

клеток синусоидов, Уу ск 0,07±0,01 0,07±0,01 0,04±0,00*л 0,04±0,01*

Численная плотность:

гепатоцитов, N3, г„ 21,64±0,28 22,63±0,24* 19,68±0,27*л 20,14±0,26*

диплокариоцитов, N^ лк 1,24±0,10 1,73±0,13* 1,29±0,13л 1,22±0,12

клеток синусоидов, Nai ск 8,46±0,31 9,33±0,25* 6,03±0,18*л 6,65±0,25*л

V /V * V ЯД ' * V цкт 0,22±0,01 0,28±0,02* 0,19±0,03л 0,24±0,01л

N ■ /N ■ дк гц 0,06±0,01 0,08±0,01* 0,06±0,01 0,06±0,01

Vv каг/Уу пар 0,17±0,01 0,20±0,02* 0,18±0,02 0,22±0,02*л

N„ ci/^ai гц 0,40±0,02 0,42±0,01 0,31±0,01*л 0,33±0,01*

Примечание. Уу - объемная плотность структур (% от объема цитоплазмы); - численная плотность структур (число в тестовой площади); * - р<0,05 по сравнению с контролем, л - р<0,05 по сравнению с предыдущим сроком.

(на 15,25 и 8%, р<0,05) и снижению объемной плотности ядер (на 6, 21 и 4% соответственно) по сравнению с соответствующими сроками спонтанного развития опухоли. Дцерно-цитоплазматическое соотношение гепатоцитов снижалось на 20,42 и 14%, (р<0,05) по сравнению с группами без воздействия; на 7-е сут величина показателя обусловлена делением двуядерных гепатоцитов.

Максимальное повышение численной плотности двуядерных гепатоцитов (на 40%, р<0,05), отражающее активность репаративных процессов в печени, имело место на 3-й сут после воздействия цитостатиком и снижалось на последующих сроках. Объемная плотность дистрофически измененных клеток уменьшалась на 14-е сут после воздействия (на 15%, р<0,05), объемная плотность клеток с признаками некроза возрастала на 3-й и 7-е сут после введения циклофосфана (на 45 и 35%) и снижалась к 14-м сут на 11% (р<0,05) по сравнению с соответствующими сроками

спонтанного роста карциносаркомы W256. Существенным было снижение объемной плотности клеток синусоидов на 3-й, 7-е и 14-е сут (на 10,13 и 27% соответственно, р<0,05), а также уменьшение их численной плотности (на 16,36 и 32%, р<0,05), что обусловлено процессами цитодеструкции.

Введение циклофосфана тормозило опухолевую инвазию, уменьшало выраженность застойных явлений микроциркуляции с достоверным снижением объемной плотности синусоидов на 30% на 3-й и на 37% на 7-е сут (р<0,05) после воздействия препарата. К 14-м сут эффекты циклофосфана нивелировались. Достоверное снижение коэффициента васкуляризации на 3-й, 7-е и 14-е сут (на 38, 43 и 20% соответственно, р<0,05), сопровождалось уменьшением площади пространств Малла на 49 и 23% (3-й и 7-е сут) по сравнению с аналогичным сроком спонтанного развития опухоли.

Морфометрические показатели сосудистого русла существенно не менялись после введения препарата, отмечалось лишь возрастание диаметра холангиол на 3-й и 7-е сут (на 11 и 15%, р<0,05) со снижением к 14-м сут (на 7%, р<0,05), обусловленным усилением холестаза.

Сравнительная оценка метастатического поражения печени крыс Wistar в условиях спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и после воздействия цитостатиком. В группах животных со спонтанным развитием карциносаркомы W256 наблюдали развитие метастатического процесса в динамике роста новообразования. Для всех экспериментальных групп данной серии было характерно распространение клеток карциносаркомы W256 в системе кровотока через приносящие сосуды печени и «выселение» из зоны триад в перипортальные области печеночных долек.

Опухолевые клетки обнаруживались в портальных трактах уже на 5-е сут после инокуляции перевивочного материала; при этом одиночные клетки инфильтрировали паренхиму долек. В динамике эксперимента клетки интенсивно делились с образованием конгломератов, что приводило к деформации архитектоники дольки. Внутридольковые метастазы, сопровождающиеся перифокальной дистрофией гепатоцитов и лимфоид-ной инфильтрацией, обнаруживались через 7 и 14 сут после перевивки опухоли наряду с увеличением частоты метастазирования (14,49%, 42,86% и 57,14% через 5, 7 и 14 сут эксперимента соответственно (табл. 3).

Спонтанный рост карциносаркомы W256 стимулировал в печени естественную цитотоксическую активность: на 7-е сут после трансплантации опухолевой культуры в печени наблюдалась воспалительная инфильтрация опухолевых очагов с некрозом опухоли и перифокальных гепатоцитов.

Введение циклофосфана оказывало выраженный тормозящий эффект на опухолевую инфильтрацию и формирование метастазов в печени: уменьшение частоты метастазирования на 67 и 25% на 7-е и 14-е сут после воздействия, индекс ингибирования метастазирования на 3-й сут после введения препарата составил 83%, на 7-е - 86% и 38% - на 14-е сут. Через 7 сут в синусоидах обнаруживались единичные опухолевые клетки, на 14-е сут выявлялись их конгломераты в области портальных трактов

Показатель Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 Карциносаркома Walker 256 + циклофосфан

5 сут 7 сут 14 сут 3 сут 7 сут 14 сут

Частота метастазиро-вания, % 14,29 42,86 57,14 14,29 14,29 42,86

Численная плотность метастазов 8 6 15 1 2 3

Объемная плотность метастазов, мм3/см3 155,08 ±4,45 150,65 ±5,70 155,21 ±5,09 134,75 ±5,15 136,74 ±12,18 136,93 ±9,18

Индекс ингибирования метастазированюг, % 0 -125,00 -650,00 83,33 86,01 38,00

и паренхиме долек. На 3-й сут уменьшалась площадь метастазов на 13% (р<0,05) по сравнению с группой без воздействия.

Ультраструктурная организация печени крыс при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256. Электронно-микроскопическое исследование печени на 5-е сут после трансплантации карциносаркомы W256 выявило участки сладжа эритроцитов в просветах синусоидов и адгезию тромбоцитов и гранулоцитов к эндотелию. В синусоидах обнаруживались опухолевые клетки с вытянутым ядром, увеличенным количеством лизосом и удлиненными выростами плазмалеммы, обладающие высокой пенетрационной способностью и перемещающиеся из синусоидов в пространство Диссе.

Паранеопластические факторы и взаимодействие клеток карциносаркомы W256 с гепатоцитами обусловливали нарушения ультраструктуры большинства паренхиматозных клеток: дегрануляция канальцев цитоплазматической сети, обеднение цитоплазмы гранулами гликогена, уменьшение крист митохондрий, формирование замыкаггельных пластинок латеральными цитолеммами. Часть популяции гепатоцитов обнаруживала признаки компенсаторно-восстановительных реакций: диплокариоциты с развитым белок-синтезирующим аппаратом в виде комплексов внутриклеточной регенерации - с удлиненными канальцами гранулярной цитоплазматической сети и близлежащими митохондриями.

На 7-е сут развития карциносаркомы W256 в гепатоцитах усиливались деструктивные изменения мембранных органелл с формированием миелиноподобных фигур, при этом возрастало количество пероксисом. Некоторые перипоргальные и центролобулярные гепатоциты подвергались апоптозной трансформации с маргинацией крупных глыбок гетерохрома-тина, агрегацией цитоплазматических органелл и осмиофилией клеточного матрикса. Компенсаторно-приспособительные реакции сохранившихся гепатоцитов проявлялись индукцией биосинтетической активности: инвагинации и расширение ядерной оболочки, наличие одного-двух ядрышек,

перинуклеарные и периферические комплексы внутриклеточной регенерации. Кроме того, в этой группе индуцировалась функция детоксикации пе-рицентральных и, меньше, центролобулярных гепатоцитов с увеличением числа везикул и канальцев гладкой цитоплазматической сети. Встречались эндотелиоциты и клетки Ито с признаками некробиоза и апоптоза.

На 14-е сут спонтанного роста опухоли факторы неспецифической эндогенной интоксикации приводили к дальнейшим деструктивным изменениям гепатоцитов, в том числе к дефектам специализированных полюсов плазмалемм и модификации межклеточных контактов. В цитоплазме появлялись миелиноподобные слоистые образования, скопления лизосом, наблюдалось очаговое или тотальное просветление матрикса митохондрий с лизисом органелл. В некоторых гепатоцитах имела место гиперплазия элементов гладкой цитоплазматической сети вследствие индукции цитохрома Р450 на фоне повышения паранеопластической нагрузки на орган, в таких клетках часто присутствовали многочисленные мелкие митохондрии. Эндотелиоциты синусоидов характеризовались вакуолизацией мембранных органелл, а также признаками фокального некроза.

Начиная с 5-х сут, выявлялись признаки инициации процессов фибро-зирования, которые усиливались в динамике роста опухоли: утилизация липидных капель в клетках Ито с последующей трансформацией этих клеток в миофибробласты с развитой белок-синтезирующей системой и прицеллюлярными скоплениями коллагеновых фибрилл. На фоне деструкции клеток паренхимы и стромы печени возрастало число гипертрофированных клеток Купфера, для которых были характерны наличие в цитоплазме крупных скоплений первичных лизосом, гетерофагосом, большое число митохондрий и некоторое количество компонентов белок-синтезирующей системы, гиперплазия компонентов комплекса Гольджи.

Ультраструктурная организация печени крыс с карциносар-комой Walker 256 после однократного воздействия циклофосфана. Ультраструктурный анализ микрососудистого русла долек печени крыс-опухоленосителей через 3 сут после воздействия циклофосфана выявил ультраструктурные маркеры внутриклеточной регенерации и компенсаторно-приспособительных реакций. Наибольшие изменения выявлены в большинстве эндотелиальных клеток синусоидов - перинуклеарные канальцы гранулярной цитоплазматической сети, мелкие митохондрии; вблизи люминальной и базальной цитолемм возрастало количество пиноцитозных везикул. При этом к 7-м сут после введения препарата внутриклеточные эквиваленты усиленной функциональной активности эндотелиоцитов редуцировались, вновь сменяясь преобладанием аль-теративных изменений. В гепатоцитах через 3 сут после воздействия циклофосфана отмечены признаки липолиза и длинные микроворсинки на синусоидальных и желчевыводящих полюсах; в диплокариоцитах -небольшие фокусы внутриклеточной регенерации.

На 7-е сут часть клеток эндотелиальной выстилки синусоидов по-прежнему характеризовалась гипертрофией ультраструкгур белок-син-тезиругощего аппарата - комплексами коротких параллельных цистерн гранулярной цитоплазматической сети и мелких митохондрий с плотным матриксом, а также усиленным трансэндотелиальным обменом. Тем не менее, нарастали деструктивные изменения цитоплазматических орга-нелл со снижением числа пиноцитозных везикул, отмечены зоны отека и лизиса цитоплазмы и нарушения целостности плазмалемм. Другая часть дегенерирующих эндотелиоцитов имела признаки апоптоза.

Восстановительные реакции гепатоцитов бьши связаны с адаптивными преобразованиями цитолеммы - возрастанием числа микроворсинок на синусоидальных и билиарных полюсах, что способствовало внутриклеточной регенерации, в том числе, формированию розеток гликогена. Однако на фоне цитотоксического действия опухоли и циклофосфана часть гепатоцитов претерпевала апоптотические и некробиотические изменения, имели место литические дефекты плазмалемм. В синусоидах и в пространствах Диссе локализовались плазматические клетки с гиперплазией резко расширенных цистерн гранулярной цитоплазматической сети с хлопьевидным содержимым.

Через 14 сут после воздействия циклофосфана в печени крыс-опухоленосителей нарастала выраженность дистрофии и цитодеструкции паренхиматозных клеток и эндотелиоцитов с нивелированием временного противоопухолевого эффекта низкой дозы цитостатика. Эндотелиоци-ты с признаками апоптоза обнаруживались не только изолированно, но и цепочками в 3-4 клетки. В пространствах Диссе нарастало количество коллагеновых фибрилл вблизи фиброгенно трансформированных клеток Ито.

Таким образом, развитие карциносаркомы Walker 256, характеризующейся высоким метастатическим потенциалом, обусловливало значительные структурно-функциональные изменения печеночной дольки с альтерацией паренхиматозного и стромального компартментов. Влияние паранеопластических факторов усиливалось в динамике роста опухоли, приводя к поражению печени токсического и обструктивного генеза. Воздействие циклофосфана в дозе 25 мг/кг оказывало временный ремодули-рующий эффект на опухолевый процесс в печени, снижая интенсивность метастатической инвазии с уменьшением выраженности застойных явлений микроциркуляции, с транзиторным увеличением биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов. На 7-е сут после введения препарата отмечен пик адаптивных метаболических перестроек гепатоцитов, которые в значительной степени реализовались за счет гликолиза и липолиза, с компенсаторной активацией белок-синтетических процессов. В этих условиях паренхиматозный компартмент реализовал свой регенераторный потенциал полиплоидией гепатоцитов, увеличением числа двуядерных клеток с их последующей пролиферацией.

Показано, что определяющее значение в регенерации печени в условиях опухолевого процесса и цитостатической терапии имеет внутриклеточная регенерации эндотелиальных клеток синусоидов, в которых выявлена индукция биосинтетической и пиноцитозной активности, которая происходила в более ранние сроки, чем запуск восстановительных перестроек в паренхиматозных клетках, что свидетельствует о большом значении кооперативных взаимодействий между клетками паренхимы и стромы печени. По-видимому, противоопухолевое действие низкой дозы циклофосфана с 3-х по 7-е сут после введения препарата создавало краткосрочные условия для репарации гепатоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Инокуляция карциносаркомы Walker 256 крысам Wistar приводила к опухолевому поражению печени токсического и обструкгивного генеза: в паренхиме органа - нарастающие дистрофия и некробиоз преимущественно перицентральных гепатоцитов, сопровождающиеся реактивными изменениями стромы—преимущественно лимфоцитарной инфильтрацией с формированием агрегатов, стойкой дилатацией центральных и под-дольковых вен, обструкцией синусоидов и индукцией фиброза органа. Однократное введение циклофосфана в дозе 25 мг/кг на 5-е сут развития карциносаркомы оказывало временный ремоделирующий эффект на опухолевый процесс в печени.

2. По данным морфометрического исследования, на 5-е, 7-е и 14-е сут спонтанного роста опухоли увеличивалось ядерно-цитоплазматическое соотношение гепатоцитов на 60, 50 и 29% соответственно (р<0,05), что обусловлено парциальной цитоаутофагией (по результатам электронной микроскопии) и возрастанием числа двуядерных клеток (на 62, 52 и 40% соответственно (р<0,05). После введения циклофосфана ядерно-цито-плазматическое отношение гепатоцитов достоверно (р<0,05) снижалось (максимально на 7-е сут - на 33% по сравнению с предыдущим сроком эксперимента, что связано с делением двуядерных гепатоцитов).

3. Среди ультраструктурных эквивалентов паренхиматозной цито-деструкции при спонтанном росте карциносаркомы Walker 256 доминировали гликогенолиз и секвестрация гликогена, липидная инфильтрация цитоплазмы, нарушение эвакуации желчи с формированием аутофагосом, сопровождающиеся редукцией и вакуолизацией мембранных цитоплазма-тических органелл - канальцев гранулярной цитоплазматической сети и митохондрий. Увеличение показателей поверхностной плотности холанги-ол, отражающее холестатическое поражение печени, прямо коррелировало (г=+0,2, +0,03 и +0,46 на 5-е, 7-е и 14-е сут соответственно) с вариациями параметров метастатической инвазии.

4. Однократное введение циклофосфана в дозе 25 мг/кг на 5-е сут развития карциносаркомы Walker 256 оказывало выраженный тормозящий

эффект на опухолевую инфильтрацию и формирование метастазов в печени: индекс ингибирования метастазирования на 3-й сут после введения препарата составил 83%, на 7-е - 86% и 38% - на 14-е сут (р<0,05).

5. Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 характеризовалось достоверным увеличением объемной плотности синусоидов печени крыс (на 33 и 21% на 7-е и 14-е сут соответственно), обусловленным нарастающими обтурационными и тромботическими поражениями микрососудов с развитием геморрагий на 14-е сут эксперимента. Введение циклофосфана на 5-е сут в дозе 25 мг/кг тормозило опухолевую инвазию, уменьшало выраженность застойных явлений микроциркуляции с достоверным снижением объемной плотности синусоидов на 29% на 3-й и на 37% на 7-е сут после воздействия препарата с увеличением биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов на 3-й сут. К 14-м сут эффекты циклофосфана нивелировались.

6. Возрастание структурной плотности лимфатических пространств Малла в наибольшей степени выражено на 5-е сут роста карциносаркомы Walker 256 (на 103%, р<0,05), прямо коррелируя с выраженностью застойных изменений сосудов портальных трактов и синусоидов. Временный корригирующий эффект циклофосфана зарегистрирован через 3-е сут: значимое уменьшение площади пространств Малла (на 49% по сравнению с аналогичным сроком спонтанного развития опухоли, р<0,05).

7. После введения циклофосфана на 3-й и 7-е сут обнаружены ультраструктурные маркеры компенсаторных и регенераторных реакций гепатоцитов: комплексы параллельных цистерн гранулярной цитоплазма-тической сети и мелких митохондрий с плотным матриксом, пероксисо-мы, признаки липолиза, редуцирующиеся к 14-м сут и компенсируемые гиперплазией элементов гладкой цитоплазматической сети. Обнаружены адаптивные перестройки цитолемм гепатоцитов: формирование замыка-тельных пластинок на латеральных плазмалеммах и увеличение числа микроворсинок на синусоидальном и желчевыводящем полюсах, что способствовало пролонгированию функциональной активности в условиях токсического воздействия опухоли и цитостатика.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кунц Т.А., Мичурина C.B., Белкин А.Д, Овсянко Е.В. Морфологическое исследование паренхиматозного и соединительно-тканного ком-партмента печени крыс с перевиваемой карциносаркомой УОКЕРА-256 // Лимфология. Журнал им. С.У.Джумабаева (Узбекистан). - 2009. - № 1 -2.-С. 46-47.

2. Кунц Т.А., Мичурина C.B., Белкин А.Д. Морфологическое исследование синусоидного компартмента печени крыс с перевиваемой

карциносаркомой УОКЕРА-256 // Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: Материалы 7-й научно-практической конференции молодых ученых. - Красноярск, 2009. - С. 34.

3. Мичурина C.B., Кунц Т.А., Белкин А.Д. Морфологические изменения в тканевом микрорайоне печени крыс на ранних сроках развития перевиваемой карциносаркомы WALKER-256 // Мат. Евразийского симпозиума «Проблемы саногенного и патогенного эффектов эндо- и экзоэкологиче-ского воздействия на внутреннюю среду организма» по вопросам фундаментальной и прикладной медицины (посвященный 80-летию академика Ю.И.Бородина) - Хирургия, морфология, лимфология. - 2009. - Т. 6. N° 11..-С. 123-126.

4. Кунц Т.А., Мичурина C.B., Белкин А.Д. Микроциркуляторные изменения печени крыс с перевиваемой карциносаркомой WALKER-256 в условиях терапии циклофосфаном // Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику). Материалы VII международной конференции. - Ярославль, 2009. - С. 14.

5. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Мичурина C.B., Белкин А.Д. Ультраструктурные изменения в тканевом микрорайоне печени крыс с карциносаркомой WALKER-256 // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрокгологии. Материалы 15-й Российской конференции «Гепашлогия сегодня».-Москва, 2010.-Т. 10,№ 1.-Приложение№35.-С. 65.

6. Кунц Т.А., Мичурина C.B., Овсянко Е.В. Влияние химиотерапии на регенераторные процессы в печени крыс с карциносаркомой Walker-256 // Вестник современной клинической медицины. - 2010. - Т. 3. - Прило-жение№. 1.-С. 100-101.

7. Кунц Т. А., Пустоветова М.Г. Показатели тканевого микрорайона печени крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии химиотерапии // Бюллетень СО РАМН. - 2011. - Т. 31, № 1. - С. 13 -16.

8. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Овсянко Е.В., Пустоветова М.Г. Клеточные и субклеточные проявления синдрома паранеопластической эндогенной интоксикации в печени крыс с карциносаркомой Walker 256 // Адаптация человека к экологическим и социальным условиям Севера / Отв. ред. Е.Р.Бойко. - Сыктывкар; Екатеринбург, 2012. - С. 291 - 297.

9. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Овсянко Е.В., Ефремов A.B. Печень крыс при продвинутых стадиях развития карциносаркомы Walker256 // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2011. - Т. 9, вып. 2.-С. 126-129.

10. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Пустоветова М.Г., Жураковский И.П. Морфометрические и ультраструктурные параметры клеток печени крыс на ранних стадиях развитая карциносаркомы WALKER 256 // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - Т. 126, №3.-С. 91-96.

11. Кунц Т. А., Вакулин Г. М., Ищенко И. Ю., Ефремов А. В., Овсянко Е. В. Энергетический потенциал клеток печени крыс с карциносарко-

мой Walker 256 при терапии цитостатиком // Материалы IX российско-германской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова. - Новосибирск, 2010. - С. 181 - 183.

12. Кунц Т.А., Ефремов А.В., Вакулин Г.М., Овсянко Е.В., Пустоветова М.Г. Морфометрические и ультраструктурные показатели клеток печени крыс на поздних стадиях развития карциносаркомы Walker 256 // Сибирское медицинское обозрение. - 2012. - Т. 73, № 1. - С. 23 - 28.

13. Кунц Т.А., Гусев А.В., Ефремов А.В., Овсянко Е.В. Состояние паренхимы печени крыс экспериментальной в постцитостатическом периоде // Медицинский альманах. Материалы X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине».- Новосибирск, 2011. — С. 131.

14. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ищенко И.Ю., Ефремов А.В., Овсянко Е.В. Субклеточная организация печени крыс с экспериментальной кар-циносаркомой в постцитостатический период // Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2011. -С. 149-152.

15. Овсянко Е.В., Ефремов А.В., ЛушниковаЕЛ., Сафронов И. Д., Кунц Т.А., Морозов Д.В., Овсянко Я.У., Виноградов А.С. Морфологические показатели канцерогенеза перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при воздействии цитостатиками // Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2011.—С. 197—201.

16. Кунц Т.А., Ефремов А.В., Овсянко Е.В., Вакулин Г.М., Пустоветова М.Г. Морфологический анализ печени крыс с продвинутой стадии развития карциносаркомы Walker 256 на фоне противоопухолевой терапии // Бюллетень Восточно-Сибирского Научного Центра СО РАМН. - 2011.

- № 3, вып. 79, ч. 1. - С. 210 -214.

17. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ефремов А.В., Овсянко Е.В., Ищенко И.Ю., Пустоветова М.Г. Отдаленные последствия применения цикло-фосфана, ограничивающего рост карциносаркомы Walker 256 у крыс и влияния паранеопластических факторов наультраструюурные показатели клеток печени // Сборник научных трудов SWorld. Материалы международной научно-практической конференции «Научные исследования и их практическое применение. Современное состояние и пути развития '2011».

- Медицина, ветеринария и фармацевтика, Химия, Сельское хозяйство. -Одесса: Черноморье, 2011. — Т. 28. - С. 13 - 16.

18. Kunts Т. A., Vakulin G.M., Efremov A.V., Ovsyanko E.V., Pustovetova M.G. Subcellular liver vascular bed organization in Walker-256 carcinosar-coma-bearing rats after cyclophosphamide administration // Joint Meeting of the European Society for Microcirculation and the German Society of Microcirculation and Vascular Biology. Munich, October 13-16, 2011 // Journal of Vascular Research. - 2011. - Vol. 48, suppl. 1. - P. 224.

19. Ефремов A.B., Кунц Т.А., Овсянко Е.В., Ищенко И.Ю., Пустоветова М.Г. Применение циклофосфана для ограничения роста карциносаркомы Walker 256 у крыс усугубляет паранеопластические ультраструктурные нарушения в печени // Бюллетень СО РАМН. - 2012. - Т. 32, № 4. - С. 32-36.

20. Кунц Т.А., Гусев A.B., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Пустоветова М.Г. Ультраструктура печени крыс с карциносаркомой Walker 256 на фоне введения циклофосфана // Материалы Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальш питания створення нових лшарских засоб1в». - Харьков, 2012. - Т. 1. - С. 328.

21. Кунц Т.А., Ефремов A.B. Регенераторные процессы в печени при воздействии низких доз циклофосфана // Материалы 86-й Всероссийской студенческой научной конференции памяти академика АН РТ, проф. И.Г.Салихова. - Казань, 2012. - С. 359 - 360.

22. Кунц Т.А., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Ищенко И.Ю., Пустоветова М.Г. Микрососудистое русло печени крыс с карциносаркомой Walker 256 на фоне воздействия циклофосфаном // Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2012. -С. 146-148.

23. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Пустоветова М.Г., Самсонова E.H., Сафронов И.Д., Овсянко Я.У., Кунц Т.А., Пахомова Ю.В., Кузьменко Д.Б., Виноградов A.C. Метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256 в динамике опухолевого роста и после воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина // Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2012.-С.210-213.

24. Кунц Т.А., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Пустоветова М.Г. Показатели сосудистого русла печени крыс с карциносаркомой Walker 256 // Материалы 18-й Российской Гастроэнтерологической недели, 8-10 октября 2012 г., Москва // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрокгологии. - 2012. - Т. XXII, № 5. - Приложение № 40. - С. 85.

Подписано в печать 15.03.2013. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 39. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Соискатель

Т.А.Кунц

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кунц, Татьяна Анатольевна, Новосибирск

Министерство здравоохранения и социального развития

Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования ,

«Новосибирский государственный медицинский университет»

На правах рукописи

КУНЦ ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ И МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕЧЕНИ КРЫС С КАРЦИНОСАРКОМОЙ WALKER 256 ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЦИКЛОФОСФАНА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ

^^ на соискание ученой степени

N

кандидата биологических наук

(V) ^ Научный руководитель:

Ю член-корреспондент РАМН,

О 9

СМ 00

* л см

доктор медицинских наук,

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских профессор А. В. Ефремов

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................11

1.1. Системные нарушения в организме при опухолевом процессе..........................11

1.1.1. Виды и проявления паранеопластических синдромов......................................11

1.1.2. Факторы неспецифической эндогенной интоксикации....................................14

1.1.3. Роль печени при онкопатологии..........................................................................18

1.1.3.1. Изменения печени на фоне паранеопластического синдрома.......................20

1.1.3.2. Вторичные опухоли печени и ангиогенез.......................................................23

1.2. Карциносаркома Walker 256 как модель для разработки методов противоопухолевой терапии..........................................................................................25

1.3. Современные методы противоопухолевой терапии.............................................29

1.3.1. Антиангиогенная терапия....................................................................................29

1.3.2. Цитостатическая химиотерапия..........................................................................30

1.3.3. Метрономная терапия...........................................................................................31

1.3.4. Циклофосфан как противоопухолевый агент.....................................................33

Резюме..............................................................................................................................38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................40

2.1. Объект исследования...............................................................................................40

2.2. Модель эксперимента..............................................................................................40

2.3. Методы патоморфологического анализа...............................................................41

2.3.1. Методы свето-оптического исследования..........................................................41

2.3.1.1. Приготовление и окраска парафиновых срезов..............................................41

2.3.1.2. Стереологический анализ клеточных элементов и микроциркуляторного русла печеночной дольки...............................................................................................41

2.3.1.3. Морфометрический анализ артериально-венозной системы, пространств Малла и холангиол..........................................................................................................42

2.3.1.4. Оценка интенсивности метастазирования.......................................................42

2.3.2. Электронно-микроскопическое исследование...................................................43

2.4. Методы статистического анализа...........................................................................43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................44

3.1. Морфологическое исследование печени интактных крыс..................................44

3.2. Патоморфологические изменения сосудистого русла печени крыс с карциносаркомой Walker 256 в условиях ее спонтанного развития и после воздействия цитостатиком.............................................................................................44

3.2.1. Морфологические изменения печени крыс Wistar в условиях спонтанного

развития карциносаркомы Walker 256..........................................................................44

Резюме..............................................................................................................................56

3.2.2. Морфологические изменения сосудистого русла печени крыс Wistar с

карциносаркомой Walker 256 после воздействия циклофосфаном...........................56

Резюме..............................................................................................................................67

3.3. Патоморфологические изменения паренхиматозных клеток печени крыс Wistar с карциносаркомой Walker 256 в условиях ее спонтанного развития и после

воздействия цитостатиком.............................................................................................68

3.3.1 Морфологические изменения гепатоцитов печени крыс Wistar в условиях

спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 ...................................................68

Резюме..............................................................................................................................77

3.3.2. Морфологические изменения гепатоцитов печени крыс Wistar с карциносаркомой Walker 256 после воздействия циклофосфаном...........................78

3.4. Оценка метастатического поражения печени крыс Wistar в условиях спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и после воздействия циклофосфана..................................................................................................................88

3.4.1. Оценка метастатического поражения печени крыс Wistar со спонтанным развитием карциносаркомы Walker 256........................................................................88

3.4.2. Оценка метастатического поражения печени крыс с карциносаркомой Walker

256 после воздействия циклофосфаном........................................................................93

Резюме..............................................................................................................................94

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................95

ВЫВОДЫ..........................................................................................128

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ВНЕДРЕНИЮ..........................130

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................................131

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПС — паранеопластический синдром

две — синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания

нэи — неспецифическая эндогенная интоксикация

пол — перекисное окисление липидов

АТФ — аденозинтрифосфат

HIF-1 — фактор, индуцируемый гипоксией-1

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов

TNF-a — фактор некроза опухоли-альфа

IL — интерлейкин

TGF-pi — трансформирующий фактор роста-бета 1

ЭМ — экстрацеллюлярный матрикс

W256 — Walker 256

INF-y — интерферон-гамма

NF-кВ — ядерный фактор-каппа В

МПД — максимально переносимая доза

CEPs — циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток

РНК — рибонуклеиновая кислота

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

TSP-1 — тромбоспондин-1

чм — частота метастазирования

VCAM — молекула клеточной адгезии эндотелия сосудов

VAP — сосудистый адгезивный белок

АФК — активные формы кислорода

ESF — эндотелий-стимулирующий фактор

СОС — синусоидный обструктивный синдром

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема опухолевого роста является предметом исследования специалистов многих отраслей науки, в том числе гистологии, молекулярной биологии, онкологии. Во всем мире зарегистрирован неуклонный рост заболеваемости - даже в экономически развитых странах злокачественные опухоли занимают третье место в общей структуре смертности (Jemal А. et al., 2010; Чиссов В. И. и др., 2011). Среди ведущих методов лечения, наряду с хирургическим и лучевым, в клинической онкологии широко применяют цитотоксическую химиотерапию (Shewach D. S. et al., 2009; Nussbaumer S. et al., 2011). Лечебный эффект цитостатиков основан на их способности подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (Kaufmann S. Н. et al., 2000; Beauparlant Р. et al., 2003; Lövborg H. et al., 2004; Meng X. W. et al., 2005; Nelius T. et al., 2011).

Разработаны препараты, характеризующиеся высокой противоопухолевой эффективностью в эксперименте, но не всегда обеспечивающие успешное лечение (Davidson А. et al., 1997; Yamauchi К. et al., 2008). Это связано с резистентностью опухолей к химиотерапевтическим агентам, низкой селективностью действия препаратов, а также побочными эффектами химиотерапии, наиболее выраженными при применении высоких доз цитостатиков (Thurston D. Е. et al., 2007; Nelius Т. et al., 2011).

При проведении химиотерапии организм испытывает воздействие факторов паранеопластической интоксикации и лекарственных препаратов. Печень, будучи главным органом детоксикации, осуществляет биотрансформацию и обезвреживание ксенобиотиков (Parkinson А. et al., 1996; Desmeules J. et al., 1999; Plaa G. L. et al., 2001), однако некоторые их метаболиты характеризуются еще большей токсичностью и наряду с антиопухолевым оказывают выраженный системный эффект (Thurston D. Е. et al., 2007). Это требует продолжительных промежутков между курсами для восстановления быстрообновляющихся и других клеточных популяций организма (Kerbel R. S. et al., 2004).

Повреждение сосудов опухоли при введении цитотоксических

препаратов, происходит посредством различных механизмов (Hansen S. W. et

al., 1990; Doll D. С. et al., 1992; Soultati A. et al., 2012). Данный подход

базируется на следующих положениях: во-первых, дозы, необходимые для

5

дезорганизации клеток эндотелия сосудов опухоли, гораздо ниже тех, которые необходимы для деградации трансформированных клеток (Belotti D. et al., 1996; Vacca A. et al., 1999). Во-вторых, химиотерапевтический препарат модифицирует функции эндотелиальных клеток, не вызывая их деструкции (Clements М. К. et al., 1999). Кроме того, в отличие от опухолевых клеток, эндотелиоциты не приобретают устойчивости к цитотоксическим агентам (Boehm Т. et. al., 1997; Kerbel R. S. et al., 2004).

Интенсивный поиск путей преодоления негативного побочного действия цитостатиков привел к разработке новой стратегии терапии, основанной на их антиангиогенном действии при использовании в малых дозах (Miller К. D. et al., 2001). Одновременно с развитием целенаправленной терапии на опухолевый ангиогенез происходил поиск новых способов применения цитостатиков с целью снижения их токсичности и повышения эффективности. Одним из них стал так называемый «метрономный» режим химиотерапии (использование низких доз цитостатиков при малых интервалах между химиотерапевтическими процедурами), который дает не меньший противоопухолевый эффект, чем традиционные приемы и позволяет контролировать развитие опухоли на продвинутых стадиях (Kerbel R. S. et al., 2004; Shiraga E. et al., 2008). Она подразумевает предпочтительное ингибирование активности эндотелиальных клеток в растущем сосудистом русле опухоли. Таким образом, на применение цитостатиков в режиме метрономной терапии возлагают большие надежды и включают в схемы лечения ряда онкологических заболеваний в комбинации с другими методами противоопухолевой терапии (Nelius Т. et al., 2011).

Для исследования механизмов опухолевого роста и разработки

противоопухолевой терапии широко используют экспериментальные модели,

например, карциносаркому Walker 256 (Rettori О. et al., 1995; Buffon A. et al.,

2006; Perroud A. P. A. S., et al., 2006; Guimaraes F. et al., 2010). При этом

недостаточно исследованы паренхиматозно-стромальные взаимоотношения в

печени при ее спонтанном развитии, в частности, эндотелиально-паренхи-

матозные, определяющие гемато-тканевый обмен в динамике спонтанного

развития опухоли, а также при однократном корригирующем воздействии

низкой дозы широко применяемого в клинике цитостатического препарата

циклофосфана. Кроме того, не изучены стереотипные и специфические

структурные реакции клеточных популяций печени в динамике альтерации и

6

^ >

J hl

fti" Ii

особенно регенерации в условиях системного опухолевого и низкодозового однократного цитостатического воздействия.

Цель работы: изучить морфофункциональные изменения печени крыс Wistar при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и однократном воздействии низкой дозы циклофосфана.

Задачи исследования

1. Провести сравнительное ультраструктурное исследование клеточных популяций печени крыс Wistar в динамике спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и в условиях однократного введения низкой дозы циклофосфана.

2. Изучить структурную плотность паренхиматозного и стромального компартментов печени экспериментальных животных в динамике спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и в условиях однократного введения низкой дозы циклофосфана.

3. Изучить паренхиматозно-васкулярные взаимоотношения в печени и особенности ремоделирования кровеносного и лимфатического отделов микроциркуляции.

4. Оценить эффект однократной низкой дозы (25 мг/кг) циклофосфана на процессы метастазирования карциносаркомы Walker 256 в печени.

Научная новизна

Впервые с помощью электронно-микроскопического и морфометрического анализа исследованы структурные изменения паренхимы и стромы печени крыс-самцов Wistar при инокуляции карциносаркомы Walker 256 и однократном воздействии низкой дозы циклофосфана (25 мг/кг), что позволило выявить спектр стереотипных и специфических тканевых, клеточных и внутриклеточных изменений.

Впервые показано, что спонтанный рост опухоли Walker 256 у

экспериментальных животных характеризуется резким увеличением ядерно-

цитоплазматического соотношения гепатоцитов на 5-е сут с последующим

снижением, достоверно превышая показатель контрольной группы. После

введения циклофосфана максимальное уменьшение ядерно-

цитоплазматического отношения гепатоцитов отмечено на 7-е сут, что

7

обусловлено митотическим делением двуядерных гепатоцитов.

Впервые описаны ультраструктурные эквиваленты

паранеопластического поражения печени в динамике спонтанного роста карциносаркомы Walker 256: нарушения биосинтетической, метаболической и желчевыводящей функции гепатоцитов, сопровождающиеся парциальной и тотальной цитодеструкцией; при' этом показатели холестаза прямо коррелировали с опухолевой инфильтрацией печени и структурной плотностью метастазов.

Впервые получены динамические морфометрические показатели сосудистой системы печеночной дольки при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256: достоверное увеличение структурной плотности синусоидов на 65,23%, 72,31% и 51,69% на 5-е, 7-е и 14-е сут соответственно (р<0,05), обусловленное нарастающими обтурационными и тромботическими поражениями микрососудов с развитием геморрагий на 14-е сут эксперимента. Введение циклофосфана на 5-е сут в дозе 25 мг/кг тормозило опухолевую инвазию, уменьшало выраженность застойных явлений микроциркуляции с достоверным снижением объемной плотности синусоидов на 30% на 3-е (р<0,05) и на 27% на 7-е (р<0,05) сут после воздействия препарата с увеличением биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов на 3-е сут. К 14-м сут эффекты циклофосфана нивелировались.

Впервые сделан акцент на морфометрических показателях лимфатического компартмента печеночной дольки: установлено возрастание структурной плотности лимфатических пространств Малла, в наибольшей степени выраженное на 5-е сут (в 2 раза, р<0,05) роста карциносаркомы Walker 256, прямо коррелирующее с обтурационными изменениями сосудов портальных трактов и синусоидов. Временный корригирующий эффект циклофосфана зарегистрирован через 3-е сут: значимое уменьшение площади пространств Малла (на 49%,р<0,05).

Впервые представлены ультраструктурные маркеры компенсаторных и

регенераторных реакций паренхимы на 3-й и 7-е сут после введения

циклофосфана: комплексы внутриклеточной регенерации, индукция

липолиза и глюконеогенеза, гиперплазия элементов гладкой

цитоплазматической сети, свидетельствующие об активации

биосинтетической и дезинтоксикационной функциях гепатоцитов. Выявлены

8

Г-, .

адаптивные перестройки цитолемм гепатоцитов в условиях токсического поражения печени: увеличение числа микроворсинок на синусоидальном и желчевыводящем полюсах гепатоцитов и формирование замыкательных пластинок на латеральных плазмалеммах.

В целом, на модели однократного введения низкой дозы цитостатика при развитии опухоли продемонстрирована ведущая роль внутриклеточной регенерации эндотелиальных клеток синусоидов для регенерации печени: индукция биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов опережала восстановление ультраструктуры гепатоцитов, что подчеркивает значимость васкулярно-паренхиматозных взаимодействий.

Практическая значимость

Проведено комплексное изучение структурных эквивалентов противоопухолевой активности низкой дозы циклофосфана в условиях системного опухолевого процесса с поражением печени с позиций клеточной биологии. Полученные данные продемонстрировали клеточные и ультраструктурные механизмы сочетанного опухолевого и низкодозового цитостатического воздействия на печень экспериментальных животных. Цитотоксический эффект опухолевого воздействия карциносаркомы Walker 256 модулируется цитостатическим эффектом циклофосфана, и в условиях торможения метастатической активности развивается транзиторная регенераторная реакция паренхимы - увеличение количества полиплоидных « и двуядерных гепатоцитов. Кроме того, временный противоопухолевый эффект низкой дозы циклофосфана обладает цитопротекторным потенциалом и индуцирует метаболические и регенераторные процессы в клеточных популяциях паренхимы и стромы печени животных-опухоленосителей, что может иметь важное значение для дальнейших исследований с целью разработки схем противоопухолевой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При инокуляции карциносаркомы Walker 256 крысам-самцам Wistar с

помощью электронно-микроскопического и морфометрического анализа

паренхимы и стромы печени продемонстрировано прогрессирующее

нарушение биосинтетической, ме�