Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультрафиолетовая резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния и ее применение для идентификации микобактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ультрафиолетовая резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния и ее применение для идентификации микобактерий"

,46 ОА

1 7 ШД

".а:К1/ЬСКГ.П ГССУЛ'.РОТШЯ'^П ЖиЕГСИТКГ ;:м.'!, В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.361*37 543.424

ТАТАРШЮВ Алексей' Павлович

УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ РЕЗОНАНСНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЯ. ( 03.00.02 - биофизика )

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1993

Робота выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза кивотних г.Омск.

Научные руководители:

доктор физика -математических наук , профессор

В.3.Пащенко кандидат ветеринарных наук В.И.Околелов

Официальные оппоненты:

доктор физико- математических наук, ¡трофеесор

В.Е.Холмогоров доктор ветеринарних наук, профессор

Н.П.Овдиенко

Ведущая организация: Институт Прикладных физических проблем Бслгосушшерситетз

■■ Анош 1993 г. на заседании специализировашого совета по биофизике

^ Защита .диссертации состоится

/Ъ

на засепяиди ппигнялишгоопят:

К,053.05.68 в Московском государственном университете ик).М.В.Ломоно'1ьа по адресу 119899, Москва, Ленинские горы , Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 1993 г.

Учений секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Б.А.Гуляев

ОЕШ /ЛРДСШЯСТПКА РДПОТ;!

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМ.

В нпстогсзе время поЕнгекчое зпглгот?. с г<а»:рсола1«троннсй технике i б тэ логик, мелкшн:* и ивторкнартз! прпвлзксэт разработка новыг зффзктипншс. нетодов <5£:одз1зккш1 к ¿здепта^пкатгс tгакроорганнзмов.Так, нэпрп?:зр « при создгшпт и сборке ¡.т.тсгрллбкш: osen п компонентов ^пгрос-я^кт.-рон'лкк осиоепая ироблзиэ захгезчаетсп в о'пютке вода oí бттологпчео-яя! ирлт.мсгй • в биологии оотро стоит проблема идентификации |Лйфссрггишзу.оз для ке.тй биогсхпологии, п медицине установление патогошгоетн «лдалэкоЯ UH.f?KitS! оггрпделязт баотроту и е^фзкттгость .те'íi, а в правильная

идентификация гозбуглттля кпГлк'днгкпэго й'-Со,-:ет"даш азикитапс. ».«si больное сксяомаческоа к социальное значен: о „

В последчиз года '.i¡,go-í;xíí"t зыачлтольпкй прогресс в агучеалл хге-аггзсг.с'т систематики орггятг'5.1.Особенно эта справедливо для бактерий и в иастог^-ге вре;.-.е! нопбслзо бготрораг;:квь.,етеся ггтолч детекции осноБнваются на спегогоальяом аиалиаэ различных компонентов клейся я 5.-олэк;:ляр:п?::. сгойств соэдяпвпяй , в-.одпзчх п структур?! организмов.

Сред:! изтсдез тонко .'о анализа структурно- Лункциональннг свойств белков и нуклежовь':: кислот напболызге распространен!!'.; игвла спектроскопия разспглсггаго комбинационного рассеяния света о возбуждением » УФ дг-ая?.зойэ спэктра. Неоспоримые преимущества метода- это исследование сбьох-стс» я. любом агрзгатном состоянии , высокая чувстзителшссть, сравнимая со спектроскопией УФ поглощения , возможность избарато льпого поучения отдельных колебательных код и некоторое другие позволили на осноре накоплейга обчпрного !.;атврнала, полученного для моделып-5 систем, вплотную подойти гс ПССЛЭДОВатЕЗ 6)ю7.0л2кул ln vivo. Одним кз наиболее перспективных приложений может стать разработка метода бкодет-екцпп и идентификации различных re??woB мхкреорглямямээ, т требующего их предвсритчл!иой дезинтеграции :г использования при анализе дорогостоящих зл-гае активов.

l_L§A£A4LL®Sg2PT ащюшой^РЛБОТЫ .

Целью данного исследования являлась разработка методических, подходов к использованию спектроскопа -УФ РКР для биодетекаи;; микроорганизмов in vivo.

Для достижения постаплешгои цели необходимо было решить следующие задачи :

-создать экспериментальную установку для спектроскопии У£> РКР биомолекул и целых микроорганизмов, б том число патогенных дл/t человека,

-разработать на основе отоП установки методы исследование структурно- функциональных свойств биокомпонентов в составе целой клетки, биологически безопасные для человека и наносящи;. мшишалышй вред исследуемом культурам,

-нрш.!еш1ть разработанные метода для выявления характеристических видовых особенностей в спектрах У4> РКР различных, культур микроорганизмов к реализовать на етой основе методические подходи биодетекции и идентификации микроорганизмов, на примере культур микобактерий разных видов.

JJM^MLL[9§W3IJA.B настоящей работе впервые:

1.Создана экспериментальная установка для спектроскопии УО ?КР биообъектов на основе приборов отечественного производства, модифицированных для работы на длинах волн короче ?50 нм.Ка' базе созданной ¡экспериментальной установки разработаны ' методикк исследования микроорганизмов,в том числе патох'енных, биологически безопасные и наносящие мижмалышй вред исследованным кквым' культурам.

2.Методом спектроскопии УФ РГ.Р изучены культуры мщ«обактериЯ • разных видов - патогенные , условно- патогенные для человека , и

животных и атипичные.Предложены методические подходы к использованию метода спектроскопии УФ РКР для идентификации и биодетекщш микобактерий разных видов.

3.Методом спектроскопии УФ РКР продемонстрирована взаимосвязь процессов ¡¡шзнедеятельности клетки с элементарными електронио-конформациошшми взаимодействиями ее биомолекул. Обнаружено изменение В1слада енталыши водородных связей белков в свободную •энергию связанных с ним субстратов п формирова;шз полидептидоз в

упорядоченные а-сгтралькые структуры после 7-облучэния клеток.

4.Выполнено исследование спектрсн УФ FKP мшсобактерий'-на разных стадиях роста культуры. Установлена корреляция мекду ЕЗЛ1ПШГОЙ с!гэкинга нуклеотидных оснований и фазой роста культури. Обнаружено,! что величина стогашга части нуклеотидных молекул по изменяется с возрастом популяции клеток.

диссертационной работа заключается з том, что предлокзшшс тт0дхода использования спектроскопии УФ ?КР для изучения сидосьецифическкх особенностей ка;рооргшп1гмов находят применение при разработке метода диагностики возбудителей особо опасных ин5>екций - бруцеллеза и туберкулеза гашотннх. Ото долгсно стать средством -раннего обнаружения заболевания и играть с'ольшое окоиомическое и социальное значение.

Созданная окспержентальная установка для спектроскопии УФ ГКР также используется для разработки методов диагностики, основанных на анализе других биологических объектов ( компонентов кропи, ферментов и др.), а такхса ипих практически в а-л. .и я приложений.

АПРОБАЦИЯ_____РЕЗУЛЬТАТОВ_____РАБОТУi Основные» результаты

работы докладывались на ВсесоызноЯ конкуренции по' измерительной и вычислительной технике в управлении процессглг.; в АПК (Ленинград, 19S3), Всесоюзной научно- теоретической конкуренции по биотехнологии и жнгзотноподстве и'ветеринарии (Новосибирск, 1991), 1-ом Международном конгрессе по биофизике и биотехнологии (Турция, 1991), на Практическом спшииэрв в Институте спектроскопии Гумбольского унньзрситета (ФРГ, 19Э1).

_ПЛУГ.tIiAI_S_ni.no теме диссертации опубликовано 9 работ.

51С^>Х?ЕА_И_0БЬИЛ_^ССЕГТАИМ.Д11Ссертащ1я содержит 144 страницы машинописного текста , вкл-очая список литературы (155 ссылки), 7 таблиц, 20 рисунков и 10 фотографий. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы.

' СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Бо введении обоснована актуальность теш, определена цель

р»Лоти и ое новизна, щ-исодопо краткой содап;:яшз диссертации.

ПзЕпая__глйра даосертьиадх дредсташшэт ;шт©ретуг<кнй обзор

соьремзинах фязько- яшйчееккх ыетсдоа блодегекцш а здектлфакэцяи микроорганизма::, a ïqick- результатов применения метода с11вктроскопик УФ РКР для гнад;:за струкгурао- фукхдчонэльшх osoíkjtb биологических обьоктов.

Во___Ы?Е2й___Е3212 опкоаш экспер»шо:г?альпаг. установка

для шектроскогаы УФ FiCP, катод'.жа проведения экспериментов и обработки результатов.

Уксиоркмеатальная установка дли спектроскопа УФ ГКР создала i¡a базе нрсг-шилсп^УЕ приборов отачйстсенйого' : производства, моде&ищровашшх для работы ь облает;! далекого УФ диапазона, Она ьк.п?;чает лазерную скотому, спектрометр КР и мшфсЭЬМ (рис.1). Оопэзшми олешита»«! лазерной система являются тсердотольнкй импульсный лазер типа JITit-403 (гЛЛщск) к АПАГА-1312 (г.Ереван).

Рис.1.Блок схема экспериментальной установки для спектроскопии УФ РКР.

Лазерная система АПАГА-1312 ^екер'груе'." пмяул1.с;; излучения па длинах волн 1080, 540, 270 и 216 км со средней модаэстьп излучения 2, 0.6, 0.25, 6.04 Вт ссотв?тотаенко. Среднее длительность одного импульса "10- 15 ис при частото повторения 1- 50Тп.

В лазерной система гихта ЛТЯ-403 впергпп импульса лазерного излучения на длинах волн 1064 п 532 км составляет 0.4 и 0.13 te соответственно, при длительности по урозкм 0.5 амплитуды - 10-20нс и частоте следования шлпульсов 1-50 Гц.'

Для получения дополнителышх. дл:я! волн излучения в области менее 260 км нами использован аффект Бннуэдешгого комбинационного рассеяния (ВКР) в водорода ка колебательных частотах 4155 см 1. Возбуждение ВКР тгрово.ттли к^лучекием второй гармоники лазера типа ЛГИ -403 (Я=53£ им). Екла изготовлена конструкция , псзволнвдал практически осуществить ВКР в водороде .Она состояла из двух Т-образкых переходников , изготсплсшых кз нзркавеюцеК стаж , которые соединены трубой , рнпо,гавннсЯ из того жз материала ( 1000 мм дляной, бим внутроыянЗ дазмотр). Оптимальное д^пл'лпк s использованное в експзримепте, опр-згзлялоОь чаотстячи излучепяЛ, которые били гмобходтсг/ы длл с1:спзртгмантальл:тх иеслэдопг»н5!й. П практических опытах. дызленке составляло 5-10 тТ/с;;'".

Бизкутюэ излучали«» д.гаг! isojnr.T гыделяяось о

пс>.-.с:';ьп д'и-у.рглп ««оръг. ; -о \'от'о:;пс;>аторг; ппт? Н",-х -1М п н'-^рг'рлллое"'. системой с-уркал на сбрезец -^гкусярус??:?! обьо^ггш - Р;-~се.т-пю.-

кзлучегг'.е, собрахшог ст;оте:.таЯ, оспе-дало ezo,?t •:?;;> цел»-,

двоякого м-^.-оггромг.т'ор:'. . Спектры кот'С^Жйтюгшого р^осзлк',': облздак? малой гатслспспоомг-, поэтому ллд и-: лс.о^сьзрьог. регистрации нэсбюз;,:: попользовать спетсепля^е •.«о;?о-рс«кчтори, сбладаздпо урознгм рассеянного , г: так?.*

чуйстзптел;л:Ы:. ciicT.i;.».i р:гготр; гг.п. , ' оЗ^одпкпко уг-~ "¡.ïi.î

ny.wn и отг.'::лыгоа гм». Стспадртик*! npoiOCT^msi.'.

Bap-.iaiiv сгиглрсгэтрь »na пояшоляет работать a даянвзс®

400-830 IV Длч того "Г'Об" регпсгртоов.чть сггекточ .70 PKP, м>-' тдафодфовас: .пшс-л.Д сасктралышй прибор . Кадл рлгсчитэни, изготовлен« • к установлены г- спскгрсметро сметпю ¿•одэгдо&ичвг'кио дифрчкшюнга« решетка с »шелом штрихов 2400 л 3600 на 1мм. чго позволили перекрн-Уо диапазон ешктрз от 200 гто 400 нм. Зам.не:. ■

тага;е и все стеклянные оптические элементы на кварцевую оптику, пропускающую излучение до 190 им. За выходной щелью монохроматора помещен приемный блок канала регистрации, б котором использован специальный ФЭУ ■ (типа ФЭУ-142 ,) с. максимумом спектральной чувствительности на длине волны 253 им и нечувствительный к. излучению видимого■диапазона (\>ЗбО нм). С анода ФЭУ импульсы токи поступали на блок регистрации импульсных сигналов (БРКС) Создание етого электронного блока 1 обусловлено тем , что в сконструированной нами окслэрименталыюй установке для позбукдения спектров УФ РКР применялось импульсное излучение с длительностью одного импульса 10-20 не и частотой следования импульсов от 1 до 50 Гц. Разработанный блок рс-гистрац'да импульсных сигналов значительно повысил аффективность детекции.

Спектр УФ РКР, записывали и интервале 500- 2000см"1 с сагом

. о

0.07А/сек. Для увеличения отношения сигнал/шум осуществлялось накопление спектров от повторных -сканирований (10- 20 сканирований). Для уменьшения теплового шума ФЭУ .охлаждали до -40°С. Ширина входной цели монохроматора составляла "100- 200 мкм. При етом спектральная ширина щели- была "10 см-1 -. Воспроизводимость составляла не менее 4см . Юстирозка системы облучения проводилась tt-aaiM образом , . чтобы предотвратить попадание на входную щель спектрометра луча , отраженного . от образца'. Спектрометр

калибровали по линиям ртутной' лампы шзкого давления. Длину еолны

—1 -1 лазера корректировали .с точностью до 2 см по линии ЗСР 981 см . ,

внутрешгего спектроскопического стандарта NagSO^ .

Для повышения разрешающей способности экспериментальной установки применялась математическая обработка спектральной информации с помодью, метода быстрого преобразования Фурье с ограничением влияннл высоких частот на устойчивость решения с помощью метода регуляризации Тихонова. При этом, для решения налей задачи стабилизирующая функция .О(и),а) была выбрана такой, .что результирукаций спектр можно было представить в виде уравнения:

1 00

где ъ(ш) =,\ (и)»X* (и)«|(о) |2, И

к=б ^ или М(ш)=|ш|2(1,

q - параметр регуляризации. Описанный метод, реализованный программно на языках программирования ФОРТ и МАКРО 1.1 позволил в несколько раз повысить разрешение экспериментальной установки.

Смысл применения спектроскопии КР в биохимических исследованиях состой'* в- том, чтобы соотнести характерные особенности спектров .лР с определенными. свойствами биомолекул , например, с молекулярной копформацией и молекулярным окружением . Методика возбуждения и регистрации ■ спектров УО РКР долгна обеспечивать сохранение структуры' и функциональных особенностей исследуемых образцов- при высокой воспроизводимости результатов и необходимым отношением сигиал/шум. .При разработке методики в качестве критериев ее эффективности использовали идентификацию исследованных культур согласно ГОСТу,- 26072- &4, сопоставление спектров поглощения . микобактерий до п после облучения, тестирование спектров УО РКР на отсутствие новых линий.

Для предотвращения фоторазлокениа бактериальных образцов мм использовали прокачку суспензии 'клеток под лучом лззерз, термостатирсзание исследуемого раствора , ограниченна средней мощности возбуждающего излучения'и небольаук расфокусировку луча на образце .Средняя мощность е о г С уада кие го излучения 'составляла 3 - 6 мВт при частоте следования импульсов 20 - 25 Гц. Концентрация

о . о .

образца составляла 10-10' микробных тел/мл, что соответствовало коэффициенту поглощения на длине волны 252 нм 5-6 единиц оптической плотности.

Для обеспечения безопасности манипуляций с образцами патогенных микроорганизмов ■ была сконструировала герметичная бактериальная камера. ' ' ' , ^

Для количе ствснного сопоставления спектров УФ РКР необходимо измерять интенсивность линий, которая зависит от многочисленных факторов . . В большинстве . случаев кзмеряетоя.

относительная интенсивность, а не абсолютная .Оценка «лхтенсивностей линий в спектрах . КГ бактерий была проведена по отношении к интенсивности линии 981 см"''- от внутреннего репера IJa^SO^ на. единицу клеточной массы в мг/мл.

Б___третьей___главе_излог:ены результаты оригинальных

исследований.В параграфе 3.1. представлены результаты исследования модельных соединений бактериальных кошюнентов с помощью спектроскопии Ь'Ф РКР. Перспективность применения спектроскопии Уф РКР для исследования микроорганизмов базируется на резонансном усилении колебаний молекул таксономических маркеров клеток при возбуадешш на датах голи < 260 roí. Однако бактерии содержат чрезвычайно большое количество биоглолекул и з связи с этим линии в спектре РКР являются суперпозицией нескольких колебателышх люд различных хромофоров. Дли интерпретации спектров и соотнесения линий отдельный кодзбатольннм модам использовано известное явление- уавпскмость шхтекскзкостхх лилий КР от длины волны гозбуздошхя. ДсКстлятельно, птюисД'Зхшко исследования показали, что если рассеивание происходит i-.з более чей одного состояния молекула, то в это./ случае лхззхп и спектре будут "кзхь различную оавлсимоссь пн^епсншоста от дани;. зогаа ьозбупдетхя. Такое поведокке определзшяих линий в. спектре РКР бактерий было использовано для расресеыхя и i-штерпротации природы линий в спектрах слога'ах бполопхчиских систем , нгихрххмзр сактерий. Для итоги пакд получек: ехкг-лр:: оенэшхыж ароматические аминокислот и пуклаотидних осиовзххий при возбуждении на вх-гбрахпшх длинах воли 252 и 230 им и определены их относительные интенсивности.

D данной работе -впервые- методом спектроскопии УФ РКР исследованы 15 культур аякобактерий (параграф 3.2), относящиеся к пяти разним видам, среди которых патогенные для человека и животных, условно- патогенные и атипичные.Спектры УФ FKP при возбуждении излучением на длине волны 252 им характеризуются сходным набопом лшпхй и отличаются по их относительным ннтенснвностям .Сравнение спектров УФ РКР культур микобактерий со спектрами нуклеотидов позволяет . заключить , что преимущественный вклад в спектр дают ДНК и РНК различных тхшов , а также свободны" нуклеотиды. Оценка вклада белка в спектры

клеточных, культур ■ по интенсквностям линий ароматических аминокислот в области 757 си (Тгр), а также 1175 см и дублета Ферми 830/850' см-1(Туг) ;, позволила заключить , что он относительно мал. . .

Основные линии РКР •клеточных культур локализованы в области 1200 - 1700 см и представлены тремя группами линий:: I -1300- 1400 см-1, II - сильная линия при 1490 см-1 , III - 1570-1700см"1.

В спектрах УФ РКР микобактерий при возбуждении на длине

волны К =230 км нуклеотиднкР компонент имеет минимальный сигнал , в

за исключением вклада адешш- гуаниновой кгмпоненты. Основные

линии в спектрах микобактерий принадлежат колебательным модам

белковых молекул: аминокислотам, пептидным колебаниям и другим.В

спектрах преобладают 'линии- тирозина н триптофана (1618, 1553,

—1

1260, 1206, 1177, 1016, 763 см . ).Адеиин и гуашш представлены

—1

линиями средней интенсивности (1490, 1370 см ), цитозин линией -1 -1 при 1303 см , тимин линией при 1382 см . На длинах волн

возбугдення<230 нм происходит резонансное усилетю колебаний Амид1

пептидных связей, а также возрастает сигнал липидоз (1660 см ,)

• Полученная селективная. качественная и количественная

информация о нативных- биомолекулах целой клетки была использована

при разработке методических подходов использования спектроскопии

УФ РКР для биодетекции идентификации микобактерий разных видов 1

(параграф 3.3.).

Применение метода спектроскопии УФ FKP для Сиодетекции и

идентификации микобактерий упростило бы технику анализа, дало бы

возможность автоматизировать процесс идентификации и сократить

время постановки диагноза до десятков минут.

Для ' разработки методических • приемов биодетекции и

идентификации микобактерий разных видов в качестве обьектов

исследования были Еыбраны хорошо изученные музейные штаммы, для

которых методами анализа, согласно Г0СТу-2б072-84 определено

относительное содержание клеточных компонент, специфичное для

каждого вида микроорганизмов.

Исследование микобактерий современными биохимическими и

физико- химическими методами показало, что относит -льное

содержат» ароматических аминокислот, нуклзотвдяых оснований к липидов в бактериальной клетке внсокоспецижчно от культуре к культуре. Длл того, чтобы проварить возможности спектроскопии У5> РКР регистрировать отличие в концентрация спи биомолекул для культур разных видов мы измерили относительную интенсивность линий РКР от вклада колебательных мод компонентов клетки. При етом мы исходили из того факта, что интенсивность линий хорошо коррелирует с концентрацией биомолекул. В качестве реперов были выбраны интенсивные и хороио разрешенное линии.

В спектрах УФ РКР млхобактеркй (л =230 им) интенсивная линия —1

1660см (валентные - колебания С=С) стргшает--. значительное

содержание липвдоа в кжобактериях (Лазовская, 1985) • линии —1 — 1 ' 1609см и 1550 см отражают относительное содержание Туг irvTrp,

соответственно. Относительная интенсивность репериих лшшй была

измерена б спектрах УФ РКР культур двух видов М.avium и М.bovis.

Вычислив отношения ииег.снъностсй лшшя 1660 липидов к

линии 160? см"' Туг г. сравнив оти значения для исслздовашяис

культур, млко0актер»ш M»bövia и K.&viua были раздолена на две

группы:!. К.avium, 9, 12, 14; II. Ii.bovis, 8, 361, 14, 622 и EOG.

Б другом случае ¿оравши сачислешо отвошзния интенсивности лшши

1550 Тгр к интенсивности лшшп 1609 '-Туг , мы смогли разделить

кукьтуры па трл группы : I. К.avium, 9, 12, 14; II. И.bovis, а,

3$1, BOG; III, K.bovie 1-5-, 622. Показана корреляция между

относительный интенсивностью .isiinDt в спектре УФ РКР клетки и видом

мшеойакторий (рис .2).

В последние год-i при идентификации микроорганизмов но нуклеотидасму составу ДПК используют ' значение , суммы гуанина и цитозкиа з молярных процентах (иол.%' G+C). Селективное возбуадение нуклеотидаого компонента кикобактехий позволило по спектрам УФ PF? измерить относительные .штеноивностз: отделыых линий нуклоотидных оснований. Ни использовали критерий' специфичности в виде отношения G/'f »сходя из того , что линии ' ,соответствующие колебаниям этих основагссй, разнесены в спектре У® РКР. Полученные данные были сопоставлены для разных штаммов микобактерий.

«■ Установлено , что для атипичных мтаобактерий М.втирпаиг, и M.phlei определен! выделяется более высокое значение ■ пюсоши

Л)

В)

Л.avium,9 U.avium, 12 И.avium,14

¡1. avium, 9 U.aviun,12 Ы.avium,14

1(1660 см 1);j 1(1609 ом-1)''

M.bovi3,(5 стаммрв) U.avium, (3 штамма)

1(1550 ом~1) 1(1609 см""Ъ

М.bovis,8 г М.bovis,361 M.boviu.14 М.bovis,622 'м.bovis,»CM

и,bovis,а

M.bovis,261 M.bovis,BOG

M.bovie.l-', I II.bovis,6221

Рис.2.Группы мккобоктерпй ввдоа M.avium и Ii. bovis разделились по значениям относительной интенсивности линий л спектрах. У>2 FKP.

G (16Ю)/Т(1660). Отнокекие G(1610)/T(1233) выделило в отдельную группу культуры МЛиЬегси1оВжВ.Для Ц.bovis ето отношение несколько больше ,чем для М.avium. Показано, что относительная интенсивность линий 0(1610) и Т(123S) мовдт служить дополнительным критерием при идентификации микобэктерий .

Таким образом, измерение относительной интенсивности релергшх линий-в спектре УФ 1КР мелет быть использовано для биодетекцич и идентификации мпкобактерий разных видов.

—1

В область спектра с центром ,V1340 см вносят вклад кол?бакия нескольких мод разных компонентов клеток. Любое изменение в интенсивности ' или частоте какой-либо составляющей мода сильно меняет очертание отой группы линий(Dalterio R.A., 1996), которое

высокоспецифячно для каждого отдельного вида микроорганизмов. Для выяснения возможности использовать эту особенность спектральных характеристик для идентификации микроорганизмов, ш исследовали специфику микроокружения "хромофоров" в .составе .нативных клеточщг»-

M.AVIUM

"JTcüF"

М.BOVIS

Рис.з.Спектры УФ РКР микобактерий М.avium и M.bovis в области 1300 -1400 см-1 при возбуждении излучением 230 им. А:1, 2, 3 - Н.avium, штаммы.9, .12, 14, Б:1, 2, 3, 4 - M.bovis,'штаммы 8, 14, 361, вса.

культур (параграф 3.3.2.).Вэкслерименте были изучены спектральные характеристики семи штаммов двух видов микобактерий Ы.avium и М. bovia (рис.3). Профиль группы линий имеет специфические очертания для каждого вида микобактерий. Для М.avium (рис.3,а. ) ето интенсивная линия в центре, резко поднимающееся коротковолновое плечо к более пологий спад с длиноволновой

стороны.Для bovis (рис.3.б) характерно наличие четырех пзтков примерно равной интенсивности с преобладанием вентрального гппса (1340 см-1). '

Одной ив главных причин специфического профиля отой группы линий, очевидно, является неповторимость упаковки биомолекул клетки. Сечение рассеяния колебательных мод иуклсотидних оснований (адонина, гуагата, тимина ir цитоыпга) и ароматических аминокислот (тирозина и триптофана) зависят от локального микроокружения хромофоров, которое, в своч очередь. Определяется структурой макромолекулы. Поэтому от упаковки макромолекул записи? величина вклада колебательной моды з область спектра 1300- 1400см"''. Профиль группы линий меньше отличается для близкородстзекннх культур, поскольку их молекулярный состав отличается а меньшей степени.Отличия в спектрах согласуется с отличиями в Функциональных сг-сйства.т исследовании.-! культур. М.avium - услоьио-патогеннкй вид, зызниакций туберкулез птиц, з зид T!.bovis опасен как для гнпотш«, так и для челояека.

Таким образом, л качестве перспективного тапраале. ля использования спектроскопии УО ?КР для биодетекции и идентификации \.икроорганизмов моааю г.мдел«ть 'уш:калчиуя возможность исследозьть укпкальну» уп-икоэку латпоодз Сиси л-: кул по сязпнфнчеекоиу .'.чгкроокрукечии биодромсФороз.

?■_г.;;_4 разработанные методики регистрации и обрабо гки сп-ктр^ь :.'v ?ЧГ 'или усяявно применены для изучения белкового и >';/A.,;':í.,:;;..¡ior'j компонентов s зс."тзье яатившз структур клетки э и с с л е до :>; i ¡ >.;! ¡ ¡ x:

1 )(.'/...•>• куллрнкх перестроек после 7-облучения клеток • (параграф

4.1 .)

3/изменения структуры макромолекул па разных стадиях роста культуры (параграф 4.2.).

При анализе патогенных микроорганизмов спектральными методами обычно проводят их предварительную инактивацию. Наиболее часто применяемые методы тепловой и химической инактивации вызывают значительные структурные изменения компонентов клетки. Поэтому при, разработке методики регистрации спектров УФ РКР патогенных \тикрооргагизмов ми провели поисковые вксперименты для выяснения

границ применимости известного способа 7-инактисэцди.

Били зарегистрированы спектры УФ Р11Р микроорганизмов =230x11.:) после »оздейотвил разнил доз 7-облучен«я, анализ

в

которых. .показал, что интенсивность и частота некоторых спектральных линий изменяется пропорционально дозе облучения.Из практических исследований (Нз.1с1сЪгапс1± Т.О.,193В) известно, что

линии от вклада колебаний амкдных связей ("1660см ) и колебаний

_*

бензольного кольцо 1>дп тирозина (~155бсм ) являются своеобразными спектроскопическими индикаторами внутриклеточных перестроек белков. Кром-? того, известно > что частота линейно связана с энталытс-зй водородных саязей следующем соотношением

1603,0 - г>_ (см-1) • ■ оВ-- (2)

--1,25

где ЛИ - изменений бнтьдыши водородных связей.

Сравнение отшеитолькнх пнтепсивностей и частот лзашй-спмг/росколических. индикаторов, а также оцеьха нгмопошм онтальлзш показал:, что увеличение дозы "(- облучения гтриводат к возрастмп-ш количества соляпептида шх. участков в. а-епиральной вторичной структуре и уменьшении внталыпш водородных связей Туг в белках до значения ¿2,24 кДз/моль при максимальной использованной дозе облучения в 30 кГр. При о том разность энтальпий натишых клеток и клеток после облучения максимальной дезой составляла 7.2 кДж/моль. Наблэдаямзэ уменьшение вклада внтальшш водородных связей в свободную энергию субстратов, связанных с белковыми молекулами,, позволяет сделать вывод о том, что белки переходят из связанного на мембране состояния в свободное. Переход белков в свободное состояние может быть вызван изменением физика- химических-характеристик внутриклеточной ¡кидкости, например, рН. Уменье.лоте силы водородных связей позволяет предаь.'.гдкнть. изменение рН в щелочную сторону. В то же . время, при щелочках рН, когда аминогруппы непрогокировагш, могут формироваться- упорядоченные макромолекулярные . структуры(Кантор . Ч..1986). Амидные группы, индикатора по-видимому, взаимодействуют с молекулами, которые образуются в клетке после 7-облучения, что и приводит к

2,5 5,0 13,0 2'ДО 30,0

U, îT?

Pua.4.изменение шлсетния -танки Ug - спектрального силы водородных связей в белках и пгуелеяие витальппи содороднвх сзязгЗ ■■в зависимости от дозы ^-облучения.

Образования а-сгшралей. Большая доза облучения сплькее изменяет pli среда, ' приводе? к депротоггирэваниа Оола^ого числа амидных групп и возрастанию количества а-сшфзлей.5тк выводы хореей согласуются о экспериментальными данвчыи, полученными в других ксс^;г доваяиях (Кудряаюв Ю.Б. .1982, Аксенов С.И., 1990).-

Результат;.; спектральных исследований хорс-ао согласуются о данными параллельного изучения оф^ктияпзсти роста облученных бактерий па питательных средах и анализа улътраструк^урнц^ изменений в морфологии облученных меток по двкт::л е.тектроилсГ:

микроскопии.

Любая клетка за свой ?ш зкеквыГ. цикл проходит разлпчкие состояния, которые п общем включают в себя состояние шв,"' >н:ы специфических функций a периода покоя, ¡За что »р»мя в клетка

происходит масса изменений, например, количества биомолекул различных типов, изменение физических характеристик внутриклеточной среди, изменение . структурно- функциональных свойств макромолекул и другие. Поскольку внутриклеточные изменения связашд с внешними свойствам:! микроорганизмов, например, с вирулентностью патогенной культуры, ш исследовали культурн микобактерий методом УФ РКР на разшх стадияг роста: логарифмической (X), стационарной (II) к отмирания (III) при возбуждении спектров на длине волни 252км. При анализе спектров исходили из следукхцих носилок. ©изико- химические изменения -п клетке отражаются на характеристиках кмкроокружения хромофоров к, следоъательно, но изменении величины вклада отделышх колебателышх мод в спектры УФ PHP. Обнаружить эти изменен«): в спектргпьнцх характеристиках и было целью

исследования.

При возбуждении на длине волны 252 нм УФ РКР спектры бактерий представляют собой суперпозицию сигналов ДНК и РНК различных типои, а такхе свободах нуклеотидэв (Spiro Т.G. ,1986). Из практических исследований куклеотидннх. основан^ (там жз) известно, что пр>-переходе пуклеотиднах молекул во вторичную структуру нокг-геается интенсивность колебаний круговнх пуринов^" и пириг-лидкнорцх не; оа счет известного иффог.та пшохроицзма -резон&негшх илектр'ошии переходов. Ирк ото;.1, частота колебаний изменяется мало, Б то ::;с ърамк колгботел;,:;:::; частот,- ассоциированнио с карбо!мльт-?я: : емзднымд группа-.::, пуригюииг. и гарнылдиловц- ocHotcjüut. преобразовании вторичной огруктугн ксмзняитск значительно, что обусловлено, й основное, образование:.: водородных связей чззф* основаниям;-..

Б результате анализа спеарои УС' FKi i—oöaKTepiö; на разш/я стадиях роста установлено» что прк пэро'.о/,-') клеток ко состояний замедленного роста (стадия III) ь состояние проли&ерацш (стадии I

отличной частотой к интопо::а:1осгьа(рь'с.5). Показано, Ч7с на стадии III силы водородных связей кзкду основаниями нукл-'.шових k»«wk»t клетки OAiUiüüoDii. IIa Cj&sä I и II в клетках содержится час гь пуклоотпдшх иолокул, обьед»лотшх ¡-.¡¿г.ьшсГ. c;<iv;K ; ©дородная.

IG

Рис.5.Спектры УО FKP '.{.avium на трех стадиях роста:

логара^лапеской (I), стационарной (II) и отмирания (III) з области -1-1

спектра 1550см . - 1?00см при возбуждении на длине волны 252 им.

связей, а другая часть молекул при переходе от стадии III не изменяет величину стэкинга.

По характеру изменений интенсивности лшшй луклеотидного компонента по абсолютной и относительной величине показано, что при переходе клетки из состояния покоя в состояние активного роста концентрация данных макромолекул в расчете на клетку меняется незначительно. Установлено, что динамика перехода молекул ДНК п РНК в новую структуру, а также скорость образования новых молекул

имеет индивидуальный для каждой культуры хар&ктер. Например, микобаятерии вида aviu:r, имиюу более резкий но времени переход от стадии пролиферации к стадии покоя. Для ' них уже на стадии II заметно увеличение стэкинга пуклеотпднах оснований.

В данной работе также показано, что при изменении состояния клетки происходит изменение свойств внутриклеточной среды (ионной силы, рН и т.д.). Причем наиболее значительные изменения происходят при переходе от стадии II к стадии III.

Проведенные исследования изменений структуры макромолзгсул клетки после воздействия 7-облучзипя и 1гри изменения гкизнешюго состояния клетки позволяют утверждать следующее:

1 .Изучение структурных ' перестроек в состаае целой клетки можно проьодить методом спектроскопии У® РКР.

£.Метод спектроскопии УФ РКР чувствителен к состоянии и микроокру:::епиа боковых цепей ароматических аминокислотных остатков . и амидиых связей полшептидов белков, г. также к состоянию и мнкроскружепию связей карбонильных п акздних групп куклеотидных оснований. Это позволяет изучать изменения состояний нативных макромолекул. saiEoñ клетки при различных условиях ее существования.

3 22?H!Í92£SH • к диссертационной • работе кратко дан анализ полученных результатов. В соответствие с концепцией влектронно-конформациотых взаимодействий обьяспена связь изменений спектрялььых характеристик с элементарными взаимодействиями биомолекул. Сформулирована тактика использования метода спектроскопии У& . РКР для Сиодетекцки и идентификации микроорганизмов in vivo.

ВЫВОДЫ

1.Разработаны подходы использования спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идентификации микроорганизмов in vivo. Для практического осуществления. разработки впервые сконструирована експериментальная установка для спектроскопии УФ FKP бисмолекул и микроорганизмов, на базе модифицированных приборов отечественного производства.

2.Разработана методика исследования гзшых культур

микроорганизмов с помета спектроскопия У5> РКР. Обоснован выбор оптимальных условий возбуздепия и регистрации спектров УФ РКР, позволяющих сохранить иатигиоеть образцов в процессе измерения.

3.Впервые исследованы спшстры УС' РКР 15 культур микобнктерчЛ in vivo iî обнаружена корреляция меиду относительной интенеивгоетм отдельных линий з спектре УФ РКР • и концентрацией бактериальных иошонептоь (ароматичэ ских егсягоккело?» нуклэотпдшх осиолаяпА, липидов), что испольгозапо дат аденткфикэцпа микроорганизмов разных видов. Установлено, что тонкпп структура профиля группы лшшй в области спектра 1300- 1400см~' снсокоспешфгша для микроорганизмов разных видов.

4.Методом спектроскопии VZ>. Fît? уставовпена взаимосвязь процессов жизнедеятельности хлетга с одемеитеряима електроино-копформациокиыми взаимодепстгия!.П1 ее Сиомолекул.

5 .Установлено, что при "¡'-облучении клеток происходит изменение физико- химических характеристик внутргклеточпой среда (ионной силы.рН ), что приводят к изменения вклада енталмпгя водородных связей белков в свободную энергия связанкых с ht-lvu субстратов, а также формирована» полггпептвдов в упорядоченные а-спиррльние структуры, количество которых пропорционально дозе об лучекил.

б.При исследовании спектров УФ РКР ыпкобактеркй на рязних стадиях роста установлена корреляция между количеством нуклеотидкых молекул с меньсим стйкелгои и стадией роста клетки. Обнаружено, что часть иуклзотидпых молекул не изменяют величины стэкинга на всех стадиях развития культуры.

Оспозшэ результат;! по теиз • днссартецци изложены в следуй^:« работах:

1.Татариноп Л.П. Применение метода спектроскопии комбинацион£Ю1'о рассеяния для прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза //Иимерительнаяи вычислительная техника в управлении • производо-гьешшми процессами в АПК: Материалы Всесоюзной конференции. -Л.: АОМ, 1988. --С.55.

2.Та?аринов А.П., Феофанов A.B., Околедов Б.'Л, и др.

Спектроскопия резонансного нсмбшгцлошгаго рассеяния света и ультра ¡игодеголой области для определении нуклеотидеык основаш.п рззгахх нтамэ.»Е мжобактеряй.//6юллитепь ВКЗБ .- М.,1990. вып.73-74.

З.УФ резонансные спектры КР микобактерий туберкулеза/ A.II.Татарииов, Е.С.Мартынова, В.И.Околелов, В.3.Пащенко, ■ П.Р.Набиев //Сибирски," вест, дельхоз. науки. -1990. -11-1 -С.61 -66.

4.0кол6лоб В.Я., Татар;шсв Л.П., Мартынова S.C. Применение oneiCTpocKoriiUi коыбкнациошюо разееяшн: для идентификаций: к;п:обактерпй.//Разработка средств и методов борьбы с туберкулезо;,1 животных: Сб. науч.тр. / ВАСХЮШ. ШШЗЕ&. -Новосибирск, 1990. -С.33 -44.

5.С<есфаноа Л.П., Окололов В.П., Татарию:; А .П., п др. СелекиизшЛ: анализ нуклеиновых кислот в составе млсобектер,:^! пз дашшы сиектроскогвсп резонансного КГ// Курнал пр;и:ладноГ: спектроскопии . -1991. -т.5Е>,1!3. -С.410 -417.

б.Окололов В.П., Татарииов А.П., Мартынова E.G., Пащенко 13.Б., Насиев И.Р. Идентификация ьсгкобактеруП лазерной спектроскопией //Ветеринария. -1991 -Н2. -C.2S.

7.FasoUenko V.Z., Feofonov A.V., Tatarinov А.P., et.al. UY -resonanoe raraan spectroscopy of mycobacteria// The 1-et Int. biophiBioB oongresc and biotechnology at GAP, Turkiyc. -1991. -Abstracts. -P.109.

в.Татариноа А.П., Мартынова Ё.С., Сштцкая Т.О. и др. Оптимально дозы гамма;- инактивации кикобактерий. // Система мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных зшвотных: Сб. науч. тр. -Новосибирск, 1991. -С.128 -143.

9.Татарииов д.П. Спектрометр УФ РКР биообъектов./Совргмсшше методы борьбы с бруцелл-ззом и туберкулезом животных// Сб. науч. тр. ВНИИБТЕ,- Омск, 1992. - в печати.

S«hisi (оа огви