Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УГЛЕВОДНЫЕ АНТИГЕНЫ И ИХ ВКЛАД В СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "УГЛЕВОДНЫЕ АНТИГЕНЫ И ИХ ВКЛАД В СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM"



На правах рукописи

МЛТОРЛ Лариса Юрьевна

УГЛЕВОДНЫЕ АНТИГЕНЫ И ИХ ВКЛАД В СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА ЛгОБРИиЬШМ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Т. М. Тараненко

доктор биологических наук с.н.с. Т.С. Каледина

доктор биологических наук профессор В.И. Панасенко

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии (г. Санкт-Петербург — Пушкин)

Зашита состоится «22» декабря 2004 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146,01 при Институте биохимии и физиологии растений н микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан « /Л » ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Бактериальная поверхность представляет собой сложную комбинацию разнообразных иммуногенных компонентов, и точное устройство этой антигенной мозаики часто зависит от условий культивирования организма, так же, как и от его генетического потенциала. Это не статичная, строго очерченная химическая структура, ее состав может являться отражением условий, в которых организм обнаруживается в какое-то определенное время (Freer, 1985). Понимание свойств поверхности требуется для адекватного контроля над такими процессами, как бактериальная адгезия, адсорбция и клеточное разрушение. Изучение поверхностных структур, вовлеченных в контактные взаимодействия микроорганизмов с растениями, обоснованно занимает одно из центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений (Dazzo and Brill, 1979; Kato et al., 1980; Noel, 1992; Smit et al, 1987, 1989; 1992; Hrabak et al„ 1981; Whatley et dl., 1976; Matthysse ei al„ l98I;Newman et ai., 2000 и др.). Компоненты клеточной поверхности рассматриваются также в качестве важных хемотаксо комических маркеров для идентификации и классификации бактерий (Hancock and Poxton, 1988).

Хорошую перспективу при исследовании поверхностных бактериальных структур имеют подходы с применением методов иммунохимии (Кэбот и Мейер, 1968; Кульберг, 1985; Kabat, 1976; Westphal et al., 1983). Однако число работ с использованием подобных приемов при исследовании представителей почвенной микрофлоры ко времени начала наших исследований было сравнительно невелико. В том числе это касалось бактерий р. Azospirillum (Döbereiner and Day, 1976), которые, благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяйственных растений, на протяжении последних трех десятилетий являются модельным объектом в исследовании феномена растительно-микробной ассоциативности. Изучение деталей строения их бактериальных структур, являющихся основными поверхностными антигенами, представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность выяснить, как в целом организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы для создания биоспецифических зондов при экологических и таксономических исследованиях азоспнрилл.

Среди мажорных антигенов бактериальной поверхности азоспирилл как грамотрииательных микроорганизмов особый интерес представляет липополиса-харид (ЛПС) или О-антиген. Строение его О-спеи и ф и ч ее кого полисахарида (О-ПС) определяет нммунохимическую специфичность микроорганизмов, что служит основой для их надежной внутривидовой классификации (Staub et al., 1959; Westphal et al., 1983). К моменту начала нашей работы не существовало развитой системы серологической классификации бактерий p. Azospirillum и отсутствовали сведения об антигенной специфичности их ЛПС как наиболее важного хемо-таксономнческого критерия. Данные углеводные важными детерминантами, участвующими в npouei ния» при формировании ассоциативных взаимоотж

структуры являются1 также :ах мал<А$Яйрй6?{А«узнава-

Äft доедедшФгод*

но H-3S20!

2001). В этой связи представляют интерес сведения о степени гегерогенностн и о химическом строении и локализации их антигенных детерминант (эпигонов), позволяющие сулить об «архитектуре» поверхности клеток азоснирилл. Сочетание результатов иммунохичического анализа различных ЛПС с результатами их спектроскопических исследований может дать основания для заключения о принципиальных различиях (или сходстве) в обшей химической структуре О-спеиифических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий. Кроме того, несомненный интерес представляют результаты сравнения иммунохимиче-ской специфичности ЛПС и капсульных полисахаридов (КИС), на основании которых можно делать вывод о наличии или отсутствии индивидуального кап-сульного антнгена (К-антигена) у бактерий p. Azospirillum, что является принципиально важным фактом при построении системы серологической классификации данных бактерий.

После получения доказательств глнкозилированности флагеллина полярного жгутика у различных бактерий (Doig et al., 1996; Brimer and Montie, 1998; Wyss, Î998 и лр.) стало очевидным, что спектр углеводных антигенов бактериальной поверхности должен (или может) расшириться за счет углеводных компонентов жгутика как Н-антигена. И связи с этим представляется актуальным выяснение иммунохимичсской специфичности углеводных структур, выявленных в составе полярного жгутика азоснирилл (Moens et al., 1995), и ее сравнение с иччунохичическичи характеристиками ЛПС и капсульных полисахаридов.

Выяснение влияния R-S диссоциации, t характерной для бактерий р. Azospirillum, на иммунохимическнс свойства их клеточной поверхности представляется нам весьма значимым фундаментальным аспектом, позволяющим полнее выявить закономерности бактериальной колониально-морфологической изменчивости и расширить представления о «динамике» и изменчивости бактериальной поверхности. Среди проблем, связанных с оценками возможных функций ЛПС азоснирилл в реализации растительно-микробных взаимодействий (связанных, в частности, с их экологическим поведением в прикорневой зоне), видное место занимает изучение способности ЛПС стимулировать явления агрегации разнообразных клеточных суспензий.

Ключевыми методологическимп аспектами в практике нммунохичическо-го анализа являются проблема получения специфических антител как основного исследовательского «инструмента», а также разработка эффективных процедур выделения бактериальных антигенов.

Целью настоящей работы было изучение углеводных антигенов бактерий р, Azmpirlllum и опенка их вклада в архитектуру клеточной поверхности бактерий.

В данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать эффективные методики получения моноспецифическнх антител, обеспечивающих направленный скрининг углеводных антигенов клеточной поверхности азоснирилл.

2. Выполнить сравнительное изучение антигенных свойств и установить состав антигенов для л што полисахаридов и внеклеточных пат и сахар и лов мо-

дельных штаммов A. brasileme.

3. Оценить изменения в структуре ЛПС типового штамма A, brasíleme при R-S диссоциации,

4. Исследовать иммунохимнческую специфичность ЛПС типового штамма Л. br asílense.

5. Провести сравнительный серологический анализ различных штаммов азоспирилл с использованием антител, специфичных к углеводным антигенам их клеточной поверхности.

6. Сравнить иммунохимнческне и спектрофотометр и чес кие характеристики JHIC штаммов азоспирилл, принадлежащих к различным серотипам.

7. Оценить иммунохимнческую специфичность углеводных фрагментов гли-koíi тнрован но го флагеллина полярного жгутика азоспирилл.

8. Провести исследования агрегаиионных эффектов бактериальных ЛПС в клеточных суспензиях азоспирилл и молельных клеточных суспензиях.

9. Оптимизировать способ получения высокоочишснных препаратов ЛПС,

Научная новизна работы определяется ее следующими основными результатами:

• Впервые выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов штаммов A. brasileña; Sp7 и Sp245, сопровождающаяся отсутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена. Оценен вклад отдельных О-специфических полисахаридов в формирование кап-сульного и э кзопол исахар и дно го слоя.

• Описан новый характер микробной R-S диссоциации, обусловленной изменяющимся вкладом двух О-антигенов в архитектуру клеточной поверхности в зависимости от возраста культуры.

• Впервые получены данные о моносахаридном составе эпигонов и ссротнпе типового штамма A. br asílense Sp7.

• Обнаружено, что разные О-спеинфические полисахариды, определяющие гетерогенность ЛПС А. brasilense Sp245, отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий на лабораторных средах.

• У молельных штаммов A. brasilense впервые выявлено наличие прочно связанного чехла (лнпо)полисахарндной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика.

• Установлено, что углеводные фрагменты гл и «оптированного флагеллина полярного жгутнка типового штамма A. brasih'fise Sp7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

• Впервые систематизированы структурообразующие свойства ЛПС азоспирилл в клеточных суспензиях.

Практическая значимость работы.

В работе предложен эффективный способ иммунизации животных целыми клетками, обработанными глутаровым альдегидом, обеспечивающий получение моноснсиифичсских антител на бактериальные ЛПС, демонстрирующих

штамм овую специфичность. Сослана биотест-снстема серологической идентификации бактерий рола А:<крт!1ит, учитывающая иммунохимичсские особенности их линополисахарнлных антигенов. Разработан новый способ получения высокооч пшенных препаратов ЛИС, защищенный патентом РФ.

Полученные данные, характеризующие особенности антигенного строения клеточной поверхности азоснирнлл, могут способствовать разработке адекватных представлений о механизме ассоциативных взаимоотношений между растениями и почвенной микрофлорой. Выполненная в работе идентификация О-спепифического полисахарида, гомологичного по составу основным внеклеточным структурам А. ¿пш'/еш?, обеспечивает целенаправленный поиск эффективных биосиеиифичсских зондов при проведении цитохимических, таксономических и экологических исследований азоспирилл.

Результаты диссертационной работы применяются при проведении научных исследований в Лаборатории генетики, Лаборатории бпосенсоров на основе наноразмерных структур, Лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и др. Они используются автором при проведении лекшюнных занятий по курсу «Основы аналитической иммунохимии» к практических занятий со студентами, подготовке ими курсовых и дипломных работ в Учеб но-научном центре физико-химической биологии Саратовского госуниверситета и ИБФРМ РАН. Материхтм диссертации использованы при написании методического пособия «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.). Основные положении, выносимые на защиту:

• Предварительная обработка клеточной поверхности глутаровым альдегидом исключает иммунный ответ на нативные мембранные белки и обеспечивает синтез антител на углеводные соматические бактериальные антигены. Получаемые при этом антитела имеют штаммовую специфичность.

• ЛПС штаммов А. ЬгазИсте 5р7 и Бр245 обладают выраженной иммунохимн-ч ее кой гетерогенностью, выражающейся в наличии двух фракций О-антигена, регистрируемых в составе бактериального ЛПС.

• диссоциация типового штамма А. ЪгаъИсже 5р7 имеет нетипичный характер. В этом случае не происходит кардинальных изменений в структуре О-спепифических полисахаридов, а изменяется лишь их антигенность.

• Иммуноломинангными моносахаридами в составе антигенных детерминант л и полол и сахар ила штамма Л, ЬгазИеюе Эр7 являются галактоза и рамноза.

• У штаммов А. ЬгазИете Бр7 и 5р245 отсутствует индивидуальный капсуль-ный антиген, а капсул ьный слой и экзополисахарид иммунохимическн идентичны одному из двух О-спе пифических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий.

• Полярный жгутик бактерий рода А:о$р!гШит покрыт чехлом (ли-по) полисах аридной природы, ассоциированным с поверхностью флагеллы и обладающим экранирующим эффектом.

• Н-ашнгсн демонстрирует наличие антигенных перекрёстов у представителей видов A. brasilense и A, lipoferum. Углеводные фрагменты гликошлнроианкого флагедлина полярного жгутика штамма A. brast'¡eme Sp7 антиген но идентичны фрагментам соматического антигена.

• Спектры поглощения света препаратами ЛПС имеют характерные отличия для серологически различных штаммов, а изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелируют с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

• Препараты ЛПС азосиирилл проявляют различные типы структурообразующих эффектов в суспензиях растительных, бактериальных клеток и эритроцитов.

• Обработка протеиназоЙ К высокомолекулярного ЛПС-содсржашего комплекса, экстрагированного из наружной мембраны азосиирилл, обеспечивает получение высокоочишеиных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих эффективное разделение при электрофорезе в полиакриамидном геле (ПЛЛГ).

Лпробаиня работы. Основные наложения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на VIII Всесоюзной конференции «Химия и биохимия углеводов» (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); И Всесоюзном семинаре «Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов» (Саратов, 1991); VIH Восточноевропейском симпозиуме по биологической азотфикса-шш «N¡trogenfix'92» (Саратов, 1992); I Европейской конференции по азотфикса-шш (Сегед, Венгрия, 1994); VI Рабочем совещании «Azospirillum и родственные микроорганизмы» (Шарвар, Венгрия 1994); IX Баховском коллоквиуме по азот-фиксашш (Москва, 1995); X Между народном конгрессе по азотфиксаинн (Санкт-Петербург, 1995); VIII Международном конгрессе по молекулярным растигель-но-мнкробным взаимодействиям (Ноксвилл, Теннеси, США, 1996); II Европейской конференции ио азотфиксаиии (Познань, Польша, 1996); XI Международном конгрессе но азотфиксаиии (Париж, Франция, 1997); III Европейской конференции по азотфиксаиии (Люнтерен, Нидерланды, 1998); X Международном Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002); XI Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям растений и микроорганизмов (Санкт-Петербург, 2003); Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений в условиях техногенных загрязнений» (Саратов, 2003); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004), а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 23 нюня 2004 года.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 53 работы.

Структура н о бьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, восьми глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов и сии-

ска цитируемой литературы, включающего 459 источников. Диссертация нио-жена на 266 страницах машинописного текста, содержит 62 рисунка и 6 таблиц.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (Кг roc, per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н., профессор Щсго-лев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Создание эффективной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксируюших бактерий, ассоциированных с высшими растениями», выполненному в соответствии с Госзаказом от Миннауки РФ в рамкач ГНТП «Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии» (Распоряжение № 816ф от 15.03.95 г. и последующие, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголе в С.Ю.), Работа поддержана фантами Комиссии РАН по работе с молодежью но итогам конкурсов 2002-2004 г.г. по поддержке базовых кафедр и филиалов кафедр, созданных при институтах РАН, грантом Президента РФ № Н111-1529.2003.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ, грантом Саратовского Международного центра перспективных исследований 98-4-04, грантом INTAS 96-1015 и грантами NATO LST.CLG 975040 и LST.EV 980093.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы, состоящем из 5 разделов, дано описание бактерий рода AzospirtUum как модельного объекта в исследованиях эффектов ассоциативности; изложено строение наружной мембраны трамотрииательных бактерий; дана подробная характеристика дипонолисахаридов как мажорных компонентов мембраны и важнейших углеводных антигенов (О-ангигенов); приведено описание антигенных свойств и структуры капсульных полисахаридов (K-антигенов) и полярных жгутиков (Н-анти ге но в); проанализирована роль поверхностных структур микроорганизмов в расти гель ном нкробных взаимодействиях и в про* нессах бактериальной агрегации; дано описание иммунохимичсских подходов в исследовании поверхности почвенных бактерий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной главе приводится характеристика использованных в работе бактериальных штаммов и мутантов. Описаны методики получения антител (Ат), препаратов углеводных антигенов (Лг) и препаратов полярного жгутика азоспи-рилл. Дано описание экспериментов, основанных на иммунопренипитаиии. Приведены методики денатурирующего электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга, и мм у нофер ментного анализа (вариант ELISA), дот-анализа целых клеток, имму-ноэлектронной микроскопии и ралиоинликаторного анализа. Описано использование конкурентного иммуноанали за при опенке строения углеводных эпигонов бактерий и определения иммунохимической активности О-ПС с применением

метола спектротурбидиметрин. Дано описание методики опенки подвижности бактериальных клеток. Описаны приемы исследования агрегации клеток в суспензиях, агглютинации эритроцитов и фазового разделения их суспензий.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Разработка способа получения моноснецнфическнх антител на О-антигены и модификация способа выделения высокоочшценных препаратов J1 ПС

3.1.1. Опенка эффективности иммунизации животных целыми бактериальными клетками, обработанными бифункциональным реагентом. В

работе предложена новая методика иммунизации целыми бактериальными клетками, позволяющая получать антитела на углеводные антигены бактерий, минуя стадии термической обработки клеток и дополнительной очистки антисывороток. Предлагаемая методика заключается в иммунизации животных отмытыми от капсулы бактериальными клетками, обработанными 2%-ным раствором глу-тарового альдегида (ГА). Установлено, что антитела к клеткам, обработанным ГЛ, в отличие от антител к ингактным клеткам, не взаимодействуют с белками, входящими в состав экстракта бактериальных мембран, образуя четкую линию преципитации с л inioi юл исач аридной фракцией (О-антигеном) (рис. 1). Результаты сравнительного анализа антител на хроматографически очищенный препарат ЛПС штамма Cd с антителами, полученными с помощью предлагаемого нами способа, подтверждают, что иммунизация животных целыми бактериальными клетками, обработанными ГЛ, приводит к получению высокоспсцифичных антител на ЛПС исследуемых бактерий. При этом в отличие от антител к ингактным клеткам, они демонстрируют штаммовую специфичность (рис. 2). Четкая перекрестная реакция, сравнимая с прямой реакцией по интенсивности, наблюдается только лля близкородственных штаммов (на рис. 2 - для штаммов Cd и Sp7).

Данный способ иммунизации успешно апробирован на других грамотри-цательных бактериях. В частности, получены специфичные антитела к штаммам Agrobucterium radiobacter Р221 н 5D-I. Кроме того, имеется положительный опыт получения специфичных антител к углеводным антигенам клеточной поверхности трамположительных бактерий на примере штамма Rhodococcus maris ЛМЗ.

s -W-i

•1 Щ-

1 Л

tJ r i

V щ

f (® i

1 k ? i. -

3

i j f;

i t

Рис. 1. Результат линейного иммуноэлектрофо-реза экстракта наружных мембран штамма Сс1 с гомологичными антителами, полученными к обработанным ГЛ (1) и к интактным (2) клеткам.

3.1.2. Обсуждение возможного механизма ингнбирования глутаровым альдегидом иммунного ответа на натнвные белко* вые поверхностные антигены. Механизм ингнбирования глутаро-вым альдегидом иммунного ответа на нативные белковые поверхностные антигены связан, по нашему мнению, со способностью ГА взаимодействовать со свободными аминогруппами в белках и с химической бифункциональностью этого реагента. Мы установили, что способность ГА перекрестно сшивать белки не только исключает иммунный ответ на нативные белковые антигены, но также обеспечивает устойчивость фиксированных клеток к их разрушению иод влиянием таких химических соединений как додеиилсульфат натрия (ДСН) и 2-меркаитоэтанол, являющихся компонентами буфера для приготовления образцов для денатурирующего электрофореза. Показано, что стандартная процедура получения клеточного ли-зата, заключающаяся в кипячении бактериальных клеток в буфере для образцов, в случае предварительной обработки раствором ГА не приводит к разрушению клеток. Можно предположить, что активация глутаровым альдегидом, модифицируя белковые эпитоиы, исключает иммунный ответ на нативные мембранные белки, и, одновременно с этим, перекрестно ешквая их, обеспечивает более длительную псрсистеннию бактерий в ходе иммунизашш. При этом бзктсрии могут более эффективно исполнять рать корпускулярных адьювантов иммунного ответа, что приводит к получению ант и сыворотки, демонстрирующей высокий титр О-снецифических антител. Титры антисывороток против обработанных и ин-тактных клеток составляют 1:20000 и 1:5000, соответственно.

3.2. Модификация способа получения высокоочншенных препаратов ЛПС. В основу предложенного нами способа быстрого получения высокоочи-шенных препаратов бактериальных л и по полисахаридов легли два различных метода выделения ЛПС. Первый из них основан на экстракции ЛПС из бактериальной мембраны с помощью хелзтирующего агента ЭДТА в Трис-HCI буфере (Leive et at., 1968). При использовании второго метола высокоочишенный, не содержащий белка препарат ЛПС получается в результате обработки предварительно литерованных бактерий высокоэффективным иротсолитическим ферментом протеиназа К (Hitchcock and Brown, 1983).

Предложенный нами упрошенный способ получения высокоочншенных бактериальных ЛПС заключается в протеиназной обработке не лизата бактерий, а солюбилизата их наружных мембран. Данный способ позволяет упростить процедуру выделения чистого ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных

©С ©Э4

©■£> О -О

Л в

Рис. 2. Результаты иммунодиффузион-ного анализа экстрактов наружных мембран штаммов А. ЬгшНеюе С(1 (1), Эр245 (2), Бр7 (3), Ш125Л2 (4) и 5р 107 (5) с антителами к штамму Сс1, полученными к интактным (А) и обработанным ГА (Б) клеткам.

клеток в присутствии ДСН, что обеспечивает отсутствие примесей этого соединения в получаемом препарате ЛПС. Кратко предлагаемый способ состоит в следующем. Бактерии выращивают на соответствующей питательной среде при оптимальной температуре культивирования до логарифмической фазы роста. Затем их отделяют от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстрагируют из них комплекс, состоящий из лмпололисахарида и белка, путем добавления к клеточной массе буферного раствора, содержащего ЭДТЛ в количестве 0.01 - 0.05 мМ на 1 г влажных клеток. Экстракт отделяют от интактных бактериальных клеток с помощью центрифугирования и добавляют к нему протеиназу К до конечной концентрации 80 мкг/мл. Данную смссь ннкубируюг в течение 60 мин при температуре 5б-60°С. Получаемый ЛПС используют как в растворе, так и после выделения его из раствора с помощью стандартных процедур осаждения.

Препарат ЛПС, полученный с помощью предложенного нами способа, образует Солее чёткий трек при электрофоретическом разделении, чем препарат ЛПС, полученный при протеиназной обработке целых клеток (рис. 3 Л). При этом ЛПС, полученные всеми тремя способами, идентичны с нммунохимической точки зрения (рис, 3 Б).

Следовательно, в результате протеиназной обработки экстракта наружной мембраны, полученного экстракцией ЭДТЛ, мы получаем препарат ЛПС, применимый для анализа в ПЛЛГ и демонстрирующий при электрофорезе более чёткое разделение. При этом данный препарат ан-тигенно идентичен ЛГ1С, выделенному из бактериального лизага, но выгодно отличается простотой получения. Выделенный описанным способом препарат, благодаря отсутствию трулноулалимых примесей ДСН, может быть использован не только в злектрофоретиче-скнх экспериментах, но и в широком наборе микробиологических, биохимических и иммунологических исследований.

А-.

■ -■У

Ж

А Б

Рис. 3 Л. Результаты электрофореза в ПЛЛГ препаратов ЛПС 5р245, полученных протеиназной обработкой бактериального лизата (1), экстракцией из целых клеток с помошью ЭДТЛ (2) и протеиназной обработкой экстракта, выделенного с помощью ЭДТЛ (3). Б. Результаты нммунодиффузионного анализа данных препаратов с Лт на ЛПС Бр245,

Глава 4. Иммунохпмнческий анализ ЛПС молельных штаммов

ЛгоьрпШит ЬгжИете 4.1. Анализ строении О-антнгенных летерминант типового штамма А. ЬгаьИепъе 5р7. По результатам химического анализа в составе ЛИС типового штамма А. ЬгаяНете Эр7 было выявлено несколько О-ПС (Жемеричкин с соавт., 1989). Для оиенки им м у нохим и ч ее кой активности отдельных фракций О-ПС мы применили известный подход с использованием эффекта торможения процесса образования нерастворимых комплексов Ат+ЛПС при добавлении к смеси реагентов «конкурентных» фракций О-ПС с заранее определенной структурой (Кэ-бот и МеЙер, 1968; КаЬш, 1976, 1980). При этом оказалось возможным усовершенствовать традиционную процедуру, используя способность О-ПС даже при малых концентрациях (менее 2 мкг/мл) образовывать нерастворимые комплексы со специфичными антителами. Последние, таким образом, могут быть удалены из раствора, например, центрифугированием. Мы определяли концентрацию преципитата, образующегося при взаимодействии препарата суммарного ЛПС, выделенного с поверхности бактерий, с антителами в растворе, истощенном предварительной обработкой исследуемым О-ПС. По уменьшению концентрации образовавшегося преципитата (по сравнению с таковой, полученной при использовании неистощенного раствора Ат) судили об иммунохнмической активности данного О-ПС.

На рис. 4 приведены результаты спектротурбидиметри-ческого определения концентрации С иммунных комплексов ЛПС+Ат до истошения (данное значение С было принято за 10044) и после истощения растворов антител одним из О-ПС данного штамма, чей моносахарид-ный состав был определен в работе Жемеричкина с соавторами (1989). Можно констатировать, что этот О-ПС связывает примерно до 50% антител, полученных против целых клеток А. ЪгазИепье 5р7. Эта оценка согласуется с наличием у данного штамма О-ПС, более детально исследованных нами в экспериментах, представленных в следующих разделах. Полученные результаты были сопоставлены с данными независимого метода — ингибирования реакции преципитации в геле. В результате иммуно-лиффузионного анализа был зарегистрирован выраженный ингибируюший эффект исследуемого О-ПС.

Рис. 4. Влияние истощения растворов антител фракцией О-ПС на массово* объемную концентрацию С частиц иммунных комплексов ЛПС+Ат в зависимости от концентрации Со.цс полисахарида.

Мы провели оценку валентности данного О-ПС, т.е. числа детерчинант-ных групп (или мест связывания антител) в расчете на одну молекулу антигена. Это число устанавливали методом Кэбота (Кэбот и Мейер, 1968), определяя молярное отношение Лг/Лт в преинпитатс в зоне эквивалентности (максимума кривой осажления). Анализ состава преципитата показал, что отношение малярных концентраций О-ПС и Ат составляет приблизительно 1:6. При данных вычислениях значения молекулярной массы антител и полисахаридов принимали равными 160 К Да (Кэбот и Мейер, 1968) и 15 КДа (Жемеричкин соавт., 1989), соответственно. Допуская, что оба активных центра Ат связаны с детерминантами полисахарида, можно получить, что в рассматриваемой молекуле О-ПС ичеется 12 мест связывания с антителами. Эти оценки согласуются с числами мест связывания, приведенными в литературе для других микробных полисахаридов с близким химическим составом и молекулярной массой (Кэбот и Мейер, 1968; Соловьева с соавт., 1986).

Нами оценен ингибируюший эффект моносахаридов, входящих в состав исследуемого О-ПС — галактозы, галактуроновой кислоты и рамнозы. Для сравнения в качестве ингибиторов были использованы также глюкоза и мальтоза. Концентрацию моносахаридов Ю^М выбирали с заведомым избытком но отношению к концентрации специфических антител. Оптимальное соотношение концентраций Лг и Ат для последующего построения традиционных кривых осаждения подбирали с помощью метода спектротурбиднчетрии. Результаты, представленные на рис. 5 показывают, что по убыванию степени торможения иммунохимичсскнх реакций данные моносахариды можно расположить в следующей последовательности: галактоза (кривая 3), рамноза (кривая 4) и глюкоза (кривая 5), Галакту-роновая кислота практически не оказывала влияния на полноту осаждения комплексов Л ПС+Лт, и кривая осаждения для Ат, обработанных этим моносахаридом, фактически совпадает с контрольной кривой осажления для необработанных Лт (кривая 6).

Следует отметить, что, несмотря на избыток концентрации ингибирующих моносахаридов, степень торможения, характеризуемая уменьшением С, составляет, например, для рамнозы и галактозы лишь около

Рис. 5. Зависимость концентрации преципитата С в смеси ЛПС + Ат от концентрации антигена Сдцс при добавлении до 10"4 М галактозы (3), рамнозы (4), глюкозы (5) и галактуроновой кислоты (6) в сравнении с контролем (растворы Лт без моносахаров) (6, темные ромбы).

30440%. Однако, эти значения близки к результатам, приведенным в литературе для лругих систем с низкомолскулярными ингибиторами реакций ЛПС + Лт (Мпп ап(] \Уе51рЬа1, 1975), не превышающим, как правило, 50%. Можно предположить, что существование предела степени ингибирования связано с тем, что терминальным моносахаридом блокируется только часть объема активного центра антител, рассчитанного на большую по размеру детерминанту.

В качестве независимого метола для сравнительного анализа ингнбиру-щей активности моносахаридов использовали двойную радиальную иммуно-лиффузию. Добавление к раствору Лт галактозы и рамнозы приводило к существенному ослаблению линий преципитации по сравнению с контролем (без добавления моносахаридов). Таким образом, и в этом случае эффективными ингибиторами для реакции между ЛПС Л. ЬпкИепье 5р7 и антителами являются галактоза и рамноза, что свидетельствует об их доминирующем положении в составе антигенных детерминант. Следовательно, именно эти моносахаридные остатки вносят определяющий вклад в ссротип данного микроорганизма, представляющий собой всю совокупность О-антигенных детерминант, выявляемых в серологическом акал изо.

4.2. Выявление нетипичного характера Й-в диссоциации штамма А. ЬгжНете 5р7. Явление колониально-морфологической изменчивости или диссоциации бактерий известно с 20-х годов прошлого века как своеобразная форма изменчивости, в основе которой лежат мутации, и изучено, главным образом, на примере патогенных бактерий. Согласно традиционным представлениям о микробной диссоциации, различие между К- и Б-варпантами обусловлено отсутствием О-спеиифических цепей в составе ЛПС И-варианта.

В 1987 г. впервые была обнаружена спонтанная изменчивость морфологии колоний типового штамма А, ЬгазНете Бр7 (Матвеев с соавт., 1987). Было показано, что образование стабильной В-формы штамма 5р7 связано с исчезновением в его плазмидном профиле плазм и лы 115 МДа (р115). Авторы предположили, что р115 может обуславливать диссоциативные переходы у А. ЬгшИете 5р7,

Мы отметили, что по внешнему виду колонии 13-часовых культур Бр7-К и Бр7-5 не отличаются друг от друга, однако по прошествии примерно 72 часов исходный штамм Бр7-Я формирует на твердой среде шероховатые колонии с неровным краем. В тех же условиях колонии мутантного Бр7-3 штамма остаются гладкими и блестящими и не проявляют даже со временем фенотипнческих признаков, характерных для исходного штамма. В этой связи нам представлялось целесообразным проследить за изменением ЛПС Я- и Б-форм типового штамма А. Ъга&Иете Бр7 в зависимости от возраста культур. В работе использовали культуры, выращенные в течение 18 ч на жидкой малагной среде, а также выращенные в течение 72 ч на среде того же состава с добавлением 1,5% агара. Основным инструментом анализа служили антитела на ЛПС, полученные для 18-часовых и 72-часовых культур К- и Э-форм. Однородность культур контролировали по плазмидному составу: наличию (у 5р7-И) и отсутствию (у 5р7-5) в плазмидном профиле р115 (анализ плазмидного профиля по методу Экхардта (ЕскЬагск, 1978)

Tt П

г з

а=

U

Рис. 6. Л. Результаты линейного иммуно-электрофореза препаратов ЛПС, выделенных из 18-часовой Я-формы (2) и из 18-часовой Э-формы (3), с Лт на ЛГ1С 18-часовой фор мы (а), 72-часовоЙ Б-формы (Ь), 18-часовой К-формы (с) и 72-часовоЙ К-формы ((1); В. Результат электрофореза в ПЛАГ препаратов ЛПС, выделенных из 18-часовой И-формы (2) и 18-часовой Б-формы (3).

проводила старший научный сотрудник группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН Л.П. Петрова).

Сравнение результатов иммунизации краткое 18- и 72-часовыми культурами Я-формы штамма Бр7 выявило исчезновение в иммуноэлск-трофоретическоч профиле 72-часовоЙ И-формы одной т двух полос преципитации, выявляемых антителами к 18-часовой К-форме (рис. 6 А, с, (1). Для Б-формы наблюдали обратную картину: одна из двух полос преципитации не выявлялась с помощью антител к 18-часовой 5-форме (рис. 6 Л, а), и только антитела к 72-часовой 5-форме выявляли оба антигена в соста-

ве препаратов ЛПС штамма Sp7 (рис. 6 А, Ь). В то же время, сами препараты ЛПС были идентичны между собой по числу выявляемых (двух) антигенных компонентов (рис. 6 А) и демонстрировали одинаковые электрофоретические профили в ПАЛГ-элсктрофорезе (рис. 6 В). Также было показано, что спектры поглощения продуктов реакции с фенолом и серной кислотой у ЛПС R- и S-форм штамма Sp7 практически совпадают, В соответствии с результатами работы (Dubois el а/., 1956), совпадение этих спектров для исследуемых препаратов свидетельствует о близости их тотального мо-носахарилиого состава.

Следовательно, для штамма A. brasileme Sp7 мы обнаружили нетипичный случай K-S диссоциации, при которой не происходит качественных изменений в структуре полисахарилных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность. Полученные результаты позволили нам предположить, что R-S диссоциация А. brasileme Sp7 состоит в изменении у мутантного S-варианта особенностей синтеза одного из О-ПС, который мы условно обозначали как R-антиген. Второй из двух идентифицированных О-ПС мы обозначили как S-антигсн. В соответствии со схемой, представленной на рис. 7, мы полагаем, что основной вклад в формирование характерной морфологии колоний 72-часовой R-формы, очевидно, вносит R-антиген. Преимущественным синтезом именно этого О-ПС на достаточно поздних стадиях роста дикого штамма и его экранирующим действием по отношению ко второму О-ПС (S-ангигену) можно, по-видимому, объяснить морфологические и иммунологические особенности R-формы A. brasilense Sp7. V 18-

т?т?т?

(^В-форма (^^в-форма 18

Т?

ттт

?

^^^форма 72

ттт?т?

Рис. 7. Предполагаемая схема распределения О-антигенов при Я-Э диссоциации штамма А. Ьпя1-/ете 5р7 (темные кружки - Я-антиген, светлые кружки — Б-антиген).

II

С

часовой Б-формы Я-антиген, очевидно, экранирован Б-антигеном, и заметно иммуногенным этот О-ПС становится только у 72-часовоЙ Б-формы бактерий.

Иммунофермент-ный анализ позволит нам визуализовать Я- и 8-антигены в электро-форетнческом профиле ЛПС штамма 5р7 с помощью антител к ЛПС Б-формы. На рис. 8 можно видеть, что антитела к ЛПС 18-часовоЙ Э-формы четко выявляют Б-антиген и практически не выявляют Я-антиген, в то время как антитела к ЛПС 72-часовой Б-формы выявляют оба антигена в составе ЛПС, поскольку, как было отмечено выше, у старой культуры Б-формы наряду с антигеном иммуногенным становится также и Я-антнген.

Имеется достаточно оснований для заключения о том, что, как Я-так и Б-вариант данного штамма имеют полноценный ЛПС с развитой структурой О-антигена. Переход от Я- к 5-варнанту связан, по нашему мнению, с перераспределением вкладов двух О-ПС (четко выявленных как у исходного штамма, так и у его Б-мутанта) в архитектуру клеточной поверхности бактерий в зависимости от возраста культур и коррелирует с исчезновением из экстрахромосомного состояния шшмилы 115 МДа. 4.3.1. Исследование и м му н о х и м и ч еско ¡1 гетерогенности О-сиеиифических полисахаридов штамма А. ЬтаьНете 8р245. Иммунохимиче> ские исследования ЛПС, выделенных из наружной мембраны бактерий дикого штамма А. ЬгшИете Эр245 и его мутантов с измененной структурой ЛПС,

Л' Ц

5-А г

С-* К-Аг

Рис, 8. Результат электрофореза в ПААГ препарата ЛПС, выделенного из 18-часовой К- формы (А) и визуализация Б- н Я-антигенов в иммуноблоттинге с Лт к молодой Б-форме (В) и старой 5-форме (С).

'4| ' 3*' :

1 < г) (з

Рис. 9. Результат иммуно-диффузионного анализа препаратов Л ПС штаммов Эр245 (1), КМ018 (2), КМ252 (3) и КМ 348 (4) с Ат против ЛПС исходного штамма (А).

позволили установить, что для штамма 5р245 (как и для типового штамма Бр7) характерно наличие двух О-ПС в составе ЛПС, которые мы обозначили как О-ПС1 и 0-ПС2. При иммунодиффузионном анализе (рис. 9) антитела против ЛПС исходного штамма выявляют О-ПС! в препарате ЛПС мутантного штамма КМ018 и 0-ПС2 - в препаратах ЛПС штаммов КМ252 и КМ348. По результатам линейного иммуноэлектрофореза (рис, 10) данные О-ПС отличаются по заряду: 0-ПС1, имеющий анодную подвижность, является кислым полисахаридом, а О-ПС2 — нейтральным. Данные химического анализа подтвердили наличие двух О-ПС в составе ЛПС данного штамма. ЛПС мутанта КМ252 содержал только нейтральный О-ПС, а ЛПС мутанта КМ018 - только кислый О-ПС (Ре(1опепко е! а!., 2002).

Тандемный иммуноэлектрофорез выявил наличие общих антигенных детерминант не только в составе ЛПС исходного штамма и его мутантов (рис. II)

(о чем свидетельствуют сливающиеся пики преципитации), но и в составе фракций О-ПС1 и 0-ПС2 при непосредственном сравнении их между собой. При этом на данных иммуноэлектрофореграммах отчетливо наблюдаются и так называемые шпоры - продолжения линий преципитации, отмеченные стрелками. Наличие шпор, в свою очередь, говорит о том, что в составе 0-ПС2 имеются антигенные детерминанты, отсутствующие у 0-ПС1.

Результаты химического анализа препаратов О-ПС! и 0-ПС2, полученных с помощью кислотного гидролиза, не выявили различий в строении данных структур. ИК- и ЯМР-спектры исследуемых полисахаридов оказались идентичными и го-

Рис. 10. Результат линейного иммуноэлектрофореза препаратов ЛПС КМ018 (1), Бр245 (2) и КМ252 (3) с Ат против ЛПС исходного штамма.

Рис. П. Результат тандемного иммуноэлектрофореза препаратов ЛПС КМ252 (I), 5р245 (2) и КМ018 (3) с Ат на ЛПС исходного штамма.

порят о том, что данные О-ПС представляют собой гомон ол и мер и D-рамнана (Fedonenko et «/., 2002). Сумма полученных результатов подтверждает известное положенно о том, что основную роль в определении серологической специфичности О-антигснов играют не мажорные полисахариды, а так называемые О-факторы или антигенные детерминанты в составе О-ПС (LOderitz, 1966; Staub and Tinelli, 1957; Staub, 1964). lî соответствии с этим, главным отлнчнем 0-ИС2 от О-ПС! следует, вероятно, признать антигенную гетерогенность этого полисахарида, обусловленную присутствием в структуре его цепи, но крайней мере, двух различающихся по химическому строению антигенных детерминант.

4,3.2. Изменение антигенных свойств О-снецифических полисахаридов штамма Л. brasitense Sp245 при модификации условий культ и ни реванш). Различия двух О-спсиифическнх полисахаридов, входящих в состав Ж1С А. brasilense Sp245, ис исчерпываются различиями их антигенных свойств. Мы установили, что данные О-ПС отличаются также по способности к модификации антигенных летерминанг под влиянием внешних факторов. В частности, к модификации, являющейся результатом присутствия катионов Три с в среде культивирования.

Для выделения ЛПС мы, наряду с другими подходами, провод! Li и экстракцию натнвпого ЛПС с поверхности бактериальной клетки с помощью ЭДТА в Трнс-HCl буфере (Leive ci «Л, 1968). В данной методике рекомендуется при выращивании бактерий добавлять в среду культивирования 0.1 M Трнс-HCl буфер, поскольку при экстрагировании ЛПС Трнс оказывается токсичным для клеток, не адаптированных к его присутствию. Токсический эффект Трис заключается, в частности, в повышении проницаемости наружной мембраны бактерий, вероятно, посредством нарушения ионных взаимодействий (Irvin et ai, 1981). До наших исследований в литературе не было сведений о том, что Трис, широко используемый лля приготовления буферных систем, модифицирует тс или иные бактериальные структуры. Анализ возможных антигенных модификаций ЛПС представлялся нам актуальным в связи с известной способностью катионов Трис электростатически взаимодействовать с ЛПС (David et а/., 1994).

Мы установили, что добавление Трис в среду для культивирования азос-пирилл приводит к блокированию взаимодействия отдельных структур в составе ЛПС со специфическими антителами. Па рис. 12 А представлены результаты иммуноднффузионного анализа препаратов ЛИС штаммов Sp245 и KMÛ18 (имеющего только 0-ПС1 п составе ЛПС), выделенных из бактерий, выращенных до логарифмической фазы роста как на среде, содержащей Трис, так н без него. В нммунодиффузионном профиле ЛПС штаммов, выращенных на среде, содержащей Трнс, практически не выявляется полоса преципитации, соответствующая 0-I1C1. Следовательно, Трис, будучи добавленным в среду культивирования, изменяет структуру антигенных летерминанг только т)ного из двух О-ПС штамма Sp245. Рис. 12 А показывает, что подобные изменения картины взаимодействия с ашшелачи у данного 0-I1C не обнаруживаются ни при внесении в среду культивирования 0.1 M H EPH S, ни при замене среды культивирования.

Кроме того, у ЛПС штамма КМ018, выращенного в присутствии Трис, в электрофоре тичес ком профиле в ПАЛГ отсутствует серия полос с молекулярной

41||3

1

3 5

21 аЧ 6

А Б

Рис. 12. Л. Результаты иммунолиффузионного анализа препаратов ЛПС Бр245 и КМ018 с Лт против ЛИС Эр245 (а), I - 5р245, 2 -КМ018, 3 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 4 -Бр245, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 5 — КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М НЕРЕ5, б - КМ018, выращенного на среде ЬВ. Б. Результаты электрофореза в ПАЛГ препаратов ЛПС Эр245 (I), КМ018 (2) и ЛПС КМ018, выращенного на среде, содержащей 0.1 М ТРИС (3).

массой окаю 30 кДа, характерных для дикого штамма и мутанта (рис. 12 Б). В то же время спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС штамма КМ018, выращенного как в присутствии Трис, так и без него, практически не различаются между собой, что свидетельствует о близости их моносахаридного состава.

Таким образом, мы продемонстрировали, что Трис(гилрокси-метил)аминометан не является инертным соединением и может взаимодействовать с исследуемыми объектами - в частности, модифицировать антигенные детерминанты бактериальных ЛПС. Нами показано, что разные О-ПС, входящие в состав ЛИС А. ЬгазПоие 5р245 отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом присутствия катионов Трнс в среде культивирования.

4.3.3. Исследование пммунохнмической гетерогенности О-спеии фи чески* полисахаридов штамма А. ЬгтНепхе Бр7 и близкородственных штаммов. Был проведен сравнительный иммунохимический анализ О-ПС, входящих в состав ЛПС А. Ьга$Исте 5р7, генетически родственного ему штамма

Сс1, а также производного от Бр7 штамма 7.К.2. Различия в строении ЛПС данных близкородственных штаммов позволили оценить иммунохимическую гетерогенность двух О-слеиифнческих полисахаридов типового штамма А:о^р1гШит ЬгазИепзе.

Штамм А. ЬмхИепзе С(1 был выделен из корней Супойоп Цас(у!оп после инокуляции этого растения культурой Бр7 (Еьке\у е( о/., 1977). Бр7 и С(1 демонстрируют выраженные различия роста на плотной среде. Кроме того, у штамма Сй не отмечено возрастных изменений морфологии ко: лоний, и он не претерпевает, в отличие от Бр7, И-Б диссоциацию на минимальных синтетических средах. Как и в случае штамма 5р7-Б (Матвеев с соавт., 1987), плазмидный профиль А. ЬгахМете С(1 отличается от такового у ¿р7 отсутствием р115 (Петрова с соавт., 2004).

Результаты линейного иммуноэлектро-фореза ЛПС этих штаммов (рис. 13)говорято том, что в составе ЛПС штамма С(1 имеются как к-, так и З-О-ПС, характерные для штамма 5р7. Однако оба его О-ПС выявляются только антителами на ЛПС штамма 5р7, в то время как антитела на ЛПС самого штамма С(1 визуализуют в составе его ЛПС только один О-ПС. Результаты денатурирующего электрофореза в ПЛАГ позволяют сделать вывод о том, что в структуре ЛПС А, ЬгазНепзе С(1 произошли изменения, не позволяющие достичь разделения двух О-ПС (рис. 14).

ЛПС спонтанного мутанта 7.К.2 отличается от ЛПС 5р7 тем, что в его иммунодиф-фузионном профиле выявляется только Е1-0-ПС. Электрофоретическое разделение ЛПС 7.К.2 в ПААГ демонстрирует отсутствие Б-О-ПС в составе его ЛПС (рис. 14). При этом в плазм ид ном профиле данного штамма, как и у 5р7-Б и СО, не визуализуется плазмида 115 МДа.

В связи с выявленными особенностями строения, получение антител на О-антиген спонтанного мутанта 7.К.2 представлялось нам очень перспективным в плане исследования нмунохнмической гетерогенности ЛПС типового штамма 5р7. Получение антител на

Рис. 13. Результат линейного иммуноэлектрофореза препаратов ЛПС штаммов Бр7( 1) и С(1 (2) с Ат на ЛПС штаммов С(1(3) и 5р7(4).

1 2 3 Рис. 14. Результат электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС штаммов С<1 (I). Эр7 (2) и 7.К.2 (3).

ЛПС штамма 7.К.2 и анализ их взаимодействия с различными антигенами позволили нам прийти к заключению о том, что R-0-ПС — это иммунохимически гетерогенный полисахарид. На рис. 15 приведены результаты иммунодиффузионного анализа антител на ЛПС 7.К.2 с препаратами ЛПС штаммов Sp7 и 7.К.2. Можно видеть, что антитела на ЛПС 7.К.2 распознают детерминанты, характерные для S-антигена. В то время как реакция иммунодиффузии с собственным антигеном завершается образованием одной полосы преципитации, реакция с ЛПС исходного штамма Sp7 образует весь спектр полос, характерных как для R-, так к для S-антигена. Следовательно, на поверхности R-ОПС выявляются все антигенные детерминанты, характерные для полноценного ЛПС штамма Sp7.

Обобщая результаты иммунохимичсского анализа ЛПС молельных штаммов Л, bras Пете^ можно констатировать, что главным отличием двух О-ПС, выявляемых в составе ЛПС Sp7 и Sp245, является антигенная гетерогенность одного из полисахаридов, обусловленная наличием в его структуре, по крайней мере, двух различающихся по своему строению О-факторов или антигенных детерминант. При этом второй О-ПС у обоих штаммов иммунохимически гомогенен и идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС. Кроме того, результаты исследования различий иммунохнмических и физико-химических характеристик ЛПС типового штамма A. brasilense Sp7 и близкородственных штаммов (выполненные совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН) позволили прийти к заключению о том, что выявленные различия их ЛПС определяются наличием, а также способом поддержания в клетках фрагмента) 15 МДа.

Глава 5. Сравнительный нммунохнмнческнй аналнз ЛПС, капсульнмх полисахаридов м экзополисахаридов Azospirillum brasilense

Помимо ЛПС, углеводными компонентами клеточной оболочки грамот-рипательных микроорганизмов являются внеклеточные полисахариды — полисахариды капсулы и экзо полисах ар иды (ЭПС), В некоторых случаях, по химической и антигенной структуре КПС, ЭПС и ЛПС оказываются идентичными (Бот-винко, 1985; Kenne and Lindberg, 1983; Jann and Jann, 1990 и др.). Нами был проведен детальный сравнительный аналнз антигенных свойств ЛПС A. brasilense Sp7 и Sp245, их О-ПС, КПС и ЭПС. Препараты КПС и ЭПС были любезно предоставлены Д.А. Жемеричкиным и С.А. Коновой.

По результатам иммунодиффузионного анализа с антителами на ЛПС препараты КПС и ЭПС штамма Sp7 образуют сливающиеся полосы преципитации с одним из двух О-ПС, входящим с состав ЛПС данного штамма. Результаты линейного иммуноэлектрофореза говорят о том, что антигенные детерминанты

Ат

Рис. 15. Результат иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС штаммов Sp7(l) и 7.К.2 (2) с Ат на ЛПС 7.К.2 (Ат).

всех трех препаратов обладают близкими значениями электрофоретической подвижности. Рис. 16 демонстрирует результаты перекрестного иммуноэлектрофо-реза препарата ЛПС (Л), танлемного перекрестного фореза ЛПС и ЭПС (Б) и слитного ракетного фореза ЛПС н КПС (В). В данном случае КПС и ЭПС образуют общие пики преципитации с ЛПС, не формируя при этом дополнительных пиков. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что ЛПС данного штамма имеет аналогичные иммунодетерминантные участки как с КПС, так и с ЭПС. Учитывая, что согласно данным Конновой с соавторами (Коппоуэ е( а1„ 1994), названные полимеры имеют одинаковый моносахар ид ный состав, можно говорить об отсутствии у штамма Эр7 специфического капсульного антигена. По-видимому, капсула и ЭПС в данном случае представляют собой О-специфические фрагменты ЛПС, экскретируемые клеткой в окружающую среду.

Л Б В

Рис. 16. Результат перекрестного иммуноэлектрофореза (Л), тандемного перекрестного иммуноэлектрофореза (Б) и слитного ракетного иммуноэлектрофореза (В) препаратов КПС (2), ЭПС (3) и ЛПС (4) штамма Эр7 с Ат на ЛПС данного штамма.

Мы обнаружили принципиальное отличие данных внеклеточных полисахаридов и О-ПС, являющихся частью липополисахарида исследуемых бактерий. Изолированный препарат ЭПС штамма Бр7, несмотря на антигенную идентичность полисахаридным структурам ЛПС, проявил в наших экспериментах крайне низкую иммуногенность. При исследовании сывороток крови кроликов, иммунизированных ЭПС двумя различными способами (внутривенно и подкожно) мы не обнаружили присутствие антител в концентрации, достаточной для проявления эффекта иммунопреципитации. Иммунный ответ на ЭПС нам удалось обнаружить только с помощью более чувствительного, однако, косвенного приема — метода бактериальной агглютинации. Значение титров агглютинации и при первом, и при втором способах иммунизации оказалось одинаковым и достаточно низким — 160Н320. Принципиально важным для нас представляется тот факт, что

сыворотки против ЭПС содержали антитела, агглютинирующие фиксированные и живые клетки, отмытые от капсулы, в одинаковых титрах. Относительно слабая иммуногенность внеклеточных полисахаридов в сравнении с бактериальными ЛПС (несмотря на выявленную антигенную идентичность данных структур), вероятно, объясняется тем, что именно ЛПС с полноценной структурой обладает способностью взаимодействовать с самыми различными клеточными рецепторами и клетками иммунной системы животных.

Аналогичные результаты, свидетельствующие об антигенной идентичности угле вол содержащих компонентов клеточной поверхности, были получены нами при исследовании другого модельного штамма - A. brasilense Sp245, В данном случае для сравнения был использован мутант этого штамма — КМ018, в составе ЛПС которого присутствует только О-ПС1. На рис. 17 показан результат иммуно-диффузионного анализа препаратов ЛПС, КПС и ЭПС штамма Sp245 и ЛПС КМ018. Необходимо отметить, что терминами КПС и ЭПС здесь нами обозначены полисахарид-липндные комплексы, выделенные Конно-вой с соавторами (1994) из капсулы и куль-туралыюй жидкости Sp245, соответственно. Слияние полос преципитации, образованных КПС, ЭПС и 0-ПС1, говорит о полной идентичности их антигенных детерминант. То есть, капсула и ЭПС штамма Sp245 состоят из вещества, содержащего антигенные детерминанты, идентичные таковым у 0-ПС1. Таким образом, из двух О-ПС, выявленных в составе ЛПС исследуемого штамма, именно 0-ПС1, очевидно, формирует вещество капсулы и ЭПС A. bras Heme Sp245.

Имеются все основания предположить, что внеклеточные полисахариды Azospirillum brasilense, вероятно, представляют собой О-антнгенные фрагменты липополисахарилов, экскретируемые бактериями в культуральную среду, и их идентификация в качестве капсулы или экзополисахарида зависит от прочности связи данных полисахаридов с поверхностью бактериальной клетки.

Глава б. Изучение Н-антнгенов бактерий p.Azospiril/um

6.1. Выявление полисахарилного чехла на поверхности полярного жгутика. Известно, что полярные жгутики бактсрий-монотрихов нередко имеют на своей поверхности чехол белковой или полисахарид ной природы (Тимаков с соавт., 1983). В некоторых случаях было продемонстрировано участие ЛПС в формировании чехла, покрывающего полярный жгутик бактерий (Thomashow and Rittcnberg, 1985; Fuerst and Репу, 1988; Doig and Trust, 1994).

С помощью электронной микроскопии и антител на ЛПС нами впервые было выявлено наличие (липо)полисахаридного чехла на поверхности

К 2 3 ) 3 2 4

Рис. 17, Результат сравнительного иммунолиффузионного анализа препаратов ЛПС (1), 0-ПС1 (2), ЭПС (3) и КПС (4) A, brasilense Sp245 с Ат к ЛПС данного штамма (а).

Рис. 19. Результат имму-н о ли ффуз ионного анализа препарата ЛПС (1) и препарата нативного жгутика (2) А. ЬгаьИепье Бр245 с Лт на ЛПС данного штамм ма (А).

А

Рис. 18. Взаимодействие конмогспов протеин A-коллоидное золото с Лт на ЛПС A. brasílense Sp245 с клетками данного штамма. Длина масштабной метки 200 нм.

полярного жгутика типовых штаммов бактерий рода Azospirillum. На рис. 18 показано взаимодействие коньюгатов протеин А - коллоидное золото и штаммос-псиифичных антител на ЛПС с бактериальной клеткой штамма А. brasilerne Sp245. Метка выявляет наличие антител на ЛПС не только на самой клетке, но и на поверхности полярного жгутика. При этом можно видеть, что антитела на ЛПС взаимодействуют не столько с поверхностью полярного жгутика, сколько с очехляюшей его субстанцией. На рис. 19 приведены результаты сравнительного иммунолиффузионного анализа препарата нативного жгутика, не изолированного от чехла, и препарата ЛПС штамма Sp24S с антителами на ЛПС данного штамма. В данном случае препарат жгутика образует общую линию преципитации с одним из О-ПС, входящим в состав ЛПС Sp245. Второй О-ПС, характерный для ЛПС данного штамма, также присутствует в составе препарата жгутика, но линия преципитации, соответствующая ему, выражена намного слабее.

Мы полагаем, что (липо)полисахаридный чехол достаточно прочно связан со жгутиком, поскольку нам не удалось отделить его даже при удьтрацентрифу-гировании препарата полярного жгутика в градиенте плотности сахарозы. Отделение чехла от жгутика оказалось возможным только в результате кислотной диссоциации полярного жгутика и его последующей реассониации. Однако единственной структурой, сохраняющей свою нативность после описанных процедур с полярным жгутиком азоспирилл, был ЛПС, а вместо полимерного фла-геллина ассоциировались случайные конгломераты молекул.

6.2. Исследование углеводных фрагментов гл и коз и л про ванн ого фла-геллина полярного жгутика. Исследование углеводных фрагментов полярного жгутика штамма А. brasileme Sp7, у которого впервые для азоспирилл было показано наличие данных структур (Moens et al., 1995), проводили с помощью двух производных этого штамма - 1Z5 и 7.К.2. Первый из этих производных был отобран Г. Александре. Штамм 1Z5 характеризовался неподвижностью клеток и отсутствием в составе флагеллина полярного жгутика структур, выявляемых с по-

флагеллин

флагеллин

ЛПС

es

мошью красителей на углеводы. Штамм 7.К.2 был отобран нами с помощью им-мунодиффузионного теста с антителами на ЛИС штамма Sp7. Он, как было отмечено выше, отличался отсутствием в составе ЛПС одного из двух характерных для Sp7 О-спеиифических полисахаридов.

1 2 12 На рис. 20 Л представ-

лен результат иммуноблот-тинга препаратов полярного жгутика штаммов Sp7 и IZ5 с использованием антител на Ж1утик А. Hpofcrttm 4В, любезно предоставленных Г. Александре (Alexandre et al., 1999). Взаимодействие антител на флагеллин штамма, относящегося к виду А. Про-/егит, с препаратами полярного жгутика штаммов, относящихся к роду А. brasih'mü, свидетельствует о наличии род оспе цифнчных антигенных детерминант в составе Н-антигена у азоспирилл. Сохранившая у мутанта 125 способность взаимодействовать с данными антителами говорит о том, что его флагеллин, в отличие от углеводных фраг-

Рис.20. А. Результат нммуноблотинга с Ат на флагеллин полярного жгутика А. Нро/егит 4В препаратов полярного жгутика Эр7 (1) и 1/5 (2). Б. Результат иммуноблогинга с Ат на ЛПС Бр7 препаратов полярного жгутика 5р7 (1)11125 (2).

ментов жгутика, очевидно, не претерпел каких-либо изменений. Результаты нммуноблотинга тех же препаратов полярного жгутика с антителами на ЛПС штамма Бр7 приведены на рис. 20 Б. В то время как антитела на флагеллин одинаково эффективно взаимодействуют с гликозилированным флагедлином дикого штамма и негдикозилированным флагеллином мутанта 125, антитела на ЛИС распознают только препарат жгутика дикого штамма. При этом как у исходного штамма, так и у его мутанта антитела выявляют сопутствующий жгутику лиио-полисахарид (чехол жгутика), мигрирующий в электрическом папе отдельно.

Следовательно, антитела на ЛПС распознают некие углеводные структуры, входящие в состав гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий дикого штамма и, очевидно, гомологичные отдельным фрагментам соматического антигена. Для получения ответа на вопрос, какие именно структуры в составе ЛПС штамма Бр7 антиген но идентичны углеводным компонентам флагеллина полярного жгутика, мы использовали штамм 7.К.2.

Сравнительный электрофоретнческий анализ ЛПС штаммов Бр7 и 7.К.2 (рис.14) выявляет отсутствие Б-О-ПС в составе ЛПС штамма 7.К,2. Поскольку выше было отмечено наличие перекрестной иммунологической реакции между

жгутиком и ЛПС, в частности — 5-О-ПС (рис. 20 Б), логичным представлялось предположение о том, что углеводные фрагменты полярного жгутика штамма Бр7 гомологичны фрагментам именно этого О-ПС. Электрофоретический анализ с последующей иммунодетекцией препаратов полярного жгутнка показал, что мономеры флагеллина у штамма 7.К.2 имеют меньшую молекулярную массу и, в отличие ог 5р7, не взаимодействуют с антителами на ЛПС этого штамма (рис.

21). В составе препарата жгутика исходного штамма антитела выявляюг наличие

ЛПС, очехляющего жгутик (мигрирующего при электрофорезе отдельно), а также антигенные детерминанты ЛПС в составе собственно полярного жгутика, образующего в данном случае двойную полосу. При этом хорошо вид но, что в составе препарата полярного жгутика 7.К.2 5-антиген не выявляется ни в составе собственно жгутика, ни в составе сопутствующего материала (чехла), В то же время второй О-ПС (Я-антиген) ви-зуализуегся очень четко.

Полученные результаты позволили нам прийти к заключению о том, что углеводные структуры гликозилирован-ного флагеллина полярного жгутика штамма 5р7 могут являться, по своей сути, фрагментами Э-О-ПС данного штамма. Однако для того, чтобы сделать безоговорочный вывод об антигенной идентичности этих структур, необходимо было получить антитела на мономеры полярного жгутика данного штамма.

63. Получение и анализ антител на флагеллин А. ЬгаьИепхе Бр7. Самым важным этапом в решении этой задачи являлось получение флагеллина штамма 5р7, тщательно освобожденного от полисахаридного чехла. Мы использовали схему, предложенную Муравлевым с соавторами (1999), и получили антитела на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, разделенные с помощью электрофореза в ПДАГ и извлеченные из геля путем специальной диффузии.

Результат сравнительной иммунолиффузии полученных антител на изолированный жгутик штамма 5р7 и антител на ЛПС данного штамма говорит о том, что субъединицы полярного жгутика имеют общие детерминанты с ЛПС (рис.

22). Мажорная шпора, отмеченная стрелкой на этом рисунке, в свою очередь, свидетельство того, что основной пул антител, полученных на изолированный полярный жгутик, специфичен именно Н-антигену. Углеводные детерминанты вносят очень небольшой вклад в иммунный ответ на изолированный жгутик, что доказывает картина преципитации при сравнении препаратов жгутиков Бр7 и

Гц ч*П ЦТ*

! Х'Л

"' /м

флагеллин

8-А г

Я-А г

1

г 1 2

Рис. 21. А. Результат электрофореза в ПААГ препаратов полярного жгутика Бр7 (1) ц 7.К.2 (2) (окраска Кумасси). Б, Результат нммунобло-тинга данных препаратов с Ат на ЛПС Бо7.

Г*

Ar

з 1

Рис. 22. Результат нммуно-лиффузнонкого анализа препарата флагеллина

штаммма Sp7 (Ar) с Лт на ЛПС (1) и Ат на флагеллин (2) данного штамма.

Рис. 23. Результат иммунолнффузнонного анализа препаратов флагеллина штаммов А. bras Herne Sp7 (К 4), Л. brasilense 7.К.2 (2), А. brasilense Sp245 (3). А. Hpoferum Sp59b (5) и Е. coli К12 (6) с Ат на флагел-лин А. brasilense Sp7.

7.К.2 (рис. 23). Такой вклад данных структур в иммунный ответ может определяться, наряду с иными причинами, существенно меньшим их количеством (но сравнению с флагеллином) в составе полярного жгутика. Данный рисунок также демонстрирует характер взаимодействия антител на мономеры жгутика А. brasilense Sp7 с препаратами изолированных жгутиков другого штамма этого же вида (/(. brasilense Sp245), штамма другого вила (Л. Hpoferum Sp59b) и бактерий другого рода (Е. coli К12). Отсутствие взаимодействия антител со жгутиком £. coli — свидетельство родовой специфичности всех антигенных детерминант мономеров полярного жгутика азоспирилл. Различная интенсивность взаимодействия антител с препаратами жгутиков других штаммов может привноситься как штаммовой специфичностью детерминант их олигосахарилных фрагментов, так и наличием, наряду с ролоспеиифичнмми, вило- и штаммоспеиифичных детерминант в составе самого флагеллина.

€.4. Исследование изменений подвижности клеток азосннрнлл нрк взаимодействии с антителами к О- н Н-антигенам. С целью проверки предположения об экранированности флагеллина полярного жгутика выявленным нами (л ипо)пол исахар идным чехлом, мы провели серию экспериментов по исследованию подвижности азоспирилл штаммов Sp7 и Sp245 в присутствии антител на ЛПС данных штаммов и антител на флагеллнн штамма Sp7 (работа выполнялась совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН). Мы судил и о взаимодействии данных антител с полярным жгутиком азоспирилл, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя среднюю скорость движения у случайно выбранных подвижных единичных клеток. Во время наблюдений вели видеозапись на видеокамеру.

средкяя скорость движения клеток

■"/а [юлвнжньгс клеток

Диафамма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток A. brasitense Sp7 от конненфаини штаммоспецифичных антител на ЛПС (рис. 24) показывает, что увеличение концентрации данных антител приводило к полному прекращению движения бактерий. При этом добавление к клеточной суспензии как антител на флагеллин, так и антител на ЛПС другого штамма не приводило к такому эффекту. Из этого следует, что мономеры флагеллина у азос-пирнлл действительно изолированы от окружающей среды (л it-no) поп и сахар ид н ы м чехлом и жгутик, вероятно, может участвовать в процессах прикрепления данных бактерий на корнях растения только

в качестве носителя субстанции, обеспечивающей адсорбцию.

Поскольку отмечено, что дефект гликозилирования полярного жгутика у азоспирилл не связан напрямую с утратой бактериальной подвижности, возникает вопрос о роли углеводных структур в составе фдагеллы у этих бактерий. Антигенная идентичность этих структур с О-антигеном исключает предположение об умножении антигенного бактериального спектра, что присуще, к примеру, роду Campylobacter (Doig et й/„ 1996). Кроме того, такому предположению противоречит наличие у азоспирилл чехла надежно изолирующего полярный жгутик. Основываясь на данных, полученных для гл и коз ил про ванных пилинов (Marceau et а/., 1998), а также учитывая тот факт, что традиционные процедуры диссоциации и реассоцнаиии полярных жгутиков азоспирилл не приводят к образованию полимерного флагеллина, мы полагаем, что углеводные фрагменты в данном случае могут обеспечивать, главным образом, структурную стабилизацию флагеллы.

Рис. 24. Зависимость процента подвижных клеток н средней скорости подвижных клеток А. ЬгахИете Эр7 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма: 1 — контроль (без антител); 2 — 1 мкг/мл; 3—10 мкг/мл; 4 - 100 мкг/мл; 5 - 1000 мкг/мл.

Глава 7. Характеристика некоторых физико-химических свойств ЛПС

азосшфилл

7.1. Сравнение снектрофот©метрических хнрпкгсрнстик* ЛПС различных серотнпов. Для детектирования углеводов и определения их концентрации широко применяется колориметрический метол, основанный на способности растворов моно-, олиго- и полисахаридов и их производных приобретать жёлто-оранжевую окраску в присутствии фенола и концентрированной серной кислоты. При этом растворы различных моносахаридов демонстрируют индивидуальные особенности спектров поглощения света продуктами фенол-сернокислогной реакции (Dubois et а/. J 956). Данный метод может быть также достаточно информативным при сравнительном исследовании различных углеводсодержаших биополимеров, поскольку спектрофоточ етр и ч ее кие характеристики растворов гетероолиго- и гетерополисахаридов определяются остатками моносахаридов, входящими в их состав.

Мы провели сравнение спектров поглощения света в интервале длин волн 400-520 нч продуктами фенол-сернокислотной реакции препаратов ЛПС, выделенных из различных штаммов Azospirilium brasileitse. Были проанализированы препараты ЛПС четырех штаммов, принадлежащих к двум различным се-рогипам. На рис. 25 приведены спектры поглощения света продуктами фенол-сернокислотной реакции препаратов ЛПС (для краткости ниже мы их будем именовать «спектрами поглощения») для четырех штаммов азоспирилл, попарно демонстрирующих антигенные перекресты в иммунологе с гомологичными антителами (Глава 8). Установлено, что спектры поглощения серологически близких штаммов Sp7 и Cd демонстрируют сходный характер и два пика поглощения (Д„а, | = 410-420 нм и /W,2 е 485 нм). В то же время, спектры поглощения препаратов ЛПС второй пары близкородственных штаммов — Sp245 и Sp 107 — имели только один выраженный пик поглощения (Д^щ = 480 нм). Таким образом, принадлежащие к одному виду, но серологически различные штаммы A. brasileme обнаружили четкие отличия спектров поглощения ЛПС. что говорит о существенном различии их моносахарндного состава (Dubois et ul. 1956).

«О <10 420 430 440 4SO 460 430 «0 4УО 600 ЯО $20

Я. НМ

Рис. 25. Спектры поглощения продуктов реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС Sp7, Cd, Sp245 и Spl07.

Проведенное сравнение спектров поглощения препаратов ЛПС A. brasi-leme Sp7 и Sp245 со спектрами их мутантов, дефектных по одному из двух О-специфических полисахаридов (О-ПС), выявленных в составе ЛПС показало, что иммунохимическая гетерогенность О-ПС в пределах одного штамма исследуемых бактерий не связана с радикальными различиями их моносахарид кого состава. Сходный качественный характер спектров поглощения, выявленный нами в каждом из рассматриваемых случаев, говорит о принципиальном сходстве мо-носахаридного состава О-специфических полисахаридов в составе ЛПС данных штаммов. Отмеченные при этом количественные изменения спектров могут быть следствием тех тонких структурных различий, которые и определяют иммуно-химическую специфичность каждого конкретного О-ПС.

7.2. Оценка структурообразующих эффектов бактериальных липопо-лисахаридов в клеточных суспензиях азоспирилл и модельных клеточных суспензиях. Анализ литературных данных позволил нам предположить, что ЛПС бактерий p. Azospirillum могут выступать в роли структур, которые опосредуют взаимодействие данных бактерий между собой с образованием агрегатов, а также взаимодействие бактерий с корнями растений (Sadasivan and Neyra, 1985; Bashan с/о/., 19S6; Окоп and Kapulnik, 1986; Del Gallo et ai„ 1989; Mad i and Heñís, 1989; Michiels et al, 1990; Zaady et ai, 1993 и др.). В данной части диссертационной работы представлены результаты исследования структурообразующих свойств ЛПС и ЛПС-солержащих препаратов, изолированных с поверхности клеток азоспирилл, в отношении суспензий растительных и бактериальных клеток (а также животных клеток - эритроцитов). Мы оценивали роль ЛПС как во взаимодействии между бактериальными и растительными клетками, так и во взаимодействии бактериальных клеток между собой во флоккулирующих культурах.

При изучении влияния ЛПС данных бактерий на суспензии растительных, бактериальных и животных клеток нам представлялось целесообразным использовать не только высокоочишенные препараты ЛПС, но и препараты липополи-сахарил-белковых комплексов (ЛПБК), поскольку именно в такой форме ЛПС азоспирилл может быть активен in vivo, В дополнение к ЛПС и ЛПБК, мы исследовали также взаимодействие с различными клеточными суспензиями О-специфических полисахаридов и белковых фракций, выделенных из ЛПБК.

Известно (Matthysse et 1987; Eyers et al.t 1988), что бактерии родов Agrobacterium и Azospirillum способны агрегировать суспензии морковных клеток. При использовании данной модельной системы мы обнаружили, что предварительная обработка морковных клеток бактериальным ЛПС приводит к усилению эффекта сравнительно быстрой (порядка несколько секунд) агрегации суспензий штаммами Sp245 и Cd. Очевидно, что за такие короткие промежутки времени наиболее вероятно проявление так называемых «неспеиифических» связей между компонентами микробных и растительных клеток по механизмам ван-дер-ваальсовых, электростатических и/или иных относительно слабых физико-химических взаимодействий без включения специфических ответных реакций со стороны партнеров.

С цсле.ю оценки возможного участия ЛПС азоспирилл на уровне таких не-специфнческих связей также и в бактериальной агрегаипн (ши сачоагрепшии), мы провели соответствующие эксперименты со штаммом А. ЬгшИеюе Эр245 с использованием ЛПС, выделенных из штаммов 5р245 и Сс1. Ныло устаноплсно, что во всех случаях непосредственно после добавления к гомогенной суспензии клеток штамма 5р245 препарата ЛПС до конечной концентрации 15 мкг/мл происходила агрегация бактериальных клеток (рис. 26). При этом оба препарата ЛПС, независимо от штамма, из которого они были выделены, действовали одинаково эффективно. Аналогичный результат был напучен и при исследовании агрегации бактерий, относящихся к другому роду -АцгоЬаси'Пит ште/аЫепз ЯШ, под действием ЛПС А. ЬгазИагзе 5р245, Как и в случае агрегации суспензии морковных клеток, бактериальная агрегация также имела обратимый характер - агрегаты разрушались при встряхивании суспензий и затем фор-мнроватись вновь.

Представлялось целесообразным сопоставить концентрацию ЛПС, использованную во всех экспериментах в данной части нашей работы, с концентрацией ЛПС, выделяемого клетками в культуральную среду. Для ее опенки мы применили метод ракетного иммуноэлектрофореза с антителами против ЛПС штамма Л. ЬгтИсте Эр245 (рис. 27). Можно видеть (ср. длину ракет), что концентрация ЛПС, экскретируемого клетками в культуральную среду, была порядка 10 мкг/мл (в случае 18-часовых культур) и 100 мкг/мл (в случае 48-часовых культур). Следовательно, концентрация Л11С, использованная в наших молельных экспериментах, находилась в пределах значений, обусловленных продукцией бактериального ЛПС т гп'о.

Данные, характеризующие способность препаратов ЛПС, ЛГИЖ, О-ПС и белковых фракций ЛПБК агрегировать суспензии морковных клеток и эритроцитов, а также суспензии бактерий родов АгюрМИит и А^гоЬаШгшт, представлены в Таблице 1. Как ЛПС, так и ЛПБК вызывали агрегацию растительных и бактериальных суспензий, но не агрегировали эритроциты. В ло же время ни О-ПС, ни белки, входящие в состав ЛПБК, не агрегировали ни один из видов клеточных суспензий, нспользованпых в данных экспериментах.

1 2 3

4 5 6

Рис. 26. Влияние предварительной обработки культур морковных клеток препаратами ЛИС штаммов А. ЬгтИеюе 5р245 (1-3) п Сс1 (4-6) на степень их агрегаипн иод действием бактерий данных штаммов. Контрольные (необработанные) суспензии (1, 4), суспензии, агрегированные под действием бактерий (2, 5), усиление агрегации за счет предобработки морковной суспензии бактериальными ЛИС (3,6).

Следующим структурообразующим эффектом исследуемых препаратов, обнаруженным в наших опытах, была клеточная агглютинация. В дополнение к морфологическим отличиям возникающих клеточных структур (см, ниже), время их образования при агглютинации (несколько часов) существенно превышало время, за которое происходила агрегация клеток (секунды). Результаты исследования агглютинации кроличьих эритроцитов препаратами ЛПС, О-ПС и белковыми фракциями ЛГТБК штамма 8р245 приведены в той же Таблице 1. Титры агглютинации для ЛПС, О-ПС и белков составляли, соответственно, 2.5,0.625 и 1.25 мкг/мл.

к

V

12 3 4

Рис. 27. Результат ракетного иммуно-электрофореза лило пол исахаридных антигенов: препараты ЛПС штамма А. ЬгазИепзе Бр245 (1-3) и образцы культу-ральной среды данного штамма , выращенного в течение 18 (4) и 48 (5) часов, при концентрации ЛПС 100 (1), 50 (2) и 25 (3) мкг/мл.

Таблица 1. Структурообразующая активность препаратов'* наружной мембраны азоспирилл в клеточных суспензиях

Структурообразующий эффект Клетки Препараты

ЛПС ЛПБК О-ПС Белки

Агрегация Морковь + + - -

Л:озр1пНит ЬгшНете ЪрИб + + - -

А^гоЬас1егшт Ште/аает 1110 + + - -

Эритроциты - - - -

Агглютинация + - + +

Фазовое разделение - + - -

«+» - активны, «-» - не активны.

Что касается препарата ЛПБК, то для него был зарегистрирован иной тип структурообразования в клеточных суспензиях, кинетические параметры которого имели промежуточные значения по сравнению с параметрами, характерными

для эффектов агрегации и агглютинации клеток. Добавление к »-ной суспензии эритроцитов препарата ЛПБК в интервале его концентраций 10*40 мкг/мл вызывало относительно быстрое (за время порядка 10-20 минут) выделение клеток в отдельную гомогенную фазу. При этом в контроле (без добавления ЛПБК) наблюдаюсь относительно слабое проявление эффекта осаждения эршроцитов под действием силы тяжести. Эффект осаждения становился заметным (существенное просветление надосадка эритроцитарных суспензий) за несколько часов, что сопоставимо со временем проявления эффекта клеточной агглютинации. При использовании других препаратов (а также при более низких концентрациях ЛПБК) фазовое разделение суспензий эритроцитов не наблюдаюсь.

Методом иммунолиффузии была сделана сравнительная оценка концентрации ЛПБК в обеих фазах (рис. 28). Эти результаты показали, что ЛПБК в значительной степени был вытеснен из нижней (эритро-иитарной) фазы, что доказывает значительно более низкая концентрация иммунопре-цкцитата, образовавшегося в геле. Эти наблюдения находятся в хорошем согласии с теоретическими и экспериментальными данными но фазовому анализу многокомпонентных систем с участием полимеров и коллоидных частиц (Непер, 1986; Литмано-вич с соавт., 1997).

Можно заключить, что, в зависимости от химического состава препаратов наружной мембраны азоспирилл, под влиянием их добавления к использованным суспензиям клеток возможно формирование агрегационных клеточных структур трех типов. Они существенно отличаются друг от друга, как по скорости образования, так и по морфологическим свойствам.

Первый и второй типы связаны с эффектами клеточной агрегации и агглютинации. В соответствии с известным описанием структур, возникающих в результате агглютинации клеток (что находится в согласии нашими наблюдениями), их общие черты сходны с решеточной структурой и ммун о преципитата (Bach, 1982). С физико-химической точки зрения в системе такого типа (условно неограниченного объема) могут возникать кластеры бесконечного размера, состоящие из связанных между собой клеток. Визуально это регистрируется в виде характерного преципитата четко отличимого ог конгломерата клеток, осевших на дне лунки под действием силы тяжести.

В противоположность агглютинации, эффект агрегации клеток, по всей видимости, обусловлен иными молекулярными механизмами. Результатом их действия является весьма быстрая (несколько секунд) потеря агрегаиионной ус-

©

Рис. 28. Результат сравнительного иммунолиффузионного анализа образцов дисперсионной среды, взятых из фазы, обедненной (I) и обогащенной (2) эритроцитами с антителами против ЛПС штамма А. ЬгтПете Эр245 (Л).

тойчивости клеточных суспензий. При этом размер образовавшихся кластеров остается конечным. Внешне это проявляется в формировании хлопьевидного осадка, видимого невооруженным глазом.

Третий тки структурообразования мы обнаружили при добавлении к суспензии эритроцитов препарата ЛПБК. Он проявляется в фазовом разделении системы с выделением клегок в хорошо наблюдаемую отдельную гомогенную жидкую фазу. Необходимо отметить, что подобное явление ранее было достаточно подробно описано для суспензий эритроцитов и культур клеток животных, подвергнутых действию протеогликанов и их комплексов (Бычков и Кузьмина, 1992), и объяснено, так называемым, эффектом «стерического исключения». Последний, по мнению цитируемых авторов, обусловлен возникновением в дисперсионной среде специфических пространственных структур, включающих в свой состав отрицательно заряженные полисахаридные иепи. Считается, что такие структуры связывают значительное количество молекул волы (что существенно влияет на термодинамические параметры системы) и уменьшают долю объема суспензии, доступного для клеток.

Л ПС являются сложными молекулами, содержащими в своем составе гидрофобные (липидные) фрагменты и проявляющими анионные свойства. В препарате нативного ЛПБК (в отличие ЛПС, полученного протеиназной обработкой) содержатся мембранные белки, а также в них оказывается существенно более высоким содержание липидов (Leive et а!,, 1968), что, очевидно, увеличивает степень гидрофобное™ молекул. На этом основании можно предположить, что бактериальные ЛПБК (подобно протеогликанам) могут действовать как неспецифические факторы по механизму стерического исключения (Бычков и Кузьмина, 1992), приводящему в наших экспериментах к разделению фаз в суспензиях эритроцитов.

Так называемое, «неспепифнческое» (агрегирующее) действие ЛПС и ЛПБК на клеточные суспензии азоспирилл может иметь вполне определенный биологический смысл. Известна способность многих видов почвенных бактерий, в том числе, азоспирилл, образовывать агрегаты при их адгезии на корнях растений, а также наличие подобных скоплений бактериальных клеток в ризосфере (Matthysse, 1985; Окоп and Kapulntk, 1986; Bash an et ai, 1986; Arunakumari et a!., 1992). В наших экспериментах (проведенных совместно с научным сотрудником Лаборатории генетики ИБФРМ РАН Ссшововой Г.К) было установлено, что предварительная обработка корней пшеницы препаратом ЛПС штамма А. brasilense Sp245 не снижает, как в аналогичных экспериментах с агробактериями (Whatley et «/., 1976), а значительно увеличивает количество бактерий данного штамма, прикрепившихся к корням растений. Результаты радио индикаторного анализа, в частности, показали, что инкубация корней в растворе ЛПС с концентрацией 1.5 мг/г корня приводит к увеличению адсорбции азоспирилл на корнях пшеницы в 10 раз по сравнению с контролем (корнями, не подвергнутыми обработке ЛПС). С учетом результатов исследования структурообразующих свойств ЛПС азоспирилл, представляется очевидным, что предобработка корней, проводимая при избытке ЛПС, способствует агрегаиионным явлениям в бактериаль-

ной суспензии, что способствует увеличению адсорбции клеток (Zaady et al., 1993), Вероятно, структурообразующие эффекты ЛПС азоспирилл, обильно экс-кретируемые данными бактериями в культу рал ьную среду, можно рассматривать как проявление механизма адаптации, в том числе, облетающего прикрепление бактерии к корням растений.

Глава 8. Тест-система серологической идентификации бактерий

р. Azospiríllum

О-антигенная специфичность аитител, получаемых с помощью предложенного нами способа, легла в основу созданной тест-си с гс мы серологической идентификации бактерий р. AzospiriUum и эффективного метода скринировання мутантов по структуре ЛПС. К настоящему моменту получен набор антител родовой и штаммовой специфичности и отработаны эффективные методики выявления специфических иммунных взаимодействий.

Для определения штаммовой принадлежности азоспирилл мы предлагаем использовать твердм[>атый иммуыоанатт г/елых клеток или u.\t.uyitoówpifiyju-опный аназиз умеводных аитигенов, выделенных с поверхности клеток или из культуральной среды исследуемых бактерий. Кроме того, для быстрой штаммовой идентификации может быть использован тест на ингибиртание тх)вижно-сти азоспирилл при добавлении к клеточной суспензии штаммоспеппфичных антител на ЛПС.

На рис. 29 приведен пример использования дот-анализа с гомологичными антителами целых бактериальных клеток шести штаммов азоспирилл, относящихся к вилам А. brasilense и А. Iipoferum, Специфические взаимодействия О-антигснов и антител в данном случае выявляются с помошью конъюгата протеин А -кохктдное заюто. Перекрестные реакции отмечаются для двух пар штаммов - Sp245 и Spl07, а также Sp7 и Cd, что объясняется их близким родством. Известно, что штамм A. brasilense Sp245, как и Spl07, был выделен из корней пшеиииы, и их отличия заключатся в том, что первый был выделен в полевых, а второй — в лабораторных условиях (Baldani et al., 1980, 1987). В свою очередь, штамм A. brasileme Cd был выделен из корней Cynodon dactylon после инокуляции этого растения культурой Sp7 (Eskew ct al., 1977). Таким образом.

а б в г д с

1 С/

2

3 _

4 _С

5 ^

6 ^

Рис. 29. Результат дот-анализа целых клеток (а-е) с гомологичными антителами (1-6), выявляемыми конъюгатом протеин Л-коллоилное золото: A. brasileme Spl07(a, l); A. brasileme Cd (б, 2); А. ipoferum 59b (в, 3 ); brasilense JM125A2 (г, 4); A. brasilense Sp70t, 5); A. brasileme Sp245(e, 6).

и м му н ох им ич ее к и й анализ целых Сактерихчъных клеток с использованием штамм оспе цифичных антител на ЛПС позволяет быстро и достаточно надежно определять серотип бактерий р. Azospirtllum, Дот-анализ иелых бактериальных клеток азоспирилл со штаммоспсиифичными антителами возможен также с использованием традиционных маркеров специфических иммунных реакций -ферментных меток.

Сравнительный иммунолиффузионный анализ О-сиеиифических антигенов азоспирилл со штаммоспецифичными антителами — тест, основанный на ии-MyHonpetfunumatfuu, — в некоторых случаях оказывается более информативным при серологическом анализе, поскольку позволяет выявлять тонкие различия в строении специфических антигенов у исследуемых штаммов и, в некоторых случаях, может демонстрировать наличие антигенных перекрестов, не обнаруживаемых в итоге твердофазного анализа. В частности, с помощью иммунолиффу-зионного анализа выявляется односторонняя реакция между антителами к штамму А. lipoferum 59b и ЛПС штамма А. bras Herne Sp7. Последнее наблюдение свидетельствует о наличии общих О-факторов в составе ЛПС у штаммов, принадлежащих к разным видам р. AzosplriUum. Эти данные согласуются с результатами сравнения последовательностей рДНК различных видов азоспирилл (Fani et al., 1995), говорящими о том, что вилы А. brasilense и А. lipoferum среди сравниваемых видов наиболее близки между собой.

Следовательно, для проведения детального се рол отчее ко го анализа того или иного штамма азоспирилл перспективным представляется именно сочетание иммунохимических тестов, основанных на использовании метки (коллоидного золота, фермента и т.д.) в дот-анализе иелых клеток, с нммунопрешшитаиион-ными экспериментами с использованием изолированных специфических антигенов данных бактерий.

Антитела на ЛПС исследуемых бактерий выявляют специфический антиген не только в составе препарата, изолированного с бактериальной поверхности конкретного штамма азоспирилл, но также в составе его культуральной среды. Этот факт позволяет использовать иммуноферментный анализ (метод ELISA) для количественного выявления бактерий изучаемых штаммов азоспирилл непосредственно в почвенных суспензиях. В результате наших экспериментов установлено, что способ получения штаммоспецифнчных антител на ЛПС азоспирилл в сочетании с эффективным методом детектирования комплексов антиген-антитело позволяет изучать динамику численности исследуемых штаммов непосредственно в почвенных суспензиях (н иных исследуемых образцах), минуя стадию высева бактерий на питательную среду,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный комплексный иммунохимический анализ углеводных антигенов бактериазьной клеточной поверхности позволил впервые для представителей почвенной микрофлоры — азотфиксирующих бактерий рода AzospiriUum -оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие дан-

ных детерминант в составе О-, К- и Н- антшенов, получить сведения о химическом строении нммуноломинантных участков линополисахарпдон бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл.

Одним из наиболее существенных результатов нам представляется выявление нового характера микробной R-S диссоциации. Были получены доказательства неприменимости традиционных представлений о микробной диссоциации (подробно описанной для энтеробактерий) для типового штамма A. brasilense Sp7, поскольку как R-, так и S-варнант этого штамма имеют в своем составе полноценный ЛПС с развитой структурой О-антигена. Показано, что R-S — переход в данном случае (в отличие от энтеробактерий) связан с более тонкими изменениями строения клеточной поверхности. Прн отсутствии радикальных изменений в структуре ЛПС, имеет место перераспределение вкладов двух О-антигенов (выявленных как лля исходного штамма, так и для его S-вариант) в строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур, В этой связи уместно упомянуть известные литературные данные о зависимости эффективности адсорбции азоспирилл на корнях растения от фазы роста культур (Umati-Garsia ct al., 1980; Kapulnik et al., 1985). Напрашивается предположение, что особенности тонкой структурной организации и время экспрессии дипополнсаха-рнлных антигенов на клеточной поверхности азоспирилл mofyr являться факторами, определяющими их экологическое повеление.

Сочетание различных иммунохимпчсских методов позволило установить, что ЛПС бактерий р. Azospirillum представляет собой не индивидуальное химическое соединение, а ансамбль макромолекул, демонстрирующих антигенные различия. При этом иммунохимическая гетерогенность соматического антигена «уравновешивается» отсутствием у данных бактерий индивидуального каисуль-ного антигена. Главным отличием двух О-ПС, выявляемых в составе ЛПС исследованных штаммов азоспирилл, является антигенная гетерогенность одного из полисахаридов, обусловленная наличием в структуре полимерной пени, по крайней мере, двух различающихся по своему строению О-факторов (антигенных детерминант). При этом второй О-ПС но всем тестам гомогенен и антигенно идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС. Разные О-с не пифические полисахариды, определяющие иммунохимичсскую гетерогенность ЛПС A, traíllense Sp245, отличаются также по способности к антигенной модификации, являющейся результатом присутствия катионов Тр ис( гилро кси м етил )ам и но м етан а в среде культивирования. Следует отмстить, что сама возможность изменений структуры антигенных детерминант О-слеинфических полисахаридов ЛПС под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах была выявлена нами впервые.

Продемонстрированная антигенная идентичность полисахарндного материала, формирующего капсулу и ЭПС у Л. brustlettse, одному из двух О-спеиифических полисахаридов, выявленных у исследованных штаммов данного вила, по-видимому, дает основания для уточнения существующих в настоящее время представлений о самостоятельной роли ЭПС азоспирилл » формировании

их ассоциативных взаимоотношений с растениями. Знание особенностей структурной организации капсулы и ЭПС азоспирилл может также способствовать созданию эффективных биоспецифических зондов хтя цитохимических, таксономических и экологических исследований данных бактерий.

Сочетание результатов иммунохимического анализа с данными спектроскопических исследований ЛПС позволило сделать заключения о принципиальных различиях (или сходстве) в обшей химической структуре О-спецпфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС азоспирилл. В згой связи представляются важными результаты, доказывающие, что иммунохимическая гетерогенность О-спсцифическнх полисахаридов в пределах ЛПС одного штамма не связана с радикальными различиями их моносахаридного состава. Было бы весьма интересно проверить этот вывод с использованием более детальных структурных исследований ЛПС соответствующими физико-химическими методами.

Проведенный комплексный анализ поверхностных структур клеток, содержащих О-антнгсны, дает представление о распределении данных антигенов в пределах клеточной поверхности азоспирилл, В свою очередь, это позволяет судить о возможной рати соматического антигена при контактных взаимодействиях исследуемых бактерий с разнообразными партнерами. Выявление чехла (ли-по)нолисахарплной природы на флагеллине полярного жгутика бактерий р. А20$рМИшп, а также известное описание роли полярного жгутика на этапе адсорбции этих бактерий на корнях растений (МшМеЬ с/ а1„ 1991), позволяют расценивать поверхностные полисахариды азоспирилл как одну из доминирующих субстанций, обеспечивающих адсорбцию данных бактерий на корнях растения. Кроме того, результаты, полученные при исследовании изменений подвижности азоспирилл под влиянием различных антител н свидетельствующие об экранирующем эффекте полисахарилиого чехла, могут иметь практическое приложение. В частности, тест на ингибирование подвижности бактерий при добавлении к клеточной суспензии штаммослецнфичных антител на ЛПС может быть использован в качестве быстрого серологического теста.

Обнаруженная иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов гл и коз илиро ванного флагеллина полярного жгутика штамма А. ЬгазИсте 5р7 одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена представляется достаточно важным наблюдением. С учетом полученных нами данных об идентичности антигенных детерминант в составе капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и ли попал исахарндов азоспирилл, это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода АтоврмИит. Представляется целесообразным развитие этих исследований в направлении изучения конкретных химических структур, ответственных за установленную нами антигенную идентичность углеводных компонентов соматического и жгутикового антигенов азоспирилл, с использованием хорошо развитых современных физико-химических методов анализа строения биомакрочолекул.

Исследованное нами агрегирующее действие ЛПС и ЛПБК азоспирилл на клеточные суспензии может иметь вполне определенный биологический смысл.

Известна способность многих вило в почвенных бактерий образовывать агрегаты при их адгезии на корнях растений, а также наличие подобных скоплений бактериальных клеток в ризосфере. С этой точки зрения структурообразующие эффекты ЛПС азоспирилл, обильно экс к ре тируемых данными бактериями в куль-туральную среду, можно рассматривать как проявление механизма адаптации, облегчающего адгезию бактерий на корнях растений.

Экспериментальные данные показали, что развитый подход, использованный при создании биотсст-системы серологической идентификации бактерий рода А:о$р1гШит (учитывающий иммунохимичсскне особенности их углеводных антигенов) имеет значение для более широкого круга микроорганизмов. Нам кажется перспективным распространение методологии комплексных иммунохн-мических исследований клеточной поверхности, развитой на примере азоспирилл, на представителей других родов почвенных микроорганизмом, представляющих интерес в широком круге ф из иол от о-биохи мических и экологических задач (например, агробактерий, ролококков и др.). Кроме анализа принципиальных вопросов, связанных с изучением структурной организации поверхности клеток, важных для понимания молекулярных механизмов их взаимодействий с разнообразными партнерами, полученные нами результаты планируются к применению в развитии эффективных методик определения и исследования штаммов микроорганизмов не посредственно в растительных и почвенных образцах.

Наконец, следует отметить, что традиционно иммунохимический анализ бактерий ограничивается, например, идентификацией исследуемых антигенов на электрофореграммах или в составе клеточной поверхности с использованием различных меток. В отличие от этого, антитела были использованы нами для получения сведений об особенностях структурной организации важнейших поверхностных антигенов азоспирилл. В конечном итоге, это делает возможным построение целостной топографической картины распределения различных струклурных элементов в пределах клеточной поверхности исследуемых микроорганизмов, имеющей большое значение для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На основе иммунохимическою анализа развиты подходы к изучению клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий рола ЛюзрИПит, позволяющие оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие данных детерминанг в составе О-, К- и Н- антигенов, получить сведения о химическом строении ичмунодочинангных участков липо-полисахарилов бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл.

Установлено, что предварительная обработка клеточной поверхности глутаровым альдегидом исключает иммунный ответ на нативные мембранные белки и обеспечивает синтез антител на углеводные соматические антигены целых клеток азоспирилл. Предложен способ получения антисывороюк с копнен-

-грацией моноспсциф и чес ких антител, достаточной для реализации эффекта им-мунопрсиишгтаннн с целью выявления и анализа углеволсодержашнх полимеров в сложных смесях клеточных компонентов. Показано, что получаемые при этом антитела имеют выраженную иггаммовую специфичность.

3. Выявлена иммунохимическая гетерогенность О-спсиифическнх полисахаридов штаммов А. Ьга^Иете Бр7 и 5р245, проявляющаяся в наличии двух фракций О-антигсна, регистрируемых в составе бактериального ЛПС. Обнаружено, что разные О-спецнфические паз и сахар иды, определяющие гетерогенность ЛПС А, ЬгазИсте 5р245, отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий вырашивання бактерий на лабораторных средах — присутствия катионов Трис(гнлроксиметил)амино-метана в среде культивирования.

4. Обнаружено, что у штаммов А. ЬгазИепзе Бр7 и Эр245 отсутствует индивидуальный капсульный антиген, а капсульный слой и экзополисахарид иммуно-химически идентичны одному из О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий.

5. Для типового штамма^. Ьгаз Пете Эр7 установлен нетипичный характер К-Б диссоциации, при которой не происходит кардинальных изменений в структуре полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигснность, что является следствием перераспределения вкладов двух О-ПС (выявленных как для исходного штамма, так и для его спонтанного мутанта) в строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур.

6. С использованием конкурентного иммуноанализа и метода спектротур-биднметрии показана роль галактозы и рамнозы как иммуноломинантных моносахаридов в составе антигенных детерминант О-специфического полисахарида А. ЬгазИеюе Бр7.

7. Разработана биотест-система серологической идентификации бактерий рода Аю$рт11ит. учитывающая иммунохимические особенности нх л и по полисахаридных антигенов.

8. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены характерные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с имму-нохимическимн и биохимическими различиями штаммов.

9. С использованием антител, напученных на высокоочишенные субьеди-ницы полярного жгутика, продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов А. ЬгазИете и А. Нро/егит. У молельных штаммов А. ЬгаьИете установлено наличие прочно связанного чехла полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика. Обнаружено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма А. ЬгазИете Бр7 антигенно идентичны одному из двух О-специфнческих полисахаридов соматического антигена.

10. Установлено, что, в зависимости от химического состава препаратов наружной мембраны азоспирилл (л и пополи сахар и да. О- специфического полисахарида, липополисахарид-белкового комплекса или его белковой фракции),

добавляемых к суспензиям растительных, бактериальных клеток или эритроцитов, в них возможно формирование структур трех типов, обусловленных эффектами агрегации, агглютинации, а также фазового разделения, наблюдаемого в суспензиях эрнтроинтов.

11. Разработан новый способ выделения высокоочишснных ЛПС, заключающийся в протеиназной обработке экстрактов бактериальных наружных мембран, полученных с помощью ЭДТЛ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Магора Л.Ю., Шварнбурл Б.А. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотнпировании азоспирилл//Микробиология. -1991.-Т.60, № 3. - С. 524-528,

2. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А„ Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварибурд Б.И. Физико-химические свойства клеточной поверхности S- и R- вариантов штамма Azospirillum brasilettsv Sp7 И Микробиология. - 1992. - Т. 61, №. 4. -С. 645-651.

3. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu„ Schwartsburd B.l. The serotyping of Azospirillum spp. by ccll-gold immunoblotting // FKMS Microb. Lett. - 1992. -96.-P. 115-118.

4. Matora L„ Solovova G., Serebrennikova 0„ Selivanov N., Shchyogolev S. Immunological properties and evaluation of the involvement of bacterial lipopolysaccha-rides in plant-azospirilium contact interaction // Proc. Ist European Nitrogen Fixation Conference & Workshop «Safe Application of Genetically Modified Microorganisms in the Environment»! Ed. G, Kiss, G. Endre. - Szeged: Officina, 1994, - P. 347.

5. Chumakov M., Solovova G„ Vclikov V„ Kurbanova 1„ Matora L., Shchyogolev S, Wheat root-associated Agrobuclcritwi radiobacter // proc, 1st European Nitrogen Fixation Conference & Workshop «Safe Application of Genetically Modified Microorganisms in the Environment» / Ed. G. Kiss, G. Endre. - Sieged: Officina, 1994. - P.275-279.

6. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. On the involvement of lipopolysaccharide in bacteria-plant contact interactions for nitrogen-fixing associative bacteria of the genus Azospirillum // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications / Eds. I. Tikhonovich, N. Provorov, V. Romanov, W.E. Newton. - Dordrecht: Kluwer Academic, 1995. - P. 340,

7. Matora L„ Solovova G., Serebrennikova O,, Selivanov N., Shchyogolev S. Immunological properties of Azospirillum cell surface: the structure of carbohydrate antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction // Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology / Eds. I. Fendrik, M. Del Gallo, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy. - NATO AS! Series G: Ecological Studies. - Berlin: Springer, 1995. - Vol. G37. - P. 377-382.

8. Dykman L., Matora L., Bogatyrev V. Use of colloidal gold for obtaining antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. - 1996, - 24. - P. 247-248.

9. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-спепифическпх полисахаридов почвенных азотфи кси ру ющ их бактерий AzospiriUum brasilense И Микробиология. - 1998.-Т. 67, .Na 6. - С. 815-820.

10. Katzy L., Matora L., Serebrennikova О., Scheludko A. Involvement of a 120-MDa plasm id of Azospirllum brasiense Sp245 in production of lipopolysaccha-rides// Plasmid. -1998. -40. - P. 73-83.

11. Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Sumaroka M.V., Colina M., Rcnou-Gonnord M.-F., Ignatov V.V. Spectroscopic characterization of cell membranes and their constituents of the plant-associated soil bactcrium AzospiriUum brasilense // Journal of Molecular Structure. - 1999. - 480-481. - P. 387-393.

12. Kamnev A.A., Matora L.Yu„ Serebrennikova O.B., Antonyuk L.P., Renou-Gonnord M.-F., Ignatov V.V. FTIR spectroscopic study of Hpopolysacchande-containing cell components of the bacteria AzospiriUum brasilense U Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions / Eds. J. Grcve, G.J. Puppels, C.Otto. -Dordrecht: Kluwcr, 1999. - P. 459-460.

13. Matora L.Yu„ Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu, Structurization effects of the AzospiriUum lipopolysaccharides in cell suspensions U Biomacromolccules. -2001. - V. 2, Jfe2. - P. 402-406.

14. Бурыгнн Г.Л., Матора Л.Ю., Щегодев С.Ю. Изменение антигенных свойств липополисахаридов AzospiriUum brasilense при внесении в среду культивирования Трис(гилроксиметил)аминометака // Прикл. биохим. и микробиол. -2002. - Т. 38, №3.- С. 292-294.

15. Матора Л.Ю., Щсголев С.Ю. Ангигенная идентичность лнпополнеахари-дов, капсулы и экзополисахарилов AzospiriUum brasilense // Микробиология. - 2002. - Т. 71, №2. - С. 211-2I4.

16. Капы Е.И., Борисов И,Б., Петрова Л.П., Матора Л.Ю. Использование фрагментов 85- и 120-МДа плазмид AzospiriUum brasilense Sp245 для изучения плазм ид ной перестройки у этой бактерии и для поиска гомологичных последовательностей в плазмидах AzospiriUum brasilense Sp7 // Генетика. - 2002. -Т.38, №2. - С. 182-189.

17. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин ГЛ., Щеголев

C.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации AzospiriUum brasilense 11 Микробиология. - 2003. - Т. 72, №1. - С. 60-63,

18. Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. A method for studying insoluble immune complexes // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - V. 1670, № 3. - P. 199-207.

19. Khlebtsov B.N., Buiygin G.L., Matora L.Y11., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. Structure of insoluble immune complexes as studied by spectroturbidimetry and dynamic light scattering// Coherent Optics of Ordered and Random Media IV / Ed.

D. A. Zimnyakov. - Bellingham, Washington: SPIE, 2004. - Vol. 5475. - P. 26-37.

20. Практические занятия no физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров: Учебное издание / И.Н. Клочкова, С.А. Конкова,

Л.Ю. Магора, Г.Л. Бурыгнн, С.Ю. Щеголев / Под ред. С.Ю. Щеголева. - Саратов: Изд-во Сараг. ун-та, 2003. - 87 с.

21. Бурыгин Г.Л., Матера ЛЛО., Щеголев С.Ю. Способ получения липополиса-харидов // Патент РФ № 2237719, Бюл. № 28, 10.10.2004 г., МКИ С 12 Р 19/04

22. Чумаков М., Иванова (¡Матора) Л., Емиев В. Модифицированный метод выделения ассоииатнвкых азотфмксируюших бактерий из корней злаков // Известия ТСХЛ. -1987, выи.З.- С. 112-115.

23. Баберднна И., Иванова (Матора) Л„ Шварибурд К., Матора Л., Скворцов И., Игнатов В. Кислые экзополисахариды A.brasileme Sp7: выделение, очистка и иммунохимия // Тез. VIII Всес. конф. «Химия и биохимия углеводов» - Тбилиси, 1987.- Пуши но: ОНТИ НЦБИЛНСССР, 1987.-С.113.

24. Bogatyrev V., Ivanova (Matora) L., Schwartsburd B„ Khlcbtsov N. Use of colloidal gold in immunodot technigue // Abstr. XIXй1 FEBS Meeting. - Home, 1989. - P.30.

25. Шварибурд Б., Щегол ев С., Матора Л., Игнатова В. О-антигенныЙ состав клеточной поверхности бактерий A. brasilense Sp7 // Тез. Всес. конф. «Регуляция микробного метаболизма» - Пущино, 1989.- С.22.

26. Schwartsburd В., Matora L„ Zhemerichkin D„ Ignatov V. O-specific polysaccharides of A.brasilcnse Sp7: immunochemical activity and structure of immunodominant sites // Abstr. Vth Europ. Carbohydrate Symp. - Prague, 1989. - P.69.

27. Matora L., Bogatyrev V., Dykman L„ Katzy E„ Schwartsburd. Effect ofplasmid content on cell-surfase antigens of A. bras Heme Sp245 // Abstr. V,!l Int. Symp. on Nitrogen Fixation with non-legumes. - Florence, Italy, 1990. - P.97.

28. Schwartsburd В., Shchyogolev S., Matora L„ Ignatov V. Cell surface carbohydrate antigens of soil nitrogen-fixing bacteria of Azospirilium genus: immunochemical aspects // Abstr, VIй Europ. Symp. on Carbohydrate Chemistry «Euro-carb VI». - Heriot-Watt University, Edinburg, Scotland, 1991. - P. 18.

29. Matveev V., Bogatyrev V., Dykman L„ Matora L„ Schwartsburd B, Changes of physico-chemical properties of A.brasik'me Sp7 cell surface in consequence of R-S dissociation // Abstr. VIIIth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation «Nitrogenfix'92». - Saratov, Russia, 1992. - P.75.

30. Schwartsburd В., Matora L., Bogatyrev V„ Dykman L., Shchyogolev S. Structure of the cell surface carbohydrate determinants and its dependence on the plasmid content in bacteria of the genus Azospirilium // Abstr. VI IIth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation «Nitrogenfix'92». - Saratov, Russia, 1992.-P.43.

31. Chumakov M., Velikov V., Solovova G„ Matora L„ Shchyogolev S. Root acco-ciated non-pathogenic agrobacteria from wheat // Abstr. Iм European Nitrogen Fixation Conference. - Szeged, Hungary, 1994.-Abstr.68.

32. Solovova G., Matora L., Bogatyrev V., Dykman L„ Shchyogolev S„ Chumakov M. Short-term colonization and attachment of bacteria of the famcly Rhizobiaceae and of the genus Azospirilium to plant roots // Abstr, NATO Advanced Research Workshop on Azospirilium and Related Microorganisms. - Sarvar, Hungary, 1994.

33. Matora L.T Solovova G., Serebrennikova О., Selivanov N., Shchyogolev S. Immunological properties of Azospirillunt cell surface: the structure of carbohydrate antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction // Abstr. NATO Advanced Research Workshop on AzospiriUum and Related Microorganisms. - Sarvar, Hungary, 1994.

34. Mагора JI„ Соловова Г., Серебренникова О., Селиванов Н„ Щеголсв С. О роли л и по пол и сахар ило в бактерий при их контактных взаимодействиях с растениями для ассоциативных азотфиксаторов рола AzospiriUum II 9-й Ба-ховский коллоквиум по азотфиксаиии: Сб. тез.- Пушнно: ОНТИ ПНЦ, 1995. -С.58.

35. Matora L„ Schwartsburd В., Shchyogolev S. Lipopolysaccharidcs from soil bacteria of the genus AzospiriUum: immunochemical properties and epitopes structure tt Abstr. Iй Intern. Conf. on Polysaccharide Engineering. - Trondheim, Norway, 1994.

36. Petrova L„ Alenkina S., Matora L. Studies of AzospiriUum mutants with altered surface structures It Abstr. 10th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation.- St,-Petersburg, Russia, 1995. - Abstr. 119.

37. Matora L., Bogatyrcv V., Dykman L., Shchyogolev S. Development of an efficient immunoassay system for monitoring soil nitrogen-fixing bacteria associated with higher plants tt Abstr. Intem. Workshop on Assoc. Interactions of Nitr.-Fixing Bacteria with Plants. - Saratov, Russia, 1995. - P. 25.

38. Matora L., Schwartsburd В., Shchyogolev S. Comparative immunochemical analysis of exocellular and somatic AzospiriUum polysaccharide antigens It Abstr. Intem. Workshop on Assoc. Interactions of Nitr.-Fixing Bacteria with Plants. -Saratov, Russia, 1995. - P. 68.

39. Matora L., Sercbrennikova O., Ponomareva T„ Petrova L„ Shchyogolev S, R-S dissociation in A.brasiiense Sp7: immunochemical aspects // Abstr. 2м European Nrfixation Conf. - Poznan, Poland, 1996. - P.I81.

40. Kurbanova I.V., Solovova G.K., Matora L.Yu„ Shchyogolev S.Yu., Markelova T.S., Ishin A.G., Chumakov M.I. Behaviour and wheat root colonization by attachment-deficient agrobacterial strains // Abstr. Vllft Intern, Symposium «Nitrogen Fixation with Non-Legumes». - Faisatabad, Pakistan, 1996.-P. 131.

41. Matora L., Serebrennikova O., Sumaroka M., Shchyogolev S. Immunochemical heterogeneity of the iipopolysaccharide from AzospiriUum brasilense Sp245// Abstr. 3d Eur. Nrfixation Conf. - Lunteren, The Netherlands, I998.-P. 177.

42. Matora L., Sumaroka M.T Dykman L,, Serebrennikova O., Shchyogolev S. Revealing a cap on the polar flagcMum of AzospiriUum brastlense Sp245 // Abstr. Xll"1 Int. Congr. on Nj-fixation. - Parana, Brasil, 1999,- P.99.

43. Butygin G., Matora L„ Shchyogolev S. Structural alteration of lipopolysaccharidcs from the nitrogen-fixing bacteria AzospiriUum brasilense as a result of a modification of culture growth conditions tt Abstr. IVй1 Eur. N;-fixation Conf. -Sevilla, Spain, 2000. - P.135.

44. Serebrennikova O.B., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Shchyogolev S.Yu. Development of an immunoassay system for monitoring soil nitrogen-

fixing bacteria azospirillum associated with higher plants // Abstr. Vth John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology' - Push-chino, 2000. - P.83.

45. Бурыгнн Г.Л., M агора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Изменение структуры лшюпо-лисахарилов почвенных азотфиксируюших бактерий A. brasHeme Sp245 при модификации условий культивирования // Сб. тез. межвузовской конференции молодых ученых «Растение, микроорганизмы и среда». - Санкт-Петербург, 2000. - С. 15.

46. Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Иммунохимическая гетерогенность линонолисахарилов почвенных азотфиксируюших бактерий Azospirillum brastknse Sp7 и Sp245 // Сб. тез. Школы-конференинн «Горизонты физико-химической биологии». - Ну щи но: Путинский научный нентр РАН, 2000. - Т. 2. - С. 109-110.

47. Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Изучение линонолисахарилов почвенных азотфиксируюших бактерий рода Azospirillum // Сб. тез, Конф. «Молодые ученые Вол го-Уральского региона на рубеже веков». - Уфа: Башкирский университет, 2001. - Т. 2. - С. 23-25.

48. Бурыгнн ГЛ., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Исследование гомологичных структур в составе лип о пол и сахар ила и полярного жгутика бактерий рода Azospirillum // Сб. тез. Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов: Изд-во Саратовского университета, 2002. - С. 14.

49. Бурыгин ГЛ., Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Быстрый метод скрнннрования мутантов по структуре л ипо полисахар ила ассоциативных бактерий рола Azospirillum И Сб. тез. VI Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». - Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л.Н. Толстого. 2002. -Т. 3. - С. 10.

50. Burygin G.L. Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu. Investigation of homologous structures that are part of the lipopoly saccharide and the polar fl age Hum of Azospirillum brasilonsc // Abstr, Xth Intern, Congr. on Bacteriology and Applied Microbiology «The World of Microbes». - Paris, Francc, 2002, - P. 261.

51. Katzy E.I., Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Borisov I.В., Kamncva А.В., Matveeva E.V., Matora L.Yu„ Burygin G.L. Properties of piant-grovvth-promoting rhizo-bacterium Azospirillum brmilcusc relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediation // Abstr. Int. Symp. «Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Environmental Pollutants». -Saratov: Saratov University Publishing House, 2003, - P. 15.

52. Matora L.Yu„ Burygin G.L., Shchyogolev S.Yu. Immunochemical analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Abstr. Xl-th Int. Congr. on Molccular Plant-Microbial Interactions «New bridges between Past and Future». - St.-Petersburg, Russia. 2003.-P. 309.

53. Плешакова H.B., Матора Л.Ю, Изучение эффективности биоремелнаини нефтезагрязненной почвы при интродукции в нее штамма fihociococciis maris АМЗ // Научные труды Международного бно технологического нентра Ml "У:

тезисы докладов второй международной научной конференции «Биотехнология — охране окружающей среды» и третьей школы-конференции молодых ученых и студентов «Сохранение биоразнообразия и рациональной использование биологических ресурсов», Москва 25-27 мая 2004 rJ Ред. А.П. Садчиков, C.B. Котелевцев. - М: Изд-во «Спорти культура»,2004.-С. 178.

к 1 S^S/< /£''

/

5; Hcc^.-^ ■

Подписано в печать 05.07.2004. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Бумага типовая. Объём 2,65 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ №7

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13