Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Расположение и возможная функциональная роль участков связывания транскрипционного фактора CTCF в локусе 19 хромосомы человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Расположение и возможная функциональная роль участков связывания транскрипционного фактора CTCF в локусе 19 хромосомы человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчин!

На правах рукописи

ВЕТЧИНОВА АННА СЕРГЕЕВНА

'ЧЯЯ

РАСПОЛОЖЕНИЕ II ВОЗМОЖНАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ УЧАСТКОВ СВЯЗЫВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА СТСГ В ЛОКУСЕ 19 ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции генов человека Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Акопов Сергей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится "1\ " апреля 2007 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " \ " марта 2007 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

\

V]

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Стремительный прогресс в молекулярной биологии позволил расшифровать полные последовательности геномов различных организмов. В частности, установлена полная первичная структура генома человека (Lander et al., 2001). Однако, определение одной только нуклеотидной последовательности генома человека не даёт, к сожалению, исчерпывающей информации о расположении генов, их функциональном назначении и регуляции их экспрессии. Для решения этой задачи требуется привлечение знаний из разных областей науки: биоинформатики, генетики, биологии развития, молекулярной биологии, биохимии и т. д.

Достижения в определении первичной структуры и картировании геномов привели к появлению нового направления исследований -функциональной геномики, которая включает в себя главным образом идентификацию, локализацию в геноме и функциональный анализ новых генов. В то же время геном содержит множество нетранскрибируемых функционально активных элементов, обладающих важнейшими регуляторными свойствами и имеющих решающее значение для его нормальной работы. Примерами таких структур могут служить энхансеры, терминаторы транскрипции, участки связывания ДНК с регуляторными белками, участки начала репликации, места интеграции ретроэлементов и т.д. В большинстве случаев подобные структуры невозможно идентифицировать, имея данные только о нуклеотидной последовательности участков ДНК, которые их содержат. Одним из способов их корректной идентификации является соответствующий экспериментальный функциональный подход. Картирование последовательностей с известной функциональной ролью значительно облегчает понимание общей организации и основных принципов регуляции работы генома в целом.

Решение задачи картирования функциональных элементов генома сопряжено со значительными трудностями. Они обусловлены, в первую очередь, чрезвычайным многообразием самих функционально значимых последовательностей, обнаруживаемых в геноме человека, а у

необходимостью применения большого арсенала разнообразных методических приемов, с помощью которых они могут быть выявлены среди множества других последовательностей геномной ДНК.

Известно, что многие белки способны специфически связываться с теми или иными участками ДНК. Связывание ядерных белков с регуляторными последовательностями ДНК является главным механизмом регуляции экспрессии у эукариот (Kadonaga et al., 2004). Для обнаружения взаимодействий ДНК с ядерными белками существует несколько экспериментальных подходов. Метод EMSA, несомненно, является одним из самых широко используемых как для изучения связывания ДНК с индивидуальным белком (Fried and Crothers, 1981), так и с клеточными или ядерными белковыми экстрактами (Strauss and Varshavsky, 1984).

В настоящей работе взаимодействие in vitro транскрипционного фактора CTCF с последовательностями ДНК было использовано для отбора и идентификации фрагментов ДНК, предпочтительно связывающихся с транскрипционным фактором CTCF, в локусе длиной около 1 млн.п.о. между маркерами FXYD5 и СОХ7А1 19 хромосомы человека. Этот локус содержит значительное число известных генов и его нуклеотидная последовательность полностью установлена, что позволило, как картировать все отобранные элементы с большой точностью, так и сделать выводы о взаимном расположении белок-связывающих элементов и генов и их возможной функциональной взаимосвязи.

Данная работа направлена на решение фундаментальной проблемы биологии - картирование регуляторных элементов генома человека и изучение их свойств.

Цели работы.

Целью настоящей работы являлось выявление сайтов связывания транскрипционного фактора CTCF на протяженных участках генома человека. Для решения данной задачи неотъемлемым этапом были разработка и оптимизация метода, позволяющего проводить поиск участков связывания

транскрипционного фактора в протяженных участках ДНК. Метод был применен для выявления сайтов связывания белка СТСТ в локусе РХУВ5-СОХ7А1 19 хромосомы человека.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Среди методов, использующихся для обнаружения ДНК-белковых взаимодействий, метод сдвига электрофоретической подвижности (ЕМБА) является наиболее простым. Кроме того, чувствительность метода очень высока - до 10'18 моль ДНК в случае детекции радиоактивно меченых молекул. Метод ЕМ8А используют как для изучения связывания ДНК с индивидуальным белком, так и с белковым ядерным или клеточным экстрактом. В представленной работе оригинальная модификация метода ЕМБА явилась основой для поиска и идентификации новых участков связывания фактора транскрипции СТСР с участком ДНК длиной 1 млн. п.о., расположенным между маркёрами РХУ.05 и С0Х7А1 19 хромосомы человека. ДНК этой хромосомы имеет размер около 67 млн. п.о.

В нашей лаборатории решается задача получения детальной карты функциональных элементов, расположенных в локусе длиной около 1 млн п.н. 19 хромосомы человека между маркерами К\У05 и С0Х7А1. Этот локус содержит большое число известных генов, а его нуклеотидная последовательность полностью установлена, что позволяет картировать функциональные элементы с большой точностью, а так же судить о взаимном расположении этих элементов и генов и их возможной функциональной взаимосвязи. В этом локусе картированы Б/МАЯ-элементы, инсуляторы, охарактеризован статус метилирования локуса, картированы сайты связывания, а также идентифицированы гены, регулируемые системой белков Мус:Мах:Мас1.

Транскрипционный фактор СТСР играет существенную роль в регуляции транскрипции генов. Картирование, а также функциональный анализ участков связывания этого фактора представляют несомненный интерес и требуют особого внимания. Это позволит приблизиться к созданию функциональной карты генома, а также к пониманию роли взаимодействия белка с той или иной

5

последовательностью. Решение этого вопроса и создание базы данных с последовательностями, связывающимися с CTCF, возможно позволит применить их в генной терапии.

Разработанный и испытанный нами метод позволяет выявлять последовательности, способные связываться с различными ядерными транскрипционными факторами, что чрезвычайно актуально при создании функциональных карт геномов, поскольку в настоящее время не существует иных путей обнаружения участков связывания, кроме прямого анализа специфической активности, который является очень трудоемким при исследовании протяженных последовательностей.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

1. XV Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005)

2. XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов 2006" (Москва, 2006)

3. 1 llh Human Genome Meeting Helsinki Fair Centre (Helsinki, 2006)

4. Международная конференция «Генетика в России и мире» (Москва, 2006).

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 181 ссылку.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Идентификация участков связывания транскрипционного фактора CTCF на 19 хромосоме в локусе FXYD5 - СОХ7А1.

Анализ функциональных элементов на уровне целого генома в связи с его размерами сопряжен с определенными трудностями. Более удобно исследовать отдельные, протяженные сегменты генома. В нашей лаборатории исследуется локус девятнадцатой хромосомы человека длиной один миллион пар нуклеотидов. В нем находятся несколько десятков генов, поэтому локус представляет собой удобную модель для изучения роли различных функциональных элементов в геноме. Примерами таких элементов служат энхансеры, сайленсеры, S/MAR-элементы, инсуляторы, а так же участки связывания белка CTCF.

Белок CTCF - высоко консервативный и полифункциональный транскрипционный фактор, впервые описанный как транскрипционный фактор, регулирующий активность гена с-тус (Lobanenkov et al., 1990). Белок состоит из трех доменов, один из которых содержит 11 цинковых пальцев. Фактор CTCF связывается с промоторами генов myc, Pim-1, PLK, DAF. Связываясь с промоторами генов, CTCF в одних случаях подавляет транскрипцию, в других - активирует ее. Транскрипционный фактор CTCF вовлекается в регуляцию функций энхансеров, инсуляторов, сайленсоров (Bell et al., 1999, Kanduri et al., 2000, Valadez -Graham et al., 2004, Docquier et al., 2005, Moon et al., 2005). Важной особенностью белка CTCF является его способность взаимодействовать с широким набором сайтов-мишеней за счет использования различных комбинаций цинковых пальцев. Участки ДНК, связывающиеся с белком, столь разнообразны и не содержат консенсусных последовательностей, что делает невозможным предсказание участков связывания белка в геноме на основе первичной структуры ДНК.

Для решения проблемы выявления участков связывания CTCF необходима разработка новых подходов, которые позволят обнаружить места посадки белка в геноме. Нами была разработана модификация метода

7

торможения ДНК-белковых комплексов в геле, позволяющая обнаружить и идентифицировать участки связывания транскрипционного фактора CTCF, Для выявления сайтов связывания транскрипционного фактора CTCF в анализируемом локусе нами была получена библиотека коротких фрагментов локуса 19 хромосомы человека с применением мелкощепящих рестриктаз Sau ЗА Csp 6.1. В результате рестрикции был получен набор фрагментов длиной 200-1000 п.о., имеющих липкие концы. Для последующей ПЦР-амшшфикации к полученному набору фрагментов присоединяли синтетические линкеры. Транскрипционный фактор CTCF нарабатывали в препаративных количествах in vitro с помощью бесклеточной системы транскрипции-трансляции. Функциональную активность синтезированного белка проверяли с помощью EMSA и Вестерн блот анализа (рисунок 1).

А Б

Рисунок 1.

А - Функциональный анализ транскрипционного фактора CTCF, синтезирован ноге и системе in vitro с помощью метода EMS А. I - меченный фрагмент промотора гена с-тус. 2-отсутствие связывания при добавлении тоциферазы, синтезированной в системе in vitro. 3 - образование комплекса при добавлении белка CTCF, синтезированного in vitro.

Б - Функциональный анализ транскрипционного фактора CTCF, синтезированного в системе in vitro, с помощью Вестерн блот анализа. Люцифераза и CTCF были синтезированы в системе in vitro Белок СТС из клеточной линии HeLa имеет молекулярный вес 160 кДа (Klenova et.al, 1997)

Селекцию фрагментов проводили в два раунда с применением двумерного электрофореза ДНК-белковых комплексов. Радиоактивно меченую библиотеку коротких фрагментов 19 хромосомы связывали с синтезированным транскрипционным фактором СТСР и наносили на гель в неденатурирующих

8

условиях. После разделения в первом направлении полосы геля, содержащие комплексы ДНК-белок и не связавшиеся фрагменты локуса, были вырезаны и нанесены на гель второго направления. Разделение проводили в по лиакр идами дном геле той же концентрации, что и в первом направлении, но в денатурирующих условиях с добавлением 508 для отделения связавшихся фрагментов ДНК от белка.

Космккнаи ДНК псргкрыкчгощча .юкус 19 кр4>|НС*ймы ■■ I".k: между MapKfjiaMH

FXYDS СОХ7А1

у PafiueiL-iCHne t iKMquibH} ргстрнчтй! Sau3A t.'S[)6-l

Ji - iiii"" i " ii V

о-

Первое направление* EMSA

-меченне библиотеки помощью ПЦР

In vitro синтез транскрипционного фактора CTCF

Инк^баиив меченой библиотеки с белком CTCF. нанесен не на полиакрмлдмиднын i ель

Фрагменты ДНК, связывающиеся с CTCF

Фрагменты ДНК, связывающиеся с белком CTCF

Выделение hi геляллюния +

ГЩР-амилнфм кацмя, клон нрование, секвелн ро&йнис^картирование

Рисунок 2, Схема метода двумерного EMSA, позволяющего выявить последовательности, с пособи связываться с транскрипционным фактором CTCF in vitro.

На рисунке 2 представлен радиоавтограф двумерного электрофореза после второго раунда селекции. Верхняя диагональ с наклоном, приблизительно, в сорок пять градусов, формируют фрагменты, не связавшиеся с белком, так как торможение этих фрагментов и в первом и во втором направлениях было одинаково. Фрагменты нижней диагонали, обозначенные точками, тормозились в первом направлении сильнее, чем во втором, вследствие их взаимодействия с белком. Эта диагональ отсутствует на радиоавтографе двумерного электрофореза с мечеными фрагментами библиотеки без белка CTCF (данные не приведены). После двух раундов отбора, фрагменты нижней диагонали были элюированы из геля, амплифицированы и лигированы в вектор pGEM-T, которым трансформировали компетентные клетки Е. coli. Для отбора клонов, содержащих плазмиду со вставкой, применяли бело-голубую селекцию. Для этого клетки высевали на чашки Петри с LB средой, ампициллином, X-gal и IPTG. 84 отобранные белые колонии были ранжированы в один 96-луночный планшет и проверены с помощью ПЦР на наличие и размер вставки без выделения плазмидной ДНК с использованием библиотечного праймера.

Из проанализированных 84 колоний - 13 колоний содержали по 2 вставки, 7 колоний не содержали вставки. В результате секвенирования в 21 колонии библиотеки выявлены в качестве вставок повторяющиеся элементы генома и, поэтому, локализовать эти фрагменты в геноме не представляется возможным. Оставшиеся 33 колонии содержали интересующие нас вставки, последовательности которых гомологичны участкам ДНК в исследуемом локусе. При сравнении полученных последовательностей между собой были обнаружены идентичные фрагменты, поэтому, в итоге из 33 фрагментов мы обнаружили 10 уникальных участков ДНК, к которым были подобраны специфичные для каждой последовательности пары праймеров.

Функциональный анализ, выявленных участков ДНК, способных связываться с транскрипционным фактром CTCF.

На первом этапе методом EMS А мы проверили способность 10 отобранных последовательностей связываться с транскрипционным фактором

10

CTCF in vitro. После того, как было подтверждено, что белки ядерного экстракта из культуры клеток линии HeLa взаимодействуют с идентифицированными фрагментами ДНК, необходимо было проверить, что они образуют комплекс именно с белковым фактором CTCF. Для проверки использовали метод дополнительного сдвига эле ктрофо р ети ческой подвижности в геле за счет взаимодействия комплекса ДНК-белок с антителами к CTCF. Добавление в реакцию антител к CTCF приводило к существенному ослаблению полосы, соответствующей комплексу белок-ДНК. Отсутствие полосы, соответствующей комплексу белок-ДНК-антитело, может объясняться либо слишком большой молекулярной массой этого комплекса, не позволяющей ему проникать в гель, либо тем, что антитела, связываясь с ДНК-узнающей областью белка CTCF, разрушают ДНК-белковый комплекс (рисунок 3). Подобная картина комплекса CTCF-ДНК при добавлении антител наблюдалась ранее (FiUppova et al, 2001).

6 4 7 I-1 r--—11-1

H«U NE + + 1 - + + - + +

1 unli-TTCF - - +J- -- + +

Рисунок 3. ЕЭМА и метод дополнительного сдвига электрофоретической подвижности для фрагментов, связывающихся с белком СТСР, выявленных с помощью двухмерного ЕМ8А (таблица 2). Ап^-СТСТ - ¡юликлопальные антитела к транскрипционному фактору СТСГ. Стрелками указано образование комплекса ДНК-СТСТ

Для проверки связывания фактора CTCF с обнаруженными фрагментами in vivo использовали метод хроматин-иммунопреципитации с применением специфических антител к CTCF. Для выявления связывающихся с CTCF фрагментов ДНК этим методом, нами была выбрана клеточная линия HeLa, так как эта клеточная линия характеризуется достаточно высоким уровнем экспрессии CTCF (Docquier et.al., 2005). Предварительно были отработаны условия обработки клеток ультразвуком для получения фрагментов ДНК от 200-1000 нуклеотидов.

Для выделения фрагментов ДНК, взаимодействующих с фактором CTCF в клетке и сшитых формальдегидом, использовали специфические поликлональные антитела к фактору CTCF. В качестве контроля проводили «преципитацию» ДНК-белковых комплексов неспецифическими антителами, полученными к растительному белку тауматину. Анализ выделенной ДНК проводили ПЦР-амплификацией, используя специфические пары праймеров для каждой обнаруженной нами последовательности (таблица 1). В результате амплификации обнаружены все 10 фрагментов (панель - a-CTCF на рисунке 4 А).

При использовании неспецифических антител для иммунопреципитации хроматина, амплификации фрагментов не наблюдалось, это говорит об отсутствии исследуемых фрагментов в реакционной смеси (панель -неспецифические антитела). Панель «input chromatin» представляет результат амплификации фрагментированной геномной ДНК, выделенной из тех же самых клеток без использования каких-либо антител. В этом случае, в выделенной фрагментированной геномной ДНК содержатся все обнаруженные нами фрагменты.

На рисунке 4 Б изображен результат амплификации фрагментов, выбранных нами в качестве положительного и отрицательного контролен. Положительным контролем был выбран фрагмент промотора гена с-тус, содержащий сайт связывания белка CTCF (Fillippova et.al., 1996). В качестве отрицательного контроля был выбран фрагмент кодирующей части гена Р-актина, не содержащий участков связывания фактора CTCF. В этом случае

12

амплификации фрагмента р-актина не наблюдается (рис.4 Б). По результатам ПЦР-анализа иммунопреципитированной ДНК мож[ю сделать заключение, что все десять обнаруженных фрагментов связываются с транскрипционным фактором CTCF ir) vivo в клетках линии HeLa.

фрагменты, связывающиеся с CTCF 234567X9 10

а1гг*ттсла к

бсЯКу растений

«í (> t & I h \ а

с-тус ¡j-актин

Рисунок 4, ПЦР-анализ ДНК, выделенной методом хроматин-иммуиопренииитации с использованием антител к белку СТСР. (Л) Цифры указывают номер идентифицированной последовательности (табл. 1), амплйфицируемоЙ со специфической парой праймероп, (Б) Положительный (фрагмент с-тус ггромотора) и отрицательный (фрагмент кодирующей области гена Р-актииа) ко I про л и амгошфицированные с ДНК, выделенной с использованием антител к СТО' (а-СТСР),

Анализ расположения фрагментов, связывающихся с CTCF, в л о кусе FXYD5-COX7AI 19 хромосомы человека.

Все десять, обнаруженных нами, фрагментов были нанесены на карту

локуса FXYD5-COX7AI 19 хромосомы человека (таблица 2), Схема

расположения фрагментов относительно всех известных генов в локусе

приведена на рисунке 6. Семь идентифицированных последовательностей

локализованы внутри генов, три в межгенных областях локуса. В основном,

участки связывания CTCF расположены в нитронах (в некоторых случаях

частично перекрываются с небольшими экзонами) генов GAPDS

(глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, специфичная для яичек), WDR62, и

MGC10433, кодирующих гипотетические белки с неустановленной функцией;

MAG (гликопротеин, ассоциированный с миелином); и CD22 (нзоформа В-

13

клеточного рецептора), а также в З'-нетранслируемой области гена АТР4А (каталитическая а-субъединица Н+/К+-АТФазы, ответственная за поддержание определенной кислотности в желудке). Все указанные гены, за исключением MGC10433, характеризуются различной тканеспецифической экспрессией.

Известно, что CTCF связывается с последовательностями, обладающими функциями инсуляторов (Bell et al., 1999; Antes et al., 2001). Вероятно, некоторые из найденных участков (в основном фрагменты, локализованные в межгенных участках) могут выполнять функции инсуляторных элементов, разграничивая функционально-независимые домены хроматина. Нами были определены три гена, фланкированные с каждой стороны сайтами связывания CTCF, которые могут выполнять роль пограничных элементов: ген, кодирующий а-субъединицу Н+/К+ - АТФазы, ограниченный фрагментами 2 и 8; ген MAG (myelin-associated glycoprotein), кодирующий гликопротеин, ассоциированный с миелином, фланкированный фрагментами 4 и 5, и ген NIFIE14, кодирующий белок, содержащий семь трансмембранных доменов, ограниченный фрагментами 1 и 8 (рисунок 6). По крайней мере, два из указанных генов характеризуются различной тканеспецифической экспрессией, отличающейся от экспрессии окружающих их генов. Ген АТР4А экспрессируется преимущественно в слизистой желудка и поджелудочной железе (Oshiman et al., 1991), а ген MAG экспрессируется преимущественно в нервных тканях (Konat et al., 1996). Можно предположить, что фрагменты, фланкирующие эти гены, способны выполнять роль инсуляторов, образующих петлевые домены хроматина со сходным уровнем экспрессии входящих в них генов.

Локус FXYD5-COX7A1 также содержит кластер из четырех генов, кодирующих рецепторы, сопряженные с G-белками: GPR40, GPR41, GPR42 и GPR43. Ранее было обнаружено, что гены GPR41 и GPR43 имеют различные профили экспрессии, и предполагалось, что GPR42 представляет неактивный ген GPR41 (Brown et al., 2003). Обнаруженный нами фрагмент 9, расположенный между генами GPR42 и GPR43, потенциально способен обеспечивать независимую экспрессию генов GPR42 и GPR43.

14

Две обнаруженные нами последовательности, связывающиеся с белком CTCF, содержат фрагменты повторяющихся элементов, схожих с Alu-элементами и способных к транспозициям. В литературе нет данных о расположении сайтов связывания CTCF в мобильных элементах генома, однако, у некоторых Alu-элементов обнаружены свойства инсуляторов (Willoughby et al., 2000).

Функциональный анализ последовательностей, обладающих инсуляторной

активностью.

Ранее в нашей лаборатории был разработан метод позитивно-негативной селекции, с помощью которого были идентифицированы восемь последовательностей инсуляторов.

CTCF является единственным инсуляторным белком позвоночных (Bell et al., 1999). Тем не менее, существуют инсуляторы, для функционирования которых связывание с CTCF не является обязательным условием. По всей видимости, инсуляторы позвоночных можно разделить на две группы: CTCF-зависимые и CTCF-независимые (Magdinier et al., 2004). Обнаружены участки ДНК, которые не содержат сайтов связывания с белком CTCF, но характеризуются при этом сильной энхансер-блокирующей активностью.

С помощью метода EMSA мы проверили способность выявленных ранее инсуляторных последовательностей связываться с транскрипционным фактором CTCF in vitro. Для этого 8 фрагментов были наработаны и помечены с помощью ПЦР. Далее их инкубировали с ядерным экстрактом клеточной линии HeLa, после чего образовавшиеся комплексы были разделены в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. Было показано, что все восемь последовательностей инсуляторов способны связываться с разной эффективностью с белками ядерного экстракта, образуя одну или несколько полос торможения комплекса ДНК-белок на радиоавтографе.

С помощью метода иммунопреципитации хроматина мы исследовали способность 8 последовательностей инсуляторов связываться с белком CTCF in vivo. Для всех последовательностей были подобраны специфические пары праймеров за исключением № 8, вследствие того, что внутри этой

15

последовательности располагается протяженный повторяющийся элемент Alu. Иммунопреципитацию и анализ ДНК с помощью ПЦР проводили в условиях, отработанных для связывания с CTCF in vivo 10 CTCF-связывающих сайтов. Все 7 последовательностей амплифицировались с помощью специфических пар праймеров на матрице, полученной в результате обработки ультразвуком ДНК клеточной линии HeLa, сшитой с ядерными белками и преципитированной антителами к белку CTCF (рис. 5 А). При добавлении неспецифических антител к растительному белку тауматину, как и ожидалось, амплификации со специфическими праймерами не наблюдалось. В качестве положительного контроля с ДНК, выделенной при использовании антител к CTCF, амплифицировали фрагмент промотора гена с-тус длинной 150 п.н., связывающийся с CTCF (Filippova et al., 1996). Как видно на рисунке 5 Б, амплифицируется продукт нужной длины, в то же время, амплификации фрагмента, кодирующей части гена ß-актина (отрицательный контроль) не наблюдается (рис. 5 Б). Согласно полученным результатам, можно сделать заключение, что все 7 обнаруженных инсуляторов связываются с транскрипционным фактором CTCF с различной эффективность in vivo в клетках линии HeLa.

А

Рисунок 5. ПЦР-анализ ДНК, выделенной методом хроматин-иммунопреципитации с использованием антител к белку CTCF. (А) Цифры указывают номер идентифицированной последовательности, амплифицируемой со специфической парой праймеров. (Б) Положительный (фрагмент с-тус промотора) и отрицательный (фрагмент кодирующей области гена ß-акгина) контроля, амплифицированные с ДНК, выделенной с использованием антител к CTCF (a-CTCF).

Input chromatin a-CTCF

Неспецифические антитела

c-myc ß-actin

Выявленные нами десять сайтов связывания транскрипционного фактора CTCF и обнаруженные ранее последовательности инсуляторов не совпадают по координатам. Близко расположены участки связывания белка CTCF и последовательности инсуляторов между генами GPR42 и GPR43, а также на границах функционального домена гена АТР4А.

Следует отметить, что выявленные ранее последовательности инсуляторов, способные связывать транскрипционный фактор CTCF in vivo, не были обнаружены среди тех фрагментов, что были выявлены с помощью двумерного метода EMSA. Все исследованные последовательности (ранее выявленные инсуляторы и участки связывания CTCF) связываются с транскрипционным фактором CTCF с разной эффективностью. Мы проводили два раунда селекции для отбора фрагментов 19 хромосомы, связывающихся с транскрипционным фактором. Вероятно, в первом раунде были элиминированы последовательности, к которым родство CTCF in vitro невелико.

В дальнейшем при создании библиотеки, обогащенной фрагментами, связывающимися с белком CTCF, нами было получено 64 клона, содержащих вставки, соответствующие участкам 19 хромосомы. При анализе нукпеотидной последовательности этих клонов большая часть содержала повторяющиеся элементы, принадлежащие 19 хромосоме, однако, при картировании возникали некоторые трудности, и не все последовательности удалось расположить на карте.

В данной работе нами проведен поиск и анализ последовательностей 19 хромосомы человека, способных связываться с транскрипционным фактором CTCF, а также впервые построена карта расположения этих участков в исследуемом локусе.

Информация о расположении сайтов CTCF может помочь выявить инсуляторные элементы, обладающие энхансер-блокирующей функцией, а так же определить возможные границы функциональных доменов хроматина внутри локуса. Кроме того, создание полной функциональной карты генома, содержащей участки связывания фактора CTCF, позволит приблизиться к пониманию роли взаимодействия белка с той или иной последовательностью.

17

Решение этого вопроса и создание базы данных с информацией о сайтах связывания СТСТ, возможно, позволит применить эти последовательности в различных векторных конструкциях для модуляции активностей различных генов и их регуляторных элементов, используемых в генной терапии.

Таблица 1. Структура праймеров для ПЦР- амплификации для фрагментов 19 хромосомы, связывающихся с СЮТ

Обозначение фрагмента Положение на хромосоме 191 Последовательность пар праймеров 5'—>3'

1 40,727,41940,727,843 GTTTGTGACCTGTGCCCTTT GAGGCCCCGACTCTTAACTC

2 40,814,60340,814,912 ACCGAGATTATACCAGAATTTTACATC AGGTCCCTTCTCTCCCTGCT

3 40,478,13040,478,310 AATGATATTCCTCACGGCACT ACCCACCTCCAACCTGCT

4 40,475,30040,475,714 CGACTGAGGCTTACAGAGGAA CAGGCTGCAATCTGGGAGGT

5 40,496,56140,496,812 GCAAAAACCAGCATGAGGA GCTTTCTGACCCGCCTTT

6 40,511,82040,512,662 ATAGAGAAGCAGGGGGTGTG TGCTGTTCCGTAATAACTTGCT

7 40,732,82740,733,075 CACTAATGAGAGACGCTGAGGA GCTTCTGGAGGGTGTTTCTG

8 40,731,38840,731,652 CCTTGACTTTGATGTAGAAAGGAA CACCGTCCTCTGCCAACT

9 40,558,34040,558,845 AAGGCACTGGCATCCTGTCT CGTGACCAGAAACCTTTGGA

10 41,286,72841,287,176 CCCTCCTCTGTCCCTCCTAA GTACAGCCCTGGAGCAAGGAC

туе GGGATCGCGCTGAGTATAAA GGATCTCCCTTCCCAGGAC

р-актин GAGCGGGAAATCGTGCGTGACATT GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG

1 в соответствии с базой данных Human Genome Browser, май 2004

to о

Genbank а Длина (П.Н.) Координаты в локусе Повторяющиеся элементы6 Положение относительно генов локуса

1 AD000090 425 40,727,41940.727.843 Интроны-9-10 и экзон 10 гена GAPDS

2 АС002115 310 40,814,60340.814.912 Интрон-4 гена MGC10433

3 АС002132 181 40,478,13040.478.310 Интрон-3 и экзон 3 гена MAG

4 АС002132 415 40,475,30040.475.714 FLAM-C (212-342) Интрон-1 гена MAG

5 АС002132 252 40,496,56140.496.812 Межгенный участок вблизи З'-конца гена МАО

6 U62631 841 40,511,82040.512.662 Интрон-1 и экзон 1генаС022

7 AD000090 249 40,732,82740.733.075 З'-нетранслируемая область гена АТР4А

8 AD000090 265 40,731,38840.7.31.652 - Межгенная область

9 АС002511 506 40,558,34040.558.845 AluJb (1-201) Межгенная область

10 АС004144 449 41,286,72841.287.176 Интрон-30 гена WDR62

Таблица 2. Связывающиеся с СТСТ последовательности, обнаруженные в локусе 19 хромосомы человека между маркерами РХУ05-С0Х7А1, и их расположение относительно известных генов.а — Коды доступа в ОепВапк соответствующих космид; б-указаны повторяющиеся элементы генома, перекрывающиеся с исследуемыми фрагментами.

7

2

3 s

Ь О u и

Тысячи пар оснований

200 300 400

Тысячи пар с

Рисунок 6. Карта локуса 19ql3.1 19 хромосомы человека между маркерами FXYD5-COX7A1. Горизонтальные стрелки соответствуют известным генам. Вертикальные стрелки обозначают положение идентифицированных нами последовательностей, связывающихся с белком CTCF.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. С помощью разработанного нами метода двумерного EMSA была получена библиотека фрагментов 19 хромосомы человека локуса FXYD5-COX7A1 длиной 1 млн.п.о., способных связываться с транскрипционным фактором CTCF.

2. В результате анализа библиотеки выявлены и картированы десять участков связывания CTCF в локусе 19 хромосомы человека.

3. Произведен анализ расположения картированных последовательностей относительно генов локуса FXYD5-COX7A1. Показано, что семь из десяти последовательностей расположены внутри генов (преимущественно в интронах), три расположены в межгенных участках локуса.

4. Методом иммунопреципитации хроматина доказано специфическое связывание всех десяти картированных последовательностей с транскрипционным фактором CTCF in vivo.

5. Показано, что обнаруженные ранее семь последовательностей, обладающих инсуляторной активностью, способны связываться с транскрипционным фактором CTCF in vivo.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Sergey В. Akopov, Vera M. Ruda, Vera V. Batrak. Anna S. Vetchinova. Igor P. Chernov, Lev G. "Nikolaev, Jürgen Bode and Eugene D. Sverdlov. Identification, genome mapping and CTCF binding of potential insulators within the FXYD5-COX7A1 locus of human chromosome 19ql3.12 (Mamm Genome. 2006 Oct; 17(10): 1042-9).

2. Anna S. Vetchinova. Sergey B. Akopov, Igor P. Chernov, Lev G. Nikolaev, Eugene D. Sverdlov. Two-dimensional EMSA. Identification and mapping of transcriptional factor CTCF target sequences within FXYD5-COX7A1 region of human chromosome 19 (Anal Biochem. 2006 Jul l;354(l):85-93).

3. Ветчинова A.C.. Акопов С.Б., Николаев Л.Г., Свердлов Е.Д.

Идентификация и картирование участков связывания транскрипционного

фактора CTCF на хромосоме 19 человека между маркерами FXYD5 и СОХ7А1.

Материалы конференции «Генетика в России и мире», Москва, 28.06-2.07, 2006,

(тезисы докладов стр. 31).

4. L. Nikolaev, S. Akopov, V. Ruda, V. Batrak, A. Vetchinova. I. Chernov, J.Bode and E. Sverdlov. Identification, genome mapping and CTCF binding of potential insulators within the FXYD5-COX7A1 locus of human chromosome 19ql3.12. HUGO'S 11th Human Genome Meeting Helsinki Fair Centre, Helsinki, Finland 31.05-03.06,2006, (Abstract book, p.80)

5. Дидыч Д.А. Ветчинова A.C. Идентификация и картирование участков связывания транскрипционного фактора CTCF на 19 хромосоме человека между маркёрами FXYD5-COX7A/.XII Меджународная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006». Москва 1215.04,2006 (тезисы докладов стр.74)

6. Ветчинова A.C.. Акопов С.Б., Николаев Л.Г., Свердлов Е.Д Идентификация и картирование участков связывания транскрипционного фактора CTCF на 19 хромосоме человека между маркёрами FXYD5-COX7A1 XV

Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». Санкт-Петербург 18.10-20.10,2005 (журнал «Цитология» том 47, стр. 801)

Принято к исполнению 22/02/2007 Исполнено 26/02/2007

Заказ № 135 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ветчинова, Анна Сергеевна

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Транскрипционные факторы, содержащие домен цинковых пальцев

2.2. CTCF - представитель многофункциональных белков, содержащих мотивы цинковых пальцев

2.3 Структурные особенности

2.4 Полифункциональность белка CTCF и регуляция его активности

2.5 Функции транскрипционного фактора CTCF

2.5.1 Регуляция транскрипции

2.5.2 Взаимодействие CTCF с последовательностями инсуляторов

2.5.3 Контроль импринтинга генетической информации

2.6 Boris

2.7 CTCF и развитие болезней 37 2.8 Методы исследования ДНК-белковых взаимодействий

2.9 Сдвиг электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле

2.10 Метод иммунопреципитации хроматина

2.11 ДНК-белковые кросс-сшивки (DNA-protein crosslinking assay, DPC)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Расположение и возможная функциональная роль участков связывания транскрипционного фактора CTCF в локусе 19 хромосомы человека"

Стремительный прогресс в молекулярной биологии позволил расшифровать полные последовательности геномов многих организмов позвоночных (Lander et.al., 2001). В частности, была установлена полная первичная структура человеческого генома и определено положение в геноме человека большей части генов. Однако, установить функции генов на основании их первичной структуры возможно далеко не всегда. Для решения этой задачи требуется привлечение знаний из разных областей науки: биоинформатики, генетики, биологии развития, молекулярной биологии, биохимии и т. д. Достижения в определении первичной структуры и картировании геномов привели к появлению нового направления исследований - функциональной геномики, которая включает в себя главным образом идентификацию, локализацию в геноме и функциональный анализ новых генов.

В то же время геном содержит множество нетранскрибируемых функционально активных элементов, обладающих важнейшими регуляторными свойствами и имеющими решающее значение для его нормальной работы. Примерами таких элементов могут служить энхансеры, терминаторы транскрипции, участки связывания ДНК с регуляторными белками, участки начала репликации, места интеграции ретроэлементов и т.д. В большинстве случаев подобные структуры невозможно идентифицировать, имея данные только о нуклеотидной последовательности участков ДНК, которые их содержат. Одним из способов их корректной идентификации является соответствующий экспериментальный, функциональный подход. Картирование последовательностей с известной функциональной ролью значительно облегчает понимание общей организации и основных принципов регуляции работы генома как целого.

Известно, что многие белки способны специфически связываться с теми или иными участками ДНК. Связывание ядерных белков с регуляторными последовательностями ДНК является главным механизмом регуляции экспрессии у эукариот. Среди белков, вовлечённых в экспрессию эукариотических генов, существуют многофункциональные белки, действующие на разных этапах экспрессии генов: при инициации и элонгации транскрипции, трансляции.

Цели и задачи работы

Целью диссертационной работы является идентификация сайтов связывания транскрипционного фактора CTCF в локусе 19 хромосомы человека, длиной около 1 млн.п.н., находящегося между маркерами FXYD5 и Сох7А1. Этот локус содержит значительное число известных генов и его нуклеотидная последовательность полностью установлена, что позволит, как картировать все отобранные элементы с большой точностью, так и сделать выводы о взаимном расположении белок-связывающих элементов и генов и их возможной функциональной взаимосвязи.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- выявить с помощью метода сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) участки связывания белка CTCF в локусе 19 хромосомы человека между маркёрами FXYD5 и Сох7А1;

- клонировать и секвенировать участки ДНК, связывающиеся с белком CTCF;

- выявить фрагменты ДНК, связывающиеся с белком CTCF in vivo с использованием метода иммунопреципитации хроматина (ChlP-assay), и сравнить их с выделенными в системе in vitro;

- построить карту распределения сайтов связывания CTCF в локусе 19 хромосомы человека между маркёрами FXYD5 и Сох7А1.

2.0бзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ветчинова, Анна Сергеевна

Выводы

1. С помощью разработанного нами метода двумерного EMSA была получена библиотека фрагментов 19 хромосомы человека локуса FXYD5-COX7A1 длиной один миллион пар оснований, способных связываться с транскрипционным фактором CTCF.

2. В результате анализа библиотеки, выявлены и картированы десять участков связывания CTCF в локусе 19 хромосомы человека.

3. Произведен анализ расположения картированных последовательностей относительно генов локуса FXYD5-COX7A1.Показано, что семь из десяти последовательностей расположены внутри генов (преимущественно в интронах), три расположены в межгенных участках локуса.

4. Методом иммунопреципитации хроматина доказано специфическое связывание всех десяти картированных последовательностей с транскрипционным фактором CTCF in vivo.

5. Показано, что обнаруженные ранее семь последовательностей, обладающих инсуляторной активностью, способны связываться с транскрипционным фактором CTCF in vivo.

Я хочу выразить самую искреннюю признательность своему научному руководителю к.б.н. Сергей Борисовичу Акопову за советы, поддержку и помощь на каждом этапе работы.

Выражаю глубокую благодарность заведущему Лабораторией Структуры и Функций Генов Человека академику Евгению Давидовичу Свердлову, заместителю заведующего лабораторией Галине Сергеевне Монастырской, Льву Григорьевичу Николаеву, а также прекрасному коллективу лаборатории за дружеское и внимательное отношение. Без их советов и дружеского участия в работе ее выполнение было бы невозможно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ветчинова, Анна Сергеевна, Москва

1. "Анализ генома. Методы". Сборник под ред. Дейвис, К., Бантинг, Г., Кантор, Ч., Коллинз Ф. и др. Пер. с англ. под ред. П.Л.Иванова. М.: Мир, 1990,247с.

2. Патрушев Л.И. «Экспрессия генов». Москва, Наука, 2000, 830 стр.

3. Adams D. van der Weyden L., Kovacic. A., Lovicu F., Copeland N., Gillbert D., Jenkins N., Ioannou P., Morris В., (2000). Chromosome localization and characterization of the mouse and human zinc finger protein 265 gene. Cytogenet. Cell. Genet., 88, 68-73

4. Ansari, S. A., Safak, M., Gallia, G. L., Sawaya, В. E., Amini, S., and Khalili, K.(1999). Interaction of YB-1 with human immunodeficiency virus type 1 Tat and TAR RNA modulates viral promoter activity. J. Gen. Virol. 80,2629-2638

5. Antes, T.J., Namciu, S.J., Fournier, R.E. and Levy-Wilson, B. (2001). The 5' boundary of the human apolipoprotein В chromatin domain in intestinal cells. Biochemistry 40(23), 6731-6742

6. Antonio L. Amelio, Peterjon K. McAnany, and David C. Bloom(2006). Virus Type 1 Latency-Associated Transcript Region Binds CCCTC-Binding Factor and Displays Enhancer-Blocking and Silencing Activities. J. Virol., 80, 2358-2368

7. Arnold, R. Burcin, M. Kaiser, B. Muller, M. Renkawitz, R. (1996). DNA bending by the silencer protein NePl is modulated by TR and RXR. Nucleic Acids Res. Jul 15; 24(14): 2640-2647

8. Baniahmad A., Steiner C., Kohne A.C., Renkawitz R. (1990). Modular structure of a chicken lysozyme silencer: involvement of an unusual thyroid hormone receptor binding site. Cell, 61,505-514

9. Bell A.C. and Felsenfeld (1999). Stopped at the border: boundaries and insulators. Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 191-198

10. Bell A.C. and Felsenfeld G.(2000). Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature, 405, 482-485

11. Bi X. and Broach J.(2001). Chromosomal boundaries in S.cerevisiae. Curr.Opin.Genet.Dev., 11,199-204

12. Bigler, J. Eisenman, R.N. (1995) "Novel location and function of a thyroid hormone response element". EMBO J. Nov 15; 14(22): 5710-23

13. Blackwood E., Kadonaga J. (1998). Going the distance: a current view of enhanser action. Science 281, 60-63

14. Buck M. and Lieb J. (2004). Chip-chip: considerations for the design, analysisand aplication of the genome-wide chromatin immunoprecipitationexperiments.Genomics 83: 349-360

15. Burcin, M. et al. (1997). Negative protein 1, which is required for function of the chicken lysozyme gene silencer in conjunction with hormone receptors, is identical to the multivalent zinc finger repressor CTCF. Mol. Cell. Biol. 17, 1281-1288.

16. Burke, L.J. Zhang, R. Lutz, M. Renkawitz, R. (2002) "The thyroid hormone receptor and the insulator protein CTCF: two different factors with overlapping functions". J Steroid Biochem Mol Biol. Dec; 83(1-5): 49-57

17. Carter D., Chakalova L., Osborne C., Dai Y., Fraser P.(2002). Long range chromatin regulatory in vivo. Nat.Genet.32 623-26

18. Cann J. R. (1998) Theoretical studies on the mobility-shift assay of protein-DNA complexes, Electrophoresis, Vol. 19, No. 2, 127-141

19. Celis J. E., Fink M., Kaltoft K. (1986). On the use of ultraviolet light to study protein-DNA cross-linking for genomewide binding microarray. Methods 31: 90-95

20. Chau M.C., Zhang X.Y., McMahon S.B., Lieberman P.M. (2006). Regulation of Epstein-Barr Virus latency type by the chromatin boundary factor CTCF. J Vir., 80 (12), 5723-5732

21. Chen N.N. and Khalili, K. (1995) Transcriptional regulation of human JC polyomavirus promoters by cellular proteins YB-1 and Pur a in glial cells. J. Virol., 69, 5843-5848

22. Chen S. and Corces V.G. (2001). The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner. Genetics, v.159, 1649-1658

23. Chernov I.P., Akopov S.B., Nikolaev L.G, and Sverdlov E.D. (2006). Identification and mapping of DNA binding proteins target sequences in long genomic regions by two-dimensional EMSA. BioTechniques 41:90-96

24. Chernukhin I., Shamsuddin S., Robinson A., Carne A., Paul A., El-Kady A., Lobanenkov V., and Klenova E. (2000). Physical and Functional Interaction between

25. Two Pluripotent Proteins, the Y-box DNA/RNA-binding Factor, YB-1, and the Multivalent Zinc Finger Factor CTCF. Journal of Biological chemistry Vol. 275, No. 38,29915-29921.

26. Chodosh L. A., Carthew R. W., and Sharp P. A. (1986). A single polypeptide possesses the binding and transcription activities of the adenovirus major late transcription factor, Mol Cell Biol, Vol. 6, №. 12,4723-4733

27. Chung, J.H., Whiteley, M. and Felsenfeld, G. (1993). A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74(3), 505-514

28. Cook P.R. (2003). Nongenic trascription, gene regulation and action at a distance. J.CellScL, 116,4483-4491

29. Das P.M., Ramachandran K., van Wert J., Singal R. (2004). Chromatin immunoprecipitation assay. BioTechiques 37: 961-969

30. Davies, R.C., Calvio, C., Bratt, E., Larsson, S.H., Lamond, A.I., Hastie, N.D. (1998) "WT1 interacts with the splicing factor U2AF65 in an isoform-dependent manner and can be incorporated into spliceosomes." Genes & Dev. 12: 3217 3225.

31. Defossez P. and E. Gilson (2002). The vertebrate protein CTCF functions as an insulator in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research, 30: 5136-5141

32. Delgado M.D., Chernukhin I.V., Bigas A., Klenova E.M., Leon J. (1999). Differential expression and phoshorylation of CTCF, a c-myc trascriptional regulator, during differentiation of human myeloid cells. FEBS Letters 444 5-10

33. DePinho, R.A. (1998). Transcriptional repression: The cancer-chromatin connection." Nature 391, 533 534

34. Dignam J. D., Lebovitz R. M., and Roeder R. G. (1983). Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei, Nucleic Acids Research, Vol. 11, №. 5, 1475-1489

35. Drueppel, L. Pfleiderer, K. Schmidt, A. Hillen, W. Berens, C. (2004) "A short autonomous repression motif is located within the N-terminal domain of CTCF". FEBS Lett. Aug 13; 572(1-3): 154-8

36. Dunaway M., Hwang J., Xiong M. and Yuen H.L. (1997). The activity of the scs and scs' insulator elements is not depend on chromosomal context. Molecular and Cellular Biology, 17,182-189

37. Dunn K.L. and Davie J.R. (2003).The many roles of the trascriptional regulator CTCF. Biochemical Cell Biology, 81, 161-167

38. El-Kady, A. Klenova, E. (2005) "Regulation of the transcription factor, CTCF, by phosphorylation with protein kinase CK2". FEBS Lett. Feb 28; 579 (6): 1424-34

39. Engel N., West A. Felsenfeld G., Bartolamei M. (2004). Antagonism between DNA hypermethylation and enhancer-blocking activity at the H19 DMD is uncovered by CpG mutations. Nat.Genet., 36, 883-888

40. Farrell, C.M. West, A.G. Felsenfeld, G. (2002) "Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human beta-globin loci". Mol Cell Biol. Jun; 22 (11): 3820-31

41. Fedoriw A., Stein P., Svoboda P., Schultz R., Bartolomei M. (2004). Trasgenenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting. Science 303, 238-240

42. Feng,J., Funk,W.D„ Wang,S.S., Weinrich,S.L., Avilion,A.A., Chiu,C.P., Adams,R.R., Chang,E., Allsopp,R.C. and Yu,J. (1995) The RNA component of human telomerase. Science, 269, 1236-1241.

43. Filippova, G. et al. (1996). "An exceptionally conserved transcriptional repressor, CTCF, employs different combinations of zinc fingers to bind diverged promoter sequences of avian and mammalian c-myc oncogenes." Moi. Cell. Biol. 16, 28022813.

44. Filippova G.N., Thienes CP, Penn BH, Cho DH, Hu YJ, Moore JM, Klesert TR, Lobanenkov VV, Tapscott SJ (2001). CTCF-binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation-sensitive insulator at the DM1 locus. Nat Genet 28: 335-343

45. Filippova, Galina N. Qi, Chen-Feng, Ulmer, J. E. et al. (2002). "Tumor-associated Zinc Finger Mutations in the CTCF Transcription Factor Selectively Alter Its DNA-binding Specificity." Cancer Res. 62:48 52.

46. Fleischer, T.C., Yun, U.J. Ayer, D.E. (2003) "Identification and characterization of three new components of the mSin3A corepressor complex". Mol Cell Biol. May; 23(10): 3456-67

47. Fox A.H., Chu Liew, Melissa Holmes, Kasper Kowalski, Joel Mackay and Merlin Crossley (1999). Transcriptional cofactors of the FOG family interact with GATA proteins by means of multiple zinc fingers. EMBO18,2812-2822

48. Friedman J., Frederics W., Jensen D., Speicher D., Huang X., Neilson E., Rauscher F., (1996). KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes Dev., 10,2067-2078

49. Fried M., Crothers D.M. (1981). Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res., Dec; 9: 6505 -6525

50. Gaszner M. and Felsenfeld G. (2006). Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews Genetics 8, 703-713

51. Gerasimova T.I. and Corces V.G. (2001). Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization. Annu. Rev. Genet, v.35, 193-208

52. Geyer, P.K. and Corces, V.G. (1992). DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 6(10), 1865-1873

53. Geyer, P.K., Green, M.M. and Corces, V.G. (1990). Tissue-specific transcriptional enhancers may act in trans on the gene located in the homologous chromosome: the molecular basis of transvection in Drosophila. EmboJ 9(7), 2247-2256

54. Gombert W.M., Farris S.D., Rubio E.D., Morey-Rosler K.M., Schubach W.H., Krumm (2003). The c-myc insulator element and matrix attachment regions define the c-myc chromosomal domain. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Vol. 23, № 24, 9338-9348

55. Grondin В., Bazinet M., Aubry (1996). The KRAB zinc finger gene ZNF74 encodes an RNA-binding protein tightly associated with the nuclear matrix. J. Biol. Chem., 271, 15458-15467

56. Grondin, В., Cote, F., Bazinet, M„ Vincent, M., Aubry, M. (1997) "Direct Interaction of the KRAB/Cys2-His2 Zinc Finger Protein ZNF74 with a Hyperphosphorylated Form of the RNA Polymerase II Largest Subunit." J. Biol. Chem. 272: 27877 27885.

57. Ghosh, D., Gerasimova, T.I. and Corces, V.G. (2001). Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. Embo J 20(10), 2518-2527

58. Hammilton Т., Borel. F., Romaniuk P., (1998). Comparison of the DNA binding characteristics of the related zinc finger proteins WT1 and EGR1. Biochemistry, 37, 2051-2058

59. Hammes A., Guo J., Lutsch G., Leheste J, Landrock D., Ziegler U., Gubler M., Schedl A., (2001). Two splice variants of the Wilms' tumor 1 gene have distinct functions during sex determination and nephron formation. Cell., 106, 319-329

60. Hark, A.T., Schoenherr, C.J., Katz, D.J., Ingram, R.S., Levorse, J.M., Tilghman, S.M. (2000) "CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus". Nature 405 (6785): 486-489.

61. Heng, S. A. Krawetz, W. Lu, S. Bremer, G. Liu,C. J. Ye, (2001). Re-defining the chromatin loop domain, Cytogenet Cell Genet. 93 155-161

62. Horikawa, I. and Barrett, J.C. (2003) Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis, 24, 1167-1176

63. Hormgren N. Kanduri С., Dell G., Ward R., Mukhopadhya et.al. (2001). CpG methylation regulates the M2/H19 insulator. Current Biology 11, 1128-1130

64. Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96(1), 23-28

65. Ishihara and Sasaki (2002). An evolutional conserved putative insulator element near the 3' boundary of the imprinted Igf2/H19 domain. Human Molecular Genetics, v. 11 (14), 1627-1636

66. Johnson P.E., McKnight S.L. (1989). Eukaryotic transcriptional regulatory proteins. Annu Rev. Biochem 58: 799-839

67. Kadonaga J. and Tjian R. (1986). Affinity Purification of Sequence-Specific DNA Binding Proteins. PNAS, 83, 5889-5893

68. Kadonaga, J.T. (2004). "Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors." Cell 116(2): 247-257.

69. Kanduri, C. et al. (2000). "The 5'-flank of the murine HI 9 gene in an unusual chromatin conformation unidirectionally blocks enhancer-promoter communication." Curr. Biol. 10,449^157.

70. Kellum, R. and Schedl, P. (1992). A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mo I Cell Biol 12(5), 2424-243

71. Kim,N.W., Piatyszek,M.A„ Prowse,K.R., Harley,C.B., West,M.D., Ho,P.L., Coviello,G.M, Wright,W.E., Weinrich,S.L. and Shay,J.W. (1994) Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 266, 2011-2015

72. Klenova E., Morse H., Ohlsson R., Lobanenkov V. V. (2002). The novel BORIS + CTCF gene family is uniquely involved in the epigenetics of normal biology and cancer, Semin Cancer Biol, Vol. 579, №. 6, 399-414.

73. Klenova E., Lobanenkova V., Ohlosson (2004). The binding sites for the chromatin insulator protein CTCF map to DNA methylation-free domains genome wide. Genome research, 14, 1594-1602

74. Kohne AC, Baniahmad A, Renkawitz R.(1993) NePl. A ubiquitous transcription factor synergizes with v-ERBA in transcriptional silencing. Mol Biol. 232(3):747-55

75. G. W. Konat (1996). Chromatin structure and transcriptional activity of MAG gene. Acta Neurobiol Exp. 56: 281-285

76. N. J. Kubat, R. K. Tran, P. McAnany, and D. C. Bloom (2004).The Herpes Simplex Virus Type 1 Latency-Associated Transcript (LAT) Enhancer/rcr Is Hyperacetylated during Latency Independently of LAT Transcription J. Virol. 78:1139-1149.

77. Kuhn E.J. and Geyer, P.K. (2003). Genomic insulators: connecting properties to mechanism. Curr Opin Cell Biol 15(3), 259-265

78. Ladomery, M., Marshall R., Arif L., Sommerville J., (2000). C4SR, a novel zinc-finger protein with SR-repeats, is expressed during early development of Xenopus. Gene, 256,293-302

79. Ladomery, M. and Dellaire, G. (2002) "Multifunctional zinc finger proteins in development and disease." Ann Hum Genet. 2002 66(Pt 5-6):331-42.

80. Ladomery M. and Sommerville, J. (1995). A role for Y-box proteins in cell proliferation. Bioessays, 17, 9-11.

81. Laemmli U.K. and Favre M., (1973) J.Mol.Biol., 80, 601-613

82. Layti J., Dyson H., Wright P., (2000). Molecular basis for modulation of biological function by alternative splicing of the Wilms' tumor suppressor protein. PNAS, 97, 11932-11935

83. Laybourn, P.J., Kadonaga, J.T. (1992). "Threshold phenomena and long-distance activation of transcription by RNA polymerase II." Science 257(5077): 1682-5.

84. Li, W. W., Hsiung, Y., Wong, V., Galvin, K., Zhou, Y., Shi, Y., and Lee, A. S. (1997). Suppression of grp78 core promoter element-mediated stress induction by the dbpA and dbpB (YB-1) cold shock domain proteins. Mol. Cell. Biol. 17, 61-68

85. Li, H., Cao, Y., Berndt,M.C., Funder,J.W. and Liu,J.P. (1999) Molecular interactions between telomerase and the tumor suppressor protein p53 in vitro. Oncogene, 18, 6785-6794

86. Loeb, D.D., Mack, A.A., Tian, R. (2002). "A Secondary Structure That Contains the 5' and 3' Splice Sites Suppresses Splicing of Duck Hepatitis В Virus Pregenomic RNA." J. Virol. 76:10195 10202.

87. Magdinier F., Yusufzau T.M., Fenselfend G. (2004). Both CTCF-dependent and -independent insulators are found between the mouse T-cell receptor a and Dadl genes. J. Biol. Chem., 279: 25381 25389

88. Manley J. L. Fire, A., Samuels, M. & Sharp, P. A. (1983). In vitro transcription: whole-cell extract. Methods Enzymol, Vol. 101, 568-582

89. Melnikova L., Gause M. and Georgiev P. (2002). The gypsy insulators flanking yellow enhancers do not form a separate transcriptional domain in Drosophila melanogaster: the enhancers can activate an isolated yellow promoter. Genetics, 160, 1549-1560

90. Mertens P.R., Alfonso-Jaume, M.A., Steinmann,K. and Lovett,D.H. (1998) A synergistic interaction of transcription factors AP2 and YB-1 regulates gelatinase A enhancer-dependent transcription. J. Biol. Chem., 273, 32957-32965

91. Morin G.B. (1989). The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell, 59:521-529

92. Morse R. H. (2003). Getting into chromatin: how do transcription factors get past the histones. Biochem Cell Biol, Vol. 81, №. 3, 101-112

93. Nagaya S., Yoshida K., Kato K., Aksaka K. and Shinmyo (2001). An insulator element from the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus suppresses variation in transgene expression in cultured tobacco cells. Mol Gen Genomics, v.265, 405-413

94. Nakano M., Yoshiura К., Oikawa M., Miyoshi О., Yamada К., Kondo S., Miwa N., Soeda E., Jinno Y., Fujii T, Niikawa N., (1998). Identification, characterization and mapping of the human ZIS (zinc finger, splicing gene). Gene, 225, 59-65

95. Nardelli J., Gibson Т., Vesque C., Charnay P. (1991). Base sequence discrimination by zinc-finger DNA-binding domains. Nature, 349,175-178

96. Nikolaev L.G. Glotov BO, Beliavskii AV, Levin AV. (1987). Characteristics of the protein specifically binding to the major late promoter of adenovirus type 2, Dokl AkadNaukSSSR., Vol. 294, №. 5, 1251-1254

97. Nikolaev L.G. Glotov B.O., Belyavsky A.V., Grachev S.A., Levin A.V. (1988). Identification of sequence-specific DNA-binding factors by label transfer: application to the adenovirus-2 major late promoter, Nucleic Acids Research, Vol. 16, №2, 519-535

98. Orlando, 2000. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation, Trends Biochem Sci. 25 99-104

99. Ogbourne, S. and Antalis, T.M. (1998). Transcriptional control and the role of silencers in transcriptional regulation in eukaryotes. Biochem J331(Pt 1), 1-14.

100. Ohlsson, R., Renkawitz, R., Lobanenkov, V. (2001). "CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease." Trends Genet 17(9): 520-527.

101. К Oshiman, M Maeda, S Tamura, S Kaya, S Mahmood, MA Reuben, LS Lasater, G Sachs, and M Futai (1991). The rat H+/K(+)-ATPase beta subunit gene and recognition of its control region by gastric DNA binding protein. J. Biol. Chem., 266:21584-21588

102. Papavassiliou A. and Silverstein S.(1990) Characterization of DNA-protein complex formation in nuclear extracts with a sequence from the herpes simplex virus. J.Biol.Chem. 265; 1648-1657

103. Park К., AtchinsonM. (1991). Isolation of a candidate repressor/activator, NF-E1, that binds to the immunoglobulin kappa 3'enhancer and the immunoglobulin heavy-chain mu El site. PNAS, 88, 809-817

104. Percec I. and Bartolomei M. (2002). Do X Chromosomes Set Boundaries. Science, Vol. 295 №. 5553, 287-288.

105. Pool J.C., Andrews L.G., Tollefsbol Т.О. (2001). Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene; 269: 1-12

106. Pritchard-Jones K., Fleming S., Davidson D., Bickmore W., Porteous D., Gosden

107. C., Bard J., Buckler A., Pelletier J., Housman D., van Heyningen V., Hastie N. (1990). The candidate Wilms' tumor gene is involved in genitourinary development. Nature 346: 194-197

108. Quitschke, W.W. Taheny, M.J., Fochtmann, L.J., Vostrov, A.A. (2000). "Differential effect of zinc finger deletions on the binding of CTCF to thepromoter of the amyloid precursor protein gene." Nucleic Acids Res. 28, 3370-3378

109. Qi C., Martensson A., Mattioli M., Dalla-Favera R., Lobanenkov V., and. Morse III H. (2002). CTCF functions as a critical regulator of cell-cycle arrest and death after ligation of the В cell receptor on immature В cells, PNAS, Vol. 100, № 2, 633638.

110. Rand E., Ben-Porath I., Keshet I., Cedar H. (2004).CTCF elements direct allele-specific undermethylation at the imprinted H19 locus. Current biology, 14 (11):1007-1012

111. Rasko J., Klenova E., Javier Leon J., Galina N. Filippova G., Dmitri I. Loukinov

112. Raj G.V., Safak,M., MacDonald,G.H. and Khalili,K. (1996) Transcriptional regulation of human polyomavirus JC: evidence for a functional interaction between RelA (p65) and the Y-box-binding protein, YB-1. J. Virol., 70, 5944-5953

113. Recillas-Targa, F., Bell, A.C. and Felsenfeld, G. (1999). Positional enhancer-blocking activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. PNAS USA 96(25), 14354-14359

114. Recillas-Targa, F., Valadez-Graham, V. and Farrell, C.M. (2004). Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis. Bioessays 26(7), 796-807

115. Renaud S., Loukinov D., Bosman F., Lobanenkov V., Jean Benhattar (2005). CTCF binds the proximal exonic region of hTERT and inhibits its transcription. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 21, 6850-6860

116. Robinett, C.C., O'Connor, A. and Dunaway, M. (1997). The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes. Mol Cell Biol 17(5), 2866-2875

117. Rollins R.A., Morcillo P. and Dorsett D. (1999). Homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes. Genetics, v.152, 577-593

118. Ruppert J., Kinzler K., Wong A., Bigner S., Kao F., Law M., Seuanez H., O'Brien S., Vogelstein B. (1988). The GLI-Kruppel family of human genes. Mol Cell Biol., 8,3104-3113

119. Safak M., Gallia,G.L., Ansari,S.A. and Khalili,K. (1999) Physical and functional interaction between the Y-box binding protein YB-1 and human polyomavirus JC virus large T antigen. J. Virol., 73, 10146-10157

120. Saitoh, N., Bell, A.C., Reeillas-Targa, F„ West, A.G., Simpson, M., Pikaart, M., Felsenfeld, G. (2000) "Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken fi-globin domain". EMBO J. 19: 2315 2322

121. Sambrook P.N., Eisman J.A., Champion G.D., Cohen M.L., Pocock N.A. and Yeates M.G. (1989) Effect of low dose corticosteroids on bone mass in rheumatoid arthritis: a longitudinal study. Ann Rheum Dis. 48: 535-538

122. Semenza G.L. (1994). Transcriptional regulation of gene exptession: mechanism and pathophysiology. Human Mutation 3: 180-199

123. Szabo, P.E., Pfeifer, G.P., Mann, J.R. (2004) "Parent-of-origin-specific binding of nuclear hormone receptor complexes in the H19-Igf2 imprinting control region". Mol Cell Biol.; 24(11):4858-68

124. Szabo P., Tang S., Silva F., Tsark W., and Mann J. (2004). Role of CTCF Binding Sites in the Igf2/H19 Imprinting Control Region, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Vol. 24, № 11, 4791-4800.

125. Takai, D., Gonzales, F.A., Tsai, Y.C. Thayer, M.J., Jones, P.A. (2001) "Large scale mapping of methylcytosines in CTCF-binding sites in the human H19 promoter and aberrant hypomethylation in human bladder cancer". Hum Mol Genet.; 10(23):2619-26

126. Theunissen O., Rudt F., Guddat U., Mentzel H., Pieler T. (1992). RNA and DNA binding zing fingers in Xenopus TFIIIA. Cell, 71, 679-690

127. Tilghman, S.M. (1999) "The sins of the fathers and mothers: genomic imprinting in mammalian development". Cell. Jan 22; 96(2): 185-93

128. Tolhuis, В., Palstra, R.J, Splinter, E., Grosveld, F., and de Laat, W. 2002. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active P-globin locus. Mol. Cell 10: 1453-1465

129. Torrano V, Chernukhin I., Docquier F., D'Arcy V, Leon J., Klenova E., Dolgado M.D (2005). CTCF regulates groth and erythroid differentiation of human myeloid leukemia cells. J. Biol. Chem. 280: 28152-28161.

130. Tsao Y.P., Huang S.J., Chang J.L. (1999). Adenovirus mediated p21(WAFl/SDII/CIPl) gene transfer induces apoptosis of human cervical cancer cell lines. J.Virol, 73,4983-4990

131. Tybulewicz, V.L, Crawford, C.E, Jackson, P.K, Bronson, R.T. and Mulligan, R.C. (1991). Neonatal lethality and lymphopenia in mice with a homozygous disruption of the c-abl proto-oncogene. Cell 65(7), 1153-1163

132. Yang, X.J., Ogryzko, V.V, Nishikawa, J, Howard, B.H, Nakatani, Y. (1996). "A рЗОО/CBP-associated factor that competes with the adenoviral oncoprotein El A." Nature. 382(6589): 319-24.

133. Yusufzai Т., Tagami H, Nakatani Y, and Felsenfeld G. (2004). CTCF Tethers an Insulator to Subnuclear Sites, Suggesting Shared Insulator Mechanisms across Species. Molecular Cell, Vol. 13, 291-298.

134. Valadez-Graham V, Razin S.V, Recillas-Targa (2004). CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken a-globin gene domain. Nucleic Acids Res. vol.32 (4) 1354-1362

135. Vostrov A.A. and Quitschke W.W (1997). The zinc finger protein CTCF binds to the APB-P domain of the amyloid precursor protein promoter. J. Biol. Chem., 272, 33353-33359

136. Vostrov, A.A., Taheny, M.J., Quitschke, W.W. (2002). "A Region to the N-terminal Side of the CTCF Zinc Finger Domain Is Essential for Activating Transcription from the Amyloid Precursor Protein Promoter." J. Biol. Chem. 277: 1619-1627

137. Wei G., Liu P., Liang C.(2005). Chromatin domain boundaries: insulator and beyond. Cell Research, 15(4), 292-300

138. Wenqiang, Т., Yi, G., Yu, S., Jung, Т., DaYe, S. (1997) "Extracellular calmodulin-binding proteins in body fluids of animals". J Endocrinol. Oct; 155(l):13-7

139. West, A.G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. (2002). "Insulators: many functions, many mechanisms." Genes Dev. 16: 271-288.

140. West A. and Fraser P. (2005). Remote control of gene transcription. Hum.Mol.Genet., 14,R101-110

141. Willoughby D.A., Vilalta A., Oshima R.G. (2000). An Alu element from the K18 gene confers position-independent expression in trasgenic mice. J. Biol.Chem. v. 275 (2):759-768

142. Wingender E., Dietze P., Karas H., Knuppel R.(1996). TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites. Nucleic Acids Res., 24(1):238-41

143. Ru Zhang, Les J. Burke, John E.J. Rasko, Victor Lobanenkov, Rainer Renkawitza (2004). Dynamic association of the mammalian insulator protein CTCF with centrosomes and the midbody. Experimental Cell Research 294: 86-93

144. Zhan H. C., Liu, D.P. et al. (2001). "Insulator: from chromatin domain boundary to gene regulation." Hum Genet 109(5): 471-478

145. Zhao, H. and Dean A. (2004). An insulator blocks spreading of histone acetylation and interferes with RNA polymerase II transfer between an enhancer and gene. Nucleic Acids Res. 32,4903-4919

146. Zhong, X.P. and Krangel, M.S. (1997). An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus. PNAS USA 94(10), 5219-5224