Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum

Матора, Лариса Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum"

На правах рукописи

МАТОРА Лариса Юрьевна

УГЛЕВОДНЫЕ АНТИГЕНЫ И ИХ ВКЛАД В СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДААгОБРШЬЬиШ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Т. М. Тараненко

доктор биологических наук с.н.с. Т.С. Калебина

доктор биологических наук профессор В.И. Панасенко

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии (г. Санкт-Петербург - Пушкин)

Защита состоится «22» декабря 2004 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиология растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан « ЯГ » ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Бактериальная поверхность представляет собой сложную комбинацию разнообразных иммуногенных компонентов, и точное устройство этой антигенной мозаики часто зависит от условий культивирования организма, так же, как и от его генетического потенциала. Это не статичная, строго очерченная химическая структура, ее состав может являться отражением условий, в которых организм обнаруживается в какое-то определенное время (Freer, 1985). Понимание свойств поверхности требуется для адекватного контроля над такими процессами, как бактериальная адгезия, адсорбция и клеточное разрушение. Изучение поверхностных структур, вовлеченных в контактные взаимодействия микроорганизмов с растениями, обоснованно занимает одно из центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений (Dazzo and Brill, 1979; Kato et al, 1980; Noel, 1992; Smit et al, 1987, 1989; 1992; Hrabak et al, 1981; Whatley et al, 1976; Matthysse et al., 1981; Newman et al., 2000 и др.). Компоненты клеточной поверхности рассматриваются также в качестве важных хемотаксономических маркеров для идентификации и классификации бактерий (Hancock and Poxton, 1988).

Хорошую перспективу при исследовании поверхностных бактериальных структур имеют подходы с применением методов иммунохимии (Кэбот и Мейер, 1968; Кульберг, 1985; Kabat, 1976; Westphal et al, 1983). Однако число работ с использованием подобных приемов при исследовании представителей почвенной микрофлоры ко времени начала наших исследований было сравнительно невелико. В том числе это касалось бактерий p. Azospirillum (Döbereiner and Day, 1976), которые, благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяйственных растений, на протяжении последних трех десятилетий являются модельным объектом в исследовании феномена растительно-микробной ассоциативности. Изучение деталей строения их бактериальных структур, являющихся основными поверхностными антигенами, представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность выяснить, как в целом организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы для создания биоспецифических зондов при экологических и таксономических исследованиях азоспирилл.

Среди мажорных антигенов бактериальной поверхности азоспирилл как грамотрицательных микроорганизмов особый интерес представляет липополиса-харид (ЛПС) или О-антиген. Строение его О-специфического полисахарида (0-ПС) определяет иммунохимическую специфичность микроорганизмов, что служит основой для их надежной внутривидовой классификации (Staub et al., 1959; Westphal et al., 1983). К моменту начала нашей работы не существовало развитой системы серологической классификации бактерий p. Azospirillum и отсутствовали сведения об антигенной специфичности их ЛПС как наиболее важного хемо-таксономического критерия. Данные углеводные структуры являются также важными детерминантами, участвующими в процессах моле^лярного «узнавания» при формировании ассоциативных с соавт.,

j бкБлиатвд А* i

2001). В этой связи представляют интерес сведения о степени гетерогенности и о химическом строении и локализации их антигенных детерминант (эпитопов), позволяющие судить об «архитектуре» поверхности клеток азоспирилл. Сочетание результатов иммунохимического анализа различных ЛПС с результатами их спектроскопических исследований может дать основания для заключения о принципиальных различиях (или сходстве) в общей химической структуре 0-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий. Кроме того, несомненный интерес представляют результаты сравнения иммунохимиче-ской специфичности ЛПС и капсульных полисахаридов (КПС), на основании которых можно делать вывод о наличии или отсутствии индивидуального кап-сульного антигена (К-антигена) у бактерий p. Azospirillum, что является принципиально важным фактом при построении системы серологической классификации данных бактерий.

После получения доказательств гликозилированности флагеллина полярного жгутика у различных бактерий (Doig et al, 1996; Biimer and Montie, 1998; Wyss, 1998 и др.) стало очевидным, что спектр углеводных антигенов бактериальной поверхности должен (или может) расшириться за счет углеводных компонентов жгутика как Н-антигена. В связи с этим представляется актуальным выяснение иммунохимической специфичности углеводных структур, выявленных в составе полярного жгутика азоспирилл (Moens et al, 1995), и ее сравнение с иммунохимическими характеристиками ЛПС и капсульных полисахаридов.

Выяснение влияния R-S диссоциации, характерной для бактерий р. Azospirillum, на иммунохимические свойства их клеточной поверхности представляется нам весьма значимым фундаментальным аспектом, позволяющим полнее выявить закономерности бактериальной колониально-морфологической изменчивости и расширить представления о «динамике» и изменчивости бактериальной поверхности. Среди проблем, связанных с оценками возможных функций ЛПС азоспирилл в реализации растительно-микробных взаимодействий (связанных, в частности, с их экологическим поведением в прикорневой зоне), видное место занимает изучение способности ЛПС стимулировать явления агрегации разнообразных клеточных суспензий.

Ключевыми методологическими аспектами в практике иммунохимическо-го анализа являются проблема получения специфических антител как основного исследовательского «инструмента», а также разработка эффективных процедур выделения бактериальных антигенов.

Целью настоящей работы было изучение углеводных антигенов бактерий p. Azospirillum и оценка их вклада в архитектуру клеточной поверхности бактерий.

В данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать эффективные методики получения моноспецифических антител, обеспечивающих направленный скрининг углеводных антигенов клеточной поверхности азоспирилл.

2. Выполнить сравнительное изучение антигенных свойств и установить состав антигенов для липополисахаридов и внеклеточных полисахаридов мо-

дельных штаммов А. ЬгазИепзе.

3. Оценить изменения в структуре ЛПС типового штамма А Ьrasilense при R-S диссоциации.

4. Исследовать иммунохимическую специфичность ЛПС типового штамма А. Ьrasilense.

5. Провести сравнительный серологический анализ различных штаммов азос-пирилл с использованием антител, специфичных к углеводным антигенам их клеточной поверхности.

6. Сравнить иммунохимические и спектрофотометрические характеристики ЛПС штаммов азоспирилл, принадлежащих к различным серотипам.

7. Оценить иммунохимическую специфичность углеводных фрагментов гли-козилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл.

8. Провести исследования агрегационных эффектов бактериальных ЛПС в клеточных суспензиях азоспирилл и модельных клеточных суспензиях.

9. Оптимизировать способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС.

Научная новизна работы определяется ее следующими основными результатами:

• Впервые выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов штаммов А. Ьrasilense Sp7 и Sp245, сопровождающаяся отсутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена. Оценен вклад отдельных О-специфических полисахаридов в формирование кап-сульного и экзополисахаридного слоя.

• Описан новый характер микробной R-S диссоциации, обусловленной изменяющимся вкладом двух О-антигенов в архитектуру клеточной поверхности в зависимости от возраста культуры.

• Впервые получены данные о моносахаридном составе эпитопов и серотипе типового штамма А. Ьrasilense Sp7.

• Обнаружено, что разные О-специфические полисахариды, определяющие гетерогенность ЛПС А. Ьrasilense Sp245, отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий на лабораторных средах.

• У модельных штаммов А. Ьrasilense впервые выявлено наличие прочно связанного чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика.

• Установлено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма А. Ьrasilense Sp7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

• Впервые систематизированы структурообразующие свойства ЛПС азоспи-рилл в клеточных суспензиях.

Практическая значимость работы.

В работе предложен эффективный способ иммунизации животных целыми клетками, обработанными глутаровым альдегидом, обеспечивающий получение моноспецифических антител на бактериальные ЛПС, демонстрирующих

штаммовую специфичность. Создана биотест-система серологической идентификации бактерий рода Л?,о$рт11ыт, учитывающая иммунохимические особенности их липополисахаридных антигенов. Разработан новый способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС, защищенный патентом РФ.

Полученные данные, характеризующие особенности антигенного строения клеточной поверхности азоспирилл, могут способствовать разработке адекватных представлений о механизме ассоциативных взаимоотношений между растениями и почвенной микрофлорой. Выполненная в работе идентификация 0-специфического полисахарида, гомологичного по составу основным внеклеточным структурам Л. brasilense, обеспечивает целенаправленный поиск эффективных биоспецифических зондов при проведении цитохимических, таксономических и экологических исследований азоспирилл.

Результаты диссертационной работы применяются при проведении научных исследований в Лаборатории генетики, Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур, Лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и др. Они используются автором при проведении лекционных занятий по курсу «Основы аналитической иммунохимии» и практических занятий со студентами, подготовке ими курсовых и дипломных работ в Учебно-научном центре физико-химической биологии Саратовского госуниверситета и ИБФРМ РАН. Материалы диссертации использованы при написании методического пособия «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Предварительная обработка клеточной поверхности глутаровым альдегидом исключает иммунный ответ на нативные мембранные белки и обеспечивает синтез антител на углеводные соматические бактериальные антигены. Получаемые при этом антитела имеют штаммовую специфичность.

• ЛПС штаммов Л. ЬгазИете 8р7 и 8р245 обладают выраженной иммунохими-ческой гетерогенностью, выражающейся в наличии двух фракций 0-антигена, регистрируемых в составе бактериального ЛПС.

• Я-8 диссоциация типового штамма Л. brasilense 8р7 имеет нетипичный характер. В этом случае не происходит кардинальных изменений в структуре О-специфических полисахаридов, а изменяется лишь их антигенность.

• Иммунодоминантными моносахаридами в составе антигенных детерминант липополисахарида штамма Л. brasilense 8р7 являются галактоза и рамноза.

• У штаммов Л. brasilense 8р7 и 8р245 отсутствует индивидуальный капсуль-ный антиген, а капсульный слой и экзополисахарид иммунохимически идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий.

• Полярный жгутик бактерий рода Лzospirillum покрыт чехлом (ли-по)полисахаридной природы, ассоциированным с поверхностью флагеллы и обладающим экранирующим эффектом.

• Н-антиген демонстрирует наличие антигенных перекрестов у представителей видов А. brasilense и А. lipoferum. Углеводные фрагменты: гликозилированно-го флагеллина полярного жгутика штамма A brasilense 8р7 антигенно идентична: фрагментам соматического антигена.

• Спектры поглощения света препаратами ЛПС имеют характерные отличия для серологически различных штаммов, а изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелируют с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

• Препараты: ЛПС азоспирилл проявляют различные типы: структурообразующих эффектов в суспензиях растительный, бактериальных клеток и эритроцитов.

• Обработка протеиназой К высокомолекулярного ЛПС-содержащего комплекса, экстрагированного из наружной мембраны азоспирилл, обеспечивает получение высокоочищеннык препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих эффективное разделение при электрофорезе в полиакриамидном геле (ПААГ).

Апробация работы. Основныге положения диссертации быши представлена: в виде устных и стендовых сообщений на VIII Всесоюзной конференции «Химия и биохимия углеводов» (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); II Всесоюзном семинаре «Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов» (Саратов, 1991); МП Восточноевропейском симпозиуме по биологической азотфикса-ции «Мйх^епИх^» (Саратов, 1992); I Европейской конференции по азотфикса-ции (Сегед, Венгрия, 1994); VI Рабочем совещании «Az,ospirittum и родственные микроорганизмы» (Шарвар, Венгрия 1994); IX Баховском коллоквиуме по азот-фиксации (Москва, 1995); X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995); VIII Международном конгрессе по молекулярным растительно-микробным взаимодействиям (Ноксвилл, Теннеси, США, 1996); II Европейской конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996); XI Международном конгрессе по азотфиксации (Париж, Франция, 1997); Ш Европейской конференции по азотфиксации (Люнтерен, Нидерланды, 1998); X Международном Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002); XI Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям растений и микроорганизмов (Санкт-Петербург, 2003); Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений в условиях техногенных загрязнений» (Саратов, 2003); Ш Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004), а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 23 июня 2004 года.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 53 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, восьми глав с изложением результатов работы: и их обсуждением, заключения, выводов и спи-

ска цитируемой литературы, включающего 459 источников. Диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста, содержит 62 рисунка и 6 таблиц.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н., профессор Щего-лев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Создание эффективной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бактерий, ассоциированных с высшими растениями», выполненному в соответствии с Госзаказом от Миннауки РФ в рамках ГНТП «Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии» (Распоряжение № 816ф от 15.03.95 г. и последующие, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.). Работа поддержана грантами Комиссии РАН по работе с молодежью по итогам конкурсов 2002-2004 г.г. по поддержке базовых кафедр и филиалов кафедр, созданных при институтах РАН, грантом Президента РФ № НШ-1529.2003.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ, грантом Саратовского Международного центра перспективных исследований 98-4-04, фантом INTAS 96-1015 и фантами NATO LST.CLG 975040 и LST.EV 980093.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы, состоящем из 5 разделов, дано описание бактерий рода Azoospirillum как модельного объекта в исследованиях эффектов ассоциативности; изложено строение наружной мембраны фамотрицательных бактерий; дана подробная характеристика липополисахаридов как мажорных компонентов мембраны и важнейших углеводных антигенов (О-антигенов); приведено описание антигенных свойств и структуры капсульных полисахаридов (К-антигенов) и полярных жгутиков (Н-антигенов); проанализирована роль поверхностных структур микроорганизмов в растительно-микробных взаимодействиях и в процессах бактериальной афегации; дано описание иммунохимических подходов в исследовании поверхности почвенных бактерий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной главе приводится характеристика использованных в работе бактериальных штаммов и мутантов. Описаны методики получения антител (Ат), препаратов углеводных антигенов (Аг) и препаратов полярного жгутика азоспи-рилл. Дано описание экспериментов, основанных на иммунопреципитации. Приведены методики денатурирующего электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга, иммуноферментного анализа (вариант ELISA), дот-анализа целых клеток, имму-ноэлектронной микроскопии и радиоиндикаторного анализа. Описано использование конкурентного иммуноанализа при оценке строения углеводных эпитопов бактерий и определения иммунохимической активности О-ПС с применением

метода спектротурбидиметрии. Дано описание методики оценки подвижности бактериальных клеток. Описаны приемы исследования агрегации клеток в суспензиях, агглютинации эритроцитов и фазового разделения их суспензий.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Разработка способа получения моноспецифических антител на О-антигены и модификация способа выделения высокоочищенных препаратов ЛПС

3.1.1. Оценка эффективности иммунизации животных целыми бактериальными клетками, обработанными бифункциональным реагентом. В

работе предложена новая методика иммунизации целыми бактериальными клетками, позволяющая получать антитела на углеводные антигены бактерий, минуя стадии термической обработки клеток и дополнительной очистки антисывороток. Предлагаемая методика заключается в иммунизации животных отмытыми от капсулы бактериальными клетками, обработанными 2%-ным раствором глу-тарового альдегида (ГА). Установлено, что антитела к клеткам, обработанным ГА, в отличие от антител к интактным клеткам, не взаимодействуют с белками, входящими в состав экстракта бактериальных мембран, образуя четкую линию преципитации с липополисахаридной фракцией (0-антигеном) (рис. 1). Результаты сравнительного анализа антител на хроматографически очищенный препарат ЛПС штамма Cd с антителами, полученными с помощью предлагаемого нами способа, подтверждают, что иммунизация животных целыми бактериальными клетками, обработанными ГА, приводит к получению высокоспецифичных антител на ЛПС исследуемых бактерий. При этом в отличие от антител к интактным клеткам, они демонстрируют штаммовую специфичность (рис. 2). Четкая перекрестная реакция, сравнимая с прямой реакцией по интенсивности, наблюдается только для близкородственных штаммов (на рис. 2 - для штаммов Cd и Sp7).

Данный способ иммунизации успешно апробирован на других грамотри-цательных бактериях. В частности, получены специфичные антитела к штаммам Agrobacterium radiobacter P221 и 5D-I. Кроме того, имеется положительный опыт получения специфичных антител к углеводным антигенам клеточной поверхности грамположительных бактерий на примере штамма Rhodococcus maris AM3.

Рис. 1. Результат линейного иммуноэлектрофо-реза экстракта наружных мембран штамма Cd с гомологичными антителами, полученными к обработанным ГА (1) и к интактным (2) клеткам.

Рис.2. Результаты иммунодиффузион-ного анализа экстрактов наружных мембран штаммов А. ЬгазИвтв Сё (1), Яр245 (2), Яр7 (3), Ж125А2 (4) и Яр 107 (5) с антителами к штамму Сё, полученными к интактным (А) и обработанным ГА (Б) клеткам.

3.1.2. Обсуждение возможного механизма ингибирования глутаровым альдегидом иммунного ответа на нативные белковые поверхностные антигены. Механизм ингибирования глутаровым альдегидом иммунного ответа на нативные белковые поверхностные антигены связан, по нашему мнению, со способностью ГА взаимодействовать со свободными аминогруппами в белках и с химической бифункциональностью этого реагента. Мы установили, что способность ГА перекрестно сшивать белки не только исключает иммунный ответ на нативные белковые антигены, но также обеспечивает устойчивость фиксированных клеток к их разрушению под влиянием таких химических соединений как додецилсульфат натрия (ДСН) и 2-меркаптоэтанол, являющихся компонентами буфера для приготовления образцов для денатурирующего электрофореза. Показано, что стандартная процедура получения клеточного ли-зата, заключающаяся в кипячении бактериальных клеток в буфере для образцов, в случае предварительной обработки раствором ГА не приводит к разрушению клеток. Можно предположить, что активация глутаровым альдегидом, модифицируя белковые эпитопы, исключает иммунный ответ на нативные мембранные белки, и, одновременно с этим, перекрестно сшивая их, обеспечивает более длительную персистенцию бактерий в ходе иммунизации. При этом бактерии могут более эффективно исполнять роль корпускулярных адъювантов иммунного ответа, что приводит к получению антисыворотки, демонстрирующей высокий титр О-специфических антител. Титры антисывороток против обработанных и ин-тактных клеток составляют 1:20000 и 1:5000, соответственно.

3.2. Модификация способа получения высокоочищенных препаратов ЛПС. В основу предложенного нами способа быстрого получения высокоочи-щенных препаратов бактериальных липополисахаридов легли два различных метода выделения ЛПС. Первый из них основан на экстракции ЛПС из бактериальной мембраны с помощью хелатирующего агента ЭДТА в Трис-HCl буфере (Leive et al, 1968). При использовании второго метода высокоочищенный, не содержащий белка препарат ЛПС получается в результате обработки предварительно лизированных бактерий высокоэффективным протеолитическим ферментом протеиназа К (Hitchcock and Brown, 1983).

Предложенный нами упрощенный способ получения высокоочищенных бактериальных ЛПС заключается в протеиназной обработке не лизата бактерий, а солюбилизата их наружных мембран. Данный способ позволяет упростить процедуру выделения чистого ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных

клеток в присутствии ДСН, что обеспечивает отсутствие примесей этого соединения в получаемом препарате ЛПС. Кратко предлагаемый способ состоит в следующем. Бактерии выращивают на соответствующей питательной среде при оптимальной температуре культивирования до логарифмической фазы роста. Затем их отделяют от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстрагируют из них комплекс, состоящий из липополисахарида и белка, путем добавления к клеточной массе буферного раствора, содержащего ЭДТА в количестве 0.01 - 0.05 мМ на 1 г влажных клеток. Экстракт отделяют от интактных бактериальных клеток с помощью центрифугирования и добавляют к нему протеиназу К до конечной концентрации 80 мкг/мл. Данную смесь инкубируют в течение 60 мин при температуре 56-60°С. Получаемый ЛПС используют как в растворе, так и после выделения его из раствора с помощью стандартных процедур осаждения.

Препарат ЛПС, полученный с помощью предложенного нами способа, образует более чёткий трек при электрофоретическом разделении, чем препарат ЛПС, полученный при протеиназной обработке целых клеток (рис. 3 А). При этом ЛПС, полученные всеми тремя способами, идентичны с иммунохимической точки зрения (рис. 3 Б).

1 2 3

Следовательно, в ре-

Рис. 3 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС 8р245, полученных протеиназной обработкой бактериального лизата (1), экстракцией из целых клеток с помощью ЭДТА (2) и протеи-назной обработкой экстракта, выделенного с помощью ЭДТА (3). Б. Результаты иммунодиффузионного анализа данных препаратов с Ат на ЛПС 8р245.

зультате протеиназной обработки экстракта наружной мембраны, полученного экстракцией ЭДТА, мы получаем препарат ЛПС, применимый для анализа в ПААГ и демонстрирующий при электрофорезе более чёткое разделение. При этом данный препарат ан-тигенно идентичен ЛПС, выделенному из бактериального лизата, но выгодно отличается простотой получения. Выделенный описанным способом препарат, благодаря отсутствию трудноудалимых примесей ДСН, может быть использован не только в электрофоретиче-ских экспериментах, но и в широком наборе микробиологических, биохимических и иммунологических исследований.

Глава 4. Иммунохимический анализ ЛПС модельных штаммов

Azospirillum br asílense 4.1. Анализ строения О-антигенных детерминант типового штамма А.

brasilense Sp7. По результатам химического анализа в составе ЛПС типового штамма A. brasilense Sp7 было выявлено несколько О-ПС (Жемеричкин с соавт., 1989). Для оценки иммунохимической активности отдельных фракций О-ПС мы применили известный подход с использованием эффекта торможения процесса образования нерастворимых комплексов Ат+ЛПС при добавлении к смеси реагентов «конкурентных» фракций О-ПС с заранее определенной структурой (Кэ-бот и Мейер, 1968; Kabat, 1976, 1980). При этом оказалось возможным усовершенствовать традиционную процедуру, используя способность О-ПС даже при малых концентрациях (менее 2 мкг/мл) образовывать нерастворимые комплексы со специфичными антителами. Последние, таким образом, могут быть удалены из раствора, например, центрифугированием. Мы определяли концентрацию преципитата, образующегося при взаимодействии препарата суммарного ЛПС, выделенного с поверхности бактерий, с антителами в растворе, истощенном предварительной обработкой исследуемым О-ПС. По уменьшению концентрации образовавшегося преципитата (по сравнению с таковой, полученной при использовании неистощенного раствора Ат) судили об иммунохимической активности данного О-ПС.

На рис. 4 приведены результаты спектротурбидиметри-ческого определения концентрации С иммунных комплексов ЛПС+Ат до истощения (данное значение С было принято за 100%) и после истощения растворов антител одним из О-ПС данного штамма, чей моносахарид-ный состав был определен в работе Жемеричкина с соавторами (1989). Можно констатировать, что этот О-ПС связывает примерно до 50% антител, полученных против целых клеток A. brasilense Sp7. Эта оценка согласуется с наличием у данного штамма двух О-ПС, более детально исследованных нами в экспериментах, представленных в следующих

разделах. Полученные результаты были сопоставлены с данными независимого метода - ингибирования реакции преципитации в геле. В результате иммуно-диффузионного анализа был зарегистрирован выраженный ингибирующий эффект исследуемого О-ПС.

Рис. 4. Влияние истощения растворов антител фракцией О-ПС на массово-объемную концентрацию С частиц иммунных комплексов ЛПС+Ат в зависимости от концентрации Со-пс полисахарида.

Мы провели оценку валентности данного О-ПС, т.е. числа детерминант-ных групп (или мест связывания антител) в расчете на одну молекулу антигена. Это число устанавливали методом Кэбота (Кэбот и Мейер, 1968), определяя молярное отношение Аг/Ат в преципитате в зоне эквивалентности (максимума кривой осаждения). Анализ состава преципитата показал, что отношение молярных концентраций О-ПС и Ат составляет приблизительно 1:6. При данных вычислениях значения молекулярной массы антител и полисахаридов принимали равными 160 КДа (Кэбот и Мейер, 1968) и 15 КДа (Жемеричкин соавт., 1989), соответственно. Допуская, что оба активных центра Ат связаны с детерминантами полисахарида, можно получить, что в рассматриваемой молекуле О-ПС имеется 12 мест связывания с антителами. Эти оценки согласуются с числами мест связывания, приведенными в литературе для других микробных полисахаридов с близким химическим составом и молекулярной массой (Кэбот и Мейер, 1968; Соловьева с соавт., 1986).

Нами оценен ингибирующий эффект моносахаридов, входящих в состав исследуемого О-ПС - галактозы, галактуроновой кислоты и рамнозы. Для сравнения в качестве ингибиторов были использованы также глюкоза и мальтоза. Концентрацию моносахаридов Ю^М выбирали с заведомым избытком по отношению к концентрации специфических антител. Оптимальное соотношение концентраций Аг и Ат для последующего построения традиционных кривых осаждения подбирали с помощью метода спектротурбидиметрии. Результаты, представленные на рис. 5 показывают, что по убыванию степени торможения иммунохимических реакций данные моносахариды можно расположить в следующей последовательности: галактоза (кривая 3), рамноза (кривая 4) и глюкоза (кривая 5). Галакту-роновая кислота практически не оказывала влияния на полноту осаждения комплексов ЛПС+Ат, и кривая осаждения для Ат, обработанных этим моносахаридом, фактически совпадает с контрольной кривой осаждения для необработанных Ат (кривая 6).

Следует отметить, что, несмотря на избыток концентрации ингибирующих моносахаридов, степень торможения, характеризуемая уменьшением С, составляет, например, для рамнозы и галактозы лишь около

С, мкг/мл

20 40 60 80

Рис. 5. Зависимость концентрации преципитата С в смеси ЛПС + Ат от концентрации антигена Слпс при добавлении до КГ4 М галактозы (3), рамнозы (4), глюкозы (5) и га-лактуроновой кислоты (6) в сравнении с контролем (растворы Ат без моносахаров) (6, темные ромбы).

30-f40%. Однако, эти значения близки к результатам, приведенным в литературе для других систем с низкомолекулярными ингибиторами реакций ЛПС + Ат (Jam and Westphal, 1975), не превышающим, как правило, 50%. Можно предположить, что существование предела степени ингибирования связано с тем, что терминальным моносахаридом блокируется только часть объема активного центра антител, рассчитанного на большую по размеру детерминанту.

В качестве независимого метода для сравнительного анализа ингибиру-щей активности моносахаридов использовали двойную радиальную иммуно-диффузию. Добавление к раствору Ат галактозы и рамнозы приводило к существенному ослаблению линий преципитации по сравнению с контролем (без добавления моносахаридов). Таким образом, и в этом случае эффективными ингибиторами для реакции между ЛПС A. brasilense Sp7 и антителами являются галактоза и рамноза, что свидетельствует об их доминирующем положении в составе антигенных детерминант. Следовательно, именно эти моносахаридные остатки вносят определяющий вклад в серотип данного микроорганизма, представляющий собой всю совокупность О-антигенных детерминант, выявляемых в серологическом анализе.

4.2. Выявление нетипичного характера R-S диссоциации штамма Л. brasilense Sp7. Явление колониально-морфологической изменчивости или диссоциации бактерий известно с 20-х годов прошлого века как своеобразная форма изменчивости, в основе которой лежат мутации, и изучено, главным образом, на примере патогенных бактерий. Согласно традиционным представлениям о микробной диссоциации, различие между R- и S-вариантами обусловлено отсутствием О-специфических цепей в составе ЛПС R-варианта.

В 1987 г. впервые была обнаружена спонтанная изменчивость морфологии колоний типового штамма A. brasilense Sp7 (Матвеев с соавт., 1987). Было показано, что образование стабильной S-формы штамма Sp7 связано с исчезновением в его плазмидном профиле плазмиды 115 МДа (р115). Авторы предположили, что pi 15 может обуславливать диссоциативные переходы у A. brasilense Sp7.

Мы отметили, что по внешнему виду колонии 18-часовых культур Sp7-R и Sp7-S не отличаются друг от друга, однако по прошествии примерно 72 часов исходный штамм Sp7-R формирует на твердой среде шероховатые колонии с неровным краем. В тех же условиях колонии мутантного Sp7-S штамма остаются гладкими и блестящими и не проявляют даже со временем фенотипических признаков, характерных для исходного штамма. В этой связи нам представлялось целесообразным проследить за изменением ЛПС R- и S-форм типового штамма A. brasilense Sp7 в зависимости от возраста культур. В работе использовали культуры, выращенные в течение 18 ч на жидкой малатной среде, а также выращенные в течение 72 ч на среде того же состава с добавлением 1.5% агара. Основным инструментом анализа служили антитела на ЛПС, полученные для 18-часовых и 72-часовых культур R- и S-форм. Однородность культур контролировали по плазмидному составу: наличию (у Sp7-R) и отсутствию (у Sp7-S) в плазмидном профиле p115 (анализ плазмидного профиля по методу Экхардта (Eckhardt, 1978)

2 3

Рис. 6. А. Результаты линейного иммуно-электрофореза препаратов ЛПС, выделенных из 18-часовой И-формы (2) и из 18-часовой Б-формы (З), с Ат на ЛПС 18-часовой Б-формы (а), 72-часовой Б-формы (Ь), 18-часовой И-формы (с) и 72-часовой И-формы (ё); В. Результат электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС, выделенных из 18-часовой И-формы (2) и 18-часовой Б-формы (З).

проводила старший научный сотрудник группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН Л.П. Петрова).

Сравнение результатов иммунизации кроликов 18- и 72-часовыми культурами Я-формы штамма Бр7 выявило исчезновение в иммуноэлек-трофоретическом профиле 72-часовой И-формы одной из двух полос преципитации, выявляемых антителами к 18-часовой И-форме (рис. 6 А, с, ё). Для Б-формы наблюдали обратную картину: одна из двух полос преципитации не выявлялась с помощью антител к 18-часовой Б-форме (рис. 6 А, а), и только антитела к 72-часовой Б-форме выявляли оба антигена в соста-

ве препаратов ЛПС штамма Sp7 (рис. 6 А, b). В то же время, сами препараты ЛПС были идентичны между собой по числу выявляемых (двух) антигенных компонентов (рис. 6 А) и демонстрировали одинаковые электрофоретические профили в ПААГ-электрофорезе (рис. 6 В). Также было показано, что спектры поглощения продуктов реакции с фенолом и серной кислотой у ЛПС R- и S-форм штамма Sp7 практически совпадают. В соответствии с результатами работы (Dubois et al, 1956), совпадение этих спектров для исследуемых препаратов свидетельствует о близости их тотального мо-носахаридного состава.

Следовательно, для штамма A. brasilense Sp7 мы обнаружили нетипичный случай R-S диссоциации, при которой не происходит качественных изменений в структуре полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность. Полученные результаты позволили нам предположить, что R-S диссоциация А. brasilense Sp7 состоит в изменении у мутантного S-варианта особенностей синтеза одного из О-ПС, который мы условно обозначили как R-антиген. Второй из двух идентифицированных О-ПС мы обозначили как S-антиген. В соответствии со схемой, представленной на рис. 7, мы полагаем, что основной вклад в формирование характерной морфологии колоний 72-часовой R-формы, очевидно, вносит R-антиген. Преимущественным синтезом именно этого О-ПС на достаточно поздних стадиях роста дикого штамма и его экранирующим действием по отношению ко второму О-ПС (S-антигену) можно, по-видимому, объяснить морфологические и иммунологические особенности R-формы A. brasilense Sp7. У 18-

^Хформа ^S-c

TtllTí

с*

форма

Рис. 7. Предполагаемая схема распределения 0-антигенов при R-S диссоциации штамма A. brasilense Sp7 (темные кружки - R-антиген, светлые кружки - S-антиген).

часовой S-формы R-т Q антиген, очевидно, экранирован S-антигеном, и

"""N. заметно иммуногенным рма 18 ч > ^ тт^

г этот О-ПС становится

------только у 72-часовой S-

формы бактерий.

Иммунофермент-ный анализ позволил нам визуализовать R- и S-антигены в электро-форетическом профиле ЛПС штамма Sp7 с помощью антител к ЛПС S-формы. На рис. 8 можно видеть, что антитела к ЛПС 18-часовой S-формы четко выявляют

S-антиген и практически не выявляют R-антиген, в то время как антитела к ЛПС 72-часовой S-формы выявляют оба антигена в составе ЛПС, поскольку, как было отмечено выше, у старой культуры S-формы наряду с S-антигеном иммуногенным становится также и R-антиген.

Имеется достаточно оснований для заключения о том, что, как R-так и S-вариант данного штамма имеют полноценный ЛПС с развитой структурой О-антигена. Переход от R- к S-варианту связан, по нашему мнению, с перераспределением вкладов двух О-ПС (четко выявленных как у исходного штамма, так и у его S-мутанта) в архитектуру клеточной поверхности бактерий в зависимости от возраста культур и коррелирует с исчезновением из экстрахромосомного состояния плазмиды 115 МДа. 4.3.1. Исследование иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов штамма A. brasilense Sp245. Иммунохимиче-ские исследования ЛПС, выделенных из наружной мембраны бактерий дикого штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов с измененной структурой ЛПС,

Рис. 8. Результат электрофореза в ПААГ препарата ЛПС, выделенного из 18-часовой R- формы (А) и визуализация 8- и R-антигенов в иммуноблоттинге с Ат к молодой 8-форме (В) и старой 8-форме (С).

Рис. 9. Результат иммуно-диффузионного анализа препаратов ЛПС штаммов 8р245 (1), КМ018 (2), КМ252 (3) и КМ 348 (4) с Ат против ЛПС исходного штамма (А).

Рис. 10. Результат линейного иммуно-электрофореза препаратов ЛПС КМ018 (1), 8р245 (2) и КМ252 (3) с Ат против ЛПС исходного штамма.

позволили установить, что для штамма 8р245 (как и для типового штамма 8р7) характерно наличие двух О-ПС в составе ЛПС, которые мы обозначили как О-ПС1 и О-ПС2. При иммунодиффузионном анализе (рис. 9) антитела против ЛПС исходного штамма выявляют О-ПС1 в препарате ЛПС мутантного штамма КМ018 и О-ПС2 - в препаратах ЛПС штаммов КМ252 и КМ348. По результатам линейного иммуноэлектрофореза (рис. 10) данные О-ПС отличаются по заряду: О-ПС1, имеющий анодную подвижность, является кислым полисахаридом, а О-ПС2 - нейтральным. Данные химического анализа подтвердили наличие двух 0-ПС в составе ЛПС данного штамма. ЛПС мутанта КМ252 содержал только нейтральный О-ПС, а ЛПС мутанта КМ018 - только кислый О-ПС (Fedonenko & т, 2002).

Тандемный иммуноэлектрофорез выявил наличие общих антигенных детерминант не только в составе ЛПС исходного штамма и его мутантов (рис. 11)

мощью кислотного гидролиза, не выявили различий в строении данных структур. ИК- и ЯМР-спектры исследуемых полисахаридов оказались идентичными и го-

Рис. 11. Результат тандемного иммуноэлектрофореза препаратов ЛПС КМ252 (1), 8р245 (2) и КМ018 (3) с Ат на ЛПС исход-

2 3 1

(о чем свидетельствуют сливающиеся пики преципитации), но и в составе фракций О-ПС1 и О-ПС2 при непосредственном сравнении их между собой. При этом на данных иммуноэлектрофореграммах отчетливо наблюдаются и так называемые шпоры - продолжения линий преципитации, отмеченные стрелками. Наличие шпор, в свою очередь, говорит о том, что в составе О-ПС2 имеются антигенные детерминанты, отсутствующие у О-ПС1.

ного штамма.

Результаты химического анализа препаратов О-ПС1 и О-ПС2, полученных с по-

ворят о том, что данные О-ПС представляют собой гомополимеры D-рамнана (Fedonenko et al., 2002). Сумма полученных результатов подтверждает известное положение о том, что основную роль в определении серологической специфичности О-антигенов играют не мажорные полисахариды, а так называемые 0-факторы или антигенные детерминанты в составе О-ПС (Lüderitz, 1966; Staub and Tinelli, 1957; Staub, 1964). В соответствии с этим, главным отличием О-ПС2 от О-ПС1 следует, вероятно, признать антигенную гетерогенность этого полисахарида, обусловленную присутствием в структуре его цепи, по крайней мере, двух различающихся по химическому строению антигенных детерминант.

4.3.2. Изменение антигенных свойств О-специфических полисахаридов штамма A. brasilense Sp245 при модификации условий культивирования. Различия двух О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС А. brasilense Sp245, не исчерпываются различиями их антигенных свойств. Мы установили, что данные О-ПС отличаются также по способности к модификации антигенных детерминант под влиянием внешних факторов. В частности, к модификации, являющейся результатом присутствия катионов Трис в среде культивирования.

Для выделения ЛПС мы, наряду с другими подходами, проводили экстракцию нативного ЛПС с поверхности бактериальной клетки с помощью ЭДТА в Трис-HCl буфере (Leive et al, 1968). В данной методике рекомендуется при выращивании бактерий добавлять в среду культивирования 0.1 М Трис-HCl буфер, поскольку при экстрагировании ЛПС Трис оказывается токсичным для клеток, не адаптированных к его присутствию. Токсический эффект Трис заключается, в частности, в повышении проницаемости наружной мембраны бактерий, вероятно, посредством нарушения ионных взаимодействий (Irvin et al., 1981). До наших исследований в литературе не было сведений о том, что Трис, широко используемый для приготовления буферных систем, модифицирует те или иные бактериальные структуры. Анализ возможных антигенных модификаций ЛПС представлялся нам актуальным в связи с известной способностью катионов Трис электростатически взаимодействовать с ЛПС (David et al, 1994).

Мы установили, что добавление Трис в среду для культивирования азос-пирилл приводит к блокированию взаимодействия отдельных структур в составе ЛПС со специфическими антителами. На рис. 12 А представлены результаты иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС штаммов Sp245 и КМ018 (имеющего только О-ПС1 в составе ЛПС), выделенных из бактерий, выращенных до логарифмической фазы роста как на среде, содержащей Трис, так и без него. В иммунодиффузионном профиле ЛПС штаммов, выращенных на среде, содержащей Трис, практически не выявляется полоса преципитации, соответствующая О-ПС1. Следовательно, Трис, будучи добавленным в среду культивирования, изменяет структуру антигенных детерминант только одного из двух О-ПС штамма Sp245. Рис. 12 А показывает, что подобные изменения картины взаимодействия с антителами у данного О-ПС не обнаруживаются ни при внесении в среду культивирования 0.1 М HEPES, ни при замене среды культивирования.

Кроме того, у ЛПС штамма КМ018, выращенного в присутствии Трис, в электрофоретическом профиле в ПААГ отсутствует серия полос с молекулярной

1 2 3

1^2

211 6

Рис. 12. А. Результаты иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС Бр245 и КМ018 с Ат против ЛПС Бр245 (а). 1 - Бр245, 2 -КМ018, 3 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 4 -Бр245, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 5 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М НЕРЕБ, 6 - КМ018, выращенного на среде ЕВ. Б. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр245 (1), КМ018 (2) и ЛПС КМ018, выращенного на среде, содержащей 0.1 М ТРИС (3).

массой около 30 кДа, характерных для дикого штамма и мутанта (рис. 12 Б). В то же время спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС штамма КМ018, выращенного как в присутствии Трис, так и без него, практически не различаются между собой, что свидетельствует о близости их моносахаридного состава.

Таким образом, мы продемонстрировали, что Трис(гидрокси-метил)аминометан не является инертным соединением и может взаимодействовать с исследуемыми объектами - в частности, модифицировать антигенные детерминанты бактериальных ЛПС. Нами показано, что разные О-ПС, входящие в состав ЛПС А. brasilense Бр245 отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом присутствия катионов Трис в среде культивирования.

4.3.3. Исследование иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов штамма А. Ьга811ете Sp7 и близкородственных штаммов. Был проведен сравнительный иммунохимический анализ О-ПС, входящих в состав ЛПС A. brasilense Бр7, генетически родственного ему штамма

Сё, а также производного от 8р7 штамма 7.К.2. Различия в строении ЛПС данных близкородственных штаммов позволили оценить иммунохимическую гетерогенность двух О-специфических полисахаридов типового штамма Az,ospiriHum brasilense.

Штамм Л. brasilense Сё был выделен из корней Cynodon dactylon после инокуляции этого растения культурой 8р7 (Eskew et ак, 1977). 8р7 и Сё демонстрируют выраженные различия роста на плотной среде. Кроме того, у штамма Сё не отмечено возрастных изменений морфологии колоний, и он не претерпевает, в отличие от 8р7, К-8 диссоциацию на минимальных синтетических средах. Как и в случае штамма 8р7-8 (Матвеев с соавт., 1987), плазмидный профиль Л. brasilense Сё отличается от такового у 8р7 отсутствием р115 (Петрова с соавт., 2004).

Результаты линейного иммуноэлектро-фореза ЛПС этих штаммов (рис. 13) говорят о том, что в составе ЛПС штамма Сё имеются как К-, так и 8-О-ПС, характерные для штамма 8р7. Однако оба его О-ПС выявляются только антителами на ЛПС штамма 8р7, в то время как антитела на ЛПС самого штамма Сё визуализуют в составе его ЛПС только один О-ПС. Результаты денатурирующего электрофореза в ПААГ позволяют сделать вывод о том, что в структуре ЛПС Л. brasilense Сё произошли изменения, не позволяющие достичь разделения двух О-ПС (рис. 14).

ЛПС спонтанного мутанта 7. К. 2 отличается от ЛПС 8р7 тем, что в его иммунодиф-фузионном профиле выявляется только К-О-ПС. Электрофоретическое разделение ЛПС 7.К.2 в ПААГ демонстрирует отсутствие 8-О-ПС в составе его ЛПС (рис. 14). При этом в плазмидном профиле данного штамма, как и у 8р7-8 и Сё, не визуализуется плазмида 115 МДа.

В связи с выявленными особенностями строения, получение антител на О-антиген спонтанного мутанта 7.К.2 представлялось нам очень перспективным в плане исследования имунохимической гетерогенности ЛПС типового штамма 8р7. Получение антител на

Рис. 13. Результат линейного иммуноэлектрофореза препаратов ЛПС штаммов 8р7(1) и Сё (2) с Ат на ЛПС штаммов Сё(3) и Бр7(4).

1 2 3 Рис. 14. Результат электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС штаммов Сё (1), 8р7 (2) и 7.К.2 (3).

ЛПС штамма 7.К.2 и анализ их взаимодействия с различными антигенами позволили нам прийти к заключению о том, что R-O-ПС - это иммунохимически гетерогенный полисахарид. На рис. 15 приведены результаты иммунодиффузионного анализа антител на ЛПС 7.К.2 с препаратами ЛПС штаммов Sp7 и 7.К.2. Можно видеть, что антитела на ЛПС 7.К.2 распознают детерминанты, характерные для S-антигена. В то время как реакция иммунодиффузии с собственным антигеном завершается образованием одной полосы преципитации, реакция с ЛПС исходного штамма Sp7 образует весь спектр полос, характерных как для R-, так и для S-антигена. Следовательно, на поверхности R-O-ПС выявляются все антигенные детерминанты, характерные для полноценного ЛПС штамма Sp7.

Обобщая результаты иммунохимического анализа ЛПС модельных штаммов A. brasilense, можно констатировать, что главным отличием двух О-ПС, выявляемых в составе ЛПС Sp7 и Sp245, является антигенная гетерогенность одного из полисахаридов, обусловленная наличием в его структуре, по крайней мере, двух различающихся по своему строению О-факторов или антигенных детерминант. При этом второй О-ПС у обоих штаммов иммунохимически гомогенен и идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС. Кроме того, результаты исследования различий иммунохимических и физико-химических характеристик ЛПС типового штамма A. brasilense Sp7 и близкородственных штаммов (выполненные совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН) позволили прийти к заключению о том, что выявленные различия их ЛПС определяются наличием, а также способом поддержания в клетках фрагмента 115 МДа.

Глава 5. Сравнительный иммунохимический анализ ЛПС, капсульных полисахаридов и экзополисахаридов Azospirillum brasilense

Помимо ЛПС, углеводными компонентами клеточной оболочки грамот-рицательных микроорганизмов являются внеклеточные полисахариды - полисахариды капсулы и экзополисахариды (ЭПС). В некоторых случаях, по химической и антигенной структуре КПС, ЭПС и ЛПС оказываются идентичными (Бот-винко, 1985; Kenne and Lindberg, 1983; Jann and Jann, 1990 и др.). Нами был проведен детальный сравнительный анализ антигенных свойств ЛПС A. brasilense Sp7 и Sp245, их О-ПС, КПС и ЭПС. Препараты КПС и ЭПС были любезно предоставлены Д.А. Жемеричкиным и С.А. Коновой.

По результатам иммунодиффузионного анализа с антителами на ЛПС препараты КПС и ЭПС штамма Sp7 образуют сливающиеся полосы преципитации с одним из двух О-ПС, входящим с состав ЛПС данного штамма. Результаты линейного иммуноэлектрофореза говорят о том, что антигенные детерминанты

Рис. 15. Результат иммуно-диффузионного анализа препаратов ЛПС штаммов Sp7(l) и 7.К.2 (2) с Ат на ЛПС 7.К.2 (Ат).

всех трех препаратов обладают близкими значениями электрофоретической подвижности. Рис. 16 демонстрирует результаты перекрестного иммуноэлектрофо-реза препарата ЛПС (А), тандемного перекрестного фореза ЛПС и ЭПС (Б) и слитного ракетного фореза ЛПС и КПС (В). В данном случае КПС и ЭПС образуют общие пики преципитации с ЛПС, не формируя при этом дополнительных пиков. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что ЛПС данного штамма имеет аналогичные иммунодетерминантные участки как с КПС, так и с ЭПС. Учитывая, что согласно данным Конновой с соавторами (Konnova et al., 1994), названные полимеры имеют одинаковый моносахаридный состав, можно говорить об отсутствии у штамма Sp7 специфического капсульного антигена. По-видимому, капсула и ЭПС в данном случае представляют собой 0-специфические фрагменты ЛПС, экскретируемые клеткой в окружающую среду.

Рис. 16. Результат перекрестного иммуноэлектрофореза (А), тандемного перекрестного иммуноэлектрофореза (Б) и слитного ракетного иммуноэлектрофореза (В) препаратов КПС (2), ЭПС (3) и ЛПС (4) штамма 8р7 с Ат на ЛПС данного штамма.

Мы обнаружили принципиальное отличие данных внеклеточных полисахаридов и О-ПС, являющихся частью липополисахарида исследуемых бактерий. Изолированный препарат ЭПС штамма 8р7, несмотря на антигенную идентичность полисахаридным структурам ЛПС, проявил в наших экспериментах крайне низкую иммуногенность. При исследовании сывороток крови кроликов, иммунизированных ЭПС двумя различными способами (внутривенно и подкожно) мы не обнаружили присутствие антител в концентрации, достаточной для проявления эффекта иммунопреципитации. Иммунный ответ на ЭПС нам удалось обнаружить только с помощью более чувствительного, однако, косвенного приема -метода бактериальной агглютинации. Значение титров агглютинации и при первом, и при втором способах иммунизации оказалось одинаковым и достаточно низким - 160+320. Принципиально важным для нас представляется тот факт, что

сыворотки против ЭПС содержали антитела, агглютинирующие фиксированные и живые клетки, отмытые от капсулы, в одинаковых титрах. Относительно слабая иммуногенность внеклеточных полисахаридов в сравнении с бактериальными ЛПС (несмотря на выявленную антигенную идентичность данных структур), вероятно, объясняется тем, что именно ЛПС с полноценной структурой обладает способностью взаимодействовать с самыми различными клеточными рецепторами и клетками иммунной системы животных.

Аналогичные результаты, свидетельствующие об антигенной идентичности углеводсодержащих компонентов клеточной поверхности, были получены нами при исследовании другого модельного штамма -A. brasilense Sp245. В данном случае для сравнения был использован мутант этого штамма - КМ018, в составе ЛПС которого присутствует только О-ПС1. На рис. 17 показан результат иммуно-диффузионного анализа препаратов ЛПС, КПС и ЭПС штамма Sp245 и ЛПС КМ018. Необходимо отметить, что терминами КПС и ЭПС здесь нами обозначены полисахарид-липидные комплексы, выделенные Конно-вой с соавторами (1994) из капсулы и куль-туральной жидкости Sp245, соответственно. Слияние полос преципитации, образованных КПС, ЭПС и О-ПС1, говорит о полной идентичности их антигенных детерминант. То есть, капсула и ЭПС штамма Sp245 состоят из вещества, содержащего антигенные детерминанты, идентичные таковым у О-ПС1. Таким образом, из двух О-ПС, выявленных в составе ЛПС исследуемого штамма, именно О-ПС1, очевидно, формирует вещество капсулы и ЭПС A. brasilense Sp245.

Имеются все основания предположить, что внеклеточные полисахариды Azospirillum brasilense, вероятно, представляют собой О-антигенные фрагменты липополисахаридов, экскретируемые бактериями в культуральную среду, и их идентификация в качестве капсулы или экзополисахарида зависит от прочности связи данных полисахаридов с поверхностью бактериальной клетки.

Глава 6. Изучение Н-антигенов бактерий p. Azospirillum

6.1. Выявление полисахаридного чехла на поверхности полярного жгутика. Известно, что полярные жгутики бактерий-монотрихов нередко имеют на своей поверхности чехол белковой или полисахаридной природы (Тимаков с соавт., 1983). В некоторых случаях было продемонстрировано участие ЛПС в формировании чехла, покрывающего полярный жгутик бактерий (Thomashow and Rittenberg, 1985; Fuerst and Perry, 1988; Doig and Trust, 1994).

С помощью электронной микроскопии и антител на ЛПС нами впервые было выявлено наличие (липо)полисахаридного чехла на поверхности

зфз

Рис. 17. Результат сравнительного иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС (1), О-ПС1 (2), ЭПС (3) и КПС (4) Л. brasilense 8р245 с Ат к ЛПС данного штамма (а).

Рис. 19. Результат имму-нодиффузионного анализа препарата Л ПС (1) и препарата нативного жгутика (2) А. brasilense 8р245 с Ат на ЛПС данного штаммма (А).

Рис. 18. Взаимодействие конъюгатов протеин А-коллоидное золото с Ат на ЛПС A brasilense 8р245 с клетками данного штамма. Длина масштабной метки 200 нм.

полярного жгутика типовых штаммов бактерий рода Azospirillum. На рис. 18 показано взаимодействие коньюгатов протеин А - коллоидное золото и штаммос-пецифичных антител на ЛПС с бактериальной клеткой штамма А brasilense 8р245. Метка выявляет наличие антител на ЛПС не только на самой клетке, но и на поверхности полярного жгутика. При этом можно видеть, что антитела на ЛПС взаимодействуют не столько с поверхностью полярного жгутика, сколько с очехляющей его субстанцией. На рис. 19 приведены результаты сравнительного иммунодиффузионного анализа препарата нативного жгутика, не изолированного от чехла, и препарата ЛПС штамма 8р245 с антителами на ЛПС данного штамма. В данном случае препарат жгутика образует общую линию преципитации с одним из О-ПС, входящим в состав ЛПС 8р245. Второй О-ПС, характерный для ЛПС данного штамма, также присутствует в составе препарата жгутика, но линия преципитации, соответствующая ему, выражена намного слабее.

Мы полагаем, что (липо)полисахаридный чехол достаточно прочно связан со жгутиком, поскольку нам не удалось отделить его даже при ультрацентрифугировании препарата полярного жгутика в градиенте плотности сахарозы. Отделение чехла от жгутика оказалось возможным только в результате кислотной диссоциации полярного жгутика и его последующей реассоциации. Однако единственной структурой, сохраняющей свою нативность после описанных процедур с полярным жгутиком азоспирилл, был ЛПС, а вместо полимерного фла-геллина ассоциировались случайные конгломераты молекул.

6.2. Исследование углеводных фрагментов гликозилированного фла-геллина полярного жгутика. Исследование углеводных фрагментов полярного жгутика штамма А. brasilense 8р7, у которого впервые для азоспирилл было показано наличие данных структур (Моет et а1., 1995), проводили с помощью двух производных этого штамма - К5 и 7.К.2. Первый из этих производных был отобран Г. Александре. Штамм К5 характеризовался неподвижностью клеток и отсутствием в составе флагеллина полярного жгутика структур, выявляемых с по-

мощью красителей на углеводы. Штамм 7.К.2 был отобран нами с помощью им-мунодиффузионного теста с антителами на ЛПС штамма Sp7. Он, как было отмечено выше, отличался отсутствием в составе ЛПС одного из двух характерных

На рис. 20 А представлен результат иммуноблот-тинга препаратов полярного жгутика штаммов Sp7 и IZ5 с использованием антител на жгутик A. lipoferum 4B, любезно предоставленных Г. Александре (Alexandra et al., 1999). Взаимодействие антител на флагеллин штамма, относящегося к виду A. lipo-ferum, с препаратами полярного жгутика штаммов, относящихся к роду A. brasilense, свидетельствует о наличии родоспецифичных антигенных детерминант в составе Н-антигена у азоспирилл. Сохранившая у мутанта IZ5 способность взаимодействовать с данными антителами говорит о том, что его флагеллин, в отличие от углеводных фрагментов жгутика, очевидно, не претерпел каких-либо изменений. Результаты им-муноблотинга тех же препаратов полярного жгутика с антителами на ЛПС штамма Sp7 приведены на рис. 20 Б. В то время как антитела на флагеллин одинаково эффективно взаимодействуют с гликозилированным флагеллином дикого штамма и негликозилированным флагеллином мутанта IZ5, антитела на ЛПС распознают только препарат жгутика дикого штамма. При этом как у исходного штамма, так и у его мутанта антитела выявляют сопутствующий жгутику липо-полисахарид (чехол жгутика), мигрирующий в электрическом поле отдельно.

Следовательно, антитела на ЛПС распознают некие углеводные структуры, входящие в состав гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий дикого штамма и, очевидно, гомологичные отдельным фрагментам соматического антигена. Для получения ответа на вопрос, какие именно структуры в составе ЛПС штамма Sp7 антигенно идентичны углеводным компонентам фла-геллина полярного жгутика, мы использовали штамм 7.К.2.

Сравнительный электрофоретический анализ ЛПС штаммов Sp7 и 7.К.2 (рис.14) выявляет отсутствие S-O-ПС в составе ЛПС штамма 7.К.2. Поскольку выше было отмечено наличие перекрестной иммунологической реакции между

для Sp7 О-специфических полисахаридов.

12 12

Рис.20. А. Результат иммуноблотинга с Ат на флагеллин полярного жгутика А. Иро/вгыт 4В препаратов полярного жгутика Бр7 (1) и 125 (2). Б. Результат иммуноблотинга с Ат на ЛПС Бр7 препаратов полярного жгутика Бр7 (1) И 125 (2).

жгутиком и ЛПС, в частности - 8-0-ПС (рис. 20 Б), логичным представлялось предположение о том, что углеводные фрагменты полярного жгутика штамма 8р7 гомологичны фрагментам именно этого О-ПС. Электрофоретический анализ с последующей иммунодетекцией препаратов полярного жгутика показал, что мономеры флагеллина у штамма 7.К 2 имеют меньшую молекулярную массу и, в отличие от 8р7, не взаимодействуют с антителами на ЛПС этого штамма (рис.

21). В составе препарата жгутика исходного штамма антитела выявляют наличие

ЛПС, очехляющего жгутик (мигрирующего при электрофорезе отдельно), а также антигенные детерминанты ЛПС в составе собственно полярного жгутика, образующего в данном случае двойную полосу. При этом хорошо видно, что в составе препарата полярного жгутика 7.К.2 8-антиген не выявляется ни в составе собственно жгутика, ни в составе сопутствующего материала (чехла). В то же время второй О-ПС (Я-антиген) ви-зуализуется очень четко.

Полученные результаты позволили нам прийти к заключению о том, что углеводные структуры гликозилирован-ного флагеллина полярного жгутика штамма 8р7 могут являться, по своей сути, фрагментами 8-0-ПС данного штамма. Однако для того, чтобы сделать безоговорочный вывод об антигенной идентичности этих структур, необходимо было получить антитела на мономеры полярного жгутика данного штамма.

6.3. Получение и анализ антител на флагеллин А. brasilense 8р7. Самым важным этапом в решении этой задачи являлось получение флагеллина штамма 8р7, тщательно освобожденного от полисахаридного чехла. Мы использовали схему, предложенную Муравлевым с соавторами (1999), и получили антитела на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, разделенные с помощью электрофореза в ПААГ и извлеченные из геля путем специальной диффузии.

Результат сравнительной иммунодиффузии полученных антител на изолированный жгутик штамма 8р7 и антител на ЛПС данного штамма говорит о том, что субъединицы полярного жгутика имеют общие детерминанты с ЛПС (рис.

22). Мажорная шпора, отмеченная стрелкой на этом рисунке, в свою очередь, свидетельство того, что основной пул антител, полученных на изолированный полярный жгутик, специфичен именно Н-антигену. Углеводные детерминанты вносят очень небольшой вклад в иммунный ответ на изолированный жгутик, что доказывает картина преципитации при сравнении препаратов жгутиков 8р7 и

1 2

Рис. 21. А. Результат электрофореза в ПААГ препаратов полярного жгутика 8р7 (1) и 7.К.2 (2) (окраска Кумасси). Б. Результат иммунобло-тинга данных препаратов с Ат на ЛПС 807.

Рис. 22. Результат иммуно-диффузионного анализа препарата флагеллина

штаммма Sp7 (Аг) с Ат на ЛПС (1) и Ат на флагеллин (2) данного штамма.

Рис. 23. Результат иммунодиффузионного анализа препаратов флагеллина штаммов A. brasilenseSp7 (I, 4),A. brasilense7.K.2 (2), A. brasilense Sp245 (3), A. lipoferum Sp59b (5) и E. coli K12 (6) с Ат на флагеллин A. brasilense Sp7.

7.К.2 (рис. 23). Такой вклад данных структур в иммунный ответ может определяться, наряду с иными причинами, существенно меньшим их количеством (по сравнению с флагеллином) в составе полярного жгутика. Данный рисунок также демонстрирует характер взаимодействия антител на мономеры жгутика А brasilense Sp7 с препаратами изолированных жгутиков другого штамма этого же вида (A. brasilense Sp245), штамма другого вида (A. lipoferum Sp59b) и бактерий другого рода (Е. coli К12). Отсутствие взаимодействия антител со жгутиком £. coli - свидетельство родовой специфичности всех антигенных детерминант мономеров полярного жгутика азоспирилл. Различная интенсивность взаимодействия антител с препаратами жгутиков других штаммов может привноситься как штаммовой специфичностью детерминант их олигосахаридных фрагментов, так и наличием, наряду с родоспецифичными, видо- и штаммоспецифичных детерминант в составе самого флагеллина.

6.4. Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам. С целью проверки предположения об экранированности флагеллина полярного жгутика выявленным нами (липо)полисахаридным чехлом, мы провели серию экспериментов по исследованию подвижности азоспирилл штаммов Sp7 и Sp245 в присутствии антител на ЛПС данных штаммов и антител на флагеллин штамма Sp7 (работа выполнялась совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН). Мы судили о взаимодействии данных антител с полярным жгутиком азоспирилл, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя среднюю скорость движения у случайно выбранных подвижных единичных клеток. Во время наблюдений вели видеозапись на видеокамеру.

Диаграмма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток A. brasilense Sp7 от концентрации штаммоспецифичных антител на ЛПС (рис. 24) показывает, что увеличение концентрации данных антител приводило к полному прекращению движения бактерий. При этом добавление к клеточной суспензии как антител на флагеллин, так и антител на ЛПС другого штамма не приводило к такому эффекту. Из этого следует, что мономеры флагеллина у азос-пирилл действительно изолированы от окружающей среды (ли-по)полисахаридным чехлом и жгутик, вероятно, может участвовать в процессах прикрепления данных бактерий на корнях растения только

в качестве носителя субстанции, обеспечивающей адсорбцию.

Поскольку отмечено, что дефект гликозилирования полярного жгутика у азоспирилл не связан напрямую с утратой бактериальной подвижности, возникает вопрос о роли углеводных структур в составе флагеллы у этих бактерий. Антигенная идентичность этих структур с О-антигеном исключает предположение об умножении антигенного бактериального спектра, что присуще, к примеру, роду Campylobacter (Doig et al., 1996). Кроме того, такому предположению противоречит наличие у азоспирилл чехла, надежно изолирующего полярный жгутик. Основываясь на данных, полученных для гликозилированных пилинов (Marceau et al., 1998), а также учитывая тот факт, что традиционные процедуры диссоциации и реассоциации полярных жгутиков азоспирилл не приводят к образованию полимерного флагеллина, мы полагаем, что углеводные фрагменты в данном случае могут обеспечивать, главным образом, структурную стабилизацию флагеллы.

средняя скорость движения клеток

Рис. 24. Зависимость процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток А. brasilense Sp7 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма: 1 - контроль (без антител); 2 - 1 мкг/мл; 3-10 мкг/мл; 4-100 мкг/мл; 5-1000 мкг/мл.

Глава 7. Характеристика некоторых физико-химических свойств ЛПС

азоспирилл

7.1. Сравнение спектрофотометрических характеристик ЛПС различных серотипов. Для детектирования углеводов и определения их концентрации широко применяется колориметрический метод, основанный на способности растворов моно-, олиго- и полисахаридов и их производных приобретать жёлто-оранжевую окраску в присутствии фенола и концентрированной серной кислоты. При этом растворы различных моносахаридов демонстрируют индивидуальные особенности спектров поглощения света продуктами фенол-сернокислотной реакции (Dubois et al., 1956). Данный метод может быть также достаточно информативным при сравнительном исследовании различных углеводсодержащих биополимеров, поскольку спектрофотометрические характеристики растворов гетероолиго- и гетерополисахаридов определяются остатками моносахаридов, входящими в их состав.

Мы провели сравнение спектров поглощения света в интервале длин волн 400-520 нм продуктами фенол-сернокислотной реакции препаратов ЛПС, выделенных из различных штаммов Azospiril-lum brasilense. Были проанализированы препараты ЛПС четырех штаммов, принадлежащих к двум различным се-ротипам. На рис. 25 приведены спектры поглощения света продуктами фенол-сернокислотной реакции препаратов ЛПС (для краткости ниже мы их будем именовать «спектрами поглощения») для четырех штаммов азоспирилл, попарно демонстрирующих антигенные перекресты в иммунодоте с гомологичными антителами (Глава 8). Установлено, что спектры поглощения серологически близких штаммов Sp7 и Cd демонстрируют сходный характер и два пика поглощения (ктах\ = 410-420 нм и Лтах2 = 485 нм). В то же время, спектры поглощения препаратов ЛПС второй пары близкородственных штаммов - Sp245 и Sp 107 - имели только один выраженный пик поглощения (Хтах = 480 нм). Таким образом, принадлежащие к одному виду, но серологически различные штаммы A. brasilense обнаружили четкие отличия спектров поглощения ЛПС. что говорит о существенном различии их моносахаридного состава (Dubois et al. 1956).

400 410 420 430 440 450 460 470 460 400 500 510 520

>. НМ

Рис. 25. Спектры поглощения продуктов реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС Sp7, Сй, Sp245 и Sp107.

Проведенное сравнение спектров поглощения препаратов ЛПС A. brasilense Sp7 и Sp245 со спектрами их мутантов, дефектных по одному из двух О-специфических полисахаридов (О-ПС), выявленных в составе ЛПС показало, что иммунохимическая гетерогенность О-ПС в пределах одного штамма исследуемых бактерий не связана с радикальными различиями их моносахаридного состава. Сходный качественный характер спектров поглощения, выявленный нами в каждом из рассматриваемых случаев, говорит о принципиальном сходстве моносахаридного состава О-специфических полисахаридов в составе ЛПС данных штаммов. Отмеченные при этом количественные изменения спектров могут быть следствием тех тонких структурных различий, которые и определяют иммуно-химическую специфичность каждого конкретного О-ПС.

7.2. Оценка структурообразующих эффектов бактериальных липопо-лисахаридов в клеточных суспензиях азоспирилл и модельных клеточных суспензиях. Анализ литературных данных позволил нам предположить, что ЛПС бактерий p. Azospirillum могут выступать в роли структур, которые опосредуют взаимодействие данных бактерий между собой с образованием агрегатов, а также взаимодействие бактерий с корнями растений (Sadasivan and Neyra, 1985; Bashan et al, 1986; Okon and Kapulnik, 1986; Del Gallo et al, 1989; Madi and Henis, 1989; Michiels et al, 1990; Zaady et al, 1993 и др.). В данной части диссертационной работы представлены результаты исследования структурообразующих свойств ЛПС и ЛПС-содержащих препаратов, изолированных с поверхности клеток азоспирилл, в отношении суспензий растительных и бактериальных клеток (а также животных клеток - эритроцитов). Мы оценивали роль ЛПС как во взаимодействии между бактериальными и растительными клетками, так и во взаимодействии бактериальных клеток между собой во флоккулирующих культурах.

При изучении влияния ЛПС данных бактерий на суспензии растительных, бактериальных и животных клеток нам представлялось целесообразным использовать не только высокоочищенные препараты ЛПС, но и препараты липополи-сахарид-белковых комплексов (ЛПБК), поскольку именно в такой форме ЛПС азоспирилл может быть активен in vivo. В дополнение к ЛПС и ЛПБК, мы исследовали также взаимодействие с различными клеточными суспензиями О-специфических полисахаридов и белковых фракций, выделенных из ЛПБК.

Известно (Matthysse et al, 1987; Eyers et al, 1988), что бактерии родов Agrobacterium и Azospirillum способны агрегировать суспензии морковных клеток. При использовании данной модельной системы мы обнаружили, что предварительная обработка морковных клеток бактериальным ЛПС приводит к усилению эффекта сравнительно быстрой (порядка несколько секунд) агрегации суспензий штаммами Sp245 и Cd. Очевидно, что за такие короткие промежутки времени наиболее вероятно проявление так называемых «неспецифических» связей между компонентами микробных и растительных клеток по механизмам ван-дер-ваальсовых, электростатических и/или иных относительно слабых физико-химических взаимодействий без включения специфических ответных реакций со стороны партнеров.

С целью оценки возможного участия ЛПС азоспирилл на уровне таких неспецифических связей также и в бактериальной агрегации (или самоагрегации), мы провели соответствующие эксперименты со штаммом A. brasilense Sp245 с использованием ЛПС, выделенных из штаммов Sp245 и Cd. Было установлено, что во всех случаях непосредственно после добавления к гомогенной суспензии клеток штамма Sp245 препарата ЛПС до конечной концентрации 15 мкг/мл происходила агрегация бактериальных клеток (рис. 26). При этом оба препарата ЛПС, независимо от штамма, из которого они были выделены, действовали одинаково эффективно. Аналогичный результат был получен и при исследовании агрегации бактерий, относящихся к другому роду -Agrobacterium tumefaciens R10, под действием ЛПС A. brasilense Sp245. Как и в случае агрегации суспензии морковных клеток, бактериальная агрегация также имела обратимый характер - агрегаты разрушались при встряхивании суспензий и затем формировались вновь.

Представлялось целесообразным сопоставить концентрацию ЛПС, использованную во всех экспериментах в данной части нашей работы, с концентрацией ЛПС, выделяемого клетками в культуральную среду. Для ее оценки мы применили метод ракетного иммуноэлектрофореза с антителами против ЛПС штамма А. brasilense Sp245 (рис. 27). Можно видеть (ср. длину ракет), что концентрация ЛПС, экскретируемого клетками в культуральную среду, была порядка 10 мкг/мл (в случае 18-часовых культур) и 100 мкг/мл (в случае 48-часовых культур). Следовательно, концентрация ЛПС, использованная в наших модельных экспериментах, находилась в пределах значений, обусловленных продукцией бактериального ЛПС in vivo.

Данные, характеризующие способность препаратов ЛПС, ЛПБК, О-ПС и белковых фракций ЛПБК агрегировать суспензии морковных клеток и эритроцитов, а также суспензии бактерий родов Azospirillum и Agrobacterium, представлены в Таблице 1. Как ЛПС, так и ЛПБК вызывали агрегацию растительных и бактериальных суспензий, но не агрегировали эритроциты. В то же время ни О-ПС, ни белки, входящие в состав ЛПБК, не агрегировали ни один из видов клеточных суспензий, использованных в данных экспериментах.

1 2 3

4 5 6

Рис. 26. Влияние предварительной обработки культур морковных клеток препаратами ЛПС штаммов А brasilense 8р245 (1-3) и Сё (4-6) на степень их агрегации под действием бактерий данных штаммов. Контрольные (необработанные) суспензии (1, 4), суспензии, агрегированные под действием бактерий (2, 5), усиление агрегации за счет предобработки морковной суспензии бактериальными ЛПС (3,6).

Следующим структурообразующим эффектом исследуемых препаратов, обнаруженным в наших опытах, была клеточная агглютинация. В дополнение к морфологическим отличиям возникающих клеточных структур (см. ниже), время их образования при агглютинации (несколько часов) существенно превышало время, за которое происходила агрегация клеток (секунды). Результаты исследования агглютинации кроличьих эритроцитов препаратами ЛПС, О-ПС и белковыми фракциями ЛПБК штамма 8р245 приведены в той же Таблице 1. Титры агглютинации для ЛПС, О-ПС и белков составляли, соответственно, 2.5,0.625 и 1.25мкг/мл.

Рис. 27. Результат ракетного иммуно-электрофореза липополисахаридных антигенов: препараты ЛПС штамма А brasilense Sp245 (1-3) и образцы культу-ральной среды данного штамма , выращенного в течение 18 (4) и 48 (5) часов, при концентрации ЛПС 100 (1), 50 (2) и 25 (3) мкг/мл.

Таблица 1. Структурообразующая активность препаратов* наружной мембраны азоспирилл в клеточных суспензиях

Структурообразующий эффект Клетки Препараты

ЛПС ЛПБК О-ПС Белки

Агрегация Морковь + + - -

АювртИит ЬгаяНете Бр245 + + - -

Agrobacterium /ите/аает Ш0 + + - -

Эритроциты - - - -

Агглютинация + - + +

Фазовое разделение - + - -

* «+»- активны,«-» - не активны.

Что касается препарата ЛПБК, то для него был зарегистрирован иной тип структурообразования в клеточных суспензиях, кинетические параметры которого имели промежуточные значения по сравнению с параметрами, характерными

для эффектов агрегации и агглютинации клеток. Добавление к 2%-ной суспензии эритроцитов препарата ЛПБК в интервале его концентраций 10-5-40 мкг/мл вызывало относительно быстрое (за время порядка 10-20 минут) выделение клеток в отдельную гомогенную фазу. При этом в контроле (без добавления ЛПБК) наблюдалось относительно слабое проявление эффекта осаждения эритроцитов под действием силы тяжести. Эффект осаждения становился заметным (существенное просветление надосадка эритроцитарных суспензий) за несколько часов, что сопоставимо со временем проявления эффекта клеточной агглютинации. При использовании других препаратов (а также при более низких концентрациях ЛПБК) фазовое разделение суспензий эритроцитов не наблюдалось.

Методом иммунодиффузии была сделана сравнительная оценка концентрации ЛПБК в обеих фазах (рис. 28). Эти результаты показали, что ЛПБК в значительной степени был вытеснен из нижней (эритро-цитарной) фазы, что доказывает значительно более низкая концентрация иммунопре-ципитата, образовавшегося в геле. Эти наблюдения находятся в хорошем согласии с теоретическими и экспериментальными данными по фазовому анализу многокомпонентных систем с участием полимеров и коллоидных частиц (Непер, 1986; Литмано-вич с соавт., 1997).

Можно заключить, что, в зависимости от химического состава препаратов наружной мембраны азоспирилл, под влиянием их добавления к использованным суспензиям клеток возможно формирование агрегационных клеточных структур трех

типов. Они существенно отличаются друг от друга, как по скорости образования, так и по морфологическим свойствам.

Первый и второй типы связаны с эффектами клеточной агрегации и агглютинации. В соответствии с известным описанием структур, возникающих в результате агглютинации клеток (что находится в согласии нашими наблюдениями), их общие черты сходны с решеточной структурой иммунопреципитата (Bach, 1982). С физико-химической точки зрения в системе такого типа (условно неограниченного объема) могут возникать кластеры бесконечного размера, состоящие из связанных между собой клеток. Визуально это регистрируется в виде характерного преципитата, четко отличимого от конгломерата клеток, осевших на дне лунки под действием силы тяжести.

В противоположность агглютинации, эффект агрегации клеток, по всей видимости, обусловлен иными молекулярными механизмами. Результатом их действия является весьма быстрая (йЭДколыедФйкэддУ,! иатеря агрегационной ус-

b»£Jtfc<lTEM i С flcipSyjr { С.» 400 ЛП »

Рис. 28. Результат сравнительного иммунодиффузионного анализа образцов дисперсионной среды, взятых из фазы, обедненной (1) и обогащенной (2) эритроцитами с антителами против ЛПС штамма А brasilense 8р245 (А).

тойчивости клеточных суспензий. При этом размер образовавшихся кластеров остается конечным. Внешне это проявляется в формировании хлопьевидного осадка, видимого невооруженным глазом.

Третий тип структурообразования мы обнаружили при добавлении к суспензии эритроцитов препарата ЛПБК. Он проявляется в фазовомразделении системы с выделением клеток в хорошо наблюдаемую отдельную гомогенную жидкую фазу. Необходимо отметить, что подобное явление ранее было достаточно подробно описано для суспензий эритроцитов и культур клеток животных, подвергнутых действию протеогликанов и их комплексов (Бычков и Кузьмина, 1992), и объяснено, так называемым, эффектом «стерического исключения». Последний, по мнению цитируемых авторов, обусловлен возникновением в дисперсионной среде специфических пространственных структур, включающих в свой состав отрицательно заряженные полисахаридные цепи. Считается, что такие структуры связывают значительное количество молекул воды (что существенно влияет на термодинамические параметры системы) и уменьшают долю объема суспензии, доступного для клеток.

ЛПС являются сложными молекулами, содержащими в своем составе гидрофобные (липидные) фрагменты и проявляющими анионные свойства. В препарате нативного ЛПБК (в отличие ЛПС, полученного протеиназной обработкой) содержатся мембранные белки, а также в них оказывается существенно более высоким содержание липидов (Leive et al, 1968), что, очевидно, увеличивает степень гидрофобности молекул. На этом основании можно предположить, что бактериальные ЛПБК (подобно протеогликанам) могут действовать как неспецифические факторы по механизму стерического исключения (Бычков и Кузьмина, 1992), приводящему в наших экспериментах к разделению фаз в суспензиях эритроцитов.

Так называемое, «неспецифическое» (агрегирующее) действие ЛПС и ЛПБК на клеточные суспензии азоспирилл может иметь вполне определенный биологический смысл. Известна способность многих видов почвенных бактерий, в том числе, азоспирилл, образовывать агрегаты при их адгезии на корнях растений, а также наличие подобных скоплений бактериальных клеток в ризосфере (Matthysse, 1985; Okon and Kapulnik, 1986; Bashan et al., 1986; Arunakumari et al, 1992). В наших экспериментах (проведенных совместно с научным сотрудником Лаборатории генетики ИБФРМ РАН Солововой Г.К) было установлено, что предварительная обработка корней пшеницы препаратом ЛПС штамма А. brasilense Sp245 не снижает, как в аналогичных экспериментах с агробактериями (Whatley et al., 1976), а значительно увеличивает количество бактерий данного штамма, прикрепившихся к корням растений. Результаты радиоиндикаторного анализа, в частности, показали, что инкубация корней в растворе ЛПС с концентрацией 1.5 мг/г корня приводит к увеличению адсорбции азоспирилл на корнях пшеницы в 10 раз по сравнению с контролем (корнями, не подвергнутыми обработке ЛПС). С учетом результатов исследования структурообразующих свойств ЛПС азоспирилл, представляется очевидным, что предобработка корней, проводимая при избытке ЛПС, способствует агрегационным явлениям в бактериаль-

ной суспензии, что способствует увеличению адсорбции клеток (/ааёу et о.1, 1993). Вероятно, структурообразующие эффекты ЛПС азоспирилл, обильно экс-кретируемые данными бактериями в культуральную среду, можно рассматривать как проявление механизма адаптации, в том числе, облегчающего прикрепление бактерий к корням растений.

Глава 8. Тест-система серологической идентификации бактерий р. Azospirillum

О-антигенная специфичность антител, получаемых с помощью предложенного нами способа, легла в основу созданной тест-системы серологической идентификации бактерий р. Az,ospirillum и эффективного метода скринирования мутантов по структуре ЛПС. К настоящему моменту получен набор антител родовой и штаммовой специфичности и отработаны эффективные методики выявления специфических иммунных взаимодействий.

Для определения штаммовой принадлежности азоспирилл мы предлагаем использовать твердофазный шмуноанализ целыхклеток или иммунодиффузи-онный анализ углеводных антигенов, выделенных с поверхности клеток или из культуральной среды исследуемых бактерий. Кроме того, для быстрой штаммовой идентификации может быть использован тест на ингибирование подвижности азоспирилл при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС.

На рис. 29 приведен пример использования дот-анализа с гомологичными антителами целых бактериальных клеток шести штаммов азоспирилл, относящихся к видам А. Ьга-вИвтв и A. lipoferum. Специфические взаимодействия О-антигенов и антител в данном случае выявляются с помощью конъюгата протеин А -коллоидное золото. Перекрестные реакции отмечаются для двух пар штаммов - 8р245 и 8р107, а также 8р7 и Сё, что объясняется их близким родством. Известно, что штамм A. Ьrasilense Sp245, как и Sp107, был выделен из корней пшеницы, и их отличия заключатся в том, что первый был выделен в полевых, а второй - в лабораторных условиях (БаЫат et al, 1980, 1987). В свою очередь, штамм A. Ьrasilense Сё был выделен

из корней Cynodon dactylon после инокуляции этого растения культурой 8р7 (Eskew et al, 1977). Таким образом,

а б в г д е

1 С

6 *

Рис. 29. Результат дот-анализа целых клеток (а-е) с гомологичными антителами (1-6), выявляемыми конъюгатом протеин А-коллоидное золото: A. Ьrasilense 8р107(а, 1); A. Ьrasilense Сё (б, 2); А. ipoferum 59Ь (в, 3 ); Ьrasilense1М125А2 (г, 4); А brasilen.se 8р7(д, 5); A. Ьrasilense 8р245(е, 6).

иммунохимический анализ целых бактериальных клеток с использованием штаммоспецифичных антител на ЛПС позволяет быстро и достаточно надежно определять серотип бактерий p. Azospirillum. Дот-анализ целых бактериальных клеток азоспирилл со штаммоспецифичными антителами возможен также с использованием традиционных маркеров специфических иммунных реакций -ферментных меток.

Сравнительный иммунодиффузионный анализ О-специфических антигенов азоспирилл со штаммоспецифичными антителами - тест, основанный на им-мунопреципитации, - в некоторых случаях оказывается более информативным при серологическом анализе, поскольку позволяет выявлять тонкие различия в строении специфических антигенов у исследуемых штаммов и, в некоторых случаях, может демонстрировать наличие антигенных перекрестов, не обнаруживаемых в итоге твердофазного анализа. В частности, с помощью иммунодиффу-зионного анализа выявляется односторонняя реакция между антителами к штамму A. lipoferum 59b и ЛПС штамма A. brasilense Sp7. Последнее наблюдение свидетельствует о наличии общих О-факторов в составе ЛПС у штаммов, принадлежащих к разным видам p. Azospirillum. Эти данные согласуются с результатами сравнения последовательностей рДНК различных видов азоспирилл (Fani et al, 1995), говорящими о том, что виды A. brasilense и A. lipoferum среди сравниваемых видов наиболее близки между собой.

Следовательно, для проведения детального серологического анализа того или иного штамма азоспирилл перспективным представляется именно сочетание иммунохимических тестов, основанных на использовании метки (коллоидного золота, фермента и т.д.) в дот-анализе целых клеток, с иммунопреципитацион-ными экспериментами с использованием изолированных специфических антигенов данных бактерий.

Антитела на ЛПС исследуемых бактерий выявляют специфический антиген не только в составе препарата, изолированного с бактериальной поверхности конкретного штамма азоспирилл, но также в составе его культуральной среды. Этот факт позволяет использовать иммуноферментный анализ (метод ELISA) для количественного выявления бактерий изучаемых штаммов азоспирилл непосредственно в почвенных суспензиях. В результате наших экспериментов установлено, что способ получения штаммоспецифичных антител на ЛПС азоспи-рилл в сочетании с эффективным методом детектирования комплексов антитен-антитело позволяет изучать динамику численности исследуемых штаммов непосредственно в почвенных суспензиях (и иных исследуемых образцах), минуя стадию высева бактерий на питательную среду.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный комплексный иммунохимический анализ углеводных антигенов бактериальной клеточной поверхности позволил впервые для представителей почвенной микрофлоры - азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum -оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие дан-

ных детерминант в составе О-, К- и Н- антигенов, получить сведения о химическом строении иммунодоминантных участков липополисахаридов бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азос-пирилл.

Одним из наиболее существенных результатов нам представляется выявление нового характера микробной Я-Б диссоциации. Были получены доказательства неприменимости традиционных представлений о микробной диссоциации (подробно описанной для энтеробактерий) для типового штамма Л. brasi-ктв Бр7, поскольку как Я-, так и Б-вариант этого штамма имеют в своем составе полноценный ЛПС с развитой структурой О-антигена. Показано, что Я-Б - переход в данном случае (в отличие от энтеробактерий) связан с более тонкими изменениями строения клеточной поверхности. При отсутствии радикальных изменений в структуре ЛПС, имеет место перераспределение вкладов двух 0-антигенов (выявленных как для исходного штамма, так и для его Б-варианта) в строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур. В этой связи уместно упомянуть известные литературные данные о зависимости эффективности адсорбции азоспирилл на корнях растения от фазы роста культур (ишаИ-вагаа в1 а1, 1980; Кари1шк в1 а1, 1985). Напрашивается предположение, что особенности тонкой структурной организации и время экспрессии липополисаха-ридных антигенов на клеточной поверхности азоспирилл могут являться факторами, определяющими их экологическое поведение.

Сочетание различных иммунохимических методов позволило установить, что ЛПС бактерий р. Лz,ospirШum представляет собой не индивидуальное химическое соединение, а ансамбль макромолекул, демонстрирующих антигенные различия. При этом иммунохимическая гетерогенность соматического антигена «уравновешивается» отсутствием у данных бактерий индивидуального капсуль-ного антигена. Главным отличием двух О-ПС, выявляемых в составе ЛПС исследованных штаммов азоспирилл, является антигенная гетерогенность одного из полисахаридов, обусловленная наличием в структуре полимерной цепи, по крайней мере, двух различающихся по своему строению О-факторов (антигенных детерминант). При этом второй О-ПС по всем тестам гомогенен и антигенно идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС. Разные О-специфические полисахариды, определяющие иммунохимическую гетерогенность ЛПС Л. Ьгаяктв Бр245, отличаются также по способности к антигенной модификации, являющейся результатом присутствия катионов Трис(гидроксиметил)аминометана в среде культивирования. Следует отметить, что сама возможность изменений структуры антигенных детерминант 0-специфических полисахаридов ЛПС под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах была выявлена нами впервые.

Продемонстрированная антигенная идентичность полисахаридного материала, формирующего капсулу и ЭПС у Л. ЬгазИвтв, одному из двух 0-специфических полисахаридов, выявленных у исследованных штаммов данного вида, по-видимому, дает основания для уточнения существующих в настоящее время представлений о самостоятельной роли ЭПС азоспирилл в формировании

их ассоциативных взаимоотношений с растениями. Знание особенностей структурной организации капсулы и ЭПС азоспирилл может также способствовать созданию эффективных биоспецифических зондов для цитохимических, таксономических и экологических исследований данных бактерий.

Сочетание результатов иммунохимического анализа с данными спектроскопических исследований ЛПС позволило сделать заключения о принципиальных различиях (или сходстве) в общей химической структуре О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС азоспирилл. В этой связи представляются важными результаты, доказывающие, что иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов в пределах ЛПС одного штамма не связана с радикальными различиями их моносахаридного состава. Было бы весьма интересно проверить этот вывод с использованием более детальных структурных исследований ЛПС соответствующими физико-химическими методами.

Проведенный комплексный анализ поверхностных структур клеток, содержащих О-антигены, дает представление о распределении данных антигенов в пределах клеточной поверхности азоспирилл. В свою очередь, это позволяет судить о возможной роли соматического антигена при контактных взаимодействиях исследуемых бактерий с разнообразными партнерами. Выявление чехла (ли-по)полисахаридной природы на флагеллине полярного жгутика бактерий р. AzospiriUum, а также известное описание роли полярного жгутика на этапе адсорбции этих бактерий на корнях растений (МгсЫек et ah, 1991), позволяют расценивать поверхностные полисахариды азоспирилл как одну из доминирующих субстанций, обеспечивающих адсорбцию данных бактерий на корнях растения. Кроме того, результаты, полученные при исследовании изменений подвижности азоспирилл под влиянием различных антител и свидетельствующие об экранирующем эффекте полисахаридного чехла, могут иметь практическое приложение. В частности, тест на ингибирование подвижности бактерий при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС может быть использован в качестве быстрого серологического теста.

Обнаруженная иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма Л. brasilense Бр7 одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена представляется достаточно важным наблюдением. С учетом полученных нами данных об идентичности антигенных детерминант в составе капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и липополисахаридов азоспирилл, это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода МозртИит. Представляется целесообразным развитие этих исследований в направлении изучения конкретных химических структур, ответственных за установленную нами антигенную идентичность углеводных компонентов соматического и жгутикового антигенов азоспирилл, с использованием хорошо развитых современных физико-химических методов анализа строения биомакромолекул.

Исследованное нами агрегирующее действие ЛПС и ЛПБК азоспирилл на клеточные суспензии может иметь вполне определенный биологический смысл.

Известна способность многих видов почвенных бактерий образовывать агрегаты при их адгезии на корнях растений, а также наличие подобных скоплений бактериальных клеток в ризосфере. С этой точки зрения структурообразующие эффекты ЛПС азоспирилл, обильно экскретируемых данными бактериями в куль-туральную среду, можно рассматривать как проявление механизма адаптации, облегчающего адгезию бактерий на корнях растений.

Экспериментальные данные показали, что развитый подход, использованный при создании биотест-системы серологической идентификации бактерий рода Az,ospirШum (учитывающий иммунохимические особенности их углеводных антигенов) имеет значение для более широкого круга микроорганизмов. Нам кажется перспективным распространение методологии комплексных иммунохи-мических исследований клеточной поверхности, развитой на примере азоспи-рилл, на представителей других родов почвенных микроорганизмов, представляющих интерес в широком круге физиолого-биохимических и экологических задач (например, агробактерий, родококков и др.). Кроме анализа принципиальных вопросов, связанных с изучением структурной организации поверхности клеток, важных для понимания молекулярных механизмов их взаимодействий с разнообразными партнерами, полученные нами результаты планируются к применению в развитии эффективных методик определения и исследования штаммов микроорганизмов непосредственно в растительных и почвенных образцах.

Наконец, следует отметить, что традиционно иммунохимический анализ бактерий ограничивается, например, идентификацией исследуемых антигенов на электрофореграммах или в составе клеточной поверхности с использованием различных меток. В отличие от этого, антитела были использованы нами для получения сведений об особенностях структурной организации важнейших поверхностных антигенов азоспирилл. В конечном итоге, это делает возможным построение целостной топографической картины распределения различных структурных элементов в пределах клеточной поверхности исследуемых микроорганизмов, имеющей большое значение для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На основе иммунохимического анализа развиты подходы к изучению клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий рода Az,ospirШum, позволяющие оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие данных детерминант в составе О-, К- и Н- антигенов, получить сведения о химическом строении иммунодоминантных участков липо-полисахаридов бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл.

трацией моноспецифических антител, достаточной для реализации эффекта им-мунопреципитации с целью выявления и анализа углеводсодержащих полимеров в сложных смесях клеточных компонентов. Показано, что получаемые при этом антитела имеют выраженную штаммовую специфичность.

3. Выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов штаммов А. Ьт.Пвтв $р7 и $р245, проявляющаяся в наличии двух фракций О-антигена, регистрируемых в составе бактериального ЛПС. Обнаружено, что разные О-специфические полисахариды, определяющие гетерогенность ЛПС А. Ьrasilense 8р245, отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий на лабораторных средах - присутствия катионов Трис(гидроксиметил)амино-метана в среде культивирования.

4. Обнаружено, что у штаммов А. Ьrasilense $р7 и $р245 отсутствует индивидуальный капсульный антиген, а капсульный слой и экзополисахарид иммуно-химически идентичны одному из О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий.

5. Для типового штамма А. Ьrasilense 8р7 установлен нетипичный характер К-8 диссоциации, при которой не происходит кардинальных изменений в структуре полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность, что является следствием перераспределения вкладов двух О-ПС (выявленных как для исходного штамма, так и для его спонтанного мутанта) в строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур.

6. С использованием конкурентного иммуноанализа и метода спектротур-бидиметрии показана роль галактозы и рамнозы как иммунодоминантных моносахаридов в составе антигенных детерминант О-специфического полисахарида А. Ьrasilense 8р7.

7. Разработана биотест-система серологической идентификации бактерий рода Azospirillum, учитывающая иммунохимические особенности их липополи-сахаридных антигенов.

8. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены характерные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с имму-нохимическими и биохимическими различиями штаммов.

9. С использованием антител, полученных на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов А. Ьrasilense и А. lipoferum. У модельных штаммов А. Ьrasilense установлено наличие прочно связанного чехла полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика. Обнаружено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма А. Ьrasilense $р7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

добавляемых к суспензиям растительных, бактериальных клеток или эритроцитов, в них возможно формирование структур трех типов, обусловленных эффектами агрегации, агглютинации, а также фазового разделения, наблюдаемого в суспензиях эритроцитов.

11. Разработан новый способ выделения высокоочищенных ЛПС, заключающийся в протеиназной обработке экстрактов бактериальных наружных мембран, полученных с помощью ЭДТА.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.А. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиология. -1991. - Т.60, № 3. - С. 524-528.

2. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Физико-химические свойства клеточной поверхности S- и R- вариантов штамма Azospirillum brasilense Sp7 // Микробиология. - 1992. - Т. 61, №. 4. -С. 645-651.

3. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp. by cell-gold immunoblotting // FEMS Microb. Lett. - 1992. -96.-P. 115-118.

4. Matora L., Solovova G., Serebrennikova 0., Selivanov N., Shchyogolev S. Immunological properties and evaluation ofthe involvement ofbacterial lipopolysaccha-rides in plant-azospirillum contact interaction //Proc. 1st European Nitrogen Fixation Conference & Workshop «Safe Application of Genetically Modified Microorganisms in the Environment» / Ed. G. Kiss, G. Endre. - Szeged: Officina, 1994. - P. 347.

5. Chumakov M., Solovova G., Velikov V., Kurbanova I., Matora L., Shchyogolev S. Wheat root-associated Agrobacterium radiobacter IIProc. 1st European Nitrogen Fixation Conference & Workshop «Safe Application of Genetically Modified Microorganisms in the Environment» / Ed. G. Kiss, G. Endre. - Szeged: Officina, 1994.-P.275-279.

6. Matora L., Solovova G., Serebrennikova 0., Selivanov N., Shchyogolev S. On the involvement of lipopolysaccharide in bacteria-plant contact interactions for nitrogen-fixing associative bacteria of the genus Azospirillum II Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications / Eds. I. Tikhonovich, N. Provorov, V. Romanov, W.E. Newton. - Dordrecht: Kluwer Academic, 1995. - P. 340.

7. Matora L., Solovova G., Serebrennikova 0., Selivanov N., Shchyogolev S. Immunological properties of Azospirillum cell surface: the structure of carbohydrate antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction // Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology / Eds. I. Fendrik, M. Del Gallo, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy. - NATO ASI Series G: Ecological Studies. - Berlin: Springer, 1995. - Vol. G37. - P. 377-382.

8. Dykman L, Matora L., Bogatyrev V. Use of colloidal gold for obtaining antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. -1996. - 24. - P. 247-248.

9. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев СЮ. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilenseЛМикробиология. -1998. - Т. 67, № 6. - С. 815-820.

10. Katzy L., Matora L., Serebrennikova 0., Scheludko A. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirllum brasiense Sp245 in production of lipopolysaccha-rides // Plasmid. -1998. - 40. - P. 73-83.

11. Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Sumaroka M.V., Colina M., Renou-Gonnord M.-F., Ignatov V.V. Spectroscopic characterization of cell membranes and their constituents of the plant-associated soil bacterium Azospirillum brasilense II Journal of Molecular Structure. - 1999. - 480-481. - P. 387-393.

12. Kamnev A.A., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Antonyuk L.P., Renou-Gonnord M.-F., Ignatov V.V. FTIR spectroscopic study of lipopolysaccharide-containing cell components of the bacteria Azospirillum brasilense II Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions / Eds. J. Greve, G.J. Puppels, C.Otto. -Dordrecht: Kluwer, 1999. - P. 459-460.

13. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu. Structurization effects of the Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules. -2001.-V.2,№2.-P.402-406.

14. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Изменение антигенных свойств липополисахаридов Azospirillum brasilense при внесении в среду культивирования Трис(гидроксиметил)аминометана // Прикл. биохим. и микробиол. -2002. - Т. 38, №3.- С. 292-294.

15. Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиология. -2002.-Т. 71, №2.-С. 211-214.

16. Кацы Е.И., Борисов И.Б., Петрова Л.П., Матора Л.Ю. Использование фрагментов 85- и 120-МДа плазмид Azospirillum brasilense Sp245 для изучения плазмидной перестройки у этой бактерии и для поиска гомологичных последовательностей в плазмидах Azospirillum brasilense Sp7 // Генетика. - 2002. -Т.38, №2.-С. 182-189.

17. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев СЮ. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. - 2003. - Т. 72, №1. - С. 60-63.

18. Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. A method for studying insoluble immune complexes // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - V. 1670, № 3. - P. 199-207.

19. Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. Structure of insoluble immune complexes as studied by spectroturbidimetry and dynamic light scattering // Coherent Optics of Ordered and Random Media IV / Ed. D. A. Zimnyakov. - Bellingham, Washington: SPIE, 2004. - Vol. 5475. - P. 26-37.

20. Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров: Учебное издание / И.Н. Клочкова, СА. Коннова,

Л.Ю. Матора, Г.Л. Бурыгин, С.Ю. Щеголев / Под ред. С.Ю. Щеголева. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 87 с.

21. Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Способ получения липополиса-харидов // Патент РФ № 2237719, Бюл. № 28, 10.10.2004 г., МКИ С 12 Р 19/04

22. Чумаков М., Иванова (Матора) Л., Емцев В. Модифицированный метод выделения ассоциативных азотфиксирующих бактерий из корней злаков // Известия ТСХА -1987, вып.3.- С. 112-115.

23. Бабердина И., Иванова (Матора) Л., Шварцбурд Б., Матора А., Скворцов И., Игнатов В. Кислые экзополисахариды Abrasilense Sp7: выделение, очистка и иммунохимия // Тез. VIII Всес. конф. «Химия и биохимия углеводов» - Тбилиси, 1987.- Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1987. -С.113.

24. Bogatyrev V., Ivanova (Matora) L., Schwartsburd В., Khlebtsov N. Use of colloidal gold in immunodot technigue // Abstr. XIXth FEBS Meeting. - Rome, 1989. - P.30.

25. Шварцбурд Б., Щеголев С., Матора Л., Игнатова Е. О-антигенный состав клеточной поверхности бактерий A. brasilense Sp7 // Тез. Всес. конф. «Регуляция микробного метаболизма» - Пущино, 1989,- С.22.

26. Schwartsburd В., Matora L., Zhemerichkin D., Ignatov V. O-specific polysaccharides of A.brasilense Sp7: immunochemical activity and structure of immunodominant sites // Abstr. Vth Europ. Carbohydrate Symp. - Prague, 1989. - P.69.

27. Matora L, Bogatyrev V., Dykman L, Katzy E., Schwartsburd. Effect ofplasmid content on cell-surfase antigens of A.brasilense Sp245 // Abstr. Vth Int. Symp. on Nitrogen Fixation with non-legumes. - Florense, Italy, 1990. - P.97.

28. Schwartsburd В., Shchyogolev S., Matora L., Ignatov V. Cell surface carbohydrate antigens of soil nitrogen-fixing bacteria of Azospihllum genus: immunochemical aspects // Abstr. VI111 Europ. Symp. on Carbohydrate Chemistry «Euro-carb VI». - Heriot-Watt University, Edinburg, Scotland, 1991. - P. 18.

29. Matveev V., Bogatyrev V., Dykman L, Matora L., Schwartsburd B. Changes of physico-chemical properties of A.brasilense Sp7 cell surface in consequence ofR-S dissociation // Abstr. VIIIth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation «Nitrogenfix'92». - Saratov, Russia, 1992. - P.75.

30. Schwartsburd В., Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S. Structure of the cell surface carbohydrate determinants and its dependence on the plasmid content in bacteria of the genus Azospirillum // Abstr. VIIIth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation «Nitrogenfix'92». - Saratov, Russia, 1992. - P.43.

31. Chumakov M., Velikov V., Solovova G., Matora L, Shchyogolev S. Root acco-ciated non-pathogenic agrobacteria from wheat // Abstr. European Nitrogen Fixation Conference. - Szeged, Hungary, 1994.-Abstr.68.

32. Solovova G., Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S., Chumakov M. Short-term colonization and attachment of bacteria of the famely Rhizobiaceae and of the genus Azospirillum to plant roots // Abstr. NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms. - Sarvar, Hungary, 1994.

33. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. Immunological properties ofAzospirillum cell surface: the structure of carbohydrate antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction // Abstr. NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms. - Sarvar, Hungary, 1994.

34. Матора Л., Соловова Г., Серебренникова О., Селиванов Н., Щеголев С. О роли липополисахаридов бактерий при их контактных взаимодействиях с растениями для ассоциативных азотфиксаторов рода Azospirillum II 9-й Ба-ховский коллоквиум по азотфиксации: Сб. тез.- Пущино: ОНТИ ПНЦ, 1995. -С.58.

35. Matora L., Schwartsburd В., Shchyogolev S. Lipopolysaccharides from soil bacteria of the genus Azospirillum: immunochemical properties and epitopes structure // Abstr. 1st Intern. Conf. on Polysaccharide Engineering. - Trondheim, Norway, 1994.

36. Petrova L., Alenkina S., Matora L. Studies of Azospirillum mutants with altered surface structures // Abstr. 10th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation.- St.-Petersburg, Russia, 1995. - Abstr. 119.

37. Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S. Development of an efficient immunoassay system for monitoring soil nitrogen-fixing bacteria associated with higher plants // Abstr. Intern. Workshop on Assoc. Interactions of Nitr.-Fixing Bacteria with Plants. - Saratov, Russia, 1995. - P. 25.

38. Matora L., Schwartsburd В., Shchyogolev S. Comparative immunochemical analysis of exocellular and somatic Azospirillum polysaccharide antigens // Abstr. Intern. Workshop on Assoc. Interactions of Nitr.-Fixing Bacteria with Plants. -Saratov, Russia, 1995. - P. 68.

39. Matora L., Serebrennikova 0., Ponomareva Т., Petrova L., Shchyogolev S. R-S dissociation in A.brasilense Sp7: immunochemical aspects // Abstr. 2nii European N2-fixation Conf. - Poznan, Poland, 1996. - P.181.

40. Kurbanova I.V., Solovova G.K., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Markelova T.S., Ishin A.G., Chumakov M.I. Behaviour and wheat root colonization by attachment-deficient agrobacterial strains // Abstr. VIIth Intern. Symposium «Nitrogen Fixation with Non-Legumes». - Faisalabad, Pakistan, 1996. - P. 131.

41. Matora L., Serebrennikova O., Sumaroka M., Shchyogolev S. Immunochemical heterogeneity of the lipopolysaccharide from Azospirillum brasilense Sp245// Abstr. 3dEur. N2-flxation Conf. - Lunteren, The Netherlands, 1998. - P. 177.

42. Matora L., Sumaroka M., Dykman L, Serebrennikova O., Shchyogolev S. Revealing a cap on the polar flagellum of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. XIIth Int. Congr. on N2-flxation. - Parana, Brasil, 1999.- P.99.

43. Burygin G., Matora L., Shchyogolev S. Structural alteration of lipopolysaccharides from the nitrogen-fixing bacteria Azospirillum brasilense as a result of a modification of culture growth conditions // Abstr. Eur. -fixation Conf. -Sevilla, Spain, 2000.-P.135.

44. Serebrennikova O.B., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman LA., Shchyogolev S.Yu. Development of an immunoassay system for monitoring soil nitrogen-

fixing bacteria azospirillum associated with higher plants // Abstr. V"1 John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology - Push-chino, 2000. - P.83.

45. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Изменение структуры липопо-лисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий A. brasilense Sp245 при модификации условий культивирования // Сб. тез. межвузовской конференции молодых ученых «Растение, микроорганизмы и среда». - Санкт-Петербург, 2000. - С. 15.

46. Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Иммунохимическая гетерогенность липополисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 // Сб. тез. Школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии». - Пущино: Путинский научный центр РАН, 2000. - Т. 2. - С. 109-110.

47. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Изучение липополисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum // Сб. тез. Конф. «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков». - Уфа: Башкирский университет, 2001. - Т. 2. - С. 23-25.

48. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Исследование гомологичных структур в составе липополисахарида и полярного жгутика бактерий рода Azospirillum // Сб. тез. Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов: Изд-во Саратовского университета, 2002. - С. 14.

49. Бурыгин Г.Л., Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Быстрый метод скринирования мутантов по структуре липополисахарида ассоциативных бактерий рода Azospirillum II Сб. тез. VI Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л.Н. Толстого, 2002. - Т. 3. - С 10.

50. Burygin G.L. Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu. Investigation of homologous structures that are part of the lipopolysaccharide and the polar flagellum of Azospirillum brasilense II Abstr. Xth Intern. Congr. on Bacteriology and Applied Microbiology «The World of Microbes». - Paris, France, 2002. - P. 261.

51. Katzy E.I., Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Borisov I.B., Kamneva A.B., Matveeva E.V., Matora L.Yu., Burygin G.L. Properties of plant-growth-promoting rhizo-bacterium Azospirillum brasilense relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediation // Abstr. Int. Symp. «Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Environmental Pollutants». -Saratov: Saratov University Publishing House, 2003. - P. 15.

52. Matora L.Yu., Burygin G.L., Shchyogolev S.Yu. Immunochemical analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Abstr. XI-th Int. Congr. on Molecular Plant-Microbial Interactions «New bridges between Past and Future». - St.-Petersburg, Russia, 2003. - P. 309.

53. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю. Изучение эффективности биоремедиации нефтезагрязненной почвы при интродукции в нее штамма Rhodococcus maris АМЗ // Научные труды Международного биотехнологического центра МГУ:

тезисы докладов второй международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» и третьей школы-конференции молодых ученых и студентов «Сохранение биоразнообразия и рациональной использование биологических ресурсов», Москва 25-27 мая 2004 г./ Ред. А.П. Садчиков, С.В. Котелевцев. - М: Изд-во «Спорт и культура», 2004. - С. 178.

Подписано в печать 05.07.2004. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Бумага типовая. Объем 2,65 печл. Тираж 100 экз. Заказ №7

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13

»25394

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Матора, Лариса Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Рост-стимулирующие ризобактерии p. Azospirillum — модельный объект в исследованиях эффектов ассоциативности.

1.2. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.1. Липополисахариды как мажорные компоненты наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.1.1. Структура и функции ЛПС.

1.2.1.2. Характеристика основных структурных элементов ЛПС.

1.2.1.3. ЛПС как соматический антиген.

1.2.1.4. Методы исследования иммунохимической специфичности ЛПС.

1.2.1.5. Физико-химические свойства ЛПС.

1.2.1.6. Изменения антигенных свойств ЛПС.

1.2.1.7. Гетерогенность ЛПС.

1.2.1.8. Изменения ЛПС при R-S диссоциации бактериальных культур.

1.2.2. Капсульные полисахариды.

1.2.3. Бактериальный жгутик.

1.2.3.1. Строение бактериальных жгутиков.

1.2.3.2. Жгутик как Н-антиген.

1.2.3.3. Гликозилирование полярного жгутика.

1.2.3.4. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика.

1.3. Роль поверхностных структур микроорганизмов в растительно-микробных взаимодействиях.

1.4. Роль углеводных компонентов наружной мембраны в процессах бактериальной агрегации.

1.5. Иммунохимические подходы в исследовании поверхности почвенных бактерий.

1.5.1. Детектирование и идентификация бактерий в природной среде.

1.5.2. Серологические исследования диазотрофов.

1.5.3. Перспективы серологического анализа азоспирилл.

1.6. Формулировка задач исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы, условия выращивания бактерий и использованные реактивы.

2.2. Иммунизация животных и получение антител.

2.2.1. Иммунизация животных целыми бактериальными клетками.

2.2.2. Иммунизация животных изолированными препаратами ЭПС.

2.2.3. Иммунизация животных изолированным препаратом

2.2.4. Иммунизация животных мономерами флагеллина полярного жгутика.

2.2.5. Получение антител.

2.3. Реакция агглютинации

2.4. Препараты углеводных антигенов.

2.5. Получение препаратов полярного жгутика.

2.6. Изучение подвижности бактериальных клеток.

2.7. Двойная иммунодиффузия.

2.8. Иммуноэлектрофорез.

2.9. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг

2.10. Дот-анализ целых клеток и иммуноэлектронная микроскопия.

2.11. Иммуноферментный анализ (вариант ELISA).

2.12. Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных эпитопов бактерий.

2.13. Определение иммунохимической активности О-специфического полисахарида с применением метода спектротурбидиметрии.

2.14. Исследование агрегации клеток в супензиях.

2.15. Исследование агглютинации эритроцитов и фазового разделения их суспензий под действием ЛПС-содержащих препаратов азоспирилл.

2.16 Радиоиндикаторный анализ.

Глава 3. Разработка способа получения моноспецифических антител на

О-антигены и модификация способа выделения высокоочищенных препаратов ЛПС.

3.1. Разработка способа получения моноспецифических антител на ЛПС.

3.1.1. Оценка эффективности иммунизации животных целыми бактериальными клетками, обработанными бифункциональным реагентом.

3.1.2. Обсуждение возможного механизма ингибирования глутаро-вым альдегидом иммунного ответа на нативные белковые поверхностные антигены.

3.2. Модификация способа получения высокоочищенных препаратов ЛПС.

Глава 4. Иммунохимический анализ ЛПС модельных штаммов Azospirillum brasilense.Ill

4.1. Анализ строения О-антигенных детерминант типового штамма A. brasilense Sp7.

4.2. Исследование нетипичного характера R-S диссоциации штамма

A. brasilense Sp7.

4.3. Исследование иммунохимической гетерогенности ЛПС азоспирилл.

4.3.1. Исследование иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов штамма A. brasilense

4.3.2. Изменение антигенных свойств О-специфических полисахаридов штамма A. brasilense Sp245 при модификации условий культивирования.

4.3.3. Исследование иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов штамма A. brasilense Sp7 и близкородственных штаммов.

Глава 5. Сравнительный иммунохимический анализ ЛПС, капсульных полисахаридов и экзополисахаридов Azospirillum brasilense.

Глава 6. Изучение Н-антигенов Azospirillum brasilense.

6.1. Выявление полисахаридного чехла на поверхности полярного жгутика.

6.2. Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика.

6.3. Получение и анализ антител на флагеллин A. brasilense Sp7.

6.4. Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам.

Глава 7. Характеристика некоторых физико-химических свойств ЛПС азоспирилл.

7.1. Сравнение спектрофотометрических характеристик ЛПС различных серотипов.

7.2. Оценка структурообразующих эффектов бактериальных липополисахаридов в клеточных суспензиях азоспирилл и

• модельных клеточных суспензиях.

Глава 8. Тест-система серологической идентификации бактерий p. Azospirillum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum"

Бактериальная поверхность представляет собой сложную комбинацию иммуногенных компонентов, и точное устройство этой антигенной мозаики часто зависит от условий культивирования организма, так же, как и от его генетического потенциала. Это не статичная, строго очерченная химическая структура, ее состав может являться отражением условий, в которых организм обнаруживается в какое-то определенное время (Freer, 1985).

Понимание свойств поверхности требуется для адекватного контроля над такими процессами, как бактериальная адгезия, адсорбция и клеточное разрушение. Изучение поверхностных структур, вовлеченных в контактные взаимодействия микроорганизмов с растениями, обоснованно занимает одно из центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений (Dazzo and Brill, 1979; Kato et al., 1980; Noel, 1992; Smit et al, 1987, 1989; 1992; Hrabak et al., 1981; Whatley et al., 1976; Matthysse et al1981; Newman et al2000 и др.). Компоненты клеточной поверхности рассматриваются также в качестве важных хемотаксономических маркеров для идентификации и классификации бактерий (Hancock and Poxton, 1988).

Хорошую перспективу при исследовании данных бактериальных структур имеют подходы с применением методов иммунохимии (Кэбот и Мейер, 1968; Кульберг, 1985; Kabat, 1976; Westphal et al., 1983). Перспективность подобных приемов определяется, среди прочих, двумя предпосылками. Во-первых, высокой селективностью и чувствительностью определения разнообразных органических соединений в реакциях типа антиген+антитело (Аг+Ат). Во-вторых, достаточной обоснованностью предположения о том, что иммуногенные компоненты клеточной поверхности исследуемых микроорганизмов могут оказаться достаточно активными также и при их взаимодействии с клетками растительных партнеров. Однако число работ с использованием подобных подходов при исследовании представителей почвенной микрофлоры ко времени начала наших исследований было сравнительно невелико. В том числе это касалось бактерий p. Azospirillum, которые, благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяйственных растений (Dobereiner and Day, 1976), на протяжении последних трех десятилетий являются модельным объектом в исследовании феномена растительно-микробной ассоциативности. Отчасти такое положение объяснялось, по-видимому, недостаточной развитостью для этих микроорганизмов соответствующей методологии, которая позволяла бы ш не только определять те или иные антигенные детерминанты в составе клеток, но и исследовать особенности структурной организации основных антигенов и оценить их вклад в общее строение клеточной поверхности.

В первую очередь сказанное можно отнести к основным антигенам бактериальной поверхности: соматическому (О-антиген), жгутиковому (Н-антиген) и капсульному (К-антиген). Изучение деталей строения этих важнейших бактериальных структур представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность выяснить, как в целом организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы для создания биоспецифических зондов при экологических и таксономических исследованиях азоспирилл.

Среди перечисленных мажорных антигенов бактериальной поверхности особый интерес представляет липополисахарид (ЛПС) или О- антиген. Строение О- специфического полисахарида (О-ПС) определяет иммунохимическую специфичность микроорганизмов, что служит основой для их надежной внутривидовой классификации (Staub et al., 1959; Westphal et al., 1983). Данные углеводные структуры относят к важным детерминантам, участвующим в процессах молекулярного «узнавания» при формировании ассоциативных ризосферных ценозов и адсорбции бактерий на корнях растений (Коннова с соавт., 1995; Федоненко с соавт., 2001). В этой связи представляют интерес сведения о степени гетерогенности и о химическом строении и локализации углеводных антигенных детерминант эпитопов), позволяющие судить об «архитектуре» поверхности клеток азоспирилл. Кроме того, несомненный интерес представляют результаты сравнения иммунохимической специфичности соматических и капсульных полисахаридов данных бактерий, на основании которых можно делать вывод о наличии или отсутствии индивидуального капсульного антигена у бактерий p. Azospirillum, что является принципиально важным фактом при построении системы серологической классификации данных бактерий.

В связи с обнаружением факта гликозилированности флагеллина полярного жгутика у различных бактерий (Doig et al., 1996; Brimer and Montie, 1998; Wyss, 1998 и др.) стало очевидным, что спектр углеводных антигенов бактериальной поверхности может быть расширен за счет углеводных компонентов Н- антигена. В связи с этим большой интерес, на наш взгляд, представляет выяснение иммунохимической специфичности углеводных структур, выявленных в составе полярного жгутика азоспирилл (Moens et al., 1995), и ее сравнение с иммунохимическими характеристиками ЛПС и капсульных полисахаридов.

Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы данной диссертационной работы. Ее целью явилось изучение углеводных антигенов почвенных бактерий p. Azospirillum и оценка их вклада в архитектуру клеточной поверхности исследуемых бактерий. Нами впервые была выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов азоспирилл, сопровождающаяся отсутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена и оценен вклад отдельных О-специфических полисахаридов в формирование капсульного и экзополисахаридного слоя. Описан новый характер микробной R-S диссоциации, обусловленной изменяющимся вкладом двух О-антигенов в архитектуру клеточной поверхности в зависимости от возраста культуры. Впервые с использованием оригинального подхода на основе спектротурбидиметрического анализа получены данные о моносахаридном составе эпитопов и серотипе типового штамма A. brasilense Sp7. Обнаружено, что разные О-специфические полисахариды, определяющие гетерогенность ЛПС азоспирилл, могут отличаться по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий на лабораторных средах. У модельных штаммов A. brasilense впервые выявлено наличие прочно связанного чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика. Установлено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена. С учетом выявленной идентичности антигенных детерминант капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и липополисахаридов азоспирилл, это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода Azospirillum. Впервые систематизированы структурообразующие свойства ЛПС азоспирилл в клеточных суспензиях.

Практическая значимость работы заключается, прежде всего, в том, что на примере решения конкретных задач изучения поверхности азоспирилл в работе продемонстрирована высокая эффективность развитой методологии комплексного иммуноанализа как средства, позволяющего получать информацию о тонких деталях структурной организации клеточной поверхности почвенных бактерий. Полученные данные, характеризующие особенности антигенного строения клеточной поверхности азоспирилл, могут способствовать разработке адекватных представлений о механизме ассоциативных взаимоотношений между растениями и почвенной микрофлорой. Выполненная в работе идентификация О-специфического полисахарида, гомологичного по составу основным внеклеточным структурам A. brasilense, обеспечивает целенаправленный поиск эффективных биоспецифических зондов при проведении цитохимических, таксономических и экологических исследований азоспирилл. Предложен эффективный способ иммунизации животных целыми клетками, обработанными глутаровым альдегидом, обеспечивающий получение моноспецифических антител на бактериальные ЛПС, демонстрирующих штаммовую специфичность, и создана биотест-система серологической идентификации бактерий p. Azospirillum, учитывающая иммунохимические особенности их липополисахаридных антигенов. Кроме этого, разработан новый способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС, защищенный патентом РФ.

Результаты диссертационной работы Матора Л.Ю. применяются при проведении научных исследований в Лаборатории генетики, Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур, Лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и др. Они используются также при проведении диссертантом лекционных занятий по курсу «Основы аналитической иммунохимии» и практических занятий со студентами, подготовке ими курсовых и дипломных работ в Учебно-научном центре физико-химической биологии Саратовского госуниверситета и ИБФРМ РАН. Материалы диссертации использованы при написании методического пособия «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.). Под научным руководством диссертанта выполнены и защищены две кандидатские диссертации.

Личный вклад соискателя. Все основополагающие экспериментальные результаты и их теоретические обобщения, представленные в данной диссертации, получены автором лично. Ему принадлежит также основная роль в обработке и интерпретации результатов экспериментов. Из части разработок, которые были проведены в соавторстве с другими исследователями, в диссертацию включены и вынесены на защиту только те положения, в развитии которых автору принадлежит определяющая роль.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Создание эффективной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бактерий, ассоциированных с высшими растениями», выполненному в соответствии с Госзаказом от Миннауки РФ в рамках ГНТП «Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии» (Распоряжение № 816ф от 15.03.95 г. и последующие, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.). Работа поддержана грантами Комиссии РАН по работе с молодежью по итогам конкурсов 2002-2004 г.г. по поддержке базовых кафедр и филиалов кафедр, созданных при институтах РАН, грантом Президента РФ № НШ-1529.2003.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ, грантом Саратовского Международного центра перспективных исследований 98-4-04, грантом INTAS 96-1015 и грантами NATO LST.CLG 975040 и LST.EV 980093.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Матора, Лариса Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. На основе иммунохимического анализа развиты подходы к изучению клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum, позволяющие оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие данных детерминант в составе О-, К- и Н- антигенов, получить сведения о химическом строении иммунодоминантных участков липополисахаридов бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл.

2. Установлено, что предварительная обработка клеточной поверхности глутаровым альдегидом исключает иммунный ответ на нативные мембранные белки и обеспечивает синтез антител на углеводные соматические антигены целых клеток азоспирилл. Предложен способ получения антисывороток с концентрацией моноспецифических антител, достаточной для реализации эффекта иммунопреципитации с целью выявления и анализа липополисахаридов в сложных смесях клеточных компонентов. Показано, что получаемые при этом антитела имеют выраженную штаммовую специфичность.

3. Выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245, проявляющаяся в наличии двух фракций О-антигена, регистрируемых в составе ЛПС. Обнаружено, что разные О-специфические полисахариды, определяющие гетерогенность ЛПС A. brasilense Sp245, отличаются по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий на лабораторных средах - присутствия катионов Трис(гидроксиметил)-аминометана в среде культивирования.

4. Обнаружено, что у штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 отсутствует индивидуальный капсульный антиген, а капсульный слой и экзополисахарид иммунохимически идентичны одному из О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий.

5. Для типового штамма A. brasilense Sp7 установлен нетипичный характер R-S диссоциации, при которой не происходит кардинальных изменений в структуре полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность, что является следствием перераспределения вкладов двух О-ПС (выявленных как для исходного штамма, так и для его спонтанного мутанта) в строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур.

6. С использованием конкурентного иммуноанализа и метода спектротурбидиметрии показана роль галактозы и рамнозы как иммунодоминантных моносахаридов в составе антигенных детерминант О-специфического полисахарида Л. brasilense Sp7.

7. Разработана биотест-система серологической идентификации бактерий рода Azospirillum, учитывающая иммунохимические особенности их липополисахаридных антигенов.

8. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены характерные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

9. С использованием антител, полученных на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов A. brasilense и A. lipoferum. У модельных штаммов A. brasilense установлено наличие прочно связанного чехла полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика. Обнаружено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма А. brasilense Sp7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

10. Установлено, что, в зависимости от химического состава препаратов наружной мембраны азоспирилл (липополисахарида, О- специфического полисахарида, липополисахарид-белкового комплекса или его белковой фракции), добавляемых к суспензиям растительных, бактериальных клеток или эритроцитов, в них возможно формирование структур трех типов, обусловленных эффектами агрегации, агглютинации, а также фазового разделения, наблюдаемого в суспензиях эритроцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методы иммунохимического анализа, примененные и развитые в нашей работе (в частности, новые разработки на основе спектротурбидиметрии, метод получения антител к целым клеткам, обеспечивающий специфический иммунный ответ на О-антигены клеточной поверхности, оригинальный способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС и др.) позволили впервые для представителей почвенной микрофлоры - азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum — оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие данных детерминант в составе О-, К- и Н- антигенов, получить сведения о химическом строении иммунодоминантных участков липополисахаридов бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл.

Одним из наиболее существенных результатов нам представляется выявление нового характера микробной R-S диссоциации. Были получены доказательства неприменимости традиционных представлений о микробной диссоциации (подробно описанной для энтеробактерий) для типового штамма A. brasilense Sp7, поскольку как R-, так и S-вариант этого штамма имеют в своем составе полноценный ЛПС с развитой структурой О-антигена. Показано, что R-S - переход в данном случае (в отличие от энтеробактерий) связан с более тонкими изменениями строения клеточной поверхности. При отсутствии радикальных изменений в структуре ЛПС, имеет место перераспределение вкладов двух О-антигенов (выявленных как для исходного штамма, так и для его S-варианта) в строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур. В этой связи уместно упомянуть известные литературные данные о зависимости эффективности адсорбции азоспирилл на корнях растения от фазы роста культур. Напрашивается предположение, что особенности тонкой структурной организации и время экспрессии липополисахаридных антигенов на клеточной поверхности азоспирилл могут являться факторами, определяющими их экологическое поведение.

Сочетание различных иммунохимических методов позволило установить, что ЛПС бактерий p. Azospirillum представляет собой не индивидуальное химическое соединение, а ансамбль макромолекул, демонстрирующих антигенные различия. При этом иммунохимическая гетерогенность соматического антигена уравновешивается отсутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена. Главным отличием двух О-ПС, выявляемых в составе ЛПС исследованных штаммов азоспирилл, является антигенная гетерогенность одного из полисахаридов, обусловленная наличием на его поверхности, по крайней мере, двух различающихся по своему строению О-факторов (антигенных детерминант). При этом второй О-ПС по всем тестам иммунохимически гомогенен и идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС. Разные О-специфические полисахариды, определяющие гетерогенность ЛПС А. brasilense Sp245, отличаются также по способности к антигенной модификации, являющейся результатом присутствия катионов Трис(гидроксиметил)аминометана в среде культивирования. Следует отметить, что сама возможность изменений структуры антигенных детерминант О-специфических полисахаридов ЛПС под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах была выявлена нами впервые.

Продемонстрированная антигенная идентичность полисахаридного материала, формирующего капсулу и ЭПС у A. brasilense, одному из О-специфических полисахаридов, выявленных у исследованных штаммов данного вида, по-видимому, дает основания для уточнения существующих в настоящее время представлений о самостоятельной роли ЭПС азоспирилл в формировании их ассоциативных взаимоотношений с растениями. Знание особенностей структурной организации капсулы и ЭПС азоспирилл может также способствовать созданию эффективных биоспецифических зондов для цитохимических, таксономических и экологических исследований данных бактерий.

Проведенный комплексный анализ поверхностных структур клеток, содержащих О-антигены, дает представление о распределении данных антигенов в пределах клеточной поверхности азоспирилл. В свою очередь, это позволяет судить о возможной роли соматического антигена при контактных взаимодействиях исследуемых бактерий с разнообразными партнерами. Выявление чехла (липо)полисахаридной природы на флагеллине полярного жгутика бактерий p. Azospirillum (а также известное описание роли полярного жгутика на этапе адсорбции этих бактерий на корнях растений, Michiels et al., 1991) позволяет расценивать поверхностные полисахариды азоспирилл как одну из доминирующих субстанций, обеспечивающих адсорбцию данных бактерий на корнях растения. Кроме того, результаты, полученные при исследовании изменений подвижности азоспирилл под влиянием различных антител, и свидетельствующие об экранирующем эффекте полисахаридного чехла, могут иметь практическое приложение. Тест на ингибирование подвижности бактерий при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС может быть использован в качестве быстрого серологического теста.

Обнаруженная иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. brasilense Sp7 одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена представляется достаточно важным наблюдением. С учетом полученных нами данных об идентичности антигенных детерминант в составе капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и липополисахаридов азоспирилл, это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий p. Azospirillum. Представляется целесообразным развитие этих исследований в направлении изучения конкретных химических структур, ответственных за установленную нами антигенную идентичность углеводных компонентов соматического и жгутикового антигенов азоспирилл, с использованием хорошо развитых современных физико-химических методов анализа строения биомакромолекул.

Обнаруженное нами агрегирующее действие ЛПС и ЛПБК азоспирилл на клеточные суспензии может иметь вполне определенный биологический смысл. Известна способность многих видов почвенных бактерий образовывать агрегаты при их адгезии на корнях растений, а также наличие подобных скоплений бактериальных клеток в ризосфере. С этой точки зрения структурообразующие эффекты ЛПС азоспирилл, обильно экскретируемых данными бактериями в культуральную среду, можно рассматривать как проявление механизма адаптации, облегчающего адгезию бактерий на корнях растений.

Полученные экспериментальные данные показали, что предлагаемый подход, использованный при создании биотест-системы серологической идентификации бактерий рода Azospirillum (учитывающий иммунохимические особенности их углеводных антигенов) имеет значение для более широкого круга микроорганизмов. Распространение методологии комплексных иммунохимических исследований клеточной поверхности, показанной на примере азоспирилл, на представителей других родов почвенных микроорганизмов (например, агробактерий, родококков и др.), представляющих интерес для решения широкого круга физиолого-биохимических и экологических задач, кажется нам достаточно перспективным. Кроме анализа принципиальных вопросов, связанных с изучением структурной организации поверхности клеток, важных для понимания молекулярных механизмов их взаимодействий с разнообразными партнерами, полученные результаты планируются к использованию при разработке эффективных методик определения и исследования штаммов микроорганизмов непосредственно в растительных и почвенных образцах.

В заключение автор считает своим приятным долгом выразить глубокую признательность Борису Исааковичу Шварцбурду, Сергею Юрьевичу Щеголеву, Геннадию Леонидовичу Бурыгину, Оксане Борисовне Серебренниковой, Елене Ильиничне Кацы, Лилии Петровне Петровой, Андрею Вячеславовичу Шелудько, Светлане Анатольевне Конновой, Дмитрию Александровичу Жемеричкину, Владимиру Александровичу Богатыреву, Льву Абрамовичу Дыкману, Валерию Ивановичу Панасенко, Галине Константиновне Солововой, Игорю Борисовичу Жулину и Гледис Александре (Gladys Alexandre) за плодотворное сотрудничество, за предоставленные объекты для исследования и возможность использовать соответствующее оборудование, а также за помощь в работе и неоценимую поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Матора, Лариса Юрьевна, Саратов

1. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Получение и характеристика мутанта Azospirillum brasilense Sp7 по лектиновой активности // Микробиология. 1998. - 63. - С. 763-768 .

2. Антонюк Л.П., Игнатов В.В. О роли агглютинина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в её поддержку // Физиология растений. -2001.-48.-С. 427-433.

3. Баканчикова Т.И., Лобанок Е.В., Павлова-Иванова Л.К., Редькина Т.В., Нагапстян Ж.А., Майсурян А.Н. Подавление процесса опухолеобразования у двудольных растений штаммами Azospirillum brasilense // Микробиология. 1993. - 62. - С. 515-523.

4. Баканчикова Т.И., Мякиньков А.Г., Павлова-Иванова Л.К., Майсурян А.Н. Участие генов хемотаксиса в установлении ассоциативных взаимоотношений между Azospirillum brasilense и пшеницей // Молекуляр. генетика. 1989. - №4. - С. 24-32.

5. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Соловьёва Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липополисахаридный состав Yersinia pseudotuberculosis II Биоорг. химия. 2001. - 21.- С. 151-155.

6. Ботвинко И.В. Экзополисахариды бактерий // Успехи микробиологии. -М: Наука, 1985. С. 79-122.

7. Бычков С.М., Кузьмина С.А. Протеогликаны как факторы стерического исключения и адгезии клеток // Успехи современной биологии.— 1992-112.-С. 273-280.

8. Васильев Н.В., Луцюк Н.Б., Палий Г.К., Смирнова О.В. Биохимия и иммунохимия микробных полисахаридов. Томск: Изд-во Томского унта, 1984.-303 с.

9. Вильде И.В. Шварцбурд Б.И., Скворцов И.М. Внеклеточный полисахарид Azospirillum brasilense Sp7 // Сб. тез. Всес. конф., Алма-Ата, 1985. — Алма-Ата: Наука, 1985. Т. 7. - С. 16.

10. Ю.Голубев В.И., Манукян А.Р., Лазарев П.И. Функции капсулы у дрожжевых организмов // Ж. общ. биол. 1984. - 45. - С. 507-517.

11. П.Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985. - 190 с.

12. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985.-376 с.

13. Домарадский И.В. Роль поверхностных структур клеток-реципиентов при конъюгации бактерий // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 1985.-№12.-С. 3-11.

14. Итальянская Ю.В., Никитина В.Е., Мышкина А.К. Серологическая активность полисахаридных компонентов клеточной поверхности Azospirillum brasilense II Микробиология 1987 - 56. - С. 124-127.

15. Кавун Э.М., Колибо Д.В., Борисова Е.Г. Анализ В-эпитопов, формирующихся на белках при обработке глутаровым альдегидом // Прикл. биохим. микробиол. 1998. - 34. - С. 214-219.

16. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под. ред. В.В. Игнатова. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. — 172 с.

17. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. — М.: Медицина, 1983.

18. Кленин В.И., Шварцбурд Б.И., Астафьева Н.Г. Характеристика реакций преципитации на стадии формирования агрегетов комплексов антиген-антитело спектротурбидиметрическим методом // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1979. - № 6. - С. 18-23.

19. Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Саратов: Изд-во Сарат. унта, 1977.- 176 с.

20. Книрель Ю.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // Прогресс химии углеводов / Под ред. И.В. Торгова М.: Наука, 1985. — С. 54-71.

21. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. -58. - С. 166-181.

22. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Структура ЛПС грамотрицательных бактерий III. Структура О-антигенов: Обзор // Биохимия. 1994. - 59. — С. 1324-1383.

23. Коннова С.А., Брыкова О.С., Сачкова О.А., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Исследование защитной роли полисахаридных компонентов капсулы бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 2001. - 70. - С. 503508.

24. Коннова С.А., Скворцов И.М., Макаров О.Е., Игнатов В.В. Свойства полисахаридных комплексов, продуцируемых Azospirillum brasilense, и получаемых из них полисахаридов // Микробиология. 1994. - 63. - С. 1020-1030.

25. Коннова С.А., Скворцов И.М., Макаров О.Е., Прохорова Р.Н., Игнатов В.В. Полисахаридные комплексы, выделяемые Azospirillum brasilense, и их возможная роль во взаимодействие бактерий с корнями пшеницы // Микробиология. 1995. - 64. - С. 762-768.

26. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология М.: Высшая школа, 1985287 с.

27. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина, 1968.-684 с.

28. Литманович А.А., Кузовлев Ю.Е., Полякова Е.В. Фазовые равновесия в системах типа полимер-частицы-растворитель: несовместимость и комплексообразование // Высокомолек. соед. Б. 1997. - 39. - С. 15271530.

29. Ляшенко В.А., Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов. М.: Медицина, 1982. - 272 с.

30. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Физико-химические свойства поверхности R- и S-вариантов штамма Azospirillum brasilense Sp7 // Микробиология. 1992. - 61. - С. 645-651.

31. Матвеев В.Ю., Петрова Л.П., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Особенности диссоциации в культурах Azospirillum brasilense Sp7 //

32. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987. - №8. — С. 16-18.

33. Метлина A.J1. Жгутики прокариот как система биологической подвижности // Успехи биол. химии. 2001. - 41. - С. 229-282.

34. Муравлёв А.И., Чикаев Н.А., Никонова А.А., Шелковникова Э.М., Мертвецов Н.П. Иммунохимическая идентификация белковых продуктов трёх новых генов из области р13-14 хромосомы 11 человека // Молекул, биология.- 1999.-33.-С. 163-168.

35. Неппер Д. Стабилизация коллоидных дисперсий полимерами. М.: Мир, 1986.-487 с.

36. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл: свойства, биологическая активность и перспективы их практического использования: Автореф. дисс. д-ра биол. наук. Саратов: РНИПЧИ «Микроб», 2001. - 43 с.

37. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарёва Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл // Биохимия. 1994. -59. - С. 656-662.

38. Петров Р.В. Иммунология. М.: Наука, 1983. - 368 с.

39. Петрова JI. П., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Борисов И.В., Кацы Е.И. Анализ ДНК, ряда культурально-морфологических свойств и структуры липополисахаридов у близкородственных штаммов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2004. - В печати.

40. Ройт А. Основы иммунологии. -М.: Мир, 1991. 327 с.46.де Савиньи Д., Спейсер Ф. Иммуноферментная диагностика тропических заболеваний, вызванных паразитами // Иммуноферментный анализ / Под. ред. Т. Нго, Г. Ленхоффа. М: Мир, 1988. - С. 367-384.

41. Соловьёва Т.Ф., Оводов Ю.С. Липополисахарид-белковые комплексы внешней мембраны грамотрицательных бактерий // Биоорг. химия. 1983. -9.-С. 725-733.

42. Соловьева Т.Ф., Набережных Г.А., Мазур А.К. Исследование ассоциации О-специфического полисахарида из Pseudomonas fluorescens с антителами // Биоорг. химия. 1986. - 12. - С. 265-271.

43. Тараненко Т.М., Вейнблат В.И. Современные представления о структуре О-соматического антигена чумного микроба // Иммунохимия и лабораторная диагностика особо опасных инфекций Саратов, 1985.- С. 10-17.

44. Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медицина, 1983.-512 с.

45. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - 70. - 384-390.

46. Федорова Л.С., Позднякова Л.И., Каневская С.В. Выделение азоспирилл из культурных и дикорастущих злаков Саратовской области // Микробиология. 1985. - 54. - С. 684-685.

47. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Давыдов М.В., Шварцбурд Б.И. Спектротурбидиметрический метод изучения дрожжевых суспензий // Прикл. биохим. микробиол. 1988. - 24. — С. 581-586.

48. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на стенке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - 70. - С. 662-667.

49. Щеголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Применение мини- и микро-ЭВМ при определении параметров дисперсных систем спектротурбидиметрическим методом. — Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1984. — 48 с.

50. Щеголев С.Ю. Физико-химический анализ дисперсных систем на основе спектротурбидиметрии: Автореф. дисс. д-ра хим. наук. Саратов: СГУ, 1999.-39 с.

51. Яковлев М.Ю. «Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи современной биологии. — 2003. 123. - С. 31-40.

52. Achouak W., DeMot R., Neulin Т. Purification and partial characterization of an outer membrane protein involved in the adhesion of Rhanella aquatilis to wheat roots // FEMS Microbiol. Ecol. 1995. - 16. - P. 19-24.

53. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirillum from interior of various parts of some graminaceous plants // Z. Mikrobiol. — 1991. -146.-S. 217-219.

54. Albrecht S.L., Okon Y., Lonnquist L., Burris R.H. Nitrogen fixation by corn-Azospirillum associations in a temperate climate // Crop. Sci. 1981. - 21. - P. 301-306.

55. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. - 7. - P. 167-202.

56. Alexandre G., Rohr R., Bally R. A phase variant of Azospirillum brasilense lacks a polar flagellum and constitutively expresses mechanosensing lateral flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. - P. 4701-4704.

57. Alexander D.C, Valvano M.A. Role of the rfe gene in the biosynthesis of the Escherichia coli 07-specific lipopolysaccharide and other O-specific polysaccharides containing N-acetylglucosamine // J. Bacteriol. 1994. - 176. -P. 7079-7084.

58. Amano K., Fukushi K. Electron microscopic studies of endotoxins treated with alkaline and acid reagents // Microbiol. Immunol. 1984. - 28. - P. 161-168.

59. Andersson J., Melchers F., Galanos C., Luderitz O. The mitogenic effect of lipopolysaccharide on bone marrow-derived mouse lymphocytes. Lipid A as the mitogenic part of the molecule // J. Exp. Med. 1973. - 137. -P. 943-953.

60. Armstrong J.L., Shigeno D.S., Calomiris J.J., Seidler R.J. Antibiotic-resistant bacteria in drinking water // Appl. Environ. Microbiol. 1981. - 42. - P. 277283.

61. Arora S. K., Bangera M., Lory S., Ramphal R. A genomic island in Pseudomonas aeruginosa carries the determinants of flagellin glycosylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - 98. - P. 9342-9347.

62. Arunakumari A., Lamm R.B., Neyra-Estens C.A. Changes in the cell surface properties of azospirilla in relation to cell pleomorphism and aggregation // Symbiosis.- 1992. 13. - P. 291-305.

63. Assmus В., Schloter M., Kirchhof G., Hutzler P., Hartmann A. Improved in situ tracking of rhizosphere bacteria using dual staining with fluorescence-labeled antibodies and rRNA-targeted oligonucleotides // Microbial Ecology. 1996. -33.-P. 32-40.

64. Attridge S.R., Fazeli A., Manning P.A., Stroeher U.H. Isolation and characterization of bacteriophage-resistant mutants of Vibrio cholerae 0139 // Microb. Pathog. 2001. - 30. - P. 237-246.

65. Aucken H.M., Oxley D., Wilkinson S.G. Structural and serological characterisation of an O-specific polysaccharide from Serratia plymuthica II FEMS Microbiol. Lett. 1993. - 111. - P. 295-300.

66. Axelson N.H., Kroll J., Weeke B. A manual of quantitative immunoelectrophoresis, methods and applications // Scand. J. Immunol. -1973.-2.- Suppl. 1.

67. Bach J.-F. Antigen-antibody reactions // Immunology / Ed. J.-F. Bach. New York: John Wiley & Sons, 1982. - P. 285-326.

68. Bagger Y.Z. Monoclonal antibodies against Yersinia enterocolitica common antigen produced by immunization with immunoprecipitates // APMIS 1991. -99.-P. 972-976.

69. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. -1983.-29.-P. 924-929.

70. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Inoculation of field-grown wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum sp. // Brasil. Biol. Fertil. Soils. 1987. -4. - P. 37-40.

71. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host-plant specificity in the infection of cerals • with Azospirillum spp. // Soil Biol. Biochem. 1980. - 12. - P. 433-439.

72. Barbieri P., Zanelli Т., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - 36. - P. 87-90.

73. Barbiery P., Galli E. Effect on wheat root development of inoculation with an Azospirillum brasilense mutant with altered indole-3-acetic production // Res. Microbiol. 1993. - 144.-P. 69-75.

74. Bashan Y., Levanony H. Factors affecting adsorption of Azospirillum brasilense Cd to root hairs as compared with root surface of wheat // Can. J. Microbiol. 1989. - 35. - P. 936-944.

75. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture // Can. J. Microbiol. — 1990. 36. -P. 591-608.

76. Bashan Y., Levanony H., Klein E. Evidence for a weak active external adsorption of Azospirillum brasilense Cd to wheat roots // J. Gen. Microbiol. -1986.- 132.-P. 3069-3073.

77. Bashan Y., Levanony H.,Whitmoyer R.E. Root surface colonization of noncereal crop plants by pleomorphic Azospirillum brasilense Cd // J. Gen. Microbiol. 1991. - 137. - P. 187-196.

78. Bastarrachea F., Zamudio M., Rivas R. Non-encapsulated mutants of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II Can. J. Microbiol. — 1987.-34.-P. 24-29.

79. Bastin D.A., Reeves P.R. Sequence and analysis of the О antigen gene {rfb) cluster of Escherichia coli 0111 // Gene. 1995. - 164. - P. 17-23.

80. Baxa U., Cooper A., Weintraub A., Pfeil W., Seckler R. Enthalpic barriers to the hydrophobic binding of oligosaccharides to phage P22 tailspike protein // Biochemistry. 2001. - 40. - P. 5144-5150.

81. Bazil V., Strominger J.L. Shedding as a mechanism of down-modulation of CD14 on stimulated human monocytes // J. Immunol. 1991. - 147. - P. 15671574.

82. Beijerinck M.W. Uber ein Spirillum, welches freien Stickstoff binden kann? // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkun. Infektionskr. Hyg. 1925. - 63. - S. 353359.

83. Belunis C.J., Clementz Т., Carty S.M., Raetz C.R. Inhibition of lipopolysaccharide biosynthesis and cell growth following inactivation of the kdtA gene in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 2764627652.

84. Berg H. С., Brown D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analyzed by three-dimensional tracking // Nature. 1972. - 239. - P. 500-504.

85. Bhat U.R., Carlson R.W. Chemical characterization of pH-dependent structural epitopes of lipopolysaccharides from Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli // J. Bacteriol. 1992. - 174. - P. 2230-2235.

86. Bilar R., Rasul G., Arshad M., Malik K.A. Attachment, colonization and proliferation of Azospirillum brasilense and Enterobacter spp. on root surface of grasses // Word J. Microbiol. Biotechnol. 1993. - 9. - P. 63-69.

87. Bleakley B.H., Gaskins M.H., Hubbell D.H., Zam S.G. Flok formation by Azospirillum lipoferum grown on poly-b-hydroxybutyrate // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - 54. - P. 2986-2995.

88. Bohlool В., Schmidt E. The immunofluorecence approach in microbial ecology // Advances in Microbial Ecology / Ed. M. Alexander. — London: Academic press, 1980. P. 203-207.

89. Borneleit P, Blechschmidt B, Kleber HP. Lipopolysaccharide-protein interactions: determination of dissociation constants by affinity electrophoresis // Electrophoresis. 1989. - 10. - P. 848-852.

90. Brade H., Brade L., Rietschel E.T. Structure-activity relationships of bacterial lipopolysaccharides (endotoxins). Current and future aspects // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. А. 1988a. - 268. - P. 151-79.

91. Brade H., Galanos С. Common lipopolysaccharide specificity: new type of antigen residing in the inner core region of S- and R-form lipopolysaccharides from different families of gram-negative bacteria // Infect. Immun. 1983. -42.-P. 250-256.

92. Bradford M. N. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - 72. - P. 248-254.

93. Brimer C.D., Montie T.C. Cloning and comparison of fliC genes and identification of glycosylation in the flagellin of Pseudomonas aeruginosa a-type strains // J Bacteriol. 1998. - 180. - P. 3209-3217.

94. Brisson J.R., Perry M.B. The structures of the two lipopolysaccharide O-chains produced by Salmonella boecker II Biochem. Cell Biol. 1988. - 66. -P. 1066-1077.

95. Carlin N.I., Lindberg A.A., Bock K., Bundle D.R. The Shigella flexneri O-antigenic polysaccharide chain. Nature of the biological repeating unit // Eur. J. Biochem. 1984. - 139. - P. 189-194.

96. Carlson R.W., Kalembasa S., Turowski D., Pachori P., Noel K.D. Characterization of the lipopolysaccharide from a mutant of Rhizobium phaseoli which is defective in infection thread development // J. Bacteriol. -1987.- 169.-P. 4923-4928.

97. Castric P. pilO, a gene required for glycosylation of Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin // Microbiology. 1995. - 141. - P. 1247-1254.

98. Cava J.R., Elias P.M., Turowski D.A., Noel K.D. Rhizobium leguminosarum CFN42 genetic regions encoding lipopolysaccharide structures essential for complete nodule development on bean plants // J. Bacteriol. 1989. - 171. - P. 8-15.

99. Chaudhury S., Sengupta A. Association of nitrogen fixing bacteria with leaves of Avicennia officinalis L. a tidal mangrove tree of Sandarban // Indian. J. Microbiol. 1991. - 31. - P. 321 -322.

100. Chester I.R., Meadow P.M. Heterogeneity of the lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa II Eur. J. Biochem. 1975. — 58. - P. 273-282.

101. Choma A. Lipopolysaccharides from Mesorhizobium huakuii and Mesorhizobium cicereti: chemical and immunological comparative data I I Acta Biochim. Polonica. 2002. - 49. - P. 1043-1052.

102. Costacurta A., Vanderleyden J. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria // Crit. Rev. Microbiol.-1995,- 21.- P. 1-18.

103. Ciacci-Woolwine F., Blomfield I. C., Richardson S. H., Mizel S. B. Salmonella flagellin induces tumor necrosis factor alpha in a human promonocytic cell line // Infect. Immun. 1998. - 66. - P. 1127-1134.

104. Coley W.B. Treatment of inoperable malignant tumors with the toxins of Erysipelas and the Bacillus prodigiosus II Am. J. Med. Sci. 1894. - 108. - P. 183-212.

105. Coley-Nauts H, Swift W.E., Coley B.L. The treatment of malignant tumors by bacterial toxins as developed by the William B. Coley, MD, revised in the light of modern research // Cancer Res. 1946. - 6. - P. 205-216.

106. Coughlin R.T., Haug A., McGroarty E.J. Physical properties of defined lipopolysaccharide salts // Biochemistry. 1983. - 22. - P. 2007-2013.

107. Clementz Т., Raetz C.R. A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing //J. Biol. Chem. 1991. - 266. - P. 9687-9696.

108. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M. Microbial biofilms // Ann. Rev. Microbiol. 1995. - 49. - P. 711-745.

109. Croes C.L., Moens S., van Bastelaere E., Vanderleyden J., Michiels K. The polar flagellum mediated Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993. - 139. - P. 2261-2269.

110. Dahm H., Rozycki H., Strzelczyk E., Li C.Y. Production of B-group vitamins by Azospirillum spp. grown in media of different pH at different temperatures // Z. Mikrobiol. 1993. - 148. - S. 195-203.

111. David SA, Bechtel B, Annaiah C, Mathan VI, Balaram P. Interaction of cationic amphiphilic drugs with lipid A: implications for development of endotoxin antagonists // Biochim Biophys Acta. 1994. - 1212. - P. 167-175.

112. Davies M. Immunopotentiating activity of lipopopolysaccharides // Immunology of the bacterial cell envelope / Eds. D.E.S. Stewart-Tull, M. Davies.-John Wiley & Sons, 1985.-P. 271-300.

113. Davies R.L., Parton R., Coote J.G., Gibbs H.A., Freer J.H. Outer-membrane protein and lipopolysaccharide variation in Pasteurella haemolytica serotype Al under different growth conditions // J. Gen. Microbiol. 1992. - 138. - P. 909-922.

114. Dazzo F.B., Brill W.J. Bacterial polysaccharide which binds Rhizobium trifolii to clover root hairs // J. Bacteriol. 1979. - 137. - P. 1362-1373.

115. Dazzo F.B., Milam J.B. Serological studies of Spirillum lipoferum II Soil. Crop. Sci. Soc. Florids Proc. 1976. -35-P. 122-126.

116. Dazzo F.B., Urbano M.R., Brill W.J. Transient appearance of lectin receptors on Rhizobium trifolii II Curr. Microbiol. 1979. — 2. - P. 15-20.

117. Deasey M.C., Matthysse A.G. Interactions of wild-type and cellulose-minus mutant of Agrobacterium tumefaciens with tobacco mesophili and tobacco tissue culture cells // Phytopathol. 1984. - 74. - P. 991-994.

118. Dekker R.F., Rietschel E.T., Sandermann H. Jr. Isolation of alpha-glucan and lipopolysaccharide fractions from Acetobacter xylinum II Arch. Microbiol. 1977.- 115.-P. 353-357.

119. Del Gallo M., Negi M., Neira C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum И J. Bacteriol. 1989. - 171. - P. 3504-3510.

120. Deloe I.M., Gilchrist J.E. Release of endotoxin in the form of cell wall blebs in vitro growth of Neisseria meningitidis II J. Exp. Med. 1973. - 138. - P. 1156-1167.

121. De Mot R., Vanderleyden J. Application of two-dimensional protein analysis for strain fingerprinting and mutant analysis of Azospirillum species // Can. J. Microbiol. 1989. - 35. - P. 960-967.

122. De-Polli H., Bohlool B.B., Doebereiner J. Serological differentiation of Azospirillum species to different host-plant specificity groups // Arch. Microbiol. 1980. - 126. - P. 217-222.

123. Diaz C., Melchers L., Hooykaas P., Lugtenberg В., Kijne J. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhisobium-\Qg\m\Q symbiosis // Nature. 1989. -338. - P. 579-581.

124. Diedrich D.L., Stein M.A., Schnaitman C.A. Associations of Escherichia coli K-12 OmpF trimers with rough and smooth lipopolysaccharides // J. Bacteriol.- 1990.- 172.-P. 5307-5311.

125. Di Fabio J.L., Brisson J.R., Perry M.B. Structural analysis of the three lipopolysaccharides produced by Salmonella madelia II Biochem. Cell Biol. -1989.-67.-P. 78-85.

126. Dmitriev B.A., Ehlers S., Rietschel E.T. Layered murein revisited: a fundamentally new concept of bacterial cell wall structure, biogenesis and function//Med.Microbiol. Immunol. (Berl).- 1999.- 187.- P. 173-181.

127. Dobereiner J., Baldani V.L. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria // Can. J. Microbiol. 1979. -25 - P. 1264-1269.

128. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington, 1976. - P. 518-537.

129. Dodds K.L., Perry M.B., McDonald I.J. Alterations in lipopolysaccharide produced by chemostat-grown Escherichia coli 0157:H7 as a function of growth rate and growth-limiting nutrient // Can. J. Microbiol. — 1987. — 33. — P. 452-458.

130. Doig P., Kinsella N., Guerry P., Trust T. J. Characterization of a post-translational modification of Campylobacter flagellin: identification of a serospecific glycosyl moiety // Mol. Microbiol. 1996. - 19. - P. 379-387.

131. Doig P., Trust T.J. Identification of surface-exposed outer membrane antigens of Helicobacter pylori II Infect. Immun. 1994. - 62. - P. 4526-4533.

132. Dolph P.J., Majerczak D.P., Coplin D.L. Characterization of a gene cluster for exopolysaccharide biosynthesis and virulence in Erwinia stewartii II J. Bacteriol. 1988. - 170. - P. 865-871.

133. Dow M., Newman M.A., von Roepenack E. The induction and modulation of plant defense responses by bacterial lipopolysaccharides // Annu. Rev. Phytopathol. 2000. - 3 8. - P. 241 -261.

134. Droge W., Lehmann V., Liideritz O., Westphal O. Structural investigations on the 2-keto-3-deoxyoctonate region of lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1970.- 14.-P. 175-184.

135. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Roberts P. A. Smith F. Colorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Biochem. 1956. - 72. - P. 350-356.

136. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria// Plasmid 1978. - 1. - P. 584-588.

137. Eckert В., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - 51. - P. 17-26.

138. Eskew D.L., Focht D.D., Ting I.P. Nitrogen fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a highly pigmented Spirillum lipoferum II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - 34. - P. 582-585.

139. El-Samalouti V.T., Hamann L., Flad H.-D. The biology of endotoxin // Bacterial toxins: methods and protocols / Ed. O. Hoist- Totowa, NJ: Humana Press, 2000.-P. 287-309.

140. Eyers M., Vanderlayden J., Van Cool A. Attachment of Azospirillum to isolated plant cells // FEMS Microbiol. Lett. 1988. - 49. - P. 435-439.

141. Falk E.C., Dobereiner J., Johnson J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense Magalhaes et al. 1984 and emendation of the description of the genus Azospirillum II Inter. J. Syst. Bacteriol. 1985. -35.-P. 117-118.

142. Falk E.C., Johnson J.L., Baldani V.L., Dobereiner J., Krieg N.R. Deoxyribonucleic and ribonucleic acid homology studies of the genera Azospirillum and Coglomeromonas II Inter. J. Syst. Bacteriol. 1986. - 36. - P. 80-95.

143. Fallik E., Sarig S., Okon Y. Morphology and physiology of plant roots associated with Azospirillum II Azospirillum!plant associations / Ed. Y. Okon -Boca Raton, Fla: CRC Press, 1994. P. 77-85.

144. Fani R., Bandi C., Bazzicalupo M., Ceccherini M.F., Fancelli S., Gallori E., Gerace L., Grifoni A., Miclaus N., Damiani G. Phylogeny of the genus Azospirillum based on 16S rDNA sequence ff FEMS Microbiol. Lett. 1995. -129.-P. 195-200.

145. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - 337. - P. 869-872.

146. Felix G., Duran J.D., Volko S., Boiler T. Plants recognise bacteria through the most conserved domain of flagellin // Plant J. 1999. - 18. - P. 265-276.

147. Ferreira M., Fernandes M., Dobereiner J. Role of Azospirillum brasilense nitrate reductase in nitrate assimilation by wheat plants // Biol. Fertil. Soils. -1987.-4.-P. 47-53.

148. Freer J.H. Illustrated guide to the anatomy of the bacterial cell envelope // Immunology of the bacterial cell envelope / Eds. D.E.S. Stewart-Tull, M. Davies. John Wiley & Sons, 1985. - P. 355-384.

149. Freer E., Rojas N., Weintraub A., Lindberg A.A., Moreno E. Heterogeneity of Brucella abortus lipopolysaccharides // Res. Microbiol. 1995. - 146. - P. 569-578.

150. Frey E.A., Miller D.S., Jahr T.G., Sundan A., Bazil V., Espevik Т., Finlay B.B., Wright S.D. Soluble CD14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide // J. Exp. Med. 1992. - 176. - P. 1665-1671.

151. Fuerst J.A., Perry J.W. Demonstration of lipopolysaccharide on sheathed flagella of Vibrio cholerae 0:1 by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacteriol. 1988. - 170. - P. 1488-1494.

152. Funahara Y., Nikaido H. Asymmetric localization of lipopolysaccharides on the outer membrane of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1980. - 141. — P. 1463-1465.

153. Gafny R., Okon Y., Kapulnik Y., Fisher M. Adsorption of Azospirillum brasilense Cd to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1986. - 132. - P. 30693073.

154. Ge Y., Li C., Corum L., Slaughter C. A., Charon N. W. Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi II J. Bacteriol. 1998. - 180. - P. 2418-2425.

155. Gerl L., Sumper M. Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family. Characterization of five flagellin genes // J. Biol. Chem. 1988. — 263. -P. 13246-13251.

156. Giovanetti L., Ventura S., Bazzicalupo M., Fani R., Materassi R DNA restriction fingerprint analysis of the soil bacterium Azospirillum II J. Gen. Microbiol. 1990. - 136. - P. 1161-1166.

157. Goldman R.C., Leive L. Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2 // Eur. J. Biochem. 1980. - 107. - P. 145-153.

158. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Raetz C.R., Wright S.D. Human phagocytes have multiple lipid A-binding sites // Infect. Immun. 1990. - 58. -P. 4069-4075.

159. Gomez-Gomez L., Bauer Z., Boiler T. Both the extracellular leucine-rich repeat domain and the kinase activity of FSL2 are required for flagellin binding and signaling in Arabidopsis II Plant Cell. 2001. - 13. - P. 1155-1163.

160. Gomez-Gomez L., Boiler T. FLS2: A LRR receptor-like kinase involved in recognition of the flagellin elicitor in Arabidopsis II Mol. Cell. 2000. — 5. - P. 1-20.

161. Gomez-Gomez L., Felix G., Boiler T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1999. - 18. - P. 277284.

162. Goodman J.W. Antigenic determinants and antibody combining sites // The Antigens / Ed. M. Sela. New York: Academic Press, 1975. - Vol. 3. - P. 127187.

163. Gowri P.M., Srivastava S. Encapsulation as a response of Azospirillum brasilense Sp7 to zinc stress I I Wold J. Microbiol. Biotechnol. 1996. - 12. — P. 319-322.

164. Gryllos I., Shaw J.G., Gavin R., Merino S., Tomas J.M. Role offlm locus in mesophilic Aeromonas species adherence // Infect. Immun. — 2001. — 69. P. 65-74.

165. Guerry P., Aim R.A., Power M.E., Logan S.M., Trust T.J. Role of two flagellin genes in Campylobacter motility II J. Bacteriol. 1991. - 173. - P. 4757-4764.

166. Gundisch C., Kirchhof G., Baur M., Bode W., Hartmann A. Identification of Azospirillum species by RFLP and pulsed-field gel electrophoresis // Microbial Release. 1993.- 1.-P. 41-45.

167. Gutsmann Т., Haberer N., Carroll S.F., Seydel U., Wiese A. Interaction between lipopolysaccharide (LPS), LPS-binding protein (LBP), and planar membranes // Biol. Chem. 2001. - 382. - P. 425-434.

168. Gustafsson В., Holme Т. Rapid detection of Vibrio cholerae 0:1 by motility inhibition and immunofluorescence with monoclonal antibodies // Eur. J. Clin. Microbiol. 1985. - 4. - P. 291-294.

169. Hadas R., Okon Y. Effect of Azospirillum brasilense inoculation on root morphology and respiration in tomato seedlings // Biol. Fertil. Soils. — 1987. -5.-P. 241-247.

170. Hancock I.C., Poxton I.R. Bacterial cell surface techniques. John Wiley & Sons, 1988.-329 p.

171. Hancock R.E., Scott M.G. The role of antimicrobial peptides in animal defenses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - 97. - P. 8856-8861.

172. Hartmann A., Singh M., Klingmuller W. Isolation and characterization of Azospirillum mutants excreting high amounts of indole acetic acid // Can. J. Microbiol. 1983. - 29. - P. 916-923.

173. Hartwell J.L., Shear M.J., Adams J.R. Jr. Chemical treatment of tumors. VII. Nature of hemorrage-producing fractions from Serratia marcescens {Bacillus prodigiosus) culture filtrate // J. Natl. Cancer Inst. 1943. - 43. - P. 107-122.

174. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S., Underhill D.M., Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5 // Nature. 2001. - 410. -P. 1099-1103.

175. Hayashi S., Wu H.C. Lipoproteins in bacteria // J. Bioenerg. Biomembr. -1990.-22.-P. 451-471.

176. Haziot A., Chen S., Ferrero E., Low M.G., Silber R., Goyert S.M. The monocyte differentiation antigen, CD 14, is anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol linkage // J. Immunol. 1988. - 141. - P. 547-552.

177. Haziot A., Ferrero E., Kontgen F., Hijiya N., Yamamoto S., Silver J., Stewart C.L., Goyert S.M. Resistance to endotoxin shock and reduceddissemination of gram-negative bacteria in CD14-deficient mice // Immunity. -1996.-4.-P. 407-414.

178. He X., Rivkina M., Stocker В., Robinson W. S. Hypervariable region IV of Salmonella gene fliCd encodes a dominant surface epitope and a stabilizing factor for function flagella // J. Bacteriol. 1994. - 176. - P. 2406-2414.

179. Heckels J.E., Virji M. Preparation of lipopolysaccharide and enterobacterial common antigen // Bacterial Cell Surface Techniques / Eds. I. Hancock, I. Poxton. John Wiley & Sons. - 1988. - P. 90-96.

180. Helander I.M., Moran A.P., Makela P.H. Separation of two lipopolysaccharide populations with different contents of O-antigen factor 122 in Salmonella enterica serovar typhimurium // Mol. Microbiol. — 1992. — 6. — P. 2857-2862.

181. Henrichsen J. Bacterial surface translocation: a survey and a classification // Bacteriol. Rev. 1972. - 36. - P. 478-503.

182. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella polysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. - 154. - P. 269-277.

183. Holme Т., Rahman M., Jansson P.E., Widmalm G. The lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis structural relationships and antigenic properties // Eur. J. Biochem. 1999. - 265. - P. 524-529.

184. Hoist O., Brade H. Chemical structure of the core region of bacterial lipopolysaccharides // Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides / Eds. D.C. Morrison, J.L. Ryan. Boca Raton: CRC Press, 1992. - Vol. 1 - P. 135-170.

185. Hoist O., Ulmer A.J., Brade H., Flad H.D., Rietschel E.T. Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxin // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - 16.-P. 83-104.

186. Holzenburg A., Engel A., Kessler R., Manz H.J., Lustig A., Aebi U. Rapid isolation of OmpF porin-LPS complexes suitable for structure-function studies // Biochemistry. 1989. - 28. - P. 4187-4193.

187. Hood D.W., Moxon E.R. Lipopolysaccharide phase variation in Haemophilus and Neisseria II Entoxin in Health and Disease / Eds. H. Brade, S.M. Opal, Vogel S.N., Morrisson D.C. New York: Marcel Dekker, 1999. -P. 39-54.

188. Hrabak E., Urbano M., Dazzo F. Growth-phase-dependent immunodeterminants of Rhizobium trifolii lipopolysaccharide which bind trifoliin A, a white clover lectin // J. Bacteriol. 1981. - 148. - P. 697-711.

189. Ibarrola I., Sanz M.L., Gamboa P.M., Mir A., Benahmed D., Ferrer A., Arilla M.C., Martinez A., Asturias J.A. Biological characterization of glutaraldehyde-modified Parietaria judaica pollen extracts // Clin Exp Allergy. -2004.-34.-P. 303-309.

190. Irvin R.T., MacAlister T.J., Costerton J.W. Tris(hydroxy-methyl)aminometane buffer modification of Escherichia coli outer membrane permeability//J. Bacteriol. 1981. - 145.-P. 1397-1403.

191. Ishii J., Nakae T. Lipopolysaccharide promoted opening of the porin channel // FEBS Lett. 1993. - 320. - P. 251-255.

192. Jacques M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adhesion // Trends Microbiol. 1996. - 4. - P. 408-410.

193. Jain D., Partiquin D. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheat -Azospirillum association // Appl. Environ. Microbiol. 1984. — 48. - P. 1208-1213.

194. Jakeman S., Lee H., Trevors J. Survival, detection and containment of bacteria // Microbial. Releases. 1993. - 2. - P. 237-252.

195. Jann K., Jann B. Structure and biosynthesis of O-antigens // Handbook of Endotoxin, Vol. 1. Chemistry of Endotoxin / Ed. Rietschel E. Th. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1984.-P. 138-186

196. Jann В., Jann K. Structure and biosynthesis of the capsular antigens of Escherichia coli// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - 150. - P. 19-42.

197. Jann В., Reske K., Jann K. Heterogeneity of lipopolysaccharides. Analysis of polysaccharide chain lengths by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis // Eur. J. Biochem. 1975. - 60. - P. 239-246.

198. Jann K., Westphal O. Microbiol polysaccharides // The antigens / Ed. M. Sela. New York: Academic Press, 1975. - P. 1-126.

199. Josenhans C., Ferrero R. L., Labigne A., Suerbaum S. Cloning and allelic exchange mutagenesis of two flagellin genes of Helicobacter felis II Mol. Microbiol. 1999. - 33. - P. 350-362.

200. Kabat E.A. Structural concepts in immunology and immunochemistry. -New York: Holt Rinehardt Winston, 1976. 547 p.

201. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reaction // Meth. Enzymol. Immunochemical Techniques. — New York: Academic Press, 1980. — Vol. 70. — P. 3-49.

202. Kalmokoff M.L., Jarrell K.F. Cloning and sequencing of a multigene family encoding the flagellins of Methanococcus voltae II J. Bacteriol. 1991. - 173. -P. 7113-7125.

203. Kannenberg E.L., Carlson R.W. Lipid A and O-chain modifications cause Rhizobium lipopolysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development // Mol. Microbiol. 2001. - 39. - P. 379-391.

204. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - 31. - P. 881887.

205. Kato G., Maruyama Y. Nakamura M. Role of bacterial polysaccharides in the adsorption process of the Rhizobium-pza symbiosis. // Agric. Biol. Chem. -1980-44.-P. 2843-2855.

206. Kato N, Ohta M, Kido N, Naito S, Kuno T. Ultrastructure of Klebsiella 03 lipopolysaccharide isolated from culture supernatant: structure of various uniform salt forms // Microbiol Immunol. 1984. - 28. - P.559-567.

207. Katz A., Weckesser J., Drews G., Mayer H. Chemical and biological studies on the lipopolysaccharide (O-antigen) of Anacystis nidulans II Arch. Microbiol. 1977.- 113.-P. 247-256.

208. Katzy E.I., Matora L. Yu.} Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-Mda plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - 40. - P. 73-83.

209. Kauffmann F. The Kauffmann-White schema; diagnostic Salmonella antigen schema // Ergeb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1957. - 30. - P. 160216.

210. Kauffmann F., Liideritz O., Stierlin H., Westphal O. Zur Immunchemie der O-Antigene der Enterobacteriaceen. I. Analyse der Zuckerbausteine von Salmonella-O-Antigenen // Zentralbl. Bakt. I Orig. 1960. - 178. - S. 442-458.

211. Kawahara K., Seydel U., Matsuura M., Danbara H., Rietschel E.T., Zahringer U. Chemical structure of glycosphingolipids isolated from Sphingomonaspaucimobilis IIFEBS Lett. 1991. - 292. - P.107-110.

212. Kawahara K., Moll H., Knirel Y.A., Seydel U., Zahringer U. Structural analysis of two glycosphingolipids from the lipopolysaccharide-lacking bacterium Sphingomonas capsulate // Eur. J. Biochem. 2000. - 267. — P. 1837-1846.

213. Kawasaki S., Moriguchi R., Sekiya K., Nakai Т., Ono E., Kume K., Kawahara K. The cell envelope structure of the lipopolysaccharide-lacking gram-negative bacterium Sphingomonas paucimobilis II J. Bacteriol. 1994. — 176.-P. 284-290.

214. Keenleyside W.J, Whitfield C. Genetics and biosynthesis of lipopolysaccharide O-antigens // Entoxin in Health and Disease / Eds. H. Brade, S.M. Opal, S.N. Vogel, D.C. Morrisson. New York: Marcel Dekker, 1999. -P. 331-358.

215. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // The polysaccharides, Vol. 2 / Ed. G.O. Aspinall. Orlando: Academic Press, 1983. - P. 287-363.

216. Kerr S., Ball H.J., Mackie D.P., Pollock D.A., Finlay D.A. Diagnostic application of monoclonal antibodies to outer membrane protein for rapid detection of Salmonella II J. Appl. Bacteriol. 1992. - 72. - P. 302-308.

217. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Kaiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. - 140. - P. 679-693.

218. Kijne J.W. The Rhizobium infection process // Biogical Nitrogen Fixation / Eds. G. Stacey, R.H. Burris, H.J. Evans. New York: Chapman and Hall, 1992. -P. 349-398.

219. Kirchhof G., Schloter M., Assmus В., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Boil. Biochem. 1997. - 29. - P. 853-862.

220. Kitchens R.L. Role of CD 14 in cellular recognition of bacterial lipopolysaccharides // Chem. Immunol. 2000. - 74. - P. 61-82.

221. Koch A.L. The biophysics of the gram-negative periplasmic space // Crit. Rev. Microbiol. 1998. - 24. - P. 23-59.

222. Kohler G., Milstein C. Continous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specifity // Nature. 1975. - 256. - P. 495-497.

223. Korhonen T.K, Tarkka E., Ranta H, Haahtela K. Type 3 fimbriae of Klebsiella sp.: molecular characterization and role in bacterial adhesion to plant roots // J. Bacteriol. 1983. - 155. - P. 860-865.

224. Kosslak R.M., Bohlool B.B. Prevalense of Azospirillum spp. in the rhizosphere of tropical plants // Can. J. Microbiol. 1983. - 29. - P. 629-639.

225. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum Tarrand, Krieg and • Dobereiner 1979 // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1. —

226. Baltimore/London: Williams & Wilkins, 1984. P. 94-104.

227. Krziwon C., Zahringer U., Kawahara K., Weidemann В., Kusumoto S., Rietschel E.T., Flad H.D., Ulmer A.J. Glycosphingolipids from Sphingomonas paucimobilis induce monokine production in human mononuclear cells // Infect. Immun.- 1995.-63.-P. 2899-2905.

228. Laird M.W., Kloser A.W., Misra R. Assembly of LamB and OmpF in deep rough lipopolysaccharide mutants of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. -1994.- 176.-P. 2259-2264.

229. Lechner J., Wieland F. Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins //Annu. Rev. Biochem. 1989. - 58. - P. 173-194.

230. LeClerc G., Wang S. P., Ely B. A new class of Caulobacter crescentus flagellar genes //J. Bacteriol. 1998. - 180. - P. 5010-5019.

231. Leive L., Shovlin V.K., Mergemhagen S.E. Physical, chemical and immunological properties of lipopolysaccharides released from Escherichia coli by ethylenediaminetetraacetate // J. Biol. Chem. 1968. - 243. - P. 6384-6391.

232. Lerouge I., Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal/plant-microbe interactions // FEMS Microbiol. Rev. -2001.-26.-P. 17-47.

233. Levanony H., Bashan Y. Enhancement of cell division in root tips and growth of the elongation zone in wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Bot. 1989. - 67. - P. 56-61.

234. Levanony H., Bashan Y. Active attachment of Azospirillum brasilense to root surface of non-cereal plants and to sand particles // Plant Soil. 1991. -137.-P. 91-97.

235. Levanony H., Bashan Y., Kahana Z.E. Enzyme-linked immunosorbent assay for specific identification and enumeration of Azospirillum brasilense Cd in cereal roots // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - 53. - P. 358-364.

236. Logan S.M., Kelly J.F., Thibault P., Ewing C.P., Guerry P. Structural heterogeneity of carbohydrate modifications affects serospecificity of Campylobacter flagellins // Mol. Microbiol. 2002. - 46. - P. 587-597.

237. Loppnow H. LPS, recILl and smooth muscle cell-ILl activate vascular cells • by specific mechanisms // Prog. Clin. Biol. Res. 1994. - 388. - P.309-321.

238. Luderitz O., Staub A.M., Westphal O. Immunochemistry of О and R antigens of Salmonella and related Enterobacteriaceae II Bacteriol. Rev. — 1966.-P. 192.

239. MacNab R.M. Genetics and biogenesis of bacterial flagella // Annu. Rev. Genet. 1992.-26.-P. 131-158.

240. Madi L., Henis Y. Aggregation in Azospirillum brasilense Cd: conditions and factors involved in cell-to-cell adhesion // Plant and Soil. 1989. - 115.-P. 89-98.

241. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new acid-tolerant Azospirillum species I I An. Acad. Brasil Cienc. 1983. — 55. -P. 417-430.

242. Mamat U., Seydel U., Grimmecke D., Hoist O., Rietschel E.T. Lipopolisaccharides // Carbohydrates and Their Derivative Including Tannins, Cellulose and Related Lignins / Ed. B.M. Pinto. Amsterdam: Elsevier, 1999. -Vol.3.-P. 179-239.

243. Marceau M., Forest К., Beretti J.L., Tainer J., Nassif X. Consequences of the loss of O-linked glycosylation of meningococcal type IV pilin on piliation and pilus-mediated adhesion // Mol. Microbiol. 1998. - 27. - P. 705-715.

244. Matthysse A.G. Role of bacterial cellulose fibrils in Agrobacterium tumefaciens infection // J. Bacteriol. 1983. - 154. - P. 906-915.

245. Matthysse A.G. Mechanisms of bacterial adhesion to plant surfaces // Bacterial adhesion / Eds. D.C. Savage, M. Fletcher. New York, London: Plenum Press, 1985. - P. 255-273.

246. Matthysse A.G. Characterization of nonattaching mutants of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 1987. - 169. - P. 313-323.

247. Matthysse A.G., Holmes K.V., Gurlitz H.G. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot cells // J. Bacteriol. -1981.-145.-P. 583-599.

248. Mavingui P., Laguerre G., Berge O., Heulin T. Genetic and phenotypic diversity of Bacillus polymyxa in soil and in the wheat rhizosphera // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - 58. - P. 1894-1903.

249. McCartney A.C., Wardlaw A.C. Endotoxin activities of lipopolysaccharides // Immunology of the Bacterial Cell Envelope / Eds. D.E.S. Stewart-Tull, M. Davies. Chichester: John Wiley & Sons, 1985. - P. 203-238.

250. McGroarty E.J., Rivera M. Growth-dependent alterations in production of serotype-specific and common antigen lipopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa PAOl // Infect. Immun. 1990. - 58. - P. 1030-1037.

251. McDermott P.F., Ciacci-Woolwine F., Snipes J.A., Mizel S.B. High-affinity interaction between gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation // Infect. Immun. 2000. - 68. - P. 55255529.

252. Meikle P.J., Perry M.B., Cherwonogrodzky J.W., Bundle D.R. Fine structure of A and M antigens from Brucella biovars // Infect. Immun. 1989. - 57. - P. 2820-2828.

253. Michiels K., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. -1991.- 137.-P. 2241-2246.

254. Michiels K., Vanderleyden J., Van Gool A.P., Signer E.R. Isolation and characterization of Azospirillum brasilense loci that correct Rhizobium meliloti exoB and exoC mutants // J. Bacteriol. 1988. - 170. - P. 5401-5404.

255. Michiels K., Verreth C., Vanderleyden J. Azospirillum lipoferum and Azospirillum brasilense surface polysaccharide mutants that are affected in flocculation // J. Appl. Bacteriol. 1990. - 69. - P. 705-711.

256. Milner K.C., Rudbach J.A., Ribi E. Bacterial endotoxins: general characteristics // Microbial Toxins. Vol. IV. Bacterial Endotoxins / Eds. G. Weinbaum, S. Kadis, S.J. Ajl. New Work and London: Academic Press, 1971.-P. 1-65.

257. Mimori-Kiyosue Y., Yamashita I., Yamaguchi S., Namba K. Role of the outermost subdomain of Salmonella flagellin in the filament structure revealed by electron microscopy // J. Mol. Biol. 1998. - 284. - P. 521-530.

258. Minamino Т., Yamaguchi S., Macnab R. M. Interaction between FliE and FlgB, a proximal rod component of the flagellar basal body of Salmonella II J. Bacteriol. 2000. - 182. - P. 3029-3036.

259. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum of Azospirillum brasilense, a gram-negative nitrogen-fixing bacterium // Microbiology. 1995. - 141. - P. 2651-2657.

260. Molin S. O., Nygren H., Dolonius L. A new method for the study of glutaraldehyde-induced crosslinking properties in proteins with special reference to the reaction with amino groups // J. Histochem Cytochem. 1978. - 26.-P. 412-414.

261. Morgan J.A.W., Winstanley C., Pickup R., Saunders J. Rapid immunocapture of Pseudomonas putida cells from lake water by using bacterial flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - 57. - P. 503-509.

262. Muhlradt P.F., Golecki J.R. Asymmetrical distribution and artifactual reorientation of lipopolysaccharide in the outer membrane bilayer of Salmonella typhimurium II Eur. J. Biochem. 1975. - 51. — P. 343-352.

263. Murty M.G., Ludha J.K. Differential colonization of Azospirillum lipoferum on roots of two varieties of rice (Oryza sativa L.) // Biol. Fertil. Soils. 1987.-4.-P. 3-7.

264. Muzio M., Polentarutti N., Bosisio D., Prahladan M.K., Mantovani A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes // J. Leukoc. Biol. 2000b - 67. - P. 450-456.

265. Namba K., Yamashita I., Vonderviszt F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella // Nature. 1989. - 342. - P. 648-654.

266. Nelson D., Bathgate A.J., Poxton I.R. Monoclonal antibodies as probes for detecting lipopolysaccharide expression on Escherichia coli from different growth conditions// J. Gen. Microbiol. 1991. - 137.-P. 2741-2751.

267. Newman M.A., Van Roepenack E., Daniels M., Dow M. Lipopolysaccharides and plant responses to phytopathogenic bacteria // Plant Pathol. 2000. - 1. - P. 25-31.

268. Newton S.M.C., Wasley R.D., Wilson A., Rosenberg L.T., Miller J.F., Stocker B.A. Segment IV of a Salmonella flagellin gene specifies flagellar antigen epitopes // Mol. Microbiol. 1991. - 5. - P. 419-425.

269. Nghiem H.O., Himmelspach K., Mayer H. Immunochemical and structural analysis of the О polysaccharides of Salmonella zuerich II J. Bacteriol. — 1992. 174.-P. 1904-1910.

270. Nikaido H. Porins and specific channels of bacterial outer membranes // Mol Microbiol. 1992. - 6. - P. 435-442.

271. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. - 49. - P. 1-32.

272. Nikaido H., Vaara M. Outer membrane // Escherichia coli and Salmonella typhimurium / Ed. F.C. Neidhardt. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987.-P. 7-22.

273. Noel K.D. Rhizobial polysaccharides required in symbiosis with legumes // Molecular signals in Plant-Microbe Communications / Ed. D.P.S. Verma. — Boca Raton: CRC Press, 1992. P. 341-357.

274. Nosko P., Bliss L.C., Cook F.D. The association of free-living nitrogen-fixing bacteria with the roots of High Arctic graminoids // Arct. Alp. Res. -1994.-26.-P. 180-186.

275. Nuhse T.S., Peck S.C., Hirt H., Boiler T. Microbial elicitors induce activation and dual phosphorylation of the Arabidopsis thaliana МАРК 6 // J. Biol. Chem. 2000. - 275. - P. 7521-7526.

276. Nuijten P.J, van Asten F.J., Gaastra W., van der Zeijst B.A. Structural and functional analysis of two Campylobacter jejuni flagellin genes // J. Biol. Chem. 1990. - 265. - P. 17798-17804.

277. Obst U., Huebner I., Wecker M., Bitter-Suermann D. Immunological method using monoclonal antibodies to detect Enterobacteriaceae in drinking water // Aqua. 1989. - 38. - P. 136-142.

278. Ohta-Tada U., Takagi A., Koga Y., Kamiya S., Miwa T. Flagellin gene diversity among Helicobacter pylori strains and IL-8 secretion from gastric epithelial cells // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - 32. - P. 455-459.

279. Ogan M. Studies on the ecology of aquatic bacteria of the lower Niger delta: populations of viable cells and physiological groups // Arch. Hydrobiol. — 1991. 124.-P. 235-252.

280. Okon Y. Microbial inoculants as crop-yield enhancers // Crit. Rev. Biotechnol. 1987. - 6. - P. 388-401.

281. Okon Y., Itzigsohn R. Poly-(3-hydroxybutyrate metabolism in Azospirillum brasilense and the ecological role of PHB in the rhizosphera // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - 103. - P. 131-139.

282. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of ^zosp/V/Z/wra-inoculated roots // Plant Soil. 1986. - 90. - P. 3-16.

283. Okon Y., Labandera-Gonzales C. Agronomic application of Azospirillum'. An evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil Biol. Biochem. -1994.-26.-P. 1591-1601.

284. Onica D., Dobre M.A., Lenkei R. Immunogenicity of glutaraldehyde treated homologous monomeric albumin in rabbits // Immunochemistry. 1978. — 15. -P. 941-944.

285. Onkelinx E., Meuldermans W., Joniau M., Lontie R. Glutaraldehyde as a coupling reagent in passive haemagglutination // Immunology. 1969 — 16. -P. 35-43.

286. Orskov F., Orskov I. Escherichia coli serotyping and disease in man and animals // Can. J. Microbiol. 1992. - 38. - P. 699-704.

287. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis // Handbook of Experimental Immunology. Vol. 1. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. Oxford: Alden Press, 1979. - P. 19-33.

288. Palva E.T., Makela P.H. Lipopolysaccharide heterogeneity in Salmonella typhimurium analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis // Eur. J. Biochem. 1980. - 107. - P. 137-143.

289. Parge H. E., Forest К. Т., Hickey M. J., Christensen D. A., Getzoff E. D., Tainer J. A. Structure of the fibre-forming protein pilin at 2.6 A resolution // Nature. 1995. - 378. - P. 32-38.

290. Patriquin D.J., Dobereiner J. Light microscopy observations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brasil // Can. J. Microbiol. 1978. - 24. - P. 734-747.

291. Patriquin D.J., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses // Can. Microbiol. 1983- 29 - P. 900-915.

292. Paul A., Clark F.E. Soil microbiology and biochemistry. San Diego: Academic Press, 1988.

293. Pazur J.H., Kelly S.A. The identification of antigenic determinants by coupled imhibition agar diffusion method // J. Immunol. Meth. - 1984. - 75. -P. 107-116.

294. Pedersen J.C., Jacobsen C.S. Fate of Enterobacter cloacae JP120 and Alcaligenes eutrophus АЕ01Ю6 in soil during water stress: effects of culturability and viability // Appl. Environ. Microbiol. — 1993. 59. - P. 15601564.

295. Peterson A.A., McGroarty E.J. High-molecular-weight components in lipopolysaccharides of Salmonella typhimurium, Salmonella minnesota, and Escherichia colill J. Bacteriol. 1985. - 162. - P. 738-745.

296. Pfeiffer R. Untersuchungen iiber das Choleragift // Z. Hygiene. 1892. - 11. -S. 393-412.

297. Pleier E., Schmitt R. Identification and sequence analysis of two related flagellin genes in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1989. - 171. - P. 14671475.

298. Pleier E., Schmitt R. Expression of two Rhizobium meliloti flagellin genes and their contribution to the complex filament structure // J. Bacteriol. 1991. — 173.-P. 2077-2085.

299. Pon G., Staub A.M. Chemical study of a somatic typhoid polyoside // Bull. Soc. Chim. Biol. (Paris). 1952. - 34. - P. 1132-1144.

300. Power P.M., Jennings M.P. The genetics of glycosylation in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - 218. - P. 211-222.

301. Puvanesarajah V., Schell F., Stacey G., Douglas C., Nester E. Role of 2-linked-b-D-glucan in the virulence of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 1985.- 164-P. 102-106.

302. Qadri F, Haque A, Hossain A, Albert MJ. Production of slime polysaccharides by Shigella dysenteriae type 1 // Microbiol Immunol. — 1994. — 38. -P. 11-18.

303. Rabinovitch M. Attachment of modified erythrocytes to phagocytic cells in absence of serum // Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1967. - 124. - P. 396-399.

304. Ramos A., Zavala F., Hoecker G. Immune response to glutaraldehyde-treated cells. I. Dissociation of immunological memory and antibody production // Immunology. 1979. - 36. - P. 775-780.

305. Reinhold В. В., Hauer C. R., Plummer Т. H., Reinhold V. N. Detailed • structural analysis of a novel, specific O-linked glycan from the prokaryote

306. Flavobacterium meningosepticum II J. Biol. Chem. 1995. — 270. - P. 1319713203.

307. Rely veld E.H. Preparation of antitoxic and antimicrobial vaccines using glutaraldehyde //Acad. Sci. Hebd. Seances Acad. Sci. D. 1973. - 6. - P. 613616.

308. Reuhs B.L., Kim J.S., Badgett A., Carlson R.W. Production of cell-associated polysaccharides of Rhizobium fredii USDA205 is modulated by apigenin and host root extract // Mol. Plant Microbe Interact. 1994. - 7. - P. 240-247.

309. Rick P.D., Hubbard G.L., Barr K. Role of the rfe gene in the synthesis of the 08 antigen in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1994. - 176. - P. 28772884.

310. Ried G., Hindennach I., Henning U. Role of lipopolysaccharide in assembly of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA, OmpC, and OmpF // J. Bacteriol. 1990. - 172. - P. 6048-6053.

311. Rietschel E.T., Brade H. Bacterial endotoxins // Sci. Am. 1992. - 267. - P. 54-61.

312. Rietschel E.T., Kirikae Т., Schade F.U., Ulmer A.J., Hoist O., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke H.D., Kusumoto S. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity // Immunobiology. 1993. -187.-P. 169-190.

313. Rietschel E.T., Westphal O. Endotoxin: historical perspectives // Entoxin in Health and Disease / Eds. H. Brade, S.M. Opal, S.N. Vogel, D.C. Morrisson. -New York: Marcel Dekker, 1999. P. 1-30.

314. Rivera M., Bryan L.E, Hancock R.E, McGroarty E.J. Heterogeneity of lipopolysaccharides from Pseudomonas aeruginosa: analysis of lipopolysaccharide chain length //J. Bacteriol. 1988. - 170. - P. 512-521.

315. Robbins P.W., Uchida T. Studies on the chemical basis of the phage conversion of O-antigens in the E group Salmonella II Biochemistry. 1962a. -l.-P. 323-335.

316. Robbins P.W., Uchida T. Determinants of specificity in Salmonella: changes in antigenic structure mediated by bacteriophage // Fed. Proc. 1962b. - 21. -P. 702-710.

317. Rodelas В., Salmeron V., Martinez-Toledo M.V., Gonzalez-Lopez J. Productions of vitamins by Azospirillum brasilense in chemically-defined media // Plant Soil. 1993. - 153. - P. 97-101.

318. Sadasivan L., Neyra C. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: exopolysaccharides and cyst formation // J. Bacteriol. — 1985.- 163.-P. 716-723.

319. Sadasivan L., Neyra C. Cyst production and brown pigment formation in aging cultures of Azospirillum brasilense ATCC 29145 // J. Bacteriol. 1987. -169.-P. 1670-1677.

320. Sanderson C.J., Frost P. The induction of tumour immunity in mice using glutaraldehyde-treated tumor cells // Nature. 1974. - 19. - P. 690-691.

321. Sarig S., Blum A., Okon Y. Improvement of the water status and yield of field-grown grain sorghum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense // J. Agric. Sci 1988. - 110. - P. 271-277.

322. Schaad N. Serological identification of plant pathogenic bacteria // Ann. Rev. Phytopathol. 1979. - 17. - P. 123-147.

323. Schank S.C., Smith R.L., Weiser G.C. Fluorescent antibody technique to identify Azospirillum brasilense associated with roots of grasses // Soil Biol. Biochem.- 1979.- 11.-P. 287-295.

324. Schindler H., Rosenbusch J.P. Matrix protein in planar membranes: clusters of channels in a native environment and their functional reassembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - 78. - P. 2302-2306.

325. Schlosshardt J. Studies on the origin of T antigens in the S-R variation in Salmonella // Arch. Hyg. Bakteriol. 1960. - 177. - P. 176-185.

326. Schloter M., Assmus В., Hartmann A. The use of immunological methods to detect and identify bacteria in the environment // Biotechnol. Advances. 1995. -13.-P. 75-90.

327. Schloter M., Bode W., Hartmann A. Characterization of monoclonal antibodies against cell surface structures of Azospirillum brasilense Sp 7 using ELISA Techniques // Symbiosis. 1992. - 13. - P. 37-45.

328. Schloter M., Hartmann A. Production and characterization of strain specific monoclonal antibodies against outer membrane components of Azospirillum brasilense Sp245 // Hybridoma. 1996. - 15. - P. 225-232.

329. Schnaitman C.A., Klena J.D. Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria // Microbiol. Rev. 1993. - 57. - P. 655-682.

330. Schumann R.R., Leong S.R., Flaggs G.W., Gray P.W., Wright S.D., Mathison J.C., Tobias P.S., Ulevitch R.J. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein // Science. 1990. - 249. - P. 1429-1431.

331. Sen K., Nikaido H. Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin // J. Bacteriol. 1991. - 173. - P. 926-928.

332. Seydel U., Labischinski H., Kastowsky M., Brandenburg K. Phase behavior, supramolecular structure, and molecular conformation of lipopolysaccharide // Immunobiology. -1993.-187.-P.191-211.

333. Shah S., Karkhanis V., Desai A. Isolation and characterization of siderophore, with antimicrobial activity, from Azospirillum lipoferum II Curr. Microbiol. 1992. - 25. - P. 347-351.

334. Shands J.W., Chun P.W. The dispersion of gram-negative lipopolysaccharide by deoxycholate. Subunit molecular weight // J Biol Chem. 1980.-255.-P. 1221-1226.

335. Shchyogolev S.Yu. Inverse problems of spectroturbidimetry of biological disperse systems: An overview // J. Biomed. Opt. 1999. - 4. - P. 490-503.

336. Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G., Schwartsburd B.I. Spectroturbidimetry as applied to biomedical and immunological investigations // Optical Methods of Biomedical Diagnostics and Therapy / Ed. V.V. Tuchin. Bellingham: SPIE, 1993.-Vol. 1981.-P. 67-87.

337. Shear M.J., Turner F.C. Chemical treatment of tumors. V. Isolation of the hemorrage-producing fractions from Serratia marcescens (Bacillus prodigiosus) culture filtrate // J. Natl. Cancer Inst. 1943. - 43. - P. 81-97.

338. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. Approved lists of bacterial names // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - 30. - P. 225-420.

339. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. — 1998.- 165.-P. 223-229.

340. Sleytr U.B., Messner P., Minnikin D.E., Heckels V.E., Virji M., Hancock I., Poxton I. Structure of bacteria and their envelopes // Bacterial Cell Surface Techniques / Eds. I. Hancock, I. Poxton. John Wiley & Sons. - 1988. - P. 132.

341. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J.J. Correlation between extracellular fibrils and attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1986.- 168.-P. 821-827.

342. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J.J. Involvement of both cellulose fibrils1. Л Iand Ca -dependent adhesin in the attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips//J. Bacteriol. 1987. - 169.-P. 4294-4301.

343. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J.J. Roles of flagella, lipopolysaccharide and Ca -dependent cell surface protein in attachment of Rhizobium leguminosarum biovar viciae to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1989. — 171. -P. 569-572.

344. Smit G., Swart S., Lugtenberg B.J.J., Kijne J.W. Molecular mechanisms of attachment of Rhizobium bacteria to plant roots // Mol. Microbiol. — 1992. 6. -P. 2897-2903.

345. Smith A.R., Zamze S.E., Munro S.M., Carter K.J., Hignett R.C. Structure of the sidechain of lipopolysaccharide from Pseudomonas syringae pv. morsprunorum C28 // Eur. J. Biochem. 1985. - 149. - P. 73-78.

346. Soto G.E., Hultgren S.J. Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly // J. Bacteriol. 1999. - 181. - P. 1059-1071.

347. Spaink H.P. Rhizobial lipo-oligosaccharides: answers and questions // Plant Mol. Biol. 1992. - 29. - P. 977-986.

348. Speiser F. Serodiagnosis of tissue dwelling parasites: application of a multi-antigen Enzyme-Linked-immunosorbent Assay (ELISA) for screening // Ann. Soc. Beige Med. Trop. 1982. - 62. - P. 103-120.

349. Stancheva I., Dimitrov I., Kaloyanova N., Dinev N., Poushkarov N. Improvement of the nitrogen uptake and nitrogen content in maize {Zea mays L.) by inoculation with Azospirillum brasilense II Agrochimica. — 1995. — 39 — P. 299-306.

350. Starnes C.O. Coley's toxins in perspective // Nature. 1992. - 357. - P. 1112.

351. Staub A.M. Chemical constitution of some sites present on the surface of Enterobacteriaceae responsible for their specificity towards antibodies and bacteriophages // Pathol. Microbiol. (Basel). 1961. - 24. - P. 890-909.

352. Staub A.M., Tinelli R., Luderitz O., Westphal O. Immunochemical study of Salmonella. V. Role of various sugars, especially 3, 6-bis-desoxyhexoses, in the specificity of Kauffmann-White О antigens // Ann Inst Pasteur (Paris). 1959. -96.-P. 303-332.

353. Stead A., Main J.S., Ward M.E., Watt P.J. Studies on lipopolysaccharides isolated from strains of Neisseria gonorrhoeae II J. Gen. Microbiol. — 1975. -88. P. 123-131.

354. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - 24. - P. 487-506.

355. Stevenson G., Kessler A., Reeves P.R. A plasmid-borne O-antigen chain length determinant and its relationship to other chain length determinants // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - 125. - P. 23-30.

356. Strzelczyk E., Kampert M., Li C.Y. Cytokinin-like substances and ethylene production by Azospirillum in media with different carbon sources // Microbiol. Res.-1994.-149.-P. 55-60.

357. Stutman O. Specific immune response to soluble antigens from mouse mammary tumors // Proc. VIII Meeting on Mammary Cancer in Experimental Animals and Man. National Cancer Programs, 1973. P. 47.

358. Syzmanski С. M., Yao R., Ewing C. P., Trust T. J., Guerry P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni И Mol. Microbiol. 1999. - 32. - P. 1022-1030.

359. Tao H., Brewin N.J., Noel K.D. Rhizobium leguminosarum CFN42 lipopolysaccharide antigenic changes induced by environmental conditions 11 J. Bacteriol. 1992. - 174. - P. 2222-2229.

360. Tapia-Hernandez A., Mascarua-Esparza M.A., Caballero Mellado J. Production of bacteriocins and siderophore-like activity by Azospirillum brasilense И Microbiology. 1990. - 64. - P. 73-83.

361. Thomashow L.S., Rittenberg S.C. Isolation and composition of sheathed flagella from Bdellovibrio bacteriovorus 109J // J. Bacteriol. — 1985. 163. - P. 1047-1054.

362. Tien Т., Gaskins M., Hubbell D. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet // Appl. Environ. Microbiol. 1979. - 37. - P. 1016-1024.

363. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Vol. 15 / Eds. R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. Amsterdam, New York, London: Elsevier, 1985. - P. 423-447.

364. Tobias P.S. Lipopolysaccharide-binding protein // Entoxin in Health and Disease / Eds. H. Brade, S.M. Opal, S.N. Vogel, D.C. Morrisson. New York: Marcel Dekker, 1999. - P. 359-367.

365. Tronick S.R, Martinez R.J. Methylation of the flagellin of Salmonella typhimurium IIJ Bacteriol. 1971. - 105. - P. 211-219.

366. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharidesin polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. — 119.— P. 115-119.

367. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques (ELISA) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis // Methods Enzymol. -1983.-92.-P. 377-391.

368. Tyler M.E., Milam J.R., Smith R.L., Schank S.C., Zuberer D.A. Isolation of Azospirillum from diverse geographic regions // Can. J. Microbiol. 1979. -25.-P. 693-697.

369. Uchida Т., Robbins P.W., Luria S.E. Analysis of the serologic determinant groups of the Salmonella О antigen // Biochemistry. 1963. — 2. — P. 663-668.

370. Umali-Garcia M., Hubbell D., Gaskins M., Dazzo F. Adsorption and mode of entry of Azospirillum brasilense to grass roots // Associative ^-Fixation, Boca Raton: CRC Press, 1981. Vol. 1. - P. 49-62.

371. Umali-Garcia M., Hubbell D., Gaskins M., Dazzo F. Association of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - 39. - P. 219-226.

372. Unger F.M. The chemistry and biological significance of 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (Kdo) // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. — 1981. -38.-P. 323-387.

373. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Rev. 1992. - 56. - P. 395-411.

374. Vaara M. Lipopolysaccharide and permeability of the bacterial outer membrane // Endotoxin in Health and Disease / Eds. H. Brade, S.M. Opal, S.N. Vogel, D.C. Morrisson. New Work: Marcel Dekker, 1999. - P. 31-38.

375. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Methods of carbohydrate chemistry / Ed. R. L. Whistler. New York: Academic Press, 1965. - Vol. 5. -P. 83-91.

376. Westphal O., Jann K., Himmelspach K. Chemistry and immunochemistry of bacterial lipopoplysaccharide as cell wall antigens and entotoxins // Prog. Allergy. 1983. - 33. - P. 9-39.

377. Westphal O., Luderitz O, Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser // Z. Naturforsch. 1952. - 7. - S. 148-155.

378. Westphal O., Luderitz O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bakterien // Angew. Chem. 1954. - 66. -S. 407-417.

379. Whatley M., Bodwin J., Lippincott В., Lippincott J. Role for Agrobacterium cell envelop lipopolysaccharide in infection site attachment // Infection and Immunity. 1976. - 13. - P. 1080-1083.

380. Whitfield C., Richards J.C., Perry M.B., Clarke B.R., MacLean L.L. Expression of two structurally distinct D-galactan О antigens in the lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae serotype Ol // J Bacteriol. 1991. - 173.-P. 1420-1431.

381. Whitfield С., Valvano M.A. Biosynthesis and expression of cell-surface polysaccharides in Gram-negative bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1993. -35.-P. 135-246.

382. Wiemann В., Starnes C.O. Coley's toxins, tumor necrosis factor and cancer research: a historical perspective // Pharmacol. Ther. 1994. - 64. - P. 529-564.

383. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides themes and variations // Prog. Lipid Res. - 1996. - 35. - P. 283-343.

384. Wolpert J., Albersheim P. Host-symbiont interactions. I. The lectins of legumes interact with the O-antigen containing lipopolysaccharides of their symbiont rhizobia // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. - 70. - P. 729737.

385. Wood P.J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides // Carbohydr. Res. 1980. - 85. - P. 271-287.

386. Wright S.D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevitch R.J., Mathison J.C. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein //Science. 1990.-249.-P. 1431-1433.

387. Wyckoff T.J., Raetz C.R., Jackman J.E. Antibacterial and antiinflammatory agents that target endotoxin // Trends. Microbiol. 1998. - 6. -P. 154-159.

388. Wyss C. Flagellins, but not endoflagellar sheath proteins, of Treponema pallidum and of pathogen-related oral spirochetes are glycosylated // Infect. Immun. 1998. - 66. - P. 5751-5754.

389. Xu P., Leong S., Sequeira L. Molecular cloning of genes that specify virulence in Pseudomonas solanacearum II J. Bacteriol. 1988. — 170. - P. 617-622.

390. Yagoda-Shagam J., Barton L.L., Reed W.P., Chiovetti R. Fluorescein isothiocyanate-labeled lectin analysis of the surface of the nitrogen-fixingbacterium Azospirillum brasilense by flow cytometry // Appl. Environ. Microbiol. 1988.-54.-P. 1831-1837.

391. Yegorenkova I.V., Konnova S.A., Sachuk V.N., Ignatov V.V. Azospirillum brasilense colonisation of wheat root and the role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation // Plant Soil. — 2001.-231.-P. 275-282.

392. Yokota S., Kaya S., Sawada S., Kawamura Т., Araki Y., Ito E. Characterization of a polysaccharide component of lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa IID 1008 (ATCC 27584) as D-rhamnan // Eur. J. Biochem. 1987. - 167. - P. 203-209.

393. Yonekura K., Maki S., Morgan D.G., DeRosier D.J., Vonderviszt F., Imada K., Namba K. The bacterial flagellar cap as the rotary promoter of flagellin self-assembly // Science. 2000. - 290. - P. 2148-2152.

394. Zaady E., Perevolotsky A., Okon Y. Promotion of plant growth by inoculum with aggrigated and single cell suspentions of Azospirillum brasilense Cd // Soil. Biol. Biochem. 1993. - 25. - P. 819-823.

395. Zhulin I.B., Armitage J.P. The role of taxis in the ecology of Azospirillum //Symbiosis.-1992.-13.-P. 199-206.

396. Zhulin I.B., Armitage J.P. Motility, chemokinesis and methylation-independent chemotaxis in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. — 1993. — 175.-P. 952-958.

Информация о работе

Матора, Лариса Юрьевна
доктора биологических наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы