Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие вторичных посредников в изменениях электрофизиологических свойств мембран зародышевых клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Участие вторичных посредников в изменениях электрофизиологических свойств мембран зародышевых клеток"

9 г

ЛКЛДЕМ1Я ПАУК УКРЛШИ 1НСТИТУТ Ф13ЮЛ0ГП ¡м- О. О. БОГОМОЛьця

На правах рукоиису УДК Г>77.352.5:57.017.642 + 577.017.02

ЧАБАН Впстор Володимнроипч

УЧАСТЬ ВТОРИННИХ ПОСЕРЕДИИК1В У ЗМ1НАХ ЕЛ ЕКТР0Ф1310Л0Г1ЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ МЕМБРАН ЗАРОДКОВИХ КЛ1ТИН

. 03 00.02 — бшс|тика

Автореферат диссртацп на здобуття паукового ступспя кандидата бтлопчних наук

КИТВ -

199.1

Робота виконзка в 1нстктут1 ф1г1ологИ iw. О.С. Бсгомольцн Академх1 наук Укра1нк.

HayKDbi кер1зни?ж: доктор бхолопчних иаук М. I. Кононенко, док.'ор tiomri4PHx наук O.A. Гойла. .

0ф1ц3.йн1 опонектк: академ1к AK Укра!ни М.Ф. Шуба,

доктор 61олог1чшгс наук C.D. Костер1к.

Пров1дна орган1зац1я': "Д1 ф1а1одог11 Кшвського ун!вер-сктету iM. Тараса Шев-»енка

Захист Ехдбудеться " "/" 7? 1993^- в Ягодин!

на эас1дакн1 слетала зевано! ради Д 01.13.01 в 1кститут1 ф1г1ологН in. 0.0. Богомолыдя АН Укра'1:::: за адресос: 252501' Ки1в - 24, е/л. Богомольца, 4

3 дисерташно можна ознайомитися в б1бл1отец1 ¡нституту ф!в10Л0Г11 iM. О.С. Богомольца АН "Украши.

Автореферат роз1слако " ' " ^ ISS^p.

Вчений секрету спешалпзсванох ради,

доктор Схологччнех наук 3.0. CopoKiHa - MapiHa

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальность теми На сучаоному этаги наукових дослад.мэиь с1шстер1гасться зростання \п?ересу до проблемп механ1&м!в передач! сигнал1в м1ж поверхневою мембраною шптини й внутргшньсж» лтшними органонами, що эабеэпечумть затащи I й олец1альи1 функцП иптини.

Значит стъ внугр1тн1окл1тишшх сигналов полягяе е. тому, що еьанюючи фунюцонування певши ферментних систем, вони еабез1Ъ-чують тривалу пе-рэбудову шйтшшо? д1алъноот1. Багатьыа авторами гидтримувться г.скцвпцг.ч, эпдко э якою кл!тинна ¡. выбрана я одним в голоь-шх центрхв К'.орфогенетичних прошс1а рсэЕитку организму, що мав ч1тку пергодичисгь вгпни стаи!в систеии по 1ошшх 1 електричних градДентах (Матер1али 11 б1оф1еичного конгресу, Будалешт, 1993; генерашьна дискуо!я). Питания про тэ, яким чином цитоплагма й плавматична мембрана можуть вплигати нп специф1чн1 функц11 ядра 1 ед:и*1нювати регул.-ючий вшшв на мета-бслгвм юл тин, в одним з наЙЕаюиыших напрямк!? фундаменчад!-них дослхджень.

ЕИдсмо, що при регуляцП метаЗсипему в!дбувытся процеси, власдхдок лкик вхдбуваетьоя активування, чи 1нг1бування одШв! э систем вторшших посередкиШв (Бегг1де, 1933). иссблаг.кй 1н-терес в цьому плаШ становлять пнцеклптини, виготи й эародки, що роэЕивавтьоя, бо тут мсжлнво снсстер1гаги .панцюгн метабол!* шчних перетгорень, що ведуть до утворення ц1л1сного орган!эму. Однас, гштаьня вивчення систем ьнутр1шш с.шцтинних песереднпгЛв на шк ^б'ггктах доол]дхбнь, що нШЦыкт, фосфорилюаання маиб-¡•анпмх внутрлнньошптиннпх бзлгав, лил вабсвпечуитъ регуля-

I

ты Миноге гсмеостагу и рН цитоплавни, ээлигааеться «ало вивче-)Ш1, до того ж не о'ясованс ¡х фкпологцчие значения,

-г-

Мет-1 роботи 1 завдання доол1длень 8 метою вивчення меха-н1вм1в сш'Иалгвац!'! прк.под!л! юитин эа участю мембрановв'лва-Н11Х процео1в у ранньому роввитку холоднокровных тварин,досл!д-лувався вплив вторинних посерздник!в на вм!ни !онно! пров!дноо-т1 плазматичних мембран в чао дробления бластомер!в в'юна -Шв^итив ГоззШз 1 шяорцево! жаби - Хепориз 1аеу1з.

При виконанн! роботи Сули поставлен! наступи! завдання:

1.'Досл!дити характер рорпод!лу !онних град1ент1в на плаэ-матичних мембранах протягом пер!одичних дроблень бластомер1в в'юна;

2. Охарактеризувати дпнамхку електроф1в!олог!чних парамет-р1в мембран п!д ча нормального роввитку вародк!в шпорцево! жаби;

3. З'яоувати роль елемент1в цитсскелету в регуляци 1онно1 Пров1дност1 плагматичних'мембран зародк!в в'юна!

4. ДсзлШгги вплив 1сн!в кальЩи 1 !'х причетнЮть до гёиеру-вання коливапь мембранного потенц!ачу й вм1н 1онно1 пров1дност! еародк1в в'юна;

5.. Вивчити д!ю цнклШних нуклеотидхв на генерування мембранного потенциалу й пров!дн!сть плазматичних мембран , а тагах вм1-нк проте'1Нк!навно! актизност! в пер!од дробления зародк1в в'юна;

Наукова новизна Б ранньому ембр!огенез! риб та амЗйбай вивчено вплив вторинних кооередн»1к1в на елевтроф!з1олог1чн1 па-

I.-!

раметри эародгових мембран бяаотомер1в, що д!ляться : отрим-шо йов1 дан! про корекцш метаболтмних процес1Е , що летать в основ} генерування осцшшц1н !нтограяьного 1онного струму, про-в!дноот! й мембранного потенциалу вародк!в в'юна; доел!длено дин. \t\Kj эм!е рН цлтопла?ми при нормальное/ роввитку ! при дП

Эароестровако зм!ни провгдносп, тегрального 1онного струму й мембранного потешцалу протягом 8 ця!ткнних цикл1в у Б&родк1В шпорцево'1 жаби (Хепориз 1ае71з й.). Досвджен! амиш електрсф1в1ологхчиих пзрачетр1в ззродкоьих мембран при 1нг1бу~ вашй гл1кол1тичних процесав; вплив цшШчних нуклоотид1в 'на акшш провгдноот! й мембранного потенц1алу при дроблени! блао-ти/1ер1в вародк1в в'юна.

Досдадкешш вплив 1он1в кальцш на р1аних етапак кл1 тинного циклу 1 його вплив на ашштуду коливанъ' МП аародшв в'юна.

Науково - практична 1инн1сть роботи Отриман! нами дан! мо-жутъ використовуватися для розробки способ1в присгарекня, чи гальмування прол!феративних процэс1в на р1вних отйд1н,ч снтогне-зу тварин. Основна налравлипсть роботи була в пг.оведенн1 фун-даментальних експериментальних досл1джень >част! вторинних по~ середниШв в мембраноав'яэалих працесах регуляцП еыбр1оналыю-го розвитку риб 1 амф1б1Й. Д1щам1кь эм1и електроф1в1олог1чнин параметров езронкових шмбран риб може хзракгериэуЕати $1&1оло-г:.чшш стан вародк1в, що роэвквзкться. Електричн1 покавники. дннаткз яких ч1тко в1дпов.1да5 темпам прэл1ферацП , можуть використовуватися для вивначення фаэ кл1тинного циклу в умовах штучного 1нкубувашт ьародШв, а такс» бути критериями оиДнки якоот1 еашиднення й теотувзти рхвень литтевдатност! аародШв в рибних господарствах. Отрнмши нами реэультати молуть викорис-токуватиси при тдготовц! спецкурсов по бЮлогП ' роэвитку, мн.йранологп 1 б1Рф1гиц1.

ОсноьнЛ положения як! виносяться на захист :

1. При нормальному розвитку эародк!в в'юна i шпорцево! жа-би, в1дбуваються' осцилякП мембранного потенщалу, пров1дност1 й вих1дного Энного струму, пер!од коливань яких сп!впадае за фазою з тривал1стс окремого м1тотичного циклу.

2. Речовшш - модиф1катори стану елемент!ь цитоскелету мало впливагать на ритмхксу коливань електроф1з1олог1чних параметр!в ембр1онБЛьно1 мембрыш;

3. 1нг1бувакня , чи Ективування проте1нк1назно1 активност! клН'ини опричинае t)Mii;y пров1дност! плазматично! мембрани;

4. Амшптуда коливань мембранного потенц1алу й пров1дност! мембрани протягом перших шести годин розвитку зародкав в'юна заложить е1д концентрацГ! Юн;в кальц1га в середовищ!;

fj. сДМР 1 сЗМР активно, але рхэнонапр'ямлено д1ють на ре-гудъсван! ними матаболгтн! мембранозв'язан1 процеоп в пер1од раннього ембр1огенезу риб.

Дпробац1я роботи Вигладен! в дис?рта1цйн1й робот1 резуль-

твтк допов1далиоь i обговорювались на Всесоюзной штамп - сем1-

n;ipi "Устойчивость биологических систем" (KyTa'ici, 1989); XIII

з'1рд! Украпюького fii3io.uori4Horo Товарг тва (Харкав, 1990);

Symposium on Molecular Neurobiology (Kiev, 1991); Conference

v

"Mc-chanism of Ion Channel Activity" (Hif-sur- 'vette, 1932); Conference "Ion Chattels anri Cellular Car-1'" (Bristol, 1992); XI International Piophysicrj Congress (Budapest,1993)j International Symposium "The Hole of Cell Adheruon inoleoules in itnmuno -pet! jlcfry" (Warsaw, 1993).

Публлкащ! По материалах дисертэцП оггубл1ковано и роб!г.

Структура та об'вы роботи Диоертад1йка робота складазться ia вступу, огляду Л1тератури, орису об'ект!в i метод!в дсюдхд-ження, 8 глав досл!д;*ень i ix обгоьорення, buohobkib та б!бл!ог-patfiii. Робота аикладеда на i«7 CTopiHKSX, м1стить з< pucyiwiB i таблиць. ЕШл1ограф!я вм!щув 190 першоджерел в!тчизняних га ва-pyöiMHiix aBTopiB.

ОБ'СКТ I МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ

Дссл!дження проводится на ззрсдках в'юна, вивхльнених в1д перив!тел1ново1 оболонки ! еародках шпсрцево! жаби, штШнених в1д драглистих оболонок механ!чн:м способом препаруваяьшми гол-каш. 1нкубували об'екти дссл!дкень при температура +20-21" С б модниц кованому рогчина Гольтфр^тера при pH 7.4: Naol - 110 r.iM; KCl - 1,4 inM; CaClg - 1,8 mM; £-5MiHo,2 (Ндрскскметил)- 1,3 -хлсрпропандхол - 5 мМ.

Вим1рювання елрктроф1в1олог1чних параметров проводили ев дг.могою стандартно! мжроелектродно! технхки (Костюк, Критгаль, 1981 ; Магура, 1961; Первио, 1503).

Для отримашш неперервно] !н|ормацП про електрофШодо-riMHi параметри мембран, керування ходом екзперименту ! сбробщ дани.ч, сикориотовували комплекслу рееструючу автомагн^свачу до-в1дникову систему КРАДС (Коритний, 1987).

/ /

РЕЗУЛЬТЛТИ ДОСЛГДЕЕНЬ I IX ОБГОВОРЕН!«

1.3м1ни електрсф1в1 лог1чних параметра в'юна в период синхронного дробления 6ластомер1в.

Як показано на рис. 1 протягом перЮду раннього ембрхоге-иееу в'юна, Синхронно в дроблениями бластомер1В, вм1нювалися 1онний струм 1 проЕ1дн1оть мембрани. При ф1коац1'1 потенц!алу на р1вн! -40 мВ, шр в1дпов!дт сепедн!м значениям МП зародкЛв в'юна, амплитуда коливань 1онного струму склад ала в1д 5 до 10 нА, причому в м1ру г1перполяриеац11 мембрани, ампл!туда коливань 1о1шого струму иаростала . В1домо, що йри г1перполяривацП мемб-ранч понад - 60 мЕ реверсЛю струму на цих об'вктах отримати не вдаеться (Гойда, Меднна, 1988).

Дооягнення максимальних еначень Интегрального струму 1

>1у< •

прэв1днос.1 сгпвпадало в моментом Закладки борозни наступного подглу, тобто в прометафаэ1 - коли р!вень синтезу макромолекул в максимальаим. При анал1в! результата можиа помгтити д1ллнка, коли зС1льшення прсв1дност! супроводжувалося посиленням вх1дно-"о струму, ар св1дчить про складн! змпш 1 он транспортних влзс-тквоотей плазматичних мембран протягом кл1тинного циклу.

Хврзгаеризуючи динамику зм1н електроф1в1олог1чних парамет-

р1в плазматичних мем-ран протягом пер1оду дробления бластомер1в

(л

в'юна ол1д в1дм1тити, шр в цей перЮд опостер!гаються осшишцП мембранного потенциалу (№1), ¡онного струму й пров1дност! плззма-тично1 мембрани, сипхронн! е клШшними циклами. В1доио, що протягом кожного кяНинного циклу у вародк1в в'юна гаконом1рно вар1-юе 1:рва пров!д1пст:< мембран, що оприяе горекцП примембранних град1рнг1а осшйли« еле-к1еог<»юш 1он1з (Гсйда и др. 1383 - ¿993}.

Рио.-1 АГ Цин^ика осциллЩй 1ошюго струму О ) Й прорадиоот! ап мемРрзни эарпдк!в в'юна (р1вень ф1коацП похенщапу-40 Ы?) л- фрагмент оригинального запису ходу енспершеяту;-В- приклад'формування БАХ мембрани.

Зв!Д'!Л . ВИХОДИТЬ, ЩО Пер!ОДИЧН1 КОЛИВЗННЯ бЛеКТрофШоЛЭ-г1чнпх параметров олоовр?дкоиая1 механ!эмом регуляцП каМево! прокик-лвост! мембран прот..гом дробления Оластомер!в и'юна.

КрШ того, б уда виявлена ч!тка колнвна д;шам!ка р1вня внутр1кл1тиннсто рИ нротягом синхронних дроблень бластомер!в в'юна, яка не пов'нвана 1з На+/Н+-обм!ном,

В процесс експериментального досл!джеиня, показано також, що речовики - модиф!катори отану 8лемент!в цитоскелету мало вили-вають на аагальну ритм!ку. чоливань досл1джуваш1Х парзметр!в емб-р!онапъних мембран ктитин. Однак, п1д д!ею 1нг10уЕання процео!в вбирания - розбкраннн м!кротрубочок колцем1дом проходила зм!на к! лъглсних характеристик коливань р!вня МП, зменшувався потенц!ал реверс!'! вольт - амперких характеристик (ВАХ) за рахунок эменшен-ия г1перполяризац1'1 мембрани. М!кроф!лам9НТи, очевидно, в б!льш!й м!р! гедяят в процесах регуляцП цикл.1чних вмп! електроф1з1оло-г1чних параметр1в, оск!льки потенциал реверс!! через 2 години и!сля дП 1НГ1б1гора процео!в збирзння - роэбирання м1кроф!ламен-т!в цитохалазшюм В зм1нювався в!д -50 мВ до -20 мВ.

Д1я фактора стаб1л1эац!1 м1краф!ламент1в - фгшкндину сут-тевнх зм!н в пров!дпоот! ыембраии не викликала.

Враховуючи структурн! ем1пи зародк1в п!сля руйнування мж-роф1ламгнг1 в, досить скледно^зд&кватна !нтерпретувати змпш по-тснщап1в реверс! 1 БАХ 1 зсув коливачь хонного струму й 1оннсЛ пров1дност1 за фазою. Так! ?ы1ни могли проходит« 1 внзол!док пер?розпод!лу 10ПНИХ град!е1гг!в.

Сл1д ьадмгтнти, ¡до в цих дослЗда". були виявлен! гм!ни кинетики перех!дних процес1в колг.ваиь струму й пров1дност! в си-нус01д£сьнич йс И - п'дцЮиж. Цэ вгязуз на те, що пер!одичн! ко-

ливання пров1дноот1 мембршш 1 МП у фазах рростанця й опаду, лише в певн1й м!р1 залежать в!д отану м!кроф1ламент1в, що ув-годжуеться э клнетичшми параметрами роботи одиночнкх 1 синих ка^алгв, П1сля дИ цитохалавину (Ережестовскин и др., 1993).

3 1ншого боку, незалежна в1д стану цитоокелету ампд1туда пер1одичних осциляцай електроф1и1олог1чних параметр1в ембр1о-нально! клхтшш зд1йснювться на метабол!тичному р1вн1 шцт.ли, про що св!дчать експеримещи з 1нг 1буванням процес1в трант крипцп та трансллцП (Санагурский, 1982).

2.Пор1вня.льна характеристика 1онтранспор1них систем у риб 1 амфЮгй за перюд 1х раннъого розвитку

3 л1тератури в1домо, що загальн1 законом!рнос?1 аьпн електроф1а1олог1чних покаеюшв мембран вародклв риб 1 емф1б1й за "^агатьма аспектами гиявшцгая под1бними, неэвамаючи на в1д-мпшост1 типу дробления й будови евродк!в Полтава, 19?4).

Для уточнения цих даних нами Суло проведено оьр1ю дослгд-жень осциляц1й електричпих пока! Лив У ранньому еибр1огенеа1 амф!б1й.

На рис.2 нредстазленл результат« експериыент1в реестра^'» 1нтегрального 1онного струмуй прсв1дноот1 вародковсп мембрани шпорцево! жаби.

Протягом окремого кл1тинного циклу вначення юнного отру<у и иров1дност.' змлшвалион теж пер1одкчно та синхронно а !штнн-пш.ш дгленнпми, як 1 у зародк1в в'юна.

Однак, як видно з представявного матер1алу, поряд ? за-гальними законсм!рностями ритм1чних кол,лань Юнного струму тр. про!пдност1 зародково! мембршш, у ембр1оН1Е риб та амф1б1й е 1 дьнгд сугтев! в1дм1пност1.

30 X (НА) 15

~1б 2

G (мкСм) 1

60 SO 120 150 180 Z10 2-40 270 í»0 t™ Рио.2 Динач1ка (t) 1нтеграцП ioimoro струму (И 1 пров1д-hoctí (0) мемСрани kjiíthh гарсдк1в Xenopus lasvls ва умев ф1ксацП пстенцгалу (значения ф1ксованого потенциалу складало -40 мВ);

(стр1лками в каг ана KijaKiCb Слаотомер1в) i -

Ам^;л1туда коляванг алнного струму у вародгав в'гона мае тендекц1ю до аарсстання збеолюгних значокь при г!перполяривацП в пс-р1ов синхронного дробления 6ластомер1в. У рародгЛв Xenopus Izsvls вХдбувалася р1вном!рн1ша г1перполяри?зц1я мембранн на фон! ритм1чних осцилкщй юичого струму.

О

-и

Узагальнюючи отриман! дан1 та даш л1тёрзтури, ол1д в!ди1-тити загальну под1бн1сть ем!н електрсф18юлсг1чних покав-ншлв в пер 1 од раннього ьыбр1огеневу риб 1 амф1б1й. Як виявк-лось, у представник!в обох клаохв тваркн ртвень кшИево! про-в1дност1 плазматичних мьмбран, то в ведучмс в дацому прочее!, визначаеться новсутореною мембраною (Гойда, Медина, 1688}, а ышш 1онно'1 пров1д:юст1 е вир1шальнм.ш в мехал1зм1 генерацП колиЕань МП в пер1од раннього ембр1огецеэу як риб так 1 амфЮИ.

З.Вплив 1он1в кальц!д на динам!ку мембранного потенциалу зародк!в в'юна

Одним з эавдаль нашого дослад'ження було вивчення впдиву 1он1в Са2+ на динащку влектроф1з1олог1чних пярамотр1в зародк1в в'юна. •

Для приготування 1нкубац1йного середовивд використовували ровчин Голыфретерз , модиф1 кований 140 мМ гэхаровов.

Було проведено екоперименти при нзявноот1 в ипсубац) гаюму с^редовищ!: 1.8 мМ Са2*"; 20 Ш 40 мМ Сз2т1 80 Ш 0а2+

(Рио. 3).

Проведений кореляцШгай анал1з одержаних даних показав, щс. до стад 11 8 бластомэр1в ам1ии МП т д впливсм £0 нМ Са2'1" були не до:тов1рн1 в пор!внянн1 в оптимальною концентрацию 0&2 в 1,8 1А!, але по абсолютних значениях все - гаки слостерхгалася тец-денцгя до г1л--рполяриэац1} мембрани.

Несб/лдио В1Д1,птити, що динашка МП ввергала, в основному, коливний характер, синхронний дробленям блаотомер1в, Алэ р1зниця ь е-Л-юлютних ве-лнчилах ч\л ¡гонтралсм та д1вю 20 ыМ Саг+ складна 10-?0 мВ.

Гис.З Залежн1сть ампл1туди генеруваьня коливань мембранного потенщалу (Ет) в1д концентрацП 1он1в кальц!ю в се-редовшЦ 1нкубувЙ!ня аародк!в в'юна.

О- 1.8 ММ Са2+; 20 ММ Са2'; Д- 40 мМ Са2+: к- 80 мМ Са2\

При 1нкубац11 вародк1в в'юна в середовищах, що м1стили 40 1 80 мМ Са2+ спостер1галося вначне зменшення величини МП протя-гом усього ,пер1оду експгрименту.

Представлен1 ревультати показують канцентрац1йну залеж-н1сть величини МП в!д наявйост! в середовищ! 1он1в калыЦю.

1Д фокги увгоджуйться 1в в!домостяыи 1нших автор!в про те, що аапл1днею1й та роввиток аародк1в гальмуеться при в1дсутност1 в серэдовишД камщ1ю (Ротт, 1987) :

Омснхення абсолютних величин МП у пор1внянн! з ф1з1олог1ч-иим оптимумом у 1нкубац1йних середовищах з надлишко, гальц!ю моле Сути насл1дс.ом пм1н пречиглипсот; плэг.матични:: момСран

1нших 1он1в у цих умовах. Сл1д зауважитн, що 1онч Са21" р. ф1э1олог1чно оптимальних концентращях не псрушують п?р1сдич-ноот! коливаг, МП при сшг'ронних дробленях блаотомерав 1 спри-чиняють лише незна-»н1 рм!ни проц^о1в раннього ембрхогенезу . Але дуле велит концентрапП 1он1в са21" в середовищл р1вко ени-жутоть МП 1 порушують нормальний ембр!сгенез, що св1дчить про взамозв'язок цих ьроцес1п.

Для б!льш глибо!«эго вивчення дП 1он1в Са2+ на зм1ну електроф1з!олог1чних парам<?тр1в мембран в ранньому ембр1огенез! в'юна, було визначено характер рм1н МП при апл1игц11 1он1в кальц!ю на р!зних ет'апах кМтинного циклу. На стадп 1нтерфаэи кл1тиннсго циклу трс :ього синхронного дробления пр:: утвор^нч! 8 благтомер1в апл!кац1я 1С мМ Саг' приводила до г'пешгалпризацИ мембрани на 10-12 мВ (Рис. 4).

Ашикащя г 1в1 само! концентрацП в!льного кальц1ю в пер1-од м1тозу спричиняла деполяризаШю мембрани па 5-7 мВ., а в момент утворення бороэни назтупного под1лу , що в1дпов1дае перго-дов1 про-метафззи щптинного циклу, приводило до Г1перполприза-цп мембрани "ише на 3-5 мВ.Анал1 одер.тдних нами результатов 1 пор1внпння IX з данями л!тератури показув, щэ морфогенеигаи функцГ] зародкових юитмн в залежними в1^ наявност! 1сн1в каль-1дга в зовн!шньсму середовипц. Найбгльп. чутливим до впли.ву кашь-Ц1Ю виявмвся пертц 1нтерфази кл1Тиш;/)го циклу, коли активупть-ся метабол1т1пн1 процеси 1 иде накопичення сиктете?ованиу речо-1е1н для наступного мистичного под!лу кл!тпни.

В1домо, що в реал1вац1: юп инноЗ в1дпс Дд! на стгмуляц1ю метабол1т1иних процэс1в гормонами, рсстовими факторами та 1иши-- ми агента,1и, значну роль в1/играоть цикл1чн1 нуклеотвди. ^ ог- . л Iду на це, намн пров:д<?на наступил с^ия експ?римс-нт1в по дос-

л1л.чя11!в цих пр_'ц4с1в.

60 90 120 150 1Ь0 210 240 ЗОО^.хв

Ет "

(МВ)

-20

-40 -60

2 4

I I

16 32 64 128 1)11

Рио.4 Вплив ши-^кацП 10 ыМ Са2* на дннаийку нец .ютшшп Ш (Ет) у р1&них фазах 'юи'лшного циклу пер1оду синхронного дробления бластомер1в в'юна.

4.ЦИШ11ЧШ нуклеотиди як модулятори проникливост! зародкоьо! мембран и.

Дссл1д;кення, в яких були ьикористан! 1НП61тор фосфодиес-терааи - .'еофШн та 1нг101тор протешк'шази А - тол0утам1д, показали, щс при гидЕ;иценн1 н цитоаол! чонцентрацН сАМР наступав йиразнз деполлри. ац!я мембрани, а Шхбуванна протепнйнази А опричина* додаткову г1перполярнзйц:.ь плаематичних мембран.

Активатор пг.оте'!Нк1иаэи С- форбол, 12,-м1риотзт, 13-ацегат приводив до валужненнй цитоплазми к ьикликав швидку деполяриььцш мембрани.

Ц1 результата говорить на ксристь того, ар метабол!ти эде-н1латциклазно1 системи , що в втсришлми пссегедниками передач1 1нформац11 Bi М9) !>ран до цитоплаеми, твкои причетн1 до кор<?к-ц!'1 осциляц1й мембранного потенц!алу й Iohho'í нров1дносТ1 плаэ-матичних мембран.

Для в'ясування щл1сно5 картини метабол1?му мембранозк'яза-них процес!в раннього ембршгенезу, ц!кавим було доол1длення взавмовв'явку мгж гл!кс-Лтичними процесами й проте'1нк1навно» активюстю клзтмш. ' Для цього экспериментально простежено характер 3MÍH мембранного потенциалу пЮля аплжеиП db сЛМР в умовах !нг1буваннп гЛ1кол1т1Г-лшх процес1в.

3 рис. 5 видно, що 1нг1б1тор процео!в гл!кол.*?у - анетат ртут! пхсля додавання в !нкубаш.йне середсвище ^икликав деполяризаций мембрани на 8-10 мВ . Доданий n)aw. цього cío cAMP г1-перполяризував плазматшну мембрану на 10-12 мВ., причому рит-м!ка й цишпчн1сть осцилпц!й МП не порушуваялся.

Анал1зуючи отриман! експериментальн! дан!, видно, що 1нг1-бування ироцегпв гл1кол1ву й апл1кац1я проникаючего аналогу цшипчного аденоэин 3',5'- млгаФосфату, проявляють ср1й вплпв in мембранний потеши ал.

Очевидно, тут Mas ),цсце певна корекщя враеыозв'пгку мета-бшптичних ланок енергозабе?лечення ак.ивного транспорту ioijin П1Д впливом cAMF з гл1кол1тичними процесами. Це полипа?. 1 на характер ?м1н електричних парпметр!в мембран рародкових кМтин.

До реч1. регуляшя аkthbhoctI íohhüx канал! в оДМР-затеним фосфорипкпанням була описана баг тьма автора и на plpnovmlTimx обЧ-кта.х (Porcshenko et al. ,1982; Cbrhelln et Ewald

et al., 138Б; fJ-ikoPiiuз & Gold. .1937: Sadcshtuu? et al.,l?í:3; Kuire st al., 1509). г>ащй ?аугалпти, цо pip«nh внуф^итшшоге

60

120

Ещ 0 (МВ)

-20 -40 -60

• 1

1В0 ¿40

300 ^Хв

(СНдСООЖя

! 7 г

аьсАМР

Рис. Ь Сум1сний вплиа ШгЮування гл1кол1зу ацетатом ртут! й аг1л1кац1Ч с!Ь сЛМР на динамшу нарос ;ання МП (Ет) у к-Итинах еародк1в в'кна.

сАМР, прот.-'],чк1иавва актиьшсгь й фосфоршшвання б!лк1в вмхню-ються гаг:;.* и^рюдично :. синхронно в дроблениями бластомер!в (Лазар^а 1> др., 1964; РёаиоеШег е! а1.,1934).

Отже, вг!днэ г л1тератури1шп даат.ш, в зародкових шитинах функцп цикл1чних луклооти^'в маыть широкий д1апазон д11 в1д катального для вс1х кл!тин пуск воги механ1ему метабол1тично1 актщ.ност1 до системних еплив1в на 4ункц1онуЕання генетичного апарагу.

На рис. 8 представлено результата експерименту но досл!д-женшо характеру осциляц!й МП п1д Д1е.. проникаючого аначогу сЛМР - N б,0-2'дибутир'"таденовпн 3' :5'-цикл1чний монофосфат (<1Ь сАМР). В експериментах, прсведених нами ран!ше, полагало, що фунгсцЮ-нальну активн!сть у вивченн! електроф1з!олог!чних параметр!в емб-р!оНальних мембран проявляв лише проникаючий аналог сАМР ! що в!н активний лише п!сля стад'! 8 бластомер!в (Гойда, Мпдынп, „ 1988). с/Ь сАМР виклнкав г1перполяризац1ю мембрани на 12-17 мВ. Сл1д ?ау-ваадти, що апл!каЦ!я с/Ь сАМР в 1нкубац!йне середовнще розвипгу зародк!в в'юна, не викликала зм1н у пер1од! та ритм!и! осши1яп!й мембранного потенц!алу.

Одним 1з эавдань досл!дження участ! Цикломонопуклеотид!п у метабол!зм! мембранозв'язаних процес1в було вив'*ення характеру ?м1н пров1дност1 плазматично! м°мбрани п!д вгливом апл!кацП с/Ь сАМР. Так, вже через к!лька хвилин п!сля алл!кац11 пров1д-н1сть ембр!онально! мембрани еростала (Гпс.7).

З'ясуванню рол1 сЭЛР у метабол!зм! мемранозв'язаних проце-с1в була прнсвячена наступна сер!я досл!д!в.

В цьсму випацку трнвал! лть пгр1оду осциляц!й мембрачного -,о-тенц!алу протягом раннього ембр!огенезу в'юна, значно зростала (Рис.3), а р!зниця гм!н м!ж мШмальнога л максимальною величиною при цьсму падала майже вдв!ч1. Зауваж но таиож . виявлену в цих експериментах г1перполяризац1п м^мбрачи на 8 - 10 мБ у пор1чнянн1 з контролем.

Той факт, що д!ч сБМР спричинялз гбьлъшення тривапост! гл!тинного циклу з 20 - 31 хв. контрол1 дп 40 - 45 кв. св!д-чить про антибатнпй характер дП того вторичного по!герг'Днпка на електричн1 прсц°си мембрзн гярод^в у пор!вняян! до сАМГ>.

1»Пйе Збчиепсе

Р»з. 3 Д1я анл1каци Ю-3 М с/Ь сШР на осщшщП мембранного потеиц1алу (Ет) у раннъому ембр1огенеэ1 в'юна.

Сгивотавляючи отршан1 нами ревудьтати й л!гературн1 Даш, мп ир^понуемо наступну схему чшсш! оргшивацп мембраиоэв'-яршшх процес1в у ранньому еыбрЮгенеа! тварин (Рио.е). Деполя-риеац1я мембречи тонц-жтращйними град!еитами юше, гормонами, роотовшд! факторами та 1н.,тобто первиншши посредниками актп-вув роботу ¿онних |канал1в, що Эб1льшуб осмошлл£шк:ть цито&оню, та спричиняз лсвине вроотання 1онно! пров!дност1 плазматичнр! мэмбрани.

Рис. 7 Вплив lib сАМР на характер вм!н пров1днссг1 мембрани raiiTira ?ародк!в в'юна.

Це веде до'вростання концентрацП внутр1шиьокл1тшшого гса-лш й сприяв г1перполяривацП.

ИперполяриеаЩя плаематично1 мембрани, яка сп1вп"ав ? пе-рюдом 1нтерфаэи кл1тинного циклу в свою чергу веде до вм1ни роботи потешиалэалежних ioHHiix кал ал. в, йаступна 1нактивац1я яких Ееде до деполяриаацП.

Внутр1шньокл1тинн1 сигнали корегуютьсп системою втсрннних пссередник1в (сАМР, cGWP, Са2'*) , но в к1нцевсму насл!дку веде до фос'форнлювання 1онних канал1в, а отяе, до ново! Iу активацП.

Под^Сний лачшзг вакоординовзних процес!в повтор, зться в кожному настунному цикл1 в час дробления Зластомер1в тварин.

Виявлена ватежн1сть життевдатност1 эародк1в в1д вих!дного piBim мембранного потенц!алу й отг (У icmral прсв1-ноет!, ноже бути викс-ристано в практиц! як прогновуший тест.

lime 5*чиепс* Plot

ч

-12

■22

ш

-32

-S3

1

£gm р

к - ,1 1 ib 1 32 1

......... 'V

40

¿а

Tims-

80

I Ой

fno.3 Д1а апл1кацП 1СГ3 М o&lP на осциляцп мембранного потенциалу (ЕЯ1) у ранньому ембрюгенеы в'юна.

(отроками показано момент формувапня оороэнн дроблашл иаотупиого мИотичного циклу, щр в1диов1дае кальксси бластомзр1В на даному eiani ембр1онаиьного росдштку)

АКТИВЛЦШ 101ШИХ КЛ11ЛЛ1В

Перпинн! мсссеиджерн □-(Илии

Цеполярииац1я мембранм

Эб1лбшення рИа \

Фосфорнлнтання

Вх1д На\01~,Н20

\

Вториши мессонджерм / Актизац1я ДГ<-»рН+ (в т.ч.сЛМГ.сПМР.Са2^) / На+,)С+-АТРааи

К! наяна активн1сть

I нант-тац ¡я ¡оиних канал!в

[КК->Г1п^ рполярча ац \ я .••ембрани

Эменшення рНз'

Рио.9 Шляхи метабол!?му мембранозв'яваних процес!в у ранньому емСр1сген?э1 тварин.

ЕИСНОВКИ

1. Досл1джено динам1ку ем!н мембранного потентату й про-

в!дност1 нлазматично! мембрани протя.см пер1оду синх-

оонного дробл-?ння бл.т,томер1в р'юна 1 ыпсрнево! жаб и та

)

остановлено, п;о ц1 пзряметри копивлоться синхронно, э

передом кл1 тинного циклу яг. у зэродглв г иб, так 1 у Е-зрогдав ач'Мв1й.

2. Показано, що абсолютн! величини мембранного потенц1алу, BJixiflnoro ionHoro отруму и npoBiflnocTi плаэматичних мембран в nepiofl дробления зародк1в риб i амф1б1й ыак-оимальн! в прометафазах юпти.:них цишив.

3. Е^стаьовлено, що 1снуе вэаемоаь'явок М1Ж протепниназною активнЮтю i пров1дн!стю плавматично'1 мембрани. Так, при активацп сАМР-залежно}' проте'ткхнази в1дбуваеться зменшення К* - провгдност! мембрани, а при 1нг1бувалн1 ri- шдвищення'Kf - npoBiflHOOTi плазматично'1 мембрани. При активацп проте1кк1наэи С форболоЕпм еф1ром в!дбу~ вазться зменшення К+ - пров1дност! мембрани та залум-нення цитоплазми .

4. nponifliiicTb ембр1оналыю1 мембрани эроотае при деф1Цит1 ioHiB кальц1ю в 1нкубацшюму середовищг. Апл1кац1я io-HiB ьа2+ веде до мперпаляризаци мембрани, причому цей ефект нанвиразнше прсявлявся протягом лиерфази гл1тщшого циклу.

5. Рои ' ашикацП db сАМР зросгае проыдность плазыатнчно1 мембрани, що спишадае за фазою is зростанням мембранного потенц1алу ,

6. сАМР i caff5 д1ють по-рЛзноиу на динашку електричних пз раметр1в мембран вародгЛв риб. Зокрема db сАМР вигликаз ;'1перг.олл,л1еащи н азматично! мембрани вародк!в в'юна, не вшнюючи тривалосп ксливань мембранного потенщалу, ефект ашчкацп сбИР зб1льшуе триваПеть цього пер!оду. Залропонована схема про шляхи регулкцЦ перюдичних ко-ливних мгчбранавв'язаних npoi^cirt у. рант,ому ембр1огенев1 тварин i участь втсринних посередннкль у цпх процесах.

- 23 -

Список наукових праць Чабана В.В., опублакованиу по тематгац дисертацП:

1.Гойда Е.А. ,Медына И.Р. .Стельмах Н.И.,Тызьо ;'.В., Чабан В.В Влияние инсулина на ионный транспорт и потребление кислорода у зародышей вьюна в раннем развитии // Цитология. .-1989.-Т.КОП. , N 9.-С.1099- 1100.

2. Гойда Е.А., Медына И.Р., Чабан В.В. ,Тыэьо Р.В. Роль активности - АТРазы и уровня рН е регуляции ионюй проводимости мембран эмбриональных клеток // Цитология. -1990.,Т.XXXII, М 9.-С.92-1.

3.Гойда Е. А. .Медына И. Р. ,Стельмах Н.С.Дыэьс Р. ,ЧаСанВ.В. Влияние сАМР- зависимой протеинкиназы на пнную проводимость зародышей вьюна сопряжено с клетслшми циклами дробления бла тсмеров .Тез.докл.V Всес.конф."Фиэиоллогия

и биохимия медиатсрных процессов".-М.1990.-С.75.

4.Гойда 0.А.,Медина 1.Р. Тизьо Р.В., Чабан В.В. Мембра-нозв'язан! процеси в ранньому ембр1огенез! тварпн Мат.XIII з'1зду Укр.ф1з1олог1чного товариства.-Хзркхв 1990.-С.74

5.Гойда 0.А., Чабан В.В.,Медина I.Р. Електроф1з1олог1чн1 параметр» 1онтранспортних систем у период ранньсго розвитку риб 1 амф!б1й // Ф1 з!олог1чний ж-л.-1992, N в.-С.'Ой- 105.

6.Ережестовсгаш П.Д., Гойда Е.А., Медына И.Р.,Чабан ¿.В Роль цитоскелета в регуляции циклических изменений электрических параметров мембран зародышей вьюна М1з?игпиз ГоээШз // Онтогенез.-1993, М 3 .-С.81-9'1

7.Гойда 0. А., Ощеловський В.Г., Дж?.чаВ.1., Чабан В. В. Методшнп вказ!вки для студент1в 1У курсу б1олог5.чного факультету.- 1993,- Вид. Льетеського у-ту 64 с.

- 24 -

6.Chaban V.,Goida 0..Medina I.The effect of growth factors on rnernebrane conductivity of embryonic cells. Mat.7 Intern. Conf. of ISO "Cellular Programmes for Qrowth, Differentiation and Neoplasia".- 1992,-Helsir'-.i.- P.28.

9.Chaban V..Qoida 0..Sansgursky D. Influence of adrenalin on the TMP changes in developing loach embryos and the role of cytosceleton elements in this processes. Abstract of 7 Intern. Catecholamine Symp., Amsterdam.-1992.-P,47. ^0.Qoida 0., Medina I., Chaban V. Periodical changes of electrical parameters of- membrane in the period of cleavages of embryos. Abstr.ll Intern. Biophys. Congress.- Budapest.- July 25-SO 1993.- P.125. ll.Goida 0. & Chaban V. Role of second messengers in electrophysiological processes in embryonic celij // Mat. Intern. Symp."The role of cell adhesion molecules in irnunopathology.-Wars im.- 1993.