Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие синтеза ДНК в формировании и поддержании долговременной памяти у цыплят

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Участие синтеза ДНК в формировании и поддержании долговременной памяти у цыплят"

На правах рукописи

УДК 612 821 6

Комиссарова Наталья Викторовна

Участие синтеза ДНК в формировании и поддержании

долговременной памяти у цыплят

Специальность 03 00 13 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003168996

Москва-2008

003168996

Работа выполнена в ГУ НИИ нормальной физиологии им П К Анохина РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

член-корреспондент РАМН Константин Владимирович Анохин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Инга Игоревна Полетаева

доктор биологических наук, профессор Владимир Вячеславович Раевский

Ведущая организация: Институт биологии развития

им Н К Кольцова РАН

Защита диссертации состоится 29 мая 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д001 008 01 при ГУ НИИ нормальной физиологии им ПК Анохина РАМН по адресу Москва, ул Моховая 11, строение 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ нормальной физиологии им П К Анохина РАМН

Автореферат разослан 24 апреля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Современные представления о молекулярных механизмах формирования долговременной памяти основаны на концепции о зависимой от синтеза белка консолидации памяти Согласно этой концепции приобретение нового опыта сопровождается активацией специфического клеточного каскада экспрессии так называемых «ранних» и «поздних» генов (Анохин, 1997, Clayton, 2000, Guzowski, 2002) Результатом этого процесса являются структурные изменения синаптических контактов между клетками, сохраняющие связи нейронов, участвовавших в обучении (Rose, 1995, Анохин, 1997, Kandel, Pittenger, 1999, Isquierdo et al, 2006)

Однако одним из слабых мест этой модели является отсутствие ответа на вопрос, каким образом эти перестройки сохраняются в нервных клетках в течение длительного времени, которое может во много раз превышать время жизни синтезированных при обучении белковых молекул

Решением этой проблемы могли бы быть индуцируемые обучением изменения в самой структуре ДНК нервных клеток, надолго изменяющие их функциональные свойства (Тушмалова, 1990, Crick, 1984, Анохин, 1988, Arshavsky, 2006) Действительно, в литературе имеются экспериментальные данные, указывающие на то, что механизмы длительного хранения памяти могут вовлекать синтез ДНК Была показана индукция синтеза ДНК в мозге под влиянием обучения (Reims, 1972, Ашапкин и др, 1981, 1983, Giuditta et al, 1986), а также продемонстрировано амнестическое действие ингибиторов синтеза ДНК и антиметаболитов при их введении животным в период около обучения (Анохин и др , 1988, Wang et al, 2003, Remis, 1972) Однако эти данные разрознены и достаточно противоречивы В частности, остается неясным, насколько чувствительны разные формы памяти к действию ингибиторов синтеза ДНК и антиметаболитов Также, результаты исследований индукции синтеза ДНК под влиянием обучения не дают основания для заключения, что обнаруженный авторами синтез ДНК действительно необходим для формирования памяти (Remis et al, 1972, Guiditta et al, 1986) В то же время, результаты исследования амнезий, вызванных блокадой синтеза ДНК, не дают ответа на вопрос, как влияет обучение в этих моделях на синтез ДНК в мозге (Анохин с соавт, 1988, Wang et al, 2003)

Настоящая работа объединяет эти два прежде разрозненных направления - исследование нарушений памяти, вызванных вмешательством в синтез ДНК, и изучение индукции синтеза ДНК в мозге при обучении Это стало возможным благодаря методу иммуногистохимического выявления клеток мозга, ДНК которых включает вводимый в организм нуклеотидный аналог 5'-бромо-2'-дезоксиуридин (BrdU) BrdU и близкий ему по структуре и эффектам 5'-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) являются аналогами тимина и встраиваются в синтезирующуюся ДНК в процессе удлинения ее цепи При этом они изменяют свойства новой ДНК таким образом, что нарушаются ее основные функции — репликация, транскрипция и связывание с белками (Morris, Cramer, 1968, Goz, 1978) Таким образом, введение IdU или BrdU в период обучения позволяет впоследствии детектировать именно ту ДНК, которая синтезируется при этом обучении, а тестирование сохранности памяти дает возможность оценить, насколько необходима эта новосинтезированная ДНК, измененная встроенными аналогами, для формирования и поддержания долговременной памяти

Для исследований нарушений памяти в настоящей работе был использован преимущественно IdU, поскольку механизмы его действия на ДНК изучены более детально (Morris, Cramer, 1966, 1968) Основные амнестические эффекты IdU были проверены с помощью введения BrdU, который использовали преимущественно для мечения синтезирующих ДНК клеток, а также ингибитора ДНК-полимераз широкого спектра действия З'-амино-З'-дезокситимидина (AMT) и ингибитора обратной транскрипции З'-азидо-З'-дезокситимидина (АЗТ)

Для моделирования различных форм долговременной памяти в работе использовали разные задачи обучения у новорожденных цыплят, способных формировать устойчивую память после однократного сеанса нового опыта (Andrew, 1990, Rose, 2000)

Цель и задачи исследования

Цель работы исследовать влияние галогенизированных нуклеотидных аналогов на формирование и поддержание разных видов долговременной памяти у новорожденных цыплят, а также синтез ДНК в мозге при этих воздействиях

Задачи работы

1. Выявить возможные амнестические эффекты 5'-йодо-2'-дезоксиуридина (IdU) у цыплят в моделях обучения (1) пассивному избеганию, (2) вкусовой аверсии, (3) импринтингу, (4) при пространственном обучении в лабиринте

2 В моделях, где введение IdU вызывало амнезию, исследовать влияние 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) и ингибиторов синтеза ДНК З'-амино-З'-дезокситимидина (AMT) и З'-азидо-З'-дезокситимидина (A3T) на формирование долговременной памяти

3 В моделях обучения, где введение IdU, BrdU и ингибиторов синтеза ДНК вызывало амнезию, при помощи метода иммуногистохимической детекции BrdU определить, где и когда под влиянием обучения в мозге цыплят может индуцироваться синтез ДНК

Основные результаты и их научная новизна

Было исследовано влияние галогенизированных нуклеотидных аналогов (IdU и BrdU) на формирование памяти у цыплят при обучении в разных экспериментальных моделях, и впервые обнаружено избирательное амнестическое действие 5'-йодо-2'-дезоксиуридина при обучении цыплят в модели вкусовой аверсии В других использованных моделях обучения -импринтинге, пассивном избегании и обучении в лабиринте, нарушения памяти под влиянием IdU обнаружено не было Связь амнестического действия IdU в модели вкусовой аверсии с синтезом ДНК было подтверждено эффектами аналога IdU 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU), а также субстратного ингибитора ДНК-полимераз широкого спектра действия З'-амино-З'-дезокситимидина (AMT) Впервые было обнаружено нарушение памяти у цыплят при обучении вкусовой аверсии под влиянием ингибитора обратной транскрипции З'-азидо-З'-тимидина (АЗТ), что дает основание предполагать вовлечение синтеза ДНК и обратной транскрипции в мозге в механизмы консолидации памяти при обучении вкусовой аверсии

Впервые было исследовано включение BrdU клетками мозга цыплят через короткий срок после обучения - через 2ч Впервые была продемонстрировано повышение числа BrdU-содержащих клеток уже через 2 ч после обучения вкусовой аверсии в промежуточном медиальном мезопаллиуме (IMM)

3

структуре, критически необходимой для этого вида памяти, что свидетельствует об индукции синтеза ДНК под влиянием обучения в этой области мозга После 40-минутной процедуры импринтинга такого повышения включения BrdU не наблюдалось Показано, что к 24 ч после обучения вкусовой аверсии более высокий уровень включения BrdU в IMM, который наблюдался у обученных животных через 2 ч после обучения, нивелировался повышением числа BrdU-позитивных клеток в данной области у животных контрольной группы В то же время, через 24 часа после обучения в дорсальном и апикальном гиперпаллиуме обученных цыплят наблюдались более отставленные эффекты обучения вкусовой аверсии - снижение плотности BrdU-позитивных клеток у обученных животных по сравнению с контрольной группой, не получавшей хлорид лития

Полученные данные впервые выявляют отличие механизмов консолидации памяти при выработке вкусовой аверсии от процессов, лежащих в основе формирования памяти при обучении в лабиринте, импринтинге или пассивном избегании В совокупности, результаты работы указывают на возможность участия синтеза и функционирования новосинтезированной ДНК в поддержании долговременной памяти вкусовой аверсии

Научно-практическое значение работы

Результаты данной работы позволяют расширить представления о молекулярных механизмах, обеспечивающих приобретение и хранение долговременной памяти в нервной системе

Полученные результаты показали, что в основе обучения вкусовой аверсии могут лежать процессы, принципиально отличные от механизмов консолидации памяти в других исследованных моделях обучения и связанные с de novo синтезом ДНК Это делает вкусовую аверсию перспективной моделью для изучения вовлечения синтеза ДНК в процессы долговременной памяти

Обнаруженные амнестические эффекты ингибитора обратной транскрипции З'-азидо-З'-тимидина, в совокупности с данными, полученными ранее при обучении мышей активному избеганию (Анохин с соавт, 1988), дают основания для дальнейшего исследования возможного участия обратной транскрипции в механизмах консолидации долговременной памяти, в частности, более тонкого изучения молекулярных механизмов этого процесса

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на научных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (2005, 2006 и 2007 гг ), Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006 г), итоговых сессиях НИИ нормальной физиологии им П К Анохина РАМН (2005, 2006 и 2007гг), конференции Европейского общества изучения мозга и поведения (EBBS) (Триест, 2007)

Диссертационная работа была апробирована на заседании отдела системогенеза НИИ нормальной физиологии им ПК Анохина РАМН 28 сентября 2007 года

Структура диссертации

Диссертация состоит из следующих основных разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, заключение и список использованной литературы Рукопись работы включает 144 страницы текста, 12 рисунков и 8 таблиц Список литературы включает в себя 344 работы

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные и вводимые вещества. В работе использовали 893 цыплят-самцов и 97 цыплят обоих полов (в экспериментах с импринтингом) породы Ломон Браун в возрасте от 1 до 5 дней Были использованы растворы препаратов нуклеотидных аналогов IdU, BrdU, AMT и АЗТ, разведенных в 0 9% NaCl Растворы вводили либо внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл, либо в мозг, в область IMM в объеме 10 мкл на полушарие, согласно стандартному протоколу внутримозговых инъекций новорожденным цыплятам (Andrew, 1990), контрольным животным вводили эквивалентный объем физиологического раствора

Методики обучения. Для импринтинга была использована методика обучения во вращающемся колесе, разработанная МакКейбом с соавторами (McCabe et al, 1981) Каждого цыпленка помещали в индивидуальное свободно вращаемое колесо и импринтировали в течение 40 мин на освещенный

5

вращающийся красный куб Тестирование предпочтения импринт-объекта проводили через 48ч после обучения путем одновременного предъявления импринт-объекта (красного куба) и нового объекта (чучела курицы) в течение 10 мин Уровень предпочтения импринт-объекта выражался коэффициентом предпочтения К=100%х(число оборотов колеса в сторону импринт-объекта/общее число оборотов колеса) IdU вводили внутрибрюшинно либо за 10 мин до обучения, либо через 1 ч после начала обучения в дозе 10 мг/кг

В модели пространственного обучения в лабиринте использовали пятидневных цыплят Каждого цыпленка помещали в прямоугольный лабиринт размером 150x90x30 см, где он обучался находить вход через боковую дверку в пенал, передняя стенка которого была сделана из прозрачного оргстекла Через это стекло цыпленок мог видеть корм и других цыплят, которые находились внутри этого пенала Сеанс обучения состоял из 5 попыток длительностью не более 5 мин IdU вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг либо за 15 мин до начала обучения, либо через 60 мин после начала обучения Тестирование проводили через 48 ч после обучения, помещая цыпленка в лабиринт и измеряя латентный период захода в пенал через боковую дверцу

Для обучения пассивному избеганию использовали 1-2-суточных цыплят Обучение заключалось в однократном предъявлении цыпленку белой бусины, смоченной жгучим веществом метилантранилатом (Sigma) В силу врожденной склонности клевать небольшие яркие объекты цыплята клевали бусину, после чего у них вырабатывалось устойчивое ее избегание Уровень избегания тестировали через 24 часа после обучения путем предъявления цыплятам белой бусины, на которую проводили обучение, а затем красной (нейтральной) бусины Цыплята, избегавшие нейтральную бусину, не учитывались в дальнейшем анализе, чтобы исключить животных с генерализованным избеганием всех бусинкок Процент избегания рассчитывали как отношение количества цыплят, избегавших белую бусинку, к общему количеству цыплят.

Для обучения вкусовой аверсии использовали 1-2-суточных цыплят Цыплятам давали несколько раз клюнуть сухую белую бусину, а через 40 мин внутрибрюшинно вводили раствор хлорида лития (0,1 мл 1,ЗМ LiCl) Такая инъекция вызывала у цыплят болезненное состояние, приводившее к последующему избеганию бусины, которую цыплята клевали перед введением LiCl IdU вводили либо за 5 мин до обучения (предъявления бусины), либо через 55 мин после него (т е через 10 мин после инъекции LiCl) Тестирование

проводили через 24 или 48 ч после обучения При тестировании цыплятам предъявляли белую бусину, на которую проводили обучение, а затем показывали новую бусину другого цвета Цыплята, избегавшие эту новую нейтральную бусину, не учитывались в дальнейшем анализе

Илшуногистохимическая детекция Вг(Ш Клетки мозга, в который происходил синтез ДНК, детектировали по включению ВгсШ, используя стандартный иммуногистохимический протокол (Бегтоп й а1, 2004)

При исследовании включения ВгсШ в модели обучения вкусовой аверсии цыплят обучали по стандартному протоколу (см выше) и за 5 мин до обучения (предъявления бусины) им вводили ВгсЮ (100 мг/кг, в/бр) Через 2 или 24 ч после обучения (предъявления бусины) цыплят декапитировали и проводили иммуногистохимический анализ включения ВгсШ В качестве контроля использовались две группы цыплят - «Контроль», в которой животным предъявляли белую бусину, но вместо хлорида лития вводили физ раствор и группу «1лС1», которой вводили хлорид лития через 45 мин после введения ВгсШ без предъявления бусинки В обоих случаях у цыплят не развивалось избегания белой бусинки

При исследовании включения ВгсШ после импринтинга цыплятам вводили ВгсШ в дозе 100 мг/кг, через 20 мин импринтировали в течение 40 мин, а через 2 ч после начала импринтинга декапитировали и извлекали мозг для иммуногистохимического анализа на ВгсШ

Статистика. Для оценки достоверности различий между группами были использованы однофакторный дисперсионный анализ АКОУА при исследовании эффектов 1сШ в моделях импринтинга и пространственного обучения, критерий \ в моделях пассивного избегания и вкусовой аверсии Статистический анализ данных иммуногистохимической окраски срезов мозга на ВгсШ проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа АКЮУА и критерия Манна-Уитни для попарного сравнения групп

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние IdU на долговременную память у цыплят при обучении в различных моделях

Целью первого раздела работы было выявление моделей обучения, в которых амнезия у цыплят может быть вызвана введением галогенизированных нуклеотидных аналогов Приоритетным было выявление амнестических эффектов 5'-йодо-2'-дезоксиуридина Было использовано 4 разные модели обучения - импринтинг, вкусовая аверсия, пассивное избегание и обучение в лабиринте IdU вводили внутрибрюшинно перед обучением или после обучения

Импринтинг. После инъекции IdU за 10 мин до обучения коэффициент предпочтения им принт-объекта был равен 0,60±0,43' (п=19), тогда как в контрольной группе, получавшей физраствор, коэффициент предпочтения составил 0,65±0,37 (n=23, р=0,693, F (1,40)=0 157, ANOVA, рис 1) При введении IdU через 1 ч после начала обучения коэффициент предпочтения импринт-объекта составил 0,57±0,47 (п=14), тогда как у контрольных животных этот показатель был равен 0,69±0,41 (п=13, р=0 458, F(l,25)=0 569, ANOVA) В следующем эксперименте, для получения более высоких коэффициентов предпочтения цыплят импринтировали в течение 2ч, а тестировали не через 48 ч, а через 24 ч после обучения В этом случае IdU вводили за 5-10 мин до обучения в дозе 20 мг/кг У цыплят, получавших IdU, коэффициент предпочтения импринт-объекта составил 0,89±0,29 (п=10), тогда как у контрольных животных этот показатель был равен 0,85±0,35 (п=8, р=0,788, F(l,16)=0 075, ANOVA) Таким образом, введение IdU в использованных дозах ни до обучения, ни после обучения не нарушало формирования долговременной памяти при импринтинге

Обучение в лабиринте. При введении IdU (10 мг/кг) за 15 мин до обучения латентный период захода в пенал составил 34,8±20,8 с (п=10), тогда как в контрольной группе, получавшей физ раствор, этот показатель был равен 34,0±22,3с (р=0,932, n=12, F(l,20)=0 008, ANOVA, рис 2) При введении IdU через 60 мин после начала обучения латентный период захода в пенал составил 22,8±6,9 с (п=5), тогда как в контроле он был равен 17,5±5,3 с (р=0,275,

' Здесь и далее данные представлены в формате «cpeflHeeiSD»

8

АЫОУА, п=5, Р(1,8)=1 439, рис 2) Таким образом, введение Ии ни до обучения, ни после обучения не нарушало формирования долговременной памяти при обучении в лабиринте

Пассивное избегание. И и (10 мг/кг) вводили за 30 мин, за 5 мин до обучения, либо через 40 мин, 2 ч или 3 ч после обучения, однако ни в одном из случаев введение Ии не вызывало амнезии (Табл 1)

Таблица 1 Уровень избегания у цыплят, получавших Ии или физраствор в разное

группа / время инъекции за 30 мин за 5 мин через 40 мин через 2 ч через 3 ч

контроль (ФР) 75% (п=16) 86% (п=15) 83% (п=21) 67% (п=18) 67% (п=18)

Ии, 10 мг/кг 82% (п=17) 93% (п=14) 67% (п=22) 64% (п=14) 50% (п=20)

р (критерий х2) 0,606 0,585 0,194 0,888 0,299

Вкусовая аверсия. Инъекция 1<Ш (10 мг/кг) за 5 мин до обучения через 24ч приводила к достоверному снижению уровня избегания от 39% (п=18) в контрольной группе, получавшей физраствор, до 7% (п=14, р=0 040, критерий X2, рис 3) Выраженная амнезия в тесте через 24 ч после обучения наблюдалась

ю

09 08 07 Об 05 0,4 03

0 г

01 о

за 5 10 мин через 60 мин время введения 1сШ

Рис 1 Уровень предпочтения импринт-объекта у цыплят, получавших физраствор или Ии до или после импринтинга Здесь и далее на рисунках данные представлены в виде «среднее±8ЕМ»

за 15 мин

через 60 мин время введения 1сШ

Рис 2 Обучение в лабиринте Латентный период захода в пенал у цыплят, которым вводили физ раствор или 1<Ш до или после обучения

! фр

I ми

за 5 мин

через 55 мин время введения 1сШ

Рис 3 Нарушение воспроизведения реакции избегания у цыплят в модели вкусовой аверсии под влиянием введения Ии, *р<0 05, критерий х2

также при введении IdU через 50-55 мин после предъявления бусины (65% избегания в контрольной группе (п=17) и 14% у цыплят, получавших IdU (п=21, р=0 014, критерий х\ рис 3)) Данные амнестические эффекты IdU были воспроизведены и в дополнительных экспериментах при тестировании других групп обученных цыплят через 48 ч после обучения

Далее было исследовано влияние разных доз IdU (1, 3, 10 и 20 мг/кг) на формирование памяти при вкусовой аверсии (Рис 4) В тесте через 24 ч после обучения введение IdU через 55 мин после обучения в дозах 1, 10 и 20 мг/кг достоверно снижало уровень избегания бусины по сравнению с контрольными животными Различия между контрольной группой и группой, получавшей 3 мг/кг IdU, были статистически значимы на уровне тенденции (р=0,052)

Было обнаружено, что память при вкусовой аверсии уже через 2ч после обучения нечувствительна к действию IdU введение IdU через 2 ч после предъявления бусины в дозе 10 мг/кг (п=16) не влияло на уровень избегания при сравнении с контрольной группой (п=18) в тесте через 24 ч после обучения (Рис 5)

ФР 3 мг/кг

I мг/кг 10 мг/кг

До»ы IdU

Рис 4 Вкусовая аверсия Нарушение воспроизведения реакции избегания у цыплят под влиянием различных доз 1(Ш * р<0 05, 0 05<р<0 06, критерий х2

через 50 иин

через 2 ч время введения 1(111

Рис 5 Отсутствие амнестического действия Ми при его введении через 2 ч после обучения вкусовой аверсии * р<0 05 при сравнении групп «ФР» и «Ми», "р<0 05 при сравнении двух групп «МШ

1 ФР IdU

через 3 ч через 6 ч время тестирования

Рис 6 Уровень избегания в тесте через 3 ч и через 6 ч после обучения вкусовой аверсии * р<0 05 при сравнении групп «ФР», #р<0 05 при сравнении групп «МШ через 3 ч и через 6ч после обучения

Далее было исследовано, насколько быстро после обучения под действием Ни развивается амнезия Для этого цыплят тестировали через 3 ч или 6 ч после обучения (Рис 6) Через 3 ч после обучения у цыплят, которым

вводили IdU после обучения (п=28) в дозе 10 мг/кг, также как и у контрольных животных (п=27), наблюдался низкий уровень избегания (5-15%) К шести часам после обучения аверсия в одинаковой степени развивалась в контрольной (п=24) и в экспериментальной группе (п=28) Таким образом, вызванная IdU амнезия развивалась более чем через 6 ч после обучения

Для проверки воспроизводимости амнестических эффектов IdU в модели вкусовой аверсии был использован его аналог 5'-бромо-2'-дезоксиуридин (BrdU), который также включается в ДНК и в дальнейшем был использован для мечения клеток мозга, синтезирующих ДНК Введение BrdU в дозе, эффективной для иммуногистохимического мечения (100 мг/кг, Dermon et al, 2004) после обучения вызывало достоверное снижение уровня избегания в тесте через 48 ч после обучения от 64% (п=26) в контрольной группе до 18% (п=21, р=0 007) у цыплят, получавших BrdU (Рис 7)

Для дополнительной проверки зависимости формирования памяти в модели вкусовой аверсии от синтеза ДНК были также использованы субстратный ингибитор синтеза ДНК широкого спектра действия З'-амино-З'-дезокситимидин (AMT) и субстратный ингибитор зависящего от обратной транскрипции синтеза ДНК З'-азидо-З'-дезокситимидин (АЗТ), которые в предшествующих экспериментах эффективно нарушали формирование памяти у мышей при обучении пассивному избеганию (Анохин с соавт, 1988) Введение АЗТ в дозе 30 мг/кг через 10 мин после инъекции хлорида лития приводило к снижению уровня избегания от 58% у контрольных животных (п=26) до 10% у цыплят, получавших АЗТ (п=21, р=0 0008) в тесте через 48 ч после обучения (Рис 7)

70

50

60

Рис 7 Нарушение воспроизведения реакции избегания под влиянием инъекции BrdU и АЗТ в модели вкусовой аверсии В случае AMT различия между группами на

тенденции (0 05<р<0 06) * р<0 05,

40

0 05<р<0 06, критерий х2

30

20

10

о

ФР BrdU ФР АЗТ ФР AMT

AMT вводили цыплятам в дозе 10 мг/кг через 10 мин после инъекции хлорида лития При тестировании через 24 ч после обучения цыплята, получавшие AMT, демонстрировали значительно более низкий уровень избегания по сравнению с контрольной группой (Рис 7), получавшей физраствор (33% избегания у цыплят, получавших AMT (п=22), и 60% избегания в контрольной группе (п=25)), однако статистическая достоверность различий между группами была на уровне тенденции (р=0 062, Рис 7)

Таким образом, введение IdU, BrdU и субстратных ингибиторов синтеза ДНК AMT и АЗТ приводило к нарушению памяти в модели вкусовой аверсии Вызванная IdU амнезия развивалась более чем через 6 ч после обучения, однако введение IdU через 2 ч после обучения уже не оказывало амнестического эффекта В совокупности, полученные экспериментальные данные указывают на возможную роль синтеза ДНК в период около обучения в консолидации долговременной памяти вкусовой аверсии у цыплят

Влияние обучения вкусовой аверсии на включение BrdU в ДНК клеток мозга цыплят

Задачей настоящего раздела работы было выявить возможную индукцию синтеза ДНК в мозге цыплят под влиянием обучения вкусовой аверсии Для этого в мозге цыплят, обученных вкусовой аверсии, было исследовано включение BrdU через 2ч и 24 ч после обучения

Количество BrdU-позитивных клеток подсчитывали в ассоциативных структурах конечного мозга цыплят в промежуточном медиальном мезопаллиуме (IMM) — области, критически необходимой для формирования памяти при вкусовой аверсии, в гомологичной амигдалярному комплексу млекопитающих задней миндалине (РоА), в промежуточном аркопаллиуме (AI), в ядре полоски (ТпА), в медиальном стриатуме, в дорсальном и апикальном гиперпаллиуме (НА,HD), а также в гиппокампе (Нр)

Через 2 ч после обучения (или введения BrdU у контрольных животных) в мозге цыплят наблюдалось активное включение BrdU (Рис 9) Наиболее интенсивное мечение наблюдалось в вентрикулярных зонах вдоль стенок желудочков Однако BrdU-положительные клетки были обнаружены и в паренхиме мозга

В промежуточном медиальном мезопаллиуме плотность BrdU-меченых клеток была подсчитана отдельно для более ростральной части IMM и более

12

каудальной части (Рис 8) В ростральном 1ММ средние плотности Вг<Ш-позитивных клеток были близкими по значению во всех трех экспериментальных группах В каудальном 1ММ у обученных цыплят плотность ВгсЮ-меченых клеток была на 86 6% выше по сравнению с 1ММ группы «Контроль» (р=0,002, критерий Манна-Уитни) и на 62 5% выше, чем в группе «Ь1С1» (р=0,030) (Рис 8)

Ростральный 1ММ Каудальный 1\1М А1

Рис 8 Плотность BrdU-пoзитивныx клеток в ростральной части 1ММ, каудальной части 1ММ и в промежуточном аркопаллиуме (А1) контрольных и обученных цыплят через 2 ч и через 24 ч после введения Вг<Ш *р<0 05 при сравнении группы «Обучение» с каждой из контрольных групп " р<0 05 при сравнении плотности в одной и той же группе животных через 2 ч и через 24 ч после обучения, критерий Манна-Уитни

В промежуточном аркопаллиуме (А1) через 2 ч после обучения плотность меченных Вг<Ш клеток была приблизительно одинаковой во всех трех экспериментальных группах (Рис 8) В то же время, в каудальной части аркопаллиума - в задней миндалине (РоА) у цыплят группы «Обучение» число меченых ВгсШ клеток было на 71,3% выше, чем у цыплят группы «1лС1», получавших хлорид лития (Рис 10), однако различия между группами не достигали достоверности (р=0,065) У обученных цыплят плотность ВгсШ-позитивных клеток в РоА была также на 29,0% выше, чем в группе «Контроль», но в этом случае различия между группами были недостоверны (р=0,428) В других исследованных структурах конечного мозга - гиппокампе (Нр), медиальном стриатуме (Мб!), ядре полоски (ТпА), дорсальном и апикальном гиперпаллиуме (НБ и НА), интенсивность включения ВгсШ клетками во всех трех экспериментальных группах через 2 ч после обучения значительно не различалась (Рис 10,11)

Таким образом, обучение вкусовой аверсии приводило к достоверному усилению включения ВгсШ из всех исследованных структур только в 1ММ -области, критически необходимой для формирования памяти при вкусовой аверсии и, недостоверно, в РоА. При этом отдельные компоненты обучения -предъявление бусинки (группа «Контроль») или инъекция хлорида лития (группа «1лС1») сами по себе не оказывали того эффекта на включение ВгсШ клетками 1ММ, каким обладала вся процедура обучения.

Через 24ч после обучения в промежуточном медиальном мезопаллиуме (1ММ), как в его ростральной, так и в каудальной части, статистически достоверных различий между группами в плотности меченых ВгсШ клеток обнаружено не было (Рис. 8). В каудальном 1ММ цыплят групп «Контроль» и «ЫС1» плотность меченых ВгсШ клеток через 24 ч после обучения была достоверно выше, чем в соответствующих группах через 2 ч после обучения: в группе «Контроль» на 76,2% (р=0,004), в группе «1лС1» на 66,9% (р=0,032). У обученных цыплят плотность включивших ВгсШ клеток через 24 ч после обучения была на 36,8% ниже, чем через 2 ч после обучения, однако эти различия не достигали достоверности (р=0,329, рис. 8).

А , , I С Е

В Р ^

I

0.25 мм

Рис. 9. Включение BrdU клетками каудальной части промежуточного медиального мезопаллиума (1ММ) через 2 ч после введения Вгёи. А,В - соответственно левый и правый 1ММ контрольного цыпленка, которому предъявляли бусинку, но не вводили хлорид лития. С,О - соответственно левый и правый 1ММ цыпленка группы «1лС1», которому не предъявляли бусинку, но делали инъекцию хлорида лития. ЕД7 - соответственно левый и правый 1ММ цыпленка, который был обучен вкусовой аверсии.

Таким образом, в группах «Контроль» и «LiCl» более низкое количество меченых BrdU клеток в IMM, наблюдаемое через 2 ч после введения BrdU, к 24ч после введения BrdU повышалось до уровня, на котором у обученных цыплят плотность BrdU-позитивных клеток находилась уже через 2 ч после введения BrdU В ростральной части IMM всех трех экспериментальных групп плотность включивших BrdU клеток через 2 ч после обучения и через 24 ч после обучения также достоверно не различалась

Mst

Ts

I

2 часа

24 часа

2 часа

24 часа

Рис 10 Плотность BrdU-позитивных клеток в задней миндалине (РоА), гиппокампе (Нр) и медиальном стриатуме (Mst) контрольных и обученных цыплят через 2 ч и через 24 ч после введения BrdU "р<0 05 при сравнении со значениями плотности меченых BrdU клеток у цыплят той же группы через 2 ч после обучения

В промежуточном аркопаллиуме (AI) через 24 ч после обучения значения плотности BrdU-позитивных клеток во всех трех группах достоверно не различались При сравнении плотности BrdU-содержащих клеток в AI через 2 ч и через 24 ч после введения BrdU в каждой из экспериментальных групп достоверных различий обнаружено не было (Рис 8) В задней миндалине (РоА) средние значения плотности в обеих контрольных группах через сутки после обучения были очень близкими, и различия меэду группами были статистически незначимы По сравнению с плотностью меченых BrdU клеток РоА через 2 ч после обучения, через 24 ч у цыплят группы «Контроль» наблюдалось достоверное повышение плотности включивших BrdU клеток на 46,5% (р=0,016), а в группе «LiCl» - на 84,4% (р=0,002) В то же время, в РоА обученных цыплят не происходило повышения числа включивших BrdU клеток к 24ч после обучения (р=0,485) Таким образом, наблюдаемая через 2 ч после обучения тенденция к повышению числа меченых BrdU клеток РоА у

2 •г

ТпА

! Контроль |ЫС1

| Обучение

2 часа

ТО

2

5

^ 20

24 часа

( часа 2 часа 24 часа 2 час.

Рис 11 Плотность ВгсШ-позитивных клеток (на 1 мм2) в ядре полоски (ТпА), апикальном гиперпаллиуме (НА) и дорсальном гиперпаллиуме (НО) контрольных и обученных цыплят через 2 ч и через 24 ч после введения ВгсЮ *р<0 05 при сравнении группы «Обучение» с группой «Контроль», * р<0 05 при сравнении со значениями плотности меченых ВгШ клеток у цыплят той же группы через 2 ч после обучения, критерий Манна-Уитни

обученных цыплят уже через 24 ч после обучения нивелировалось повышением плотности включивших ВгсШ клеток в контрольных группах

В гиппокампе значения плотности меченых ВгсШ клеток через 24 ч после обучения были близкими во всех трех группах животных (Рис 10) По сравнению с включением ВгсШ через 2 ч после обучения, через сутки после обучения в группе «Обучение» наблюдалось достоверное повышение плотности меченых Вгс1и клеток на 57% (р=0,032), в группе «1лС1» повышение на 89%, однако статистическая значимость различий в последнем случае была на уровне тенденции (р=0,056) (Рис 10) В группе «Контроль» плотность включивших ВгсШ клеток через 24 ч достоверно не отличалась о соответствующих значений через 2 ч

В медиальном стриатуме (МБ!) обученных цыплят через 24 ч после введения ВгсШ значения плотности включивших ВгсШ клеток были близкими во всех трех экспериментальных группах, и различия между группами были недостоверны (Рис 10) В группах «Контроль» и «Обучение» значения плотности меченных ВгсШ клеток в Г^ через 2 ч и через 24 ч после обучения достоверно не различались, тогда как в группе «1лС1» к 24 ч после обучения наблюдалось достоверное повышение плотности меченых ВгсШ клеток на 75,7% (р=0,017)

В ядре полоски (ТпА) через 24 ч после обучения плотность меченых ВгсШ клеток была практически одинаковой во всех трех группах (Рис 11)

Достоверное повышение плотности через 24 ч после обучения по сравнению с 2 часами после обучения наблюдалось только в группе «1лС1» (р=0,030)

В дорсальном и апикальном гиперпаллиуме через 24ч после обучения наблюдалось достоверное снижение плотности ВгсШ-позитивных клеток по сравнению с контрольной группой (р=0,009 и 0,041 соответственно), однако в сравнении с группой «1лС1» у обученных цыплят снижение плотности меченых клеток в НА и НО было статистически незначимым (р=0,180 и 0,818 соответственно, рис 11) В обеих структурах - и в НА, и в НО цыплят группы «Контроль» через 24 ч после обучения плотность меченых ВгсШ клеток была достоверно выше, чем у цыплят этой группы через 2 ч после обучения - в НА на 82,3% (р=0,026), в НО на 90% (р=0,004) В группе «1лС1» плотность меченых клеток через 24 ч после обучения достоверно не отличалась от соответствующих значений через 2 ч после обучения (Рис 11) В дорсальном гиперпаллиуме обученных цыплят плотность меченых клеток через 24 ч после обучения была выше, чем через 2 ч после обучения, на 20,4% (р=0,041), а в апикальном гиперпаллиуме обученных цыплят плотности меченых клеток через 2 ч и через 24 ч после обучения были практически одинаковыми (р=0,657) Таким образом, у животных группы «Контроль» наблюдался значительный прирост числа меченых ВгсШ клеток в НА и НО через 24 ч после введения ВгсШ по сравнению с двумя часами после введения ВгсШ, тогда как у животных двух других групп («1лС1» и «Обучение») такого значительного прироста не наблюдалось

Таким образом, повышение включения ВгсШ в 1ММ через 2 ч после обучения носило временный характер, и к 24 ч после обучения нивелировалось повышением плотности ВгсШ-позитивных клеток в 1ММ животных контрольных групп приблизительно до тех же значений В то же время, через 24 часа после обучения в дорсальном и апикальном гиперпаллиуме обученных цыплят наблюдались более отставленные эффекты обучения вкусовой аверсии - снижение плотности ВгсШ-позитивных клеток у обученных животных по сравнению с контрольной группой, не получавшей хлорид лития

Влияние имиринтинга на включение ВгсШ в ДНК клеток области 1ММ через 2 ч после обучения

Как нами было показано ранее, 1-часовая процедура импринтинга приводит к повышению плотности включивших ВгсШ клеток этой области через 24 ч после обучения. Однако оставалось неясным, насколько усиление синтеза ДНК в 1ММ через 24 ч после импринтинга связано собственно с обучением, а не с отдаленным последствием действия на цыпленка различных компонентов процедуры импринтинга.

% 35

контроль импринтинг

Рис. 12. Импринтинг. Плотность ВгсШ-позитивных клеток в промежуточном медиальном мезопаллиуме (1ММ) контрольных и импринтированных цыплят через 2 ч после введения ВгсЮ.

левый 1ММ среднее

правый 1ММ

В связи с этим в настоящей работе было проанализировано влияние процедуры импринтинга на включение ВгсШ клетками 1ММ не через сутки после обучения, а через более короткий срок - через 2 ч, также как и в случае вкусовой аверсии. Значения плотности ВгсШ-позитивных клеток в 1ММ у контрольных и обученных цыплят были очень близки как в ростральной, так и в каудальной части 1ММ (Рис. 12), достоверных различий между группами обнаружено не было.

Таким образом, в отличие от вкусовой аверсии, 40-минутная процедура импринтинга не индуцировала «дополнительного» синтеза ДНК в 1ММ, который может быть детектирован через 2 ч после обучения.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе обнаружено, что галогенизированный нуклеотидный аналог 5'-йодо-2'-дезоксиуридин (1сШ) вызывает избирательный амнестический эффект в модели обучения вкусовой аверсии у цыплят. Полученные нами эффекты не были обусловлены общим токсическим действием 1сШ на

18

поведение животных, поскольку амнезия наблюдалась только в одной модели -вкусовой аверсии, тогда как в остальных моделях обучения память не нарушалась В частности, никак не нарушалось сходное поведение отвергания цыплятами бусинки в модели пассивного избегания В отличие от выполенной ранее работы с использованием IdU (Reims et al, 1972), в настоящей работе IdU вызвал амнезию при его введении не только непосредственно перед обучением, но и после введения хлорида лития, что предполагает его влияние на процесс консолидации памяти, а не собственно обучения

Косвенным подтверждением того, что эффекты IdU обусловлены его влиянием на ДНК, являются установленные в работе амнестические эффекты ингибитора ДНК-полимераз З'-амино-З'-дезокситимидина и ингибитора обратной транскрипции З'-азидо-З'-дезокситимидина в модели вкусовой аверсии К настоящему моменту имеются некоторые экспериментальные свидетельства возможного вовлечения процессов обратной транскрипции в механизмы консолидации долговременной памяти (Salganik et al, 1983, Анохин с соавт , 1988) Полученные нами данные также свидетельствуют в пользу этой гипотезы

Особый интерес представляет то, что амнестическое действие IdU было обнаружено только при обучении в модели вкусовой аверсии В отличие от других моделей обучения (например, условно-рефлекторное замирание или пассивное избегание), формирование вкусовой аверсии вовлекает функциональные системы не только поведенческого, но и метаболического уровня (Garcia et al, 1974, 1985) Кроме того, вкусовую аверсию, можно отнести к категории «отставленного обучения», поскольку временной интервал между предъявлением новой пищи и введением хлорида лития должен составлять не менее 30 мин Таким образом, синтез ДНК в клетках мозга может быть связан с этими особенностями длительных модификаций акцептора результата действия (АРД) в данной функциональной системе

Метод иммуногистохимической детекции BrdU, который используется в исследованиях нейрогенеза (Taupin, 2006), в настоящей работе был применен для анализа синтеза ДНК на более коротких сроках - через 2 ч после обучения вкусовой аверсии, когда нейрогенез еще не дает значительного вклада в общее включение ДНК клетками мозга (Gould, Gross, 2002)

Достоверное повышение включения BrdU по сравнению с обеими контрольными группами было обнаружено только в одной из исследованных

областей мозга цыпленка - промежуточном медиальном мезопаллиуме (IMM) Эта высшая ассоциативная область, по-видимому, может выполнять функции поддержания измененного АРД в случае вкусовой аверсии, поскольку, как было показано Барбер с соавторами (Barber et al., 1999), она критически необходима для этого вида обучения, а также обладает многочисленными связями с областями мозга, которые вовлечены в обработку как висцеральной, так и зрительной афферентации (Хорн, 1988)

Через 24ч после обучения не было обнаружено различий в плотности BrdU-позитивных клеток в области IMM между группой «Обучение» и контрольными группами В каудальной части IMM нивелирование различий, наблюдаемых через 2ч после обучения, было обусловлено значительным повышением числа включивших BrdU клеток к 24 часам после обучения у цыплят обеих контрольных групп Известно, что у млекопитающих при внутрибрюшинном введении BrdU доступен для мечения синтеза ДНК в течении первых двух часов (Packard et al, 1973), следовательно теоретически число включивших BrdU клеток через 24 ч после обучения должно оставаться приблизительно на том же уровне, который наблюдался через 2 ч после обучения В то же время, длительность клеточного цикла при нейрогенезе составляет около 24 ч (Gould, Gross, 2002), следовательно, повышение числа BrdU-позитивных клеток через 24ч после обучения у контрольных животных может быть обусловлено пролиферацией клеток, включивших BrdU в первые 2 часа после его введения

Данные группы Джудитты (Perrone-Capano et al, 1982) о постоянном синтезе и деградации ДНК в мозге крыс с длительностью цикла около 4 часов позволяют предположить, что такая деградация может наблюдаться и в мозге цыплят обучение индуцирует в IMM синтез ДНК, который еще может быть обнаружен через 2 ч после обучения, однако к 24 часам после обучения эта ДНК уже деградирует Возможным способом деградации BrdU-содержащей ДНК может быть как элиминация целых клеток, так и деградация самой содержащей BrdU ДНК Так, у млекопитающих в некоторых случаях обучение может приводить не к повышению, а к снижению числа BrdU-положительных клеток и усилению апоптоза в зубчатой фасции (Ambrogini et al, 2004) В то же время, имеются данные, что в мозге цыплят обучение пассивному избеганию может приводить к снижению числа BrdU-позитивных клеток в гиппокампе

(№ко1окорои1ои й а1, 2006), не влияя на интенсивность апоптоза в этой области

Из всех исследованных структур мозга различия между контрольными и обученными цыплятами в уровне включения ВгсШ через 24ч после обучения наблюдались только в дорсальном (НО) и апикальном гипераллиуме (НА) Плотность меченых ВпШ клеток в этих областях у обученных цыплят было достоверно ниже, чем у животных группы «Контроль», но достоверно не отличалась от плотности в группе «1лС1». Таким образом, обнаруженное снижение включения ВгсШ могло быть обусловлено не столько обучением, сколько болезненным состоянием, вызванным инъекцией хлорида лития

Исследованию эффектов лития на функции мозга посвящено большое количество исследований (бесИев е! а1, 2004, ВеаиЬеи е1 а1, 2004, ВаБзеЬп е! а1, 2005, Ога\¥а е1 а1, 1975, Яи5зе1 й а1, 1981), особый интерес представляют данные о повышении продолжительности сна под влиянием лития (\fanmsts е1 а1, 1976) В экспериментах Джудитты с соавторами было показано значительное снижение количества ДНК, которая была синтезирована при обучении в мозге крыс под влиянием сна (Бсагош й а1, 1983) Аналогичным образом, выявленное в настоящей работе снижение числа ВгсШ-позитивных клеток в НА и НБ могло быть связано не с обучением, а с введением хлорида лития и его влиянием на продолжительность сна у цыплят

Обнаруженные в настоящей работе различия между вкусовой аверсией и импринтингом (амнестическое действие 1сШ в модели вкусовой аверсии и его отсутствие в модели импринтинга, повышение включения ВгсШ через 2ч после обучения вкусовой аверсии, но не после импринтинга) с большой вероятностью могут отражать принципиальное отличие механизмов долговременной пластичности, лежащих в основе этих двух видов обучения Возможно, что для формирования поведения следования при импринтинге нет необходимости в индукции синтеза ДНК, а обнаруженное ранее повышенное включение ВгсШ через 24ч после импринтинга отражает последствия процедуры импринтинга — двигательной активности, зрительной и слуховой стимуляции, и пр

Таким образом, в настоящей работе на модели обучения цыплят вкусовой аверсии впервые продемонстрирована индукция включения ВгсШ клетками промежуточного медиального мезопаллиума при обучении, которая, вероятно, обусловлена синтезом ДНК в этих клетках Также было показано, что введение животным 1сШ, ВгсШ и АЗТ при обучении вкусовой аверсии приводило к

развитию амнезии, что может свидетельствовать в пользу участия выявленного синтеза ДНК в формировании и поддержании долговременной памяти.

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что из четырех исследованных моделей обучения цыплят (импринтинг, пассивное избегание, вкусовая аверсия, обучение в лабиринте) введение нуклеотидного аналога 5'-йодо-2'-дезоксиуридина приводит к развитию амнезии только в модели вкусовой аверсии Эти данные указывают на отличие механизмов консолидации памяти при вкусовой аверсии от механизмов формирования памяти в других моделях обучения Показано, что вызванная 1сШ амнезия развивается более, чем через 6 ч после обучения, при этом память доступна для нарушения 1сШ в течение менее, чем 2 ч после обучения

2 Показано, что при обучении цыплят в модели вкусовой аверсии амнестическим действием обладает внутрибрюшинное введение аналога 1<Ш -5'-бромо-2'-дезоксиуридина и субстратных ингибиторов синтеза ДНК 3'-амино-З'-дезокситимидина и З'-азидо-З'-дезокситимидина, а также внутримозговое введение З'-азидо-З'-дезокситимидина Эти данные указывают на необходимость синтеза ДНК для поддержания памяти при вкусовой аверсии, а также косвенно подтверждают, что амнестическое действие 5'-йодо-2'-дезоксиуридина связано с его включением в ДНК

3 Установлено, что среди исследованных структур мозга цыпленка имеются области (промежуточный медиальный мезопаллиум - 1ММ), где обучение вкусовой аверсии индуцирует синтез ДНК, который может быть выявлен путем иммуногистохимического мечения ВгсШ через 2 ч после обучения Через 24 ч после обучения повышенное включение ВгсШ, обнаруженное через 2 ч после обучения в промежуточном медиальном мезопаллиуме, нивелируется повышением включения ВгсШ у контрольных животных

4 Показано, что в мозге цыплят имеются также структуры, где через 24 ч после обучения наблюдается снижение уровня включения ВгсШ - дорсальный гиперпаллиум и апикальный гиперпаллиум

5 Полученные данные позволяют предположить, что для формирования долговременной памяти в модели вкусовой аверсии у цыплят требуется синтез

22

ДНК непосредственно после обучения Этот синтез, по-видимому, протекает в

промежуточном медиальном мезопаллиуме - области мозга, критически

необходимой для этого вида памяти

Список публикаций

1 Комиссарова Н В , Анохин К В Влияние процедуры импринтинга на клеточную пролиферацию в мозге цыпленка Журн Высш Нервн Деят, 2007, т 57, №2, стр 196-205

2 Комиссарова Н В , Тиунова А А , Анохин К В Избирательное нарушение консолидации памяти у цыплят под влиянием 5'-йодо-2'-дезоксиуридина Журн Высш Нервн Деят , 2008, т 58, №4

3 Комиссарова Н В «Клеточная пролиферация в мозге цыпленка влияние импринтинга» Конференция молодых ученых Института Высшей нервной деятельности и нейрофизилогии РАН, Москва, 12-13 декабря 2005 ,стр 45

в сборнике тезисов

4 Комиссарова Н В «Влияние импринтинга на клеточную пролиферацию в мозге цыпленка» Съезд физиологов СНГ, 19-24 сентября 2005г , стр 211 в сборнике тезисов

5 Комиссарова Н В , Анохин К В «Влияние ингибиторов синтеза ДНК на формирование долговременной памяти у новорожденных цыплят» 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 17-21 апреля 2006 г , стр 145 в сборнике тезисов

6 Комиссарова Н В Влияние ингибитора синтеза ДНК 5'-йодо-2'-дезоксиуридина на формирование долговременной памяти у цыплят Конференция молодых ученых Института Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, 11-12 октября 2006 г, стр 11 в сборнике тезисов

7 Комиссарова Н В Синтез ДНК в мозге новорожденных цыплят после обучения в модели вкусовой аверсии Конференция молодых ученых Института Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, 10-12 октября 2007 г , стр 25 в сборнике тезисов

Заказ № 62/04/08 Подписано в печать 03 04 2008 Тираж! 00 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20

С^О) \v\vw с/г ги , е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комиссарова, Наталья Викторовна

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность исследования.

1.2. Цель и задачи работы.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Научно-практическое значение работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Введение.

2.2. Современные представления о механизмах памяти.

2.3. Данные, противоречащие интерпретации экспериментально вызванных амнезий как нарушений формирования и хранения памяти.

2.4. Альтернативные гипотезы о механизмах формирования и поддержания долговременной памяти.

2.4.1. Исследования нейрогенеза в мозге птиц и млекопитающих, как возможного механизма долговременной пластичности.

2.4.2. Исследования участия синтеза ДНК в формировании долговременной памяти.

2.4.2.1. Амнестические эффекты ингибиторов синтеза ДНК и нуклеотидных аналогов, обладающих антиметаболитными свойствами.

2.4.2.2. Исследования индукции синтеза ДНК в мозге под влиянием обучения.

2.4.2.3. Исследования «метаболической ДНК».

2.4.2.4. Обратная транскрипция как возможный механизм поддержания долговременной памяти.

2.4.2.5. Негомологичное соединение концов ДНК (ЫНЕЗ) как возможный механизм долговременной памяти.

2.4.3. Модификации гистонов и ДНК как возможные механизмы поддержания долговременной памяти.

2.5. Влияние галогенизированных нуклеотидных аналогов 5'-йодо-2'-дезоксиуридина (16и) и 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (ВгсШ) на клеточные функции.

2.6. Раннее обучение у цыплят и процессы системогенеза.

2.6.1. Раннее пищевое обучение у цыплят.

2.6.2. Пассивное избегание м вкусовая аверсия -экспериментальные модели обучения у цыплят, основанные на пищевой функциональной системе.

2.6.3. Импринтинг и функциональная система следования за матерью.

2.7. Резюме и экспериментальные задачи настоящей работы.

3. МЕТОДИКА.

3.1. Объект исследования.

3.2. Вводимые вещества и способы инъекций.

3.3. Исследование амнестического действия нуклеотидных аналогов.

3.3.1. Обучение в модели импринтинга.

3.3.2. Пространственное обучение в лабиринте.

3.3.3. Обучение в модели вкусовой аверсии.

3.3.4. Обучение в модели пассивного избегания.

3.4. Иммуногистохимическое выявление клеток, включивших 5'-бромо-2'~ дезоксиуридин при обучении.

3.4.1. Исследование включения ВгсШ при обучении.

3.4.1.1. Вкусовая аверсия.

3.4.1.2. Импринтинг.

3.4.2. Иммуногистохимическая детекция включения ВгсШ клетками мозга.

3.4.3. Обработка иммуногистохимических данных.

3.5. Статистическая обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.•.

4.1. Влияние «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК на формирование долговременной памяти у цыплят при обучении в различных моделях.

4.1.1. Влияние 5'-йодо-2'-дезоксиуридина на формирование памяти при обучении в различных моделях.

4.1.1. а) Импринтинг.

4.1.1. б) Пространственное обучение в лабиринте.

4.1.1. в) Вкусовая аверсия.

4.1.1. г) Пассивное избегание.

4.1.2. Влияние препаратов, действие которых направлено на нарушение синтеза ДНК или её последующей репликации/транскрипции, на формирование памяти при обучении вкусовой аверсии.

4.1.2. а) Амнестические эффекты 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (ВгсШ) при обучении цыплят вкусовой аверсии.

4.1.2. б) Амнестические эффекты субстратных ингибиторов синтеза ДНК при обучении цыплят вкусовой аверсии.

4.2. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (ВгсШ) в ДНК клеток мозга цыплят.

4.2.1. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение 5'-бромо-2'~ дезоксиуридина (ВМС!) в ДНК клетками мозга, измеренное через 2 ч после обучения.

4.2.2. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (Вгс1и) в ДНК клеток мозга, измеренное через 24 ч после обучения.

4.2.3. Качественный анализ фенотипа клеток 1ММ, включивших ВгсО) через 2 ч после обучения.

4.2.4. Влияние импринтинга на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина

Вгс1и) в ДНК клетками мозга через 2 ч после обучения.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Влияние «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК на формирование памяти у цыплят при обучении в различных моделях.

5.2. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение Вгби в ДНК клеток мозга цыплят через 2 ч после обучения.

5.3. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение ВгсШ в ДНК клеток мозга цыплят через 24 ч после обучения.

5.4. Влияние импринтинга на включение ВгсО) в ДНК клеток мозга цыплят через 2ч после обучения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие синтеза ДНК в формировании и поддержании долговременной памяти у цыплят"

1.1 Актуальность исследования Современные представления о молекулярно-биологических механизмах обучения и памяти основаны на положении о кратковременной и долговременной формах хранения информации в мозге. В основе этой теории лежит открытие Г.Мюллера и А.Пильзекера, обнаруживщих в 1900 г., что переход из кратковременной и легко нарушаемой памяти в долговременную устойчивую память происходит у человека в течение первого часа после получения им новой информации. Они назвали этот процесс консолидацией памяти (Muller, Pilzecker, 1900). Однако существующие в настоящее время критерии для определения принадлежности «временному» исследователей, памяти признаку к к кратковременной следует или долговременной По мнению память, по достаточно расплывчаты. одних которая кратковременной относить удерживается от нескольких секунд до нескольких часов, а к долговременной память, которая сохраняется от нескольких часов до нескольких дней, после чего переходит в постоянное хранение. Согласно другим представлениям, кратковременной считают память, которая удерживается в течение нескольких секунд, долговременной память, которая сохраняется от нескольких секунд до нескольких лет (Александров, 2000). Основным шагом в понимании биологических механизмов консолидации памяти стало открытие 1960-х гг., показавшее, что переход памяти из кратковременной в долговременную форму требует синтеза новых молекул РНК и белка, т.е. экспрессии генов (Davis, Squire, 1984). Современные представления о молекулярных механизмах формирования долговременной памяти основаны на концепции о зависящей от синтеза белка консолидации памяти, согласно которой приобретение нового опыта сопровождается индукцией синтеза белка в мозге, в том числе экспрессией так называемых «ранних генов» (Анохин, 1997; Clayton, 2000; Guzowski, 2002). Результатом этого процесса является экспрессия широкого спектра новых белков и последующие структурные изменения определенных синаптических контактов между клетками (Rose, 1995; Анохин, 1997; Kandel, Pittenger, 1999; Isquierdo et al., 2006). Однако в отличие от механизмов формирования долговременной памяти, которые считаются к настоящему времени во многом раскрытыми, механизмы длительного поддержания долговременной памяти все еще остаются неясными 6 (Kandel, Pittenger, 1999). В частности, остается неясным, каким образом в нервных клетках в течение длительного времени сохраняется информация о произошедщих при обучении синаптических перестройках, тогда как это время может во много раз превышать время жизни отдельных белковых молекул. Экспериментальные данные последних лет предполагают, что одним из возможных молекулярных механизмов сохранения вызванных обучением долговременных изменений в нервных клетках может быть реорганизация хроматина и изменение статуса метилирования генов (Weaver et al., 2004; Levenson et al., 2004; Miller, Sweatt, 2007). В то же время, имеются данные, свидетельствующие о том, что механизмы длительного хранения памяти могут вовлекать синтез ДНК. Так, рядом авторов было показано, что обучение может индуцировать в мозге синтез ДНК (Reinis, 1972; Ашапкин и др. 1981, 1983; Giuditta et al, 1986а). Кроме того, в экспериментах с нарушениями памяти ингибиторами синтеза белка и ДНК были получены данные, которые не находят объяснения в теории консолидации памяти. Во-первых, было показано, что память, которая была нарушена блокадой синтеза белка при обучении, может восстанавливаться спонтанно, либо под действием процедуры напоминания или физиологически активных веществ (Quartermain 1970; Squire, Barondes, 1972; Quartermain, Botwinik, 1975; Радюшкин, Анохин, 1997). Во-вторых, было продемонстрировано амнестическое действие ингибиторов синтеза ДНК и антиметаболитов при их введении животным в период около обучения (Reinis, 1972; Анохин с соавт., 1988; Wang et al., 2003). В совокупности, эти данные позволяют предположить, что в мозге могут существовать дополнительные механизмы формирования и поддержания долговременной памяти, вовлекающие синтез ДНК. Для проверки гипотезы о механизмах памяти, требующих синтеза ДНК, необходимы экспериментальные свидетельства того, что (1) консолидация памяти сопровождается синтезом ДНК в мозге и (2) обнаруженный синтез ДНК критически необходим для формирования или поддержания долговременной памяти. Также принципиальным является вопрос о том, насколько универсален такой механизм, т.е. в какой степени он участвует в формировании/поддержании различных видов памяти. Известные к настоящему времени данные о синтезе ДНК при обучении достаточно противоречивы авторами и не дают ДНК основания для заключения, необходим что для обнаруженный синтез действительно формирования памяти (Reinis et al., 1972; Guiditta et al., 1986b). Кроме того, в этих 7 работах преимущественно использовали количественный анализ радиоактивного мечения синтезированной ДНК в гомогенатах мозга недостаточно точный метод, использование которого не позволяет выявить конкретные структуры мозга и клетки, в которых обучение может вызвать синтез ДНК. В то же время, результаты исследований амнезий, вызванных блокадой синтеза ДНК в определенных моделях обучения, не дают ответа на вопрос, действительно ли данный вид обучения, чувствительный к действию ингибиторов синтеза ДНК, индуцирует в мозге синтез ДНК (Анохин с соавт., 1988; Wang et al., 2003). Также остается неясным, насколько чувствительны другие виды памяти (при обучении в других моделях) к действию ингибиторов синтеза ДНК. Настоящая работа объединяет эти два прежде разрозненных направления исследование нарушений памяти, вызванных блокадой синтеза ДНК, и изучение индукции синтеза ДНК в мозге обучением. Это стало возможным благодаря методу иммуногистохимического мечения на срезах мозга клеток, ДНК которых содержит нуклеотидный аналог 5-бромо-2-дезоксиуридин (BrdU). BrdU и близкий ему по структуре и функциям 5-йодо-2-дезоксиуридин (IdU) являются аналогами тимина и могут встраиваться в ДНК в процессе удлинения её цепи. При этом они изменяют свойства новой ДНК таким образом, что нарушаются её основные функции репликация, транскрипция и связывание с белками (Morris, Cramer, 1968; Goz, 1978). BrdU и IdU влияют на функции только той ДНК, которая синтезируется в их присутствии. Поэтому, с одной стороны, введение IdU или BrdU в период около обучения позволяет детектировать именно ту ДНК, которая синтезируется при обучении, с другой стороны, последующее тестирование сохранности памяти дает возможность оценить, насколько необходима новосинтезированная ДНК для формирования/поддержания долговременной памяти. Для доказательства того, что амнестистические эффекты ДНК, IdU и BrdU обусловлены синтеза ДНК влиянием на новосинтезированную амнестическими они были подтверждены аналогичными (З-амино-З1- эффектами ингибиторов дезокситимидина и З-азидо-З-дезокситимидина). Механизмы действия IdU на ДНК изучены более детально (Morris, меньшие дозы Cramer, 1966, 1968), кроме того, в памяти были необходимы 5-бромо-2-дезоксиуридина чем предшествующих исследованиях для нарушения 5-йодо-2-дезоксиуридина, (Анохин, неопубликованные данные; Reinis, 1972), в связи с этим в исследованиях амнезии преимущественно использовали IdU. Основные амнестические эффекты 8 IdU были подтверждены для 5-бромо-2-дезоксиуридина, который использовали преимущественно для мечения синтезирующих ДНК клеток. Таким образом, использованный в настоящей работе подход позволяет одновременно оценить уровень синтеза ДНК в мозге при обучении и определить, насколько необходим синтез данной ДНК для формирования памяти. Исследование проводили на новорожденных цыплятах домашней курицы (Gallus gallus). В настоящее время цыплята широко используются для изучения механизмов консолидации и реорганизации памяти (Rose, 2000; Matsushima, 2003). Будучи зрелорождающимися животными, уже через несколько часов после вылупления цыплята готовы активно исследовать окружающую среду. В связи этим у новорожденных цыплят возможен широкий спектр различных видов обучения, таких как импринтинг, зрительная дискриминация пищевых объектов, пространственное обучение и пр. (Rose, 2000; Matsushima, 2003). Отсутствие у новорожденных цыплят индивидуального опыта позволяет предположить, что обучение в первые дни жизни должно вызывать в их мозге значительные пластические перестройки (Rose, 2000). Модели пассивного избегания и импринтинга в настоящее время активно используются для исследования механизмов долговременной пластичности (Rose, 2000; Horn, 2004). Системные и молекулярные механизмы зрительного импринтинга были детально исследованы в работах Хорна с соавторами (Хорн, 1988; Horn, 2004). Известные к настоящему моменту процессы, лежащие в основе молекулярных механизмов консолидации памяти, были подробно изучены на модели пассивного избегания у цыплят Роузом с соавторами (Rose, 2000) и другими исследователями (Andrew, 1991). Таким образом, одним из преимуществ использования новорожденных цыплят в исследованиях механизмов памяти является большое количество известных экспериментальных фактов о системных и молекулярных механизмах памяти у этих животных. Другим преимуществом использования цыплят в настоящей работе является то, что в первые дни жизни череп цыплят не оссифицирован, и это позволяет вводить им необходимые препараты непосредственно в мозг без имплантации канюль, анестезии и пр. Кроме того, незамкнутость гематоэнцефалического барьера у цыплят способствует быстрому проникновению в мозг препаратов, вводимых внутрибрюшинно (Rose, 2000). В работе использовали четыре принципиально различные модели обучения цыплят импринтинг, пространственное обучение в лабиринте, вкусовую аверсию 9 на бусину и пассивное избегание. В основе импринтинга, вкусовой аверсии и пассивного избегания лежит реализация врожденных предрасположенностей цыплят: в случае импринтинга это формирование реакции следования за матерью, в случае пассивного избегания и вкусовой аверсии используется врожденная склонность клевать небольшие яркие объекты. Эти виды обучения относятся к категории раннего обучения и возможны только в критический период первые 1-3 дня после рождения (Bolhuis, 1991; Barber et al., 1998; Rose 2000). В этом возрасте у цыплят наблюдается активный синтез ДНК в паренхиме конечного мозга, чувствительный к действию внешних факторов, в том числе обучения импринтингу и пассивному избеганию (Dermon et al., 2003, Nikolakopoulou et al., 2006; Комиссарова, Анохин, 2007). Как было показано ранее, оба вида обучения вызывают повышение числа содержащих BrdU клеток в различных структурах мозга цыплят уже через 24 ч после обучения. Вкусовая аверсия может быть выработана у цыплят на различные виды пищи (цветная бусинка, зерно, окрашенная вода и пр.) в разном возрасте (Gaston, 1977; Martin, Bellingham, 1979; Barber et al., 1998). В настоящей работе для выработки вкусовой аверсии у новорожденных цыплят использовали цветную бусину. Этот тип вкусовой аверсии также в определенной степени является «ранним» обучением, поскольку отсутствие неофобии и склонность клевать незнакомые объекты проявляется только у новорожденных цыплят. Вкусовая аверсия у цыплят исследована в меньшей степени, чем пассивное избегание и импринтинг, однако было показано, что у млекопитающих формирование памяти в этой модели может быть нарушено введением антиметаболита Ara-C (Wang et al., 2003). В отличие от других трех моделей обучения, пространственное обучение в лабиринте не относится к категории раннего обучения и возможно, начиная с 3-4 дня после рождения (Jakupi, Rickard, 2004). Таким образом, использование широкого спектра моделей обучения для исследования амнестических эффектов IdU, BrdU и ингибиторов синтеза ДНК позволяет определить, насколько универсален описанный ранее феномен нарушения памяти этими препаратами, и, следовательно, насколько универсален может быть ДНК-зависимый механизм формирования и поддержания долговременной памяти. 10

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Комиссарова, Наталья Викторовна

6. выводы

1. Установлено, что из четырех исследованных моделей обучения цыплят (импринтинг, пассивное избегание, вкусовая аверсия, обучение в лабиринте) введение нуклеотидного аналога 5'-йодо-2'-дезоксиуридина приводит к развитию амнезии только в модели вкусовой аверсии. Эти данные указывают на отличие механизмов консолидации памяти при вкусовой аверсии от механизмов формирования памяти в других моделях обучения. Показано, что вызванная 1сШ амнезия развивается более, чем через 6 ч после обучения, при этом память доступна для нарушения 1сШ в течение менее, чем 2 ч после обучения.

2. Показано, что при обучении цыплят в модели вкусовой аверсии амнестическим действием обладает внутрибрюшинное введение аналога 1сШ - 5'-бромо-2'-дезоксиуридина и субстратных ингибиторов синтеза ДНК З'-амино-З'-дезокситимидина и З'-азидо-З'-дезокситимидина, а также внутримозговое введение З'-азидо-З'-дезокситимидина. Эти данные указывают на необходимость синтеза ДНК для поддержания памяти при вкусовой аверсии, а также косвенно подтверждают, что амнестическое действие 5'-йодо-2'-дезоксиуридина связано с его включением в ДНК.

3. Установлено, что среди исследованных структур мозга цыпленка имеются области (промежуточный медиальный мезопаллиум - 1ММ), где обучение вкусовой аверсии индуцирует синтез ДНК, который может быть выявлен путем иммуногистохимического мечения ВгсШ через 2 ч после обучения. Через 24 ч после обучения повышенное включение ВгсШ, обнаруженное через 2 ч после обучения в промежуточном медиальном мезопаллиуме, нивелируется повышением включения ВгсШ у контрольных животных.

4. Показано, что в мозге цыплят имеются также структуры, где через 24 ч после обучения наблюдается снижение уровня включения ВгсШ - дорсальный гиперпаллиум и апикальный гиперпаллиум.

5. Полученные данные позволяют предположить, что для формирования долговременной памяти в модели вкусовой аверсии у цыплят требуется синтез ДНК непосредственно после обучения. Этот синтез, по-видимому, протекает в промежуточном медиальном мезопаллиуме - области мозга, критически необходимой для этого вида памяти.

5.5. Заключение

В настоящей работе на модели обучения цыплят вкусовой аверсии впервые была продемонстрирована индукция включения BrdU клетками промежуточного медиального мезопаллиума при обучении, которая, очевидно, обусловлена синтезом ДНК в этих клетках при обучении. Также было показано, что обнаруженный синтез ДНК критически необходим для поддержания долговременной памяти при вусовой аверсии, поскольку введение животным веществ, нарушающих синтез или транскрипцию/репликацию той ДНК, которая была детектирована при обучении, приводило к развитию амнезии.

Амнестические эффекты «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК были обнаружены только для модели вкусовой аверсии. Эти данные указывают на возможное принципиальное различие молекулярных механизмов формирования и хранения долговременной памяти при вкусовой аверсии от других исследованных моделей (импринтинг, пассивное избегание, обучение в лабиринте). Эта гипотеза также подтверждается отсутствием индукции синтеза ДНК при обучении в модели импринтинга.

В совокупности, амнестические эффекты 5'-йодо-2'-дезоксиуридина, 5'-бромо-2'-дезоксиуридина, З'-амино-З'-дезокситимидина и З'-азидо-З'-дезокситимидина предполагают, что для формирования памяти при вкусовой аверсии необходим синтез ДНК, который может представлять собой обратную транскрипцию определенных молекул РНК, кроме того, критической для поддержания памяти является транскрипция данной ДНК или её репликация.

В то же время, избирательная зависимость памяти в модели вкусовой аверсии от синтеза ДНК предполагает, что этот феномен не может лежать в основе универсального механизма формирования и хранения различных видов долговременной памяти.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комиссарова, Наталья Викторовна, Москва

1. Александров Ю.И. (2000). Психофизиология. Учебник для вузов, С.-Пб., «Питер».

2. Анохин К.В. (1992) "Ранние гены" в механизмах обучения и памяти. Автореферат дисс. на соискание ученой степени доктора мед. наук, НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН, Москва.

3. Анохин К.В. (1997) Молекулярные сценарии консолидации долговременной памяти. ЖВНД, 47: 261-279.

4. Анохин К.В., Белоцерковская H.A., Краевский A.A. (1988) Нарушение долговременной памяти у мышей под влиянием азидотимидина. Бюл. Экспер. Биол., 8: 144-145.

5. Анохин П.К. (1949) Узловые вопросы в изучении высшей нервной деятельности. В кн: Проблемы высшей нервной деятельности. М., с. 9-128.

6. Анохин П.К. (1968) Системогенез как общая закономерность развития мозга. В кн: Биология и нейрофизиология условного рефлекса. М., «Медицина», с. 76-109.

7. Ашапкин В.В., Романов Г.А., Тушмалова H.A., Ванюшин Б.Ф. (1981) Индукция синтеза ДНК в мозге крыс при обучении. Биол. науки, с. 30.

8. Ашапкин В.В., Романов Г.А., Тушмалова H.A., Ванюшин Б.Ф. (1983) Индуцированный обучением избирательный синтез ДНК в мозге крыс. Биохимия, т.48 (3), 355-362.

9. Белоцерковская H.A. (1991) Исследование навыка пассивного избегания у мышей при действии ингибиторов синтеза ДНК. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН, Москва.

10. Богомолова Е. М., Курочкин Ю. А. Системогенез поведенческих актов. Формирование функциональной системы приближения к матери. В кн: Теория системогенеза. М: «Горизонт», 1997, с. 303-310.

11. Ванюшин Б.Ф., Тушмалова H.A., Гуськова Л.В. (1974) Метилирование ДНК мозга как показатель участия генома в механизмах индивидуальной приобретенной памяти. Докл. АН СССР, т. 219, стр. 272.

12. Голубева, Е.Л. (1949) Развитие системных реакций у эмбрионов морских свинок. Рефераты научно-исследовательских работ. Медико-биологические науки. М., Изд-во АМН СССР, с. 28-31.

13. Голубева, E.Jl. и Шулейкина, К.В. (1966) Развитие двигательной активности плода человека. В: Очерки по физиологии плода и новорожденного, п/ред. В.И.Бодяжиной. М., Медицина, с. 54-77.

14. Гуськова Л.В., Бурцева H.H., Тушмалова H.A., Ванюшин Б.Ф. (1977) Уровень метилирования ДНК ядер нейронов и глии коры больших полушарий мозга крыс и его изменения при выработке условного рефлекса. Докл. АН СССР, 233(5): 993-996.

15. Комиссарова Н.В., Анохин К.В. (2007) Влияние процедуры импринтинга на клеточную пролиферацию в мозге цыпленка. ЖВНД, 57(2), 196-205.

16. Краевский А.Л., Куханова М.К. (1986) Репликация ДНК у эукариот. Итоги науки и техники. Молекулярная биология. Винити. - №22, стр. 3-132.

17. Радюшкин К.А., Анохин К.В. (1997) Восстановление памяти у цыплят, нарушенной при обучении: обратимость амнезии, вызываемой блокаторами синтеза белка. Русский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 83: 1118.

18. Судаков К.В. (1984) Общая теория функциональных систем. М., Медицина, с. 121-127.

19. Судаков К.В.(1987) Основные принципы общей теории функциональных систем. В: Функциональные системы организма. М., Медицина, с. 26-48.

20. Тинберген, Н. (1974) Мир серебристой чайки. М., Мир.

21. Третьяк Т.М., Виленчик М.М., Трепиловская О.Н., Тирас Н.Ф. (1976) Синтез ДНК в нервных клетках головного мозга крыс. Докл. АН СССР, 228 (3), 749751.

22. Тушмалова H.A. (1990) О новой мнемофункции ДНК мозга (дальнейшее развитие гипотезы). В сб.: Мозг и поведение. Наука. - Москва.

23. Хаютин С. Н., Дмитриева Л. П. (1991) Организация раннего видоспецифического поведения. М., Наука.

24. Хаютин, С.Н. (1983) Некоторые проблемы онтогенеза поведения. В: Теоретические проблемы современной биологии. Пущино, с. 58-78.

25. Хорн Г. Память, импринтинг и мозг. Исследование механизмов. Пер. с англ. -М.: Мир, 1988.

26. Шулейкина К. В. (1971) Системная организация пищевого поведения. М., Наука.27