Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1

Лекомцев, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ЛЕКОМЦЕВ Сергей Александрович

ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ С ВАРИАНТНЫМИ ГЕНЕТИЧЕСКИМИ КОДАМИ: УЗНАВАНИЕ СТОП-КОДОНОВ ФАКТОРОМ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ еКН

03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ииа174461

Москва-2007

003174461

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной геномики (зав лаб акад Л.Л Киселев) Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН и в лаборатории молекулярной генетики биосинтеза белка (зав. лаб проф ЖП Руссе) Института генетики и микробиологии (Орсэй, Франция)

Научный руководитель

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, профессор Л. Ю. Фролова

Официальные оппоненты-

доктор биологических наук, профессор '

В. В. Алешин

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник В. В. Кушниров

Ведущая организация-

Институт биохимии А. Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится "73 в ТУ часов на заседании

Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного совета кандидат химических наук

. М. Крицын

Актуальность работы. В организмах с универсальным генетическим кодом 61 смысловой кодон используется для кодирования 20 природных аминокислот, а три стоп-кодона UAA, UAG и UGA служат сигналами для остановки белкового синтеза Однако, в митохондриях животных, ресничных инфузориях, прокариоте Mycoplasma, дрожжах рода Candida и в некоторых других организмах обнаружены отклонения от универсального кода Например, у ресничных родов Stylonychia, Tetrachymena и Paramecium кодоны UAA и UAG не участвуют в терминации трансляции и кодируют аминокислоту глутамин, тогда как у Euplotes кодон UGA кодирует цистеин, а кодоны UAA и UAG служат для терминации трансляции.

В процессе терминации трансляции ключевую роль играют два класса белковых факторов У эукариот со стандартным кодом фактор терминации 1-го класса eRFl узнает все три стоп-кодона и индуцирует гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы Молекула eRFl состоит из 3-х функционально-различных доменов - N-концевого, М (среднего) и С-концевого, где N-домен ответствен за узнавание стоп-кодонов Фактор терминации 2-го класса eRF3 является eRFl-зависимой и рибосомо-зависимой ОТРазой и ускоряет гидролиз пептидил-тРНК, катализируемый eRFl

Молекулярные механизмы декодирования стоп-кодонов у организмов с универсальным генетическим кодом изучены недостаточно, а у организмов с вариантным генетическим кодом — вообще не изучены В организмах с вариантным генетическим кодом об узнавании стоп-кодонов известно очень мало Почти ничего неизвестно об аминокислотных остатках фактора eRFl ресничных, ответственных за специфичность узнавания стоп-кодонов Неизвестны также пути возникновения вариантных кодов у ресничных что возникло раньше - переосмысление стоп-кодона (ов) в значащий (значащие) или изменение специфичности декодирования eRFl9 Изучение декодирующих свойств eRFl ресничных инфузорий является не только актуальным, но и позволит приблизиться к пониманию возможных путей возникновения вариантных генетических кодов у ресничных

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в идентификации аминокислотных остатков, определяющих декодирующие свойства факторов терминации трансляции eRFl инфузорий с разньми вариантными кодами

В рамках поставленной цели сформулированы следующие задачи 1) экспериментально показать, что N-концевые домены eRFl ресничных, подобно N-концевым доменам eRFl со стандартным кодом, целиком определяют декодирующие свойства исследуемых факторов, 2) получить химерные конструкции, сочетающие различные участки N-домена eRFl ресничных и человека, 3) выделить полученные химерные белки eRFl и охарактеризовать их функциональную активность, 4) получить генноинженерные конструкции химерных eRFl для экспрессии т vivo в клетках человека, 5) охарактеризовать влияние химерных eRFl на уровень сквозного прочтения (readthrough) в отношении 3-х стоп-кодонов в клетках человека

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые создан набор генноинженерных конструкций eRFl для двух родов ресничных инфузорий, в которых N-домен eRFl ресничных соединен с МС-доменом человека, что позволило тестировать функциональную активность полученных химер на рибосомах млекопитающих Благодаря разработанному методологическому подходу, впервые установлены участки N-концевого домена eRFl стилонихии и эуплоты, ответственные за их вариантные декодирующие свойства. Методом точечного мутагенеза впервые установлены два участка в N-концевом домене eRFl парамеции, определяющие UGA-специфичность

Практическая ценность полученных результатов состоит в том, что найдено несколько способов изменения декодирующих свойств eRFl (например, превращение омнипотентного eRFl человека в узнающего только стоп-кодон UGA eRFl), что открывает новые перспективы исправления наследственных дефектов геномов путем считывания нонсенс мутаций как

смысловых, используя in vivo eRFl с направленно измененными декодирующими свойствами («трансляционная терапия»)

Апробация работы. Материалы работы были представлены на следующих международных конференциях The 21th International tRNA Workshop (Bangalore, India, 2005), The 8th Engelgardht Conference on Molecular Biology (Sergiev Pasad, Russia, 2006), Molecular and Cell Biology at Spetsai. Past, Present and Future - A forty years anniverseiy (Island of Spetses, Greece, 2006), Protein Synthesis and Translational Control (Heidelberg, Germany, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на^^э^страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (¿¿^"наименований) Диссертация содержит 20 рисунков и 3 таблицы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Амплификация N-концевых частей гена eRFl Euplotes aediculatus и

Stylonychia mytilus и конструирование генов химерных eRFl. Нуклеотидные

последовательности, кодирующие N-концевые домены eRFlb Е aediculatus и

eRFl S mytilus амплифицированы в клетках Е aediculatus и S mytilus,

соответственно Культуры клеток инфузорий любезно предоставлены МС

Раутиан (Санкт-Петербургский Государственный Университет) ПЦР-продукты

гидролизовали Ndel и Xhol рестриктазами и лигировали с плазмидой pERF4b,

обработанной Ndel и Sail рестриктазами Плазмида pERF4b является

производной плазмиды pET23b (hmtrogen) с клонированным геном eRFl

человека Кодирующая последовательность N-домена eRFl Е aediculatus

содержит стоп-кодон UGA в положении 132 (нумерация по аминокислотной

последовательности eRFl человека), а кодирующая последовательность N-

домена eRFl S mytilus содержит интрон и пять стоп-кодонов UAA/UAG Для

экспрессии генов химерных eRFl эуплота/человек и стилонихия/человек стоп-

кодоны заменены на кодоны, кодирующие цистеин и глутамин, соответственно,

согласно правилам кодирования в ресничных Euplotes (UGA = Cys) и Stylonychia (UAR = Gin) Интрон в кодирующей последовательности N-домена eRFl стилонихии удален с помощью стандартных генно-инженерных манипуляций Конечные конструкции названы pERF4bEu (Eu-1) и pERF4bSt (St-1) для эуплоты и стилонихии, соответственно

Для получения химерных eRFl участок N-домена Eu-1 или St-1 заменяли на соответствующий участок N-домена eRFl человека, используя метод мегапраймерного ПЦР со сменой матрицы На первом этапе амплифицировали интересующую часть нуклеотидной последовательности N-домена eRFl человека (матрица pERF4b), при этом праймер, комплементарный области соединения участков eRFl ресничного и человека, содержал на 3'- и 5'-концах нуклеотидные последовательности N-домена eRFl человека и ресничного, соответственно На втором этапе полученный ПЦР-продукт очищали и использовали как мегапраймер в ПЦР, но с плазмидой Eu-1 или St-1 в качестве матрицы Полученный ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами Ndel и Bst98l и лигировали с плазмидой pERF4b, обработанной теми же рестриктазами Для экспрессии генов химерных бежов в клетках человека N-концевые части химерных генов eRFl из плазмиды pERF4b переносили в плазмиду pcDNA3 (Invitrogen), содержащую ген eRFl человека (pcDNA3-Hs-eRFl), используя сайты рестрикции Hindlll и ВатШ Сайт ВатШ находится в положениях 228229 М-домена eRFl человека Все конструкции проверены секвенированием

Культура клеток и определение уровня "сквозного прочтения" (readthrough). Фибробласты человека С293 культивировали в среде DMEM с добавлением эмбриональной сыворотки теленка (FCS) до 10% при 37°С и 5 5% насыщения С02 Для трансфекции использовали примерно один миллион клеток Клетки одновременно трансфецировали вектором pcDNA3, несущим химерный ген eRFl, и репортерным вектором pACstop, несущим гены р-галактозидазы и люциферазы Количество каждой плазмиды составляло 10 мкг Для трансфекции использовали метод ДНК/фосфат копреципетации. Клетки собирали на третий день после трансфекции, экстракт получали как описано

ранее (Cassan et al., 1994). Для каждой тестируемой конструкции выполнено пять независимых опытов.

Репортерный вектор pACstop содержит ген ß-галактозидазы (lacZ), к 3'-концу которого присоединен ген люциферазы {lue). Нуклеотидная последовательность между генами lacZ и lue содержит один из трех стоп-кодонов, находящийся в одной рамке считывания с инициирующим кодоном AUG lacZ (рис. 1).

Активность люциферазы Сквозное Активность Р-галактозидазы прочтение

Рис. 1. Схема двойной репортерной системы для определения уровня сквозного прочтения (readthrough) в культуре клеток человека. (NNN)3 STOP (NNN)3 -нуклеотидное окружение стоп-кодонов GCCCGGTGTstopGATAATTTA и GGAACACAAstopCAATTACAG использовали для оценки влияния на сквозное прочтение химерных eRFl эуплота/человек и стилонихия/человек, соответственно.

В результате транслирующие рибосомы синтезируют Р-галактозидазу, и небольшая часть рибосом за счет эффекта сквозного прочтения стоп-кодона продолжает чтение и синтезирует С-концевую часть гибридного белка (люциферазу). Активность Р-галактозидазы в такой двойной репортерной системе является внутренним контролем, учитывающим стабильность мРНК, степень трансфекции, эффективность транскрипции, трансляции и т.д., что позволяет сравнивать разные опыты между собой. Уровень сквозного прочтения оценивается как отношение активности люциферазы к активности ¡3-галактозидазы (рис. 1). Для определения относительной активности ферментов

в качестве контроля использовали вектор pACTQ, содержащий значащий кодон CAG вместо стоп-кодона между lacZ и luc Для определения величины уровня сквозного прочтения в процентах отношение активностей люциферазы/р-галактозидазы репортерного вектора pACstop делили на отношение активностей люциферазы/р-галахтозидазы контрольной конструкции pACTQ Измерение активностей р-галактозидазы и люциферазы проводили в одном экстракте, как описано ранее (Bidou et al, 2000)

Выделение химерных eRFl и определение их функциональной активности т vitro. Для экспрессии генов химерных eRFl использовали штамм Е coli BL21(DE3)pUBS520 Рекомбинатный белок, содержащий His6-tag, выделяли на смоле Ni-NTA Superflow (Qiagen)

RF-активность (Release Factor activity) химерных eRFl определяли in vitro (Caskey et al, 1974) по способности eRFl, связанного в A-участке рибосомы, в присутствии тетрарибонуклеотидов, содержащих один из трех стоп-кодонов, индуцировать гидролиз формилметионил-тРНК, находящейся в Р-участке рибосомы в присутствии код она инициации AUG RF-активность eRFl человека дикого типа принимали за 100% RF-активность химерных eRFl в процентах рассчитывали от 100% RF-активности eRFl человека

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Методы определения специфичности химерных и мутантных eRFl. Для

определения специфичности химерных и мутантных eRFl использовали две

тест-системы in vitro и in vivo Обе системы подходят для сравнения ответа

исследуемых eRFl на разные стоп-кодоны RF-активность eRFl в отношении

трех стоп-кодонов измеряли in vitro В этой системе пептидил-тРНК заменена

формилметионил-тРНК ([f35S]Met-tRNAMrt), которая связывается с

инициирующим кодоном AUG в Р-сайте рибосомы При этом eRFl связывается

с одним из трех тетраплетов UAAA, UAGA или UGAA в A-сайте рибосомы

кролика и индуцирует отщепление формилметионина [f^SJMet в зависимости

от узнавания стоп-кодона Однако, в этой системе отсутствуют природная

мРНК, фактор терминации 2-го класса (eRF3) и GTP/GDP, что может в принципе, повлиять на специфичность узнавания исследуемых химерных или мутаятных белков Чтобы исключить такую возможность, для определения декодирующих свойств химерных eRFl мы использовали систему т vivo, в которой измеряли влияние eRFl на уровень сквозного прочтения стоп-кодона в культуре клеток фибробластов человека Специфичность декодирования химерных eRFl оценивали по их влиянию на сквозное прочтение в отношении всех трех стоп-кодонов Для измерения уровня сквозного прочтения использовали двойную репортерную систему (см Материалы и методы) (рис 1) Измерения сквозного прочтения т vivo проводили в присутствии эндогенного eRFl человека Известно, что связывание eRFl с рибосомой зависит от взаимодействия eRFl со стоп-кодоном в A-участке рибосомы Поэтому, при слабом связывании химерного eRFl с данным стоп-кодоном такой eRFl будет неэффективно конкурировать с тРНК и (или) эндогенным eRFl человека Сниженное взаимодействие химерного eRFl со стоп-кодоном будет способствовать связыванию со стоп-кодоном близкородственной тРНК или супрессорной тРНК, повышая тем самым уровень сквозного прочтения на стоп-кодоне

Данные т vitro полностью подтверждают данные in vivo Химерные eRFl (St-1, St-6, St-11 и St-13), утратившие способность узнавать стоп-кодон in vitro, не конкурировали с тРНК за связывание с этим стоп-кодоном, тем самым способствуя повышению уровня сквозного прочтения В свою очередь, химерные eRFl (St-12, St-14 и St-15), узнающие все три стоп-кодона успешно конкурируют с тРНК за связывание со стоп-кодоном и уровень сквозного прочтения остается низким (рис 4)

Специфичность узнавания стоп-кодонов в ресничных определяется N-

концевым доменом eRFl. В организмах с универсальным генетическим кодом

специфичность узнавания стоп-кодонов определяется исключительно N-

концевым доменом eRFl Для организмов с вариантным кодом это менее

очевидно, тк в настоящее время существуют противоречивые данные о

«достаточности» N-концевого домена eRFl для запрещения узнавания

некоторых стоп-кодонов в инфузории Tetrahymena (Salas-Marco et al, 2006)

Для решения этой проблемы в случае ресничных эуплота и стилонихия нами

сконструированы химерные белки, состоящие из N-домена eRFlb Euplotes

aediculatus или eRFl Stylonychía mytilus и МС-домена eRFl человека

Функциональный анализ этих химерных eRFl показал, что специфичность

узнавания стоп-кодонов фактором eRFl в ресничных эуплота и стилонихия

определяется исключительно N-доменом eRFl этих организмов Химерный

белок St-1, состоящий из N-концевого домена eRFl стилонихии и МС-домена

eRFl человека узнает стоп-кодон UQA со 100% эффективностью, но не узнает

кодоны UAA и UAG т vitro (рис 2) При экспрессии конструкции St-1 в

клетках человека значительно повышается уровень сквозного прочтения на

стоп-кодонах UAA (6 0%, увеличение в 18 9 раза) и UAG (11 3%, увеличение в

5 5 раза), в то время как уровень сквозного прочтения на UGA практически не

изменяется (рис 4) Данные, полученные in vitro согласуются с данными in

vivo химерный белок St-1, потерявший способность узнавать UAA и UAG не

конкурирует с тРНК за связывание с этими стоп-кодонами, в результате чего

уровень сквозного прочтения на UAA и UAG значительно возрастает Эти

данные согласуются с тем, что у стилонихии кодоны UAA и UAG

используются для кодирования глутамина, а кодон UGA служит для

терминации белкового синтеза В ресничном Euplotes кодон UGA используется

для кодирования цистеина, a UAA и UAG выполняют роль стоп-кодонов

Экспрессия в клетках человека Еи-1, состоящего из N-концевого домена eRFl

эуплоты и МС-домена eRFl человека приводит к значительному возрастанию

уровня сквозного прочтения на кодоне UGA (1 61%, увеличение в 107 раз), в

тоже время уровень сквозного прочтения на ко донах UAA (0 019%, увеличение

в 2 раза) и UAG (0 032%, увеличение в 3 раза) меняется незначительно (рис 6)

Более того, химерный белок Еи-1 узнает кодоны UAA и UAG, но не узнает

UGA т vitro Специфичность узнавания стоп-кодонов eRFl парамеции также

определятся N-доменом. Этот вывод сделан на основании того, что

одновременная замена участка 61-64 (NIKS) и 122-131 в eRFl человека на

соответствующую аминокислотную последовательность eRFl парамеции приводит к полной потери способности химерного белка Ра-2 узнавать стоп-кодоны UAA и UAG in vitro, однако узнавание UGA сохраняется (рис 5)

UGA-специфичность eRFl Stylonychia определяется главным образом дипептидом QF. Как показано в диссертации, специфичность узнавания стоп-кодонов eRFl стилонихии полностью зависит от структуры N-концевого домена Далее мы локализовали аминокислотные остатки N-домена eRFl стилонихии, ответственные за дискриминацию узнавания кодонов UAA и UAG Для этого мы сконструировали химерные белки, заменяя аминокислотную последовательность N-домена eRFl стилонихии (в конструкции St-1) на соответствующий участок eRFl человека На первом этапе был локализован участок 122-145 N-домена eRFl стилонихии, необходимый для обеспечения UGA-специфичыости Конструкции St-2 и St-б, содержащие этот участок, обладают выраженной UGA-специфичностью т vitro, тогда как при его замене на соответствующий участок eRFl человека, химерный белок St-З узнает все три стоп-кодона (рис 2) Из анализа конструкций St-4, St-5 и St-6 очевидно, что основную роль в достижении UGA-специфичности играют положения Q122 и F123, тк конструкции, содержащие данный дипептид узнают только стоп-кодон UGA, но не UAA и UAG Тем не менее, замена участка 124-131 в St-б на соответствующий участок eRFl человека приводит к тому, что химерный белок St-9 узнает все три стоп-кодона Очевидно, что часть аминокислотных остатков, важных для UGA-специфичности, находится в участке 124-131 В свою очередь, введение фрагмента 127-132 eRFl стилонихии в eRFl человека не приводит к появлению избирательной UGA-специфичности химерного белка St-10, хотя RF-ажтивность на стоп-кодоне UGA больше, чем на UAA и UAG Важность Metl24 для UGA-специфичности очевидна из анализа конструкций St-4 и St-5 В результате замены L124M в конструкте St-4, согласно структуре eRFl стилонихии, RF-активность St-5 на UGA возрастает с 60% до 90%

I I-человек

-стилонихия

БМ

Б«

81-3

ЯР-активность, % 20 40 60 80 100 120

124 145

«■■■II

1 Э^б 125 145

шшш^шшвшшшьиа

122 145 ■

1 мШиИКНЙВв

1 Б1-7 122 126 145

И тЖ' д^И

1 122 126 145 >

такгЯП

1 Э^Э* 122 124 -- 132 145 _1_ _. 1

I яп тт

1 вмо* 127 133 145 ^-1

I иАА 3 иАС I Ъ'СА

20 40 60 80 100 120

Рис. 2. Яр-активность химерных факторов eR.Fl стилонихия/человек. Конструкция БМ содержит полноразмерный И-домен еШ^ стилонихии (положения 1-145). Все конструкции содержат МС-домен еМЧ человека (146-437). Соединение И-домена с МС-доменом соответствует положениям 144-145 и находится в петле между ]М- и М-доменами еМЛ. Во всех конструкциях нумерация аминокислотных остатков соответствует последовательности еКР1 человека дикого типа. ТБЬ и С^М -аминокислотные мотивы еЯН человека и еИЛ стилонихии, соответственно (положения 122-124). Номер на границе соединения аминокислотных последовательностей еИР 1 человека и еМЛ стилонихии соответствует правому аминокислотному остатку относительно границы. * - конструкции получены П.М. Колосовым и предоставлены для функционального анализа.

Н.sapiens Е. aediculatus lb В.japonicum S. mytilus P. tetraurelia

H.sapiens E. aediculatus lb B. japonicum S. mytilus P. tetraurelia

Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей N-доменов eRFl Homo sapiens (универсальный генетический код), Euplotes aediculatus lb и Blepharisma japonicum (UAR-специфичность), Stylonychia mytilus и Paramecium tetraurelia (UGA-специфичность). Нумерация согласно аминокислотной последовательности eRFl человека. Идентичные и консервативные аминокислотные остатки обозначены черным и темно-серым соответственно.

Положение 126 является консервативным в разных группах организмов и соответствует остатку лейцина в организмах с универсальным кодом, изолейцина в организмах с UAR-специфичностью и фенилаланина в организмах с UGA-специфичностью фактора eRFl (рис. 3). На основании генетических и биоинформатических исследований высказано предположение, что положение 126 важно для достижения UGA- и UAR-специфичностей. Однако, замена F126 в St-б на аминокислотные остатки лейцина (St-7) и изолейцина (St-8) не приводит к нарушению UGA-специфичности (рис. 2). По-видимому, положение 126 не важно для UGA-специфичности в контексте структуры фактора eRFl стилонихии. Ранее показано, что мутация L126F в eRFl человека также не приводит к изменению специфичности узнавания стоп-кодонов (Kolosov et al., 2005).

Данные in vitro полностью подтверждаются данными измерений сквозного прочтения стоп-кодона в клетках человека. Химерные белки (St-1, St-6, St-11 и St-13), утратившие способность узнавать стоп-кодоны UAA и UAG in vitro, не способны конкурировать с супрессорной тРНК за узнавание, поэтому уровень сквозного прочения на этих стоп-кодонах повышается. Например, экспрессия конструкции St-1, содержащей N-домен фактора eRFl стилонихии, приводила к повышению уровня свозного прочтения в 18,9 раза на UAA (6,0%) и в 5,5 раза

на UAG (11,3%), тогда как уровень сквозного прочтения на стоп-кодоне UGA практически не изменялся (возрастание в 1,4 раза) и составлял 1,1% (рис 4) В то же время, химерные белки St-12, St-14 и St-15, узнающие все три стоп-кодона гп vitro, не вызывали повышения уровня сквозного прочтения Замена аминокислотной последовательности eRFl человека в положениях 122-145 на соответствующий участок eRFl стилонихии приводит к полной потери способности St-6 отвечать на стоп-кодоны UAA и UAG in vitro, тогда как узнавание UGA сохраняется Экспрессия St-6 в клетках человека повышает уровень сквозного прочтения в 19,1 раз на UAA (6,1%) и в 5,4 раза на UAG (11,0%), тогда как уровень сквозного прочтения на стоп-кодоне UGA изменяется незначительно (возрастание в 1,4 раза; 1,1%) Для UGA-специфичности химерного бежа St-6 более важную роль играют аминокислотные остатки в положениях 122-132 eRFl стилонихии, что следует из анализа химерных белков St-11 и St-12 Химерный белок St-11 узнает только стоп-кодона UGA in vitro, и экспрессия его гена в клетках человека приводит повышению уровня сквозного прочтения на стоп-кодоне UAA в 16,7 раза (5,3%) и в 6,8 раза на UAG (13,9%) В свою очередь, St-12 узнает все три стоп-кодона in vitro и не влияет на уровнь сквозного прочтения in vivo на UAA и UAG (рис 4) Очевидно, что участок 133-145 eRFl стилонихии не существенен для UGA-специфичности как т vitro, так и in vivo Для более узкой локализации аминокислотных остатков eRFl стилонихии, препятствующих узнаванию UAA и UAG, положения 122-126 в eRFl человека были заменены на мотивы QFMYF, QFM и QF, соответствующие аминокислотной последовательности eRFl стилонихии Как видно из рисунка 4, St-13 обладает UGA-специфичностъю т vitro и способствует повышению уровня сквозного прочтения в 11,2 раза на UAA (3,6%) и в 5,8 раза на UAG (11,9%), тогда как на стоп-кодоне UGA уровень сквозного прочтения остается низким (1,1%, повышение в 1,4 раза) В отличие от St-13, для St-14 и St-15 наблюдали потерю UGA-специфичности in vitro, т к химерные белки St-14 и St-15 кроме UGA узнают также стоп-кодоны UAA и UAG с достаточно высокой эффективностью (30-60%) Из приведенных данных очевидно, что мотив QFMF, находящийся в положениях 122-126, является минимальной аминокислотной последовательностью eRFl стилонихии, необходимой для UGA-специфичности

CD-человек ШВ -СТИЛОНИХИЯ А RF-активность, % В Сквозное прочтение, %

20 40 во ао юо 5 m

20 40 60 80 100 5 10 15

Рис. 4. Измерение RF-активности in vitro (А) и измерение уровня сквозного прочтения с использованием двойной репортерной системы в клетках человека (В). Уровень сквозного прочтения для каждого из стоп-кодонов измеряли в присутствии eRFl человека (1) или химерного eRFl (2). Все конструкции содержат МС-домен eRFl человека (146-437). * - числа показывают, во сколько раз увеличивается уровень сквозного прочтения при экспрессии химерного eRFl относительно уровня прочтения в присутствии дикого типа eRFl человека (базовый уровень).

Комбинация мотива SIKD и участка 122-131 обеспечивает UGA-специфичность eRFl Paramecium. В ресничной Paramecium, как и в ресничном Stylonychia кодоны UAA и UAG кодируют глутамин, a UGA выполняет функцию стоп-кодона. Однако, в отличие от стилонихии UGA-специфичность не может быть достигнута заменой участка 122-131 фактора eRFl человека на соответствующий участок eRFl парамеции. Для UGA-специфичности необходима комбинация мотива SIKD (положения 61-64) и участка 122-131 eRFl парамеции (рис. 5).

Ра-1

Ра-3

1 61 65

122

132 145

6 1 65 12 2 132 145

§псЮ> LslyFcdFQf

145

RF-активность, % 20 40 60 80 100 120

ЕШ UAA ш uag ■в uga

Рис. 5. ЯР-активность мутантных еКР1 с аминокислотными заменами, соответствующими структуре eR.Fl парамеции. Все конструкции содержат МС-домен еЯБ! человека (146-437).

В еЯР1 парамеции положения 122-124 соответствуют трипептиду ЬБЬ, который существенно отличается от критически-важного для обеспечения Р1СА-специфичности трипептида ОРМ в факторе еЯР1 стилонихии. Одновременно, положения 128-130 соответствуют трипептиду ОРСЗ в eR.Fl парамеции или ввК в еИР 1 стилонихии (рис. 3). Поскольку, аминокислотные остатки в положениях 122-131 важны для иОА-специфичности eRFl стилонихии, мы заменили эти положения в е!1Р1 человека на аналогичный участок еРЛ парамеции (Ра-1). При этом, химерный белок Ра-1 узнавал все три стоп-кодона

in vitro (рис 5) Очевидно, что участка 122-131 eRFl парамеции недостаточно для UGA-специфичности в отличие от eRFl егалонихии Ранее, показана важность мотива NIKS (положения 61-64) для узнавания стоп-кодонов фактором eRFl человека (Chavatte et al, 2002, Frolova et al., 2002) Однако, в eRFl парамеции мотив NIKS заменен на SIKD (рис 3) При этом замены N61S и S64D в eRFl человека не приводили к появлению UGA-специфичности (Ра-3) (Seit-Nebi et al, 2002) Мутантный eRFl (Ра-3) узнает все три стоп-кодона, но с уменьшенной эффективностью (рис 5) Однако, при одновременной замене участков 61-64 и 122-131 eRFl человека на соответствующие участки eRFl парамеции химерный белок Ра-2 узнает in vitro только стоп-кодон UGA, но не UAA и UAG (рис 5) Таким образом, в отличие от eRFl стилонихии, для UGA-специфичности в eRFl парамеции необходимо одновременное присутствие двух участков мотива SIKD и участка 122-131 По-видимому, мотив DPQ во фрагменте 122-131 определяет UGA-специфичность Ранее показана возможность превращения омнипотентного eRFl человека в eRFl, узнающий только UGA, в результате четверной мутации N61S+S64D+N129P+K130Q согласно структуре eRFl парамеции (Seit-Nebi et al, 2002)

Аминокислотные остатки, препятствующие узнаванию стоп-кодона UGA eRFl Euplotes. В ресничном Е aediculatus кодон UGA кодирует цистеин, а UAA и UAG выполняют роль стоп-кодонов Ранее показано, что фактор терминации eRFl эуплоты не узнает стоп-кодона UGA и обладает UAR-специфичностью (Kervestm et al, 2001) Мы определили участки N-домена eRFl эуплоты, ответственные за потерю способности узнавания кодона UGA Для этого создали химерный белок, в котором N-домен eRFl человека заменен на N-домен eRFl эуплоты В положении 132 N-домена eRFl эуплоты (нумерация согласно eRFl человека) находится кодон UGA в одной рамке считывания с инициирующим кодоном Для экспрессии гена химерного белка в клетках человека кодон UGA заменяли HaUGC, кодирующий цистеин

I I - человек

- эуплота

Eu-1 1 ■■■HHBS инвннннвв

1 40 145

Eu-2 I пЕЭЩ

1 51 145

Eu-3 I IIP ШЯЯ 1

1 123 145

Eu-4 I IIP !'»■■

1 38 123 145

Eu-5 С ■ LLS

1 38 125 145

Eu-6 L ■ LLS TFK Ш|

1 40 125 145

Eu-7 t

1 38

Eu-1 Ol T~

Eu-11

1 38_51

Eu-12|

1 38_51

125 145

es:

123 145

шшш

123 133145

Сквозное прочтение, % 0,5 1,0 1,5 2,0

BUAA □ UAG ■ UGA * 2 3

2 3

2 2 58

I 6 61 3 2

2 3

3 2 58

2 2 16

3 3 11 58 2 3 2 3 3

3 3 ■■■H 64

0,5 1,0 1,5 2,0

Рис. 6. Измерение уровня сквозного прочтения с помощью двойной репортерной системы. Уровень сквозного прочтения каждого из стоп-кодонов измеряли в присутствии дикого типа eRFl человека (1) и химерного eRFl (2). Все конструкции содержат МС-домен eRFl человека (146-437). Нумерация - согласно аминокислотной последовательности eRFl человека. LLS, IIP, TFK и TSL - аминокислотные мотивы. Номер на границе соединения аминокислотных последовательностей eRFl человека и eRFl эуплоты соответствует правому аминокислотному остатку, относительно границы. * - числа показывают, во сколько раз увеличивается уровень сквозного прочтения при экспрессии химерного eRFl относительно уровня прочтения в присутствии дикого типа eRFl человека (базовый уровень).

Далее, для локализации участков N-концевого домена, ответственных за

"неузнавание" UGA, сконструированы химерные eRFl, в которых участки N-

домена химерного eRFl эуплота/человек (конструкция Еи-1) заменены на

соответствующие участки N-домена eRFl человека Специфичность

декодирования химерных eRFl оценивали по влиянию химерного eRFl на

сквозное прочтение в отношении всех трех стоп-кодонов в культуре клеток

фибробластов человека по аналогии с eRFl стилонихии (см выше) (рис 1)

В результате анализа химерных eRFl эуплота/человек обнаружены два

участка (38-50 и 123-145), важные для UAR-специфичности eRFl эуплоты

Наибольший уровень сквозного прочтения на UGA наблюдали для химерного

eRFl Eu-11 (1 84%, возрастание в 122 раза относительного базового уровня),

содержащего оба эти участка (рис 6) В присутствии только одного из этих

участков уровень сквозного прочтения ниже для Еи-4 (0 91%, увеличение в 61

раз) или практически не отличается от базового уровня для Еи-10 (0 03%)

Помимо того, что in vivo химерный £u-10 не вызывает изменения уровня

сквозного прочтения в случае UGA, RF-активность Еи-10 в системе in vitro

определяется на всех трех стоп-кодонах По-видимому, более эффективная

дискриминация кодона UGA участком 123-145 (Еи-4) по сравнению с участком

38-50 (Еи-10) объясняется тем, что в состав участка 123-145 входит

консервативный мотив YxCxxxF (положения 125-131), играющий основную

роль в узнавании нуклеотидов во 2-м и 3-м положениях стоп-кодона (Kolosov et

al, 2005) В участке 38-50 N-домена eRFl эуплоты остатки лейцина L38 и L39

важны для дискриминации UGA, т к замены L38I и L39I в Еи-6, в соответствии

со структурой eRFl человека, приводят к значительному уменьшению уровня

сквозного прочтения на стоп-кодоне UGA для Еи-7 (с 1 55% до 0 86%)

Трипептид QFM (положения 122-124 в eRFl человека) важен для UGA-

специфичности eRFl стилонихии (рис 4) Замена трипептида QFM на TSL,

присутствующий в том же положении eRFl человека, приводит к исчезновению

UGA-специфичности eRFl стилонихии У eRFl эуплоты в положениях 122-124

находится трипептид TFK (рис 3), замена которого на трипептид TSL eRFl

человека не уменьшает уровня сквозного прочтения, и, следовательно, не

приводит к нарушению UAR-специфичности химерного Eu-5 (1 63%, увеличение в 108 раз) Замена участка 133-145 в Еи-11 на соответствующий участок eRFl человека уменьшает уровень сквозного прочтения в два раза (с 1 84% до 0 96%), что может указывать на важность аминокислот в положениях 133-145 для обеспечения UAR-специфичности eRFl эуплоты Участки 38-50 и 123-145 находятся далеко друг от друга в первичной структуре (рис 6), однако сближены в третичной (рис 7) (Song et al, 2000) Из наших данных следует, что дискриминацию ко дона UGA в eRFl эуплоты, т е UAR-специфичность, можно достичь двумя путями, а именно, комбинируя участок 38-50 с участком 123-145 (Еи-11) или длинным участком 38-122 (Eu-5) По-видимому, UAR-специфичность обеспечивается не только определенными аминокислотными остатками, но и трехмерной структурой N-домена eRFl эуплоты В отличие от eRFl эуплоты в eRFl ресничных стилонихии и парамеции UGA-специфичность достигается за счет небольшого набора аминокислотных остатков (рис 7)

Аминокислотные остатки eRFl, определяющие специфичность узнавания стоп-кодонов, различны у ресничных Stylonychia, Paramecium и Euplotes.

Предполагают, что ресничные произошли от организмов с универсальным

генетическим кодом Ответвление ресничных от древних предшественников с

универсальным кодом произошло на самых ранних этапах эволюции В

результате первичные структуры N-доменов eRFl организмов с вариантным и

универсальным кодами существенно различаются (рис 3) Однако, в N-домене

eRFl ресничных имеются консервативные аминокислотные остатки, играющие

важную роль в узнавании стоп-кодонов у организмов с универсальным кодом

На этом основании предложена «гипотеза негативных детерминант» (Seit-Nebi

et al, 2002), согласно которой в eRFl организмов с вариантным кодом

определенные аминокислотные остатки выполняют роль негативных

детерминант, взаимодействующих с консервативными "узнающими"

аминокислотными остатками и препятствующих узнаванию одного или двух

стоп-кодонов Эта гипотеза подтверждается возможностью превращения

омнипотентного (узнающего все три стоп-кодона) eRFl в унипотентный и,

наоборот, при замене некоторых неконсервативных аминокислотных остатков, что следует из данных диссертации и предыдущих работ (Seit-Nebi et al., 2002).

В работах Kim et al., 2005 и Lozupone et al., 2001 на основании анализа филогенетического древа выдвинуто предположение, что вариантные коды ресничных возникли независимо, в том числе в группах инфузорий с одинаковой кодовой специфичностью. Ресничные стилонихия и парамеция дивергировали на ранних этапах развития и возможно имеют разных предшественников. Это подтверждается экспериментальными данными, т.к. дискриминаторные элементы eRFl стилонихии и парамеции, идентифицированные в этой работе, радикально различаются (рис. 4 и 5). В случае eRFl стилонихии UGA-специфичность достигается за счет замены положений 122-126 eRFl человека на единственный мотив QFMYF согласно структуре eRFl стилонихии (St-13) (рис. 4 и 7).

Рис. 7. Трехмерные структуры N-концевого домена eRFl стилонихии, парамеции и эуплоты. Черным выделены некоторые консервативные аминокислотные остатки семейства eRFl (162, К63, Y125, С127 и F131). Темно-серым выделены аминокислотные остатки eRFl стилонихии (А) и парамеции (Б), необходимые для UGA-специфичности. В случае eRFl эуплоты темно-серым выделены аминокислотные остатки, находящиеся на границе участков 38-50 и 123-145, необходимых для UAR-специфичности. Трехмерные структуры eRFl стилонихии, парамеции и эуплоты смоделированы с помощью программы SWISS-MODEL (Schwede et al., 2003), используя в качестве модели кристаллическую структуру eRFl человека (Song et al., 2000).

Дискриминаторный участок QFMYF частично перекрывается с консервативным мотивом YxCxxxF, важным для узнавания стоп-кодонов в eRFl организмов с универсальным кодоном В случае парамеции для появления UGA-специфичности, необходимо присутствие двух удаленных участков eRFl парамеции мотив SIKD и участок 122-131 (Ра-2) Несмотря на то, что eRFl парамеции и стилонихии имеют одинаковую специфичность, аминокислотные остатки, препятствующие узнаванию UAA и UAG, имеют разную природу и локализованы в разных участках eRFl этих организмов

Фактор eRFl эуплоты обладает UAR-специфичностью в отличие от UGA-специфичности eRFl стилонихии и парамеции Для достижения UAR-специфичности необходима комбинация двух участков 38-50 и 123-145 eRFl эуплоты Как и ожидалось, аминокислотные остатки, необходимые для достижения UGA- и UAR-епецифичности, различны, что говорит о возможно разных механизмах запрета узнавания некоторых стоп-кодонов Несмотря на то, что природа дискриминаторных аминокислотных остатков eRFl стилонихии, парамеции и эуплоты существенно различается, место их локализации частично перекрывается в области консервативного мотива YxCxxxF По-видимому, это связано с тем, что основная роль мотива YxCxxxF - это узнавание 2-го и 3-го положений стоп-кодона, как показано для организмов с универсальным генетическим кодоном (Kolosov et al, 2005, Seit-Nebi et al, 2002) У ресничной инфузории Blepharisma кодон UGA кодирует триптофан, и поэтому считают, что eRFl этого организма по специфичности узнавания стоп-кодонов относится к UAR-типу (Kim et al, 2005) Однако, при сравнении аминокислотных последовательностей eRFl эуплоты и блефаризмы (рис 3) очевидно, что участки 38-50 и 123-145, определенные как участки дискриминации узнавания UGA у eRFl эуплоты, сильно различаются Например, в eRFl блефаризмы отсутствуют остатки лейцина L38 и L39, которые важны для поддержания UAR-специфичности eRFl эуплоты (рис 6) По-видимому, как и в случае UGA-специфичных eRFl стилонихии и парамеции, UAR-специфичность eRFl эуплоты и блефаризмы определяется

аминоксилотными остатками разной природы

Мотивы NIKS и YxCxxxF удалены друг от друга в пространственной структуре eRFl (Song et al, 2000), однако из данных молекулярного моделирования (Vorobiev and Kisselev, 2007), следует что eRFl может испытывать конформационные изменения N-домена, в результате которых мотивы NIKS и YxCxxxF становятся сближенными со стоп-кодоном мРНК в А-сайте рибосомы Вероятно, один из возможных механизмов достижения определенной специфичности узнавания стоп-кодонов заключается в экранировании «узнающих» аминокислотных остатков негативными детерминантами, в результате чего eRFl не способен взаимодействовать с одним или двумя стоп-кодонами

Возникновение вариантного генетического кода у ресничных: гипотеза

мутагенеза eRFl. Согласно мнению большинства исследователей, гипотезы,

объясняющие происхождение вариантных генетических кодов, рассматривают

как первый этап отклонения от универсального генетического кода

возникновение мутаций в тРНК, приводящих к узнаванию одного или двух

стоп-кодонов Затем, на втором этапе, eRFl теряет способность узнавать один

или два стоп-кодона также в результате мутаций На основании полученных

нами данных мы считаем, что напротив, первым этапом является мутагенез

именно фактора eRFl, приводящий к изменению декодирующих свойств

(неузнавание одного или двух стоп-кодонов) Это предположение

подтверждается тем, что одиночная замена в аминокислотной

последовательности eRFl может приводить к изменению специфичности

декодирования стоп-кодонов (Kolosov et al, 2005) В результате, такие

мутантные eRFl частично или полностью теряют способность связываться со

стоп-кодоном в рибосоме, что приводит к «освобождению» одного или двух

стоп-кодонов для их переосмысления (reassignment) Появление

«переосмысленных» стоп-кодонов, в открытой рамке считывания мРНК,

вызывает необходимость адекватных изменений в пуле тРНК На втором этапе,

в результате точечного мутагенеза, возникает тРНК, способная узнавать «стоп-

кодон» в открытой рамке считывания с высокой эффективностью Эта гипотеза

подтверждается тем, что замены T122Q+S123F в eRFl человека, исходя из структуры eRFl стилонихии, приводят к ослаблению узнавания стоп-кодонов UAA и UAG мутантным eRFl, тогда как узнавание UGA сохраняется (рис 4) Такой eRFl будет с меньшей эффективностью конкурировать с тРНК за связывание со стоп-кодоном, что в дальнейшем может привести к превращению стоп-кодона в значащий и появлению тРНК эффективно декодирущей этот стоп-кодон В ресничном тетрахимена присутствуют две тРНК01", узнающие кодоны UAA и UAG (Hanyu et al, 1986) Однако, у эуплоты, где UGA кодирует цистеин, отсутствует TPHKCys с антикодоном, комплементарным UGA (Grimm et al, 1998) Вместо супрессорной TPHKCys кодон UGA декодируется обычной тРНК§?д, несмотря на возникающую неканоническую пару G А в первом положении антикодона По-видимому, вследствие того, что сначала фактор eRFl эуплоты полностью потерял способность узнавать стоп-кодон UGA, тРНК§?А в отсутствие конкуренции эффективно декодирует UGA

Заключение.

Рассматривая в совокупности все полученные данные, можно придти к некоторьм общим заключениям, касающимся взаимоотношений структуры и функции факторов терминации трансляции eRFl эукариот с вариантными генетическими кодами

Безусловно, N-домен eRFl отвечает за специфичность узнавания стоп-

кодонов у ресничных Stylonychia, Paramecium и Euplotes, как и у организмов с

универсальным генетическим кодом Этот вывод согласуется с последними

результатами исследований, полученными с помощью других подходов

(сравнение первичных структур, опыты по химической сшивке и др)

Аминокислотные остатки, важные для специфичности узнавания стоп-кодонов,

различны у eRFl ресничных, исследованных в этой работе Следует отметить,

что аминокислотные остатки, важные для одной и той же специфичности у

организмов стилонихия и парамеция, совершенно разные по природе и

локализованы в разных частях N-домена По-видимому, эволюционирование

генетического кода в стилонихии и парамеции происходило независимо В ресничной инфузории Euplotes для установления UAR-специфичности eRFl необходимо значительно большее количество аминокислотных остатков, чем для UGA-специфичности в eRFl парамеции и стилонихии Возможно, это связано с фундаментальными различиями в узнавании разных стоп-кодонов фактором eRFl

Для того чтобы достичь решающего прорыва в расшифровке молекулярного механизма терминации трансляции, необходимо установить трехмерную структуру различных химерных eRFl, описанных в этой работе Кроме того, целесообразно расширить список eRFl с разными декодирующими свойствами и разной первичной структурой

ВЫВОДЫ

1 В инфузориях Stylonychia и Euplotes специфичность узнавания in vivo стоп-кодонов фактором терминации трансляции 1-го класса eRFl определяется N-доменами eRFl соответствующего организма

2 Методом молекулярных химер установлено, что дипептид QF (положения 122-123) в основном определяет in vivo UGA-специфичность eRFl Stylonychia Аминокислотные остатки М124 и F126 eRFl Stylonychia также важны для узнавания UGA

3 Методом молекулярных химер установлено, что в eRFl Euplotes UAR-специфичность зависит от пептидных фрагментов, локализованных в положениях 38-50 и 123-145 N-домена

4 Из полученных результатов следует, что инфузории с одинаковым вариантным кодом (Stylonychia и Paramecium) используют разные структурные элементы, определяющие их UGA-специфичность, что свидетельствует о независимых путях их молекулярной эволюции

5 Полученные экспериментальные данные согласуются с гипотезой о возникновении вариантных кодов в результате эволюции древних организмов с универсальным кодом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Lekomtsev S . Kolosov Р, Bidou L, Frolova L , Rousset J -P, Kisselev L (2007) Different modes of stop codon restriction by the Stylonychia and Paramecium eRFl translation termination factors Proc Natl Acad Sci USA 104, 10824-10829

2 Лекомцев С A (2007) Вариантные генетические коды и терминация трансляции Молекулярная биология 41 (6), 964-972

3 Лекомцев С А , Колосов П M, Фролова Л Ю , Биду Л, Руссе Ж-П и Киселев Л Л (2007) Как фактор терминации трансляции eRFl ресничных рода Euplotes не узнает стоп-кодон UGA Молекулярная биология 41 (6), 1005-1013

Подписано в печать 26 09 2007 г Исполнено 27 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ №773 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat m

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лекомцев, Сергей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Терминация трансляции

1.1.1. Факторы терминации 1 -го класса

1.1.2. Факторы терминации 2-го класса

1.2. Вариантные генетические коды

1.2.1. Митохондрии

1.2.2. Прокариоты

1.2.3. Эукариоты

1.2.4. Кодирование селеноцистеина и пирролизина

1.3. Гипотезы о причинах возникновения вариантных генетических кодов

1.3.1. Гипотеза исчезновения кодона

1.3.2. Гипотеза минимизации генома

1.3.3. Гипотеза «неопределенного интермедиата»

1.3.4. Гипотеза точечного мутагенеза еКБ

1.4. Эволюция генетического кода

Глава 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды 5 О

2.1.2. Среды

2.1.3. Реактивы

2.1.4. Ферменты

2.1.5. Олигонуклеотиды

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из Е.соИ

2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК

2.2.4. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК

2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.6. Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера"

2.2.7. Метод мегапраймерной ПЦР со сменой матрицы

2.2.8. Амплификация N-концевых частей гена eRFl

Euplotes aediculatus и Stylonychia mytilus

2.2.9. Конструирование генов химерных eRFl

2.2.10. Синтез и выделение белков

2.2.11. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ

2.2.12. Определение активности eRFl

2.2.13. Культура клеток и трансфекция

2.2.14. Измерение активности люциферазы и ß-галактозидазы

2.2.15. Определение уровня "сквозного прочтения" (readthrough)

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Измерение in vitro RF-активности химерных eRFl стилонихия/человек

3.2. Определение влияния химерных eRFl стилонихия/человек на уровень сквозного прочтения в клетках человека

3.3. Измерение in vitro RF-активности мутантных eRFl парамеция/человек

3.4. Определение влияния химерных eRFl эуплота/человек на уровень сквозного прочтения в клетках человека

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Методы определения специфичности декодирования eRF

4.2. Специфичность узнавания стоп-кодонов в ресничных определяется N-концевым доменом eRFl

4.3. В ресничных Stylonychia и Paramecium UGA-специфичность достигается за счет различных аминокислотных остатков N-концевого домена eRFl

4.4. Два участка последовательности eRFl эуплоты, препятствующие декодированию кодона UGA

4.5. Аминокислотные остатки eRFl, определяющие специфичность узнавания стоп-кодонов различны в ресничных Stylonychia, Paramecium и Euplotes

4.6. Возникновение вариантного генетического кода в ресничных: гипотеза мутагенеза eRF

Введение Диссертация по биологии, на тему "Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1"

Генетический код состоит из 64 кодонов. В организмах, использующих универсальный генетический код, для кодирования 20 природных аминокислот используется 61 смысловой или значащий кодон, а три код она - UAA, UAG и UGA, названные стоп, нонсенс или терминирующими, служат для остановки белкового синтеза. В организмах, использующих вариантные, неуниверсальные или альтернативные генетические коды, изменены значения некоторых кодонов. Отклонения от универсального кода приводят к изменению смысла кодирования значащих (sense) кодонов или к использованию стоп-кодонов для кодирования определенных аминокислотных остатков.

На ранних этапах изучения проблемы передачи информации полагали, что генетический код универсален для всех царств живой природы и, возникнув один раз на заре эволюции, код уже не изменялся до настоящего времени. Считали, что изменения в генетическом коде невозможны, так как любые из них будут летальными. Но затем были найдены нестандартные (неканонические, альтернативные) версии кода в митохондриях. После этого открытия вариантные коды обнаружили в простейших ресничных (Ciliophora), относящихся к эукариотам, в микоплазме (прокариоты), в некоторых дипломонадах (Diplomonadida), в одном из родов дрожжей Candida и в зеленых водорослях Acetabularia (Soll and RajBhandary, 2006). Во всех вариантах нестандартных кодов (кроме дрожжей Candida) использовались стоп-кодоны для кодирования аминокислот. Более того, стоп-кодоны UGA и UAG могут кодировать селеноцистеин (21-я аминокислота) и пирролизин (22-я аминокислота) соответственно в организмах как с универсальным, так и с вариантным генетическим кодом (Нао et al., 2002).

В универсальном коде стоп-кодоны UAA, UAG и UGA используются для терминации трансляции и узнаются факторами терминации 1-го класса, которые затем индуцируют гидролиз пептидил-тРНК в рибосоме. В прокариотах два фактора терминации 1-го класса, RF1 и RF2, узнают

UAG/UAA и UGA/UAA соответственно, а в эукариотах фактор eRFl узнает все три стоп-кодона (Kisselev et al., 2003). Функционально eRFl сходны с тРНК, т.к. декодируют стоп-кодон в малой субъединице рибосомы и активируют пептидилтрасферазный центр в большой субъединице (Kisselev and Buckingham, 2000). За узнавание стоп-кодонов ответствен N-концевой домен eRFl (Bertram et al., 2000; Chavatte et al., 2002; Frolova et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005). Факторы терминации 2-го класса, RF3 и eRF3, представляют собой eRFl-зависимые (для eRF3) и рибосомо-зависимые GTP-азы, которые стимулируют активность факторов 1-го класса (Frolova et al., 1996; Zavialov et al., 2001; Alkalaeva et al., 2006) и выход RF1/RF2 из рибосом.

Во многих вариантах альтернативного кода происходит изменение смысла стоп-кодонов. "Переосмысленные" стоп-кодоны больше не используются для терминации трансляции, а кодируют аминокислотный остаток. Для этого необходимо присутствие тРНК, которая может узнавать стоп-кодон, что возможно, если антикодон тРНК мутирует. В свою очередь, фактор терминации 1-го класса должен потерять способность узнавать такой "переосмысленный" стоп-кодон или иметь к нему низкое сродство, позволяя соответствующей тРНК декодировать этот стоп-кодон. Общепринято, что ресничные произошли от организмов с универсальным кодом, поэтому в первичной структуре eRFl ресничных должны существовать аминокислотные остатки, ответственные за изменение специфичности декодирования стоп-кодонов.

Одной из наиболее широко представленных групп организмов с вариантным генетическим кодом у эукариот являются ресничные инфузории. В этой группе организмов встречаются различные виды вариантных кодов. Например, в ресничных Euplotes кодон UGA кодирует цистеин (Meyer et al., 1991), а в ресничном Blepharisma - триптофан (Lozupone et al., 2001). В ресничных Stylonychia и Paramecium кодоны UAA и UAG используются для кодирования глутамина и только UGA служит для терминации биосинтеза белка (Caron and Meyer, 1985; Helftenbein, 1985).

Молекулярные механизмы декодирования стоп-кодонов у организмов с универсальным генетическим кодом изучены недостаточно, а у организмов с вариантным генетическим кодом - вообще не изучены. В организмах с вариантным генетическим кодоном об узнавании стоп-кодонов известно очень мало. Почти ничего неизвестно об аминокислотных остатках фактора eRFl ресничных, ответственных за специфичность узнавания стоп-кодонов. Неизвестны также пути возникновения вариантных кодов у ресничных: что возникло раньше - переосмысление стоп-кодона (ов) в значащий (значащие) или изменение специфичности декодирования eRFl? Изучение декодирующих свойств eRFl ресничных инфузорий является не только актуальным, но и позволит приблизиться к пониманию возможных путей возникновения вариантных генетических кодов у ресничных.

Основная цель работы состояла в идентификации участков N-концевого домена eRFl ресничных, относящихся к разным вариантным кодам, которые определяют декодирующие свойства этих белков. В рамках поставленной цели сформулированы следующие задачи: 1) экспериментально показать, что N-концевые домены eRFl ресничных, подобно N-концевым доменам eRFl со стандартным кодом, целиком определяют декодирующие свойства исследуемых факторов; 2) получить химерные конструкции, сочетающие различные участки N-домена eRFl ресничных и человека; 3) выделить, очистить и охарактеризовать функциональную активность полученных химерных форм eRFl;"4) получить генно-инженерные конструкции химерных eRFl для экспрессии in vivo в клетках человека; 5) охарактеризовать влияние химерных eRFl на уровень сквозного прочтения (readthrough) в отношении 3-х стоп-кодонов в клетках человека.

В этой работе исследовали декодирующие свойства eRFl трех ресничных инфузорий: Euplotes aediculatus, Stylonychia mytilus и Paramecium tetraurelia. Ha эволюционном древе ресничные и млекопитающие находятся далеко друг от друга, поэтому существует большая вероятность неэффективного связывания eRFl ресничных с рибосомой млекопитающих. Для преодоления этой трудности мы сконструировали химерные белки, состоящие из N-домена eRFl Euplotes или Stylonychia и МС-домена eRFl человека. Рибосомы млекопитающих способны связывать МС-домен eRFl человека в отсутствие N-домена (Дубовая и др., 2006). Ранее, с использованием "химерного" подхода показано, что узнавание стоп-кодонов определяется N-доменом eRFl эуплоты (Chavarte et al., 2003b; Salas-Marco et al., 2006). В случае с Paramecium, в eRFl человека вводили мутации в соответствии с аминокислотной последовательностью eRFl парамеции. Для определения специфичности химерных и мутантных eRFl использовали две тест-системы: in vitro и in vivo. In vitro измеряли RF-активность (Release Factor activity) eRFl в отношении трех стоп-кодонов (Frolova et al., 1994). In vivo в культуре клеток человека характеризовали влияние исследуемых eRFl на сквозное прочтение стоп-кодона (readthrough) с использованием двойной репортерной системы (Bidou et al., 2000). Обе системы подходят для сравнения ответа исследуемых eRFl на разные стоп-кодоны.

В работе впервые создан набор генно-инженерных конструкций eRFl для двух родов ресничных инфузорий, в которых N-домен eRFl ресничных соединен с МС-доменом человека, что позволило тестировать функциональную активность полученных химер на рибосомах млекопитающих. Благодаря разработанному методологическому подходу, впервые установлены участки N-концевого домена eRFl стилонихии и эуплоты, ответственные за их вариантные декодирующие свойства. Методом точечного мутагенеза впервые установлены два участка в N-концевом домене eRFl парамеции, определяющие UGA-специфичность. Практическая ценность полученных результатов состоит в том, что найдено несколько способов изменения декодирующих свойств eRFl (например, превращение омнипотентного eRFl человека в eRFl, узнающий только стоп-кодон UGA), что открывает новые перспективы исправления наследственных дефектов геномов путем считывания нонсенс мутаций как смысловых, используя in vivo eRFl с направленно измененными декодирующими свойствами ("трансляционная терапия").

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лекомцев, Сергей Александрович

выводы

1. В инфузориях Stylonychia и Euplotes специфичность узнавания in vivo стоп-код онов фактором терминации трансляции 1-го класса eRFl определяется N-доменами eRFl соответствующего организма.

2. Методом молекулярных химер установлено, что дипептид QF (положения 122-123) в основном определяет in vivo UGA-специфичность eRFl Stylonychia. Аминокислотные остатки Ml24 и F126 eRFl Stylonychia также важны для узнавания UGA.

3. Методом молекулярных химер установлено, что в eRFl Euplotes UAR-специфичность зависит от пептидных фрагментов, локализованных в положениях 38-50 и 123-145 N-домена.

4. Из полученных результатов следует, что инфузории с одинаковым вариантным кодом {Stylonychia и Paramecium) используют разные структурные элементы, определяющие их UGA-специфичность, что свидетельствует о независимых путях их молекулярной эволюции.

5. Полученные экспериментальные данные согласуются с гипотезой о возникновении вариантных кодов в результате эволюции древних организмов с универсальным кодом.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубокую благодарность и искреннюю признательность Льву Львовичу Киселеву, за постоянное внимание к работе, моральную и интеллектуальную поддержку и Людмиле Юрьевне Фроловой за неоценимую помощь в проведении экспериментальной работы, конструктивную критику и плодотворное обсуждение полученных результатов.

Искренне признателен Петру Колосову за создание теоретических и экспериментальных основ без которых была бы невозможна эта работа.

Я благодарю Елену Алкалаеву за мудрые советы и помощь в экспериментальной части работы, Алену Иванову за конструктивную критику и помощь в написании гранта.

Я благодарю всех сотрудников нашей лаборатории, словом и делом помогавших проведению работы: Зиновьеву Ольгу Леонидовну, Сенченко Веру Николаевну, Дубовую Веру Ивановну, Машкову Тамару Дмитриевну, Нину Опарину, Екатерину Анедченко, Бориса Елисеева, Артема Кононенко, Елену Узлову, Анну Кудрявцеву, Юрия Мазура, Алексея Дмитриева и Григория Краснова.

Отдельная благодарность в адрес Андрея Борисовича Полтарауса, Софьи Малахо, Татьяны Родионовы и Василия Пехова за проведение секвенирования всех образцов ДНК.

Я благодарен Жан-Пьеру Руссе за поддержку и возможность эффективно работать в лаборатории Génétique Moléculaire de la Traduction (GMT), Лоре Биду за помощь в "клеточной" части работы, а также всему коллективу лаборатории GMT за дружественную атмосферу и плодотворное обсуждение полученных результатов.

4.7. Заключение

Рассматривая в совокупности все полученные данные, можно придти к некоторым общим заключениям, касающимся взаимоотношений структуры и функции факторов терминации трансляции 1-го класса эукариот с вариантными генетическими кодами.

Безусловно, N-концевой домен eRFl отвечает за специфичность узнавания стоп-кодонов у ресничных Stylonychia, Paramecium и Euplotes, как и у организмов с универсальным генетическим кодом. Этот вывод согласуется с последними результатами исследований, полученными с помощью других подходов (сравнение первичных структур, опыты по химической сшивке и др). Тем не менее, неизвестно, можно ли применить "правило М-домена" ко всем представителям ресничных так как в настоящее время существуют противоречивые данные по этому вопросу.

Аминокислотные остатки, важные для специфичности узнавания стоп-кодонов, различны у еШЧ ресничных, исследованных в этой работе. Следует отметить, что аминокислотные остатки, важные для одной и той же специфичности у организмов стилонихия и парамеция, совершенно разные по природе и локализованы в разных частях ^домена. По-видимому, эволюционирование генетического кода в стилонихии и парамеции происходило независимо.

В ресничной инфузории ЕирШей для установления иАЯ-специфичности еШЧ необходимо значительно большее количество аминокислотных остатков, чем для 1ЮА-специфичности в ею7! парамеции и стилонихии. Возможно, это связано с фундаментальными различиями в узнавании разных стоп-кодонов фактором е!Ш.

Для того чтобы достичь решающего прорыва в расшифровке молекулярного механизма терминации трансляции, необходимо установить трехмерную структуру различных химерных еШ^Т, описанных в этой работе. Кроме того, целесообразно расширить список еШ^Т с разными декодирующими свойствами и разной первичной структурой. Безусловно, в будущем существенную роль должен сыграть рентгеноструктурный анализ высокого разрешения комплексов эукариотических рибосом с еШ7! и мРНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лекомцев, Сергей Александрович, Москва

1. Alkalaeva E.Z., Pisarev A.V., Frolova L.Y., Kisselev L.L., and Pestova T.V. 2006. In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3. Cell 125,1125-1136.

2. Allmang C., and Krol A. 2006. Selenoprotein synthesis: UGA does not end the story. Biochimie 88,1561-1571.

3. Ambrogelly A., Palioura S., and Soil D. 2007. Natural expansion of the genetic code. Nat Chem Biol 3, 29-35.

4. Andersson S.G., and Kurland C.G. 1995. Genomic evolution drives the evolution of the translation system. Biochem Cell Biol 73, 775-787.

5. Andersson S.G., and Kurland C.G. 1998. Reductive evolution of resident genomes. Trends Microbiol 6,263-268.

6. Askarian-Amiri M.E., Pel H.J., Guevremont D., McCaughan K.K., Poole E.S., Sumpter V.G.,' and Tate W.P. 2000. Functional characterization of yeast mitochondrial release factor 1 .J Biol Chem 275, 17241-17248.

7. Beier H., and Grimm M. 2001. Misreading of termination codons in eukaryotes by natural nonsense suppressor tRNAs. Nucleic Acids Res 29,4767-4782.

8. Bertram G., Bell H.A., Ritchie D.W., Fullerton G., and Stansfield I. 2000. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA 6,1236-1247.

9. Bidou L., Hatin I., Perez N., Allamand V., Panthier J.J., and Rousset J.P. 2004. Premature stop codons involved in muscular dystrophies show a broad spectrum of readthrough efficiencies in response to gentamicin treatment. Gene Ther 11, 619-627.

10. Bidou L., Stahl G., Hatin I., Namy O., Rousset J.P., and Farabaugh P.J. 2000. Nonsense-mediated decay mutants do not affect programmed -1 frameshifting. RNA 6,952-961.

11. Birnboim H.C. 1983. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Methods Enzymol 100, 243-255.

12. Brinkmann U., Mattes R.E., and Buckel P. 1989. High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85,109-114.

13. Caron F., and Meyer E. 1985. Does Paramecium primaurelia use a different genetic code in its macronucleus? Nature 314,185-188.

14. Caskey C.T., Beaudet A.L., and Tate W.P. 1974. Mammalian release factor; in vitro assay and purification. Methods Enzymol 30,293-303.

15. Cassan M., Delaunay N., Vaquero C., and Rousset J.P. 1994. Translational frameshifting at the gag-pol junction of human immunodeficiency virus type 1 is not increased in infected T-lymphoid cells. J Virol 68,1501-1508.

16. Chapman B., and Brown C. 2004. Translation termination in Arabidopsis thaliana: characterisation of three versions of release factor 1. Gene 341, 219225.

17. Chauvin C., Salhi S., Le Goff C., Viranaicken W., Diop D., and Jean-Jean O. 2005. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation. Mol Cell Biol 25, 5801-5811.

18. Chavatte L., Frolova L., Kisselev L., and Favre A. 2001. The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur JBiochem 268,2896-2904.

19. Chavatte L., Frolova L., Laugaa P., Kisselev L., and Favre A. 2003a. Stop codons and UGG promote efficient binding of the polypeptide release factor eRFl to the ribosomal A site. J Mol Biol 331,745-758.

20. Chavatte L., Kervestin S., Favre A., and Jean-Jean O. 2003b. Stop codon selection in eukaryotic translation termination: comparison of thediscriminating potential between human and ciliate eRFls. Embo J 22, 16441653.

21. Chavatte L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., and Favre A. 2002. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. Embo J21, 5302-5311.

22. Cohen J., and Adoutte A. 1995. Why does the genetic code deviate so easily in ciliates? Biol Cell 85,105-108.

23. Dontsova M., Frolova L., Vassilieva J., Piendl W., Kisselev L., and Garber M. 2000. Translation termination factor aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes. FEBSLett 472,213-216.

24. Doronina V.A., and Brown J.D. 2006. Неканоническое декодирование стоп-кодонов у эукариот. Молекулярная биология 40, 731-741.

25. Eisen J.A., Coyne R.S., Wu M., Wu D., Thiagarajan M., Wortman J.R., Badger J.H., Ren Q., Amedeo P., Jones K.M., et al. 2006. Macronuclear genome sequence of the ciliate Tetrahymena thermophila, a model eukaryote. PLoS Biol 4, e286.

26. Freistroffer D.V., Kwiatkowski M., Buckingham R.H., and Ehrenberg M. 2000. The accuracy of codon recognition by polypeptide release factors. Proc Natl Acad Sci USA 97,2046-2051.

27. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., and Kisselev L. 1996. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2, 334-341.

28. Frolova L, Seit-Nebi A, and Kisselev L. 2002. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8, 129-136.

29. Frolova L.Y, Merkulova T.I, and Kisselev L.L. 2000. Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6,381-390.

30. Giege R, Sissler M, and Florentz C. 1998. Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity. Nucleic Acids Res 26, 5017-5035.

31. Gomes A.C, Costa T, Carreto L, and Santos M.A. 2006. Молекулярный механизм эволюционных изменений генетического кода. Молекулярная биология 40, 634-639.

32. Grimm М, Brunen-Nieweler С, Junker V, Heckmann К, and Beier Н. 1998. The hypotrichous ciliate Euplotes octocarinatus has only one type of tRNACys with GCA anticodon encoded on a single macronuclear DNA molecule. Nucleic Acids Res 26,4557-4565.

33. Hanyu N, Kuchino Y, Nishimura S, and Beier H. 1986. Dramatic events in ciliate evolution: alteration of UAA and UAG termination codons to glutamine codons due to anticodon mutations in two Tetrahymena tRNAs. Embo J 5, 1307-1311.

34. Hao B., Gong W., Ferguson T.K., James C.M., Krzycki J.A., and Chan M.K. 2002. A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296,1462-1466.

35. Hauryliuk V., Zavialov A., Kisselev L., and Ehrenberg M. 2006. Class-1 release factor eRFl promotes GTP binding by class-2 release factor eRF3. Biochimie 88, 747-757.

36. Helftenbein E. 1985. Nucleotide sequence of a macronuclear DNA molecule coding for alpha-tubulin from the ciliate Stylonychia lemnae. Special codon usage: TAA is not a translation termination codon. Nucleic Acids Res 13, 415433.

37. Hoffman D.C., Anderson R.C., DuBois M.L., and Prescott D.M. 1995. Macronuclear gene-sized molecules of hypotrichs. Nucleic Acids Res 23,12791283.

38. Inagaki Y., Bessho Y., Hori H., and Osawa S. 1996. Cloning of the Mycoplasma capricolum gene encoding peptide-chain release factor. Gene 169,101-103.

39. Inagaki Y., Bessho Y., and Osawa S. 1993. Lack of peptide-release activity responding to codon UGA in Mycoplasma capricolum. Nucleic Acids Res 21, 1335-1338.

40. Inagaki Y., Blouin С., Doolittle W.F., and Roger A.J. 2002. Convergence and constraint in eukaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucleic Acids Res 30, 532-544.

41. Inagaki Y., and Doolittle W.F. 2001. Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucleic Acids Res 29,921-927.

42. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., and Philippe M. 2003. Eukaryotic release factors (eRFs) history. Biol Cell 95,195-209.

43. Ito K., Uno M., and Nakamura Y. 2000. A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680-684.

44. Jukes Т.Н., and Osawa S. 1990. The genetic code in mitochondria and chloroplasts. Experientia 46,1117-1126.

45. Keeling P.J., and Doolittle W.F. 1996. A non-canonical genetic code in an early diverging eukaryotic lineage. EmboJ 15,2285-2290.

46. Keeling P.J., and Leander B.S. 2003. Characterisation of a non-canonical genetic code in the oxymonad Streblomastix strix. J Mol Biol 326,1337-1349.

47. Kervestin S., Frolova L., Kisselev L., and Jean-Jean O. 2001. Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor does not respond to reassigned UGA codon. EMBO Rep 2, 680-684.

48. Kervestin S., Gamier O.A., Karamyshev A.L., Ito K., Nakamura Y., Meyer E., and Jean-Jean O. 2002. Isolation and expression of two genes encodingeukaryotic release factor 1 from Paramecium tetraurelia. J Eukaryot Microbiol 49,374-382.

49. Kim O.T., Yura K., Go N., and Harumoto T. 2005. Newly sequenced eRFls from ciliates: the diversity of stop codon usage and the molecular surfaces that are important for stop codon interactions. Gene 346,277-286.

50. Kisselev L., Ehrenberg M., and Frolova L. 2003. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? Embo J22,175-182.

51. Kisselev L.L., and Buckingham R.H. 2000. Translational termination comes of age. Trends Biochem Sci 25, 561-566.

52. Klaholz B.P., Pape Т., Zavialov A.V., Myasnikov A.G., Orlova E.V., Vestergaard В., Ehrenberg M., and van Heel M. 2003. Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90-94.

53. Knight R.D., Freeland S.J., and Landweber L.F. 2001. Rewiring the keyboard: evolvability of the genetic code. Nat Rev Genet 2,49-58.

54. Kolosov P., Frolova L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., Kononenko A., Oparina N., Justesen J., Efimov A., and Kisselev L. 2005. Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. Nucleic Acids Res 33, 6418-6425.

55. Kong C., Ito K., Walsh M.A., Wada M., Liu Y., Kumar S., Barford D., Nakamura Y., and Song H. 2004. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Mol Cell 14, 233245.

56. Kononenko A.V., Mitkevich V.A., Dubovaya V.I., Kolosov P.M., Makarov A.A., and Kisselev L.L. 2007. Role of the individual domains of translation termination factor eRFl in GTP binding to eRF3. Proteins, в печати.

57. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Didichenko S.A., Smirnov V.N., Chernoff Y.O., Derkach I.L., Novikova O.N., Inge-Vechtomov S.G., Neistat M.A., and Tolstorukov, II. 1990. Divergence and conservation of SUP2

58. SUP35) gene of yeast Pichia pinus and Saccharomyces cerevisiae. Yeast 6, 461-472.

59. Kushnirov V.V, Ter-Avanesyan M.D, Telckov M.V, Surguchov A.P, Smirnov V.N, and Inge-Vechtomov S.G. 1988. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 66,45-54.

60. Le Goff X, Philippe M, and Jean-Jean 0. 1997. Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells. Mol Cell Biol 17,3164-3172.

61. Lee C.C, Timms K.M, Trotman C.N, and Tate W.P. 1987. Isolation of a rat mitochondrial release factor. Accommodation of the changed genetic code for termination. J Biol Chem 262,3548-3552.

62. Liang A, Brunen-Nieweler C, Muramatsu T, Kuchino Y, Beier H, and Heckmann K. 2001. The ciliate Euplotes octocarinatus expresses two polypeptide release factors of the type eRFl. Gene 262, 161-168.

63. Liang H, Wong J.Y, Bao Q, Cavalcanti A.R, and Landweber L.F. 2005. Decoding the decoding region: analysis of eukaryotic release factor (eRFl) stop codon-binding residues. JMolEvol 60, 337-344.

64. Liu J.J, Sondheimer N, and Lindquist S.L. 2002. Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion PSI+. Proc Natl Acad Sci USA 99,16446-16453.

65. Lozupone C.A, Knight R.D, and Landweber L.F. 2001. The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol 11, 65-74.

66. Ma B, and Nussinov R. 2004. Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes. J Biol Chem 279, 53875-53885.

67. Mandel M, and Higa A. 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol 53,159-162.

68. Meyer F, Schmidt H.J, Plumper E, Hasilik A, Mersmann G, Meyer H.E, Engstrom A, and Heckmann K. 1991. UGA is translated as cysteine inpheromone 3 of Euplotes octocarinatus. Proc Natl Acad Sci USA 88, 37583761.

69. Mikuni 0., Ito K., Moffat J., Matsumura K., McCaughan K., Nobukuni T., Tate W., and Nakamura Y. 1994. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 91, 5798-5802.

70. Miranda I., Silva R., and Santos M.A. 2006. Evolution of the genetic code in yeasts. Yeast 23,203-213.

71. Mora L., Heurgue-Hamard V., Champ S., Ehrenberg M., Kisselev L.L., and Buckingham R.H. 2003. The essential role of the invariant GGQ motif in the function and stability in vivo of bacterial release factors RF1 and RF2. Mol Microbiol 47, 267-275.

72. Muramatsu T., Heckmann K., Kitanaka C., and Kuchino Y. 2001. Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons. FEBS Lett 488,105-109.

73. Nakamura Y., and Ito K. 1998. How protein reads the stop codon and terminates translation. Genes Cells 3,265-278.

74. Nakamura Y., and Ito K. 2003. Making sense of mimic in translation termination. Trends Biochem Sci 28,99-105.

75. Nakamura Y., Ito K., and Ehrenberg M. 2000. Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101,349-352.

76. Nakamura Y., Ito K., and Isaksson L.A. 1996. Emerging understanding of translation termination. Cell 87,147-150.

77. Nguyen V.T., Morange M., and Bensaude O. 1988. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Anal Biochem 171,404-408.

78. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F., and Nyborg J. 1995. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270,1464-1472.

79. Osawa S., and Jukes T.H. 1995. On codon reassignment. JMol Evol 41, 247249.

80. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., and Ter-Avanesyan M.D.1996. Propagation of the yeast prion-like psi+. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor. Embo /15,3127-3134.

81. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., and Ter-Avanesyan M.D.1997. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. Mol Cell Biol 17,2798-2805.

82. Petry S., Brodersen D.E., Murphy F.V.t., Dunham C.M., Selmer M., Tarry M.J., Kelley A.C., and Ramakrishnan V. 2005. Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RFl and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123,1255-1266.

83. Pisareva V.P., Pisarev A.V., Hellen C.U., Rodnina M.V., and Pestova T.V. 2006. Kinetic analysis of interaction of eukaryotic release factor 3 with guanine nucleotides. J Biol Chem.

84. Poole E., and Tate W. 2000. Release factors and their role as decoding proteins: specificity and fidelity for termination of protein synthesis. Biochim Biophys Acta 1493,1-11.

85. Preer J.R., Jr., Preer L.B., Rudman B.M., and Barnett A.J. 1985. Deviation from the universal code shown by the gene for surface protein 51A in Paramecium. Nature 314, 188-190.

86. Prescott D.M. 1994. The DNA of ciliated protozoa. Microbiol Rev 58, 233267.

87. Ramakrishnan V. 2002. Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572.

88. Rawat U.B., Zavialov A.V, Sengupta J, Valle M, Grassucci R.A, Linde J, Vestergaard B, Ehrenberg M, and Frank J. 2003. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421, 87-90.

89. Salas-Marco J, and Bedwell D.M. 2004. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. Mol Cell Biol 24, 7769-7778.

90. Salas-Marco J, Fan-Minogue H, Kallmeyer A.K, Klobutcher L.A., Farabaugh P.J, and Bedwell D.M. 2006. Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena and Euplotes. Mol Cell Biol 26,438-447.

91. Sambrook J, Fritsch E.F, and Maniatis T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual, 2 edn (N.Y, Cold Spring Harbor).

92. Samsonova M.G, Inge-Vechtomov S.G., and Taylor P. 1991. Structure comparison and evolutionary relations between elongation factors EF-Tu (EF-1 alpha) and SUP 2 proteins. Genetica 85,35-44.

93. Santos M.A, Cheesman C, Costa V, Moradas-Ferreira P, and Tuite M.F. 1999. Selective advantages created by codon ambiguity allowed for the evolution of an alternative genetic code in Candida spp. Mol Microbiol 31, 937-947.

94. Santos M.A, Moura G., Massey S.E, and Tuite M.F. 2004. Driving change: the evolution of alternative genetic codes. Trends Genet 20,95-102.

95. Sarkar G, and Sommer S.S. 1990. The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8,404-407.

96. Schultz D.W, and Yarns M. 1994. Transfer RNA mutation and the malleability of the genetic code. J Mol Biol 235,1377-1380.

97. Schultz D.W, and Yarns M. 1996. On malleability in the genetic code. J Mol Evol 42, 597-601.

98. Schwede T., Kopp J., Guex N., and Peitsch M.C. 2003. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res 31, 33813385.

99. Seit-Nebi A., Frolova L., Justesen J., and Kisselev L. 2001. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucleic Acids Res 29, 3982-3987.

100. Seit-Nebi A., Frolova L., and Kisselev L. 2002. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBORep 3,881-886.

101. Selmer M., Al-Karadaghi S., Hirokawa G., Kaji A., and Liljas A. 1999. Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic. Science 286, 2349-2352.

102. Soil D., and RajBhandary U.L. 2006. The genetic code thawing the 'frozen accident'. JBiosci 31,459-463.

103. Song H., Mugnier P., Das A.K., Webb H.M., Evans D.R., Tuite M.F., Hemmings B.A., and Barford D. 2000. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl-mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Cell 100,311-321.

104. Stahl G., Bidou L., Rousset J.P., and Cassan M. 1995. Versatile vectors to study recoding: conservation of rules between yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res 23,1557-1560.

105. Studier F.W., and Moffatt B.A. 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189,113-130.

106. Tourancheau A.B., Tsao N., Klobutcher L.A., Pearlman R.E., and Adoutte A. 1995. Genetic code deviations in the ciliates: evidence for multiple and independent events. Embo J14,3262-3267.

107. Trobro S., and Aqvist J. 2007. A Model for How Ribosomal Release Factors Induce Peptidyl-tRNA Cleavage in Termination of Protein Synthesis. Mol Cell 27,758-766.

108. True H.L., and Lindquist S.L. 2000. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature 407,477-483.

109. Uno M., Ito K., and Nakamura Y. 2002. Polypeptide release at sense and noncognate stop codons by localized charge-exchange alterations in translational release factors. Proc Natl Acad Sci U S A 99,1819-1824.

110. Vestergaard B., Van L.B., Andersen G.R., Nyborg J., Buckingham R.H., and Kjeldgaard M. 2001. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl .Mol Cell 8,1375-1382.

111. Wang W., Czaplinski K., Rao Y., and Peltz S.W. 2001. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts. Embo J 20, 880-890.

112. Weixlbaumer A., Petry S., Dunham C.M., Selmer M., Kelley A.C., and Ramakrishnan V. 2007. Crystal structure of the ribosome recycling factor bound to the ribosome. Nat Struct Mol Biol 14, 733-737.

113. Yamao F., Muto A., Kawauchi Y., Iwami M., Iwagami S., Azumi Y., and Osawa S. 1985. UGA is read as tryptophan in Mycoplasma capricolum. Proc Natl Acad Sci USA 82, 2306-2309.

114. Yarns M., and Schultz D.W. 1997. Further comments on codon reassignment. Response. J Mol Evol 45,3-6.

115. Zavialov A.V., Buckingham R.H., and Ehrenberg M. 2001. A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107,115-124.

116. Zavialov A.V., Mora L., Buckingham R.H., and Ehrenberg M. 2002. Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell 10, 789-798.

117. Zhang Y., Baranov P.V., Atkins J.F., and Gladyshev V.N. 2005. Pyrrolysine and selenocysteine use dissimilar decoding strategies. J Biol Chem 280, 2074020751.

118. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov S., Kisselev L., and Philippe M. 1995. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. EmboJU, 4065-4072.

119. Воробьев H. и Киселев JI.JI. 2007. Модель структуры эукариотического рибосомного комплекса терминации трансляции. Молекулярная биология 41, 103-111.

120. Дубовая В.И., Колосов П.М., Алкалаева Е.З., Фролова Л. и Киселев Л.Л. 2006. Влияние индивидуальных доменов фактора терминации трансляции eRFl на индукцию ГТФазной активности фактора терминации трансляции eRF3. Молекулярная биология 40, 310-316.

121. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бахланова И.В., Горелов В.И., Кузьмин Н.П., Крюков В.М. и Ланцов В.А. 1986. Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. Генетика 22,2721-2727.

122. Якобсен Ш.Г., Сегаард Т.М.М., Жан-Жан О., Фролова Л., и Юстесен Ю. 2001. Идентификация нового фактора терминации трансляции eRF3b, обладающего in vitro и in vivo активностью eRF3. Молекулярная биология 35, 672-681.

Информация о работе

Лекомцев, Сергей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы