Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие транскрипционных факторов USF и CTCF в регуляции синтеза белка-предшественника β-амилоида

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Участие транскрипционных факторов USF и CTCF в регуляции синтеза белка-предшественника β-амилоида"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВОСТРОВ Александр Аркадьевич

УЧАСТИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ иЭР И СТСР В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА р-АМИЛОИДА

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургского государственного университета и на кафедре психиатрии Университета штата Нью-Йорк в Стоунн Брук (США)

Научный руководитель

- доктор биологических наук Ещенко Наталья Дмитриевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Борхсениус Сергей Николаевич

Ведущее учреждение

кандидат биологических наук Чихиржина Галина Ивановна

■ Петербургский институт ядерной физики им Б П Константинова РАН

Защита состоится "Ж" ЛЮУ^Су 2005 года в {¿.часов на заседании Диссертационного совета Д 212 232 09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им А М Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "Sfy" j&Ct^v^ 2005 года

Ученый секретарь^. р . доктор биологических наук Лк/и Крутецкая З.И.

9т

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Болезнь АльцгсИмсра проявляется как постепенная и прогрессирующая потеря памяти у людей пожилого возраста. В развитых странах, в связи с увеличивающейся долей престарелых среди населения, болезнь Альцгсймсра пыходиг на первый план среди социальных проблем. Согласно оценкам экспертов, в США этоИ болезнью страдают до 4-х миллионов человек, а общие экономические потери превышают 100 миллиардов долларов п год.

Причины возникновения болезни Альцгеймера до сих пор окончательно не ясны При микроскопическом исследовании мозга умерших пациентов наблюдается нейродегенерация мозга, сочетающаяся с наличием в мозге внеклеточных отложений амилоида (сенильных бляшек или амилоидных бляшек), а также с присутствием внутринейронных нейрофибриллярных сплетений. Исследования показывают, что при заболевании в патологические процессы на клеточном уровне вовлечено множество различных факторов, как белковой, так и небелковой природы. Одной из наиболее пристально изучаемых в этой связи макромолекул является белок-предшественник амилоида (amyloid precursor protein, АРР). Бета-амилоидный пептид, являющийся основным компонентом сснильиых бляшек /Glcnner & Wong, 1984/, представляет собой фрагмент белка АРР, образующийся в результате протеолиза. Одна из ведущих гипотез о механизме образования сенильных бляшек предполагает, что в его основе лежит дисбаланс между производством бе га-амилоидного пептида и его утилизацией организмом /Гольдгабер, 2003/. В связи с этим, актуальной является задача выяснения механизма регуляции образования пептида на уровне транскрипции гена белка-предшественника, те, белка АРР. К моменту начала данной работы промотор гена АРР был детально изучен в структурном /Salbaum et д!, 1988/ и функциональном /Quitschkc, 1994/ аспектах В участке промотора длиной примерно 100 нп, примыкающем с 5'-стороны к старту транскрипции, были выделены два регуляторных элемента ДНК (сайты АРВа и APBß), отвечающие за высокий уровень транскрипции гена /Quitschke, 1994/. Таким образом, для дальнейшего понимания механизма регуляции транскрипции гена АРР стало необходимым решить задачу идентификации белков, связывающихся с элементами АРВа и APBß в промоторе данного гена.

Цели исследования. Целью исследования являлось: идентифицировать белки, связывающиеся с регуяяторными элементами АРВа и APBß в промоторе гена АРР, выяснить особенности взаимодействия данных белков с промотором. Задачи исследования:

1 Проверить ранее опубликованные данные о связывании белков USr /Bram & Romberg, 1987/ и APLP2 /Vidal et al., 1992/ с CDE1 последовательностью ДНК, сходной с АРВа элементом промотора гена АРР. Выяснить, связываются ли эти белки с АРВа элементом

2 Выделить белок, связывающийся с APBß элементом промотора гена АРР. Степень очистки выделенного белка должна позволить идентифицировать белок-кандидат микросеквенированием Проверить, действительно ли данный белок связывается с APBß

элементом промотора гена АРР.

3. Выяснить, как в процессе дифференцнровкн изменяется в ядрах нейронов крысы количество белков, связывающихся с АРВа и APBß элементами промотора гена ЛЯЯ.

4. Получить препаративные количества белка, связывающегося с APBß элементом промотора гена АРР.

5. Выяснить, какие элементы ДНК-связывающего домена белка, узнающего APBß сайт, взаимодействуют с 12-нуклеотидным ядром сайта и являются необходимыми для связывания белка с сайтом. Выяснить, какую роль в связывании играет взаимодействие белка с периферическими последовательностями сайта.

6. Определить, какой участок молекулы белка, связывающегося с APBß элементом промотора гена АРР, отвечает за активацию транскрипции.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые, одновременно с тремя другими независимыми группами исследователей, опубликованы данные о том, что фактор USF связывается с АРВа последовательностью промотора гена АРР Впервые показано, что белком, связывающимся с APBß элементом в промоторе гена АРР, является фактор CTCF. Впервые опубликована процедура очистки активного рекомбинантиого белка CTCF из дрожжей Pichia Pastoris. Впервые показано, что белки USF и CTCF связываются с соответствующими элементами проксимального промотора гена АРР в ядрах дифференцирующихся нейронов гиппокампа крысы, а также проанализированы изменения количества этих белков в данных клетках -со временем. Впервые определены индивидуальные цинковые пальцы белка CTCF, взаимодействующие с APBß элементом промотора гена АРР. На примере промотора гена АРР впервые получены прямые доказательства того, что белок CTCF способен активировать транскрипцию, а также установлено, что в активации транскрипции участвует N-концевая часть белка.

Данная работа посвящена изучению механизма регуляции синтеза белка АРР на уровне транскрипции его гена. Исследования в этой области могут помочь выяснить механизмы развития патологических процессов при болезни Альцгеймера. В процессе работы были получены препараты рекомбинантиого белка CTCF, а также антител к данному белку, которые широко используются в экспериментальной работе других групп исследователей, в частности, в лаборатории под руководством V Lobanenkov в Национальных Институтах Здравоохранения США и в лаборатории под руководством R. Ohlsson в Уппсальском Университете (Швеция). Основные положения, выносимые на защиту.

1. Транскрипционный фактор USF связывается с АРВа элементом промотора гена АРР

2. Белок CTCF связывается с APBß последовательностью в промоторе гена АРР

3. Разработаны процедуры очистки CTCF из культивированных клеток человека, а также из рекомбинантных дрожжей Pichia Pastoris.

4. Белки USF и CTCF связываются с элементами АРВа и APBß промотора гена АРР в ядрах

дифференциирующихся нейронов гиппокампа крысы. В процессе дифференцнровкн количество - —■

СТСЕ^а.|цегке,возрастает примерно в 5 раз, а количество USF - примерно в 2 раза.

i в/-.» : I ort f-

5. Во взаимодействии CTCF с АРВР промоторным сайтом ДНК принимают участие цинковые пальцы с №1 по №9. При этом критическим является взаимодействие цинковых пальцев №5, №6 и №7 с последовательностью промотора, расположенной между нуклеотидами в позиции -94 и в позиции -83 Периферические цинковые пальцы усиливают связывание CTCF с АРВр элементом ДНК.

6 Получены прямые доказательства того, что, в контексте промотора гена АРР, CTCF является активатором транскрипции В осуществлении транскрипционной активации принимает участие N-концевая часть белка.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены автором на следующих симпозиумах и конференциях:

- Митинги Американского Нейронаучиого Общества (American Society for Neurosciencc) в 1993, 1996,1997,1998, 1999,2000 и 2003 гг.

- Семинар Национальных Институтов Здравоохранения США (июль 2000 г )

Публикации. По теме диссертации опубликовано б печатных работ.

ОбъСм и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, указателя литературы, включающего 77 источников^ рис -34,гл0» 1

Материалы и методы.

Экстракты ядер. Все эксперименты по получению ядерных экстрактов проводили при 0°С Экстракты ядер клеток HeLa получали из клеток, выращенных в жидкой среде до поздней логарифмической фазы (5x10*-!О9 кл/л) .Клетки собирали центрифугированием при 3000xg в течение 10 мин. Клетки дважды промывали буфером А, содержащим 10 мМ 11CPI2S, pll 7,6, 2 мМ MgCl;, 0,1 мМ ЭДТА, 15 мМ KCI, 1мМ ДТТ, 0,2 мМ PMSF Клетки рссуспсндировали в 4 объемах буфера А и гомогенизировали 20 движениями пестика л гомогенизаторе Даунса. К гомогенагу добавляли 1/10 объема буфера В, содержащего 50 мМ HEPES, рН 7,6, 2 мМ MgCI2, 0,1 мМ ЭДТЛ, 1М КС1, 1мМ ДТТ, 0,2 мМ PMSF Ядра собирали центрифугированием при 5000xg в течение 10 мин> и рссуспсндировали в 4 объемах буфера, состоящего из 10 частей буфера А и одной части буфера В Ядра лидировали добавлением 1/10 объёма 4М (NH^SO* Лизис продолжали в течение 30 мин с медленным покачиванием пробирки Лизат осветляли центрифугированием при 100.000xg в течение 90 мин. К супернатанту добавляли (NH4)2SC>4 из расчета 0,3 г на 1 мл. Осажденные белки собирали центрифугированием при 15.000xg в течение 20 мин. Белковый осадок ресуслендировали в буфере D, содержащем 25 мМ HEPES, рН 7,6, 2 мМ MgCI2, 0,1 мМ ЭДТА, 100 мМ KCI, 1мМ ДТТ, 0,2 мМ PMSF, и диализовали против 1л буфера D в течение 8 часов с одной смсной буфера в середине диализа Полученный экстракт, содержащий примерно 10 мг белка на 1мл, хранили порциями по 100 мкл при -80°С. Истощение экстракта ядер антителами против CTCF проводили добавлением к экстракту аффинно очищенных поликлональных антител к полноразмерному рекомбинантному CTCF. После инкубации при 0°С в течение 1 ч. к эстракту добавляли '/« объема

бслок-А-Ссфарозы (Pharmacia Biotech), уравновешенной буфером D. Смесь острожно перемешивали в течение 30 мин при 0°С Сорбент удаляли центрифугированием при ШОООхц в течение 20 сек.

Анализ связывания белков с ДНК метолом сдвш а электрофоре гической моГпип.носш (ретардации элскт рофоретичсских зон). Реакцию связывания белков с ДНК проводили в объеме 16 мкл в буфере, содержащем 40 мМ HEPES, pH 7,6, 2 мМ MgClj, 0,1 мМ ЭД'ГА, 75 мМ KCl, 10% глицерин Реакцию проводили в присутствии I мкг двухцепочечного полимера ДНК po!y(dI-dC) po!y(d!-dC) (Pharmacia Biotech) в качестве ингибитора белков, неспецифически связывающихся с ДНК Белки проинкубировали в реакционной смеси в течение 1-3 мин при 25°С, а затем к смеси добавляли 2,5 иг исследуемого "Р-олигонуклеотида, меченного полинуклеотидкинаэой по 5 -концу Реакцию связывания проводили в течение 30 мин при 23°С. Продукты реакции свял,шапия анализировали с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. Гель фиксировали и высушивали Количество радиоактивности в зонах определяли при помощи прибора Phosphor Imager (Bio-Rad) За единицу сдвига электрофорстической мобильности (есм) принимали количество фактора, необходимого для сдвига I нг олигонуклеотида в зону с уменьшенной электрофоретической мобильностью. При проведении экспериментов по конкурентному связыванию радиоактивно меченный олигонуклеотид предварительно смешивался с конкурентным олиюнуклеотидом в требуемом соотношении. В экспериментах по иммуноретрдации электрофоретических зон белки ядерного экстракта инкубировали с антителами против индивидуальных транскрипционных факторов в течение часа при комнатной температуре По окончании инкубации реакцию связывания и анализ её продуктов проводили по вышеописанной методике.

Анализ белков методом сшивки с ДНК ультрафиолетовым облучением. Однотпепой олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания исследуемым белком, отжигали с затравочным додскануклеотидом, комплиментарным к его S'-концевой части Двуншевой олигонуклеотид достраивали модифицированной ДНК-полимсразой фага Т7 (Sequenase™, Untied States Biochcmicals, США) согласно инструкции изготовителя. В реакции использовали 5-бромо-2'-дезоксиуриднн-трифосфат вместо ТТФ, а также дЦТФ, радиоктивно меченный фосфором-32 по а-положению Полученный олигонуклеотид очищали фенольной экстракцией и осаждением этанолом. Реакцию связывания с белками проводили, как описано выше Продукты реакции связывания облучали в приборе Stratalinker 2400 (Stratagenc, США) в течение 10 мин К реакционной смеси добавляли MgCI2 до 5 мМ и СаС12 до 2 мМ концентрации и 5-20 сд ДНК-азы I После инкубации при 37°С в течение 20 мин реакцию гидролиза останавливали добавлением 20 мМ ЗДТЛ и 1% ДСП, и белки осаждали 5 объемами ацетона при -20°С л течение, как минимум, 6 часов Продукты реакции анализировали денатурирующим электрофорезом с ДСН.

Анализ связывания белков с ДНК методом футпринтимга ДНК-язой I, Радиоактивно меченные по одному из 5'-концои дцушисмыс фрагменты Д11К получали ПЦР-пмшшфмкпцнсМ с

использованием пары праймеров, один из которых был предварительно помечен при помощи полинуклеотид-кипазы фага Т4 /Maniatis et а! 1989/ Синтезированные фрагменты очищали препаративным электрофорезом в неденатурирующем пол иакрилам идиом геле. Реакцию связывания бел ко» с ДНК проводили, как описано в гл 3 2 2 К продуктам реакции спжынлнпя добавляли ДНК-азу I и инкубировали при 25°С в течение 10 мин Реакцию i идролиэа останавливали добавлением 20 мМ ЭДТА и 1% ДСП, и белки экстрагировали фенолом ДНК осаждали )ганолом и анализировали электрофорезом в денатурирующем пол иакрилам и дном геле

Транскрипция hi vitro. Для проведения реакции транскрипции m vitro в конечном объёме 16 мкл смешивали 4 мкл экстракта ядер клеток HeLa с 2 мкг матричной плазмиды Реакционная смесь содержала 25 мМ HEPES, pH 7,6, 2 мМ MgCI2, 0,1 мМ ЭДТА, 75 мМ KCl, !мМ ДТТ, а также 600 мкМ каждого из ГТФ, УТФ, ЦТФ и 200 мкМ АТФ (указаны конечные концентрации) Реакцию проводили при 30°С в течение 30 мин По окончании реакции РНК очищали на колонке RNcasy (QIAULiN, (JLiJA) '_>л»ои|ю»ш»1иу|о PI IK 01жи(шш с радоак ишно меченными нрпймерммм, комнлименгарными к синтезированной РНК Реакцию обратной транскрипции проводили при 48°С ü течение 90 мин в буфере, содержащем 10 мМ Трис-IICI, рП 8 0, 75 мМ NaCI, 8 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 0 5 мМ каждого из дАТФ, дГТФ, дЦТФ и ТТФ, а также 10 сд плацентарной» ингибитора РНК-азы и 20 ед обратной транскриптазы AMV (Roche Molecular Biochemicals, США) По окончании реакции кДНК очищали экстракцией фенолом и осаждали этанолом Продукты реакции анализировали электрофорезом в денатурирующем пол иакрилам идиом геле Результаты и обсуждение.

DSF связывается с АРВа последовательностью промотора гена Л PP. Промоторный элемент АРВа похож rio своей первичной структуре на консервативный элемент CDM, содержащийся в ДНК дрожжевых центромер В литературе упоминались два белка, способных связываться с последовательностью CDEI в клетках млекопитающих — транскрипционный фактор USF /Bram & Kornberg, 1987/, а также белок APLP-2, обладающий сходством по первичной структуре с белком АРР /Vidal et. al, 1992/ Таким образом, перед нами встала задача исслс делания возможности того, что белковым фактором, связывающимся с элементом АРВа промотора гена АРР, является один из этих белков.

На первом этапе решения этой задачи мы поставили эксперименты по конкурентному связыванию белков ядер клеток мозга быка с элементами АРВа, CDE1, a также с элементом промотора аденовируса, узнаваемым фактором USF Результаты экспериме!ггол показали, что п данных клетках одни и те же белки связываются со всеми тремя последовательностями /IHK

На следующем этапе мы синтезировали фактор USF /я vitro в прокариотической бесклеточной системе Поскольку в образовании фактора участвуют два белка с молекулярными массами 43 кДа и 44 кДа, то эти белки, обозначаемые в литературе USF43 и USF44, были синтезированы как по отдельности, так и совместно Данные белки самопроизвольно димершукнея между собой В эксперименте по ретардации электрофоретичсских зон (Рис 1) удалось

зарегистрировать комплексы как гомодимеров, так и гетеродимеров белков ЮТ с олигоиуклео гидом, содержащим элемент АРВа промотора гена АРР Зоны со сходной электрофоретической мобильностью обнаруживались также о случае использования в реакции свягмпания экстракта ядер клеток мозга быка Связывания олигонуклеотида ни с какой нз известных 4-х форм белка АРЬР-2 зпрсгсстрировано не было.

Рис.1. Синтезированные 1п Vиго белки, иЯР и АР1..Р-2 инкубировали с радиоактивно меченным олм< онуклееггндом А1Мкх 1I рол у к-г м реакции анплн зиронвли элскторфорек>м II» >лек-|рофорс1р.1ммс укн ымы юмодимернме и гсчеролимсрные комплексы и81г (43, 44 и 41/44) с олиюнуклеогидом Семимппнис ко-транслироваииых 1п унго белкой и8Р43 и иЭГ44 в соотношениях 3 1, I I и3.1 анализировали о дорожках I. 2 и 1, соответственно, а ежпезирооаиных отдельно 1}5»Г43 и и8Р44 - п дорожках 4 и V соошетсгвешю В дорожке 7 использовались продукты контрольной реакции, не содержавшей плаэмидной мал риим Для сраписння, продукты связывания белков экстракта ядер клеток моэ1а быка с олигонуклеотилом анализировали в дорожке 6 Связывания олигонуклеотида с белками АРЬР-2 зарегестрировано не было (дорожки 8-1!) Воспроизведено из Майю* с! а!., 1995/

Для окончательною доказательства юю, что белком экстракта ядер клеюк моз!а быка, связывающимся с последовательностью АРВа, является иБЯ, были проведены эксперименты но им муно ретардации В контрольном эксперименте проводилась реакция связывания сингезированного т уиго иЗГ43 с олиго||уклсотидом АРВа. Продукты реакции инкубировали с

антителами против белка иБГ43 и анализировали электрофорезом (Рис. 2)

----- '"

Рис. 2. Анали! иммунореактивности комплексов, образоппннмх радиоактивно меченным олиюнуклеогидом АРВа с USF43 (дорожки I и 2), USF44 (дорожки 3 и 4), ко-транслирошншыми ш viim USF43 и USI 44 (дорожки 5 и 6) или белками зкетракта ядер клеток мои а быка (дорожки 7 и 8) Реакция связывания приводилась в отсутствии (-) или в присутствии (+) антител против USF43 На элсктрофореграммах указаны гомолимерные и гегеролимерные комплексы USr (43, 44 и 43/44) или комплексы ядерных белков (Са, Са! и Са2) с олигонуклеотилом АРВа Обозначен также сдвиг комплексов под воздействием антител (ч) Воспроизведено из /Voslrov et al, 1995/

В присутствии антител (Рис 2, дорожка 2) комплекс гомодимера USF43 с

олигонуклеотилом полностью сдвигался в район старта электрофореза Инкубация антител с

комплексом, образованным гомоднмером USP44, не приводила к изменению картины электрофореза (Рис. 2, дорожки 3 и 4) В случае же использования в реакции продуктов совместной трансляции USF43 и USF44 (Рис. 2, дорожки S и 6), сдвигу подвергались только комплексы, образованные гомоднмером USF43 и гетсродимером USF43/44. В продуктах связывания, которые белки экстракта ядер клеток мозга быка образуют с олигонуююотидом АР 13а, преобладает комплекс Са, мигрирующий при электрофорезе в окружении менее представленных комплексов Cal и Са2 (Рис. 2, дорожка 6) После инкубации с антителами против USF43 с вигу подвергались комплексы Са и Са2, в то время как позиция комплекса Cal оставалась неизменной (Рис. 2, дорожка 7) В целом, приведенные результаты позволяют утверждать, что основной комплекс Са образован гетсродимером USF43/44, а сагеллитные комплексы Cal н Са2 - гомодимерамн USF43 и USF44, соответственно. Таким образом, результаты наших экспериментов показали, что белком, связывающимся с последовательностью АРВа в промоторе гена АРР, является USF

CTCF связывается с АРВр последовательностью промотора гена ЛРР. Оценка

молекулярной массы белка, связывающегося с АРВР элементом, проводилась методом

ультрафиолетовой сшивки На авторадиограмме геля на фоне отдельных минорных полос чётко

выделяется зона, соответствующая молекулярной массе 140 кДа (Рис 3).

Рис. 3. Ультрафиолетовая сцжвка ядерного белка с АРВр элементом. После проведения реакции связывания с олигонуклеотилом АРВР-WT, меченным 5-бром-2-дезоксиуридином и а-(32Р]~лезоксицитидином, белки подвергали ультрафиолетовому облучению, обрабатывали , ДНК-аюй I и анализировали гель-электрофорезом

п присутствии ДСН Дорожка 1 - тотальный экстракт ядер клеток HeLa, дорожка 2 - фракция экстракта, очищенная хроматографией na СМ-aiapoJc, дорожка 3 - белок препаративно очинённый сдвигом элсктрофорстичсской мобильности Слева указаны позиции маркеров молекулярной массы Снраиа скобками обозначены Г - свободные оли! онуклеотилные фрагменты, b - олигонуклеотид, сшитый с белком Воспроиj ведено из /Vostrov et ai, 1997/

Ядерный белок, связывающийся с АРВр элементом, был частично очищен в несколько хроматографичсских стадий ДНК-связывающая активность во фракциях определялась сдвигом элекгрофорстичсской мобильности. В очищенных фракциях наблюдалась чётко выраженная зона белка с молекулярном массой 140 кДа Данный белок был очищен препаративным электрофорезом. Гидролиз 140 кДа белка трипсином и микросеквенированис двух из полученных пептидов проводились компанией Harvard Microchem на коммерческой основе Поиск в базе данных GenBank показал, что обе пептидные последовательности, YCDAVFHER и IQMQK, полное 1ью содержатся в последовательности транскрипционного фактора CTCF, впервые описанного в качестве репрессора гена с-тус курицы /Lobanenkov et al, 1990/.

Для проверки предположения о том, что CTCF связываетсяя с АРВр последовательностью,

были поставлены эксперименты но конкурентному связыванию Мерных белков с промо горными сайтами (Рис 4). В экспериментах использовали 80-чпенные двухцепочечные олигонуклеотиды АРВр-80ЙТ, содержащий АРВР элемент дикого типа, олигонуклеотид АРВР-80МР2, содержащий описанную ранее мутацию, предотвращающую связывание ядерного белка с АРВР элементом /ОиПБсЬкс 1994/, а также олигонуклеотид МУС-80, содержащий фрагмент промотора гена с-тус курицы, связывающий СТСИ /ЬоЬапепкоу с! а!., 1990/.

Д Anil-KnWT» М| 2 3 i

R MVC-»* 12 14

Й-1 »S 8

enmpefltor« S

Рис. 4. Конкурентное ингнбирооанне связывания белков с олигонуклеотидами. Л Радиоактивно меченный олигонуклеотид АРЕф-80\УТ инкубировали с тотальным экстрактом ядер клеток НеЬа. Продукты реакции анализировали сдвигом электрофорстичсской мобильности Реакцию спязмвания проводили либо » отсугсгпии конкурентного олигонуклеотид а (дорожка 1), либо в присутствии 200-кратного молярного избытка ол и го« «ук л сотида ЛР13р-80^П (до рож к,! 2), оли1 онуклеотидп АР1)(1-80Мр2 (дорожка 3) или олигонуклео-гидп МУС-КО (дорожки л) И 1« же что и А, за исключением того, что и реакции связывания использовался радиоактивно меченный олигонуклеотид МУС-ЙО

Воспроизведено из /Уовичмг с! а!., 1997/

Анализ связывания белков тотального экстракта ядер клеток HcLa с радиоактивно меченым оли гону клеотидом APBß-80WT представлен на Рис. 4 А. В отсутствие конкурса! ного олигонуклеотида (Рис. 4А, дорожка I) на геле наблюдалась выраженная зона с уменьшенной мобильностью, соответствующая комплексу белка с ДНК. Как сам олигонуклеотид APBß-80WT (дорожка 2), так и олигонуклеотид MYC-80 (дорожка 4), добавленные к реакционной смеси немеченными в 200-кратном молярном избытке, ингибируют образование комплекса с меченым нуклеотидом за счет конкуренции за связывание с ядерным белком. Олигонуклеотид APBß-80Mß2, добавленный в тех же количествах, на образование комплекса не влиял (дорожка 3).

Приведенные выше данные показывают, что APBß последовательность и ранее описанный сайт узнавания CTCF в промоторе гена с-тус курицы связывают один и тот же ядерный белок.

Данный вывод подтвердился в эксперименте по реципрокному ингибированию связывания (Рис. 4В). Таким образом, результаты экспериментов по конкурентному связыванию ядерных белков позволяют утверждать, что CTCF связывается с APBß элементом в промогорс гена АРР Факт связывания CTCF с APBß элементом был также в дальнейшем подтвержден в экспериментах по иммуноретардации электрофорстичсских зон с использованием антител против CTCF

CTCF регулирует усиление экспрессии гена АРР в процессе дифференциации нейронов гиппокампа крысы. В 1999 г. Yang et al. опубликовали d соавторстве с хами работу, посвященную изучению экспрессии гена АРР в нейронах гиппокампа крысы и процессе эмбрионального развития Нашими соавторами было показано, что в процессе дифференцировки первичных нейронов в клетках происходит 30-кратное усиление активности промотора гена АРР,

ведущее к пропорциональному увеличению количества транскрипта гена. Было также показано, чго ключевым событием в этом процессе является активация элемента APBß в промоторе гена

Нашей задачей явилось установить, связываются ли факторы USF и CTCF в ядрах данных клеток с соответсвующимн элементами промотора гена АРР, а также проследить, как изменяется со временем количество данных факторов в клетках в процессе дифференцировки Методами конкурентного связывания белков экстрактов ядер нейронов гиппокампа крысы с олигонукпеотидами, а также иммуноретардации электрофоретических зон мы показали, что и ь этих клетках с элементом АРВа связывается фактор USF, а с элементом APBß - фактор CTCF

Рис. 5. Связывание транскрипционных факторов CTCF и USF с ДНК в культивированных нейронах гиппокямпд крысы. Изменения со временем в процессе дифференцировки. Относительная ДНК-свяэывакмцая пктилносп. фактороп и ядерных экстрактах на I-ыН, па 4-ый или на 7-ой лень культивирования Связывание сто' и USF с ЛИК определялось метолом количественной ретардации электрофоретичческих зон Связывание CTCF и USF » пробах, полученных на 1-ый день культивирования, принималось зп I 11рслстпнлспм усредненные данные по результэтам трех независимых экспериментов по культивированию нейронов. Воспроизведено и t /Yang et al, 1999/

iley l'dayJüyV

Дифференцировка эмбриональных нейронов гиппокампа крысы происходила в культуре клеток в течение 7 дней. С мелью количественной оценки факторов USF и CTCF в клетках экстракты ядер получали из нейронов на i-ый, на 4-ый и на 7-ой день культивирования. Экстракты анализировали методом ретардации электрофоретических зон с использованием радиоактивно меченных олигонуклеотидов, содержащих элеменгы АРВа и APBß. Количество радиоактивности в рстардироваииых зонах ишеряли и нормировали на параллельно измеренное количество конститутивно экспрессируемого фактора NF-Y в экстрактах в каждой временной точке (Рис.5). Оказалось, что ДНК-связывающая активность фактора USF удваивается к 4-ому дню культивирования, оставаясь в дальнейшем постоянной. В то же время, ДНК-свяэывающая активность CTCF увеличивается примерно в 3 раза на 4-ый день культивирования и примерно в 5 раз - на 7-ой день культивирования. Таким образом, были получены данные, позволяющие утверждав, что возрастание общей акгивиости лромогора гена АРР в процессе дифференцировки нейронов в культуре происходит вследствие возрастания ДНК-связывающей активности CTCF в ядрах клеток.

Очистка рекомбииантиого белка CTCF экепрессированиого в Picltla Pastoris. По нашему опыту, получить высокий уровень экспрессии CTCF и рекомбинантной системе крайне сложно. Так, например, при экспрессивном клонировании в Е coli CTCF подвергается интенсивной деградации, так что полноразмерный белок в исходных экстрактах составляет не более 5-10% от

массы фрагментирооанного белка. Более подходящей оказалась система экспрессии в дрожжах l'idua Pastoiis. Нами была разработана методика очистки рскомбинантпого CTCF, сосюяшая из 3-х хроматографических стадий, позволяющая получить препарат белка пригодный для иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител. С получением больших количеств рекомбинантного белка CTCF стала также возможной постановка экспериментов ш vitro по юучению механизмов его взаимодействия с промотором гена APP.

Влияние делецмй индивидуальных цинковых пялыдев на связывание CTCF с Ai'liß последовательностью промотора гена APP. ДНК-связывающий домен белка CTCF содержит 11 цинковых пальцев CTCF связывается со множеством разнообразных последовательностей ДНК, часто не имеющих сходства между собой Такое разнообразие сайтов узнавания возникает за счет того, что цинковые пальцы взаимодействуют с ДНК неодинаково Для каждого из сайюв имеется определенный набор цинковых пальцев, присутствие которых абсолютно необходимо для связывания. Другие же пальцы вносят меньший вклад во взаимодействие с сайтом и могут быть делетированы без потери связывания. Для определения набора цинковых пальцев, необходимых для связывания CTCF с АРВр элементом промотора гена АРР, был получен набор из 11 белков, содержащих делении индивидуальных пальцев. Результаты показали, что делецин цинковых пальцев №5, Ns6 и №7 приводят к noiepe способности белка к связыванию с APBß элементом При делениях же других пальцев, способность к связыванию не теряется.

J 9 «3 - + * * * + + ♦_+■

Рис. 6. Футлрннтшп промотора гена АРР дикого типа ДИК-азой I с использованием деле ин о иных вариантов белка СТСК. Л. Дорожки I и 10 • гидролиз фрагмента промотора ДНК-азой I проводили без предварительной инкубации с белком Дорожка 2 - перед проведением I илролиза ДНК инкубировали с СТСР, очищенным из .экстракта ядер клеток НсЬа Дорожки 3-9 - перед проведением > илролиза Д1 П< инкубировали с рекомбинантными производными белка СЛСР. Полнораэмерныи СТСГ - дорожка 3. Дслеции, дорожки- 4 - М249, 5 - М285, 6 - 7,п4. 7 -061?, 8 - С525, 9 » ¿п9. Слева скобкой отмечена область, защищенная от ДНК-азы I и одноразмерным белком СТСГ (ГЬ СТСГ), стрелка указывает на сайт, гипсрчувстьителышй к ДНК-азс I (Иу) Справа скобками отмечены области, защищенные от ДНК-азы I белками СТСР, содержащими делении С-концсных цинковых пальцев (АС-£п) и М-концсвых цинковых пальцев Ооспрошведено из

/Уовсгоу « а1, 2000/

iiiSiiilei

lifillljsi üülüht l!l4iilMll

Участие периферических цинковых пальцев в связывании для связывания CTCF с APBß

эл смс hi ом изучали методом футпринтинга ДНК-азой I (Рис 7) Связывание CTCF с ДНК промотора гена АРР приводит к образованию защищенного от гидролиза участка ДНК, простирающегося от позиции -116 до позиции -78 (Рис. 7, дорожки 2 и 3). При этом в позиции -98 возникал сайт, гиперчувствительный к ДНК-азе 1 Идентичная картина наблюдалась при использовании делециоиных вариантов М249 (дорожка 4) и D617 (дорожка 7), в которых удалены N-коицепая часть или С-концевая часть, соответственно Это позволяет предположить, что CTCF взаимодействует с APBß элементом ДНК только посредством своих цинковых пальцев. В случае более обширной N-концевой делеции М285, затрагивающей цинковый палец №1, происходит сокращение 3'-концевой области защищенного от нуклеазы участка до позиции -83 (Рис, 7, дорожка 5) Такое же и »мененис картины футпринтинга происходит и при использовании внутренней делеции цинкового пальца №4 (дорожка 6) В случаях же использования С-концевой делеции С525, удаляющей цинковые пальцы №10 и №11 (дорожка 8), и внутренней делеции цинкового пальца №4 (дорожка 9) происходи! сокращение S'-концевоЙ области защищенного от шдролиза участка до позиции -98, а также исчезновение сайта, гиперчувсгвительного к ДНК-азе I Аналт кинетики диссоциации комплексов, образованных делеционными вариантами CICF с ДНК APBß элемент показал, что взаимодействие периферических цинковых пальцев с элементом значительно увеличивает стабильность комплексов

N-концсвяя часть белка CTCF необходима дли активации промотора i сна ЛРР. Роль фактора CTCF в активации промотора гена АРР изучали в экспериментах по транскрипции т vuto Матричная плаэмида содержала гены-репортера хлорамфеникол-ацетилтрансферазы и ß-галактозидазы РНК ß-галактозидазы синтезировалась под контролем конститутивного промогорй ß-актинопого гена, и служила в качестве внутреннего контроля для нормировки общего уровня транскрипции РНК хлорамфеникол-ацетилтрансферазы синтезировалась под контролем промоюра гена АРР. В результате транскрипции т vitro образовывались молекулы РНК двух типов, которые анализировались обратной транскрипцией с радиоактивно меченных специфических праймерок Транскрипгы гена ß-галактозидазы начинались, в основном, с одного стартового нуклеогида, в го время как транскрипция хлорамфеиикол-ацежлтрансфсразы под контролем промотора гена АРР инициировалась в двух стартовых точках - в позициях +1, и -4 (Рис. 7А). В реакции использовали как цельный экстракт ядер клеток НеЬа (Рис 7А дорожка 1), так и экстракт, истощённый аффинно очищенными антителами против CTCF (дорожка 2). При использовании истощённою экстракта количество РНК, синтезированной под контролем промотора гена АРР, уменьшалось до 23% от количества, синтезированного с использованием цельного экстракта. При этом количество РНК, синтезированной под контролем промотора ß-актинового гена, не изменялось. Таким обратом, удаление из экстракта ядер фактора CTCF приводило к специфическому снижению активности промотора гена АРР.

Для восстановления способности истощённого эксгракта ядер клеток HeLa к акинищии промотора гена АРР использовали белок CTCF, очищенный из рекомбннангимк дрожжей l'tchui

Pastoris При добавлении рекомбинантного белка к истощенному экстракту, активность промотора гена АРР восстанавливалась пропорционально количеству добавленного активного CTCF, достигая уровня наблюдаемого в цельном экстракте (Рис 7А, дорожки 3-5). При этом во всех случаях активность промотора ß-актинового гена оставалась на постоянном уровне По данным нескольких экспериментов, была построена кривая восстановления активности промотора полноразмерным CTCF (Рис. 7В) в зависимости от количества добавленного активного CTCF Результаты показали, что в присутствии значительного избытка CTCF активность промотора может достигать 1,5-кратного уровня, наблюдаемого в исходном цельном экстракте. Таким образом, нами было получено прямое доказательство того, что фактор CTCF является транскрипциоиным активатором в контексте промотора гена АРР.

Рис. 7. Восстяноолеиис способное гм истощен иного экстракта ядер клеток Не La к яктнпяции промотора ген я АРР путём добавления рекомбипянтиою белка CTCF и его делециониых производных, А. Транскрипция ш v иго с использованием цельного экстракта (дорожка I), истощённою экстракта (дорожка 2), или истощенного экстракта с добавкой л возрас гшощих количес » i»ax i юл i шр.имержн о рскомбинаитно! о CIС Г (дорожки 3-5), или СIС Г, содержащего делеции С525 (дорожки 6-8), D6I7 (дорожка 9), М249 (дорожки 10, II), М285 (дорожка 12) Количество транскрипта, синтезированного под контролем промотора гена АРР, при использовании тотального экстракта принимали за 100% Справа скобками обозначены сайты инициации транскрипции в промоторе гена АРР в позициях -4 и +1, а также в промоторе ß-актиноеого гена В. Кривые восстановления активности промотора полноразмерным CTCF (-•-), а также делеционными вариантами М249 (-♦-) и С525 (-■-). в зависимости от количества добавленного активного белка. Кривые построены по данным нескольких независимых экспериментов. Воспроизведено из /Voslrov ci al, 2002/

Участки белка CTCF, придающие к цинковым пальцам как с N-концевой, так и с С-концевой стороны, не участвуют в связывании белка с APBß элементом ДНК Однако, вполне вероятно, чго они могут принимать участие в активации промотора гена АРР Для проверки функциональной необходимости этих участков были поставлены эксперименты, и которых к истощенному экстракту ядер клеток HeLa добавляли рекомбинантные белки CTCF, содержащие делеции N-концевой или С-концсвой часги белковой молекулы Оказалось, что в реакции транскрипции т vitro N-концевые и С-коицевые делеционные варианты CICF веду г себя по-разному, Белки CTCF, содержащие делеции С-концевой части молекулы, восстанавливали способность истощенного ядерного экстракта к активации промотора гена АРР (Рис. 7А, дорожки

Hri4 into tuntt ? irphtt*

тмМмнСТСТйМ - - n. UM S MI* i

»•мим >M«d |м>«| - - 1 71ЫМ l|l|4 5 J I é

ЛГГ ргвш*Irr Mllrtt« |%j IM 2t м|м|м 39|»l|tt И j||js II

A in**:««»*-!1 **

\

1 I J 4 5 * т ■ f I» II 12

6-9), п то время как добавки к истощенному экстракту N-концевых делеционных вариантов С ГС1- к увеличению активности промотора гена АРР не приводили По данным нескольких экспериментов были построены кривые восстановления активности промотора белками CTCF, содержащими либо N-концевую делецию М249, либо С-концевую делецию С525 (Рис 7В), позволившие заключить, что С-концевыс делеционные варианты активируют лромоюр гена АРР примерно с той же эффективностью, что и полпоразмсрныЙ рекомбинантный белок. Белок, содержавший N-коицсную делению М249 терял способность к активации промотора Таким образом, был сделан вывод о юм, что N-концевая часть молекулы CTCF необходима для активации фешскрииции с нромоюра юна АРР, а ю время как С-концснмя часть молекулы л данной функции белка участия не принимает

Выводы.

I Методами сдвига элсктрофоретичсской мобильности (ретардации), конкурентною связывания белков с ДНК, а ыкже иммуноретардации с использованием антшел ирогнн белка USi'13 установлено, что 1ранскрипционный фактор USF связывается с АРВа последовательное 1ыо в промоторе гена АРР.

2. Очищенный белок, связывающийся с APBß последовательностью в промоторе iena АРР, идентифицирован, как ядерный фактор CTCF Факт связывания CTCF с APBß элементом подтвержден методом конкурентного связывания белков с ДНК, а также комбинацией сдвига электрофоретической мобильности с Вестерн блоттингом 3 Разработана процедура препаративной очистки рекомбинант но го белка Cl'CF из дрожжей Pichia Past oris, включающая в себя« катион-обменную хроматографию на SP-сефарозс, аффинную хроматографию на Ni-сефарозе и хроматографию на геларин'сефарозе. 4. Методами сдвша электрофоретической мобильности, конкурентного связьшанин белков с 1К» а также иммуноретардации показано, что белки USF и CTCF связываются с элементами АРВа и APBß промотора гена АРР в ядрах дифференцирующихся нейронов гиппокамна крысы Количественная оценка комплексов ядерных белков USF и CTCF с радиоактивно меченными олигонуклеотидами методом сдвига электрофоретической мобильности показала, чю в процессе дифференцировки нейронов количество CTCF в клетках возрастает примерно н 5 puj, а количество USF - примерно в 2 раза Результаты экспериментов по конкурентному связыванию CTCF с делеционными вариантами промотора гена АРР в совокупности с полученными ранее данными опытов по транзиентной трансфекции свидетельствуют о том, что количество CTCF в данных клетках является фактором, лимитирующим активность промотора гена A PP.

5 Методом сдвига электрофоретической мобильности с использованием вариантов белка СЛ С Г, несущих индивидуальные делецин цинковых пальцев, а также методом футпринтиига ДНК-азой 1, показано, что во взаимодеисгвии CTCF с APBß промоторным сайтом ДНК принимают участие цинковые пальцы с №1 по №9. При этом критическим является взаимодсйсшие

цинковых пальцев № S, №6 и №7 с последовательностью промотора, расположенной между яуклеотвдами в позиции -94 и в позиции -83 Исследование кинетики диссоциации комплексов CTCF с АРВр элементом ДНК позволило утверждать, что периферические цинковью пальцы усиливают связывание CTCF с элементом.

6. Методом транскрипции in vitro с использованием экстракта клеток HeLa, истощенного антителами против CTCF, получены прямые доказательства того, что в контексте промотора гена АРР CTCF является активатором транскрипции Путем восстановления специфической транскрипционной активности истощенного ядерного экстракта добавлением делеционных вариантов рскомбннатною белка CTCF покашно, <:ю в ocvmcciBjiciimi транскрннционнон активации принимает учашис N-концсвая часть белка '

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации ^

*

1 В остров А А , Пшенке Н Д, Тахсни М Дж , Квичкс В В Белок CTCF - транскрипционный фактор гена предшественника бета-амилоида выделение и очистка рскомбииантной формы Н Нейрохимия, 2004, т 21, № 3, с.225-232

2 Vostrov А А. Quiltschkc W W , Vidal F, Schwarzman A L., Goldgaber D USF bindss to the APB alpha sequence in the promoter of the amyloid beta-protcm precursor gene,// Nuclcic Acids Res, 1995, Vol 21, p 2734-2741

3 Vostrov A A. Quiltschkc W W The 7ink finger protein CTCF binds to the APBbcta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter Evidance for a role in transcriptional activation II J. Biol Chem, 1997, Vol 272, p 33353-33359

4 Yang Y , Quiltschkc W W . Voslrov A A , Brewer G J CTCF is esential for up-regulating t expression from the amyloid precursor protein promoter during differentiation of primary hippocampal neurons II J/Neurochem, 1999, Vol 73, p 2286-2298

5. Quiltschkc W.W , Tacheny M J, Fochtmann L I, Vostrov A A // Differential clTcct of zinc ^

finger deletions on the binding of CTCF to the promoter of the amyloid precursor protein gene II Nucleic Acids Res, 2000, Vol. 28, p.3370-3378

6 Vostrov A.A.. Tacheny M.J. Quittschkc W.W A region to the N-terminal side of the CTCF zinc finger domain is essential for activating transcription from (he amyloid precursor protein promoter IIJ Biol Chem., 2002, Vol. 227, p 1619-1627

Подписано в печать 2101 05. Формат 60'84 1/16. Бумага офсетная Печать офсетная Уел печ л 0.93 Тираж 70 экз. Заказ № 02

Типографии Изда 1ельс та СП6ГУ 199061. С -Петербург. Средний пр .41

;

í

*

i

■.i

i-2817

РНБ Русский фонд

2006-4 9899

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Востров, Александр Аркадьевич

Список сокращений.

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели исследования.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы.

1.4. Основные положения, выносимые на защиту.

1.5. Апробация работы.

1.6. Публикации.

2. Обзор литературы.

2.1. Болезнь Альцгеймера.

2.1.1. Общие сведения.

2.1.2. Характерные невропатологические черты.

2.1.3. Нейрофибриллярные сплетения.

2.1.4. Отложения амилоида. Состав амилоидных бляшек. Бета амилоидный пептид.

2.1.5. Наличие сходной патологии у больных синдромом Дауна.

2.2. Белок-предшественник амилоида (АРР).

2.2.1. Клонирование гена АРР. Первичная последовательность белка АРР. Наличие различных форм белка АРР, возникающих в результате альтернативного сплайсинга.

2.2.2. Протеолитический гидролиз белка АРР и образование бета-амилоидного пептида.

2.2.3. АРР-подобные белки.

2.2.4. Существующие гипотезы об участии белка АРР в патологических процессах при болезни Альцгеймера.

2.3. Регуляция синтеза АРР на стадии транскрипции гена. . 14 2.3.1. Промотор гена АРР. Функциональные элементы ДНК в проксимальном промоторе гена АРР, связывающие транскрипционные факторы (сайты АРВа и АРВр).

2.3.2. Другие элементы ДНК, участвущие в регуляции экспрессии гена АРР.

2.4. Транскрипционный фактор USF. Димерная структура фактора. Существование двух различных белков USF, образующих гомо- и гетеродимеры. Разнообразие сайтов ДНК, связывающих USF.

2.5. Транскрипционный фактор CTCF.

2.5.1. Необычность структуры фактора. ДНК-связывающий домен CTCF содержит 11 цинковых пальцев.

2.5.2. Использование различных комбинаций цинковых пальцев позволяет CTCF связываться с необычайно широким спектром последовательностей ДНК.

2.5.3. Полифункциональность CTCF. Участие CTCF в активации и репрессии промоторов, а также в процессах инсуляции и импринтинга.

3. Материалы и методы

3.1. Материалы.

3.1.1. ДНК

3.1.2. Антитела.

3.1.3. Экстракты ядер.

3.2. Методы.

3.3. Общие биохимические методы.

3.4. Анализ связывания белков с ДНК методом сдвига электрофоретической мобильности (ретардации электрофоретических зон).

3.4.1. Анализ белков методом сшивки с ДНК ультрафиолетовым облучением.

3.4.2. Анализ связывания белков с ДНК методом футпринтинга ДНК-азой 1.

3.4.3. Получение рекомбинантного белка CTCF.

3.4.3.1. Культивирование рекомбинантных дрожжей Pichia Pastoris.

3.4.3.2. Очистка рекомбинантного CTCF.

3.4.4. Транскрипция in vitro.

4. Результаты.

4.1. USF связывается с АРВа последовательностью промотора гена АРР.

4.1.1. Белки экстракта ядер клеток HeLa , мозга быка и мозга крысы образуют сходные комплексы с AdMLP, CDEI и АРВа мотивами ДНК.

4.1.2 AdMLP, CDEI и АРВа последовательности ДНК связывают одни и те же ядерные белки.

4.1.3 Транскрипт человеческого гомолога гена CDEBP мыши подвергается альтернативному сплайсингу.

4.1.4 Синтезированные in vitro белки USF связываются с AdMLP, CDEI и АРВа элементами ДНК.

4.1.5 Антитела против USF43 реагируют с белками, связывающимися с АРВа элементом промотора гена АРР.

4.2 CTCF связывается с АРВр последовательностью промотора гена

4.2<1 Цвиттерионный детергент CHAPS позволяет зарегистрировать связывание очищенного ядерного белка с АРВр последовательностью.

4.2.|2 Идентификация методом ультрафиолетовой сшивки 140 «Да белка, связывающегося с АРВр элементом.

4.2J 3 Частично очищенные фракции экстракта ядер клеток HeLa, демонстрирующие связывание с АРВр последовательностью, содержат CTCF - белок с кажущейся молекулярной массой

140 «Да.

4.2]4 АРВр элемент в промоторе гена АРР и сайт связывания CTCF в промоторе гена с-тус курицы конкурируют за связывание с одним и тем же ядерным фактором

4.2J5 Антитела против пептидов из последовательности CTCF узнают белок, связывающийся с АРВр элементом.

4.2.16 Связывание CTCF с АРВр элементом активирует промотор гена АРР in vitro.

4.3 CTCF регулирует усиление экспрессии гена АРР в процессе дифференциации нейронов гиппокампа крысы.

4.3J1 CTCF и USF связываются с промотором гена АРР в культивированных нейронах гиппокампа.

4.312 В процессе дифференцировки нейронов количество CTCF в клетке, способного к связыванию с промотором гена АРР, возрастает многократно.

4.313 Замена последовательности, прилегающей к АРВр-сайту с 5'-стороны, на последовательность векторной ДНК приводит к снижению эффективности связывания CTCF с сайтом.

4.4 Очистка рекомбинантного белка CTCF экспрессированного в Pichia Pastoris.

4.4.1 Экспрессия CTCF в дрожжах и получение грубого экстракта.

4.4.2 Катион-обменная хроматография на SP-сефарозе.

4.4]3 Аффинная хроматография на Ni-сефарозе.

4.4.14 Хроматография на гепарин-сефарозе.

4.5 Влияние делеций индивидуальных цинковых пальцев на связывание CTCF с АРВр последовательностью промотора гена АРР.

4.5.1 Для связывания с АРВр элементом промотора гена АРР, необходимо присутствие цинковых пальцев №5, №6 и №7 в молекуле CTCF.

4.5.|2 В молекуле CTCF, при связывании с АРВр элементом промотора гена АРР, N-концевые цинковые пальцы располагаются на ДНК ближе к транскрипционному старту.

4.5.3 Делеции периферических цинковых пальцев снижают стабильность комплекса CTCF с АРВр элементом промотора гена АРР.

4.5.|4 Замена последовательности, прилегающей к АРВр-сайту с 5'-стороны, на последовательность векторной ДНК приводит к изменению картины футпринтинга ДНК-азой I. . 85 4.6 N-концевая часть белка CTCF необходима для активации транскрипции с промотора гена АРР.

4.6.11 Истощение ядерного экстракта антителами против CTCF приводит к снижению транскрипционной активности промотора гена АРР.

4.6.12 Добавление рекомбинантного CTCF к истощённому ядерному экстракту восстанавливает активность промотора гена АРР.

4.6]3 N-концевая часть белка CTCF необходима для активации транскрипции с промотора гена АРР.

5 Обсуждение.

6 Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие транскрипционных факторов USF и CTCF в регуляции синтеза белка-предшественника β-амилоида"

1.1. Актуальность проблемы.

Болезнь Альцгеймера проявляется как постепенная и прогрессирующая потеря памяти у людей пожилого возраста. При микроскопическом исследовании мозга умерших пациентов наблюдается нейродегенерация мозга, сочетающаяся с наличием в мозге внеклеточных отложений амилоида (сенильных бляшек или амилоидных бляшек), а также с присутствием внутринейронных нейрофибриллярных сплетений.

В развитых странах, в связи с увеличивающейся долей престарелых среди населения, болезнь Альцгеймера выходит на первый план среди социальных проблем. Согласно оценкам экспертов, в США этой болезнью страдают до 4-х миллионов человек, в то время как общие экономические потери превышают 100 миллиардов долларов в год.

Причины возникновения болезни Альцгеймера до сих пор окончательно не ясны. В последнее время, однако, стало ясно, что при заболевании в патологические процессы на клеточном уровне вовлечено множество различных факторов, как белковой, так и небелковой природы, роль которых в развитии болезни является предметом интенсивных исследований. Одной из наиболее пристально изучаемых в этой связи макромолекул, является белок-предшественник амилоида (amyloid precursor protein, АРР). К причинам интереса к данному белку относится тот факт, что бета-амилоидный пептид, являющийся основным компонентом сенильных бляшек /Glenner & Wong, 1984/, представляет собой фрагмент белка АРР, образующийся в результате протеолиза. Более того, мутации в гене АРР, кодирующем данный белок приводят к развитию семейной формы болезни Альцгеймера, составляющей, однако, очень малую долю в общем числе случаев заболевания /Goate et al., 1991/.

Одна из ведущих гипотез о механизме образования сенильных бляшек предполагает, что в его основе лежит дисбаланс между производством бета-амилоидного пептида и его утилизацией организмом /Гольдгабер, 2003/. В связи с этим, актуальной является задача выяснения механизма регуляции образования пептида на уровне транскрипции гена белка-предшественника, т.е. белка АРР. К моменту начала данной работы промотор гена АРР был детально изучен в структурном /Salbaum et al., 1988/ и функциональном /Quitschke, 1994/ аспектах. В участке промотора длиной примерно ~ 100 нп, примыкающем с 5'-стороны к старту транскрипции, были выделены два регуляторных элемента ДНК (сайты АРВа и АРВр), отвечающие за высокий уровень транскрипции гена /Quitschke, 1994/. Также было показано, что эти элементы ДНК специфически узнаются не идентифицированными белками из экстрактов ядер клеток HeLa и РС12. Таким образом, для дальнейшего понимания механизма регуляции транскрипции гена АРР стало необходимым решить задачу идентификации белков, связывающихся с элементами АРВа и АРВр в промоторе данного гена.

1.2. Цели исследования.

Целью исследования являлось: идентифицировать белки, связывающиеся с регуляторными элементами АРВа и АРВр в промоторе гена АРР, выяснить особенности взаимодействия данных белков с промотором.

В связи с этим перед нами встали следующие задачи:

1. Проверить ранее опубликованные данные о связывании белков USF /Bram & Kornberg, 1987/ и APLP2 /Vidal et al., 1992/ с CDEI последовательностью ДНК, сходной с АРВа элементом промотора гена АРР. Выяснить, связываются ли эти белки с АРВа элементом.

2. Выделить белок, связывающийся с АРВр элементом промотора гена АРР. Степень очистки выделенного белка должна позволить идентифицировать белок-кандидат микросеквенированием. Проверить, действительно ли данный белок связывается с АРВр элементом промотора гена АРР.

3. Выяснить, как в процессе дифференцировки изменяется в ядрах нейронов гиппокампа крысы количество белков, связывающихся с

АРВа и АРВр элементами промотора гена АРР.

4. Получить препаративные количества белка, связывающегося с АРВр элементом промотора гена АРР.

5. Выяснить, какие элементы ДНК-связывающего домена белка, узнающего АРВр сайт, взаимодействуют с 12-нуклеотидным ядром сайта и являются необходимыми для связывания белка с сайтом. Выяснить, какую роль в связывании играет взаимодействие белка с периферическими последовательностями сайта.

6. Определить, какой участок молекулы белка, связывающегося с АРВр элементом промотора гена АРР, отвечает за активацию транскрипции.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Востров, Александр Аркадьевич

6. Выводы.

1. Методами сдвига электрофоретической мобильности (ретардации), конкурентного связывания белков с ДНК, а также иммуноретардации с использованием антител против белка USF43 установлено, что транскрипционный фактор USF связывается с АРВа последовательностью в промоторе гена АРР.

2. Очищенный белок, связывающийся с АРВр последовательностью в промоторе гена АРР, идентифицирован, как ядерный фактор CTCF. Факт связывания CTCF с АРВр элементом подтвержден методом конкурентного связывания белков с ДНК, а также комбинацией сдвига уэлектрофоретической мобильности q Вестерн блоттингом.

3. Разработана процедура препаративной очистки рекомбинантного белка CTCF из дрожжей Pichia Pastoris, включающая в себя катион-обменную хроматографию на SP-сефарозе, аффинную хроматографию на Ni-сефарозе и хроматографию на гепарин-сефарозе.

4. Методами сдвига электрофоретической мобильности, конкурентного связывания белков с ДНК, а также иммуноретардации показано что белки USF и CTCF связываются с элементами АРВа и АРВр промотора гена АРР в ядрах дифференцирующихся нейронов гиппокампа крысы. Количественная оценка комплексов ядерных белков USF и CTCF с радиоактивно меченными олигонуклеотидами методом сдвига электрофоретической мобильности показала, что в процессе дифференцировки нейронов количество CTCF в клетках возрастает у pUr -/ s,— примерно в 5 раз, а количество USF - примерно в 2 раза. Результаты экспериментов по конкурентному связыванию CTCF с делеционными вариантами промотора гена АРР в совокупности с полученными ранее данными опытов по транзиентной трансфекции свидетельствуют о том, что количество CTCF в данных клетках является фактором, лимитирующим активность промотора гена АРР.

5. Методом сдвига электрофоретической мобильности с использованием вариантов белка CTCF, несущих индивидуальные делеции цинковых пальцев, а также методом футпринтинга ДНК-азой I, показано, что во взаимодействии CTCF с АРВр промоторным сайтом ДНК принимают участие цинковые пальцы с №1 по №9. При этом критическим является взаимодействие цинковых пальцев №5, №6 и №7 с последовательностью промотора, расположенной мехзду нуклеотидами в позиции -94 и в позиции -83. Исследование кинетики диссоциации комплексов CTCF с АРВр элементом ДНК позволило утвериодать, что периферические цинковые пальцы усиливают связывание CTCF с элементом.

6. Методом транскрипции in vitro с использованием экстракта ядер клеток HeLa, истощённого антителами против CTCF, получены прямые доказательства того, что, в контексте промотора гена АРР, CTCF является активатором транскрипции. Путём восстановления специфической транскрипционной активности истощённого ядерного экстракта добавлением делеционных вариантов рекомбинантного белка CTCF показано, что в осуществлении транскрипционной активации принимает участие N-концевая часть белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Востров, Александр Аркадьевич, Санкт-Петербург

1. Гольдгабер Д.Я. Молекулярные основы болезни Альцгеймера. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Москва, 2003.

2. Bahmanyar S, Higgins GA, Goldgaber D, Lewis DA, Morrison JH, Wilson MC, Shankar SK, Gajdusek DC. (1987) Localization of amyloid beta protein messenger RNA in brains from patients with Alzheimer's disease. Science. 237, 77-80

3. Bell AC, West AG, Felsenfeld G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98, 387-96

4. Bourbonniere M, Nalbantoglu J. (1996) The helix-loop-helix transcription factor USF interacts with the basal promoter of human amyloid precursor protein. Brain Res Mol Brain Res. 35, 304-8

5. Bram RJ, Kornberg RD. Isolation of a Saccharomyces cerevisiae centromere DNA-binding protein, its human homolog, and its possible role as a transcription factor. Mol Cell Biol. 1987 Jan;7(1):403-9

6. Carthew RW, Chodosh LA, Sharp PA. (1987) The major late transcription factor binds to and activates the mouse metallothionein I promoter. Genes Dev. 1, 973-80.

7. Chernak JM. (1993) Structural features of the 5' upstream regulatory region of the gene encoding rat amyloid precursor protein. Gene. 133, 255-60.

8. Chodosh LA, Carthew RW, Morgan JG, Crabtree GR, Sharp PA. (1987) The adenovirus major late transcription factor activates the rat gamma-fibrinogen promoter. Science. 238, 684-8.

9. Cotman C.W., Cummings В.J., and Pike C.J. (1993) Molecular cascade in adaptive versus pathological plasticity. Neurodegeneration II (Gorio A., ed.), pp. 217-240. Raven Press, New York.

10. Danilition SL, Frederickson RM, Taylor CY, Miyamoto NG. (1991) Transcription factor binding and spacing constraints in the human beta-actin proximal promoter. Nucleic Acids Res. 19, 6913-22.

11. Dawirs RR, Teuchert-Noodt G, Kacza J. (1992) Naturally occurring degrading events in axon terminals of the dentate gyrus and stratum lucidum in the spiny mouse (Acomys cahirinus) during maturation, adulthood and aging. Dev Neurosci. 14, 210-20.

12. Ellis J, Talbot D, Dillon N, Grosveld F. (1993) Synthetic human beta-globin 5'HS2 constructs function as locus control regions only in multicopy transgene concatamers. EMBOJ. 12, 127-34.

13. Glenner, G.G., and Wong, C.W. (1986) Alzheimer's disease: Initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261, 6084-6089

14. Goldgaber, D., Lerman, M.I., McBride, O.W., Saffiotti, U. and Gaidusek, D.C. (1987) Characterization and chromosomal localization of a cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer's disease. Science 235, 877-884

15. Goldgaber D, Harris HW, Hla T, Maciag T, Donnelly RJ, Jacobsen JS, Vitek MP, Gajdusek DC. (1989) Interleukin 1 regulates synthesis of amyloid beta-protein precursor mRNA in human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 7606-10

16. Goate A, Chartier-Harlin MC, Mullan M, Brown J, Crawford F, Fidani L, Giuffra L, Haynes A, Irving N, James L, et al. (1991) Segregation of amissense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349, 704-6.

17. Gregor PD, Sawadogo M, Roeder RG. (1990) The adenovirus major late transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimer. Genes Dev. 4, 1730-1740

18. Gu J, Stephenson CG, ladarola MJ. (1994) Recombinant proteins attached to a nickel-NTA column: use in affinity purification of antibodies. Biotechniques. 17, 257, 260, 262.

19. Hark AT, Schoenherr CJ, Katz DJ, Ingram RS, Levorse JM, Tilghman SM. (2000) CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/lgf2 locus. Nature. 405(6785):486-9.

20. Hoffman PW, Chernak JM. (1994) The rat amyloid precursor protein promoter contains two DNA regulatory elements which influence high level gene expression. Biochem Biophys Res Commun. 201, 610-617

21. Kang, J., Lemaire, H.-G., Unterbeck, A., Salbaum, M.J., Masters, C.L., Grzeschik, K.H., Multhaup G., Beyreuther K., Muller-Hill B. (1987) The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature 325, 733-736.

22. Klenova EM, Fagerlie S, Filippova GN, Kretzner L, Goodwin GH, Loring G,

23. Neiman РЕ, Lobanenkov W. (1998) Characterization of the chicken CTCF genomic locus, and initial study of the cell cycle-regulated promoter of the gene. J Biol Chem. 273, 26571-9.

24. Korhonen P, Huotari V, Soininen H, Salminen A. (1997) Glutamate-induced changes in the DNA-binding complexes of transcription factor YY1 in cultured hippocampal and cerebellar granule cells. Brain Res Mol Brain Res. 52, 3303.

25. Kovacs DM, Wasco W, Witherby J, Felsenstein KM, Brunei F, Roeder RG, Tanzi RE. (1995)The upstream stimulatory factor functionally interacts with the Alzheimer amyloid beta-protein precursor gene. Hum Mol Genet. 4, 152733.

26. La Fauci G, Lahiri DK, Salton SR, Robakis NK. (1989) Characterization of the 5'-end region and the first two exons of the beta-protein precursor gene. Biochem Biophys Res Commun. 159, 297-304.

27. Lee TC, Shi Y, Schwartz RJ. (1992) Displacement of BrdUrd-induced YY1 by serum response factor activates skeletal alpha-actin transcription in embryonic myoblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 9814-8.

28. Lukiw WJ, Rogaev El, Wong L, Vaula G, McLachlan DR, St George Hyslop P. (1994) Protein-DNA interactions in the promoter region of the amyloid precursor protein (APP) gene in human neocortex. Brain Res Mol Brain Res. 22,121-31.

29. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY.

30. Marquez-Sterling NR, Lo AC, Sisodia SS, Koo EH. (1997) Trafficking of cell-surface beta-amyloid precursor protein: evidence that a sorting intermediate participates in synaptic vesicle recycling. J Neurosci. 17,140-51.

31. Masliah E, Fagan AM, Terry RD, DeTeresa R, Mallory M, Gage FH. (1991) Reactive synaptogenesis assessed by synaptophysin immunoreactivity is associated with GAP-43 in the dentate gyrus of the adult rat. Exp Neurol. 113, 131-42.

32. Morimoto T, Ohsawa I, Takamura C, Ishiguro M, Kohsaka S. (1998) Involvement of amyloid precursor protein in functional synapse formation in cultured hippocampal neurons. J Neurosci Res. 51,185-95.

33. Morishima M, lhara Y. (1994) Posttranslational modifications of tau in paired helical filaments. Dementia. 5, 282-8.

34. Murre C, McCaw PS, Baltimore D. (1989) A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, MyoD, and myc proteins. Cell. 56, 777-83.

35. Pollwein P, Masters CL, Beyreuther K. (1992) The expression of the amyloid precursor protein (APP) is regulated by two GC-elements in the promoter. Nucleic Acids Res. 20, 63-68

36. Pollwein P. (1993) Overlapping binding sites of two different transcription factors in the promoter of the human gene for the Alzheimer amyloid precursor protein. Biochem Biophys Res Commun. 190, 637-47.

37. Potter JJ, Cheneval D, Dang CV, Resar LM, Mezey E, Yang VW. (1991) The upstream stimulatory factor binds to and activates the promoter of the rat class I alcohol dehydrogenase gene. J Biol Chem. 266, 15457-63.

38. Quitschke WW, Lin ZY, DePonti-Zilli L, Paterson BM. (1989) The beta actin promoter. High levels of transcription depend upon a CCAAT binding factor. J Biol Chem. 264, 9539-46.

39. Quitschke WW, Goldgaber D. (1992) The amyloid beta-protein precursor promoter. A region essential for transcriptional activity contains a nuclearfactor binding domain. J Biol Chem. 267, 17362-17368

40. Quitschke WW. (1994) Two nuclear factor binding domains activate expression from the human amyloid beta-protein precursor promoter. J Biol Chem. 269, 21229-21233.

41. Quitschke WW, Matthews JP, Kraus RJ, Vostrov AA. (1996) The initiator element and proximal upstream sequences affect transcriptional activity and start site selection in the amyloid beta-protein precursor promoter. J Biol Chem. 271, 22231-9.

42. Quitschke WW, Taheny MJ, Fochtmann LJ, Vostrov AA. (2000) Differential effect of zinc finger deletions on the binding of CTCF to the promoter of the amyloid precursor protein gene. Nucleic Acids Res. 28, 3370-8

43. Selkoe, D.J. (1997) Alzheimer's disease: genotypes, phenotypes, and treatments. Science. 275,630-631.

44. Salbaum JM, Weidemann A, Lemaire HG, Masters CL, Beyreuther K. (1988) The promoter of Alzheimer's disease amyloid A4 precursor gene. EMBO J. 7, 2807-2813

45. Sawadogo M, Roeder RG. (1985) Interaction of a gene-specific transcription factor with the adenovirus major late promoter upstream of the TATA box region. Cell. 43, 165-175

46. Sawadogo M, Van Dyke MW, Gregor PD, Roeder RG. (1988) Multiple forms of the human gene-specific transcription factor USF. I. Complete purification and identification of USF from HeLa cell nuclei J Biol Chem. 263, 1198511993

47. Schwarzman AL, Gregori L, Vitek MP, Lyubski S, Strittmatter WJ, Enghilde JJ, Bhasin R, Silverman J, Weisgraber KH, Coyle PK, et al. (1994)

48. Transthyretin sequesters amyloid beta protein and prevents amyloid formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8368-72.

49. Scotto KW, Kaulen H, Roeder RG. (1989) Positive and negative regulation of the gene for transcription factor IIIA in Xenopus laevis oocytes. Genes Dev. 3, 651-62.

50. Selkoe, D.J. (1997) Alzheimer's disease: genotypes, phenotypes, and treatments.Science. 275,630-631.

51. Sinha S, M^ity SN, Lu J, de Crombrugghe B. (1995) Recombinant rat CBF-C, the third subunit of CBF/NFY, allows formation of a protein-DNA complex with CBF-A and CBF-B and with yeast HAP2 and HAP3. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 1624-8.

52. Sinha S, Maity SN, Seldin MF, de Crombrugghe B. (1996) Chromosomal assignment and tissue expression of CBF-C/NFY-C, the third subunit of the mammalian CCAAT-binding factor. Genomics. 37, 260-3.

53. Sirito M, Walker S, Lin Q, Kozlowski MT, Klein WH, Sawadogo M. (1992) Members of the USF family of helix-loop-helix proteins bind DNA as homo- as well as heterodimers. Gene Expr. 2, 231-240

54. Small DH. (1998) The role of the amyloid protein precursor (APP) in Alzheimer's disease: does the normal function of APP explain the topography of neurodegeneration? Neurochem Res. 23, 795-806.

55. St George-Hyslop PH. (2000) Genetic factors in the genesis of Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci. 924,1-7.

56. Stewart MJ, Dipple KM, Stewart TR, Crabb DW. (1996) The role of nuclear factor NF-Y/CP1 in the transcriptional regulation of the human aldehyde dehydrogenase 2-encoding gene. Gene. 173,155-61.

57. Ulaner GA, Yang Y, Hu JF, Li T, Vu TH, Hoffman AR. (2003) CTCF binding at the insulin-like growth factor-ll (IGF2)/H19 imprinting control region is insufficient to regulate IGF2/H19 expression in human tissues Endocrinology. 144, 4420-6.

58. Vidal F, Blangy A, Rassoulzadegan M, Cuzin F. (1992) A murine sequence-specific DNA binding protein shows extensive local similarities to the amyloid precursor protein. Biochem Biophys Res Commun. 189, 1336-41.

59. Vostrov AA, Quitschke WW, Vidal F, Schwarzman AL, Goldgaber D. (1995) USF binds to the APB alpha sequence in the promoter of the amyloid beta-protein precursor gene. Nucleic Acids Res. 23, 2734-2741.

60. Vostrov AA, Quitschke WW. (1997) The zinc finger protein CTCF binds to the APBbeta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation . J Biol Chem. 272, 33353-9

61. Vostrov AA, Taheny MJ, Quitschke WW. (2002) A region to the N-terminal side of the CTCF zinc finger domain is essential for activating transcriptionfrom the amyloid precursor protein promoter J Biol Chem. 277,1619-27.

62. Yang Y, Quitschke WW, Vostrov AA, Brewer GJ. (1999) CTCF is essential for up-regulating expression from the amyloid precursor protein promoter during differentiation of primary hippocampal neurons. J Neurochem. 73, 2286-2298

63. Выражаю свою искреннюю благодарность всем коллегам, без помощи и участия которых было бы невозможным выполнение этой работы.

64. Выражаю глубочайшую благодарность своему научному руководителю Наталье Дмитриевне Ещенко за огромную помощь в получении результатов и в написании данной работы, а также за терпение и понимание.

65. Благодарю сотрудников кафедры Биохимии СпбГУ за помощь и участие. Спасибо Людмиле Ивановне Тищенко за конструктивную критику, приведшую к значительному улучшению данной работы.

66. Благодарю всех своих коллег, в соавторстве с которыми были получены и опубликованы приведённые в этой диссертации результаты. Хочу упомянуть в их числе Майкла Тахени, Яошинга Янга, Грегори Бревера и Лору Фохтман.