Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участки N-концевого домена фактора терминации трансляции эукариот eRF1, ответственные за узнавание стоп-сигналов в мРНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Участки N-концевого домена фактора терминации трансляции эукариот eRF1, ответственные за узнавание стоп-сигналов в мРНК"

На правах рукописи

КОЛОСОВ Петр Михайлович

УЧАСТКИ М-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА ФАКТОРА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ ЭУКАРИОТ еМЧ, ОТВЕТСТВЕННЫЕ ЗА УЗНАВАНИЕ СТОП-СИГНАЛОВ В мРНК

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики (зав. академик РАН, доктор биологических наук, профессор Л. Л. Киселев) Учреждения Российской Академии Наук Института молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: Л. Ю. Фролова

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, О.Л. Поляновский профессор

кандидат биологических наук С.Е. Дмитриев

Ведущая организация: Институт теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится «6» ноября 2008 года в 11°° час на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан 6 октября 2008 г.

Актуальность работы

Заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи - терминация трансляции - происходит в тот момент, когда в A-участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов транслируемой мРНК - UAA, UAG или UGA. Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции. Факторы 1-го класса принимают участие в узнавании стоп-кодона мРНК и в гидролизе пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосом. Факторы 2-го класса связываются с факторами 1-го класса в рибосоме и гидролизуют ГТФ. Известна трехмерная структура фактора терминации 1-го класса eRFl человека и методом ЯМР определена трехмерная структура его М домена в растворе. Известно, что фактор терминации eRFl состоит из трех доменов. N-концевой домен ответствен за узнавание стоп-кодонов, М-домен вовлечен в процесс гидролиза пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, а С-концевой домен взаимодействует с фактором терминации 2-го класса, eRF3. Функции факторов обоих классов нуждаются в дальнейшем изучении, так как до сих пор не выявлены с достаточной степенью достоверности участки, вовлеченные в непосредственное узнавание стоп-сигналов мРНК, тригтерная функция катализа пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы не изучена и остается невыясненной до настоящего времени, недостаточно исследовано собственно взаимодействие между факторами этих 2-х классов. В настоящее время созданы предпосылки для таких исследований. Во-первых, в качестве основного инструмента исследования стали использовать точечный мутагенез eRFl с последующим функциональным тестированием в системах in vivo и in vitro, во-вторых, созданы базы данных для множества организмов с частично или полностью секвенированным геномом, в-третьих, обнаружено уже достаточно большое число организмов с так называемым вариантным генетическим кодом, использующих в качестве значащих кодонов один или два «стоп»-кодона из трех существующих. Факторы терминации трансляции этих организмов, несмотря на высокую степень гомологии с остальным большинством омнипотентных факторов, проявляют би-/унипотентность при узнавании стоп-сигналов в мРНК, что открывает для исследователей новую возможность для создания и изучения гибридных (химерных) форм факторов терминации трансляции.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в выяснении функциональной роли аминокислотных остатков, находящихся в высококонсервативных участках молекулы еКР1. в особенности, поиск участков молекулы eR.Fl, вовлеченных в декодирование стоп-кодонов. Сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1) методом направленного мутагенеза получить точечные замены аминокислот в Ы-концевом домене еМЧ человека;

2) выделить и очистить мутантные формы е№1 человека, охарактеризовать их функциональную активность;

3) получить гибридную конструкцию, где М-концевой домен е№1 человека замещен И-концевым доменом еКР1 инфузории 8(у1опусЫа туНШ; охарактеризовать функциональную активность гибридного фактора;

4) получить набор гибридных конструкций, где участки И-концевого домена еКР1 человека замещены аналогичными участками И-концевого домена еКР1 инфузории Б]у1опусЫа туШ$\ охарактеризовать их функциональную активность;

5) получить мутантные eR.Fl с заменами избранных аминокислотных остатков на метионин в различных положениях И-концевого домена с целью идентификации сшивок еКРКмРНК в рибосоме;

6) получить генноинженерные конструкции фрагментов гена ег/1 человека, кодирующие индивидуальные домены еШП; охарактеризовать их взаимодействие, участие в образовании комплексов еЯД-еКРЗ, их влияние на способность активировать ГТФазную активность еИРЗ в рибосоме.

Научная новизна и практическая ценность работы

Методом сайт-направленного мутагенеза получен широкий спектр точечных мутаций К-концевого домена еЮТ. Установлено, что консервативный Туг125 образует водородную связь с 01и55. Высказано предположение, что водородная связь фиксирует ориентацию Туг125 в молекуле еЫ!, что важно для узнавания третьего положения в стол-кодоне. Доказано, что рекомбинирование доменов между гомологичными факторами терминации приводит к изменению специфичности узнавания стоп-кодонов, присущей каждому из этих факторов. Выявлен дипептид ТБ/СН7 в И-концевом домене ейН человека (положения 122123), замена которого на дипепгид (^Р, находящийся в аналогичном положении в

N-концевом домене Stylonychia mytilis, приводит к потере омнипотентности и узнаванию только стоп-кодона UGA. Показано, что гуанин в стоп-кодоне UGA образует сшивку с участком 121-124 eRFl, а гуанин стоп-кодона UAG образует сшивку после 131-ого аминокислотного остатка eRFl. Установлено, что минвдомен YxCxxxF, вовлеченный в узнавание стоп-кодонов, является более протяженным, чем считали ранее и ограничен положениями 121-132.

Результаты представленной работы открывают перспективы для создания теоретической и экспериментальной базы данных с целью изучения РНК-белковых взаимодействий в общем и работы трансляционного аппарата клетки, в частности. Результаты данной работы могут помочь при разработке супрессорных методов лечения онкозаболеваний. Кроме того, введение неканонических аминокислот в состав белков с использованием стоп-кодонов в качестве смысловых может значительно расширить функциональное разнообразие белков. Результаты работы демонстрируют возможность исследования молекулярной машинерии клетки in vitro и in vivo путем создания широкого спектра мутантных форм белков и гибридных конструкций с помощью относительно простых генно-инженерных манипуляций.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на следующих международных конференциях: Engeighardt Conference on Molecular Biology (Suzdal, 2004); Protein Synthesis and Translational Control (Heidelberg, 2005, 2007); tRNA workshop (Bangalore, 2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 118 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (146 наименований). Диссертация содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

Э КС П ЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ Ь

Клонирование и экспрессия мутантных форм и индивидуальных доменов eRFl человека

Для продукции белка eRFl, его индивидуальных доменов и сдвоенного МС-домена в клетках Е. coli созданы генно-инженерные конструкции на основе вектора pET23b(+) (Novagen). Участок гена erfl инфузории St. mytilis (N-домен с 1-ого по 147-ой а.о.) амплифицировали, используя в качестве матрицы геномную ДНК. Индивидуальные домены eRFl человека клонировали, выбрав участки ДНК, кодирующие eRFl (Рис. 1А) с 1-ой по 142-ую аминокислоту; со 140-ой по 275-ую аминокислоту; с 275-ой по 437-ую аминокислоту. В клонированном индивидуальном М-домене Leul40, а в индивидуальном С-концевом домене Leu275 заменили на метионин. "Двойной" NM-домен eRFl состоит из полипептида с 1-ого по 275-ый остаток, а "двойной" MC-домен - со 140-ого по 437-ый остаток. Структура олигодезоксирибонуклеотидов, использованных для амплификации фрагментов гена erfl, кодирующих отдельные и "двойные" домены eRFl, приведена в разделе «Материалы и методы» диссертации.

Рис.]. (А) Трехмерная структура eRFl человека по данным рентгеноструктурного анализа [Song et al., 2000]. Показаны участки полипептидной цепи, по которым проведено разделение индивидуальных и "двойных" доменов. (Б) Проверка чистоты выделенных препаратов eRFl гель-элекгрофорезом в денатурирующих условиях. Электрофоретический анализ белков в 20% ПААГ + 0.1% ДДС-Na. На каждую дорожку нанесено -5 мкг соответствующего белка (перегрузка дана для выявления дополнительных полос). 1 - полноразмерный eRFl, -50 кДа; 2 - МС-"двойной" домен, -34.5 кДа; 3 - С-домен, -20 кДа; 4 - М-домен, -16 кДа; 5 - N-домен, -17 кДа; 6 -маркеры молекулярных масс белков.

Для экспрессии гена eRF\ человека и его производных использовали штамм Е. coli BL21(DE3). Рекомбинатный белок выделяли на смоле Ni-NTA Superflow (Qiagen). Результат очистки представлен на рис.1 Б.

Сайт-направленный мутагенез и определение функциональной активности in vitro мутантных форм eRFl

Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью ПЦР с использованием "мегапраймера". Сначала с помощью ПЦР получали фрагмент ДНК, несущий требуемую замену, в присутствии соответствующего «мутагенного» праймера и одного из праймеров, комплементраных 5'- или 3'- концу гена. Полученный фрагмент использовали в следующем раунде ПЦР в качестве "мегапраймера" в паре с одним из праймеров, комплементарным к 3'- или 5'- концу гена. Плазмидами с нужной мутацией трансформировали штамм Е. coli BL21(DE3) для выделения мутантного белка.

RF-активность полученных мутантных форм eRFl определяли in vitro по способности eRFl, связанного в A-участке рибосомы в присутствии тетрарибонуклеотидов, содержащих один из трех стоп-кодонов, индуцировать гидролиз формилметионил-тРНК, находящейся в Р-участке рибосомы в присутствии кодона инициации AUG (функциональный анализ выполнен Л.Ю. Фроловой). Способность индивидуальных доменов eRFl индуцировать ГТФ-азную активность eRF3 в рибосоме исследовала В.И. Дубовая.

Система для сшивок мРНК аналогов с 80S рибосомой и eRFl разработана в лаборатории Г.Г. Карповой (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Аналоги мРНК содержат кодон UUC (Phe), за которым следует стоп-сигнал, который содержит перфлюорофенилазидную группу либо на С5 атоме уридина, либо на N7 гуанозина, либо на 3'-концевом фосфате.

Для картирования участков eRFl, сшивающихся с мРНК аналогами, используют подход, основанный на специфичном CNBr-индуцированном разрезании по остаткам метионина полипептидной цепи eRFl, с последующим анализом размеров полученных олигопептидов, несущих 32Р-меченые мРНК аналоги в сшивках. В этой работе мы исследовали участки сшивок N-домена с мРНК аналогами, используя мутантные формы eRFl с точечными заменами

вариабельных аминокислотных остатков на Met. Полученные рекомбинантные белки осаждали насыщенным раствором сульфата аммония (до конечной концентрации 50%) и передавали в лабораторию структуры и функции рибосом (ИХБФМ СО РАН), где получали комплексы рибосом с мРНК и eRFl, фотоиндуцированные сшивки и идентифицировали положения сшивок на молекуле eRFl.

Рис. 2. мРНК аналоги, использованные в данной работе; расстояние между модифицированным основанием и первым атомом азота азидогруппы примерно равна или меньше 11 А для и* и около 14 А для в*,

Олигорибонуклеотвды синтезированы М.Н. Репковой и А.Г. Веньяминовой, модификацию мРНК и сшивки с eRFl в рибосоме проводил КН. Булыгин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Положения 51 и 55 в eRFl человека

Положение 51 занято остатком вариабельного метионина. Показано, что in vivo замены в этом положении влияют на узнавание стоп-кодона UAG. Анализ кристаллической структуры (рис. 3) обнаружил близкое расположение в пространстве трех аминокислотных остатков - Met51, Glu55 и Туг125. Но, как оказалось, активность мутантных форм eRFl М51А, M51L, M51Y, M51D, M51R и М51Е существенно не меняется по сравнению с диким типом (данные не показаны). Поскольку химическая природа замененных аминокислот существенно разная, можно предполагать, что функция eRFl не зависит от строения аминокислотного остатка в позиции 51.

Эти данные не совпадают с результатами опытов по замене инвариантного положения 55, в котором у eRFl человека находится остаток глютаминовой кислоты Glu (Табл. 1). Это может указывать на существенную структурную и/или функциональную роль данного Glu55 в суперсемействе eRFl.

I pUUCU'AAA wAf"NI<~CM

U*= jJ

■m

,««.11 pUUC UG'AAAA

imilll pUUCUAG'AAA о сц-сн^-^^-а

«IV pUUCUAAG'AA G*=

UN

* oF_F

Таблица 1. RF-активность мутантных форм eRFl человека in vitro. RF-активность мутантных форм представлена в % от RF-акгивности eRFl дикого типа.

Мутантные eRFl Стоп-сигналы

UAAA UAGA UGAA

Е55А 59 0 48

E55D 72 21 78

E55Q 73 35 80

E55R 98 97 104

E55Y 11 2 56

E55S 27 1 36

Y125A 5 6 8

Y125E 12 14 19

Y125F 100 34 100

Y125S 17 2 54

Показано, что мутация Е55А имеет драматический эффект на RF-активность в присутствии стоп-кодона UAG, она падает практически до нуля, в то время как узнавание двух других стоп-кодонов снижено всего в 2 раза (табл. 1).

Такой избирательный эффект в отношении UAG показан с различными мутациями в положении 55 в повторных экспериментах. UAG-избирательная инактивация происходит не потому, что фактор не способен связываться с рибосомой, так как eRFl узнает два других стоп-кодона. Положения 124,125 и 126

В минидомене YxCxxxF присутствуют три инвариантных аминокислотных остатка. Замены cC127noF131 сильно влияют на узнавание одного или двух стоп-кодонов UAA/UAG, но заметно слабее на UGA-узнавание (результаты, опубликованные ранее в нашей лаборатории). Возможно, эти аминокислотные остатки вовлечены в узнавание 2-го нуклеотида стоп-кодона. В данной работе мы провели замены в трех других положениях этого минидомена: 124, 125 и 126, занятых соответственно Leu, Туг и Leu. Туг125 инвариантен, как следует из множественного выравнивания, тогда как аминокислотные остатки в положениях 124 и 126 варьируют.

Окружение 125 положения варьирует у разных организмов, и, как было показано мутационными заменами Leu (L126E, L126F и L126I), положение 126 не оказывает влияния на функцию узнавания (данные не показаны). Leul24 был заменен всего на две аминокислоты - Lys и Glu. Фактор eRFl при этом узнавал все три стоп-кодона (данные не приведены).

Функциональная активность мутантных eRFl по положению 125 приведена в таблице 1. Из этого ряда выделяется мутация Y125А, которая приводит к потере узнавания всех трех стоп-кодонов. Замена Туг125 на Glu также приводит к потере активности фактора. Интересный результат дала «мягкая» мутация Tyr-^Phe. Здесь падение функциональной активности оказалось избирательным: узнавание стоп-кодонов UGA и UAA остается на уровне eRFl дикого типа, тогда как в случае UAG оно уменьшено в три раза. Очевидно, что такая выборочная инактивация происходит не за счет потери связывания с рибосомой, так как узнавание двух других стоп-кодонов не затронуто. Это подтверждается экспериментами по определению ГТФазной активности, которая полностью зависит от связывания eRFl и eRF3 в рибосоме; она остается такой же, как и в случае eRFl дикого типа. С другой стороны, замена ароматической аминокислоты на алифатическую приводит к двухкратному падению ГТФ-азной активности. Возможно, это свидетельствует в пользу слабого связывания мутанта Y125A с рибосомой.

Таким образом, инвариантный Туг125 играет двойную роль. Его присутствие существенно для связывания eRFl с рибосомой, и в то же время он, возможно, вовлечен в узнавание стоп-кодона UAG.

Водородная связь меаду остатками Glu55 и Туг125 Исходя из анализа трехмерной структуры eRFl человека (рис. ЗА), положения 55 и 125 сближены в пространстве и способны образовывать водородную связь между атомом водорода ОН-группы Туг125 и атомом кислорода СОО'-группы Glu55. Длина связи равна 1.73 Â (рис. ЗБ). Важность возникновения водородной связи между этими остатками для декодирования подтверждается данными функциональной активности мутантных eRFl. Когда в мутанте Е55А отсутствует акцепторная группа, RF-активность полностью теряется в отношении стоп-кодона UAG (табл. 1). При замене на аспарагиновую кислоту (Asp), имеющую более короткую боковую группу, происходит увеличение расстояния между

донорной и акцепторной группами, образующими Н-связь. В этом случае наблюдали 5-кратное падение ИР-активности при узнавании иЛв.

с

Рис. 3. Структура N-домена eRFl человека (Song et al., 2000). (А) модель с элементами вторичной структуры; показаны боковые группы существенных остатков Glu55 и Туг125. (Б) и (С) Увеличенный фрагмент третичной структуры eRFl человека в районе YxCxxxF. (Б) Взаимодействие Е55 и Y125 в диком типе eRFl человека. (С) Взаимодействие R55 и Y125 в мутантном eRFl человека. Водородная связь показана в виде черной линии.

Интересно, что мутант E55Q (глутамин), который близок по структуре глутамату, также имеет уменьшенную в 3 раза RF-активность. Вероятно, это происходит из-за того, что акцепторная СОО"-группа превращается в потенциальную донорную COONH2-rpynny.

Наше предположение, что Glu55 и Туг125 образуют Н-связь, согласуется с другими наблюдениями. Мутантные по Tyrl25 eRFl имеют уменьшенную RF-активность, если донорная группа аминокислотного остатка отсутствует (Табл. 1). Неожиданный результат получен при замене E55R. Этот мутант остается полностью активным в отношении всех трех стоп-кодонов (Табл. 1). Чтобы объяснить этот факт, мы виртуально поместили в трехмерной структуре eRFl остаток аргинина вместо глютамата (рис. ЗВ). Оказалось, что образование Н-связи в данном случае также возможно. Вместо акцептора Н-связи аргинин становится

донором, а кислород ОН-группы Туг125 становится акцептором. Расстояние между атомом водорода NH-группы (Arg55) и атомом кислорода Туг125 составляет 1.82 Â (рис. ЗВ), то есть находится в пределах длины Н-связи. Такая ситуация возможна, учитывая, что сильная NH-rpynna аргинина способна образовать связь даже со слабой акцепторной группой тирозина.

Поскольку инвариантные Glu55 и Туг125, возможно, участвуют в поддержании пространственной структуры eRFl, были поставлены опыты по связыванию eRFl с рибосомой в присутствии eRF3 и ГТФ. Для исследуемых мутантных eRFl связывание с рибосомой в общем не отличалось от связывания eRFl дикого типа. Таким образом, функционально важные остатки в положениях 55 и 125, скорее всего, не вовлечены в поддержание пространственной структуры N-концевого домена, либо их участие несущественно.

Следовательно, мутации по положениям 55 и 125 ответственны за исчезновение ответа преимущественно на стоп-кодоне UAG, потому что непосредственно входят в декодирующий центр. Так как UAG отличается от двух других стоп-кодонов только гуанином в 3-ем положении, значит пара E55-Y125 вовлечена в узнавание гуанина в третьем положении в стоп-кодоне UAG. Но замена Glu на Arg не приводит к потере узнавания UAG. Мы предположили, что в паре E55-Y125 центральную роль играет тирозин, а глютамат необходим лишь для образования водородной связи и фиксации тирозина в правильном положении.

Таким образом, параллельная потеря активности eRFl, мутантных по положениям 55 и 125 свидетельствует о том, что образование Н-связи необходимо для узнавания UAG.

Создание гибридной конструкции eRFl, где N-концевой домен eRFl человека заменен на N-концевой домен инфузории Stylonychia mytüis

Вопрос об узнавании стоп-кодонов можно исследовать, используя другой подход. Среди некоторых одноклеточных эукариот (например, инфузории) есть виды с так называемым вариантным генетическим кодом. Например, род Euplotes sp. использует для кодирования аминокислоты Cys кодон UGA, при этом UAA и UAG остаются стоп-кодонами. Другим примером применения стоп-кодонов в качестве значащих служит вид Stylonychia mytüis, использующий для терминации

трансляции только один стоп-кодон UGA. Стоп-кодоны UAA и UAG у этого вида кодируют Gin. Таким образом, можно использовать факторы терминации этих организмов для опытов по локализации декодирующего центра eRFl.

N домен Stm МС домен Hs

Б

eRFl Стоп-сигналы

UAAA UAGA UGAA

eRFl(w.t.) 100 100 100

eRFl(ra6p.) 11 2 100

Рис. 4. (А) Схематичное изображение гибридной конструкции eRFl, где N-концевой домен принадлежит Stylonychia mytilis (Stm 1-145 а.о.), а МС-домен - eRFl человека (Hs 145-437 а.о.). Стрелками показаны стоп-кодоны UAA/UAG, кодирующие у Stylonychia mytilis Gin. (Б) RF-активносгь in vitro гибридного eRFl (в % RF-акгавности eRFlwt).

Вопрос функционирования данного гибридного фактора eRFl, составные части которого принадлежат разным организмам, являлся открытым. В нашем случае предстояло показать, может ли eRFl человека, у которого N-домен заменен N-доменом eRFl инфузории, сохранять функциональную активность. При этом функция eRFl - не только декодирование стоп-кодонов, но и передача сигнала о необходимости гидролиза пептидил-тРНК. Так как в гене erfl St. mytilis присутствует один интрон, то амплификацию двух экзонов проводили независимо, после чего экзоны последовательно клонировали в векторе рЕТ23Ь. В N-домене S.mytilis, находится пять «стоп»-кодонов, кодирующих у St. mytilis глутамин (рис. 4 А). Последовательным мутагенезом они были превращены в значащие стандартные кодоны для Gin (положения Q9. Q64. Q83. Q95 и Q127). Гибридный eRFl после выделения был проверен в системе in vitro (Рис. 4 Б). Показано, что такой белок полностью сохраняет свою функциональную активность, более того он стал

обладать специфичностью е!Ш Й. туШ'к. Следовательно, сконструированный гибридный белок еКР1 с ивА-специфичностью при точечном и/или делеционном мутагенезе может помочь в идентификации участков дискриминации стоп-кодонов в eR.Fl (рис. 5).

1 а

Н.sapience S.mytilus (1) (1) Vgl? г mm si gsgj, 3 - ЕВ : s Б • ¡Ш «gigs - ¡a ж ж ШШ-И us г

р Е tetraurelia aediculatus ¡1) (11 i ■К' «ssst § I : fugs ¡Egm®! ьшшш im 481 TQMES ФШ 1 Dr&ll s IAS

.termophila (1) ЦКЕ s г Ж Si ш! В m DBS

H.sapience (72) LC*S «Щ? № JSs К KVgE Д1Я? V ffiTI РИН'ЩРЩ Si fife в AgT додек

Р s.mytilus tetraurelia (76) (72) SlLggR fflSf aainii i I lisj 1 ■S : if 6 E|p TSjADgDK IBIniEPP

Е aediculatus Г.termophila (68) (71) ongpg iKEflf Ж Я m Jjjg : JgT£T? T: Ш Ш-lsi Ж-Gif a-1 sж fS(M ■e IFK® E i 1Ш«« he Egc £ВЯ;кВр-SglETgPP

Рис. 5. Множественное выравнивание первичных структур участков М-концевого доменаeR.Fl человекам некоторых инфузорий. Черным фоном обозначены инвариантные аминокислоты, серым - полуконсервативные. Представлены омнипотентный еЯР1 (человек), бипотентньш еШЧ (Е. аес11си1агиз) и унипотентные еЮ^ (остальные, представленные здесь виды инфузорий).

Создание гнбридных конструкций cRFl, где участки ^'-концевого домена еИИ человека заменены участками Гч'-концевого домена еЯР1 $1у1опус1па туйНи

Цель создания гибридных еКР1, в которых участки 1М-коцевого домена eRFl человека заменяли участками М-концевого домена еИЕ! 5(у1опус/па туМЬ, заключалась в определении минимальной природной последовательности аминокислотных остатков еКР1 Б.туИИя, которые ответственны за переключение омнипотентной специфичности на унипотентную (узнавание только стоп-кодона ЬЮА). Каждый раунд минимизации состоял в условном делении полипептидной цепи пополам с последующим анализом RF-aктивнocти полученных гибридных форм eR.Fl. Общая схема полученных конструкций и их функциональный анализ представлены на рис. 6.

Показано, что замена области 83-145 (здесь и далее указана нумерация аминокислотных остатков по еИП человека) в еКР1 человека на аналогичную область из еКР1 5. туг'/« приводила к смене специфичности, то есть фактор «узнавал» только стоп-кодон 1ЮА (рис. 6, №1). Далее, беря за основу эту конструкцию, определили следующую границу внутри этой последовательности, заменив область 122-145 в eRFl человека на аналогичную область из eRFl З.туНИъ. Оказалось, что фактор с такой заменой узнает только стоп-кодон ХЮА

(рис. 6, №4). По гибридный eRF 1, где заменили область 1-124 (зона перекрытия между двумя конструкциями 122Q-123F по S.mytilis) также обладал специфичностью только к стоп-кодону UGA (рис. 6, Лг»3). Мы обнаружили, что дипептид 122Q-123F оказался ключевым в переключении специфичности. Так две конструкции, где зоной перекрытия сделали дипептид 122T-123S по человеку, при определении RF-активности оказались омнипотентными, но малоактивными, особенно №5 (рис. 6, №. 5 и № 6).

Область 122-145 (замена на а.о. последовательность eRFl S.mytilis), была также поделена на две части. Показано, что замена области 122-132 в eRFl человека на аналогичную из инфузории приводит к узнаванию фактором только стоп-кодона UGA (рис. 6, №7). Замена области 133-145 оставляет фактор омнипотентным (рис. 6, №8).

А Б

Мугантны е eRFl Стоп-сигналы

ÜAAA UAGA UGA А

№1 25 25 100

№2 55 40 65

№3 5 10 60

№4 10 10 100

№5 Малоакт. Малоакт. Малоакт.

№6 Малоакт. Малоакт. Малоакт.

№7 0 0 90

№8 90 60 90

№9 80 80 90

№10 55 25 80

Рис. 6. (А) Схематичное изображение гибридных конструкций еЯР 1. Показан Ы-концевой домен eRFl (черным цветом выделены участки, принадлежащие З.туИН^). Все конструкции содержат МС-домен человека (146-437). Нумерация аминокислогных остатков соответствует аминокислотной последовательности еЯР1 человека (Б) РР-активность гибридных факторов еИР1 стилонихия/человек (в %). ТБ и (ЗР -аминокислотные дипептиды еИР1 человека и eRFl 8.туЫШ соответственно (положения 122-123).

В дальнейшем, к конструкции № 8 добавили двойную мутацию T122Q-S123F, но фактор остался омнипотентным. Фактор, где была сделана только двойная мутация T122Q-S123F (рис. 6, № 10), перестал узнавать преимущественно стоп-кодон UAG.

Таким образом, нами был вычленен дипептид T122Q/S123F, имеющий функциональную значимость в переключении омнипотентной специфичности фактора eRFl человека на унипотентную. Сама по себе замена этого дипептида не вызывает драматического изменения в специфичности. По-видимому, для переключения необходим дополнительный модуль аминокислотных остатков, который скорее всего находится в положениях 124-132.

Сшивки «метиониновых» мутантов eRFl человека со стоп-кодонами в рибосоме

В eRFl дикого типа находится восемь внутренних метионинов. Таким образом, в условиях полного гидролиза этого полипептида с помощью CNBr должны образоваться девять фрагментов. Ранее показано, что все мРНК аналоги (рис. 2) сшиваются с фрагментом 52-195 eRFl дикого типа. Для мРНК I получен только один меченый фрагмент после разрезания сшитого eRFl. Все остальные мРНК также сшиваются с другим участком, который более всего соответствует фрагменту 373-422 в С-концевом домене. Мутантные eRFl, несущие одиночные аминокислотые замены на метионин в области 60-73, использовали для уточнения позиций сшивок внутри фрагмента 52-195. Сшивка с мРНК II для мутантного eRFl G73M приводит к образованию продукта, связанного с С-концевой частью фрагмента 74-195. Опыты по сшивке с мРНК III и IV дали такие же результаты, как в случае мРНК И (ранее полученные результаты).

В данной работе район сшивки внутри фрагмента 74-195 eRFl для мРНК II-IV сузили с помощью серии мутантных eRFl, где Met51 заменен на Ala. При использовании двойных мутантных eRFl, имеющих в области 124-132 замену на метионин, было показано, что участок сшивки находится в N-концевой части от точки мутации 124 или 132 и локализован во фрагменте 35-124 (рис. 7Б). Таким образом, сшивка локализована во фрагменте 74-124 eRFl для мРНК II.

В случае с мРНК III не наблюдали ожидаемых полос после полного расщепления CNBr мутантных eRFl в области 35-195 (рис. 7А). Скорее всего, полосы, соответствующие полному CNBr-расщеплснию этого района, маскируются фрагментом 373-422 (рис. 7, полоса Б). Значит участок кросс-сшивки находится в С-концевой части от точки мутации и расположен в районе, ограниченном позициями 131-195. Сшивка мРНК III с мутантным eRFl Н132М+М51А оказалась устойчивой к CNBr расщеплению в положении 132.

да M Mw. «•■ /Ж

ft Ш

14.2-* щ Штт ШЫбШт ~ ЩЩЩшт

6.5-* 3.5-*

В

35 niUlt M3C132 195

У

17.0-» 14.2-*

Рис. 7. Картирование участков кросс-сшивок внутри фрагментов 74-195 и 74-124 с использованием двойных мутантных eRFl человека. (Авторадиограмма ДДС-ПААГ). Электрофоретический анализ фрагментов после CNBr-расщепления, полученных с мутантными eRFl L124M+M51A, L126M+M51A, К130М+М51А и Н132М+М51А, сшитыми с мРНК аналогами (А), а также K.109M+M195L и I120M+M195L, сшитых с мРНК 11 (Б). Маркеры молекулярных масс приведены на рисунке 7А слева, на рисунке 7Б - справа. Полоса «А» соответствует фрагменту 52-195, полоса «Б» соответствует фрагменту 373-422. Полоса, появляющаяся между полосами «А» и «Б» на рис. 7А, является продуктом неполного CNBr-расщепления кросс-сшитого eRFl (так же как и полоса «В»). (В) и (Г) - схематические представления расщепления фрагментов 35-195 и 52-241, соответственно. Приведены расчетные молекулярные массы (Юа) этих продуктов расщепления.

Возможно, сшивка находится в положении Metl32. В eRFl дикого типа в позиции 132 находится His, но сшивка, по всей вероятности, происходит в позиции 131, занятой фенилаланином, поскольку есть данные, что гистидин не способен

образовывать сшивку с перфлюорофенилазидами, тогда как фенилаланин служит хорошей мишенью.

Результаты, полученные с мРНК IV, указывают на два места сшивки, эквивалентные сшивкам для мРНК II и III соответственно. Одно из них, скорее всего в позиции РЬе 131 (фрагмент 131-195, по аналогии с мРНК П1). Что касается другого места сшивки (фрагмент 35-124, по аналогии с мРНК II), было показано, что участок сшивки для мутанта Ы26М+М51А находится внутри фрагмента 35-125 (сшивка в положении 126 маловероятна, так как в этом случае еКЛ должен был бы оказаться устойчивым к СЫВг-расшеплению в этой позиции). Следовательно, амнокислотный остаток, который мог бы образовать сшивку, это Туг125. Однако тирозин не способен сшиваться с перфлюорофенилазидами и, поэтому, наиболее вероятной мишенью для сшивки оказывается Ьеи124. Сшивка, точнее ее отсутствие, с мутантным еЫЧ Ы24М+М51А (в отличие от Ы26М+М51А и 1Л30М+М51А) возможно означает, что мРНК III сшивается с МеИ24 и делает полипептид устойчивым к расщеплению после метионина в этой позиции.

Таблица 2. Участки сшивок мРНК аналогов с е№1 человека (распределение сшивок между N и С доменами еЫЧ)

* Указаны положения модифицированных нуклеотидов в мРНК аналогах относительно первого нуклеотида стоп-кодона в А-участке. Модифицированные нуклеотиды мРНК аналогов указаны в скобках

6 Вероятные участки сшивок еМЧ указаны в скобках. " Относительная ошибка составляет около 10%.

мРНК аналоги (Рис. 2) Положение модифицированного нукпеотидаа Положения кросс-сддагых фрагментов в И-домене еыа6 Распределение сшивок между фрагментами в Ы-и С-доменах сЯР11!

"а" 52-195 "б" 373-422

I + 1(Ц) 65-73 (66) 100 0

II +2 (С) . 121-124 (данная работа) 32 68

III +3(0) 131-195 (данная работа) 34 66

IV +4(0) 131-195 и 121-124) (данная работа) 35 65

Участок сшивки внутри фрагмента 74-124 сужен для мРНК II с использованием другой серии двойных мутантов, содержащих общую точечную замену M195L. Точечные замены на метионин сделаны в позициях 109 и 120 (К109М и I120M) (рис. 7Б). Было показано, что участок сшивки локализован внутри фрагмента 120-241, и при совмещении с фрагментом 74-124 был вычленен тетрапептид 121-124. Следовательно, участок сшивки локализован внутри этого тетрапептида. Данные по сшивкам суммированы в таблице 2.

Пурины стоп-кодонов в А-участке рибосомы соседствуют с более протяженной областью N-концевого домена eRFl, чем YxCxxxF

Фотореактивная груша, использованная в работе, обладает широким радиусом реактивности (примерно 11-14 А). Областью контакта для этого реагента является додекапептид NTSLPLCDNKFH (позиции 121-132). Этот фрагмент, названный YxCxxxF петлей, оказывается рядом со вторым, третьим и четвертым (нуклеотид, расположенный с З'-конца стоп-кодона) основаниями стоп-кодона. Последний влияет на узнавание стоп-кодона и часто рассматривается как часть стоп сигнала. Ранее показано, что фотоактивируемая группа на фосфате в позиции +4 атакует другой участок в N-домене eRFl по сравнению с этой же группой на гуанине в том же положении. Таким образом, эти данные указывают на то, что фосфат в позиции +4 расположен рядом с петлей NIKS, как и первый U в положении +1 (Булыгин К., и соавт., 2007).

Сшивок между петлей NIKS и вторым, третьим и четвертым нуклеотидами стоп-ситала не обнаружено, что исключает возможность узнавания всего стоп-кодона петлей TASNIKS, как предполагали ранее. В данной работе локализовали участки сшивок для двух пуринов в стоп-кодонах UG*A и UAG*, а также для G* в 4-ом положении стоп-кодона. Для стоп-кодона UGA показана сшивка с тетрапептидом NTSL (положения I2I-I24). Сравнение данных RF-активности гибридных eRFl с опытами по сшивкам показывает, что дипептид T122Q/S123F является ключевым элементом в узнавании 2-го пурина в стоп-кодоне. Стоп-кодон UGA отличается от стоп-кодонов UAA и UAG гуанином во 2-ом положении. Возможно, двойная замена T122Q/S123F приводит к тому, что мутантный фактор eRFl перестает узнавать аденин во 2-ом положении. Сшивка eRFl со стоп-кодоном UAG* происходит после 130-ого аминокислотного остатка (видимо в положении

131, таблица 2). Предположительно, в области 124-132 происходит дискриминация пурина в 3-ем положении стоп-кодона. Модифицированный гуанин в 4-ом положении стоп-кодона оказывается проксимален обеим областям: как мотиву 121124, так и мотиву 125-132, что, как предполагают некоторые исследователи, означает наличие изгиба между 3-им и 4-ым основанием стоп-кодона.

Поведение индивидуальных доменов eRFl в ГТФазиой реакции in vitro

Изучение каталитической активности eRF3 показало, что этот белок представляет собой eRFl - и рибосомо-зависимую ГТФазу. eRF3 связывает ГТФ без участия рибосом и eRFl, то есть содержит предобразованный участок связывания ГТФ, однако каталитическая активность проявляется только в четверном комплексе еКРЗ-еЯР1-ГТФ-рибосома. В данной работе исследовали влияние индивидуальных и двойных доменов eRFl человека на способность индуцировать ГТФазную активность фактора терминации трансляции 2-го класса eRF3.

На рис.8 видно, что при подобранных концентрациях рибосом, ГТФ и факторов ГТФазная активность пропорциональна количеству добавленного eRFl. В отсутствие eRFl ГТФазная активность не обнаружена (не показано), что говорит о том, что в препарате рибосом нет примесей эндогенного eRFl, а отсутствие активности в пробах без eRF3 или рибосом, свидетельствует о том, что препараты белков не содержат примесей экзогенных ГТФаз (например, из E.coli). Эти данные полностью соответствуют ранее сделанным наблюдениям. В присутствии МС-домена eRFl ГТФазная активность eRF3 в расчете на 1 пикомоль белка снижается в ~ 4 раза по сравнению с активностью в присутствии полноразмерного eRFl (рис. 8).

Индивидуальные домены eRFl (N, М и С) и "двойной" NM-домен не индуцируют ГТФазную активность eRF3 в рибосоме (данные не приведены). Отсутствие индуцирующей ГТФазу активности у этих доменов позволило поставить опыты по конкуренции. В опытах по конкуренции N-домена и полноразмерного eRFl за способность индуцировать ГТФазную активность eRF3 показано, что N-домен слабо ингибирует eRFl-индуцируемую ГТФазную активность при низкой концентрации eRFl, и повышение концентрации eRFl

снимает ингибирующий эффект. Аналогичные опыты поставлены в отношении конкуренции между МС-доменом и N-доменом (см. диссертацию).

Двукратный и четырехкратный молярный избыток N-домена не вызывает ингибирования индуцирующей ГТФазу активности МС-домена. Поскольку NM-домен (т.е. eRFl без С-домена) полностью сохраняет RF-активность in vitro, это означает, что С-домен не вносит существенного вклада в связывание eRFl с рибосомой.

С другой стороны, МС-домен связывается с рибосомой достаточно эффективно (рис. 8), так как способность стимуляции ГТФазной активности eRF3, которая сохранилась у МС-домепа, возможна только в тройном комплексе eRF3-eRFl-рибосома. С-домен eRFl связывается с eRF3, но ГТФазную активность eRF3 не индуцирует. Таким образом, можно утверждать, что М-домен способен связываться самостоятельно с рибосомой, что мы и предполагали ранее на основании косвенных аргументов.

Поскольку С-домен eRFl связывается с eRF3 in vivo и in vitro, то он может попасть в рибосому с помощью eRF3. Однако, С-домен eRFl ГТФазную активность eRF3 не индуцирует. Поэтому мы предполагаем, что отсутствие этой способности связано не, с непопаданием С-домена в рибосому, а с тем, что для индукции ГТФазной ативности eRF3 нужны оба домена eRFl - М и С.

45 403530-

CLT 25 ПГ

S

— 204

15105 0

I eRF1 0.5

eRF1 1.0

....i eRF1 2.0

- * МС 0.5

МС 1.0

МС 2.0

Рис. 8. Индукция ГТФазной активности eRFЗ человека в присутствии рибосом, [32Р]-меченого ГТФ, полноразмерного еКР 1 или "двойного" МС домена (МС). Показано накопление [32Р]Р1. Количество добавленного eRFl и МС-домена еИП составляло 0.5-2.0 пмоль. Графики построены по данным трех независимых опытов

Какова функция МС-домена eRFl в отношении eRFB? Ранее высказано предположение, что eRFl, связанный с рибосомой, может быть либо фактором, обменивающим гуаниновые нуклеотиды (GEF), либо белком, активирующим ГТФазу (GAP). Оба эти варианта можно рассматривать и в отношении МС-домена eRFl. Возможно, что комплекс рибосома-МС-домен eRFl одновременно выполняет функции и GEF, и GAP.

выводы

1. Замена тирозинового остатка на фенилаланиновый в положении 125 N-концевого домена фактора терминации трансляции eRFl человека приводит к избирательному уменьшению RF-активности фактора в присутствии стоп-кодона UAG при сохранении полной активности в присутствии стоп-кодонов UAA и UGA (рибосомная тест-система in vitro). Замена Туг125 на другие аминокислотные остатки вызывает инактивацию eRFl по всем трем стоп-кодонам.

2. На основании данных рентгеноструктурного анализа (Song et al., 2000) высказано предположение, что Туг125 образует водородную связь с высококонсервативным Glu55. Гипотеза подтверждена опытами с заменами Glu55 на другие аминокислоты, которые приводят к полной или частичной утрате RF-активности мутантных форм eRFl, если замещение вызывает утрату способности образовывать Н-связь с Туг125. Мутант eRFl Glu55Arg сохраняет KF-активность, так как способен образовать Н-связь с Туг125.

3. Создана гибридная конструкция eRFl, где N-концевой домен eEFl человека (узнающий все три стоп-кодона) заменен на N-концевой домен eRFl инфузории Stylonychia mytilis (обладающий только UGA-специфичностью). Показано, что такой гибридный белок in vitro приобрел декодирующую специфичность eRFl St. mytilis.

4. Созданы гибридные конструкции eRFl, где различные участки N-кокцевого домена eRFl человека заменены на эквивалентные участки N-концевого домена eRFl Stylonychia mytilis. Показано, что дипептид T122Q/S123F функционально важен для переключения омнипотентной специфичности (узнавания всех трех стоп-кодонов) фактора eRFl человека на унипотентную (узнавание только одного стоп-кодона), характерную для eRFl Stylonychia sp.

5. Для картирования районов eRFl человека, соседствующих в А-участке рибосомы млекопитающих со стоп-кодоном, получен набор мутантов eRFl, где функционально несущественные аминокислотные остатки заменены на метионин. Полученные «метиониновые» мутанты в лаборатории Г.Г. Карповой (ИХБФМ СО РАН) использовали для локализации мест сшивок. Обнаружено, что гуанин стоп-кодона UGA сшивается с тетрапептидом 121-124 eRFl

человека, гуанин стоп-кодона 1)АО сшивается с фрагментом 131-195, а гуанин в положении +4 - как с тетрапептидом 121-124, так и с участком 131-195 белка е№1.

6. Экспериментально показано, что для индукции ГТФазной активности еКРЗ в рибосоме достаточно МС-домена ейЛ, то есть Ы-концевой домен, узнающий стоп-кодон, во взаимодействии с еИРЗ не участвует.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kolosov Р, Frolova L, Seit-Nebi A, Dubovaya V, Kononenko A, Oparina N, Justesen J, Efimov A, Kisselev L. Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. 2005. Nucleic Acids Res. 33; 64186425.

2. Дубовая В.И., Колосов П.М., Алкалаева E.3., Фролова Л.Ю., Киселев Л.Л. Влияние изолированных доменов фактора терминации трансляции eRFl на ГТФазную активность фактора терминации трансляции eRF3. 2006. Мол. Биология. 40; 310-316.

3. Lekomtsev S, Kolosov Р, Bidou L, Frolova L, Rousset Л", Kisselev L. Different modes of stop codon restriction by the Stylonychia and Paramecium eRFl translation termination factors. 2007. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 104; 1082410829.

Подписано в печать 03.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ №907 Тираж: ЮОэкз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 \vww.autoie ётш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колосов, Петр Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Терминация трансляции

1.1.1 Краткая схема трансляции. Участники 10 терминационного события.

1.1.2 Участие рРНК рибосомы в терминации трансляции.

1.1.3 Факторы терминации трансляции 1 -го класса. 14 1.1.4. Факторы терминации 2-го класса

1.1.5 Взаимодействие eRPl и eRF

1.1.6 Влияние контекста мРНК и пептидил-тРНК на терминацию трансляции.

1.2 Функциональная анатомия eRFl человека

1.2.1 М-домен eRFl человека. Минидомен GGO

1.2.2 N-домен eRF 1 человека. Минидомен NIKS (TASNIKS)

1.2.3 N-домен eRFl человека. Минидомен YxCxxxF

1.2.4 С-домен eRFl человека.

1.3 Гипотезы о декодировании стоп-кодонов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы

2.1.1 Штаммы бактерий и плазмиды

2.1.2 Среды

2.1.3 Реактивы

2.1.4 Ферменты

2.1.5 Олигонуклеотиды

2.2 Методы исследований

2.2.1 Выделение плазмидной ДНК из E.coli

2.2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК

2.2.4 Трансформация Е. coli плазмидной ДНК

2.2.5 Трансформация Е. coli плазмидной ДНК методом электропорации

2.2.6 Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе

2.2.7 Полнмеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.8 Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК при помощи автомата ческой системы

Applied Biosystems ABI

2.2.9 Сайт-направленный мутагенез с помощью праймеров, содержащих уникальный сайт рестрикции

2.2.10 Метод мегапраймерной ПЦР со сменой матрицы

2.2.11 Амплификация N-концевых частей гена eRFl Stylonychici mytilus

2.2.12 Конструирование генов гибридных eRFl

2.2.13 Экспрессия и выделение белков

2.2.14 Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ

2.2.15 Определение активности eRF

2.2.16 Определение ГТФазной активности eRF

2.2.17 мРНК аналоги

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение рекомбипантного белка eRFl в Е. coli

3.2 Получение eRFl с точечными заменами аминокислотных остатков в N-домене eRFl человека.

3.3 Водородная связь между остатками Е55 и Y

3.3.1. Замены аминокислот в области 51-56.

3.3.2. Замены аминокислот в положениях 124, 125 и

3.3.3. Водородная связь между остатками Glu55 и Tyrl

3.4 Создание гибридной конструкции eRFl, где N-концевой домен eRFl человека заменен на N-концевой домен eRFl инфузории Stylonychia mytilis

3.5 Создание гибридных конструкций eRFl, в которых участки N-концевого домена eRF 1 человека заменены участками N-концевого домена eRF 1 Stylonychia mytilis

3.6 Сшивки мутантов eRFl человека по метионину со стоп-кодонами в рибосоме

3.7 Пуриновые основания стоп-кодонов в А-участке рибосомы соседствуют с более протяженной областью N-концевого домена eRF 1, чем YxCxxxF

3.8 Поведение индивидуальных доменов eRFl in vitro в ГТФ-азном тесте

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участки N-концевого домена фактора терминации трансляции эукариот eRF1, ответственные за узнавание стоп-сигналов в мРНК"

Заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи - терминация трансляции - происходит в тот момент, когда в А-участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов транслируемой мРНК - UAA, UAG или UGA. Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции. Факторы 1-го класса принимают участие в узнавании стоп-кодона мРНК и в гидролизе пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосом. В универсальном коде стоп-кодоны UAA, UAG и UGA используются для терминации трансляции и узнаются факторами терминации 1-го класса, которые затем индуцируют гидролиз пептидил-тРНК в рибосоме. В прокариотах имеются два фактора терминации 1-го класса, RF1 и RF2, которые узнают стоп-кодоны UAG/UAA и UGA/UAA соответственно, а в эукариотах фактор eRFl узнает все три стоп-кодона (Kisselev et al., 2002 2003). Функционально RF сходны с тРНК, так как декодируют стоп-кодон в малой субъединице рибосомы и активируют пептидилтрасферазный центр в большой субъединице (Kisselev and Buckingham, 2000). Факторы 2-го класса связываются с факторами 1-го класса в рибосоме и гидролнзуют ГТФ. Факторы терминации 2-го класса, RF3 и eRF3, представляют собой рибосомо-зависимые ГТФ-азы, а эукариотический фактор eRF3 еще и eRFl-зависим (Frolova et al., 1996; Zavialov et al., 2001).

Методом рентгеноструктурного анализа определена трехмерная структура фактора терминации 1-го класса eRFl человека (Song L. et al., 2000) и методом ЯМР определена трехмерная структура его М-домена в растворе (Ivanova Е. et al., 2007). Согласно данным структурного анализа фактор терминации eRFl состоит из трех доменов. N-концевой домен ответствен за узнавание стоп-кодонов, М-домен вовлечен в процесс гидролиза пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, а С-концевой домен взаимодействует с фактором терминации 2-го класса, eRF3.

Функции эукарнотических факторов терминации обоих классов нуждаются в дальнейшем изучении. Так до сих пор не выявлены с достаточной степенью достоверности участки, вовлеченные в непосредственное узнавание стоп-сигналов мРНК, не изучен механизм гидролиза пептидил-тРНК в пептидплтрансферазном центре рибосомы, недостаточно исследовано взаимодействие между факторами этих 2-х классов. В настоящее время создан ряд предпосылок для таких исследований. Во-первых, для поиска функционально важных аминокислотных остатков стали широко использовать точечный мутагенез eRFl с последующим функциональным тестированием в системах in vivo и in vitro, во-вторых, созданы базы данных для множества организмов с частично или полностью секвенироваппым геномом, в-третьих, обнаружено уже достаточно большое число организмов с так называемым вариантным генетическим кодом, использующих в качестве значащих ко донов один или два «сгоп»-кодона из трех существующих. Факторы терминации трансляции организмов с вариантным генетическим кодом, несмотря на высокую степень гомологии с большинством омнипотентпых факторов, проявляют би-/унипотентность при узнавании стоп-сигналов в мРНК, что дает возможность исследовать декодирующую функцию путем создания гибридных (химерных) форм факторов терминации трансляции.

Основная цель работы состояла в выяснении функциональной роли аминокислотных остатков, находящихся в высококонсервативных участках молекулы eRFl, в особенности, поиск участков молекулы eRFl, вовлеченных в декодирование стоп-кодонов. Ранее, с использованием "химерного" подхода показано, что узнавание стоп-кодонов определяется N-доменом eRFl эуплоты (Chavatte et al., 2003b; Salas-Marco et al., 2006).

Сформулированы следующие конкретные задачи исследования: 1) методом направленного мутагенеза получить точечные замены аминокислот в N-концевом домене eRFl человека; 2) выделить и очистить мутантные формы eRFl человека, охарактеризовать их функциональную активность; 3) 7 получить гибридную конструкцию, где N-концевой домен eRFl человека замещен N-концевым доменом eRFl инфузории Stylonychia mytilis; охарактеризовать функциональную активность гибридного фактора; 4) получить набор гибридных конструкций, где участки N-концевого домена eRFl человека замещены аналогичными участками N-концевого домена eRFl инфузории Stylonychia mytilis; охарактеризовать функциональную активность гибридных факторов; 5) получить мутантные eRFl с заменами выбранных аминокислотных остатков на метионнн в различных положениях N-концевого домена с целью идентификации сшивок eRFl-мРНК в рибосоме; 6) получить генноинженерные конструкции фрагментов гена erfl человека, кодирующие индивидуальные домены eRFl; охарактеризовать взаимодействие доменов друг с другом, участие в образовании комплексов eRF l-eRF3-рибосома, их влияние на способность активировать ГТФазную активность eRF3 в рибосоме.

В работе создан широкий спектр точечных мутаций N-концевого домена eRFl. Высказано предположение, что консервативный Туг 125 образует водородную связь с Glu55, которая вероятно фиксирует ориентацию Туг125 в молекуле eRFl, что важно для узнавания третьего положения в стоп-кодоне. Показано, что замена N-концевого домена eRFl человека на гомологичный N-концевой домен eRFl инфузории S. mytilis приводит к изменению специфичности узнавания стоп-кодонов, гибридным белком. Выявлен дипептид TS в N-концевом домене eRFl человека (положения 122123), замена которого на дипептид QF, находящийся в аналогичном положении в N-концевом домене Stylonychia mytilis, переключает омнипотентность фактора на узнавание только стоп-кодона UGA в гибридных белках. Показано, что гуанин в стоп-кодоне UGA образует сшивку с участком 121-124 eRFl, а гуанин стоп-кодона UAG образует сшивку после 131-ого аминокислотного остатка eRFl. Установлено, что область, вовлеченная в узнавание стоп-кодонов, так называемый минидомен

YxCxxxF, является более протяженной, чем считали ранее и ограничена положениями 121-132.

Результаты представленной работы открывают перспективы для создания теоретической и экспериментальной базы данных которая может быть полезна для изучения РНК-белковых взаимодействий в общем и работы трансляционного аппарата клетки, в частности. Результаты данной работы могут помочь при разработке супрессорных методов лечения онкозаболеваний и других болезней, связанных с появлением нонсенс-мутаций. Работа открывает возможность значительно расширить функциональное разнообразие белков путем введения неканонических аминокислот в состав белков с использованием стоп-кодонов в качестве смысловых. Результаты работы демонстрируют возможность исследования молекулярной машинерии клетки in vitro и in vivo путем создания широкого спектра мутантных форм белков и гибридных конструкций с помощью относительно простых генно-ииженерных манипуляций.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Колосов, Петр Михайлович

выводы

1. Замена тырозинового остатка на фенилаланпповый в положении 125 N-концевого домена фактора терминации трансляции eRFl человека приводит к избирательному уменьшению RF-активности фактора в присутствии стоп-кодона UAG при сохранении полной активности в присутствии стоп-кодонов UAA и UGA (рпбосомная тест-система in vitro). Замена Туг 125 на другие аминокислотные остатки вызывает инактивацию eRFl по всем трем стоп-кодонам.

2. На основании данных рентгеноструктурного анализа (Song et al., 2000) высказано предположение, что Туг 125 образует водородную связь с высококонсервативпым Glu55. Гипотеза подтверждена опытами с заменами Glu55 на другие аминокислоты, которые приводят к полной или частичной утрате RF-активности мутантных форм eRFl, если замещение вызывает утрату способности образовывать Н-связь с Туг125. Мутант eRFl Glu55Arg сохраняет RF-активность, так как способен образовать Н-связь с Туг 125.

3. Создана гибридная конструкция eRFl, где N-концевой домен eEFl человека (узнающий все три стоп-кодона) заменен на N-концевой домен eRFl инфузории Stylonychia mytilis (обладающий только UGA-специфичностью). Показано, что такой гибридный белок in vitro приобрел декодирующую специфичность eRFl St. mytilis.

4. Созданы гибридные конструкции eRFl, где различные участки N-концевого домена eRFl человека заменены на эквивалентные участки N-копцевого домена eRFl Stylonychia mytilis. Показано, что днпептид T122Q/S123F функционально важен для переключения омнипотентной специфичности (узнавания всех трех стоп-кодонов) фактора eRFl человека на унипотентную (узнавание только одного стоп-кодона), характерную для eRFl Stylonychia sp.

5. Для картирования районов eRFl человека, соседствующих в А-участке рибосомы млекопитающих со стоп-кодоном, получен набор мутантов eRFl, где функционально несущественные аминокислотные остатки заменены на метионин. Полученные «метиониновые» мутанты в лаборатории Г.Г. Карповой (ИХБФМ СО РАН) использовали для локализации мест сшивок. Обнаружено, что гуанин стоп-кодона UGA сшивается с тетрапептидом 121-124 eRFl человека, гуанин стоп-кодона UAG сшивается с фрагментом 131-195, а гуанин в положении +4 - как с тетрапептидом 121-124, так и с участком 131-195 белка eRFl.

6. Экспериментально показано, что для индукции ГТФазной активности eRF3 в рибосоме достаточно МС-домена eRFl, то есть N-концевой домен, узнающий стоп-кодон, во взаимодействии с eRF3 не участвует.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я испытываю глубокую благодарность и признательность Льву Львовичу Киселеву за постоянное внимание к работе, моральную и интеллектуальную поддержку, и Людмиле Юрьевне Фроловой за неоценимую помощь в проведении экспериментальной работы, конструктивную критику и плодотворное обсуждение полученных результатов.

Благодарю всех сотрудников нашей лаборатории, словом и делом помогавших проведению работы: Алкалаеву Елену, Крючкову Полину, Дубовую Веру Ивановну, Кононенко Артема, Нину Опарину, Машкову Тамару Дмитриевну и Зиновьеву Ольгу Леонидовну.

Очень признателен нашим коллегам из лаборатории Галины Георгиевны Карповой, в особенности, Константину Булыгину, внесших большой вклад в представленную работу.

Отдельная благодарность в адрес Андрея Борисовича Полтарауса за проведение секвенирования всех образцов ДНК.

Благодарю Марию Раутян за предоставленные из ее коллекции некоторые виды инфузорий.

3.9. Заключение

Фактор терминации eRFl состоит из трех доменов. N-домен ответственен за узнавание стоп-кодонов, М-домен вовлечен в процесс гидролиза пептидил-тРНК в пегидил-трансферазном центре рибосомы, а С-домен взаимодействует с фактором терминации второго класса eRF3. При этом мы утверждаем, что их функция проявляется только в целом белке. Разнесение функции оказалось невозможным, что указывает на их общую сопряженность.

Основная цель данной работы состояла в выяснении функциональной роли отдельных аминокислотных остатков и протяженных участков аминокислотной цепи, находящихся в N-домене eRFl человека.

Полученные нами результаты позволили говорить о том, что механизм декодирования стоп-кодонов является двухстадийным, причем участки узнавания стоп-кодонов в N домене eRFl, видимо, делятся на два кластера, один из которых узнает первый U, а другой - два пурина в стоп-кодоне. Мы выявили ряд аминокислотных остатков в N домене eRFl человека, функционально значимых для специфичности узнавания отдельных нуклеотидов в стоп-кодонах. Кроме того, создание гибридных eRFl, в которых участки N-коцевого домена eRFl человека заменяли участками N-концевого домена eRFl Stylonychia mytilis, позволило определить минимальные кластеры природной последовательности аминокислотных остатков eRFl S. mytilis, которые ответственны за переключение омнипотентной специфичности на унипотентную (узнавание только стоп-кодона UGA). Нами было показано, что дипептид 122Q-123F оказался ключевым в переключении специфичности. В опыте по сшивкам eRFl с мРНК-аналогами в А-участке рибосомы, мы также показали, что одна из дискриминаторных областей локализована в тетрапептиде 121-124.

Для более детальной интерпретации данных полученных здесь и выведения общей гипотезы декодирования стоп-кодонов представляется исключительно важным дальнейшее введение новых тест-систем, минимизирующих экспериментальные артефакты. Например, очень важный вклад будет внесен экспериментами в «чистой» бесклеточной системе трансляции, собранной из отдельных компонентов. Данная система поможет приблизить полученные данные к ситуации in vivo.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колосов, Петр Михайлович, Москва

1. Alkalaeva E.Z., Pisarev A.V., Frolova L.Y., Kisselev L.L., and Pestova T.V. 2006. In vitro reconstitution of eulcaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3. Cell 125, 1125-1136.

2. Arkov A.L., Korolev S.V., Kisselev L.L. 1993. Termination of translation inbacteria may be modulated via specific interaction between peptide chain release factor 2 and the last peptidyl-tRNA(Ser/Phe). Nucleic Acids Res. 21:2891-2897.

3. Bertram G., Bell H.A., Ritchic D.W., Fullerton G., and Stansfield 1. 2000. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA 6, 1236-1247.

4. Bertram G., Innes Sh., Minella O., Richardson J.P. and Stanfield I. 2001

5. Endless possibilities: translation termination and stop codon recognition. Microbiology 147, 255-269.

6. Bjornsson A., Mottagui-Tabar S., Isaksson L.A. 1996. Structure of the C-terminal end of the nasccnt peptide influences translation termination. EMBO J. 15, 1696-1704.

7. Birnboim H.C. 1983. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmidDNA. Methods Enzymol 100, 243-255.

8. Brinkmann U., Mattes R.E., and Buckel P. 1989. High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85, 109-114.

9. Bonetti В., Fu L., Moon J., Bedwell D.M. 1995. The efficiency of translationtermination is determined by a synergistic interplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol. 251, 334345.

10. Caron F., and Meyer E. 1985. Does Paramecium primaurelia use a different genetic code in its macronucleus? Nature 314, 185-188.

11. Beaudet A.L. and Caskey C.T. 1970. Release factor translation of RNA phage terminator codons. Nature 227, 38-40.

12. Caskey C.T., Beaudet A.L., and Tate W.P. 1974. Mammalian release factor; in vitro assay and purification. Methods Enzymol 30, 293-303.

13. Caskey C.T., Bosch L., Konccki D.S. 1977. Release factor binding toribosome requires an intact 16 S rRNA 3' terminus. J. Biol. Chem. 252, 44354437.

14. Cassan M. and Rousset J.P. 2001. UAG readthrough in mammalian cells: Effect of upstream and downstream stop codon contexts reveal different signals. BMC Mol Biol. 2, 3-11

15. Chai В., Wang W., Liang A. 2008. Nuclear localization of eukaryotic class II release factor (eRF3): implication for the multifunction of eRF3 in ciliates Euplotes cell. Cell Biol Int 3, 353-357.

16. Chauvin C., Salhi S., Le Goff C., Viranaicken W., Diop D., and Jean-Jean O. 2005. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation. Mol Cell Biol 25, 5801-5811.

17. Chauvin C., Salhi S., Jean-Jean O. 2007. Human eukaryotic release factor 3a depletion causes cell cycle arrest at G1 phase through inhibition of the mTOR pathway. Mol Cell Biol 16, 5619-5629.

18. Chavatte L., Frolova L., Kisselev L., and Favre A. 2001. The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur J Biochem 268, 2896-2904.

19. Chavatte L., Frolova L., Laugaa P., Kisselev L., and Favre A. 2003a. Stop codons and UGG promote efficient binding of the polypeptide release factor eRFl to the ribosomal A site. J Mol Biol 331, 745-758.

20. Chavatte L., Kervestin S., Favre A., and Jean-Jean O. 2003b. Stop codon selection in eukaryotic translation termination: comparison of the discriminating potential between human and ciliate eRF Is. Embo J 22, 16441653.

21. Chavatte L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., and Favre A. 2002. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. Embo J21, 5302-531 1.

22. Cohen J., and Adoutte A. 1995. Why does the genetic code deviate so easily in ciliates? Biol Cell 85, 105-108.

23. Dincbas-Renqvist V., Engstrom A., Mora L., Heurgue-Hamard V., Buckingham R., Ehrenberg M. 2000. A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J. 19, 6900-6907.

24. Doronina V.A., and Brown J.D. 2006. Non-canonical decoding events at stop codons in eukaryotes. Mo! Biol (Mosk) 40, 731-741.

25. Doronina V.A., Wu C., de Felipe P., Sachs M.S., Ryan M.D. and Brown J.D. 2008. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon., Mol Cell Biol (Mosk) 13, 4227-4239.

26. Figaro S, Scrima N, Buckingham RH, Heurgu6-Hamard V. 2008. HemK2 protein, encoded on human chromosome 21, methylates translation termination factor eRF 1. FEBS Lett 16, 2352-2356

27. Freistroffer D.V., Kwiatkowski M., Buckingham R.H., and Ehrenberg M. 2000. The accuracy of codon recognition by polypeptide release factors. Proc Natl Acad Sci USA 97, 2046-2051.

28. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., and Kisselev L. 1996. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2, 334-341.

29. Frolova L., Seit-Nebi A., and Kisselev L. 2002. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8, 129-136.

30. Frolova L.Y., Merkulova Т.1., and Kisselev L.L. 2000. Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6, 381-390.

31. Grundner-Culemann Е., Martin G.W. 3 . Tujebajeva R., Harney J.W., Berry M.J. 2001. Interplay between termination and translation machinery in eulcaryotic selenoprotein synthesis. J. Mol Biol. 310, 699-707.

32. Gupta M., Copeland P.R. 2007. Functional analysis of the interplay between translation termination, selenoc\ steine codon context, and selenocysteine insertion sequence-binding protein 2. J Biol Chem 51, 36797-36807

33. Inagalci Y., Blouin C., Doolittle W.F., and Roger A.J. 2002. Convergence and constraint in eulcaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucleic Acids Res 30, 532-544.

34. Inagalci Y., and Doolittle W.F. 2001. Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucleic Acids Res 29, 921-927.

35. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., and Philippe M. 2003. Eulcaryotic release factors (eRFs) history. Biol Cell 95, 195-209.

36. Inge-Vechtomov S.G., Mironova L.N., and Ter-Avanesian M.D. 1994. Ambiguity of translation: a eukaryotic version?. Genetika 30, 1022-1035.

37. Ito K., Ebihara 1С., Uno M., Nakamura Y. 1996. Conserved motifs of prokaryotic and eukaryotic polypeptide chain release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5443-5448.

38. Ito K., Uno M., Nakamura Y. 1998. Single amino acid substitution in prokaryotic polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three termination codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8165-8169.

39. Ito K., Uno M., and Nakamura Y. 2000. A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680-684.

40. Ivanov V., Beniaminov A., Mikheyev A., Minyat E. 2001. A mechanism for stop codon recognition by the ribosome: a bioinformatic approach. RNA 7, 1683-1692.

41. Ivanov P.V., Gehring N.H., Kunz J.B., Hentze M.W., Kulozik A.E. 2008. Interaction between UPFI, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. EMBO J5, 736747.

42. Jakobsen C.G., Segaard T.M., Jean-Jean O., Frolova L., and Justesen J. 2001. Identification of a novel termination release factor eRF3b expressing the eRF3 activity in vitro and in vivo. Mol Biol (Mosk) 35, 672-681.

43. Jones S., Daley D.T.A., Luscombe N.M., Berman H.M., Thornton J.M. 2001. Protein-RNA interactions: a structural analysis. Nucleic Acids Res. 29, 943954

44. Kabcenell A.IC., Goud В., Northup J.IC., Novick P.J. 1990. Binding and hydrolysis of guanine nucleotides by Sec4p, a yeast protein involved in the regulation of vesicular traffic. J. Biol. Chem. 265, 9366-9372.

45. Karamyshev A.L. Ito K., Nakamura Y. 1999. Polypeptide release factor eRFl from Tetrahymena thermophila: cDNA cloning, purification and complex formation with yeast eRF3. FEBS Lett. 3, 483-8

46. Kervestin S., Frolova L., Kisselev L., and Jean-Jean O. 2001. Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor does not respond to reassigned UGA codon. EMBO Rep 2, 680-684.

47. Kim K.K., Min K., Suh S.W. 2000. Crystal structure of the ribosome recycling factor from Escherichia coli. EMBO J. 19, 2362-2370.

48. Kim O.T., Yura K., Go N., and Harumoto T. 2005. Newly sequenced eRFls from ciliates: the diversity of slop codon usage and the molecular surfaces that are important for stop codon interactions. Gene 346, 277-286.

49. Kim O.T., Sakurai A., Saito K., Ito K„ Ikchara K., Harumoto T. 2008. Ciliates use both variant and universal genetic codes: evidence of omnipotent eRFls in the class Litostomatea. Gene 417, 51-58.

50. Kisselev L., Ehrenberg M., and Frolova L. 2003. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? Embo J22, 175-182.

51. Kisselev L.L., and Buckingham R.H. 2000. Translational termination comes of age. Trends Biochem Sci 25, 561-566.

52. Klaholz B.P., Pape Т., Zavialov A.V., Myasnikov A.G., Orlova E.V., Vestergaard В., Ehrenberg M., and van FIcel M. 2003. Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90-94.

53. Knight R.D. and Landweber L.F. 2000. The early evolution of the genetic code. Cell 101, 569-572.

54. Kong C., Ito K., Walsh M.A., Wada M., Liu Y., Kumar S., Barford D., Nakamura Y., and Song H. 2004. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Mol Cell 14, 233245.

55. Kononenko A.V., Dembo K.A., Kiselev L.L., Volkov V.V. 2004. Molecular morphology of eukaryotic class I translation termination factor eRFl in solution. Mol Biol (Mosk) 2, 303-11.

56. Kononenko A.V., Mitkevich V.A., Dubovaya V.I., Kolosov P.M., Makarov A.A., and Kisselev L.L. 2007. Role of the individual domains of translation termination factor eRFl in GTP binding to eRF3. Proteins, 2, 388-393.

57. Laurberg M., Asahara H., Korostelev A., Zhu J., Trakhanov S., Noller IT. 2008. Structural basis for translational termination on the 70S ribosome. Nature 454, 852-857.

58. Le Goff X., Philippe M., and Jean-Jean O. 1997. Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells. Mol Cell Biol 17, 3164-3172.

59. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. 1988. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 66, 45-54.

60. Li G. and Rice C.M. 1993. The signal for translational readthrough of a UGA codon in Sindbis virus RNA involves a single c^tidine residue immediately downstream of the termination codon. J. Virol. 67, 5062-5067.

61. Liang A., Brunen-Nieweler C., Muramatsu Т., Kuchino Y., Beier H., and Heckmann K. 2001. The ciliate Euplotes octocarinatus expresses two polypeptide release factors of the type eRFl. Gene 262, 161-168.

62. Liu J.J., Sondheimer N., and Lindquist S.L. 2002. Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion PS1+. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16446-16453.

63. Lozupone C.A., Knight R.D., and Landweber L.F. 2001. The molecular basis of nuclear genetic codc change in ciliates. Curr Biol 11, 65-1 A.

64. Ma В., and Nussinov R. 2004. Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes. J Biol Chem 279, 53875-53885.

65. Mandel M., and Higa A. 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. JMol Biol 53, 159-162.

66. McCaughan K.K., Brown C.M., Dalphin M.E., Berry M.J., Tate W.P. 1995. Translational termination efficiency in mammals is influenced by the base following the stop codon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5431-5435.

67. Merkulova T.L, Frolova L.Y., Lazar M., Camonis J., Kisselev L.L. 1999. C-terminal domains of human translation termination factors eRF 1 and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett. 443, 41-47.

68. Meyer F., Schmidt IT.J., Plumper E., Hasilik A., Mersmann G., Meyer H.E., Engstrom A., and Heckmann K. 1991. UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Euplotes octocarinatus. Proc Natl Acad Sci USA 88, 37583761.

69. Milman G., Goldstein J., Scolnick E., Caslcey T. 1969. Peptide chain termination. 3. Stimulation of in vitro termination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 183-190.

70. Mikuni O., Ito K., Moffat J., Matsumura 1С., McCaughan K., Nobukuni Т., Tate W., and Nakamura Y. 1994. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 91,5798-5802.

71. Molotlcov M.V., Graifer D.M., Demeshkina N.A., Repkova M.N., Ven'yaminova A.G., and Karpova G.G. 2005. Positioning of mRNA 3' of the A site bound codon on the human 80S ribosome. Mol. Biol. (Mosk.) 6, 9991007.

72. Mora L., Heurgue-Hamard V., Champ S., Ehrenberg M., Kisselev L.L., and Buckingham R.H. 2003. The essential role of the invariant GGQ motif in the function and stability in vivo of bacterial release factors RF1 and RF2. Mol Microbiol 47, 267-275.

73. Moreira D., Kervestin S., Jean-Jean O., Philippe H. 2002. Evolution of eulcaryotic translation elongation and termination factors: variations of evolutionary rate and genetic code deviations. Mol. Biol. Evol. 19, 189-200.

74. Morris DK, Lundblad V. 1997. Programmed translational frameshifting in a gene required for yeast telomere replication. Curr Biol. 12, 969-76.

75. Mottagui-Tabar S., Bjornsson A., Isaksson L.A. 1994. The second to last amino acid in the nascent peptide as a codon context determinant. EMBO J. 13, 249-257.

76. Mottagui-Tabar S., Tuite M.F., Isaksson L.A. 1998. The influence of 5' codon. context on, translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 257, 249-257.

77. Muramatsu Т., Heclcmann K., Kitanalca C., and Kuchino Y. 2001. Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons. FEBS Lett 488, 105-109.

78. Nakamura Y., and Ito K. 1998. How protein reads the stop codon and terminates translation. Genes Cells 3, 265-278.t

79. Nakamura Y., and Ito K. 2003. Making sense of mimic in translation termination. Trends Biochem Sci 28, 99-105.

80. Nakamura Y., Ito K., and Ehrenberg M. 2000. Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101, 349-352.

81. Nakamura Y., Ito K., and Isaksson L.A. 1996. Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147-150.

82. Namy О, Hatin 1, Rousset JP. 2001. Impact of the six nucleotides downstream of the stop codon on translation termination. EMBO Rep. 9, 787-93.

83. Namy O, Duchateau-Nguyen G, Hatin I, Hermann-Le Denmat S, Termier M, Rousset JP. 2003. Identification of stop codon readthrough genes in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 9, 2289-2296.

84. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F., and Nyborg J. 1995. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270, 1464-1472.

85. Pagel F.T., Zhao S.Q., Hijazi K.A., Murgola E.J. 1997. Phenotypeheterogeneity of mutational changes at a conserved nucleotide in 16S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 267, 1113 -1123.

86. Pavlov M.Y., Freistroffer D.V., MacDougall J., Buckingham R.H., Ehrenberg M. 1997. Fast recycling of Escherichia coli ribosomes requires both ribosome recycling factor (RRF) and release factor RF3. EMBO J. 16, 4134-4141.

87. Pavlov M.Y., Freistroffer D.V., Dincbas V., MacDougall J., Buckingham R.H., Ehrenberg M. 1998. A direct estimation of die context effect on the efficiency of termination. J. Mol. Biol. 284, 579-590.

88. Poole E., and Tate W. 2000. Release factors and their role as decoding proteins: specificity and fidelity for termination of protein synthesis. Biochim Biophys Acta 1493, 1-11.

89. Quigley F., Dao P., Cottet A., Mache R. 1996. Sequence analysis of an 81 kb contig from Arabidopsis thaliana chromosome III. Nucleic Acids Res. 24, 4313-4318

90. Ramakrishnan V. 2002. Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572.

91. Ra\vat U.B., Zavialov A.V., Sengupta J., Valle M., Grassucci R.A., Linde J., Vestcrgaard В., Ehrenberg M., and Frank J. 2003. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421, 87-90.

92. Salas-Marco J., and Bedwell D.M. 2004. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. Mol Cell Biol 24, 7769-7778.

93. Salas-Marco J., Fan-Minogue H., Kallmeyer A.K., Klobutcher L.A., Farabaugh P.J., and Bedwell D.M. 2006. Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena and Euplotes. Mol Cell Biol 26, 438-447.

94. Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual., 2 edn (N.Y., Cold Spiing Harbor).

95. Samsonova M.G., Inge-Vechtomov S.G., and Taylor P. 1991. Structure comparison and evolutionary relations between elongation factors EF-Tu (EF-1 alpha) and SUP 2 proteins. Genetica 85, 35-44.

96. Sarkar G., and Sommer S.S. 1990. The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8, 404-407.

97. Seit-Nebi A., Frolova L., Justesen J., and Kisselev L. 2001. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucleic Acids Res 29, 3982-3987.

98. Seit-Ncbi A., Frolova L., and Kisselev L. 2002. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl .EMBO Rep 3, 881-886.

99. Selmer M., Dunham C.M., Murphy F.V. 4th, Weixlbaumer A., Petry S., Kelley A.C., Weir J.R., Ramakrishnan V. 2006. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 5795, 1935-1942.

100. Song H., Mugnier P., Das A.K., Webb H.M., Evans D.R., Tuite M.F., Hemmings B.A., and Barford D. 2000. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl—mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Cell 100, 311-321.

101. Song L., Wang Y., Chai В., Wang W., Liang A. 2007. C-terminal 76 amino acids of eRF3 are not required for the binding of release factor eRF la from Euplotes octocarinatus. J Genet Genomics 6, 486-90.

102. Song L., Chai B.F., Wang W., Liang A.H. 2006. Identification of translational release factor eRF la binding sites on eRF3 in Euploles octocarinatus. Res Microbiol 9, 842-850.

103. Stahl G., Bidou L., Rousset J.P., and Cassan M. 1995. Versatile vectors to study recoding: conservation of rules between yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res 23, 1557-1560.

104. Studier F.W., and Moffatt B.A.- 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-130.

105. Tate W., Greuer В., Brimacombe,R. 1990. Codon recognition in polypeptide chain termination: site directed crosslinking of termination codon to Escherichia coli release factor 2. Nucl. Acids Res. 18, 6537-6544.

106. Tate WP, Poole ES. 2004. The ribosome: lifting the veil from a fascinating organelle. Bioessays. 5, 582-588.

107. Velichutina I.V., Hong J.Y., Mesecar A.D., Chernoff Y.O., Liebman S.W. 2001. Genetic interaction between yeast Saccharomyces ccrevisiae release factors and the decoding region of 18S rRNA. J. Mol. Biol. 305:715-727.

108. Vestergaard В., Van L.B., Andersen G.R. Nyborg J., Buckingham R.H., and Kjeldgaard M. 2001. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol Cell 8, 1375-1382.

109. Volkov K., Osipov K., Valouev I., Inge-Vechtomov S., and Mironova L. 2007. N-terminal extension of Saccharomyces cerevisiae translation termination factor eRJF3 influences the suppression efficiency of sup35 mutations. FEMS Yeast Res 7, 357-365.

110. Vorob'cv Iu.N., Kiselev L.L. 2008. Molecular modeling of positioning of human release factor eRF 1 relative to mRNA stop-codon explains a proximity of the eRFl C-domain to stop-codon in ribosomal complex. Mol Biol (Mosk) 2,341-351.

111. Vorob'ev Iu.N., Kiselev L.L. 2007. Molecular modeling of structure of eukaryotic ribosomal translation termination complex. Mol Biol (Mosk) 1, 103-111.

112. Wang W., Czaplinski K., Rao Y., and Peltz S.W. 2001. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts. Embo J20, 880-890.

113. Yusupov M.M, Yusupova G.Zh, Baucom A, Lieberman K, Earnest T.N, Cate J.H.D, Noller H.F. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292:883-896.

114. Zavialov A.V., Buckingham R.H., and Ehrenberg M. 2001. A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107, 115-124.

115. Zhang S., Ryden-Aulin M., Isaksson L.A. 1996. Functional interaction between release factor one and P-site peptidyl-tRNA on the ribosome. J. Mol. Biol 261,98-107.

116. Zhang S., Ryden-Aulin M., Isaksson L.A. 1998. Functional interaction between tRNA2Gly2 at the ribosomal P-site and RF1 during termination at UAG. J. Mol Biol. 284, 1243-1246.

117. Zhang S., Ryden-Aulin M., Isaksson L.A. 1999. Interaction between a mutant release factor one and P-site peptidyl-tRNA is influenced by the identity of the two bases downstream of the stop codon UAG.FEBS Lett. 455, 355-358.

118. Zhang Y., Baranov P.V., Atkins J.F., and Gladyshev V.N. 2005. Pyrrolysine and selenocysteine use dissimilar decoding strategies. J Biol Chem 280, 20740-20751.

119. Zhuravleva G.A., Moskalenko S.E., Murina O.A., Inge-Vechtomov S.G. 2007. Viable nonsense mutants for the SUP45 gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae are lethal at increased temperature. Genetika 10, 1363-1371.

120. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov S., Kisselev L., and Philippe M. 1995. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. Embo J14, 4065-4072.

121. Зайцев E.H., Зайцева E.M., Бахланова И.В., Горелов В.И., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., and Ланцов В.А. 1986. Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. Генетика 22, 2721-2727.