Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства, структура и функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Свойства, структура и функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. ВА. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

□03058676

Копоненко Артём Вадимович

СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ФАКТОРОВ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ еКП и сИГЗ.

По специальностям 03 00 03 - молекулярная биология, 03 00 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003058676

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной геномики Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель академик, профессор, доктор биологических наук

Л. Л. Киселев

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, ведущий

на заседании Диссертационного совета при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

научный сотрудник О.Ф. Борисова

кандидат биологических накук, доцент П.В. Сергиев

Ведущая организация Институт химической биологии и

фундаментальной медицины СО РАН

Защита диссертации состоится

.часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Актуальность работы.

Терминация трансляции - стадия биосинтеза белков, происходящая в тот момент, когда в декодирующем участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов UAA, UAG или UGA, который декодируется фактором терминации трансляции (RF) 1-го класса В эукариотах это белок eRFl, в прокариотах - RF1 и RF2, в митохондриях и археях - mtRF 1 и aRFl, соответственно Кроме того, в терминации участвуют факторы 2-го класса -eRF3 у эукариот и RF3 у прокариот Хотя общая схема терминации трансляции известна, молекулярные механизмы этого процесса, структурные особенности и физические свойства факторов терминации остаются недостаточно изученными Ранее eRFl и eRF3 исследовали главным образом с помощью генетических, биохимических и молекулярно-биологических методов В этой работе использован ряд физических методов исследования, позволяющих изучать in vitro взаимосвязь между структурой и функциями eRFl neRF3

До сих пор неизвестно, как происходит декодирование стоп-кодона у эукариот Ранее в лаборатории для выявления функционально важных аминокислотных остатков в eRFl, участвующих в узнавании стоп ходонов, использовали точечный мутагенез с последующим определением функциональной активности (RF-активности) полученных мутантов (Seit-Nebi et al, 2002, Frolova et al, 2002, Kolosov et al, 2005) Для интерпретации RF-активности мутантов и определения функционально важных аминокислот необходимо различить изменения RF-активности, связанные с нарушением стереохимической комплементарности стоп-кодона и боковых групп аминокислот в участке узнавания eRFl, от изменений активности, вызванных конформационными перестройками молекулы белка В противном случае это может привести к ошибкам в идентификации декодирующих аминокислотных остатков eRFl Форма молекулы eRFl в растворе не установлена, следовательно, неизвестно, требуются ли изменения конформации молекулы eRFl при связывании с рибосомой Для понимания роли eRF3 на заключительной стадии синтеза белка необходимо изучение

его ГТФазного цикла, вовлеченного в терминацию трансляции

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в использовании физических методов исследования для 1) оценки стабильности белковой молекулы eRFl человека до и после внесения в молекулу точечных мутаций, 2) установления сходства и различий в конформации eRFl в кристалле и в растворе, 3) изучения взаимодействия между разделёнными N-, М- и С-доменами eRFl (рис 1), между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования экспрессировать гены псшноразмерного eRFl и лишенного с N-конца 138 аминокислот eRF3 человека, мутантов eRFl, а также N-, M-, C-, NM- и МС-доменов eRFl в клетках Е coli и получить высокоочшценные препараты этих белков, методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) оценить изменения стабильности белковой глобулы в растворе в результате мутаций Кроме того, исследовать методом малоуглового рассеяния (МУР) рентгеновских лучей структуру eRFl в растворе и сравнить ее с кристаллической структурой, установленной ранее другими авторами Также исследовать взаимодействия между N-, М- и С- доменами eRFl, между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами методом изотермической калориметрии (ITC)

Научная новизна н практическая ценность работы.

Установлен кооперативный характер плавления молекулы фактора терминации трансляции eRFl человека, состоящей из трёх доменов, что свидетельствует об их внутримолекулярном взаимодействии в растворе Ряд аминокислотных замен в N-домене не изменяет термостабильность белка, а в некоторых случаях даже приводит к ее некоторому увеличению Это указывает на невовлечённость этих аминокислотных остатков в поддержание стабильности белковой глобулы eRFl, что согласуется с данными рентгеноструктурного анализа eRFl человека У этих мутантов

избирательность утраты функции стимуляции гидролиза пептидия-тРНК в Р-участке рибосомы в присутствии стоп-кодонов не связана с дестабилизацией их трехмерной структуры, а обусловлена, скорее всего, локальными изменениями стереохимии боковых групп этих аминокислотных остатков в функционально-важных участках N-домена В N-домене Asnl29 и Phel31 существенны для поддержания стабильности структуры eRFl и влияют на избирательное узнавание стоп-кодонов мРНК в рибосоме Узнавание стоп кодонов UAG и UAA in vitro чувствительнее к стабильности трехмерной структуры eRFl человека, чем узнавание стоп-кодона UGA Определены интегральные структурные параметры и форма молекул eRFl человека по данным МУР в растворе, конформация eRFlB растворе близка к конформации в кристалле С помощью изотермической калориметрии определены термодинамические параметры и предложена возможная схема взаимодействия между eRF3 и eRFl, доменами eRFl, eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами. Для связывания ГТФ eRF3 требует присутствия eRFl Mg2" стимулирует связывание ГТФ, но не ГДФ Ранее было показано, что взаимодействие между eRFl и eRF3 ограничивается их С-доменами Мы установили, что М домен eRFl также взаимодействует с eRF3 Для связывания ГТФ с eRF3 необходимо присутствие М- и С-доменов eRFl Обнаружено взаимодействие в растворе индивидуальных доменов eRFl Тройной комплекс из М-домена, С-домена и eRF3 связывает ГТФ Все изложенные выше результаты получены впервые и ранее в литературе не описаны

Исследование терминации трансляции у эукариот имеет важное значение и для медицины Понимание механизмов функционирования факторов терминации человека может привести к разработке генно-инженерных систем, позволяющих модулировать действие факторов in vivo, то есть к созданию трансляционной терапии (Киселев, 2006), основанной на преодолении преждевременной терминации трансляции, ведущей к патологическим последствиям

Апробация работы и публикации.

Материалы работы были представлены на следующих конференциях

1 Четвертой ежегодной молодежной конференция ИБХФ РАН-ВУЗы (2004) «биохимическая физика»

2 Пятой ежегодной молодежной конференция ИБХФ РАН-ВУЗы (2005) «биохимическая физика»

3 The 8Л International Engelhardt Conference on Molecular Biology RNA-Protern interactions, august 2006

По материалам диссертации опубликовано^ работ

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 123 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (167 наименований) Диссертация содержит 23 рисунка и 6 таблиц

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение eRF3 и eRFl человека, доменов и мутантных форм eRFl.

Рекомбинантные белки укороченный с N конца eRF3 (аминокислоты 139-637), кодируемый геном GSPT1 (eRF3a), eRFl, мутантные формы eRFl человека и его MC-, NM-, N-, М- и С-домены, несущие шесть гистидиновых остатков на С-конце, экспрессировали в штаммах Е coli BL21(DE3) pUBS520 и C41(DE3) На первой стадии очистки применяли аффинную хроматографию на Ni-NTA агарозе (Qiagen), далее использовали катионобменные HiTrap Q HP 16/25 (1 или 5 мл), mono Q HR5/5 1мл и анионообменные HiTrap S HP 16/25 (1 или 5 мл) колонки В результате очистки получали гомогенные препараты белков, которые при электрофорезе в денатурирующих условиях давали единственную полосу Для ДСК препараты белков концентрировали на HiTrap Q HP 7/2 5 колонке, элюировали 50 мМ Трис-HCl, pH 8 0, 0 4 М KCl, 0 1 мМ ЭДТА Для МУР белок элюировали тем же буфером и во фракцию, содержащую 7,5 мг/мл

еКР1, добавляли мочевину до 0 5 М Для 1ТС белки диализовали против 0 1 М КС1, 25 мМ фосфата калия (рН 7 5), 10% глицерина, 1 мМ БИ (фосфатный буфер) или 0 15 М КС1, 50 мМ трис-НС! (рН 7 5), 10% глицерин 5 мМ Р-меркаптоэтанол (трис буфер) и различных концентраций При

необходимости образцы концентрировали с помощью концентрирующих мембран Сепйтсоп ирУ4ВСС25 (МШфоге)

Измерения малоуглового рассеяния.

Измерения проводили в Институте кристаллографии РАН в лаборатории малоуглового рассеяния на малоугловом рентгеновском диффрактометре АМУР-К с однокоординатным позиционно-чувствительным детектором при длине волны X = 0,154 нм со щелевой коллимацией по схеме Кратки Время измерения составляло 3 часа как для раствора белка, так и для буферного раствора

Измерение флуоресценции растворов белков.

Интенсивность собственной флуоресценции растворов еМ^ проводили в лаборатории физики биополимеров с помощью спектрофлуориметра рМ-1 (РТ1) при комнатной температуре в 50 мМ 1рис-НС1 рН 8 0, 0 4 М КС1, 0 1 мМ ЭДГА Содержание мочевины в буферном растворе варьировали от 0 1 до 3 5 М Интенсивность флуоресценции измеряли при возбуждении 1=265 и 284 нм и регистрировали в интервале длин волн 280-400 нм

Дифференциальная сканирующая и изотермическая титрационнаи калориметрии.

Измерения проводили в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа ИМБ РАН на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре СКАЛ-1 (ЗАО "Скал", Пущино, Россия) в стеклянных ячейках объемом 0,32 мл при скорости нагрева 1 К/'мкн, а в отдельных случаях 0,125, 0,5 и 2 К/мин Для обработки и анализа кривых плавления использовали программный пакет "\Ут8саГ' ЗАО

"Скал" (Россия) Термодинамические параметры взаимодействия eRF3 и eRFl с лигандами измеряли в той же лаборатории с помощью изотермического калориметра MicroCal VP-ITC (MicroCal, Northampton, MA) Опыты проводили в фосфатном и трис буферах в присутствии от 0 до 10 мМ Mg'*' при 25 °С Полученные кривые обрабатывали с помощью программы MicroCal Origin

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Связь между термостабильностью eRFl и изменениями функциональной активности его мутантов*.

Механизм декодирования стоп-кодонов мРНК фактором терминации трансляции eRFl остается во многом неясным Для выявления функционально важных аминокислотных остатков в eRFl, участвующих в узнавании стоп-кодонов, использовали точечный мутагенез, заменяя аминокислотные остатки в N-домене в участках предполагаемого взаимодействия eRFl со стоп-кодонами мРНК в рибосоме, и определяли функциональную активность полученных мутантов Данные по изменению функциональной активности этих мутантов т vitro позволили определить остатки, предположительно вовлеченные во взаимодействия со стоп-кодонами мРНК в рибосоме (Frolova et al, 2002, Seit-Nebi et al, 2002, Kolosov et al, 2005) В структуре N-домена eRFl человека можно выделить два минидомена первый содержит NIKS - мотив, инвариантный в эукариотах с универсальным генетическим кодом, и второй мотив - YxCxxxF, имеющий в своём составе как инвариантные Tyrl25, Cysl27 и Phel31, так и полуконсервативные аминокислотные остатки (рис 1) С помощью сайт-специфического мутагенеза удалось показать важную роль этих минидоменов для функции декодирования стоп-сигнала Однако, оставалось неясным, связано ли изменение RF-активности мутантов с нарушением функции декодирования стоп-кодонов или с изменением пространственной структуры белка за счет изменения его стабильности Для выявления возможного вклада дестабилизации белковой глобулы в изменении RF-активности у мутантов

N-домен

В NIKS

Ряс. 1. Пространственная структура А - eR.Fl человека по

YllS-cm-WSI данным рентгеноструктурного

N1»

.,„ -"4,1 анализа (Song а аЗ., 2000); В -

аминокислотные остатки в N-."■¿Л домене eRFl человека, свойства ' которых описаны в таблице I,

пунктиром

обозначена

преяпслогасмая водородная связь между E5S и YI25. NIKS, GGQ -функционально важные участки показаны в однобуквен-ном аминокислотном коде

использовали метод ДСК. Для анализа выбрали мутанты, содержащие замены функционально важных аминокислотных остатков, предположительно участвующих во взаимодействии со стоп-кодонами или участвующих а поддержании трёхмерной структуры белковой глобулы (рис.

Расположение доменов в кристаллической структуре молекулы eR.Fl (рис. 1) предполагает, что в молекуле eRFl под действием температуры они будут плавиться независимо друг от друга. Однако, как мы показали (рис. 2), плавление молекулы еКР1 носит кооперативный характер. Это может говорить о взаимодействии между доменами в растворе.

В таблице 1 приведены измеренные нами температуры денатурации в сравнении с изменениями функциональной активности мутантов еЛР1, взятые из литературы. Данные по изменению терм о стабиль но ста позволяют разделить все исследованные мутанты на 4 группы.

К первой группе отнесены мутации, не влияющие на термостабильность еКП или вызывающие крайне несущественные ее изменения, не превышающие 0,5°С. Это мутанты 01и55Азр, Туг125Р11е и Аяпб^ет (табл. 1 №3, 6, и 16, соответственно). Учитывая данные рентгешетру ктурного анализа кристаллов еРР1 и изменения КР-активности мутантов по остатку С1и55 (табл. !, №2, 3 и 4.), предполагали участие

1В).

I

Рис. 2 Тепловая денатурация еЛН человека Зависимость парциальной молярной

теплоемкости от температуры

«Í 10

карбоксильной группы Glu55 в

40 60

Температура,

80 образовании водородной связи с ОН-группой Tyrl25 (Kolosov et al, 2005)

Вероятно, сохранение водородной связи между остатками Glu55 и Туг125 необходимо для сохранения способности eRFl узнавать стоп-кодон UAG, но необязательно для поддержания стабильности структуры, как следует из данных калориметрии (табл 1) В кристалле остатки Asn61 и Ser64 расположены на петле, соединяющей а2 и аЗ спирали, и не участвуют во внутримолекулярных контактах (Song et al, 2000) Следовательно, они не вовлечены в поддержание трехмерной структуры белка Учитывая эти данные, уменьшение RF-активности этих мутантов можно отнести за счет изменения стереохимических взаимодействий между мутантной формой eRFl и стоп-кодоном мРНК в рибосоме

Ко второй группе отнесены мутанты Glu55Arg, Glu55Ala, Asn61Ser+Ser64Asp, Cysl27Ala, Asnl29Ala и Ser64Asp (табл 1 №1, 4, 17, 7, 10, и 15, соответственно) Замены аминокислот в этих мутантах приводят к слабым (в пределах 0 5-2 °С) эффектам на термостабильность белковой глобулы Вероятно, функциональные эффекты при этих мутациях в большей степени связаны не с дестабилизацией трехмерной структуры, а с изменением локальных стереохимических взаимодействий Влияние такой дестабилизации на функцию eRFl маловероятно, если учесть, что более глубокое падение термостабильности не влияет на RF-активность некоторых мутантов (табл 1, №7 и 8) В качестве примера рассмотрим мутант Cysl27Ala, поскольку более сильное падение термостабильности у мутанта Cysl27Ser не приводит к падению его RF-активности по сравнению с мутантом Cysl27Ala, можно предположить, что изменение в RF-активности этих мутантов не связано с уменьшением термостабильности белка Поверхностное расположение Cysl27 в кристалле eRFl не предполагает его

Таблица 1. Сравнение температуры плавления мутантных белков еМЧ человека с их функциональными свойствами

X» Мутант eRF1 Td,°C "RF-aKTHBHOCTb

аДТ„,°С UAA UAG UGA

1 Дикий тип 55 3 0 ++++ ++++ in ,

2 E55R 54 4 -0 9 4+++ ++++ ++++

3 E55D 55 8 +0 5 +++ + ++-Г

4 Е55А 54 5 -0 8 +++ + 1111

5 Y125A 52 5 -2 8 - - -

6 Y125F 55 6 +03 I l i i ++ ++++

7 С127А 54 0 -13 ++ ++ ++++

8 C127S 51 8 -3 5 ++ ++ Mil

9 C127A+N129A 50 8 -4 5 - - +++

10 N129 А 53 7 -16 ++++ 4++ 4-НЧ-

11 12 N129P 48 6 -6 7 +++ + ++++

F131A 52 6 -2 7 - _ +++

13 N129A+F131A 49 3 -6 0 - - ++

14 N129P+K130Q 47 4 -79 ■I l l l ++ ++++

15 S64D 57 +1 7 ++ ++ ++

16 N61S 55 5 402 +++ ++ ++++

17 N61S+S64D 56 4 +1 1 + -4- -r

18 N61S+S64D+ N129P+K130Q 50 -5 3 - - 1 1 1 1

Примечание Та - температура денагурационного перехода, 5АГ<1=Х)(мутант) -Т^дикий тип), 6К^-активность мутантов указана в % от активности белка дикого типа 0-10%-, 1130% +, 31-60% ++, 61-80% 4++, 81-100% ++++ Величины КР-активностей взяты из предыдущих работ лаборатории (Рго1оуа е1 а1, 2002, веЦ-КеЫ & а1, 2002, КоЬэоу ег а1, 2005)

участия во внутримолекулярных контактах

Третью группу составляют мутации Туг125А1а, Суз1278ег, Су5127А1а+А8п129А1а и РЬе131А1а (табл 1, № 5, 8, 9 и 12), дестабилизирующие структуру на 2-5 °С Изменение термостабильности этих мутантов может быть вызвано заметными изменениями в пространственной структуре белка, которые в принципе могут затрагивать декодирующий

участок cRFl Сравнение изменений термостабильности и RF-активности у мутантов, имеющих близкородственные замены, облегчает интерпретацию результатов Например, исчезновение RF-активности мутанта Туг125А1а скорее всего обусловлено утратой ароматического кольца, которое может вступать в контакт с окружающими аминокислотными остатками, поскольку замена Туг125 на Phe не влияет на термостабильность и вызывает 50% падение RF-активности только в присутствии UAG (табл 1) Уменьшение активности по отношению к стоп-кодону UAG в мутанте Tyrl25Phe связано с утратой ОН-группы тирозина и, вероятно, обусловлено локальными стереохимическими изменениями, которые могут быть связаны с утратой Н-связи между Туг125 и Glu55 в мутантном белке (Kolosov et al, 2005) (рис 1В) В кристаллической структуре eRFl Phel31 направлен внутрь белковой глобулы, что предполагает его участие во внутримолекулярных контактах (Song et al, 2000) Отсутствие ароматического кольца в мутанте Phel31Ala может вызвать достаточно существенные локальные структурные изменения, однако, не приводящие к полной инактивации (табл 1) Таким образом, роль Phe 131 в поддержании структуры eRFl кажется вероятной, в то время как непосредственное его взаимодействие со стоп-кодоном потребовало бы глобальных изменений струюуры N-домена, которые не обнаружены

Четвертую группу составляют мутации, дестабилизирующие трехмерную структуру (выше 5°С) Asnl29Pro, Asnl29Pro+ Phel31Ala, Asnl29Pro+Lysl30Gln и Asn61Ser+Ser64Asp+ Asnl29Pro+Lysl30Gln (табл 1, №11, 13, 14 и 18) Изменение RF-активности этих мутантов в принципе может быть связано с уменьшением общей стабильности белковой глобулы Единственная одиночная замена, приводящая к сильной дестабилизации белка, это Asnl29Pro (табл 1) Введение пролина в 129 положение может сильно дестабилизировать структуру белка, поскольку пролин имеет тенденцию разрушать структуру а-спирали и р-слоя В то же время в Asnl29Ala изменения RF-активности мутанта почти не происходит (табл 1, №10), поэтому маловероятно, что падение RF- активности в мутанте Asnl29Pro связано с участием Asnl29 в декодировании стоп кодонов, хотя его

расположение в кристалле eR.Fl не исключает такую возможность Наблюдается прямая зависимость между падением стабильности и ЕР-акгивности в этих двух мутантах Это позволяет отнести изменение Ш"'-активности Абп 129Рго ейЛ за счет падения стабильности белка

Сравнивая изменения термостабильности и ИТ-активности (табл 1), можно отметить отсутствие прямой корреляции между падением активности и термостабильности мутантов Так, падение Та на 6 °С у мутанта Абп 129Рго+РЬе 131 А1а коррелирует с глубокой инактивацией по двум стоп кодонам, а более глубокое падение Та на 8 °С у мутанта А5п129Рго+Ьу513001п не сопровождается существенным изменением его КГ-активности (табл 1, №13 и 14) Таким образом, у молекулы белка еШ-Т существует «запас прочности структуры», благодаря которому сильные изменения стабильности могут не сказываться или мало влиять на его конформацию и/или функцию (табл 1, №11 и 14)

Значительные изменения стабильности eR.Fl наблюдали только при отдельных точечных мутациях (табл 1, №11, 13, 14 и 18), в то время как для большинства исследованных случаев изменения функциональной активности мутантов могут быть в большей мере связаны с чисто стереохимическими эффектами и с локальными изменениями конформации соседних аминокислотных остатков (табл 1, № 2, 3, 4, 6, 9, 15,16 и 17,)

Молекулярная морфология сЯК1 в растворе.

Молекула еКР1 в кристалле состоит из трех доменов, которые сочленены друг с другом подвижными линкерами, что позволяет доменам сохранить подвижность друг относительно друга (рис 1) Как организован еВР1 в растворе и отличаются ли его общая организация в кристалле, растворе и в рибосоме неизвестно Кооперативное» плавления молекулы еШ-Т (рис 2) указывает на междоменные взаимодействия внутри молекулы, что может указывать на большие площади междоменных контактов, чем это следует из кристаллической структуры Метод МУР позволяет исследовать морфологию макромолекул в растворе в условиях, приближенных к

0,01;

0,00 0,02 0,04 0,0В 0,08 0,10 0 12 0,14 0 16

в, А1

Рис 3. Сравнение сглаженной кривой малоуглового рассеяния (точки) от раствора еЯР! с теоретической кривой рассеяния (сплошные линии), рассчитанными от известной кристаллической структуры е!Ш человека (см рис 1А), где Б - модуль

, .4115116 вектора рассеяния 1*1- д , I-

интенсивность малоуглового рассеяния

физиологическим

Опыты показали, что еМЧ склонен к агрегации По данным МУР 1520% молекул eR.Fl представляют собой димеры, что мешает корректно определить форму и размеры молекул eRFl в растворе Для предотвращения димеризации использовали 0,5 М мочевину, в присутствии которой проводили измерения Поскольку мочевина может частично денатурировать белок, необходимо было проверить отсутствие денатурации при данной концентрации мочевины Для этого использовали высокую чувствительность собственной УФ-флуоресценции белка, чтобы обнаружить возможные изменения в окружении хромофоров белка В присутствии 0 5 М мочевины изменения в спектре флуоресценции крайне незначительны форма спектра и положение максимума не меняются, интенсивность флуоресценции возрастает на 15%, независимо от времени инкубации в течение 24 часов Можно предположить, что при концентрации мочевины до 0 5 М, макромолекула е!1Р1 практически сохраняет исходную трехмерную структуру На рис 3 показаны теоретическая кривая, рассчитанная по кристаллической структуре и идеализированная сглаженная экспериментальная кривая интенсивности МУР от раствора еКР1 Видно совпадение кривых в начальной части углового диапазона для eRFl, что свидетельствует о близости формы белка в кристалле и растворе Для гипотетической формы eRFl со сближенными С и N доменами характерна большая разница между теоретическими и экспериментальными кривыми Это позволяет предпологать, что такая конформация не соответствует форме

14

Рис. 4. Форма низкого разрешения молекулы eRFl человека, восстановленная по данным малоуглового рассеяния от раствора в сравнении с кристаллической структурой Молекулы показаны в двух ориентациях. а - кристаллические структуры eRFl, д -. восстановленные структуры eRFl по данным малоуглового рассеяния

белка в растворе. На рис, 4 показана типичная структура низкого разрешения, найденная с помощью программы DAMMIN по данным рис. 3. Видно, что форма, найденная без каких-либо дополнительных предположений о структуре белка, относительно близка по анизометрии к кристаллической структуре eRFl и позюляет сделать вывод о мономерной форме eRFl в растворе в данных условиях.

Расстояние между центрами наиболее удалённых атомов (NIKS и GGQ-мотивы, рис. 1 и 4) составляет ~107 А в кристалле (без учёта гидратной оболочки (-5 А)) и примерно столько же, как мы показали, в растворе, eRFl рассматривается как функциональный аналог тРНК и поэтому в рибосоме в А-участке это расстояние должно быть существенно меньше, около 75 А, Сочленение .между N и М доменами eRFl осуществляется через достаточно гибкий линкер (рис. 1А), поэтому структура молекулы позволяет сблизить эти домены до нужного расстояния. Как показано в данной работе, этого в растворе не происходит. Отскща следует, что в рибосоме структура eRFl должна претерпевать изменения конформации по отношению к раствору

(уменьшение угла между N- и М-доменами) Следовательно, связывание eRFl с рибосомой должно вести к конформационным изменениям молекулы eRFl Молекулярное моделирование eRFl человека, выпояненное двумя разными методами (Ma & Nussinov, 2004, Воробьёв и Киселёв, 2007), подтверждает возможность такой конформационной перестройки

Образование четверного комплекса eRFl«eRF3*TT<I>*Mgi+ в растворе*.

Отсутствие достаточной информации, касающейся взаимодействия между eRF3, eRFl и гуаниловыми нуклеотидами in vitro, препятствует более глубокому пониманию ГТФазного цикла eRF3, вовлеченного в терминацию трансляции (Alkalaeva et al, 2006) Для количественного исследования формирования комплексов между eRF3 и его лигандами, сравнения их термодинамических параметров, использовали метод ITC

На рис 5, А-С показаны данные ITC для связывания eRF3 с ГДФ в отсутствие Mg2t (А) и в присутствии 2 мМ (В), 10 мМ (С) Mg2+ (табл 2) В отличие от ГДФ, не удалось обнаружить связывание ГТФ с eRF3 Взаимодействие между eRFl и eRF3 приводит к образованию комплекса, способного связывать ГТФ (табл 2) Константа связывания комплекса eRFl«eRF3 с ГТФ в 4 раза лучше, чем с ГДФ (табл 2) Mg2+ увеличивает аффинность ГТФ, но не ГДФ, к комплексу eRFl»eRF3 в 6 раз (табл 2) ГТФ вытесняет ГДФ из тройного комплекса eRFl-eRFS*^® в присутствии 2 мМ Mg2'1" (рис 5D) и наоборот (табл 2)

Основываясь на результатах, приведенных в таблице 2 и рис 5, предположена последовательность взаимодействий eRF3 с его лигандами, которая согласуется с имеющимися в литературе данными На рис 6 рассмотрены два возможных пути взаимодействия eRF3 с его лигандами Если eRF3 следует варианту (а), тогда он связывает ГДФ независимо от концентрации Mg24 Поскольку eRF3 не связывает ГТФ в отсутствие eRFl, возможно, подобно прокариотическому белку RF3, существует в цитозоле в ГДФ связанной форме На стадии (la) eRFl связывается с комплексом еКГЗ'ГДФ и, возможно меняет конформацию eRF3 Нужно отметить, что

А

ООО -«05 1 -010 а-015 -0.20 О

■ -4

I

3 -6

Рис. 5 Кривые ITC (верхняя панель) и изотермы связывания (нижняя панель) eRF3 с ГДФ в отсутствие (А) или присутствии 2 мМ (В) или 10 тМ (С) MgCb, (D) взаимодействие eRFl-eRF3*mcb комплекса с ГТФ в 2 мМ MgCl2,25°С, в фосфатном буфере (pH 7 5)

Таблица 2. Термодинамические параметры связывания eRF3 с eRFl, ГДФ и ГТФ при 25°С

и pH 7 5 полученные с помощью изотермической титрационной калориметрии3

MgCh A'de АН* T&S Д G

Образец Лиганд

мМ М1 цМ ккал/моль ккал/моль ^ккал/моль

eRF3 ЩФ 0 9 1x105 1 1 -9 8 -1 7 -8 1

eRF3 ЩФ 2 5 6x105 1 9 -9 2 -1 4 -7 8

eRF3 ЩФ 10 3 6x105 28 -2 1 55 -7 6

eRF3 eRFl 0 6 0x105 1 7 -7 4 -0 5 -7 9

eRF3 eRFl 2 1 4х106 07 -7 2 1 2 -8 4

еЯРЗ-ГДФ eRFl 2 4 9x106 02 -3 1 60 -91

eRFl-eRF3 ЩФ 2 5 1х105 20 -11 8 -40 -7 8

eRFl*eRF3 ГТФ 0 3 6x105 28 1 1 87 -7 6

eRFl»eRF3 ГТФ 2 2 0x106 05 -2 2 64 -8 6

eRFl»eRF3*IH®e ГТФ 2 3 1х10б 03 -8 9

eRFl*eRF3-n4D< ЩФ 2 4 6x105 22 -7 7

* все измерения проводили в 25 мМ К2НРО4, 10% глицерин, 1 мМ ДТТ и 0 1 М KCl

ЬКЛ - константа ассоциации (связывания), стандартное отклонение не превышает ±20% °К1=1Ж>

" АН - изменение энтальпии, стандартное отклонение не превышает ±8%

'для вычисления констант использовали модель конкурентного связывания (МЛеУкЬ е1

а!, 2006)

тройной комплекс е11Б1*еКРЗ*ГДФ будет формироваться легче, чем бинарный комплекс еКРЬеЯРЗ, поскольку константа связывания для стадии (1а) в 3 5 раза выше, чем для еКГЬеЮ-'З и еРУРЗ будет преимущественно находиться в ГДФ связанной форме На стадии (Па) ГДФ в комплексее КП'еЯРЗ'ГДФ замещается на ГТФ с образованием комплекса еКП'еИРЗ'ГТФ Благодаря

Рис. 6. Схема

иллюстрирующая взаимодействие eRF3, eRF 1, гуаниловых нуклеощдов и Mg1 в терминаини трансляции. Ке соответствующих стадий указаны в скобках (табп 2).

конформационным

изменениям, которые,

| Fiind:r>3 * the iibwevmi

вероятно, индуцирует eRFl при связывании, eRF3 приобретает способность

I

связывать ГТФ и

вытеснять ГДФ. Этот: обмен становится возможным не из-за уменьшения константы связывания eRF3 с ГДФ, которая не .меняется (табл. 2). Поскольку константа связывания ГТФ с комплексом eR.Fl*eRF3 в 4 раза выше, чем для ГДФ и концентрация ГГФ в клетках млекопитающих по крайней мере в 10 раз выше, чем ГДФ, обмен нуклеотидов становится возможным.

Вариант (Ь) в принципе также возможен (рис, 6). Если eRF3 связывается сначала с eRF], а не с ГДФ, как в варианте (а), то такой комплекс приобретает способность связывать 1ТФ (ПЬ). Хотя константа связывания sRF3 с eRFl в 2 раза выше, чем eRF3 с ГДФ, формирование такого комплекса менее вероятно кз-за существенно более низкой концентрации eRFl по сравнению с ГДФ. Независимо от того, какой вариант, (а) или (Ь), окажется предпочтительным, оба они приводят к формированию тройного комплекса eRFl*eRF3*rT®. По данным Kong et al, (2004) в присутствии Mg2" аффинность ГГФ к eRF3 увеличивается. По нашим данным аффинность ГТФ к eRFl*eRF3 возрастает в 6 раз в 2 мМ M g2' (табл. 2). Исходя из того, что Mg! стабилизирует образование тройного комплекса, можно предположить

Î8

образование четверного комплекса, который включает Мз2+, координируемый ГТФ и еЯРЗ, что характерно для большинства ГТФаз Как известно, необходим в первую очередь для связывания и предотвращения диссоциации ГТФ и на аффинность ГДФ к еЮТ М£2+не влияет Поэтому в цитозоле, вероятно, формируется четверной комплекс еЯРЬеКРЗ'ГТФ'!^^ Основываясь на наших данных, формирование этого функционально активного комплекса не нуждается ни в вЕБ (белковый фактор обмена гуаниловых нуклеотидов), ни в ОЕР-активности рибосомы, которые, как известно, необходимы для прокариотических трансляционных ГТФаз Таким образом, в эукариотах роль рибосомы сводится к тому, чтобы катализировать гидролиз ГТФ в еКР1»еКРЗ'ГТФ*М£2+-комплексе, полностью зависимый от присутствия рибосомы Следовательно, роль рибосомы по отношению к терминации трансляции, также как и функции факторов 2-го класса у про- и эукариот значительно различаются

Взаимодействия между индивидуальными доменами еКП*.

Методом 1ТС обнаружены взаимодействия между изолированными доменами eR.Fl в растворе К-домен связывается с М- и МС-доменами, но не с С-доменом, М-домен связывает И- и С-домены, С-домен связывает М- и МЫ-домены (табл 3) Связывание между МС- и Т\т- доменами происходит несомненно благодаря взаимодействию между М- и К- доменами, поскольку и С- домены не связываются Аналогично, связывание между КМ- и С-доменами происходит благодаря М-домену Обсуждая данные, собранные в таблице 3, необходимо помнить о двух существенных обстоятельствах Во-первых, вышеупомянутые взаимодействия выявлены в растворе, а не в рибосоме, где конформация eRFl может значительно меняться Во-вторых, подвижность индивидуальных доменов, не связанных ковалентно, как в целой молекуле еЯП, существенно выше, поэтому, в целой молекуле еКГ1 некоторые из описанных взаимодействий могут быть затруднены вследствие ограниченной подвижности доменов С другой стороны, кооперативное плавление еИР!, обнаруженное методом ДСК (рис 2), свидетельствует о

междоменном взаимодействии в целой молекуле еКР1 Поэтому нельзя исключать существование подобных междоменных контактов в целой молекуле еЯР 1 в цитозоле

Таблица 3 Термодинамические параметры взаимодействия между индивидуальными доменами еМЧ при 25°С, рН 7 5, рассчитанные из данных изотермической титрационной калориметрии8

домены eRFl Ki АН1 TAS* AGf

образец лигавд М1 цМ ккал/моль ккал/моль ккал/моль

С М \ 8x1О5 21 1 5 92 -7 7

N М 42x1О5 24 1 0 87 -7 7

N MC 3 6x105 28 1 0 86 -7 6

С N 4Д

NM С 3 5x105 29 19 95 -7 6

а все измерения проводились в 25 мМ К2НРО4, 10% глицерин, 1 мМ ДТТ , 0 1 М KCl и 2 мМ MgCb

bKt - константа связывания, стандартное отклонение не превышает ±20% с Кл - константа диссоциации, Kt= 1/К,

d АН - изменение энтальпии, стандартное отклонение не превышает ±8% с A.S'- изменение энтропии, рассчитанное по уравнению АG =AH-TAS ' AG - свободная энергия Гиббса, AG=-RTlnK* НД - связывание не детектируется

N, М, С,- индивидуальные домены eRFl, NM и MC - двойные домены eRFl, М+С -эквимолярная смесь двух индивидуальных доменов

Роль индивидуальных доменов eRFl в связывании ГТФ с eRF3*.

В связи с ролью доменов eRFl в формировании комплекса eRF3 с ГТФ возникает ряд вопросов могут ли индивидуальные домены eRFl связываться с eRF3 в растворе"? Какие домены или какой домен eRFl достаточны, чтобы индуцировать связывание ГТФ с eRT3 и ГТФазную активность eRF3 в присутствии рибосомы7

Ранее установлено, что eRFl связывается с eRF3 через С-домен Методом ITC показали, что М-домен eRFl также связывается с eRF3 (рис 7, табл 4) Роль М-домена в связывании eRFl с eRF3 была замаскирована

Д Т1т» (ггип)

О 20 40 80 80 1 00

£ Т!тв (Гтип)

О 20 40 60 ВО 100

^ Т1гпв (тл)

О 20 40 60

Р Ттв (тЬ)

0 20 40 60 80 100

0 0 0 5 10 13 ММагКаОо

Рис. 7 Кривые 1ТС (верхняя панель) и изотермы связывания (нижняя панель) взаимодействия еКРЗ с еИР1 (А) МС (В) М (С) и С доменами (В) при 25°С, в фосфатном буфере (рН 7 5)

Таблица 4 Термодинамические параметры связывания еКЕЗ с ГДФ, ГТФ, еКР1 и его индивидуальными доменами при 25°С, рН 7 5, полученные с помощью изотермической титрационной калориметрии3

к* ДЯ* ГМ" ДС

Образец Лиганд м1

цМ ккал/моль ккал/моль жал/моль

еЯГЗ еЫ7! 1 4x106 07 -7 2® 12 -8 4

еИРЗ N домен нд

еКРЗ Мдомен 6 7x105 1 5 3 7* 11 6 -7 9

еИРЗ С домен 1 0x106 1 -16 2 -8 0 -8 2

еЮТ МС домен 3 5х106 03 -8 8® -0 1 -8 9

еКРЗ-М С домен 1 ЗхЮ6 08 -13 5 -5 2 -8 3

М+С еЯРЗ 2 7х106 04 -7 7 1 1 -8 8

еКГЗ Л'М домен ВД

еЯП-еЯРЗ ГДФ 5 1х105 20 -11 8 -40 -78

еКРЗ-С ЩФ 4 8x105 2 1 -12 3 -4 5 -7 8

еКРЗ'М ЩФ 7 7x10' 1 3 -12 8 -48 -8 0

е^З-МС ЩФ б 4х105 1 6 -112 -3 3 79

еЫП'еЯРЗ ГТФ 2 0x106 0 5 -2 2 64 -8 6

еКИЗ-С ГТФ нд

еКИЗ-М ГТФ нд

еКРЗ-МС ГТФ 2 бхЮ6 04 -2 8 59 -8 7

еЯРЗ«(М+С) ГТФ 7 5x105 1 3 -0 5 75 -8 0

а Условные обозначения такие же, как для таблицы 3

8 расчет термодинамических параметров происходил с учетом эффекта протонирования, как описано (МлгкемсЬ е1 а1,2006)

значительно большим вкладом С-домена во взаимодействие между eRF3 и eRFl Поскольку М- и С-домены связываются с eRF3 независимо и аддитивно (табл 4, рис 7), вероятно, М-домен связывается непосредственно с eRF3, а не через взаимодействие с С-доменом Взаимодействие двух доменов eRFl из трех с eRF3 показывает, что площадь межбелковых контактов в cRF3*eRFl комплексе значительно больше, чем предполагали ранее

Интересно, что NM-домен неспособен связывать eRF3 в отличие от изолированного М-домена (табл 4) По-видимому, взаимодействие между Ми N-доменами препятствует связыванию М-домена с eRF3 Это возможно, например, в случае, когда одни и те же молекулярные поверхности М-домена вовлечены в связывание как с N-доменом eRFl, так и с eRF3 MC-домен не только эффективно связывается с eRF3 (рис 7), но также способен индуцировать связывание ГТФ с eRF3 (табл 4) Более того, МС-домен стимулирует ГТФазную активность eRF3 в присутствии рибосомы Кроме того, eRF3, М- и С-домены формируют тройной комплекс, который также способен связывать ГТФ (табл 4) Термодинамические параметры связывания eRF3 с М- и С-доменами сходны с параметрами взаимодействия между MC-доменом и eRF3 (рис 7, табл 4) Энтальпия связывания С-домена с комплексом eRF3«M приблизительно равна сумме энтальпий взаимодействий С- и М- доменов и eRF3 с С-доменом, что предполагает способность С-домена связываться одновременно как с М-доменом eRFl, так и с eRF3 Данные ITC указывают на специфическое формирование комплекса между М- и С-доменами eRFl, который можег связывать eRF3 (табл 3 и 4) В свою очередь, этот тройной комплекс приобретает способность связывать ГТФ в присутствии Mg2+ (табл 4) Таким образом, для связывания ГТФ и ГТФазной активности eRF3 недостаточно одного С-домена, необходимы одновременно М- и С-домены eRFl

Остается неясным, меняет ли MC-домен конформацию eRF3, делая его способным связывать ГТФ Участок связывания ГДФ уже сформирован в eRF3, так что задача сводится к тому, чтобы связать у-фосфат ГТФ в

активном центре фермента Можно предположить два механизма Либо МС-домен изменяет ГДФ связывающий участок еЛРЗ таким образом, что он приобретает способность связывать ГТФ (к примеру, положительно заряженные боковые группы еЯРЗ становятся доступны для взаимодействия с у-фосфатом ГТФ), либо МС-домен становится донором функциональных групп аминокислот; которые посредством взаимодействия с ГДФ связывающим центром еМ'З придают ему способность связывать ГТФ

Список литературы:

1 Воробьёв ЮН, Киселев ЯЛ 2007 Молекулярное моделирование структуры эукариотического рибосомального трансляционно-терминационного комплекса Молекулярная биология 41: 103-111

2 Киселёв ILJL 2006 Трансляционная терапия Альтернатива генной терапии7 Молекулярная биочогия 76 219-229

3 Alkalaeva Е Z , Pisarev А V, Frolova L Y, Kisselev L L, Pestova T V 2006 In vitro «constitution of eukaiyotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3 СЫ/125 1125-1136

4 Frolova L, Seit-Nebi A., Kisselev L 2002 Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential m eukaryotic translation termination factor eRFl RNA 8 129-136

5 Kolosov P, Frolova L, Seit-Nebi A, Dubovaya V, Kononenko A, Opanna N, Justesen J, Efimov A, Kisselev L 2005 Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl Nucleic Acids Res 33 6418-6425

6 Kong С, Ito K, Walsh MA, Wada M, Liu Y, Kumar S , Barford D, Nakamura Y, Song H 2004 Crystal structure and functional analysis of the eukaiyotic class П release factor eRF3 from S pombe Mol Cell 14 233-245

7 Ma В and Nussmov R. 2004 Release factors eRFl and RF2 a universal mechanism controls the large conformational changes J Biol Chem, 279 53875-53885

8 Seit-Nebi A, Frolova L, Kisselev L 2002 Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into cihate-like UGA-only unipotent eRFl EMBO Rep 3 881886

9 Song H, Mugnier P, Das A.K, Webb H M, Evans D R., Tuite M F, Hemmings В A, Barford D 2000 The crystal structure of human eukaiyotic release factor eRFl— mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis Cell 100 311-321

ВЫВОДЫ

1 Замены Glu55Asp, Tyrl25Phe, Asn61Ser Glu55Arg, Glu55Ala, Asn61Ser+Ser64Asp, Cysl27Ala и Ser64Asp не изменяют термо стабильность белка eRFl человека Это указывает на невовлеченность этих аминокислотных остатков в поддержание трехмерной структуры молекулы eRFl Обнаружены аминокислотные остатки Asnl29 и Phel31 в N-домене eRFl, существенные для

поддержания термостабильности трехмерной структуры eRFl Прямая корреляция между уменьшением RF-активности и термостабильности у мутантов eRFl отсутствует

2 Узнавание стоп-кодонов UAG и UAA в рибосоме in vitro чувствительнее к стабильности трехмерной структуры eRFl человека, чем узнавание стоп кодона UGA

3 Общая форма молекул eRFl в растворе близка или идентична кoнфopмaцииeRFl в кристалле

4 eRF3 связывает ГДФ в растворе независимо от присутствия или отсутствия eRFl, тогда как ГТФ связывается только с комплексом eRFl-eRF3 В цитозоле и в растворе образуется четверной комплекс eRFl'eRF3-lT®.Mg2

5 Изолированные С- и М-домены eRFl связываются с eRF3 МС-домен eRFl, а также смесь индивидуальных доменов М- и С- инициируют связывание ГТФ с eRF3

6 Данные изотермической калориметрии указывают на взаимодействие в растворе между М- и С-, а также М- и N-доменами eRFl, что не вытекает из данных рентгеноструктурного анализа

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Кононенко А В Дембо К А, Киселев JIЛ , Волков В В 2004 Молекулярная морфология фактора терминации трансляции 1-ого класса эукариот eRFl в растворе Молекулярная биоюгия 38 303-311

2 Volkov V V, Kononenko А V, Svergun DI, Dembo К A , Kisselev L 2004 Investigation of molecular morphology of the factor of termination translation class 1 eRFl of eukaryotes in solution The EMBL annual report

3 Митькевич В A , Кононенко А В, Опарина H Ю , Колосов П М , Макаров А А, Киселев JIЛ 2006 Тепловая денатурация эукариотического фактора терминации трансляции 1-го класса eRFl Связь между стабильностью фактора и изменениями функциональной активности его мутантов Молекулярная биология 40 100-110

4 Mitkevich V A , Kononenko A V, Petrushanko IY, Yanvarev D V, Makarov A A , Kisselev L L 2006 Termination of translation in eukaryotes is mediated by the quaternary eRF 1 eRF3 GTP Mg2+ complex The biological roles of eRF3 and prokaryotic RF3 are profoundly distinct Nucleic Acids Research 34 3947-3954

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена совместно с лабораториями конформационной стабильности белков и физических методов анализа, ИМБ РАН (зав лаб А А Макаров) и малоуглового рассеяния, Института кристаллографии РАН (зав

лаб В В Волков)

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МЛКС Пресс" Лицензия ИДК 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 05 04 2007 г Формат 60x90 1/16 Услгечт 1,5 Тираж 100 экз Заказ 168 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кононенко, Артём Вадимович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 стр. ВВЕДНИЕ 7 стр.

1. Глава 1. ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Ы.Терминация трансляция опосредована белковыми факторами 1-го и 2-го классов. 10 стр.

1.2.Особенности структуры факторов терминации 2-го класса. 11 стр.

1.2.1. Структурные особенности G домена ГТФаз. 12 стр.

1.2.2. Первичная и третичная структуры RF3 и eRF3 13 стр.

1.3.ГТФазный цикл в рибосоме. 21 стр.

1.4.Функциональные свойства eRF

1.4.1. Роль eRF3 в терминации трансляции у эукариот 24 стр.

1.4.2. Нетерминационные функции eRF3 29 стр.

1.4.3. Взаимодействие eRF3 и eRFl 36 стр.

1.5.eRF3 не является функциональным аналогом RF3 37 стр.

1.6.Структурно-функциональные свойства eRFl. 39 стр.

2. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.Штаммы бактерий, плазмиды, среды и реактивы 43 стр.

2.2.Методы исследований

2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 45 стр.

2.2.2. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК 46 стр.

2.2.3. Синтез и выделение белков

2.2.3.1. Получение eRFl человека для исследования методом малоуглового рассеяния. 47 стр.

2.2.3.2. Получение еШ71 и мутантов еШ71 человека для исследования калориметрическими методами. 48 стр.

2.2.3.3. Получение еКБЗ человека. 49 стр.

2.2.3.4. Получение доменов еЮ7! человека.

2.2.3.4.1. Получение ^ М и КМ доменов. 50 стр.

2.2.3.4.2. Получение С и МС доменов. 51 стр.

2.2.4. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ. 51 стр.

2.2.5. Измерение флуоресценции растворов белков. 52 стр.

2.2.6. Измерения малоуглового рассеяния. 52 стр.

2.2.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). 53 стр.

2.2.8. Круговой дихроизм (КД). 53 стр.

2.2.9. Изотермическая титрационная калориметрия 54 стр.

3. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Связь между термостабильностью еШ7! и изменениями функциональной активности его мутантов 56 стр.

3.1.1. Тепловая денатурация еШ71 человека и его мутантов. 57 стр.

3.1.2. Термостабильность мутантов еШ7! и его ЯР-активность. 61 стр.

3.2.Молекулярная морфология еШ7! в растворе 68 стр.

3.3.Образование четверного комплекса еШ71*еШ73«ГТФ*

§2+ в растворе. 72 стр

3.3.1. Взаимодействие еИРЗ с гуаниловыми нуклеотидами. 73 стр.

3.3.2. Термодинамические параметры образование комплекса между еШ*! и еЯРЗ 73 стр.

3.3.3. Связывание ГТФ комплексом еИРЬеНРЗ 76 стр.

3.3.4. Обмен нуклеотидов в комплексе е!1Р1*е11РЗ*ГДФ/ГТФ 77 стр.

3.3.5. еШ71 как эффектор связывания гуаниловых нуклеотидов. 78 стр.

3.3.6. Схема взаимодействия между еЯРЗ и его лигандами 78 стр.

3.3.7. Роль еШ?1 по отношению к еИРЗ 81 стр.

3.3.8. Роль магния в связывании гуаниловых нуклеотидов 84 стр.

3.3.9. Сравнение полученных результатов с данными литературы. 85 стр. 3.4.Роль индивидуальных доменов еШЧ в связывании ГТФ с еЯРЗ.

Взаимодействия между доменами еЯЛ. 90 стр.

3.4.1. Связывание еЯРЗ с индивидуальными доменами еИР1. 91 стр.

3.4.2. Взаимодействия между индивидуальными доменами еЯЛ 93 стр.

3.4.3. Связывание ГТФ с еИРЗ в присутствии М и С доменов еЯЛ. 93 стр.

3.4.4. Роль доменов еИР1 в формировании ГТФ-связывающего центра еШ\3. 94 стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства, структура и функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3"

Заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи - терминация трансляции - происходит в тот момент, когда в А-участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов транслируемой мРНК - UAA, UAG или UGA, который декодируется фактором терминации трансляции 1-го класса. Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции, которые подразделяют на два класса. Факторы первого класса или кодон-специфичные факторы принимают участие в узнавании стоп-кодона мРНК в рибосоме с последующей передачей сигнала от малой к большой субчастице рибосомы, что вызывает гидролиз пептидил-тРНК. Факторы второго класса - это G-белки, которые обладают способностью связывать гуаниловые нуклеотиды и осуществлять гидролиз ГТФ в присутствии фактора 1-го класса и рибосомы. Существует тесная взаимосвязь между факторами 1-го и 2-го класса, взаимодействующих друг с другом.

В эукариотах ключевую роль в терминации трансляции играют белковые факторы eRFl и eRF3. Хотя общая схема терминации трансляции известна, молекулярные механизмы этого процесса, структурные особенности и физические свойства факторов терминации остаются недостаточно изученными. Ранее eRFl и eRF3 исследовали главным образом с помощью генетических, биохимических и молекулярно-биологических методов. В этой работе использованы некоторые физические методы исследования, позволяющие изучать in vitro взаимосвязи структуры и функции eRFl и eRF3.

Ранее в лаборатории для выявления функционально важных аминокислотных остатков в eRFl, участвующих в узнавании стоп ко донов, использовали точечный мутагенез с последующим определением функциональной активности полученных мутантов (Seit-Nebi et al., 2001; 2002; Frolova et al., 2002;

Kolosov et al., 2005). Для интерпретации RF-активности мутантов и определения функционально важных аминокислот необходимо различить изменения RF-активности связанные с нарушением стереохимической комплементарности стоп-кодона и боковых групп аминокислот в участке узнавания eRFl,ot изменений активности, вызванных конформационными перестройками молекулы белка. В противном случае, это может привести к ошибкам в идентификации декодирующих аминокислотных остатков eRFl. Неизвестно, как организован eRFl в растворе и отличаются ли его конформации в кристалле и в растворе. Немногочисленные и противоречивые данные о взаимодействии in vitro между N, М и С доменами eRFl, между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами недостаточны для понимания механизма ГТФазного цикла eRF3 в терминации трансляции. Применение различных физических методов позволяет существенно прояснить многие из перечисленных вопросов.

Цель работы состояла в использовании физических методов для: 1) оценок стабильности белка eRFl человека после внесения в молекулу точечных мутаций, 2) установление сходства и различий в конформации eRFl в кристалле и в растворе, 3) изучения взаимодействия между N, М и С доменами eRFl, между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами. В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования: экспрессировать гены полноразмерного eRFl и eRF3 (лишённого с N конца 138 аминокислот) человека, мутантов eRFl, а также N, М, С, N-M и М-С доменов eRFl в клетках Е. coli и получить высокоочищенные препараты белка; методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) оценить изменения стабильности белковой глобулы в растворе в результате мутаций. Кроме того, мы исследовали методом малоуглового рассеяния (МУР) рентгеновских лучей структуру eRFl в растворе и сравнили её с кристаллической структурой, а также методом изотермической титрационной калориметрии (1ТС) взаимодействия между Ы, М и С доменами еЯР1, между еЯР1 и еЯРЗ, между еЯРЗ и гуаниловыми нуклеотидами.

Установлено, что плавление молекулы еШЛ человека, состоящей из трёх доменов, носит кооперативный характер, это свидетельствует о взаимодействии между доменами внутри молекулы в растворе. Ряд замен в Ы-домене не изменяет термостабильность белка, а в некоторых случаях даже приводит к ее некоторому увеличению. У этих мутантов избирательность утраты функции стимуляции гидролиза пептидил-тРНК в Р-участке рибосомы в присутствии стоп-кодонов не связана с дестабилизацией их трёхмерной структуры, а обусловлена, скорее всего, локальными изменением стереохимии боковых групп этих аминокислотных остатков в функционально-важных участках Ы-домена. Обнаружены аминокислотные остатки в И-домене, существенные для поддержания стабильности структуры еЯР1 и влияющие на избирательное узнавание стоп-кодонов мРНК в рибосоме. Определены интегральные структурные параметры и форма молекул еМЧ человека по данным МУР в растворе, конформация еКР1 в растворе близка к конформации в кристалле. С помощью изотермической калориметрии определены термодинамические параметры и предложена возможная схема взаимодействия между еКРЗ, еЯР1 и гуаниловыми нуклеотидами. Обнаружены взаимодействия между изолированными доменами еЯР1 в растворе. Показано, что М-домен еКР1 также взаимодействует с еКРЗ, определены домены еШ7! необходимые для связывания ГТФ с еКРЗ. .

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кононенко, Артём Вадимович

выводы

1. Замены Glu55Asp, Tyrl25Phe, Asn61Ser, Glu55Arg, Glu55Ala, Asn61Ser+Ser64Asp, Cysl27Ala и Ser64Asp не изменяют термостабильность белка eRFl человека. Это указывает на невовлечённость этих аминокислотных остатков в поддержание трёхмерной структуры молекулы eRFl. Обнаружены аминокислотные остатки Asnl29 и Phel31 в N-домене eRFl, существенные для поддержания термостабильности трёхмерной структуры eRFl. Прямая корреляция между уменьшением RF-активности и термостабильности у мутантов eRFl отсутствует.

2. Узнавание стоп-кодонов UAG и UAA в рибосоме in vitro чувствительнее к стабильности трёхмерной структуры eRFl человека, чем узнавание стоп ко дона UGA.

3. Общая форма молекул eRFl в растворе близка или идентична конформации eRFl в кристалле.

4. eRF3 связывает ГДФ в растворе независимо от присутствия или отсутствия eRFl, тогда как ГТФ связывается только с комплексом eRFl*eRF3. В Л цитозоле и в растворе образуется четверной комплекс eRFbeRFS^TO^Mg .

5. Изолированные С и М домены eRFl связываются с eRF3. МС домен eRFl, а также смесь индивидуальных доменов М и С инициируют связывание ГТФ с eRF3.

6. Данные изотермической калориметрии указывают на взаимодействие в растворе между М и С, а также М и N доменами eRFl, что не вытекает из данных рентгеноструктурного анализа.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данная работа выполнена совместно с лабораториями малоуглового рассеяния, Института кристаллографии РАН зав. лаб. Волков В.В. (Дембо К.А.) и лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа, ИМБ РАН зав. лаб. Макаров А.А. (Миткевич В.А., Петрушенко И.Ю.).

Я благодарен сотрудникам лаборатории физики биополимеров, где проводились измерения флуоресценции; Борисовой Ольге Филипповне за помощь в обсуждении результатов и написании рукописи, Калюжному Дмитрию и Бессчетновой Ирине за помощь в проведении экспериментов,

Я благодарю всех сотрудников нашей лаборатории, словом и делом помогавших проведению работы Людмилу Юрьевну Фролову, Нику Опарину, Дубовую Веру Ивановну, Зиновьеву Ольгу Леонидовну, Машкову Тамару Дмитриевну, Петру Колосову.

Выражаю отдельную благодарность соавтору одной из наших публикаций Дмитрию Январёву за высококачественную очистку гуаниловых нуклеотидов.

3.5. Заключение

Рассматривая в совокупности все полученные данные, можно придти к некоторым общим заключениям, касающимися взаимоотношений структуры и функции факторов терминации трансляции 1-го и 2-го класса эукариот.

В предыдущих работах на основании данных, полученных в результате определения RF-активности мутантов eRFl, показано, что N-домен отвечает за узнавание стоп-кодонов (Bertram et al., 2000; Chavatte et al., 2002; Frolova et al., 2002; Ito et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005). Причина изменения RF-активности большинства полученных мутантов не связана с дестабилизацией их третичной структуры, а обусловлена локальными стериохимическими изменениями боковых групп аминокислотных остатков, возникших в результате мутаций. В целом предположения о вовлечённости аминокислотных остатков N домена eRFl в узнавании стоп ко донов, не изменились.

ГТФазный цикл эу- и прокариотических факторов терминации трансляции 2-го класса значительно отличаются. eRF3 не нуждается в классическом GEF, в отличие от своего прокариотического аналога RF3 (Zavialov et al., 2001), поскольку в eRF3 обмен нуклеотидов не связан с падением аффинности ГДФ к eRF3 в результате связывания eRFl. Картина совершенно иная, eRFl не нарушает способность eRF3 связывать ГДФ, а предоставляет дополнительную возможность взаимодействовать с ГТФ. Скорее, по своим свойствам eRFl ближе к GAP, у которых помимо основной функции активации ГТФазной активности G-белка, появилась способность модифицировать ГДФ связывающий участок eRF3, в результате чего связывание ГТФ становится возможным. ГТФ связывается как в результате большей аффинности к ГТФазе, по сравнению с ГДФ, так и благодаря на порядок более высокой концентрации ГТФ в цитозоле. В прокариотах, GEF для комплекса КРЗ*ГДФ - это посттерминационный комплекс (Zavialov et al., 2001). В эукариотах, другая ситуация: с рибосомой связывается четверной комплекс eRFl*eRF3*GTP*Mg2+, ненуждающийся в GEF-активности рибосомы. В свете имеющихся данных, роль RF3 и eRF3 в клетке представляется различной: функция RF3 заключается в освобождении из рибосомы факторов терминации 1-го класса (Zavialov et al., 2002), тогда как предполагаемая функция eRF3 может быть связана с точным позиционированием eRFl в рибосоме, которое может осуществляться за счёт его ГТФазной активности.

Данные МУР свидетельствуют о том, что конформация eRFl в растворе, близка к его кристаллической структуре. Это означает, что расстояние между наиболее удалёнными мотивами GGQ и NIKS в молекуле eRFl составляет 107 Á. Для правильного позиционирования eRFl в рибосоме, необходимо изменить угол между этими мотивами и сблизить их на расстояние порядка 75 Á. Это может происходить за счёт ГТФазной активности eRF3. В этом отношении немаловажную роль может играть взаимодействие М домена eRFl с eRF3, поскольку связывание ГТФ и ГТФазная активность eRF3 возможна только при участии М домена. Возможно, именно в результате связывания eRF3 с М доменом может происходить изменение угла между М и N доменами внутри молекулы eRFl как в растворе, так и в рибосоме. Если для сближения N и М доменов eRFl не достаточно связывания, а требуется гидролиз ГТФ - тогда это возможно только в присутствии рибосомы. Таким образом, функция eRF3 может быть прямо противоположена прокариотическому RF3. Если функция RF3 заключается в том, чтобы диссоциировать RF1/RF2 из посттерминационного комплекса после гидролиза пептидил-тРНК (Zavialov et al., 2002), то роль eRF3, напротив, позиционировать eRFl в рибосому, что необходимо для гидролиза пептидил-тРНК.

В работе Salas-Marco & Bedwell (2004) показано, что мутации eRF3 в ГТФазном домене увеличивают уровень сквозного прочитывания стоп кодона in vivo. На основании полученных данных Salas-Marco & Bedwell (2004) предложили модель, в которой взаимодействие eRFl и стоп кодона в рибосоме стимулирует гидролиз ГТФ eRF3, а это событие в свою очередь активирует eRFl, так, что он приобретает способность индуцировать гидролиз пептидил-тРНК. Предложенная модель согласуется с данными Alkalaeva et al. (2006), где показано, что гидролиз ГТФ предшествует освобождению синтезированного пептида, но противоречит данным Frolova et al. (1996), где говорится, что гидролиз ГТФ не зависит от декодирующих свойств eRFl. К тому же, в этой работе экспериментально не показано, что гидролиз ГТФ опосредовано через eRFl индуцирует гидролиз пептидил-тРНК. Опираясь на наши данные можно предложить альтернативную интерпретацию результатов, полученных Salas-Marco & Bedwell: мутации в ГТФазном домене eRF3, в результате которых падает его ГТФазная активность, служат причиной того, что правильное позиционирование eRFl в рибосоме осуществляется менее эффективно. Это приводит к увеличению уровня сквозного прочитывания стоп кодона in vivo.

По данным ДСК молекула eRFl плавится кооперативно, одним пиком, что довольно необычно для структуры, состоящей из трёх независимых доменов различной структуры, взаимное расположение которых в растворе напоминает букву Y. Кооперативное плавление молекулы eRFl можно объяснить, предположив, что домены тесно контактируют между собой и изменения пространственной структуры, возникшие в одной части молекулы белка, передаются на всю молекулу. Данные ITC свидетельствуют о взаимодействии между доменами eRFl, которое вполне возможно имеет место, в районе линкеров, соединяющих домены между собой, располагающиеся в центральной части молекулы eRFl. В пользу этой гипотезы можно привести тот факт, что обнаружено взаимодействие только между теми доменами eRFl, которые сочленены друг с другом подвижными линкерами: N*M и М*С, но не между N и С доменами. Конечно, число степеней свободы у индивидуальных доменов в растворе существенно больше, чем в составе целой молекулы eRFl. Поэтому, взаимодействия между индивидуальными доменами в растворе могут и не иметь функционального значения. Однако, в пользу специфичности взаимодействия между изолированными доменами еКР1, которые мы наблюдаем в растворе, говорит факт связывания ГТФ тройным комплексом, состоящим из отдельных М и С доменов, взаимодействующих между собой, и с еИРЗ. Возможно, что плавление молекулы еКР1 начинается с центральной её части, где домены взаимодействуют друг с другом и, таким образом, все три домена еШЧ начинают плавиться одновременно.

Задачи будущих исследований

1. необходимость кристаллизации комплексов еЮП'еИРЗ, МОеКРЗ для понимания механизма ГТФазной активности еИРЗ и роли е!1Р1.

2. выяснить механизм замены ГДФ/ГТФ в еШ^З с помощью феномена без излучательного переноса энергии между хромофорами и других флуоресцентных методов исследования.

3. выяснить роль рибосомы в ГТФазном цикле еКРЗ

4. выяснение того, какой путь формирования четверного комплекса реализуется - а или Ь . Это можно сделать иммунохимическими методами с 32Р или флуоресценцией.

5. природа кооперативного плавления еКР1 (плавление смеси индивидуальных доменов, плавление мутантов с заменами в области линкеров, соединяющих домены еКР1 и др.)

6. изменение конформация е1Ш и еШ^З при образовании комплекса (флуоресцентные метки, ЭПР и др.)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кононенко, Артём Вадимович, Москва

1. Воробьёв Ю.Н., Киселёв Л.Л. 2007. Молекулярное моделирование структуры эукариотического рибосомного трансляционно-терминационного комплекса. Молекулярная биология 41: 103-111.

2. Гаврилюк В.В. 2006. ГТФазы прокариотического аппарата трансляции. Молекулярная биология 40: 769-783.

3. Дубовая В.И., Колосов П.М, Алкалаева Е.З., Фролова Л.Ю., Киселёв Л.Л. 2006. Влияние изолированных доменов фактора терминации трансляции eRFl на ОТРазную активность фактора терминации трансляции eRF3. Молекулярная Биология 40: 310-316.

4. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бахланова И.В., Горелов В.И., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. 1986. Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. Генетика 22:2721-2727.

5. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. 1970. Генетика 6:103-115

6. Киселев Л.Л. 2003. Факторы терминации трансляции 1-ого класса -функциональные аналоги аминоацил-тРНК .Молекуляр. биология. 37:931-943.

7. Кубаренко А.В., Сергиев П.В., Роднина М.В. 2005. ОТРазы аппарата трансляции. Молекулярная биология. 39: 746-761.

8. Любарев А.Е., Курганов Б.И. 1998. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации при переменной температуре. I. Модель, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии. Биохимия. 63:434-440.

9. Любарев А.Е., Курганов Б.И. 2000. Изучение необратимой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Успехи биологической химии. 40:43-84.

10. Могилевский Л.Ю., Дембо А.Т., Свергун Д.И., Фейгин JI.A. 1984. Дифрактометр малоуглового рассеяния с координатным детектором. Кристаллография. 29, 587-592.

11. Свергун Д.И., Фейгин J1.A. 1987. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука. 280 с. Перевод: Feigin L.A., Svergun D.I. 1987. Structure Analysis by Small-Angle X-ray and Neutron Scattering. New York: Plenum Press.

12. Сеит-Неби А., Фролова JI., Иванова H., Полтараус А., Киселев Л. 2000. Мутации остатка глутамина в универсальном трипептиде GGQ в факторе терминации трансляции eRFl человека не вызывают полной утраты его активности. Молекуляр биология. 34: 899-900.

13. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. 1988. Генетический контроль аппарата белкового синтеза. Изд-во Ленингр.ун-та. Ленинград.

14. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. 2002. Molecular Biology of The Cell, Fourth Edition.Taylor & Francis Group Press, NY, pp. 616.

15. Alkalaeva E.Z., Pisarev A.V., Frolova L.Y., Kisselev L.L., Pestova T.V. 2006. In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3. Cell 125:1125-1136.

16. Andersen G.R., Pedersen L., Valente L., Chatterjee I., Kinzy T.G., Kjeldgaard M., Nyborg J. 2000a. Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in the yeast elongation factor complex eEFlA-.eEFlB.Mo/. Cell. 6: 1261-1266.

17. Andersen G.R., Thirup S., SpremuIIi L.L., Nyborg J. 2000b. High resolution crystal structure of bovine mitochondrial EF-Tu in complex with GDP. J. Mol. Biol. 297: 421-436.

18. Bailleul P.A., Newnam G.P., Steenbergen J.N., Chernoff Y.O. 1999. Genetic study of interactions between the cytoskeletal assembly protein Slal and prion-forming domain of the release factor Sup35 (eRF3) in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 153: 81-94.

19. Berchtold H., Reshetnikova L., Reiser C.O., Schirmer N.K., Sprinzl M., Hilgenfeld R. 1993. Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365: 126-132.

20. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. 2002. Biochemistry, Fifth Edition, W.H. Freeman & Company, p66.

21. Bertram G., Bell H.A., Ritchie D.W., Fullerton G, Stansfield I. 2000. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA 6:1236-1247.

22. Bidou L., Stahl G., Hatin I., Namy O., Rousset J.P., Farabaugh P.J. 2000. Nonsense-mediated decay mutants do not affect programmed -1 Frameshifting. RNA 6: 952-961.

23. Bisbal C., Martinand C., Silhol M., Lebleu B., Salehzada T. 1995. Cloning and characterization of a RNAse L inhibitor. A new component of the interferon-regulated 2-5A pathway. J. Biol. Chem. 270: 13308-13317.

24. Bourne H. R.,. Sanders D.A., McCormick F. 1991. The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature (London) 349:117-127.

25. Breining P., Piepersberg W. 1986. Yeast omnipotent supressor SUP1 (SUP45): nucleotide sequence of the wildtype and a mutant gene. Nucleic Acids Res. 14:5187-5197.

26. Brinkmann U., Mattes R.E., Buckel P. 1989. High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85:109-114.

27. Browne G.J., Proud C.G. 2002. Regulation of peptide-chain elongation in mammalian cells. Eur JBiochem. 269: 5360-5368.

28. Buckingham R.H., Grentzmann G., Kisselev L. 1997. Polypeptide chain release factors. Mol. Microbiol. 24: 449-456.

29. Burton J.L., Burns M.E., Gatti E., Augustine G.J., Camilli P.D. 1994. Specific interactions of Mss4 with members of the Rab GTPase subfamily. EMBOJ. 13:5547-5558.

30. Chai J., Shiozaki E., Srinivasula S. M., Wu Q., Dataa P., Alnemri E. S., Shi Y. Structural basis of caspase-7 inhibition by XIAP.2001. Cell 104: 769780.

31. Caskey C.T., Beaudet A.L., Tate W.P. 1974. Mammalian release factor; in vitro assay and purification. Methods Enzymol. 30: 293-303.

32. Caskey C.T., Forrester W.C., Tate W., Ward C.D. 1984. Cloning of the Escherichia coli release factor 2 gene. J. Bacteriol. 158:365-368.

33. Carr-Schmid A., Pfund C., Craig E.A., Kinzy T.G. 2002. Novel G-protein complex whose requirement is linked to the translational status of the cell. Mol. Cell Biol. 22: 2564-2574.

34. Chavatte L.,Frolova L., Kisselev L., Favre A. 2001. The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s4.UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur. J. Biochem. 268: 2896-2904.

35. Chavatte L., Seit-Nebi., Dubovaya V., Favre A. 2002. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. EMBO. 21: 5302-5311

36. Chavatte L., Frolova L., Laugaa P., Kisselev L., Favre A. 2003. Stop codons and UGG promote efficient binding of the human polypeptide release factor eRFl to the eukaryotic ribosomal A-site. J. Mol. Biol. 331: 745-758

37. Chauvin C., Salhi S., Le Goff C., Viranaicken W., Diop D., Jean-Jean 0. 2005. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation. Mol. Cell Biol. 25: 5801-5811.

38. Chen Y.H., Yang J.T., Martinez H.M. 1972. Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion. Biochemistry. 11,4120-31.

39. Chernoff Y. O.,. Lindquist S.L, Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W., 1995. Role of the chaperone protein hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PS7". Science 268: 880-884.

40. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A. D. 1999. Evidence for a "protein mutator" in yeast: role of the Hsp70-related chaperone Ssb in formation, stability and toxicity of the PS7. prion. Mol. Cell. Biol. 19:8103-8112.

41. Chernoff Y.O. 2001. Mutation processes at the protein level: is Lamarck back? Mutat. Res. 488: 39-64.

42. Chernoff Y.O., Uptain S.M., Lindquist S.L. 2002. Analysis of prion factors in yeast. Methods Enzymol. 351: 499-538.

43. Cosson B., Berkova N., Couturier A., Chabelskaya S., Philippe M., Zhouravleva G. 2002. Poly(A)-binding protein and eRF3 are associated in vivo in human and Xenopus cells. Biol. Cell. 94: 205-16.

44. Czaplinski K., Ruiz-Echevarria M.J., Gonzalez C.I., Peltz S.W 1999. Should we kill the messenger? The role of the surveillance complex in translation termination and mRNA turnover. Bioessays 21: 685-696.

45. Czaplinski K, Majlesi N, Banerjee T, Peltz SW. 2000. Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency. RNA 6:730-743.

46. Derkatch, I. L., Y. 0. Chernoff, V. V. Kushnirov, S. G. Inge-Vechtomov and S. W. Liebman, 1996 Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 144: 1375-1386.

47. DerMardirossian C., Bokoch G.M. 2005. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation.Trends Cell Biol. 15:356-363.

48. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. 1994. The dominant PNM2- mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene. Genetics 137: 659-670.

49. Doma M.K., Parker R. 2006. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation elongation. Nature 440: 561-564.

50. Ebihara K., Nakamura Y. 1999. C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids. RNA 5:739-750.

51. Eurwilaichitr L., Graves F.M., Stansfield I., Tuite,M.F. 1999. The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol. 32:485-496.

52. Freistroffer D.V., Pavlov M.Y., MacDougall J., Buckingham R.H., Ehrenberg M. 1997. Release factor RF3 in E. coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBOJ. 16: 4126-4133.

53. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. 1996. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2: 334-341

54. Frolova L.Y., Merkulova T.I., Kisselev,L.L. 2000. Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6:381-390

55. Frolova L., Seit-Nebi A., Kisselev L. 2002. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor qKFI.RNA. 8:129-136.

56. Ghaemmaghami S., Huh W.K., Bower K., Howson R.W., Belle A., Dephoure N., O'Shea E.K., Weissman J.S. 2003. Global analysis of protein expression in yeast. Nature 425:737-741.

57. González C.I., Ruiz-Echevarría M., Vasudevan S., Henry M., Peltz S. 2000. The Yeast hnRNP like Protein Hrpl/Nab4 Marks a Transcript for NonsenseMediated mRNA Decay. Molecular Cell 5:489-499.

58. Grentzmann G., Brechemier-Baey D., Heurgue V., Mora L., Buckingham R.H. 1994. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in E. coli. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 5848-5852.

59. Grentzmann G., Kelly P.J., Laalami S., Shuda M., Firpo M.A., Cenatiempo Y., Kaji A. 1998. Release factor RF-3 GTPase activity acts in disassembly of the ribosome termination complex. RNA 4: 973-983.

60. Gross T., Siepmann A., Sturm D., Windgassen M., Scarcelli J.J., Seedorf M., Cole C.N., Krebber H. 2007. The DEAD-box RNA helicase Dbp5 functions in translation termination. Science 315: 646-649.

61. Hansen T, Schlichting B, Grotzinger J, Swan MK, Davies C, Schonheit P. (2005) Mutagenesis of catalytically important residues of cupin typephosphoglucose isomerase from Archaeoglobus fulgidus. FEBS J. 272:6266-6275.

62. Hauryliuk V., Zavialov A., Kisselev L., Ehrenberg M. 2006. Class-1 release factor eRFl promotes GTP binding by class-2 release factor eRF3. Biochimie 88:747-757

63. Hays R., Wickline L., Cagan R. 2002. Morgue mediates apoptosis in the Drosophila melanogaster retina by promoting degradation of DIAP1. Nat. Cell Biol. 4: 425-431.

64. Imataka H., Gradi A., Sonenberg N. 1998. A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-dependent translation. EMBO J. 17: 7480-7489.

65. Inagaki Y., Ford D.W., 2000. Evolution of the eukaryotic translation termination system: origins of release factors. Mol. Biol. Evol. 17, 882-889.

66. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., Philippe M. 2003. Eukaryotic release factors (eRFs) history. Biol. Cell. 95: 195-209.

67. Ito K., Ebihara K., Nakamura,Y. 1998. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. RNA 4:958-972.

68. Jensen M.A., True H.L., Chernoff Y.O., Lindquist S. 2001. Molecular population genetics and evolution of a prion-like protein in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 159: 527-535.

69. John J., Rensland H., Schlichting I., Vetter I., Goody R.S., Wittinghofer A. 1993. Kinetic and structural analysis of the Mg21-binding site of the guanine nucleotide-binding protein p21H-ras. J. Biol. Chem. 268:923-929.

70. Kawazu Y., Ito K, Matsumura K., Nakamura Y. 1995. Comparative characterization of release factor RF-3 genes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Dichelobacter nodosus. J. Bacteriol. 177: 5547-5553.

71. Keeling K.M., Lanier J., Du M., Salas-Marco J., Gao L., Kaenjak-Angeletti A., Bedwell D.M. 2004. Leaky termination at premature stop codons antagonizes nonsense-mediated mRNA decay in S. cerevisiae. RNA 10: 691-703.

72. Kisselev L., Buckingham R.H. 2000. Translation termination comes of age. Trends Biochem. Sci. 25: 561-566.

73. Kjeldgaard M., Nyborg J. 1992. Refined structure of elongation factor EF-Tu from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 223: 721-742.

74. Klaholz B.P., Pape T., Zavialov A.V., Myasnikov A.G., Orlova E.V., Vestergaard B., Ehrenberg M., van Heel M. 2003. Structure of the

75. Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421:90-94.

76. Kobayashi T., Funakoshi Y., Shin-ichi H., Katada T. 2004. The GTP-binding Release Factor eRF3 as a Key Mediator coupling translation termination to mRNA decay. J. Biol. Chem. 279:45693-45700.

77. Kolosov P., Frolova L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., Kononenko A., Oparina N., Justesen J., Efimov A., Kisselev L. 2005. Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. Nucleic Acids. Res. 33:6418-6425.

78. Kong C., Ito K., Walsh M.A., Wada M., Liu Y., Kumar S., Barford D., Nakamura Y., Song H. 2004. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Mol. Cell 14:233245.

79. Ladbury J. E., Doyle M. L. 2004. Biocalorimetry 2. Applications calorimetry in the biological sciences. The Sussex John Wiley & Sons, Ltd, pp. 259.

80. Lai C-C., Boguski M., Broek D., Powers S. 1993. Influence of guanine nucleotides on complex formation between Ras and CDC25 proteins. Mol. Cell Biol. 13:1345-1352.

81. Le Goff C., Zemlyanko O., Moskalenko S., Berkova N., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. 2002. Mouse GSPT2, but not GSPT1, can substitute for yeast eRF3 in vivo. Genes Cells 7: 1043-1057.

82. Le Roy F., Laskowska A., Silhol M., Salehzada T., Bisbal C. 2000. Characterization of RNABP, an RNA binding protein that associates with RNase L. J. Interferon Cytokine Res. 20: 635-644.

83. Le Roy F., Salehzada T., Bisbal C., Dougherty J.P., Stuart W. P. 2005. A newly discovered function for RNase L in regulating translation termination. Nat Struct Mol Biol 12:505-512.

84. Liebman S.W., Sherman F. 1979. Extrachromosomal psi+ determinant suppresses nonsense mutations in yeast. J. Bacteriol. 139: 1068-1071.

85. Liu J.J., Lindquist S. 1999. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400: 573-576.

86. Ma B. and Nussinov R. 2004. Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes. J. Biol. Chem., 279: 53875-53885.

87. Makhatadze GI, Privalov PL. 1990. Heat capacity of proteins. I. Partial molar heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: hydration effect. J. Mol Biol 213:375-84.

88. Mandel M. and Higa A. 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol Biol 53:159-162.

89. Marcotte E.M., Pellgrini M., Thompson M.J., Yeates T.O., Eisenberg D.1999. A combined algorithm for genome-wide prediction of protein function. Nature 402: 83-86.

90. Merkulova T.I., Frolova L.Y., Lazar M., Camonis J., Kisselev L.L. 1999. C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Letters 443:41-47.

91. Mikuni O., Ito K., Moffat J., Matsumura K., McCaughan K., Nobukuni T., Tate W., Nakamura Y., 1994. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5798-5802.

92. Miroux B., Walker J.E. 1996. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol 260:289-298.

93. Mora L.,Heurgue-Hamard V.,Champ S.,Ehrenberg M., Kisselev L.I., Buckingham R.H. 2003. The essential role of the invariant GGQ motif in the function and the stability in vivo of bacterial release factors RF1 and RF2. Mol. Microbiol. 47:267-275.

94. Moreira D., Kervestin S., Jean-Jean O., Philippe H. 2002. Evolution of eukaryotic translation elongation and termination factors: variations of evolutionary rate and genetic code deviations. Mol. Biol. Evol. 19: 189-200.

95. Nakamura Y., Ito K., 1998. How protein reads the stop codon and terminates translation. Genes Cells 3,265-278.

96. Nakamura Y., Ito K., Ehrenberg M.A. 2000. Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101: 349-352.

97. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. 1999. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hsp-104 and Hsp70 in prion curing. Mol. Cell. Biol. 19: 1325-1333.

98. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B., Nyborg J. 1995. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270: 1464-1472.

99. Otero L.J., Ashe M.P., Sachs A.B. 1999. The yeast poly(A)-binding protein Pablp stimulates in vitro poly(A)-dependent and cap-dependent translation by distinct mechanisms. EMBOJ. 18: 3153-3163.

100. Pan J.Y., Sanford J.C.,Wessling-Resnick M. 1996. Influence of Mg2+ on the structure and function of Rab5. J. Biol. Chem. 271:1322-1328.

101. Pan Y., Wessling-Resnick M. 1998. GEF-mediated GDP/GTP exchange by monomeric GTPases: a regulatory role for Mg2+? BioEssays 20:516-521.

102. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. 1996. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science 273: 622626.

103. Paulin E.M., Campbell L.E., O'Brien K., Loughlin J., Proud C.G. 2001. Eukaryotic translation initiation factor 5 (elF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr. Biol. 11: 55-59.

104. Paushkin S.V., KushnirovV.V., SmirnovV.N., TerAvanesyan M.D., 1996. Propagation of the yeast prion-like psi+. determinant is mediated by oligomerization of the St/P^-encoded polypeptide chain release factor. EMBOJ. 15:3127-3134.

105. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. 1997. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3)polypeptide chain release factors: Implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell Biol 17:2798-2805.

106. Petry S, Brodersen DE, Murphy FV, Dunham CM, Selmer M, Tarry MJ, Kelley AC, Ramakrishnan V (2005) Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123: 1255-1266

107. Pierce M.M., Raman C.S., Nail B.T. 1999. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods 19:213-221

108. Privalov P.L., Potekhin S.A. 1986. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131:4-51.

109. Rawat U.B., Zavialov A.V., Sengupta J., Valle M., Grassucci R.A., Linde J., Vestergaard B., Ehrenberg M., Frank J. 2003. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421:87-90.

110. Rutthard H., Banerjee A., Makinen M.W. 2001. Mg2 is not catalytically required in the intrinsic and kirromycin-stimulated GTPase action of Thermus thermophilus EF-Tu. J. Biol Chem. 276: 18728-18733.

111. Ryoo H. D., Bergmann A., Gonen H., Ciechanover A., Steller H. 2002. Regulation of Drosophila I API degradation and apoptosis by reaper and ubcDl. Nat. Cell Biol 4: 432-438.

112. Salas-Marco J., Bedwell D.M. 2004. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. Mol. Cell. Biol. 24:7769-7778.

113. Salehzada T., Silhol M., Steff A.M., Lebleu B., Bisbal C. 1993. 2',5'-Oligoadenylatedependent RNase L is a dimer of regulatory and catalytic subunits. J. Biol. Chem. 268: 7733-7740.

114. Salvesen G.S., Duckett C.S. 2002. IAP proteins: blocking the road to death's door. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3: 401^10.

115. Seit-Nebi A., Frolova L., Justesen J., Kisselev L. 2001. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucl. Acids. Res. 29: 3982-3987.

116. Seit-Nebi A., Frolova L., Kisselev L. 2002. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBO Rep. 3:881-886.

117. Serio T.R., Lindquist S.L. 1999. .PSI+.: an epigenetic modulator of translation termination efficiency. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 661-703.

118. Serio T.R., Lindquist S.L. 2000. Protein-only inheritance in yeast: something to get PSI".-ched about. Trends Cell Biol. 10: 98-105.

119. Shin D.H., Brandsen J., Jancarik J., Yokota H., Kim R., Kim S.H. 2004. Structural analyses of peptide release factor 1 from Thermotoga maritima reveal domain flexibility required for its interaction with the ribosome. J. Mol. Biol. 341: 227-239.

120. Sigurskjold B.W. 2000. Exact analysis of competition Iigand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Anal. Biochem. 277:260-266.

121. Simon I., Zerial M., Goody R.S. 1996. Kinetics of interaction of Rab5 and Rab7 with nucleotides and magnesium ions. J. Biol. Chem. 271:2047020478.

122. Song H., Parsons M.R., Rowsell S., Leonard G., Phillips S.E. 1999. Crystal structure of intact elongation factor EF-Tu from Escherichia coli in GDP conformation at 2.05 A resolution. J. Mol. Biol. 285: 1245-1256.

123. Song H., Mugnier P., Das A.K., Webb H.M., Evans D.R., Tuite M.F., Hemmings B.A., Barford D. 2000. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl-mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Cell 100:311-321.

124. Song L., Chai B.F., Wang W., Liang A.H. 2006. Identification of translational release factor eRFl a binding sites on eRF3 in Euplotes octocarinatus. Res. Microbiol. 157:842-50.

125. Sprang S.R., Coleman D.E. 1998. Invasion of the nucleotide snatchers: structural insights into the mechanism of G protein GEFs. Cell 95:155-158.

126. Stansfield I., Tuite M.F. 1994. Polypeptide chain termination in S. cerevisiae. Curr. Genet. 25: 385-395.

127. Studier F.W. and Moffatt B.A. 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189:113-130.

128. Tarun S.Z. Jr., Sachs A.B. 1996. Binding of eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) to eIF4G represses translation of uncapped mRNA. EMBO J. 15: 7168-7177.

129. Tikhodeev O.N., Getmanova V.L., Tikhomirova V.L., Inge-Vechtomov S.G. 1990. The ambiquity of translation in yeast: genetic control and modifications. Molecular Mechanism of Genetic Processes. Nauka (Moscow) pp. 218-228.

130. Tikhomirova V.L., Inge-Vechtomov S.G. 1996. Sensitivity of sup35 and sup45 mutants in Saccharomyces cerevisiae to the antimicrotubule drug benomyl. Curr Genet 30:44-49.

131. Traut T.W. 1994. Physiological concentrations of purines and pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140:1-22.

132. Uchida N., Hoshino S., Imataka H., Sonenberg N., Katada T. 2002. A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in cap/poly(A)-dependent translation. J. Biol. Chem. 277: 50286-50292.

133. Urakov V.N., Valouev I.A., Lewitin E.I., Paushkin S.V., Kosorukov V.S., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. 2001. Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae. BMC Mol Biol. 2: 9

134. Valouev I.A., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. 2002. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Cell Motil Cytoskeleton 52: 161-173.

135. Vestergaard B., Van L.B., Andersen G.R., Nyborg J., Buckingham R.H., Kjeldgaard M. 2001. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaiyotic eRFl. Mol. Cell. 8: 1375-1382.

136. Vitagliano L., Masullo M., Sica F., Zagari A., Bocchini V. 2001. The crystal structure of Sulfolobus solfataricus elongation factor 1 in complex with GDP reveals novel features in nucleotide binding and exchange. EMBO J. 20: 5305-5311.

137. Volkov K., Osipov K., Valouev I., Inge-Vechtomov S., Mironova L. 2007. N-terminal extension of Saccharomyces cerevisiae translation termination factor eRF3 influences the suppression efficiency of sup35 mutations. FEMS Yeast Res. In press

138. Wang W., Czaplinski K., Rao Y., Peltz S.W. 2001. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense- containing transcripts. EMBO J. 20: 880-890.

139. Weiss R.B., Murphy J.P., Gallant J.A. 1984. Genetic screen for cloned releasefactor genes. J. Bacteriol. 158:362-364.

140. Wells S. E., Hillner P. E., Vale R. D., Sachs A. B. 1998. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol. Cell 2: 135-140.

141. Yoo S.J., Huh J.R., Muro I., Yu H., Wang L., Wang S.L., Feldman R. M., Clem R.J., Muller H.A., Hay B.A. 2002. Hid, Rpr and Grim negatively regulate DIAP1 levels through distinct mechanisms. Nat. Cell Biol. 4: 416— 424.

142. Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H., Noller H.F. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 4.897-902.

143. Zavialov A.V., Buchingham R.H., Ehrenberg M.A. 2001. Posttermination ribosomal complex is the guanine exchange factor for peptide release factor RF3. Ce//107:115-124.

144. Zavialov A.V., Mora L., Buckingham R.H., Ehrenberg M. 2002. Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell 10: 789-798.

145. Zhang B., Zhang Y., Shacter E., Zheng Y. 2005. Mechanism of the guanine nucleotide exchange reaction of Ras GTPase-evidence for a GTP/GDP displacement model. Biochemistry 44:2566-76.

146. Zavialov A.V., Hauryliuk V.V., Ehrenberg M. 2005. Guanine-nucleotide exchange on ribosome-bound elongation factor G initiates the translocation of tRNAs. J. Biol 4:9.

147. Zhouravleva G, Frolova L, Le Goff X, Le Guellec R, Inge-Vechtomov S, Kisselev L, Philippe M. 1995. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. EMBOJ. 14:4065-4072.

148. Zhouravleva G., Alenin V., Inge-Vechtomov S., Chernoff Y. 2002. To stick or not to stick: prion domains from yeast to mammals. Recent Res. Dev. Mol. Cell. Biol. 3: 185-219.