Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность факторов терминации трансляции из организмов с вариантными генетическими кодами

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Активность факторов терминации трансляции из организмов с вариантными генетическими кодами"

005003711

на правах рукописи

ЕЛИСЕЕВ Борис Дмитриевич

АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ ИЗ ОРГАНИЗМОВ С ВАРИАНТНЫМИ ГЕНЕТИЧЕСКИМИ КОДАМИ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 НОЯ 2011

Москва-2011

005003711

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной геномики Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Ю. Фролова

доктор биологических наук, В.В. Кушниров

кандидат биологических наук, М.С. Светлов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита диссертации состоится "Ф' ^г^р 20 И г. в I 1 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " 20// г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

А. М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В организмах с универсальным генетическим кодом 61 смысловой кодон используется для кодирования 20 природных аминокислот, а три стоп кодона - UAA, UAG и UGA служат сигналами для остановки белкового синтеза. Однако в большом числе организмов обнаружены отклонения от универсального генетического кода. Многие организмы с вариантными генетическими кодами используют один или два стандартных стоп кодона в качестве смысловых кодонов. Например, археи семейства Methanosarcinaceae используют UAG для кодирования особой 22-ой аминокислоты - пирролизина. У многих ресничных инфузорий (таких как Stylonychia, Tetrahymena, Paramecium и др.) кодоны UAA и UAG не служат для терминации трансляции, а кодируют глутамин, а у представителей рода Euplotes кодон UGA кодирует цистеин.

Ключевую роль в процессе терминации белкового синтеза играют факторы терминации трансляции, которые подразделяются на два класса. У эукариот фактор терминации 1-го класса eRFl принимает участие в узнавании стоп кодонов и в гидролизе пептидил-тРНК. Фактор терминации 2-го класса eRF3 связывается в рибосоме с фактором терминации 1-го класса и является eRFl - и рибосомо-зависимой ГТФазой. У архей обнаружены только факторы терминации 1-го класса aRFl, гомологичные eRFl эукариот; вероятно, функцию фактора терминации 2-го класса выполняет фактор элонгации aEFla. Известны пространственные структуры aRFl археи Aeropyrum pernix, eRFl человека и дрожжей. Согласно этим данным eRFl и aRFl состоят из трех доменов - N, М и С, каждый из которых выполняет определенную функцию: N домен ответствен за узнавание стоп кодона, М домен индуцирует гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, а М и С домены ответственны за связывание с eRF3/aEFla.

До сих пор детально не определены структурные элементы доменов eRFl,

отвечающие за выполнение той или иной функции белка, хотя некоторые

предварительные гипотезы в литературе были высказаны. В течение последних

десяти лет предприняты многочисленные попытки для решения проблемы

декодирования стоп сигналов фактором терминации 1-го класса в рибосоме. Сайты

узнавания стоп кодонов у бактериальных факторов терминации трансляции 1-го

класса определены с использованием точечного мутагенеза и рентгеноструктурного

анализа, однако для факторов терминации эукариот и архей это до сих пор не

3

удалось. Идентификация аминокислотных остатков, определяющих специфичность узнавания стоп кодонов, факторами терминации трансляции из организмов с вариантным генетическим кодом, может помочь в выяснении механизма узнавания стоп кодонов в организмах с универсальным кодом.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось определение специфичности в отношении узнавания стоп кодонов факторов терминации трансляции 1-го класса из двух групп организмов с вариантными генетическими кодами и последующая идентификация аминокислотных остатков, определяющих декодирующие свойства этих белков. В качестве объектов исследования были выбраны белки aRFl архей семейства Methanosarcinaceae и eRFl ресничных инфузорий родов Euplotes и Blepharisma. Согласно литературным данным, первая группа использует стоп кодон UAG для кодирования пирролизина, а вторая - стоп кодон UGA для кодирования цистеина или триптофана. В ходе исследования сформулированы следующие задачи: 1) клонировать гены и выделить факторы терминации aRFl пирролизин-содержащих архей, а также aRFl архей с универсальным генетическим кодом; охарактеризовать и сравнить их функциональную активность на разных стоп кодонах in vitro; 2) получить химерные белки, содержащие различные участки N домена eRFl Euplotes и человека, и определить их специфичность в отношении узнавания стоп кодонов; 3) клонировать ген и выделить фактор терминации трансляции eRFl Blepharisma, а также химерный белок, содержащий N домен eRFl Blepharisma и МС домены eRFl человека, и исследовать их функциональную активность.

Научная новизна и практическая ценность работы. Узнавание стоп кодонов

фактором eRFl эукариот - один из ключевых процессов терминации трансляции,

понимание механизма которого чрезвычайно важно для создания теоретической и

экспериментальной базы данных РНК-белковых взаимодействий и изучения работы

трансляционного аппарата клетки. В работе использовано несколько методов

определения функциональной активности факторов терминации трансляции, в том

числе полностью реконструированная in vitro система трансляции эукариот,

применение которой позволяет избежать ряда ограничений, накладываемых другими

методами исследования. Конструирование белковых химер между N доменами

факторов терминации eRFl Euplotes и человека позволило локализовать

аминокислотные остатки, ответственные за запрет узнавания кодона UGA eRFl

4

Euplotes. Эти результаты, вместе с ранее полученными данными для eRFl Stylonychia и Paramecium, важны для выяснения механизма узнавания стоп кодонов факторами терминации трансляции eR.Fl/aRFl. Впервые исследована функциональная активность aRFl пирролизин-содержащих архей, позволяющая предложить механизм включения пирролизина в синтезируемый полипептид.

В последнее время разработан подход селективного мечения белков неприродными аминокислотами (например, флуоресцентно меченными). Метод включает использование супрессорной тРНК, несущей меченую аминокислоту, введение стоп кодона в кодирующую последовательность мРНК и замену универсального (омнипотентного) фактора терминации eRFl на уни-/бипотентный, узнающий один или два стоп кодона соответственно. Полученные в данной работе результаты могут быть использованы для разработки методов котрансляционного встраивания искусственных аминокислот, что позволяет синтезировать рекомбинантные белки, несущие разнообразные функциональные группы. Апробация работы. Материалы работы представлены на следующих международных конференциях: 6th International Symposium of Anaerobic Microbiology (Liblice,, 2009); 13th Annual Symposium for Biology Students of Europe (Казань, 2009); Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech 09 (Москва, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (146 наименований). Диссертация содержит 24 рисунка и 10 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Факторы терминации трансляции архей aRFl активны в реконструированной in vitro эукариотической системе трансляции

Известно, что аппарат трансляции архей гораздо ближе таковому эукариот, чем бактерий. Факторы терминации трансляции 1-го класса архей aRFl гомологичны эукариотическим eRFl, обладают сходной пространственной структурой и не имеют гомологии с факторами терминации 1-го класса бактерий (RF1 и RF2). Как и большинство эукариот, архей, как правило, содержат один фактор терминации aRFl и используют универсальный генетический код. Следовательно, aRFl архей, подобно

5

eRFl эукариот, должен узнавать все три стоп кодона, что показано для белков aRFl метаногеннной археи Methanococcus jannaschii и гипертермофильной археи Aeropyrum pernix. Ранее функциональную активность aRFl измеряли в системе in vitro, используя метод, предложенной Каски с соавторами, определяя степень гидролиза формил[835]метионил-тРНК, связанной в 80S рибосоме с инициаторным AUG кодоном мини-мРНК, содержащей один из трех стоп кодонов, следующий непосредственно за AUG кодоном.

В данном исследовании функциональную активность aRFl определяли по степени гидролиза пептидил-тРНК в претерминационном комплексе, полученном в полностью реконструированной in vitro эукариотической системе трансляции. Реконструированная система состояла из MVHL-stop мРНК, кодирующей тетрапептид Met-Val-His-Leu, суммарной тРНК, ацилированной Val, His, Leu, и [S35]Met, очищенных 40S и 60S рибосом кролика и факторов инициации и элонгации трансляции. Кодирующая область модельной мРНК заканчивалась одним из трех стоп кодонов (UAA, UAG или UGA). Активность фактора терминации определяли по количеству высвободившегося меченого [35S]-пептида. Для получения достоверного результата каждый эксперимент повторяли минимум 3 раза. По сравнению с ранее использованными методами определения активности eRFl эта система ближе к природной системе, благодаря присутствию мРНК с 5'- и З'-нетранслируемыми областями и разнесенными в пространстве инициаторным и стоп кодонами.

Определение активности факторов aRFl из двух родственных метаногенных архей - Methanococcus jannaschii и Methanococcus maripaludis свидетельствует о том, что aRFl М. jannaschii индуцирует высвобождение пептида in vitro в присутствии всех трех стоп кодонов, при этом происходит некоторое снижение узнавания кодона UAG (Рис. 1А). Полноразмерный aRFl М. maripaludis не активен в эукариотической системе трансляции.

У эукариот N-концевой домен eRFl ответствен за декодирование стоп кодонов, что подтверждено генетическими и биохимическими данными. Для определения специфичности eRFl низших эукариот (ресничных инфузорий Stylonychia и Euplotes) в отношении узнавания стоп кодонов ранее был использован подход по созданию химерных факторов eRFl, содержащих N домен инфузорий и МС домены человека.

M. jannaschii aRF 1 M. maripaludis a'eRF!

Рис. 1. Функциональная активность фактора терминации трансляции aRFl Melhanococcm jannaschii (А) и химерного белка a/eRFl М. maripaludis (Б) в реконструированной in vitro эукариотической системе трансляции на разных стоп кодонах.

Такие химерные факторы терминации эффективно связываются с рибосомами кролика, и их специфичность в отношении узнавания стоп кодонов аналогична еШЛ инфузорий, что позволяет избежать ограничений, накладываемых низким сродством рибосом и факторов терминации относительно друг друга у далеких видов. Аналогичный подход использован нами и для исследования специфичности факторов терминации архей в отношении узнавания стоп кодонов. С этой целью нами сконструирован химерный белок а/сИР 1, содержащий N домен фактора терминации трансляции аКР1 М тапраЫсИв и МС домены сКР1 человека

а/е11Р1 М. тапраЫсИз, так же как и аКР1 М. ]аппавскн, узнавал все три стоп кодона, причем эффективность терминации трансляции в присутствии этого белка на иЛО и иОА стоп кодонах сравнима с активностью, наблюдаемой для аЮЧ М. }аппа$сЫи а активность на иАА стоп кодоне значительно выше (Рис. 1Б).

Таким образом, аЯР 1 способны индуцировать гидролиз пептидил-тРНК в реконструированной эукариотической системе трансляции, что свидетельствует о сходстве механизма терминации трансляции у архей и эукариот, за исключением отсутствия у архей фактора терминации второго класса (гомолога еКРЗ). Недавно получены данные, позволяющие предположить, что функцию еИРЗ в археях выполняет фактор элонгации трансляции аЕПа.

2. Декодирование иАС в пирролизин-содержащих археях

Обнаружено, что иАв кодон, присутствующий в открытой рамке считывания гена монометиламинметилтрансферазы архей МеЖапсиагапа Ьагкеп, кодирует

особую аминокислоту - пирролизин (Pyl). Пирролизин обнаружен и у других представителей семейства Methanosarcinaceae, а также у нескольких неродственных видов бактерий. Эта аминокислота входит в состав ферментов класса метилтрансфераз (MtmB, MtbB, MttB), позволяющих этим археям использовать метанол и метиламины для метаногенеза, поэтому Methanosarcinaceae способны утилизировать самый большой спектр субстратов среди всех метаногенов. Установлено, что пирролизин включается в синтезируемый пептид как обычная аминокислота при трансляции мРНК с участием собственной тРНК (tRNAPyl), которая ацилируется пирролизином в присутствии своей аминоацил-тРНК-синтетазы - PylRS.

Так как пирролизин декодируется UAG кодоном, который у большинства организмов используется в качестве стоп кодона, предложено три гипотезы декодирования UAG в пирролизин-содержащих археях:

1) UAG может кодировать пирролизин при участии цис-элемента в мРНК (подобно селеноцистеину); 2) UAG стал значащим кодоном, кодирующим исключительно пирролизин. В этом случае фактор терминации должен потерять способность узнавать UAG (подобно тому, как это происходит у некоторых ресничных инфузорий); 3) UAG может быть как стоп кодоном, так и значащим кодоном и его декодирование определяется конкуренцией между пирролизиновой тРНК (тРНКРу|) и фактором терминации.

Однако последовательность PYLIS (pvrrolvsine insertion sequence), выполняющая роль цис-элемента, необходимого для кодирования пирролизина, обнаружена не во всех мРНК, кодирующих пирролизин-содержащие белки. Так, в Methanosarcina acetivorans PYLIS элемент в мРНК метилтрансферазы MtmB способствует эффективной супрессии UAG (прочтению в качестве значащего кодона). При этом PYLIS элемент не важен для встраивания пирролизина или его аналогов в синтезируемый полипептид в клетках Е. coli, трансформированных генами пирролизиновой АРСазы (PylRS) и тРНКРу1. Для связывания Ру1-тРНКРу| и включения этой аминокислоты в белок не нужен дополнительный фактор элонгации, как в случае с селеноцистеином, так как тРНКРу| непосредственно узнается стандартным фактором элонгации aEFla. Кроме того, пирролизин синтезируется в клетке индивидуально из другой аминокислоты - лизина, в отличие от селеноцистеина. Следовательно, механизм декодирования стоп кодона в качестве смыслового кодона для пирролизина

не имеет сходства с таковым для селеноцистеина.

8

2.1. Биоинформатический анализ геномов архей порядка Methanosarcinales

Ранее показано, что UAG является редким кодоном в геномах архей рода Methanosarcina и составляет менее 5% от всех стоп кодонов, в то время как UAA и UAG - составляют каждый примерно 45% от всех стоп кодонов. При этом в большинстве случаев за кодоном UAG, стоящим в конце рамки считывания гена, следует дополнительный стоп кодон UAA или UAG.

Мы предположили, что часть кодонов UAG может находиться в конце недавно приобретенных этими видами генов в результате горизонтального переноса из других архей и бактерий - часто наблюдаемого явления для рода Methanosarcina. Показано, что в геноме М. mazei более 500 генов возникли путём горизонтального переноса от бактерий. Анализ генома М. barkeri свидетельствует о том, что в нем имеются опероны, свойственные некоторым группам бактерий, но не встречающиеся у других архей. Например, опероны Р450-специфичной ферредоксинредуктазы и ферментов, ответственных за синтез муреина, имеют гомологи только в бактериальных геномах. Поэтому, мы проанализировали использование стоп кодонов в генах, общих для пирролизин-содержащих и родственных им архей (ортологичные гены). Такие гены не являются новоприобретенными и могли эволюционировать в сторону редукции UAG стоп кодона, если он используется главным образом как смысловой кодон.

Проведен анализ частоты использования стоп кодонов в ортологичных генах архей, которые относятся к порядку Methanosarcinales, полные геномные последовательности которых опубликованы в базе данных сайта NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Порядок Methanosarcinales включает два родственных семейства метаногенных архей: Methanosarcinaceae и Methanosaetaceae. Четыре из пяти выбранных видов архей относятся к семейству пирролизин-содержащих архей Methanosarcinaceae (Methanococcoides burtonii, Methanosarcina acetivorans, M. barkeri и M. mazei) и один вид к семейству Methanosaetaceae - архей не использующих пирролизин {Methanosaeta thermophila). Обработка геномных данных проведена П.К. Власовым (ИМБ РАН, Москва) и Ф.А. Кондрашовым (Centre de Regulacio Genomica, Барселона, Испания).

Биоинформатический анализ показал, что UAG в качестве стоп кодона встречается только в 6-9 ортологичных генах архей семейства Methanosarcinaceae и в 160 ортологичных генах представителя семейства Methanosaetaceae (Таблица 1), что

свидетельствует о резком снижении использования стоп кодона иЛО пирролизин-содержащими археями. Вероятно, в ортологичных генах большинство иАО кодонов мутировали в иАА, так как подобное превращение требует замены лишь одного нуклеотида, а не двух, как в случае мутации иАО в иСА. Это предположение подтверждается увеличением частот использования иАА стоп кодона в генах семейства МеМапозагстасеае по сравнению с генами Ме1Исто.чае1асеае. Количество кодонов 1ГСА в этих двух семействах различается не так существенно (Таблица 1). Таким образом, эволюция генетического кода пирролизин-содержащих архей идет по пути замены функции иАО кодона - из терминирующего кодона он постепенно превращается в смысловой кодон.

Таблица 1.

Использование стоп кодонов в ортологичных генах архей порядка МеЛапозагстакз.

иАА иле ША

МеЛапозагстасеае

Ме1Напососсо1йез ЬиПопИ 401 6 431

МеЛапозагста асейуогапз 416 7 415

МеЛапозагста Ьагкег1 505 9 324

МеЛапозагста таге1 445 8 385

Ме1\\апозае1асеае

Ме&апозае1а ЛегторкНа 107 160 571

2.2 Факторы терминации трансляции а/еКР1 пирролизин-содержащих архей рода МеЛапозагста узнают все три стоп кодона

Для решения вопроса о декодировании иАО у архей семейства МеЛапозагстасеае необходимо было выяснить, сохранил ли аНТ 1 этих архей способность узнавать кодон иАО и индуцировать в его присутствии гидролиз пептидил-тРНК. У двух видов пирролизин-содержащих архей (МеЛапозагста асе^огапз и МеЛапозагста Ьагкеп) ранее обнаружено два отличающихся друг от друга по первичной структуре фактора терминации первого класса (aR.Fl-!, форма 1 и aRFl-2, форма 2), в то время как другие виды семейства МеЛапозагстасеае, например \iethanosarcina теней содержат только одну форму аЯР1. Мы предположили, что две разные формы aRFl М. асейуогат и М. Ьагкеп могут иметь разную специфичность в отношении узнавания стоп кодонов.

Сравнение нуклеотидных последовательностей генов aRFl архей семейства Methanosarcinaceae, включающее все известные виды пирролизин-содержащих архей, позволило выяснить два факта:

1) формы 1 белков М. barkeri и М. acetivorans по аминокислотной последовательности ближе друг к другу, чем к формам 2 из тех же видов (то же самое справедливо и для форм 2 М. barkeri и М. acetivorans)', 2) aRFl М. mazei филогенетически ближе к генам форм 1 М. barkeri и М. acetivorans.

I-Methanosarcina acetiwrans aRF1 -1

_I I- Methanosarcina mazei aRF1

__I- Methanosarcina barker! aRF1-1

_I-Afethanosardna acetivorans aRF1-2

--I- Methanosarcina barkeri aRF1-2

- Methanococcoides burtonii aRF1

- Afei/;a/7ccoax'3 rr:>r;::i'\rJr> aRFl

Рис. 2. Филогенетическое древо генов aRFl из пирролизин-содержащих архей семейства Methanosarcinaceae и aRFl Methanococcus maripaludis, вида не содержащего пирролизин (отмечен серым цветом).

Мы предполагаем, что дупликация гена aRFl у архей рода Methanosarcina произошла до расхождения видов М. acetivorans, М. barkeri и М. mazei. Согласно этому сценарию, М. acetivorans и М. barkeri сохранили обе копии гена aRFl, в то время как геном М. mazei потерял вторую копию.

Определено соотношение синонимичных (не приводящих к изменению кодируемой аминокислоты) и несинонимичных (приводящих к изменению кодируемой аминокислоты) замен в генных парах aRFl М. acetivorans и М. barkeri в сравнении с контрольным геном aRFl М. mazei. Оказалось, что количество несинонимичных замен в формах aRFl-2 в несколько раз больше чем в формах aRFl-1 (Таблица 2), т.е. форма aRFl-2 эволюционирует гораздо быстрее формы aRFl-1.

Таблица 2.

Количество замен кодонов аминокислотных остатков в генах яТУ7/ М. асе^уогат и М. Ьагкеп в сравнении с аЯР1 М. mazei.

синоним./несиноним. %

М. acetivorans aRFl-1 136/27 83/17

М. barkeri aRFl-1 168/51 77/23

М. acetivorans aRFl-2 161/222 42/58

M. barkeri aRFl-2 159/221 42/58

Цифры в первом столбце показывают число синонимичных и несинонимичных замен соответственно, а во втором столбце показано их процентное соотношение.

Однако обе копии гена aRFl-2 не содержат нонсенс-мутаций и мутаций со сдвигом рамки считывания, что говорит о вероятном сохранении их экспрессии.

Для проверки функциональной активности в реконструированной in vitro эукариотической системе трансляции мы выбрали aRFl из двух видов рода Methanosarcina: М. barkeri и М. mazei - формы 1 и 2 aRFl М. barkeri и aRFl М. mazei. Поскольку полноразмерные aRFl этих двух видов оказались неактивными в использованной нами системе, подобно полноразмерному aRFl Methanococcus maripaludis, мы сконструированы химерные белки a/eRJFl, содержащие N домены aRFl и MC домены eRFl человека и проверили их функциональную активность.

Из двух форм aRFl М. barkeri функционально активна только форма 1, тогда как форма 2 не активна на всех трех стоп кодонах (Рис. ЗБ).

М. bariteria/eRFM

U. barkeri a/eRF1-2

aRF1 {пмоль)

М. mazei a/eRF1

12500 ff

I 1000 8

I 500 i

0 50 100 150 200 250

aRF1 (пмоль)

Рис. 3. Функциональная активность химерных белков a/eRFl Methanosarcina barkeri (А, Б) и Methanosarcina mazei (В) в реконструированной in vitro эукариотической системе трансляции на разных стоп кодонах.

Белок a/eRFl-1 узнавал все три стоп кодона, однако в присутствии кодона UAG эффективность терминации трансляции несколько снижена по сравнению с UAA и

UGA кодонами (Рис. ЗА). a/eRFl М. mazei индуцирует гидролиз пептидил-тРНК на всех трех стоп кодонах с примерно одинаковой эффективностью, но отмечено небольшое повышение активности в присутствии UAA кодона (Рис. ЗВ).

Выравнивание аминокислотных последовательностей факторов терминации трансляции архей показало, что неактивная форма a/eRFl-2 М. barkeri содержит замены консервативных аминокислотных остатков в положениях 61, 63 (мотив NIKS) и 122-124 (рядом с мотивом YxCxxF) (Рис. 4), чрезвычайно важных, как показано ранее, для узнавания стоп кодонов eRFl. Чтобы проверить предположение о влиянии этих замен на способность a/eRFl-2 М. barkeri узнавать стоп кодоны, получены 3 мутантных белка a/eRFl-2 М. barkeri, содержащие следующие мутации в N домене: K61N (подобно структуре других архейных aRFl), D122V+U24K (подобно aRFl-1 М. barkeri), D122T+Y123F+I124V (подобно aRFl М. maripaludis). Однако все полученные мутантные формы неактивны в терминации трансляции, как и исходный a/eRF 1 -2 М. barkeri.

50 | | 70

Methanosarcina acetivorans aRFl-1 Methanosarcina barkeri aRFl-1 Methanosarcina acetivorans aRFl-2 Methanosarcina barkeri aRFl-2 Methanosarcina mazei aRFl Methanococcus maripaludis aRFl Methanococcus jannaschii aRFl Homo sapiens eRFl

Methanosarcina acetivorans aRFl-1 Methanosarcina barkeri aRFl-1 Methanosarcina acetivorans aRFl-2 Methanosarcina barkeri aRFl-2 Methanosarcina mazei aRFl Methanococcus maripaludis aRFl Methanococcus jannaschii aRFl Homo sapiens eRFl

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей И-концевых доменов факторов терминации аМЧ пирролизин-содержащих архей, аШЧ МеЛапососсиз и еЯР1 человека. Идентичные, консервативные и полуконсервативные аминокислотные остатки обозначены черным, темно-серым и светло-серым соответственно. Стрелками обозначены положения 61, 63 и 122-124.

Таким образом, лишь форма а!1Р1-1 М. Ьагкеп активна в терминации трансляции. Роль второй копии гена aR.Fl в геномах архей М. асеНуогаю и М. Ьагкег остается неизвестной. Суммируя полученные результаты, можно заключить, что все исследованные факторы терминации аШЧ архей (кроме формы аКР1-2 М. Ьагкегг) имеют сходную специфичность и узнают все три стоп кодона.

Поскольку aRF 1 семейства МеЛапозагстасеае сохраняет способность узнавать стоп кодон иАО, можно предположить, что, скорее всего, включение пирролизина в

полипептид в процессе трансляции мРНК определяется конкуренцией тРНКРу| и фактора терминации трансляции, подобно тому, как это происходит при супрессии нонсенс-мутаций. В случае ранней терминации на UAG кодоне при синтезе пирролизин-содержащего фермента такой нефункциональный полипептид удаляется с помощью клеточных механизмов деградации белков. С другой стороны, риск того, что UAG в конце гена может быть прочитан как значащий кодон, резко уменьшается за счет присутствия дополнительных стоп кодонов UAA и UGA в рамке считывания мРНК на небольшом расстоянии от UAG кодона. Элиминация UAG стоп кодона в ортологичных генах семейства Methanosarcinaceae свидетельствует о постепенной замене функции этого кодона в геномах пиролизин-содержащих архей. Вероятно, эти виды находятся в самом начале пути, ведущего к изменению специфичности их факторов терминации трансляции и эволюции генетического кода.

3. UAR-специфичность фактора терминации трансляции eRFl Euplotes aediculatus определяется аминокислотными остатками области 70-80

Для выявления аминокислотных остатков в eRFl, ответственных за узнавание стоп кодонов, можно использовать несколько методов. Одним из возможных подходов для решения этой проблемы является создание химерных белков, которые содержат различные части eRFl из организмов с универсальным и вариантным генетическими кодами. Этот подход использован нами для поиска детерминант, ответственных за запрет узнавания UGA (UAR-специфичность) в eRFl ресничной инфузории Euplotes, у которой, согласно литературным данным, UGA кодирует цистеин. eRFl человека и Euplotes имеют высокую степень гомологии, однако существующие отличия в аминокислотных последовательностях их N доменов могут отвечать за разную стоп- кодоновую специфичность этих факторов (Рис. 5).

Химерные eRFl с детерминантой(ами) UAR-специфичности, не должны узнавать кодон UGA. Определив наименьший по длине участок аминокислотной последовательности, содержащий такие детерминанты, и разбивая его на более короткие фрагменты, можно идентифицировать аминокислоту или аминокислотный мотив, препятствующий связыванию фактора со стоп кодоном.

В1врЬаг1зта агоелгхсалит В.1арЬаг.1зпга japofi.icu.il В1ер1тг1.зта тиявыЛиа Еир1осез aecl^culatus А Еир1осез ае<Нси1а1и$ В 2ир1осея оссссаг^пасиз А Кир1осея ос£ос&г1па!.из В $су1опусЫа гг.уПИ.

Исто г-:-чрI впз

31ер>1аг1зп}а атехлсалит В1ерЬаг23г1а 1 ароп ±си:п Р1ерЬаг13та .'пиясиХия Еир1осез аесИси!а1и$ А Suplotes аесИси1а'*ия В Еир1сСез ос1осаг1па1из А !1ир1оСез оссосаглпасиз В Зйу1опусЫа туИИз Ното зао1елз

Рис. 5. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей N доменов факторов терминации трансляции еЯР1 ресничных инфузорий (вариантный генетический код) и человека (универсальный генетический код). Нумерация согласно аминокислотной последовательности еЯР1 человека.

3.1. Выбор метода определения активности химерных белков

Ранее доказана ключевая роль "Ы-концевого домена eR.Fl ЕирШез аесЧси1аш$ и ЕирШез оЫосаг'таШь в определении UAR-cпeцифичнocти факторов терминации этих организмов. На основании опытов по химическим сшивкам (с использованием химерных еЯР1) высказано предположение о том, что детерминанты, ответственные за запрет узнавания кодона ийА фактором терминации трансляции ЕирШез (Еи-eRFl), находятся в области с 35-го по 145-й аминокислотный остаток. Кроме того, имеются данные, указывающие на возможное участие в дискриминации стоп кодона ША остатков 60, 61, 78, 127.

Ранее в нашей лаборатории были созданы гибридные конструкции, содержащие N домен еКРI ЕирШеъ аесИсиШия (Eu-eRFl) и МС домены eRFl человека (Hs-eRFl), а также ряд химерных eRFl, содержащих различные комбинации участков N доменов eRFl Е. аесИсиЫш и человека, соединенных с МС доменами eRFl человека. Проведен функциональный анализ этих химерных белков с помощью двойной репортерной системы, использованной ранее для поиска негативных детерминант в eRFl 5'¡у1опусМа. В этой системе измеряли влияние экспрессии экзогенной копии гена на уровень сквозного прочтения в культуре клеток

человека. Для этого эмбриональные клетки почек человека НЕК293 трансфицировали одновременно плазмидой рсОЫАЗ, содержащей ген химерного eRFl, и репортерным вектором рАСэШр. В векторе рАСз1:ор один из трех стоп кодонов располагался между

генами ß -галактозидазы (lacZ) и люциферазы (lue) (Рис. 6). Уровень экспрессии ß-галактозидазы и люциферазы определяли по ферментативной активности. Таким образом, процент сквозного прочтения стоп кодонов является мерой активности экзогенных факторов терминации.

GCC CGG UGU *** GAU AAU UUA (А)

или

Рис. 6. Схема двойной репортерной системы для определения уровня сквозного прочтения в культуре клеток человека. Показаны контексты мРНК, в которые помещен стоп кодон. (А) из мРНК одной из изоформ дистрофина человека (Dp4271); (Б) из гена РНК репликазы вируса табачной мозаики (TMV). Также обозначены стартовый кодон (AUG), промотор вируса SV40 (Psv4o), ген ß -галактозидазы (р-gal) и ген люциферазы (lue).

Ранее с использованием двойной репортерной системы показано, что два участка N домена, 38-50 и 123-145, определяют UAR-специфичность eRFl Е. aediculatus. Однако при определении нами активности химерного белка Еи(38-50/123-145), содержащего участки 38-50 и 123-145 eRFl Е. aediculatus, в двух in vitro системах - тесте Каски и реконструированной системе трансляции эукариот, оказалось, что химерный белок Ей (38-50/123-145) способен эффективно узнавать все три стоп кодона in vitro (Таблица 3).

Возник вопрос: с чем связаны такие расхождения в результатах, полученных in vivo и in vitro'] Для ответа на этот вопрос мы провели дополнительную серию опытов, используя двойную репортерную тест-систему, с той лишь разницей, что стоп кодон был помещён в другой контекст мРНК. Ранее в двойной репортерной системе в опытах с химерными белками Euplotes/чеповек использовали контекст из мРНК одной из изоформ дистрофина человека (Dp4271) - GCC CGG UGU stop GAU AAU UUA (Рис. 6). Однако в работе с химерными конструкциями eRFl Sty ¡onychia/ человек использовали другой контекст, происходящий из гена РНК репликазы вируса табачной мозаики (TMV) - CAA stop CAA UUA (Рис. 6). Поэтому мы проверили влияние экспрессии белка Еи(38-50/123-145) на сквозное прочтение в двойной репортерной системе с контекстом TMV. Оказалось, что для контекста TMV при экспрессии белка Еи(38-50/123-145) не происходит заметного повышения сквозного

прочтения кодона UGA, что коррелирует с результатами опытов in vitro (Таблица 3).

16

Таблица 3.

Функциональная активность химерных eRFl in vitro и in vivo.

Относительное увеличение

сквозного прочтения стоп кодонов in vivo Активность в реконструированной эукариотической системе трансляции (%) Активность в in vitro тесте (%)

eRFl Стоп кодон Контекст из вируса табачной Контекст из мРНК дистрофина

мозаики человека

(TMV) (Dp4271)

UAA 18.9 1.3 22 3

St(l-145) UAG UGA 5.5 1.4 5.3 1.5 1 115 2 87

Мутантный Hs-eRFl UAA UAG 11.2 5.8 2.0 6.1 18 13 2 1

TSL L/QFM F UGA 1.4 2.5 106 80

UAA 1.2 1.4 113 90

Eu(l-145) UAG UGA 3.2 7.0 1.2 26.2 86 22 105 12

Eu(38-50/123-145) UAA UAG 5.0 5.0 2 1 80 95 71 81

UGA 8.7 228 85 55

Значение 100% соответствует активности eRFl Н. sapiens.

Также мы измерили функциональную активность другого химерного eRFl -Eu(l-145), содержащего N домен eRFl Е. aediculatus и МС домены eRFl человека, в системах in vivo и in vitro (Таблица 3). Согласно ранее опубликованным данным, этот белок должен обладать активностью, сходной с eRFl Е. aediculatus, то есть не узнавать UGA стоп кодон. В опытах in vivo с контекстом TMV обнаружены небольшие различия в свкозном прочтении на разных стоп кодонах: на кодонах UAA и UAG уровень сквозного прочтения почти не увеличивался, на кодоне UGA возрастал в 7 раз, тогда как с «дистрофиновым контекстом» наблюдали гораздо более сильное увеличение сквозного прочтения UGA кодона (в 26 раз). В in vitro системах eRFl Eu(l-145) узнавал только кодоны UAA и UAG, то есть имел строгую UAR-специфичность (Таблица 3).

Кроме того, мы определили функциональную активность ранее описанных химерных белков eRFl Stylonychia/человек в разных тест-системах. В опытах in vitro и в двойной репортерной системе с контекстом TMV химерный белок, содержащий N домен eRFl Stylonychia и МС домены eRFl человека, и мутантный Hs-eRFl TSL_L/QFM_F (эти замены соответствуют аминокислотным остаткам eRFl Stylonychia, которые определяют его UGA-специфичность) узнавали только UGA, что

подтвердило ранее полученный результат. Однако в опытах in vivo при использовании «дистрофинового контекста» мы не наблюдали никакого повышения сквозного прочтения стоп кодонов, то есть эти белки обладали специфичностью eRFl из организмов с универсальным генетическим кодом (Таблица 3). Сделан вывод, что двойная репортерная система с «дистрофиновым контекстом» непригодна для определения активности факторов терминации трансляции, Поэтому ранее полученные данные с использованием репортерной системы с дистрофиновым контекстом, свидетельствующие о важности участков 38-50 и 123-145 в определении UAR-специфичности eRFl Е. aediculatus, нельзя считать достоверными. Таким образом, вопрос об идентификации детерминант в белке eRFl Euplotes, запрещающих узнавание UGA кодона, оставался нерешенным.

3.2. Определение участка аминокислотной последовательности eRFl Euplotes, ответственного за запрет узнавания кодона UGA

У Euplotes обнаружено две формы фактора терминации трансляции eRFl (eRFla и eRFlb), которые обладают одинаковой специфичностью в отношении узнавания стоп кодонов, но eRFlb присутствует в клетках в большем количестве. Поэтому мы конструировали химерные белки на основе eRFlb Е. aediculatus.

Для определения активности химерных белков использовали реконструированную систему трансляции эукариот, так как она давала адекватный ответ при тестировании разных факторов терминации (Таблица 3) и, кроме того, позволила преодолеть ограничения, присущие другим методам определения функциональной активности eRFl. В частности, в реконструированной системе, в отличие от репортерной системы, отсутствуют эндогенные eRFl и eRF3, существенно влияющие на результаты тестов.

На первом этапе нами определена функциональная активность eRFl химерного белка Еи(1-145) и человека (контроль). Химерный белок Еи(1-145) эффективно стимулировал гидролиз петидил-тРНК на кодонах UAA и UGA, однако его активность на UGA кодоне существенно снижена, в то время как eRFl человека стимулировал гидролиз пептидил-тРНК на всех трех стоп кодонах (Рис. 7).

На основе полученных кинетических кривых определены значения эффективностей терминации трансляции (kcat/KM) на всех стоп кодонах для химерного белка Еи(1-145) и Hs-eRFl (Рис. 8Б). Для белка Еи(1-145) наблюдали более чем

пятикратное уменьшение эффективности терминации трансляции в сравнении с еЛР1 человека на ЕЮА кодоне. Однако полного подавления узнавания 1ЮА не происходило. Вероятно, пятикратного снижения активности еКП Е. аесИсиШш на 1ГСА кодоне достаточно для эффективной конкуренции супрессорной тРНК с фактором терминации в клетке.

На втором этапе для N домена ЕирШез получены две пары комплементарных конструкций Еи(1-50) и Еи(51-145), а также Еи(1-122) и Еи(123-145) (Рис. 8А). Во всех случаях здесь и далее в скобках указаны участки, принадлежащие еШЧ Еир1о1е$. Белки Еи(1-50) и Еи(123-145) узнавали все три стоп кодона, в то время как белки Еи(51-145) и Еи(1-122) показывали снижение активности на иСА кодоне (Рис. 8Б).

Таким образом, полученные данные указывают на то, что аминокислотные остатки, ответственные за иАЯ-специфичность фактора терминации трансляции ЕирШея, находятся в области между положениями 51 и 122. Для проверки этого предположения определена активность химерного белка Еи(51-125). Оказалось, что он обладает такой же специфичностью, как и белок Еи(51-145) (Рис. 8Б), что подтверждает важность области 51-122 для дискриминации кодона 1ГСЛ.

На третьем этапе область 51-122 была разбита на два участка: с 51 по 80 остаток и с 81 по 122 остаток. Для химерного белка Еи(51-80) активность в отношении кодонов 11АА и 11ЛО, но не 1ГСА, возрастала, а химерный белок Еи(81-122) узнавал все три стоп кодона (Рис. 8Б). Следовательно, детерминанты иАЯ-специфичности eR.Fl ЕирШез расположены в области 51-80.

Эту область мы поделили еще на два фрагмента и получили химерные белки Еи(51-69) и Еи(70-80). Первый из них в функциональном тесте обладал омнипотентной специфичностью, при этом на всех трёх стоп кодонах значения к,;а,/Км возрастали (Рис. 8Б). Аминокислотные последовательности белков Нв-еШ-Т и Еи-еЯП в области 51-59 отличаются тремя заменами и включают консервативный мотив МКв (остатки 61-64) (Рис. 5). Ранее показано, что область 51-69 еКР1 ЕирШев образует сшивки с мРНК, находящейся внутри рибосомы, и аминокислотные остатки 60-61 важны для связывания с рибосомой. Мы предполагаем, что аминокислотные остатки области 51-69 белка Еи-еКР1 ответственны за увеличение сродства еКР1 к рибосоме и, вероятно, не принимают участия в дискриминации кодона 1ГСА.

о ззо «о ею эоо юоо Время, сек

Рис. 7. Гидролиз пептидил-тРНК в присутствии различных еЯР1. Показана доля [З53]-меченого тетрапептида (МУНЬ), высвобождающегося из термннационного комплекса, собранного на мРНК с иАА (А), иАв (Б), ША (В) стоп кодонами как функция времени в присутствии еЯР1 человека (черные круги) и химерных еЯРЬ: Еи(Ы45) (белые круги), Еи(70-80) (черные треугольники) и мутантного eR.Fl человека Б70А (белые треугольники). Фон в отсутствие еЯР1 составляет 3-5% от максимального значения для eR.Fl человека. Значение, равное единице, соответствует максимальному значению гидролиза пептидил-тРНК, индуцируемого еКЛ человека.

А Б в

терминационнаяактивность(ксщКм, а :М )

Рис.8. Химерные белки eRFl, содержащие N-концевой домен eRFl Е. aediculatus [Eu(l-145)] полностью или комбинации различных участков аминокислотной последовательности N доменов eRFl Euplotes и человека (А). М и С домены во всех химерных белках соответствовали аминокислотной последовательности Hs-eRFl (позиции 146-437). Области, соответствующие eRFl Е. aediculatus и eRFl человека, обозначены соответственно серым и белым цветами. Нумерация аминокислотных остатков во всех конструкциях соответствует аминокислотной последовательности eRFl человека. Терминационная активность белков eRFl in vitro в реконструированной эукариотической системе трансляции на кодонах UAA, UAG и UGA в отсутствие (Б) или в присутствии (В) eRF3-GTP человека. Значения коа,/Км использованы как показатели терминационной активности белков.

Химерный белок Eu(70-80) сохраняет способность эффективно узнавать кодоны UAA и UAG, но его активность на кодоне UGA значительно снижена (Рис. 7 и 8Б). Таким образом, область, ответственная за запрет узнавания UGA стоп кодона eRFl Е. aediculatus, локализована в районе остатков 70-80.

Дальнейшая работа по мутагенезу Hs-eRFl, проведенная в нашей лаборатории, показала, что одиночная замена остатка серина 70 на аланин достаточна для того, чтобы Hs-eRFl перестал узнавать UGA кодон (Рис. 7) и из омнипотентного превратился в бипотентный.

3.3. Узнавание кодона UGA химерными eRFl EuplotesMenoeeK в присутствии eRF3.

Терминация трансляции в клетках эукариот осуществляется в результате кооперативного действия двух белковых факторов - eRFl и eRF3, взаимодействующих между собой. Мы исследовали влияние eRF3 человека на функциональную активность химерных eRFl EuplotesMenoneK. Определены значения эффективностей терминации трансляции (kcat/KM) в присутствии eRF3-GTP для шести химерных белков eRFl, которые обладали UAR-специфичностью.

В присутствии eRF3-GTP для всех исследованных химерных eRFl значения kca/Км возрастали на два порядка на UAA и UAG стоп кодонах, в то время как на UGA стоп кодоне только на порядок (Рис. 8В). То есть, в присутствии eRF3 химерные eRFl хуже узнают UGA стоп кодон по сравнению с UAA и UAG. Вероятно, коррекция фактором eRF3 узнавания UGA связана с увеличением сродства фактора к рибосоме и нивелированием мелких структурных несоответствий при распознавании стоп кодонов. Мы не наблюдали увеличения значений к^/Км для химерных белков Еи(51-145) и Еи(51-80) на UAA и UAG кодонах по сравнению с Hs-eRFl при добавлении eRF3 (Рис. 8В). По-видимому, увеличение значений эффективности терминации трансляции на два порядка компенсирует различия в сродстве химерных eRFl к рибосоме.

Поскольку химерный белок Еи(70-80) в присутствии eRF3-GTP обладал омнипотентной специфичностью, а химерный белок Еи(51-80) с минимальным участком eRFl Euplotes - UAR-специфичностью (Рис. 8В), возможно, что в области 51-70 Eu-eRFl имеются дополнительные детерминанты, способствующие запрету узнавания UGA кодона.

4. Фактор терминации трансляции eRFl Blepharisma japonicum узнает все три стоп кодона

Ресничные инфузории рода Blepharisma используют кодон UAA как терминирующий. Поскольку ген eRFl В. americanum содержит в открытой рамке считывания два UGA кодона, кодирующих триптофан, ранее высказано предположение о том, что Blepharisma обладает вариантным генетическим кодом той же специфичности что Euplotes (UAR-специфичность eRFl). При этом у Blepharisma UGA кодирует триптофан, а не цистеин как у Euplotes. Однако в открытой рамке считывания генов eRFl В. japonicum и В. musculus UGA кодона не обнаружено, у этих видов в соответствующих положениях находится триптофановый кодон UGG.

К настоящему моменту мало известно об использовании кодонов UAA, UAG и UGA в геномах представителей рода Blepharisma. В геноме В. americanum секвенирован единственный ген - eRFl, а у всех видов рода Blepharisma определена нуклеотидная последовательность не более 50 генов, кодирующих белки (из них 25 у В. japonicum). Все известные рамки считывания в геномах Blepharisma заканчиваются исключительно кодоном UAA (согласно данным базы NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov).

Сравнение аминокислотных последовательностей N доменов eRFl Euplotes и Blepharisma, ответственных за узнавание стоп кодонов, показало, что между ними имеются значительные различия (Рис. 5). Однако область 70-80 в eRFl Euplotes и Blepharisma различается лишь несколькими аминокислотными остатками. Так как именно эта область, согласно нашим данным, отвечает за запрет узнавания кодона UGA белком eRFl Euplotes, мы предположили, что eRFl Blepharisma, вероятно, также способен эффективно узнавать кодоны UAA и UAG, но не UGA.

Эффективность узнавания стоп кодонов белком eRFl В. japonicum (Bj-eRFl) определяли в двух тест-системах - in vivo и in vitro. Ген eRFl В. japonicum амплифицировали, клонировали и экспрессировали в плазмиде pRSETC. Функциональную активность Bj-eRFl определяли in vitro - в реконструированной системе трансляции эукариот и in vivo - в двойной репортерной системе с использованием контекста TMV (Рис. 9, Таблица 4). Из рисунка 9Б-Г видно, что Bj-eRFl индуцирует гидролиз пептидил-тРНК в системе in vitro в присутствии всех трех стоп кодонов, хотя его активность заметно ниже, чем у eRFl человека. В присутствии стоп кодонов UAA и UAG активность Bj-eRFl составила 50-60%, а в присутствии

UGA - 35% от активности eRFl человека (Рис. 9, Таблица 4).

22

Таблица 4.

Функциональная активность eRFl В. japonicum и химерного белка BjN-eRFl in vitro и in vivo.

eRFl Стоп кодон Относительное увеличение (уменьшение) сквозного прочтения стоп кодонов in vivo Активность в реконструированной эукариотической системе трансляции (%)

UAA 4 60

Bj-eRFl UAG 3.5 50

UGA 4.6 35

BjN-eRFl UAA UAG UGA (1.5) 1.4 1.7 110 100 65

Значение 100% соответствует активности eRFl Н. sapiens.

• Hs-eRFI о Bj-eRF1

0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 600 1000

Время, с Время, с

Рис. 9. Измерение функциональной активности eRFl Blepharisma japonicum in vivo (А) и in vitro (Б, В, Г). А - Относительное изменение уровня сквозного прочтения каждого из трех стоп кодонов, измеренного в клетках, трансфицированных плазмидами, несущими гены eRFl Homo sapiens (pcDNA3-Hs-eRF 1), В. japonicum (pcDNA3-Bj-eRFl) или химерного белка BjN-eRFl (pcDNA3-BjN-eRFl). За 1 принимали уровень сквозного прочтения в случае трансфекции клеток исходной плазмидой pcDNA3. Б - Г - Уровень гидролиза пептидил-тРНК в присутствии белков eRFl. Количество меченого [ь5]-тетрапептида, высвободившегося из терминационных комплексов со стоп кодонами UAA (Б), UAG (В) и UGA (Г) в присутствии eRFl человека (•) и eRFl В. japonicum (о). Значение 1 соответствует максимальному количеству высвободившегося меченого пептида в присутствии eRFl человека. Фоновое значение количества высвободившегося тетрапептида в отсутствие факторов терминации составляло 3-5%> от максимального значения для eRFl человека

200 400 600

Время, с

pcDNA3-Hs-eRF1

pcDNA3-B¡N-eRF1

-2-1012345 Изменение эффективности сквозного прочтения, раз

Кроме того, по аналогии с подходом, примененным при изучении функциональной активности Eu-eRFl, нами создана генетическая конструкция для синтеза in vitro химерного белка BjN-eRFl, состоящего из N домена eRFl В. japonicum и МС доменов eRFl человека. Активность в системе in vitro химерного белка BjN-eRFl, выделенного и очищенного аналогично Bj-eRFl, составила 110, 100 и 65% относительно активности eRFl человека в присутствии стоп кодонов UAA, UAG и UGA соответственно (Таблица 4). Мы предполагаем, что снижение активности полноразмерного Bj-eRFl по сравнению с активностью eRFl человека и BjN-eRFl в отношении всех трех стоп кодонов связано с низким сродством eRFl инфузории Blepharisma к рибосомам млекопитающего (кролика), использованным в реконструированной эукариотической системе.

В системе in vivo измеряли влияние экспрессии гена Bj-eRFl на уровень сквозного прочтения в культуре клеток человека. Уровень сквозного прочтения в контрольных опытах составил 0.3, 1.7 и 0.7% для pcDNA3 и 0.3, 2.0 и 0.8% для pcDNA3-Hs-eRFl в присутствии UAA, UAG и UGA соответственно (Рис. 9А).

При экспрессии Bj-eRFl в клетках человека обнаружено примерно одинаковое

увеличение уровня сквозного прочтения на всех трех стоп кодонах: 1.3% (увеличение

в 4 раза) на UAA, 7.1% (увеличение в 3.5 раза) на UAG и 4.6% (увеличение в 4.6 раза)

на UGA (Рис. 9А). Вероятно, наблюдаемое в опытах in vivo увеличение уровня

сквозного прочтения всех стоп кодонов можно объяснить тем, что eRFl В. japonicum,

с одной стороны, конкурирует за узнавание стоп кодонов с эндогенным eRFl, а с

другой, не способен эффективно связываться с eRF3 человека. Действительно, в

первичных структурах С-концевых доменов eRFl Blepharisma и человека,

ответственных за связывание с eRF3, имеются значительные различия. Таким

образом, экспрессия eRFl В. japonicum в клетках человека снижает эффективность

работы эндогенных факторов терминации и увеличивает вероятность узнавания стоп

кодонов супрессорными тРНК. В случае химерного белка BjN-eRFl, содержащего

С домен eRFl человека и поэтому способного связываться с eRF3 человека, уровень

сквозного прочтения составил 0.2% (уменьшение в 1.5 раза) на UAA, 2.8%

(увеличение в 1.4 раза) на UAG и 1.4% (увеличение в 1.7 раза) на UGA (Рис. 9А).

Таким образом, BjN-eRFl не вызывает увеличения эффективности сквозного

прочтения на всех трех стоп кодонах, что подтверждает предположение о том, что

одинаковое увеличение уровня сквозного прочтения на всех трех стоп кодонах в

24

клетках человека в случае Bj-eRFl может быть обусловлено сниженной эффективностью связывания Bj-eRFl с eRF3 человека.

Сделан вывод, что Bj-eRFl способен узнавать все три стоп кодона как in vivo, так и in vitro, но при этом узнавание UGA in vitro несколько снижено по сравнению с UAA и UAG, но не так существенно, как в случае Eu-eRFl. Следовательно, Bj-eRFl в отличие от eRFl ресничных инфузорий 5. mytilis и Е. aediculatus с вариантным генетическим кодом, обладает универсальной специфичностью. Поскольку группа Heterotrichea, к которой относится В. japonicum, находится на самой ранней ветви филогенетического древа типа Ciliata, можно предположить, что В. japonicum обладает универсальным генетическим кодом, как и возможный общий предок всех ресничных инфузорий. Сравнение N доменов eRFl трех видов Blepharisma показывает их полную идентичность на уровне аминокислотной последовательности (Рис. 5). Вероятно, факторы терминации трансляции первого класса этих трёх видов рода Blepharisma обладают сходной специфичностью в отношении узнавания стоп кодонов, так как за узнавание отвечает именно N домен белка eRFl.

выводы

1. Факторы терминации трансляции архей aRFl Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis способны узнавать все три стоп кодона и индуцировать гидролиз пептидил-тРНК in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот, что говорит о близости механизмов декодирования стоп кодонов у эукариот и архей.

2. Одна из двух форм aRFl Methanosarcina barkeri, aRFl-1 активна в терминации трансляции и узнает все три стоп кодона, а вторая форма, aRFl-2 потеряла функциональную активность.

3. В eRFl Euplotes aediculatus в районе аминокислотных остатков 70-80 локализована детерминанта, ответственная за запрет узнавания UGA стоп кодона.

4. Фактор терминации трансляции eRFl Blepharisma japonicum способен узнавать все три стоп кодона in vivo и in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Alkalaeva Е„ Eliseev В.. Ambrogelly A., Vlasov P., Kondrashov F.A., Gundllapalli S., Frolova L., Soil D., Kisselev L. (2009) Translation termination in pyrrolysine-utilizing archaea. FEBSLett., 583(21), 3455-60.

2. Eliseev B„ Kryuchkova P., Alkalaeva E., Frolova L. (2011) A single amino acid change of translation termination factor eRFl switches between bipotent and omnipotent stop-codon specificity. Nucleic Acids Res., 39(2), 599-608.

3. Елисеев Б.Д., Алкалаева E.3., Крючкова П.Н., Лекомцев С.А., Wei Wang, Ai-hua Liang, Фролова Л.Ю. (2011) Фактор терминации трансляции eRFl ресничных инфузорий Blepharisma japonicum узнает все три стоп-кодона Молекулярная Биология, 45 (4), 668-672.

Заказ № 288-1/09/2011 Подписано в печать 07.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 (^0) www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Елисеев, Борис Дмитриевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Терминация трансляции у бактерий.

2. Терминация трансляции у эукариот.

2.1. Общая модель терминации трансляции в эукариотических клетках.

2.2. Фактор терминации трансляции первого класса эукариот (еШа).

2.2.1. еКР1: общие сведения.

2.2.2. Структурная организация еКР1 и её связь с функцией .белка.

2.2.3. Поиск участков белка еКБ1, вовлеченных в узнавание стоп кодонов.

2.3. Фактор терминации второго класса эукариот (еКБЗ).

3. Терминация трансляции у архей.

4. Вариантные генетические коды.

4.1. Организмы с вариантным генетическим кодом.

4.2. Эволюция генетического кода.

4.3. Ресничные - группа эукариот с максимальным разнообразием генетических кодов.

4.4. Факторы терминации трансляции вИШ ресничных инфузорий.

4.5. Археи с вариантным генетическим кодом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность факторов терминации трансляции из организмов с вариантными генетическими кодами"

В организмах с универсальным генетическим кодом 61 смысловой кодон используется для кодирования 20 природных аминокислот, а три стоп кодона - UAA, UAG и UGA служат сигналами для остановки белкового синтеза. Однако в большом числе организмов обнаружены отклонения от универсального генетического кода. Многие организмы с вариантными генетическими кодами используют один или два стандартных стоп кодона в качестве смысловых. Например, археи семейства Methanosarcinaceae используют UAG для кодирования особой 22-ой аминокислоты -пирролизина. У многих ресничных инфузорий (таких как Stylonychia, Tetrahymena, Paramecium и др.) кодоны UAA и UAG не служат для терминации трансляции, а кодируют глутамин, а у представителей^ рода Enplotes кодон UGA кодирует цистеин.

Ключевую роль в процессе терминации белкового синтеза играют факторы терминации трансляции, которые подразделяются, на два класса (Kisselev et al., 2003). У эукариот фактор терминации 1-го класса eRFl принимает участие в узнавании стоп кодонов и в.гидролизе пептидил-тРНК. Фактор терминации 2-го класса eRF3 связывается в рибосоме с фактором терминации 1-го класса и является eRFl- и рибосомо-зависимой ГТФазой. У архей обнаружены только факторы терминации 1-го- класса aRFl, гомологичные eRFl" эукариот; вероятно, функцию фактора терминации» 2-го класса выполняет фактор элонгации aEFla (Saito et al., 2010). Известны t пространственные структуры aRFl археи Aeropyrum pernix, eRFl человека и дрожжей (Cheng et all, 2009; Saito et al.,.2010; Song et al., 2000). Согласно данным рентгеноструктурного анализа, eRFl и aRFl состоят из трех доменов - N, М< и С, каждый из которых выполняет определенную функцию: N домен ответствен за узнавание стоп кодона, М домен индуцирует гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, а М и С домены ответственны за связывание с eRF3/aEFla.

До сих пор детально не определены структурные элементы доменов еШ^, отвечающие за выполнение той или иной функции белка, хотя некоторые предварительные гипотезы в литературе были высказаны. В. течение последних десяти лет предприняты многочисленные попытки для решения проблемы декодирования- стоп сигналов фактором терминации 1-го класса в рибосоме. Сайты узнавания стоп кодонов у бактериальных факторов терминации трансляции 1-го класса определены с использованием точечного мутагенеза и рентгеноструктурного анализа (КогоБ1е1еу а1., 2008; ЬаигЬе^ е1 а1., 2008; ЛУе1х1Ьаитег е1 а1., 2008), однако для факторов терминации эукариот и архей это до сих пор не удалось.

Было установлено, что факторы терминации трансляции еКР1 из некоторых ресничных инфузорий с вариантным генетическим кодом, несмотря на высокую степень гомологии с белками еКР1 из других эукариот, проявляют би-/унипотентность при узнавании стоп кодонов< в мРНК (КегуеБЙп & а1., 2001; ЬекоггИ^еу et а1., 2007). Идентификация аминокислотных остатков, определяющих специфичность узнавания* стоп кодонов, факторами терминации трансляции из организмов* с вариантным генетическим кодом, может помочь в выяснении механизма узнавания стоп кодонов в организмах с универсальным кодом.

Основной целью данной работы являлось определение специфичности в отношении стоп кодонов факторов терминации трансляции 1-го класса из трех групп организмов с вариантными генетическими кодами'и последующая идентификация аминокислотных остатков, определяющих декодирующие свойства этих белков. В качестве объектов исследования* были выбраны факторы аКР1 архей семейства МеШапозагстасеае и еШ^ ресничных инфузорий родов ЕирЫея и ШеркапБта. Согласно литературным данным, первая группа использует стоп кодон иАО для кодирования пирролизина, а вторая - стоп кодон 1ЮА для кодирования цистеина или триптофана (Лекомцев, 2007). В ходе исследования сформулированы следующие задачи: 1) клонировать гены и выделить факторы терминации аШ7! пирролизинсодержащих архей, а также aRFl архей с универсальным генетическим кодом; охарактеризовать и сравнить их функциональную активность на разных стоп кодонах в in vitro реконструированной системе трансляции; 2) получить химерные белки, содержащие различные участки N домена eRFl Euplotes и человека, и определить их специфичность в отношении узнавания стоп кодонов; 3) клонировать ген и выделить фактор терминации трансляции eRFl Blepharisma, а также химерный белок, содержащий N домен eRFl Blepharisma и МС домены eRFl человека, и исследовать функциональную активность этих факторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Елисеев, Борис Дмитриевич

выводы

1. Факторы терминации трансляции архей aRFl Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis способны узнавать все три стоп кодона и индуцировать гидролиз пептидил-тРНК in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот, что говорит о близости механизмов декодирования стоп кодонов у эукариот и архей.

2. Одна из двух форм aRFl Methanosarcina barkeri, aRFl-1 активна в терминации трансляции и узнает все три стоп кодона, а вторая форма, aRFl-2 потеряла функциональную активность.

3. В eRFl Euplotes aediculatus в районе аминокислотных остатков 70-80 локализована детерминанта, ответственная за запрет узнавания UGA стоп кодона.

4. Фактор терминации трансляции eRFl Blepharisma japonicum способен узнавать все три стоп кодона in vivo и in vitro.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я испытываю глубокую благодарность и признательность Людмиле Юрьевне Фроловой за' постоянное внимание к работе, моральную и интеллектуальную поддержку, и Елене Зиновьевне Алкалаевой за неоценимую помощь в проведении экспериментальной работы, конструктивную критику и плодотворное обсуждение полученных результатов.

Очень признателен моим коллегам Полине Крючковой из нашей лаборатории и Петру Власову из лаборатории компьютерного и структурного анализа биополимеров, внесшим* большой вклад в представленную работу.

Хочу поблагодарить Федора Кондрашова (Группа эволюционной геномики, Centre de Regulacio Genomica, Барселона; Испания) за помощь в биоинформатическом анализе геномов архей и* Ольгу Кузьмину (ИТЦ «Биологически активные соединения и их применение»'РАН) за помощь в работе над-манускриптом.

Благодарю, сотрудников нашей лаборатории Тамару Дмитриевну Машкову и Ольгу Леонидовну Зиновьеву, помогавших проведению работы.

Отдельная благодарность в адрес Андрея Борисовича Полтарауса и сотрудников ЦКП «Геном» за проведение секвенирования всех образцов ДНК.

Искренне признателен Георгию Михайловичу Гонгадзе и Марине Борисовне Гарбер из лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН за создание теоретических и экспериментальных основ во время моего обучения в Учебном Центре Института белка РАН без которых я не смог бы выполнить эту работу.

3. Заключение

Функциональный анализ белковых химер между N доменами факторов терминации eRFl Euplotes и человека с использованием реконструированной in vitro системы трансляции эукариот позволил локализовать аминокислотные остатки, ответственные за запрет узнавания кодона UGA eRFl Euplotes в области 70-80 (нумерация согласно eRFl человека). Эти результаты, вместе с ранее полученными-данными для eRFl Stylonychia и Paramecium (Lekomtsev et al., 2007), очень важны для выяснения механизма узнавания стоп кодонов факторами терминации трансляции eRFl/aRFl. Кроме того, была определена специфичность узнавания стоп кодонов белком eRFl ресничной инфузории Blepharisma japonicum in vitro и in vivo, для которой подобно Euplotes предполагалось использование UGA в качестве значащего кодона (Lozupone et al., 2001). Установлено, что данный белок способен узнавать все три стоп кодона.

Продемонстрировано, что факторы терминации трансляции архей aRFl способны, узнавать стоп кодоны и индуцировать гидролиз пептидил-тРНК in vitro в реконструированной системе трансляции эукариот, что свидетельствует о сходстве механизмов,декодирования стоп кодонов у архей и эукариот. Впервые исследована функциональная активность- aRFl пирролизин-содержащих архей, позволяющая предложить механизм включения пирролизина в синтезируемый полипептид.

Результаты данной, работы несомненно важны как для понимания механизма терминации трансляции, в частности молекулярного механизма декодирования стоп-кодонов фактором терминации eRFl, так и для создания теоретической и экспериментальной базы данных РНК-белковых взаимодействий. Кроме того, полученные в данной работе результаты могут быть использованы для разработки методов селективного мечения белков неприродными аминокислотами путем котрансляционного встраивания искусственных аминокислотных остатков (например, флуоресцентно меченных). Данный подход включает использование супрессорной тРНК, несущей меченую аминокислоту, введение стоп кодона в кодирующую последовательность белка и замену универсального (омнипотентного) фактора терминации еЯР1 на уни- или бипотентный, узнающий один или два стоп кодона соответственно. Это позволяет синтезировать рекомбинантные белки, несущие разнообразные функциональные группы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елисеев, Борис Дмитриевич, Москва

1. Иванова, Е.В., Алкалаева, Е.З., Бирсдал, Б., Колосов, П.М., Полынаков, В.И. и Киселев, JT.JI. (2008). Интерфейс взаимодействия центрального домена фактора терминации трансляции eRFl человека с рибосомами эукариот. Молекулярная биология 42, 1056-1066.

2. Лекомцев, С.А. (2007). Вариантные генетические коды, и терминация трансляции. Молекулярная биология 41, 964-972.

3. Лекомцев; С.А., Колосов, П.М., Фролова, Л:Ю., Биду, Л., Руссе, Ж.-П. и Киселев, Л.Л. (2007). Как фактор терминации терминации трансляции eRFl ресничных рода EuplotesHe узнает стоп-кодон UGA. Молекулярная биология >41, 1014-1022.

4. Якобсен, Ш.П, Сегаард, Т.М.М., Жан-Жан, О., Фролова, Л., and Юстесен, Ю. (2001). Идентификация нового фактора терминации трансляции eRF3b, обладающего in vitro и in vivo активностью eRF3. Молекулярная биология 35, 672-681.

5. Ambrogelly, A., Palioura, S., and Soll, D. (2007). Natural expansion of the genetic code. Nat Chem Biol 3, 29-35.

6. Andachi, Y., Yamao, F., Muto, A., and Osawa, S. (1989). Codon recognition patterns as deduced from sequences of the complete set of transfer RNA species in Mycoplasma capricolum. Resemblance to mitochondria. J Mol Biol 209, 37-54.

7. Askarian-Amiri, M.E., Pel, H.J., Guevremont, D., McCaughan, K.K., Poole, E.S., Sumpter, V.G., and Tate, W.P. (2000). Functional characterization of yeast mitochondrial release factor 1. J Biol Chem 275, 17241-17248.

8. Bidou,L., Hatin; L, Perez; N:, Allämandj.V.j.Panthier, ^2004): Premature;stop codonsinvolvedlin muscular dystrophiesjshowa broadi spectrum? of readthrough efficiencies in response to gentamicin treatment. Gene Ther 77, 619-627.

9. Bidou, L., Stahl, G., Hatin, I., Namy, O:, Rousset, J.P., and Farabaugh, P.J., (2000). Nonsense-mediated decay mutants do not affect programmed -1 frameshifting. RNA 6, 952-961.

10. Birnboim, H.G., and Doly, J. (1979)1 A rapidialkaline extraction procedure for screening recombinant:plasmid?I)NAi Nucleic'Acids Resv7,' 1513-1523:

11. Blighty S.K., Larue, R.Ci, Mahapatra, A., Longstaff, D.G., Chang, E., Zhao, G:,. Rang, PIT., Green-Ghurch; K.B;, €Kaii;.M-;K., andi Krzycki, J!A. (2004)l-Direct: charging'of tRNA(CUA) with pyrrolysine in vitro and1 in vivo. Nature 431,333-335. •

12. Bock, A., Forchhammer, K., Heider, J., Leinfelder, W., Sawers, G., Veprek, B^, and Zinoni; F. (1991); Selenocysteine: the 21st amino acid: MolMicrobiol 5,515-520;

13. Brinkmann, U., Mattes, R.E., and Buckel, P. (1989). High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 55, 109-114.

14. Burke, S.A., Lo, S.L., and Krzycki, J.A. (1998). Clustered genes encoding the methyltransferases of methanogenesis from monomethylamine. J Bacteriol 180, 3432-3440.

15. Caron, F., and Meyer, E. (1985). Does Paramecium primaurelia use a different genetic code in its macronucleus? Nature 314, 185-188.

16. Chapman, B., and Brown, C. (2004). Translation termination in Arabidopsisithaliana: characterisation of three versions of release factor 1. Gene 341, 219225.

17. Chavatte, L., Frolova, L., Kisselev, L., and Favre, A. (2001). The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur J Biochem 268, 2896-2904.

18. Chavatte, L., Frolova, L., Laugaa, P., Kisselev, L., and Favre, A. (2003a). Stop codons and UGG promote efficient binding of the polypeptide release factor eRFl to the ribosomal A site. J Mol Biol 331, 745-758.

19. Chavatte, L., Kervestin, S., Favre, A., and Jean-Jean, O. (2003b). Stop codon selection in eukaryotic translation termination: comparison of the discriminating potential between human and ciliate eRFls. EMBO J 22, 16441653.

20. Chavatte, L., Seit-Nebi, A., Dubovaya, V., and Favre, A. (2002). The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. Embo J 21, 5302-5311.

21. Cheng, Z., Saito, K., Pisarev, A.V., Wada, M., Pisareva, V.P., Pestova, T.V., Gajda, M., Round, A., Kong, G., Lim, M., et al. (2009). Structural insights into eRF3 and stop codon recognition by eRFl. Genes Dev 23, 1106-1118.

22. Cohen, J., and Adoutte, A. (1995). Why does the genetic code deviate so easily in ciliates? Biol Cell 85, 105-108.

23. Crick, F.H. (1968). The origin of the genetic code. J Mol Biol 38, 367-379'.

24. Cupples, C.G., and Pearlman, R.E. (1986). Isolation and characterization of the actin gene from Tetrahymena thermophila. Proc Natl Acad Sci U St A 83, 5160-5164.

25. Dincbas-Renqvist, V., Engstrom, A., Mora, L., Heurgue-Hamard, V., Buckingham, R., and Ehrenberg, M. (2000). A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J 19, 6900-6907.

26. Dontsova, M., Frolova, L., Vassilieva, J., Piendl, W., Kisselev, L., and Garber, M. (2000). Translation termination factor aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes. FEBS Lett 472, 213-216.

27. Fourmy, D., Guittet, E., and Yoshizawa, S. (2002). Structure of prokaryotic SECIS mRNA hairpin and its interaction with elongation factor SelB. J Mol Biol 324, 137-150.

28. Frolova, L., Goff, X.L., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M., and Kisselev, L. (1996). Eucaryotic polypeptide chain-release factor eRF3 is a eRFl and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA»2, 334-341.

29. Frolova, L., Seit-Nebi, A., and Kisselev, L. (2002). Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8, 129-136.

30. Frolova, L.Y., Merkulova, T.I., and Kisselev, t.L. (2000). Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor. eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6, 381-390.

31. Gaston, M.A., Zhang, L., Green-Church, K.B., and Krzycki, J.A. (2011). The complete biosynthesis of the genetically encoded amino acid pyrrolysine from lysine. Nature 471, 647-650.

32. Hansen^ L.L., Jakobsen; C.G., and Justesen, J1 (1999): Assignment of the human trenslation termination fectoiv 1 (ETF1) to 5q31.1 and of the: proximal marker D5S1995 by radiation hybrid mapping. Cytogcnet Cell Genet 87.

33. Hao, B., Gong, W., Ferguson, T.K., James, C.M., Krzycki, J.A., and Chan, M.K. (2002). A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase; Science 296, 1462-1466.

34. Hauryliuk, V., Zavialov, A., Kisselev, L., and Ehrenberg, M. (2006). Class-1 release factor eRFl promotes GTP binding by class-2 release factor eRF3. Biochimie 88, 747-757.

35. Helftenbein, E. (1985). Nucleotide sequence of a macronuclear DNA molecule coding for alpha-tubulin from the ciliate Stylonychia lemnae. Special codon usage: TAA is not a translation-termination codon. Nucleic Acids Res 13, 415-433.

36. Herrick, G., Hunter, D., Williams, K., and' Kotter, K. (1987). Alternative processing during development of a macronuclear chromosome family in Oxytricha fallax. Genes.Dev 1, 1047-1058.

37. Hoffman, G.R., Nassar, N., and Cerione, R.A. (2000). Structure of the Rho family GTP-binding protein Cdc42 in complex with the multifunctional regulator RhoGDI. GqM IOO, 345-356.

38. Hoshino, S.-i., Imai, M., Kobayashi, T., Uchida, N., and Katada, T. (1999). The Eukary otic-Polypeptide Chain Releasing Factor (eRF3/GSPT) Carrying the Translation Termination Signal to the 3'-Poly(A) Tail of mRNA. J Biol Chem 274, 16677-16680.

39. Ibba, M:, and Soli, D. (2004). Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev 18, 731-738.

40. Inagaki, Y., Bessho, Y., Hon, H., and Osawa, S. (1996). Cloning of the Mycoplasma capricolum gene encoding peptide-chain release factor. Gene 169, 101-103.

41. Inagaki, Y., Bessho, Y., and Osawa, S. (1993). Lack of peptide-release activity responding to codon UGA in Mycoplasma capricolum. Nucleic Acids Res 21, 1335-1338.

42. Inagaki, Y., Blouin, C., Doolittle, W.F., and Roger, A.J. (2002). Convergence and constraint in eukaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucleic Acids Res 30, 532-544.

43. Inagaki, Y., and Doolittle, W.F. (2001). Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucleic Acids Res 29, 921-927.

44. Ito, K., Uno, M., and Nakamura, Y. (2000). A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680-684.

45. Jahn, C.L., Erbeznik, M., Jaraczewski, J.W., Melek, M., and* Shippen; D.E. (1994). Sequence of the macronuclear DNA encoding large subunit ribosomal protein 29 (L29) in Euplotes crassus and cycloheximide sensitivity. Gene 151, 231-235.

46. James, C.M., Ferguson, T.K., Leykam, J.F., and Krzycki, J.A. (2001). The amber codon in the gene encoding the monomethylamine methyltransferase isolated from Methanosarcina barkeri is translated as a sense codon. J Biol Chem 276, 34252-34258.

47. Jukes, T.H., and Osawa, S. (1990). The genetic code in mitochondria and chloroplasts. Experientia 46, 1117-1126.

48. Kervestin, S., Frolova, L., Kisselev, L., and Jean-Jean, O. (2001). Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor does not respond to reassigned UGA codon. EMBO Rep 2, 680-684.

49. Kim, O.T., Sakurai, A., Saito, K., Ito, K., Ikehara, K., and Harumoto, T. (2008). Ciliates use both variant and universal genetic codes: evidence of omnipotent eRFls in the class Litostomatea. Gene 417, 51-58.

50. Kisselev, L., Ehrenberg, M., and Frolova, L. (2003). Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and- release factors? The EMBO Journal 33, 175-182.

51. Kisselev, L.L., and Buckingham, R.H. (2000). Translational termination comes of age. TIBS 25, 561-566.

52. Knight, R.D., Freeland, S.J., and* Landweber, L.F. (2001). Rewiring the keyboard: evolvability of the genetic code. Nat Rev Genet 2, 49-58.

53. Knight, R.D., and Landweber, L.F. (2000). The early evolution of the genetic code. Cell 101, 569-572.

54. Kong, C., Ito, K., Walsh, M.A., Wada, M., Liu, Y., Kumar, S., Barford, D., Nakamura, Y., and Song, H. (2004). Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Molecular Cell 14, 233-245.

55. Kononenko, A.V., Mitkevich, V.A., Dubovaya, V.I., Kolosov, P.M., Makarov, A.A., and Kisselev, L.L. (2008). Role of the individual domains of translation termination factor eRFl in GTP binding to eRF3. Proteins 70, 388-393.

56. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

57. Laurberg, M., Asahara, Hi, Korostelev, A., Zhu, J., Trakhanov, S., and Noller, H.F. (2008). Structural basis for translation termination, on the 70S ribosome. Nature 454, 852-857.

58. Lee, C.C., Timms, K.M., Trotman, C.N., and Tate, W.P. (1987). Isolation of a rat mitochondrial release factor. Accommodation^ of the changed genetic code for termination. J BiolChem 262, 3548-3552.

59. Lekomtsev, S., Kolosov, P., Bidou, L., Frolova, L., Rousset, J.P., and Kisselev, L. (2007). Different modes of stop codon restriction by the Stylonychia and-Paramecium eRFl translation termination factors. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 10824-10829;

60. Liang, A., Brunen-Nieweler, C., Muramatsu, T., Kuchino, Y., Beier, H., and Heckmann, K. (2001). The ciliate Euplotes octocarinatus expresses two polypeptide release factors of the type eRFl. Gene 262, 161-168.

61. Liang, A., and Heckmann, K. (1993). Blepharisma uses UAA as a termination codon. Naturwissenschaften 80, 225-226.

62. Liang, H., Wong, J.Y., Bao, Q., Cavalcanti, A.R., and Landweber, L.F. (2005). Decoding the decoding region: analysis of eukaryotic release factor (eRFl) stop codon-binding residues. J Mol Evol 60, 337-344.

63. Longstaff, D.G., Blight, S.K., Zhang, L., Green-Church, K.B., and Krzycki, J.A. (2007). In vivo contextual requirements for UAG translation as pyrrolysine. Mol Microbiol 63, 229-241.

64. Lozupone, C.A., Knight, R.D., and Landweber, L.F. (2001). The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol ii, 65-74.

65. Mahapatra, A., Patel, A., Soares, J.A., Larue, R.C., Zhang, J.K., Metcalf, W.W., and Krzycki, J.A. (2006). Characterization of a Methanosarcina acetivorans mutant unable to translate UAG as pyrrolysine. Mol Microbiol 59, 56-66.

66. Mandel, M., and Higa, A. (1970). Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol 53, 159-162.

67. Meyer, E., Caron, F., and Guiard, B. (1984). Blocking of in vitro translation of Paramecium messenger RNAs is due to messenger RNA primary structure. Biochimie 66, 403-412.

68. Meyer, F., Schmidt, H.J., Plumper, E., Hasilik, A., Mersmann, G., Meyer, H.E., Engstrom, A., and Heckmann, K. (1991). UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Euplotes octocarinatus. Proc Natl' Acad Sci USA 88, 3758-3761.

69. Mikuni, O., Ito, K., Moffat, J., Matsumura, K., McCaughan, K., Nobukuni, T., Tate, W., and Nakamura, Y. (1994). Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci US A 91, 5798-5802.

70. Miranda, I., Silva, R., and Santos, M.A. (2006). Evolution of the genetic code in yeasts. Yeast 23, 203-213.

71. Muramatsu, Т., Heckmann, K., Kitanaka, C., and Kuchino, Y. (2001). Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons. FEBS Lett 488, 105-109.

72. Nakamura, Y., Ito, K., and Ehrenberg, M. (2000). Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101, 349-352.

73. Namy, O., Rousset, J.P., Napthine, S., and Brierley, I. (2004). Reprogrammed genetic decoding in cellular gene expression. Mol Cell 13, 157-168.

74. Namy, O., Zhou, Y., Gundllapalli, S., Polycarpo, C.R., Denise, A., Rousset, J.P., Soil, D., and Ambrogelly, A. (2007). Adding pyrrolysine to the Escherichia coli genetic code. FEBS Lett 581, 5282-5288.

75. Nguyen; V.T., Morange, M., and Bensaude, O. (1988). Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. AnalBiochem 171, 404-408.

76. Ninio, J. (1990). The revised genetic code. Orig Life Evol Biosph 20, 167171.

77. Nozawa, K., O'Donoghue, P., Gundllapalli, S., Araiso, Y., Ishitani, R., Umehara, Т., Soil, D., and Nureki, O. (2009). Pyrrolysyl-tRNA synthetase-tRNA(Pyl) structure reveals the molecular basis of orthogonality. Nature 457, 1163-1167.

78. Oba, Т., Andachi, Y., Muto, A., and Osawa; S. (1991). CGG: an unassigned or nonsense codon in Mycoplasma capricolum. Proc Natl Acad Sci USA 88, 921-925.

79. Ohama, Т., Inagaki, Y., Bessho, Y., and Osawa, S. (2008). Evolving genetic code. Proc Jpn Acad Ser В Phys Biol Sci 84, 58-74.

80. Osawa, S., and Jukes, Т.Н. (1995). On codon reassignment. J Mol Evol 41, 247-249.

81. Osawa, S., Jukes, Т.Н., Watanabe, K., and Muto, A. (1992). Recent evidence for evolution of the genetic code. Microbiol Rev 56, 229-264.125

82. Pisarev, A.V., Hellen, C.U., and Pestova, T.V. (2007). Recycling of eukaiyotic posttermination ribosomal complexes. Cell 131, 286-299.

83. Polycarpo, C., Ambrogelly, A., Berube, A., Winbush, S.M., McCloskey, J.A., Crain, P.F., Wood, J.L., and Soil, D. (2004). An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1245012454:

84. Preer, J.R., Jr., Preer, L.B., Rudman, B.M., and Barnett, A.J. (1985). Deviation from the universal code shown by the gene for surface protein 51A in Paramecium. Nature 314, 188-190.

85. Prescott, D.M. (1994). The DNA of ciliated protozoa. Microbiol Rev 58, 233267.

86. Razvi, A., and Scholtz, J.M. (2006). Lessons in stability from thermophilic proteins. Protein Sci 15, 1569-1578.

87. Rother, M., and Krzycki, J.A. (2010). Selenocysteine, pyrrolysine, and the unique energy metabolism of methanogenic archaea. Archaea12010:

88. Salas-Marco, J., Fan-Minogue, H., Kallmeyer, A.K., Klobutcher, L.A., Farabaugh, P.J., and Bedwell, D.M. (2006). Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena-and Euplotes. Mol Cell Bioh 26, 438-447.

89. Santos, M.A., Moura, G., Massey, S.E., and Tuite, M.F. (2004). Driving change: the evolution of alternative genetic codes. Trends Genet 20, 95-102.

90. Sarkar, G., and Sommer, S.S. (1990). The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8, 404-407.

91. Schmeing, T.M., and Ramakrishnan, V. (2009). What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 461, 1234-1242.

92. Schultz, D.W., and Yarns, M. (1996). On malleability in the genetic code. J Mol Evol 42, 597-601.

93. Seit-Nebi, A., Frolova, L., and Kisselev, L. (2002). Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBO Rep 3, 881-886.

94. Soil, D., and RajBhandary, U.L. (2006). The genetic code thawing the 'frozen accident'. J Biosci'37, 459-463.

95. Srinivasan, G., James, C.M., and Krzycki, J:A. (2002). Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-1462.

96. Stahl, G., Bidou, L., Rousset, J.P., and Cassan, M. (1995). Versatile vectors to study recoding: conservation, of rules between yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res 23, 1557-1560.

97. Studier, F.W., and Moffatt, B.A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-130.

98. Sueoka, N. (1988). Directional mutation pressure and neutral molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 2653-2657.

99. Tanaka, R., Muto, A., and Osawa, S. (1989). Nucleotide sequence of tryptophan tRNA gene in Acholeplasma laidlawii. Nucleic Acids Res 17, 5842.

100. Theobald-Dietrich, A., Frugier, M., Giege, R., and Rudinger-Thirion, J. (2004). Atypical archaeal tRNA pyrrolysine transcript behaves towards EF-Tu as atypical elongatortRNA. Nucleic Acids Res 32, 1091-1096:

101. Tourancheau, A.B., Tsao, N., Klobutcher, L.A., Pearlman, R.E., and Adoutte, A. (1995). Genetic code deviations in the ciliates: evidence for multiple and independent events. Embo J. 14, 3262-3267.

102. Turanov, A.A., Lobanov, A.V., Fomenko, D.E., Morrison, H.G., Sogin, M.L., Klobutcher, L.A., Hatfield, D.L., and Gladyshev, V.N. (2009). Genetic code supports targeted insertion of two amino acids by one codon. Science 323, 259-261.

103. Vestergaard, B., Van, L.B., Andersen, G.R., Nyborg, J., Buckingham, R.H., and Kjeldgaard, M. (2001). Bacterial polypeptide* release factor. RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol Celll<5, 1375-1382.

104. Wang, W., Chai, B.F., Heckmann, K., and-Liang; A.H1 (2004). Cloning, characterization and expression of the polypeptide release factor gene, eRFl, of Blepharisma japonicum. Biotechnol Lett 26, 959-963.

105. Wang, Y., Chai, B., Wang, W., and' Liang, A.' (2010). Functional characterization of polypeptide release factor lb in the ciliate Euplotes. Biosci Rep 30,.425-431.

106. Weixlbaumer, A., Jin, H., Neubauer, C., Voorhees, RIM'., Petry, S., Kelley, A.C., and1 Ramakrishnan, V. (2008). Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosome. Science 322, 953-956.

107. Yamao, F., Iwagami, S:, Azumi, Y., Muto, A., Osawa, S., Fujita, N., and Ishihama, A. (1988). Evolutionary dynamics of tryptophan- tRNAs in Mycoplasma capricolum. Mol Gen Genet 212, 364-369.142.143.144.145.146.

108. Yamao, F., Muto, A., Kawauchi, Y., Iwami, M., Iwagami, S., Azumi, Y., and Osawa, S. (1985). UGA is read as tryptophan in Mycoplasma capricolum. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 2306-2309.

109. Yarns, M., and Schultz, D.W. (1997). Further comments on codon reassignment. Response. J Mol Evol 45, 3-6.

110. Zhang, Y., and Gladyshev, V.N. (2007). High content of proteins containing 21st and 22nd amino acids, selenocysteine and pyrrolysine, in a symbiotic deltaproteobacterium of gutless worm Olavius algarvensis. Nucleic Acids Res 35, 4952-4963.