Участие и защитная роль оксида азота в стрессовых реакциях растений яровой пшеницы на обезвоживание

Бояршинов, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие и защитная роль оксида азота в стрессовых реакциях растений яровой пшеницы на обезвоживание
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие и защитная роль оксида азота в стрессовых реакциях растений яровой пшеницы на обезвоживание"

0046162

Бояршинов Андрей Владимирович

УЧАСТИЕ И ЗАЩИТНАЯ РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В СТРЕССОВЫХ РЕАКЦИЯХ РАСТЕНИЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ НА ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

~ ^ ДЕ!{ 29^0

Уфа-2010

004616212

Работа выполнена в лаборатории регуляторов роста и устойчивости растений кафедры физиологии и биотехнологии растений Казанского (Приволжского) федерального университета

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Асафова Елена Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Пахомова Валентина Михайловна

доктор биологических наук, профессор Кудоярова Гюзель Радомесовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Марийский государственный университет»

Защита состоится « /и » декабря 2010 г. в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д.212.013.11 в ГОУ ВПО «Башкирский

государственный университет» по адресу: 450074, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32,

биологический факультет, ауд. 332.

Факс (347) 273-67-78; e-mail: disbiobsu@mail.ru

Официальный сайт БашГУ: http://www.bsunet.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет». Автореферат диссертации размещён на официальном сайте: http://www.bsunet.ru/node/386

Автореферат разослан

Учёный секретарь

диссертационного совета д.б.н.

Шарипова М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Засуха относится к одному из самых распространённых и критически значимых для растений неблагоприятных факторов окружающей среды, вызывающих резкое снижение продуктивности многих сельскохозяйственных культур (Шматько и др., 1989; Passioura, 2005). Одной из неспецифических реакций растений на недостаток воды является усиленное образование активных форм кислорода (АФК), что приводит к развитию окислительного стресса и перекисного окисления липидов - ПОЛ (Чиркова, 2001). Интенсивность окислительного стресса отражает эффективность работы антиоксидантных систем растительных клеток. Сравнение показателей окислительного стресса и активности антиоксидантных ферментов в условиях водного стресса может быть удобным диагностическим критерием для оценки устойчивости растений к засухе.

Начиная с 90-х гг. изучается сигнальная роль молекулы оксида азота (II) - NO. Раскрыты пути образования и сигналингаЖ) в клетках растений (Neill et al., 2008), показана его защитная роль в условиях биотического и абиотического стрессов (Durner et al., 1998; Zhao et al., 2004). Установлено, что стресс-протекторное действие NO на растения реализуется путем активации антиоксидантных ферментов и накопления низкомолекулярных антиоксидантов (Hung et al., 2002; Чжан и др., 2008). Однако по-прежнему существует очень мало сведений об участии NO, как сигнального соединения, в стрессовом ответе растений, в том числе сельскохозяйственных, на водный дефицит (Garci'a-Mata et al„ 2001). Также очень мало данных относительно эффектов экзогенных доноров NO на активность антиоксидантных ферментов в растениях в условиях водного стресса.

В настоящее время накапливается все больше фактов об NO-синтазном пути образования оксида азота в клетках микроорганизмов (Chen et al., 1994). Так, некоторые молочнокислые бактерии рода Lactobacillus способны продуцировать NO в ходе ферментативного окисления L-аргинина (Adawie et al., 1997; Morita et al., 1997; Яруллина и др., 2007). Правомерно предполагать, что микроорганизмы способны модулировать физиологическое состояние растений через синтез NO. Однако, в настоящее время отсутствуют сведения об участии NO-синтезирующих микроорганизмов во взаимоотношениях с растениями в условиях стресса.

Цель и задачи исследования. Целью работы было установить участие эндогенного оксида азота (N0) в стрессовых физиолого-биохимических реакциях растений яровой пшеницы (Triticam aestivum L.) на обезвоживание и оценить эффект экзогенного донора (SNP), а также биологического продуцента N0 {Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ) на устойчивость растений к водному стрессу.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику показателей водного статуса, содержания Н202 и малонового диальдегида (МДА), активности антиоксидантных ферментов и уровня оксида азота (N0) в отсеченных листьях при подсушивании и в листьях целых растений яровой пшеницы в условиях почвенной засухи;

2. Установить особенности изменения содержания эндогенного N0 и показателей окислительного стресса (Н202 и МДА) в растениях двух различающихся по устойчивости к засухе сортов яровой пшеницы при действии водного дефицита;

3. Оценить эффект экзогенного донора N0, нитропруссида натрия (SNP), на изменение водного статуса, ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов в отсечённых листьях пшеницы при обезвоживании;

4. Изучить сравнительное влияние предварительной обработки растений пшеницы бактериальной суспензией Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, биогенного продуцента оксида азота, и SNP на развитие окислительного стресса в листьях при последующем водном стрессе.

Научная новизна работы. Впервые показано быстрое и преходящее накопление оксида азота листьями пшеницы в ответ на обезвоживание и на последующую регидратацию, а также увеличение содержания N0 в листьях целых растений, перенёсших почвенную засуху. С использованием двух экспериментальных подходов (подсушивание отсечённых листьев и почвенная засуха), охарактеризована сравнительная чувствительность к обезвоживанию двух сортов яровой мягкой пшеницы разного географического происхождения, различающихся по устойчивости к засухе, и выявлены сортовые особенности динамики эндогенного N0. Установлен защитный эффект экзогенного донора N0 нитропруссида натрия на листья пшеницы при действии обезвоживания, который реализуется путём повышения водоудерживающей способности листьев и

усиления активности антиоксидантных ферментов. Впервые показано, что предобработка растений пшеницы молочнокислыми бактериями Lactobacillus plantarum оказывает сходный с SNP антистрессовый эффект, снижая интенсивность окислительного стресса в листьях при их последующем обезвоживании.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть учтены при выращивании пшеницы разных сортов в районах с засушливыми условиями. Перспективным способом повышения устойчивости к засухе может являться создание новых сортов пшеницы с повышенной продукцией эндогенного N0. Защитный эффект доноров "NO может быть основой для создания химических и биологических препаратов, повышающих устойчивость растений к дефициту влаги и другим абиотическим стрессорам. Материал диссертации может быть использован для чтения курса лекций по физиологии и стрессологии растений.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем. VI съезд Общества физиологов растений России», Сыктывкар, 1824 июня 2007 г.; на ежегодных отчётных конференциях КГУ, 2008-2010 г.; на Международной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)« Саранск, 15-18 мая 2008 г.; на Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», годичное собрание ОФР, 6-10 октября, 2008 г. -Екатеринбург; на 1-м Всероссийском симпозиуме студентов и аспирантов «Симбиоз-2008. Биология: традиции и инновации в XXI веке», Казань, 2008; на 14-й Зимней студенческой школе «Биология растительной клетки» г. Пущино, 2-6 февраля, 2009 г. (Пущино, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения», посвященной памяти Р.Г. Гареева, Казань, 26-27 февраля, 2009 (Казань, 2009); на 13-м ежегодном Симпозиуме студентов и аспирантов-биологов Европы «SymBioSE 2009. Biology: Expansion of Borders» Казань, 30 июля - 8 августа, 2009 (Kazan, 2009). По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения (в 4 главах), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 5 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 164 источников, из них 127 на иностранном языке.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований и схема опытов. Исследования проводили на разных сортах яровой мягкой пшеницы (ТгШсит аеШуит Ь.). Два из трёх сортов -Дебют и Закамская имеют местное происхождение (Татарстан) и обладают высокой засухоустойчивостью, один - Омская 33 - выведен в Западной Сибири и является среднезасухоустойчивым. Использовали 7-суточные растения, выращенные на водопроводной воде при 25/18°С и фотопериоде 12/12 ч. Для опыта брали средние части листьев, длиной 4 см, выдержанные после отсечения 1.5 ч в дистиллированной воде для устранения последствий раневого стресса. Обезвоживание создавали путём подсушивания разложенных на белой бумаге листьев в вегетационной камере «Биотрон-3» при I 26-28°С и освещении 5 клк в течение различных промежутков времени (от 5 мин до 3 ч). По окончании экспозиции часть листьев подвергали регидратации, помещая их в пробирки с дистиллированной водой. Влияние засухи на растения изучали методом почвенных культур. Наклюнувшиеся семена пшеницы высевали в сосуды, содержавшие серую лесную почву. Растения выращивали на фотопериоде 12/12 ч, при I 25/18°С, и освещённости 10 клк. В течение первых 10 сут все сосуды поливали водой до уровня 70% от полной влагоёмкости почвы (ПВП) (Сказкин и др., 1973). Засуху создавали прекращением полива опытных растений. В течение 3 сут влажность почвы в опытных сосудах опускалась до 30-25% от ПВП, на этом уровне её поддерживали ещё 5 дней. К концу засухи с растений отбирали усреднённые пробы листьев 1-го и 2-го ярусов для анализа физиологических и биохимических показателей. Оставшиеся опытные растения снова начинали поливать до 70% от ПВП и спустя 3 сут отбирали пробы листьев для анализа.

Для изучения эффектов донора N0 средние части листьев 7-суточных проростков пшеницы сорта Дебют подвергали вакуум-инфильтрации (15 мин)

растворами нитропруссида натрия (SNP) в концентрациях 25-500 мкМ или дистиллированной водой (контроль) и инкубировали 1 ч в этих же растворах в темноте. Затем промывали дважды дистиллированной водой, обсушивали фильтровальной бумагой и подвергали обезвоживанию.

Обработку целых проростков пшеницы молочнокислыми бактериями Lactobacillus plantarum и химическим донором N0 проводили путём погружения их корнями в суспензию бактерий (109 клеток/мл) или в раствор SNP (250 и 500 мкМ) на 1.5-2 ч. Использовали трижды отмытые от среды и ресуспендированные клетки Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, выделенные из препарата «Лактобактерин сухой» (ФГУП «Пермское НПО «Биомед»). Для роста бактерий использовали среду МРС (De Man-Rogosa-Sharpe) с добавлением или без добавления 100 мкМ L-аргинина - субстрата NOS-активности. После инкубации листья проростков срезали и подвергали обезвоживанию в течение 3 ч, как описано выше.

Определение ОСВ, оводнённости, водного дефицита и скорости потери воды в листьях. Относительное, общее содержание воды (оводнённость) и водный дефицит (ВД) в листьях находили по формулам:

ОСВ = (шсыр - mcyx)/(mTypr - тсух) • 100 %, Оводнённость = (шсыр - тсух)/тсыр • 100 %, ВД = ((тСЬф - тсух) - (т^рг - тсух))/(ттург - шсух) • 100 %, где Штурр - сырая масса листьев в состоянии тургора, гпСЬ1р - сырая масса листьев после завядания, шсух - сухая масса листьев. Для достижения листьями состояния тургора их выдерживали в воде: 2ч- после срезания 7-суточных проростков или около суток - после взятия проб с растений, выращенных в почве. Исходя из величин потери воды листьями в ходе подсушивания, рассчитывали скорость потери воды листьями (СПВ) по формуле:

СПВ = (Ш,-Ш2)/Ш,Л, где Ш) - исходная масса навески листьев, ш2 - масса листьев после периода подсушивания, t - время подсушивания в часах. СПВ выражали в г воды/г сырой массы*час (Гунес и др., 2008).

Определение количества Н202 в листьях проводили согласно Gay et al. (2000). 0.25 г листьев растирали в ледяном 50 мМ боратном буфере (рН 8.4), гомогенат центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин, супериатапт добавляли в

реакционную смесь, содержащую краситель Xylenol Orange, инкубировали 15-30 мин при комнатной температуре и замеряли оптическую плотность на спектрофотометре (СФ) при к=560 нм. Концентрацию Н202 находили по калибровочной кривой и выражали в мкмоль /грамм сухой массы.

Определение ПОЛ в листьях. Навеску листьев в 0.2 г растирали с 4 мл 0.1% (вес/объём) трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Гомогенат центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин. 1 мл супернатанта смешивали с 4 мл 20% ТХУ, содержащей 0.5% (вес/объём) 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Смесь помещали в водяную баню, нагретую до 95°С на 30 мин, затем охлаждали в ледяной бане и снова центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин. Оптическую плотность супернатанта замеряли на СФ при двух длинах волн: 532 и 600 нм. Содержание МДА в растительной ткани (мкмоль г/сухой массы) рассчитывали по формуле:

((Е532 - Е600) проба - (Е5з2 - Ебоо) холостой )/(е*сухая масса навески, г), где е - коэффициент молярной экстинкции МДА, равный 155 мМ~ 'см" 1 (Heath, Packer, 1968).

Определение содержания NO в листьях проводили согласно Zhou et al. (2005). 0.2 г листьев растирали с 5 мл охлаждённого 50 мМ ацетатного буфера (pH 3.6), содержащего 4% Zn(CH3C00)2*2H20. После центрифугирования 15 мин при 8000 об/мин и +4°С к супернатанту добавляли 0.1 г древесного угля, перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр. 1 мл фильтрата смешивали с 1 мл реактива Грисса, выдерживали при комнатной температуре 30 мин и замеряли оптическую плотность при А.=540 нм против воды. Количество NO рассчитывали по калибровочным растворам NaN02 в ацетатном буфере и выражали в мкмоль/г сухой массы листа.

Определение активности антиоксидянтных ферментов, 0.2 г листьев растирали при 4°С в 4 мл 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7.8), содержащем 0.1 мМ ЭДТА, 5% (вес/вес) поливинилпирролидона (PVP) и 10% (вес/объём) сорбита. Экстракт фильтровали через 2 слоя капроновой ткани и ц/ф при 8000 об/мин 30 мин. Содержание белка в ферментных экстрактах определяли по Лоури в модификации Харти (1977). Активность аскорбатпероксидазы (КФ 1.11.1.11.) определяли на СФ по снижению поглощения света реакционной смесью (>-=290 нм) при окислении аскорбата за 1 мин (Nacano, Asada, 1981) и выражали в мкмоль

окисленной аскорбиновой кислоты (е=2.8 мМ~'см~') на мг белка в мин. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по снижению поглощения света реакционной смесью за 2 минуты при 240 нм, вызванном разложением Н202 и выражали в мкмоль Н202 (е=39.4 мМГ'см'1) на мг белка в минуту. Полученные результаты обработаны статистически в программе Microsoft Exel, на графиках приведены средние значения и их стандартные ошибки, достоверность различий между средними оценена по критерию Стыодента при Р<0.05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Окислительный стресс и динамика уровня NO в листьях при обезвоживании. При завядании отсечённых листьев происходило снижение их общей оводнённости, ОСВ и нарастание водного дефицита (табл. 1). Наиболее быстрое падение водного статуса наблюдали после 1-го часа завядания. К 3 ч листья теряли около половины своей исходной сырой массы, а оводнённость, ОСВ и ВД составили 80.1, 51.6, и 48.5%, соответственно. После 1 ч регидратации все показатели возвращались к исходным значениям, что указывает на восстановление тканями листьев нормального водного статуса (табл. 1) и сохранение их жизнеспособности.

К 3 ч обезвоживания содержание Н202 и МДА в тканях листьев достигало своего максимума, превышая исходное значение в 2.7 и 1.25 раза, соответственно (рис. 1, а). После 1 ч регидратации уровень пероксида снижался до контрольного, в то время как содержание МДА достоверно не изменялось (рис. 1, а), что, вероятно, связано с его более медленной метаболизацией. Обнаружена тесная отрицательная корреляция между ОСВ и количеством Н202 в листьях: г^—0.91. Активность аскорбатпероксидазы (АПО) в ходе 3 ч обезвоживания снижалась на 50% относительно начального уровня и восстанавливалась при регидратации (рис. 1, б). Снижение активности АПО в нашем случае может объясняться уменьшением пула восстановленного аскорбата, что часто наблюдается при водном стрессе (Iturbe-Ormaetxe et al., 1998; Гунес и др., 2008). Активность каталазы (КАТ) при обезвоживании листьев сначала снижалась, а к 3 ч - частично восстанавливалась (рис. 1, б). Такой характер изменений может быть связан с фазностью адаптивного ответа листьев на стресс и изменением уровня Н202 -

Таблица 1. Изменение оводнённости, ОСВ и ВД листьев пшеницы (с. Дебют) при обезвоживании и регидратации

Время, ч Оводнённость, % от сырой массы ОСВ, % вд,%

Завядание

0 85.1 ±0.3 96.1 ±0.6 3.9 ±0.3

1 84.8 ± 0.6 70.3 ± 1.0 29.3 ±0.7

2 82.2 ±0.6 61.4 ± 1.1 38.0 ±0.9

3 80.1 ±0.9 51.6 ± 1.0 48.5 ± 1.1

Регидратация

1 84.7 ± 0.4 97.8 ±0.6 2.4 ±0.5

2 84.7 ±0.4 97.6 ± 0.9 1.6 ±0.5

3 84.2 ± 0.4 99.6 ±0.5 2.0 ±0.1

Завядание, ч Регидратация, ч

Рис. 1. Динамика (а): уровня Н202 (график) и МДА (столбики) и (б): активности АПО (1) и КАТ (2) в листьях пшеницы (с. Дебют) при обезвоживании и регидратации. * - различия с контролем (0 ч) достоверны при Р<0,05.

субстрата каталазы (Bai et al., 2009). Подавление активности обоих антиоксидантных ферментов указывает на ослабление системы антиоксидантной защиты, вызванное обезвоживанием.

В ответ- как на обезвоживание, так и на последующую регидратацию в листьях пшеницы происходило кратковременное накопление N0. Повышение

уровня оксида азота было зафиксировано уже через 15 мин обезвоживания, и в последующем он возрастал в несколько раз (рис. 2, б). Пик увеличения - в 1.9 раза - приходился на 1-й и 2-й ч завядания и регидратации (рис. 2, а). Снижение ОСВ в листьях по времени предшествовало подъёму уровня N0, а коэффициент корреляции (-0.71) указывает на обратную связь между этими показателями и предполагает, что потеря воды является причиной увеличения содержания эндогенного N0.

Завядание, ч Регидратации, ч

10 20 30 40 50 60 Завядание, мин

Рис. 2. Динамика уровня N0 в листьях пшеницы (с. Дебют) при завядании и регидратации (а) и в ходе 1-го часа завядания (б): 1 - содержание N0, 2 - ОСВ.

2.2. Сортовые особенности стрессовых реакций листьев яровой пшеницы на обезвоживание. В свете полученных данных о накоплении N0 в листьях пшеницы при изменении их водного статуса представляло интерес выяснить, обладает ли динамика эндогенного N0 сортовой спецификой. Для этого исследовали изменение показателей водного статуса, окислительного стресса и динамику уровня N0 в листьях растений пшеницы двух сортов, различающихся по устойчивости к засухе (Омская 33 и Закамская). За 3 ч завядания листья пшеницы с. Омская 33 испытывали большее снижение общего и относительного содержания воды, чем листья с. Закамская (рис. 3). Как видно из рис. 4, за 1-й час стресса листья пшеницы с. Закамская испаряли 0.251 г воды/г сырой массы листа, а с. Омская 33 - 0.279 г воды/г сырой массы. По мере обезвоживания скорость водопотери существенно падала, но достоверные различия между сортами сохранялись и средняя СПВ, рассчитанная за 3 часа

эксперимента, у с. Закамская составила 0.188 г воды/г сырой массы*час, у Омской 33 -г 0.213 г воды/г сырой массы*час (рис. 4). Таким образом, листья с. Закамская обладали большей водоудерживающей способностью в сравнении со среднезасухоустойчивым сортом Омская 33.

ñ 90 rl 2 (а) 8 ГЯ1

S а

|S5

£ 80

S 75

s« 70

* m

¡£

105 ri 2 (6) 90 -H

g 60

Зшядание, ч

Регидратация, ч

Завядание.ч

Регидратация, ч

Рис. 3. Динамика общего (а) и относительного (б) содержания воды в листьях яровой пшеницы двух сортов при завядании и регидратации: 1 - Омская 33, 2 -Закамская; * - различия между сортами достоверны при Р<0.05

я о

"а

Ш g

0,3 0,25

g 0,2

0,15

0,1

1 2 3

Время завядания, ч

Рис. 4. Изменение скорости потери воды (СПВ) изолированными листьями в ходе завядания. 1 -Омская 33, 2 - Закамская; * - различия между сортами достоверны при Р<0.05

В первые 2 ч стресса между сортами не было выявлено достоверных различий в количестве накапливаемого Н202, а к 3 ч его уровень в листьях Омской 33 возрастал в 3.5 раз, а у с. Закамская - в 1.9 раз от исходного. При этом количество Н202 в листьях с. Омская 33 становилось выше, чем у с. Закамская в 2 раза (рис. 5). Большее накопление Н202 предполагает более интенсивное развитие

ПОЛ в клетках растений (Гунес и др., 2008; Холодова и др., 2007), однако после 3 ч стресса различия в содержании МДА между сортами были недостоверны (табл. 2). Полученные результаты указывают на большую чувствительность к обезвоживанию листьев пшеницы с. Омская 33, что проявилось в более интенсивном накоплении ими Н2О2, на фоне тенденции к большему уровню ПОЛ.

100 г

« к

'§ 70 х

■и

£ 40 .а

с; о

Завядание, ч

Регидратация, ч

Рис. 5. Динамика содержания Н202 в листьях при завядании и регидратации. 1 - Омская 33, 2 - Закамская; * -различия между сортами достоверны при Р<0.05

Таблица 2. Количество МДА в листьях пшеницы двух сортов в норме (контроль) и при обезвоживании (3 ч).

Вариант Омская 33 Закамская

мкмоль/г сухой массы %от контроля мкмоль/г сухой массы %от контроля

Контроль 17.5 ±0.6 100 18.0 ±0.4 100

Завядание 21.3 ±0.7 121.8 20.6 ±0.2 114.9

2.3. Динамика эндогенного N0 в листьях двух сортов пшеницы при обезвоживании. К 1 ч обезвоживания количест во N0 в листьях с. Омская 33 и с. Закамская возрастало в 2.6 и 2.1 раза, соответственно. Повышенный уровень N0 сохранялся ко 2-му часу обезвоживания, хотя в листьях с. Омская 33 уже начинался его спад. К 3 ч стресса содержание оксида азота возвращалось к своему начальному уровню в листьях обоих сортов. Такой же преходящий подъём уровня N0 наблюдали на 1 и 2 ч регидратации листьев (рис. 6, а). Можно заметить, что пик накопления N0 в листьях с. Закамкая приходился на 1-й и 2-й ч завядания, в

10 20 30 40 50 Завядание, ч Регидратация.ч Завядание, мин

Рис. 6. Динамика уровня N0 в листьях пшеницы сортов Омская 33 (1) и Закамская (2) при обезвоживании и регвдратации (а) и в ходе 1-го часа заввдания (б); * - различия между сортами достоверны при Р<0.05.

то время как у Омской 33 - только на 1 ч (Р<0.05). По нашему мнению, такие различия могли быть обусловлены разной скоростью потери воды листьями. Из рис. 6(6) видно, что листья пшеницы с. Омская 33 быстрее теряли воду в ходе 5 и 10 мин завядания - снижение ОСВ составило 21.2 и 25.5%, а в листьях Закамской 14.4 и 17.8%, соответственно. Возрастание уровня N0 в листьях Омской 33 происходило после 45 мин, а в листьях пшеницы с. Закамская только к 60 мин обезвоживания (рис. 6, б). Следовательно, в листьях с. Омская 33 аккумуляция N0 начиналась раньше, чем в листьях с. Закамская. Известно, что активация сигнальных систем в ответ на обезвоживание происходит через активацию мембранносвязанного осмосенсора, отслеживающего силу натяжения плазматической мембраны клетки (Тге\уауаз е1 а1., 2000; цит. по Алёхина и др., 2007). Поэтому более быстрая потеря воды и тургора листьями с. Омская 33 может приводить к более раннему "включению" Ш-сигнальной системы в сравнении с листьями с. Закамская.

2.4. Влияние почвенной засухи и последующего полива на водный статус, ПОЛ и содержание N0 в растениях пшеницы двух сортов. Через 5 сут почвенной засухи уменьшение общего содержания воды в листьях Омской 33 и

Закамской составило 11.2% и 6.7%, ОСВ - 43 и 34%, а ВД возрастал в 13.4 и в 10.7 раз, соответственно. Следовательно, более благоприятный водный режим при действии почвенной засухи, как и при обезвоживании отсечённых листьев, сохраняли растения пшеницы засухоустойчивого сорта Закамская. После возобновления полива значения изучаемых параметров водного статуса возвращались к уровню контроля (табл. 3). В условиях засухи уровень МДА в листьях Омской 33 был на 29% выше, чем у Закамской (рис. 7, а). Вместе с тем засуха не изменяла уровень ПОЛ относительно контроля ни у одного из сортов, что может быть следствием метаболической адаптации растений к условиям длительного обезвоживания (Ьо£®Ы е1 а1., 1999). Полученные результаты указывают, что растения пшеницы с. Закамская испытывали меньшие окислительные повреждения мембранных липидов в сравнении с растениями с. Омская 33 в условиях почвенной засухи.

Таблица 3. Оводнённость, относительное содержание (ОСВ) воды и водный дефицит (ВД) в растениях яровой пшеницы двух сортов в норме (контроль), при действии почвенной засухи и после возобновления полива.

Засуха Оводнённость, % ОСВ, % вд,%

Омская 33 Закамская Омская 33 Закамская Омская 33 Закамская

Контроль 86.1 ±0.3 87.0 ±0.1 96.7 ± 0.3 96.7 ±0.3 3.5 ± 0.3 3.5 ±0.3

Опыт 76.9*± 0.9 81.6 ±0.8 53.2*± 2.1 62.5 ±3.1 46.8*± 2.4 37.5 ± 2.7

Полив Омская 33 Закамская Омская 33 Закамская Омская 33 Закамская

Контроль 86.1 ±1.1 87.3 ± 0.6 95.5 ± 0.8 95.6 ± 0.4 4.7 ± 0.5 5.3 ±0.4

Опыт 87.1 ±0.4 87.6 ± 0.2 95.5 ±0.5 94.2 ±1.3 4.9 ±0.2 4.8 ±0.2

* - различия между сортами достоверны при Р<0.05

В контроле содержание N0 в листьях пшеницы с. Закамская было на 26% выше, чем у с. Омская 33 (рис. 7, б). Под влиянием засухи количество N0 в растениях не изменялось, что может быть объяснено его фазной динамикой, а различия между сортами по этому показателю не выявлены. После возобновления полива у обоих изучаемых сортов происходило увеличение содержания N0 в листьях на 30-31% по сравнению с контролем (рис. 7, б). Более высокий уровень

контроль опыт контроль опьгт контроль опыт контроль опыт

Засуха Полив Засуха Полив

Рис. 7. Содержание МДА и N0 в листьях яровой пшеницы при засухе и регидратации (полив). 1 - Омская 33, 2 - Закамская; * - различия между сортами достоверны при Р<0.05

N0 (на 21-22%) был в растениях с. Закамская как в контрольном, так и в опытном вариантах. Принимая во внимание тот факт, что испытавшие засуху растения приобретают повышенную устойчивость к её последующему воздействию (Саглам и др., 2008; Kosma et al., 2009), правомерно предположить, что эндогенный N0 принимает участие в формировании индуцированной устойчивости растений пшеницы к засухе и водному дефициту.

2.4. Влияние донора NO на физиолого-биохимические реакции листьев пшеницы на обезвоживание. Инфильтрация листьев пшеницы (с. Дебют) донором N0 приводила к увеличению их водоудерживающей способности (рис. 8, а). Наибольший эффект оказывали 100 и 250 мкМ SNP, сдерживающие снижение ОСВ после 3 ч завядания на 12 и 17%, соответственно. Данный эффект SNP обусловлен NO-индуцированным закрытием устьиц и снижением транспирации (Garci 'a-Mata, Lamattina, 2001). Вместе с тем, высокие концентрации донора (500 и 1000 мкМ) не влияли на потерю воды листьями, что могло быть следствием ингибирования закрывания устьиц этими дозами нитропруссида (Neill et al., 2008). Инфильтрация SNP приводила к заметному снижению аккумуляции МДА при последующем обезвоживании. Так, после 3 ч стресса в листьях контрольного

со и О

(а)

* й

100 250 500 1000

БМР (мкМ) + завядание (3 ч)

(б) Г

б Й

^N Р (мкМ) + завяданис (3 ч)

Рис. 8. Влияние 8ЫР на ОСВ (а) и ПОЛ (б) в листьях яровой пшеницы (с. Дебют) после 3 ч завядания; * - различия с контролем (точка "О") достоверны при Р<0.05. Буквы - различия между вариантами достоверны при Р<0.05.

варианта (вода) содержание МДА возрастало на 37%, а в листьях, инфильтрированных (25-250 мкМ) - на 11-24% (рис. 8, б). Наиболее

эффективной была концентрация 50 мкМ. Одной из причин сдерживания ПОЛ могла быть ИО-индуцированная активация антиоксида нтных ферментов. В ответ на обезвоживание в листьях контрольного варианта происходило снижение активности АПО, а в листьях, обработанных 50-250 мкМ активность

§60

(а) б Г*1

Ю £

А 2 ж

ай Ж

(б)

-V

«Р

SNP (мкМ) + завядание(3 ч)

ч-0

ЭЫР (мкМ) + завядание(3 ч)

Рис. 9. Влияние донора N0 на изменение активности аскорбатпероксидазы (а) и катапазы (б) в листьях пшеницы (с. Дебют) после 3 ч обезвоживания.

фермента возрастала или оставалась неизменной (рис. 9, а). Сходным образом менялась активность каталазы, которая снижалась в ответ на обезвоживание, а при обработке 50,100 и 250 мкМ возрастала на 35, 25 и 42%, соответственно (рис. 9, б). Полученные данные подтверждают, что антиоксидантный эффект донора N0 на листья пшеницы при обезвоживании мог быть следствием усиления активности ферментов антиоксидантной защиты.

2.5. Влияние на содержание N0 в листьях пшеницы при

обезвоживании. Известно, что эффекты экзогенных доноров N0 на растения достигаются путём повышения уровня окиси азота в самих растительных тканях а а1., 2004; Ни й а1., 2005). Увеличение содержания N0 в листьях пшеницы происходило после инфильтрации их всеми исследуемыми концентрациями особенно 250 мкМ (рис. 10, а). Изучение временной динамики N0 показало, что в листьях, инфильтрированных водой, незначительный подъём уровня N0 происходил через 30 мин и 3 ч завядания. Обработка 50 мкМ 5№ достоверно повышала как начальный уровень N0 в листьях - в 1.3 раза, так и через 15 и 30 мин обезвоживания - в 2.1 и 1.4 раза. Можно заключить, что донор оксида азота кратковременно увеличивает количество N0 в тканях листьев, что сопряжено с запуском защитно-приспособительных механизмов клеток и тканей.

0,5

и « 0,4

>х

К 0,3

О X 0,2

1 0,1

1 £

(а)

о 2

Вода

50 100 икМвИР

250

60 90 120 150 Завядание, мин

180

Рис. 10. (а): влияние 5ЫР на содержание N0 в листьях пшеницы до и после 1 ч обезвоживания: 1 - до завядания (контроль), 2 - после 1 ч завядания; (б): динамика N0 в листьях в ходе обезвоживания: 1 - вода (контроль), 2 - БЫР, 50 мкМ;* - различия с контролем (вода) достоверны при Р<0.05.

2.6. Эффект бактериальной суспензии Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, как потенциального источника NO, на развитие окислительного стресса и активность антиоксидантных ферментов в листьях при обезвоживании.

("2А

з 80

>1 60

(а')

mkMSNP 500

-(б)

* 2

гЗ

_ 35

л §

5 28

IS о

6 21 U

3 14 л

^ п

о 7

(б'),

Контроль L. plantarum L. plantarum 0 250 500

+ Apr мкМ SNP

Рис. 11. Эффект Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ (а-в) и SNP (а'-в') уровень Н202 (а, а'), МДА (б, б') и активность КАТ (в, в*) в листьях пшеницы: 1 - без стресса (контроль); 2 - обезвоживание, 3 ч; * - различия с контролем (без стресса) достоверны при Р<0.05.

Предварительная обработка проростков пшеницы суспензией Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, а также 250 и 500 мкМ SNP приводили к снижению накопления Н202 и МДА в листьях при их последующем обезвоживании (рис. 11, а, а', б, б')-При этом активность каталазы под действием бактерий, выращенных с добавлением L-аргинина и без него, возрастала на 18 и 37%, соответственно, а при действии SNP она оставалась неизменной (рис. 11, в, в'). Полученные данные позволяют заключить, что обработка проростков пшеницы суспензией лактобацилл оказывала защитное действие на растения в условиях последующего водного, стресса, что по ряду показателей (Н202 и МДА) было сходно с действием химического донора N0. Однако для выяснения вклада NO бактериального происхождения в защитный эффект L. plantarum на растения необходимы дополнительные исследования с применением ингибиторов NO-сигнальной системы.

ВЫВОДЫ

1. Обезвоживание листьев яровой пшеницы сопровождается накоплением Н202 и МДА, фазным изменением активности АПО и КАТ, что свидетельствует о развитии окислительного стресса.

2. Впервые показано, что в ходе нарастающего обезвоживания и последующей регидратации в листьях пшеницы происходит быстрое и кратковременное накопление эндогенного оксида азота (NO). Это указывает на активацию NO-сигнальной системы в ответ на изменение водного статуса тканей листа.

3. Более быстрая потеря воды листьями среднезасухоустойчивого сорта пшеницы Омская 33 в сравнении с листьями сорта Закамская при завядании соответствует более раннему подъёму уровня NO в них, что может отражать различия в метаболической чувствительности растений разных сортов к действию водного стресса.

4. Растения яровой пшеницы в период восстановления водоснабжения после действия почвенной засухи характеризуются повышенным содержанием NO в листьях.

5. Экзогенный донор NO - нитропруссид натрия (SNP) - в микромолярных концентрациях (50-250 мкМ) снижает потерю воды, накопление МДА и усиливает

активность аскорбатпероксидазы и каталазы в листьях пшеницы при обезвоживании, что сопряжено с непродолжительным повышением содержания оксида азота и указывает на его защитное значение.

6. Впервые показано, что обработка проростков яровой пшеницы суспензионной культурой молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ - продуцентов NO - сдерживает накопление Н202, развитие ПОЛ и повышает активность каталазы в листьях при последующем водном стрессе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, включённых ВАК МОН РФ в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий»

1. Бояршинов, А.В. Цитоскелет-зависимые эффекты нитропруссида натрия на активность аскорбатпероксидазы и содержание Н202 в корнях пшеницы /А.В. Бояршинов, Е.В. Асафова, Ю.Е. Картунова // Учёные записки Казанского государственного университета. - 2008. - Т.150. - С.91-100.

2. Бояршинов, А.В. Физиолого-биохимические реакции растений яровой пшеницы на засуху и обезвоживание /А.В. Бояршинов, Е.В. Асафова., З.С. Боброва // Вестник КГАУ. - 2009. - Т. 14, № 4. - С. 135-138.

3. Бояршинов, А.В. Окислительный стресс и образование оксида азота (NO) в листьях яровой пшеницы при обезвоживании / А.В. Бояршинов, Ю.Е. Картунова, Е.В. Асафова // Учёные записки Казанского государственного университета. -2010.-Т. 152, кн.2. -С.78-86.

Публикации в сборниках и материалах всероссийских и международных

конференций

1. Бояршинов, А.В. Изменение содержания воды и уровня Н202 в листьях яровой пшеницы при завядании / А.В. Бояршинов, Е.В. Асафова // Физиология растений: становление, развитие, перспективы. - Казань: Изд-во КГУ, 2007 -С.141-145.

2. Бояршинов, А.В. Физиолого-биохимические ответы листьев трёх сортов яровой пшеницы на обезвоживание / А.В. Бояршинов, Ю.Е. Картунова, З.С.

Боброва // Биология: традиции и инновации в XXI веке. - Казань: Изд-во КГУ, 2008. - С.23-26.

3. Картунова, Ю.Е. Продукция перокеида водорода в растениях пшеницы в условиях стресса / Ю.Е. Картунова, А.В. Бояршинов, Е.В. Асафова // Биология: традиции и инновации в XXI веке. - Казань: Изд-во Казанск. Гос. Ун-та, 2008. -С.55-57.

4. Бояршинов, А.В. Окислительный стресс и продукция оксида азота в листьях яровой пшеницы при обезвоживании / А.В. Бояршинов, Ю.Е. Картунова, З.С. Боброва, Е.В. Асафова // Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных, посвященной памяти Р.Г. Гареева, Казань, 26-27 февр., 2009. - Казань: Фолиантъ, 2009. - С. 178-181.

5. Бояршинов, А.В. Участие NO в стрессовых ответах листьев яровой пшеницы на обезвоживание / А.В. Бояршинов, Ю.Е. Картунова, З.С. Боброва, Е.В. Асафова // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая 2009 г., Пермь) -Пермь, 2009 - С.92-94.

6. Картунова, Ю.Е. Окислительный стресс в растениях яровой пшеницы: значение Lactobacillus plantarum / Ю.Е. Картунова, А.В. Бояршинов, О.А. Смоленцева, К.Р. Мамедзаде, Д.Р. Яруллина, Е.В. Асафова // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая 2009 г.) - Пермь, 2009 - С.32-34.

7. Асафова, Е.В. Влияние абиогенного и биогенного NO на развитие окислительного стресса в растениях пшеницы / Е.В. Асафова, Ю.Е. Картунова, А.В. Бояршинов // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды: Материалы Всероссийской научной конференции, 24-28 августа 2009 г. - Иркутск. - С.33-36.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Казанского университета Тираж 100 экз. Заказ 81/11

420008, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел.: (843) 233-73-59, 292-65-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бояршинов, Андрей Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Окислительный стресс и антиоксидантные системы растительных клеток.

1.2. Антиоксидантные системы как компонент устойчивости растений к водному дефициту.

1.3. Оксид азота как эндогенный модулятор устойчивости растений.

1.3.1. Физиологическая роль N0 в растениях.

1.3.2. Оксид азота и устойчивость растений к водному дефициту.:.

1.3.3. Оксид азота и окислительный стресс и антиоксидантная защита в клетках растений.;.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований и схема опытов.

2.1.1. Характеристика исследуемых сортов яровой пшеницы.'.

2.1.2. Обезвоживание отсечённых листьев растений пшеницы.

2.1.3. Создание почвенной засухи для растений пшеницы.

2.1.4. Обработка отсечённых листьев и целых растений пшеницы донором NO (SNP) и бактериальной суспензией Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ.

2.2. Методы исследований.!.!.

2.2.1. Определение ОСВ, оводнённости, водного дефицита и интенсивности транспирации в листьях.'.

2.2.2. Определение содержания Н202 в листьях.

2.2.3. Определение содержания МДА в листьях.

2.2.4. Определение содержания N0 в листьях пшеницы.

2.2.5. Определение активности антиоксидантных ферментов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Физиолого-биохимические реакции листьев яровой пшеницы на обезвоживание и почвенную засуху.

3.1.1. Изменение водного статуса.

3.1.2. Содержание Н2О2 и МДА в листьях.

3.1.3. Динамика активности аскорбатпероксидазы и каталазы и в листьях.

3.1.4. Содержание эндогенного N0 в листьях.

3.2. Сортовые особенности физиолого-биохимических реакций листьев яровой пшеницы на водный стресс.

3.2.1. Динамика водного статуса и уровня N0 в листьях пшеницы двух сортов при завядании и регидратации.

3.2.2. Динамика уровня эндогенного N0 в листьях пшеницы при обезвоживании и регидратации.

3.2.3. Динамика содержания Н2О2 и МДА в отсечённых листьях двух сортов яровой пшеницы при завядании.

3.2.4. Физиолого-биохимические реакции растений яровой пшеницы двух сортов на почвенную засуху.

3.2.4.1. Влияние засухи на водный статус растений пшеницы.

3.2.4.2. ПОЛ в растениях пшеницы при действии засухи.

3.2.4.3. Активность АПО и КАТ в растениях пшеницы при действии засухи.

3.2.4.4. Содержание N0 в листьях пшеницы в условиях почвенной засухи.

3.3. Влияние экзогенного донора N0 на физиолого-биохимические реакции листьев пшеницы на обезвоживание.

3.3.1. Влияние донора N0 на ОСВ в листьях пшеницы (с. Дебют) после завядания.

3.3.2. Влияние БМ5 на ПОЛ в листьях пшеницы при обезвоживании.

3.3.3. Влияние БЫР на активность АПО и КАТ в листьях пшеницы при обезвоживании.

3.3.4. Влияние БКР на содержание эндогенного N0 в листьях пшеницы при обезвоживании (с. Дебют).

3.4. Сравнительный эффект предобработки растений пшеницы бактериальной суспензией Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ и SNP на развитие окислительного стресса и активность антиоксидантных ферментов в листьях при обезвоживании.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие и защитная роль оксида азота в стрессовых реакциях растений яровой пшеницы на обезвоживание"

Засуха относится к одному из самых распространённых и критически значимых для сельскохозяйственных растений неблагоприятных факторов окружающей среды (Шматько и др., 1989; Passioura, 2005). К настоящему времени в связи с тенденцией к потеплению климата эта проблема приобретает особую актуальность. Уже к концу прошлого века около одной трети пахотных земель в мире недостаточно или неравномерно обеспечивались влагой вследствие частых и длительных засух, сопровождающихся высокой температурой и низкой относительной влажностью воздуха и интенсивными суховеями. В этих условиях усиленная транспирация воды надземной частью растений не восполняется поглощением её из почвы корнями. Дисбаланс между отдачей и поглощением воды приводит к развитию избыточного водного дефицита в растительных тканях. В отдельные годы засухи вызывают резкое снижение продуктивности зерновых и других сельскохозяйственных культур (Шматько и др., 1989).

Известно, что на абиотические стрессоры растения реагируют стереотипно, включая общие (неспецифические) защитные механизмы, которые объединяют под названием неспецифический адаптационный синдром или стресс (Селье, 1972; Пахомова, 2000). Одной из таких неспецифических реакций является усиленное образование активных форм кислорода (АФК), что приводит к развитию окислительного стресса (Чиркова, 2001; Тарчевский, 2002). Накопление АФК способствует возникновению каскада свободно-радикальных реакций, вызывающих повреждения биомакромолекул (белков, ДНК) и внутриклеточных стуруктур (Nakano et al., 1981; Dirk et al., 1995; Mittler et al., 2002; Scandalios et al., 2002; Чиркова, 2002). Вместе с тем в низких концентрациях АФК выступают в качестве сигнальных молекул, контролирующих регуляторные механизмы растительных клеток. Так, Н2О2 усиливает активность протеинкиназ и индуцирует экспрессию генов, включающих медленные защитные реакции в клетках растений (Мерзляк, 1999; Neill et al., 2002).

Начиная с 90-х гг. наряду с АФК интенсивно изучается роль другой сигнальной молекулы - оксида азота (II) - NO. Образование растениями оксида азота в ответ на стресс было обнаружено задолго до того, как начали активно исследовать его физиологические эффекты (Klepper, 1975, 1978). К настоящему времени раскрыты основные механизмы образования NO в клетках растений (Neill et al., 2008), установлены сигнальные каскады, в которых он участвует (Durner et al., 1998; Delledone et al., 1998; Modolo et al., 2002; Hu et al., 2005) и показана его защитная роль при ряде биотических и абиотических стрессов (Durner et al., 1998; Zhao et al., 2004; Чжан и др., 2008). Установлено, что стресс-протекторное действие экзогенных доноров NO на растения реализуется путем активации антиоксидантных ферментов и накопления низкомолекулярных антиоксидантов (Hung et al., 2002; Чжан и др., 2008), а также за счет усиления экспрессии защитных генов и синтеза стрессовых белков (Durner et al., 1998; Garci'a-Mata et al., 2001). Однако по-прежнему существует очень мало сведений об участии и роли NO как сигнального соединения в стрессовых реакциях сельскохозяйственных растений, в частности яровой пшеницы, на засуху и водный дефицит (Garci'a-Mata et al., 2001).

К настоящему моменту накапливается все больше фактов об NO-синтазном пути образования оксида азота в клетках микроорганизмов (Chen et al., 1994). Установлено, что некоторые молочнокислые бактерии рода Lactobacillus — симбионты высших растений - способны продуцировать NO в ходе ферментативного окисления L-аргинина (Adawie et al., 1997; Morita et al., 1997; Яруллина и др., 2007; Яруллина, Ильинская, 2007). Есть сведения, что ассоциативные бактерии играют важную роль в NO-зависимых процессах роста и развития растений, в частности, при корнеобразовании (Creus et al., 2005). Таким образом, можно предполагать, что микроорганизмы через синтез NO способны модулировать физиологическое состояние растений.

Использование бактерий, стимулирующих рост растений, открывает большие перспективы при возделывании сельскохозяйственных культур. В то же время отсутствуют сведения об участии NO-синтезирующих микроорганизмов во взаимоотношениях с растениями в условиях стресса. Цель работы:

Установить участие эндогенного оксида азота (NO) в стрессовых физиолого-биохимических реакциях растений яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) на обезвоживание и оценить эффект экзогенного донора (SNP) и биологического продуцента {Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ) NO на устойчивость растений к водному стрессу. Задачи:

1. Исследовать динамику общего и относительного содержания воды, Н2Ог и МДА, активности антиоксидантных ферментов и уровня оксида азота (NO) в отсечённых листьях при подсушивании и в листьях целых растений яровой пшеницы в условиях почвенной засухи;

2. Установить особенности изменения содержания эндогенного NO и показателей окислительного стресса (Н2Ог и МДА) в растениях двух различающихся по засухоустойчивости сортов яровой пшеницы при действии водного дефицита;

3. Оценить эффект экзогенного донора NO, нитропруссида натрия (SNP), на изменение водного статуса, интенсивность ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в отсечённых листьях пшеницы при обезвоживании;

Научная новизна работы. Впервые показано быстрое и преходящее накопление оксида азота в листьях пшеницы в ответ на обезвоживание и на последующую регидратацию, что может указывать на участие молекулы NO в восприятии и передаче сигнала об изменении водного статуса в клетках и тканях растений, и, следовательно, в процессах адаптации растений к водному стрессу. Установлено увеличение содержания NO в листьях целых растений, перенёсших почвенную засуху, после восстановления водоснабжения, что, вероятно, может иметь адаптивное значение.

С использованием двух экпериментальных подходов (подсушивания отсечённых листьев на воздухе и действия почвенной засухи на целые растения) охарактеризована сравнительная чувствительность к водному стрессу растений двух перспективных для сельского хозяйства РТ сортов яровой мягкой пшеницы (Омская 33 и Закамская). Выявлены особенности динамики содержания эндогенного NO в листьях растений пшеницы разного географического происхождения (сорта Омская 33 и Закамская) при нарастающем обезвоживании, что предполагает участие NO-сигнальной ситемы в реализации сортоспецифических реакций растений пшеницы на водный стресс.

Установлен защитный (антистрессовый) эффект экзогенного донора N0 нитропруссида натрия (SNP) на растения яровой пшеницы при действии обезвоживания. Показано, что данный эффект реализуется через повышение водоудерживающей способности листьев и усиление активности антиоксидантных ферментов, что ведёт к снижению интенсивности окислительных повреждений мембран. Впервые показано, что обработка суспензией молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum повышает устойчивость растений пшеницы к водному стрессу в результате сдерживания накопления Н2О2 и развития ПОЛ.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть учтены при выращивании яровой пшеницы исследованных сортов в регионах и участках с засушливыми условиями. Перспективным способом повышения неспецифической устойчивости к засухе может являться создание новых сортов пшеницы с повышенной продукцией эндогенного NO. Защитный эффект экзогенных доноров NO может быть основой для создания N0высвобождающих препаратов для повышения устойчивости растений к дефициту влаги и другим абиотическим стресс-факторам. Материал диссертационного исследования может быть использован для чтения курса лекций по физиологии и стрессологии растений.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем. VI съезд Общества физиологов растений России», Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.; на ежегодных отчётных конференциях КГУ, 2008-2010 г.; на Международной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» Саранск, 15-18 мая 2008 г.; на Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», годичное собрание ОФР, 6-10 октября, 2008 г., Екатеринбург; на 1-м Всероссийском симпозиуме студентов и аспирантов «Симбиоз-2008. Биология: традиции и инновации в XXI веке», Казань, 2008; на 14-й Зимней студенческой школе «Биология растительной клетки» г. Пущино, 2-6 февраля, 2009 г.; на Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения», посвящённой памяти Р.Г. Гареева, Казань, 26-27 февраля, 2009; на 13-м ежегодном Симпозиуме студентов и аспирантов-биологов Европы «SymBioSE 2009. Biology: Expansion of Borders» Казань, 30 июля - 8 августа, 2009.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения (в 4 главах), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 28 рисунков. Список цитируемой литературы включает 165 источникЬвиз них 127 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Бояршинов, Андрей Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Обезвоживание листьев яровой пшеницы сопровождается накоплением Н2Ог и МДА, фазным изменением активности АПО и КАТ, что свидетельствует о развитии окислительного стресса.

2. Впервые показано, что в ходе нарастающего обезвоживания и последующей регидратации в отсечённых листьях яровой пшеницы происходит быстрое и кратковременное накопление эндогенного оксида азота (N0). Это указывает на активацию NO-сигнальной системы в ответ на изменение водного статуса тканей листа.

3. Более быстрая потеря воды отсечёнными листьями среднезасухоустойчивого сорта пшеницы Омская 33 в сравнении с листьями засухоустойчивого сорта Закамская при завядании соответствует более раннему подъёму уровня N0 в них, что может отражать различия в метаболической чувствительности растений разных сортов к действию водного стресса.

5. Экзогенный донор N0 - нитропруссид натрия (SNP) - в микромолярных концентрациях (50-250 мкМ) снижает потерю воды, накопление МДА и усиливает активность аскорбатпероксидазы и каталазы в листьях пшеницы при обезвоживании, что сопряжено с непродолжительным повышением содержания оксида азота и указывает на его защитное значение.

6. Впервые показано, что обработка проростков яровой пшеницы суспензионной культурой молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ - продуцентов NO - сдерживает накопление Н2О2, развитие ПОЛ и повышает активность каталазы в листьях при последующем водном стрессе.

109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Накопившиеся за последние полтора десятилетия в мировой литературе сведения указывают на критически важное значение оксида азота (N0) как универсальной сигнальной молекулы в жизнедеятельности растительных организмов. Особенно важную роль оксид азота приобретает в условиях действия на растения неблагоприятных абиотических и биотических факторов окружающей среды. В подобных стрессовых ситуациях N0 выступает как модулятор неспецифической защитной реакции растительного организма на разных уровнях его организации от физиологического до молекулярно-генетического. В нашей работе показано участие эндогенного оксида азота в неспецифических стрессовых реакциях отсечённых листьев при подсушивании и целых растений яровой пшеницы, подвергнутых почвенной засухе, а также выявлен эффект экзогенного оксида азота на устойчивость тканей листьев пшеницы к обезвоживанию.

Приоритетным результатом в настоящем исследовании было обнаружение быстрого и кратковременного накопления эндогенного оксида азота в листьях в ответ как на завядание, так и на их последующую регидратацию. Аккумуляция N0 происходила на фоне потери и восстановления тургесцентности клеток, развития окислительного стресса, активации и инактивации антиоксидантых ферментов, что свидетельствует о принципиально важном значении образования N0 в развитии неспецифического адаптационного синдрома листьями в ответ на обезвоживание.

Накопление Н20г и МДА в листьях пшеницы в ходе прогрессирующего обезвоживания указывает на развитие реакций стрессового метаболизма, и в частности, окислительного стресса. Известно, что окислительный стресс является одной из основных неспецифических ответных реакций растительных клеток на избыточную потерю воды (Чиркова, 2001). Однако можно утверждать, что усиленное образование эндогенного Н202 наряду с повреждающим имело сигнальное и, следовательно, адаптивное значение, что согласуется с современными представлениями о сигнальных функциях Н202 в клетках растений (Neill et al., 2002). Фазные изменения активности антиоксидантных ферментов аскорбатпероксидазы и каталазы, происходившие вслед за возрастанием количества пероксида, свидетельствуют об их вовлечённости в процесс утилизации образующегося Н202.

Повышение содержания оксида азота наряду с генерацией АФК ранее было показано лишь в единичных исследованиях (Gould et al., 2003; Arasimowicz et al., 2009). Одинаковый всплеск уровня эндогенного NO в листьях в ответ как на обезвоживание, так и на регидратацию растительной ткани свидетельствует о стереотипной реакции NO-сигнальной системы на резкое изменение водного статуса независимо от его направленности (уменьшение или возрастание ОСВ), что предполагает NO-опосредованную активацию сходных механизмов, вовлечённых в адаптацию к изменившимся условиям оводнённости.

Интересным с нашей точки зрения фактом является установление различий в динамике содержания эндогенного NO в отсечённых листьях двух сортов пшеницы, имеющих неодинаковую скорость потери воды в ходе завядания на воздухе. Листья сорта Омская 33 быстрее теряли воду в ходе подсушивания на воздухе, чем листья сорта Закамская, что, очевидно, определяется разной величиной их водоудерживающей способности. Более раннее повышение уровня NO в листьях Омской 33 в ответ на обезвоживание является, по нашему мнению, реакцией на более быструю потерю ими воды и клеточного тургора в начале завядания. Известно, что внутриклеточные сигнальные системы реагируют на осмотический стресс через фосфорилирование мембраносвязанного осмосенсора, отслеживающего натяжение плазматической мембраны (Trewavas et al., 2000; цит. по Алёхина и др., 2007), поэтому более раннее падение тургора должно приводить к более быстрому "включению" сигнальных систем.

Накопление N0 наблюдали и в листьях целых растений пшеницы всех изучаемых сортов, подвергнутых восстановительному поливу после перенесённой почвенной засухи. Данные литературы свидетельствуют, что растения, перенёсшие засуху, обладают повышенной устойчивостью к её последействию (Генкель и др., 1982; Саглам и др., 2008; Kosma et al., 2009). На основании этого можно полагать, что после обезвоживания растения пшеницы приобретали состояние повышенной неспецифической устойчивости к стрессорам (кросс-адаптация), и это совпадало с увеличением количества NO в тканях листьев. Это, в свою очередь, позволяет высказать предположение, что повышение содержания оксида азота имеет прямое отношение к формированию состояния адаптации растений к стрессорам. Так, например, более высокий уровень эндогенного NO характерен для растений, прошедших низкотемпературное закаливание (Zhao et al., 2009). Известно, что оксид азота, как и АФК, является активатором генов защитных белков (Durner et al., 1998) и возрастание уровня NO должно приводить к усилению их экспрессии и сопровождаться повышением устойчивости растений.

Более высокий уровень NO в листьях пшеницы с. Закамская, установленный в наших экспериментах, может являться дополнительным подтверждением участия эндогенного NO в формировании механизмов устойчивости растений. Растения этого сорта испытывали меньшие водный дефицит и ПОЛ в условиях засухи в сравнении с Омской 33, что косвенно указывает на наличие связи между содержанием NO в листьях и уровнем метаболической резистентности. Результаты опытов с отсечёнными листьями и целыми растениями пшеницы указывают на различия не только в физиологической, но и в метаболической чувствительности двух сравниваемых сортов к водному стрессу. Выявленные нами особенности, очевидно, являются следствием разного географического происхождения изучаемых сортов и уровня их адаптации к неблагоприятным условиям водоснабжения. Предположение об участии оксида азота и других интермедиатов NO-сигнальной системы в формировании устойчивости растений пшеницы к засухе требует развития и является перспективным направлением для дальнейших исследований.

В нашей работе получены данные о стресс-протекторном эффекте донора NO нитропруссида натрия на листья пшеницы в условиях обезвоживания. Защитный эффект донора N0 проявляется одновременно на физиологическом и метаболическом уровнях путем увеличения ОСВ и сдерживания развития ПОЛ. Наиболее вероятной причиной повышения водоудерживающей способности является хорошо доказанное свойство NO вызывать закрывание устьиц и снижение интенсивности транспирации листа, и, возможно, NO-индуцированное увеличение содержания LEA-белков (Garcia-Mata, Lamattina, 2001, 2002). Возрастание активности аскорбатпероксидазы и каталазы, наблюдаемое в обработанных SNP листьях, объясняет механизм торможения пероксидации липидов клеточных мембран, заключающийся в утилизации избыточных количеств АФК, образующихся при обезвоживании. Полученные результаты согласуются с современными представлениями о том, что NO опосредует активацию антиоксидантных ферментов и усиление экспрессии их генов, что приводит к повышению антиоксидантной защиты в растениях (Zhou et al., 2005; Zhang et al., 2007). С другой стороны, ввиду кратковременности (1ч) обработки листьев пшеницы донором NO, недостаточной для усиления экспрессии генов, могло происходить прямое связывание АФК (в частности, Ог") с NO (Wink et al., 1993; Jasid et al., 2006). На возможность такого пути указывает повышенное количество NO в тканях листьев, инфильтрованных SNP, и его быстрое снижение до уровня контроля уже через 30 мин обезвоживания.

Сходный с SNP антистрессовый эффект на растения оказывала обработка их суспензией бактерий Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, в которых ранее было установлено наличие NO-синтазного пути образования NO

Аёа\у1 ^ а1., 1997; Могка ег а1., 1997; Яруллина, Ильинская, 2007). Существенное повышение содержания N0 в бактериях при выращивании их на среде с добавлением Ь-аргинина в наших экспериментах может быть обусловлено субстрат-зависимой стимуляцией Ж)8-активности. Сдерживание накопления Н2О2 и МДА на фоне усиления активности КАТ раскрывает возможный механизм антиоксидантного эффекта клеток лактобацилл. Однако отсутствие совпадения действия лактобацилл как источника N0 с эффектом БЫР, химического донора N0, а также, в ряде случаев, различий между вариантами с аргинином и без него на данный момент не позволяет утверждать, что эффект бактерий обусловлен именно продукцией ими эндогенного N0. Вероятно, дальнейшие исследования должны быть проведены с использованием ингибиторов его синтеза.

Совокупность результатов проведённого исследования позволяет утверждать, что оксид азота принимает участие в развитии неспецифического адаптационного синдрома в растениях пшеницы в ответ на действие водного стресса. Стресс-протекторный эффект, оказываемый экзогенным донором N0 и обусловленный повышением уровня N0 в тканях листьев так же, как кратковременное увеличение N0 в них при обезвоживании и регидратации предполагает важное значение эндогенного оксида азота в запуске физиологических и метаболических адаптивных механизмов растительного организма в неблагоприятных экологических условиях.

108

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бояршинов, Андрей Владимирович, Уфа

1. Алексеев, A.M. Подвижность воды в цитоплазме и её значение для процесса транспирации воды листьями / A.M. Алексеев, Г.И. Пахомова // Физиология водообмена и устойчивости растений. — Казань: Изд-во Казанск. универ-та, 1971. - С. 3-11.

2. Алексеев, В.Н. Курс качественного химического полумикроанализа / В.Н. Алексеев // М.: Госхимиздат. - 1962. - 584 с.

3. Алёхина, Н.Д. Физиология растений / Н.Д. Алёхина, Ю. В. Балнокин, В. Ф. Гавриленко и др. // Под ред. И.П. Ермакова М.: "Academia" 2007. - 640 с.

4. Асафова, Е. В. Участие NO-сигнала в повышении устойчивости растений ячменя к мучнистой росе (Bliimeria graminis) / Е.В. Асафова // Стрессовые белки растений. Материалы Всероссийской научной конференции. — Иркутск, 6-10 сентября 2004 г. С. 7-10.

5. Барабой, В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В.А. Барабой // Успехи современной биологии. 1991. - Т. 111. - С. 923-931.

6. Безуглов, В.К. К методике определения активности воды в растениях / В.К. Безуглов, В.В. Макаров, В. Сидоров // Учёные записки Каз.гос.пед.ин-та. Вып.119 1973. - С.60-71.

7. Валиуллина, Р.Н. Изменение экспрессии генов белков теплового шока в связи с разной устойчивостью растений к повышенной температуре / Р.Н. Валиуллина, В.В. Рябовол, Л.П. Хохлова // Доклады Академии наук. 2008. -Т.422, № 6. - 845-847.

8. Ванин, А. Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований / А. Ф. Ванин // Биохимия. 1998. — Т.63. - вып. 7. - С. 867-869.

9. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов биологических мембран / Ю.А. Владимиров // М.: Наука, 1972. — 252 с.

10. Генерозова, И.П. Ингибирование метаболической активности митохондрий этиолированных проростов гороха, подвергнутых водному стрессу / И.П. Генерозова, С.Н. Маевская, А.Г. Шугаев // Физиология растений. 2009. - Т.56, № 1. - С.45-52.

11. Генкель, П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений / П.А. Генкель // М.: Наука. 1982. - 279 с.

12. Гродзинский, A.M. Краткий справочник по физиологии растений / A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский // Киев: Наукова думка. 1973. - 591с.

13. Гусев, H.A. Методы исследования водообмена растений / H.A. Гусев // Казань: Изд-во Каз. гос. ун-та. 1982. 107 с.

14. Дмитриев, А.П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс / А.П. Дмитриев // Физиология растений. 2003. - Т.50, № 3. - С.459-465.

15. Дубовская, JI.B. Защитная роль оксида азота при окислительном стрессе, индуцированном в растениях табака пероксидом водорода / JI.B. Дубовская, Е.В. Колеснева, Д.М. Князев, И.Д. Волотовский // Физиология растений. -2007. Т.54, №6. - С. 847-855.

16. Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений / М.Н. Мерзляк // Соросовский образовательный журнал. 1999. - №9. - С.20-26.

17. Практикум по физиологии растений // Под ред. Проф. И.И. Гунара. М.: Колос.- 1972.- 168 с.

18. Пахомова, В.М. Неспецифический адаптационный синдром биосистем и общие закономерности реактивности клеток /В.М. Пахомова // Казань: КГУ. -2000.-215 с.

19. Полевой, В.В. Практикум по росту устойчивости растений: Учеб. пособие / В.В. Полевой, Т.В. Чиркова, Л.А. Лутова // СПб.: Изд-во СПбУ, 2001. - 212 с.

20. Пустовойтова, Т.Н. Особенности засухоустойчивости трансгенных растений табака с генами iaaM и iaaH биосинтеза ауксина / Т.Н. Пустовойтова, Т.В. Баврина, Н.Е. Жданова // Физиология растений. 2000. - Т.47, №3 -С.431-436.

21. Радов, A.C. Практикум по агрохимии / A.C. Радов, И.В. Пустовой, A.B. Коральков //-М.: Агропромиздат, 1985. 312 с.

22. Саглам, А. Физиологические изменения у растений Ctenanthe setosa при повторном действии засухи / А. Саглам, А. Кадиоглу, Р. Терци, Н. Сарухан // Физиология растений. 2008. - Т.55 - № 1 - С.53-58.

23. Сан, С. Двойственное действие салициловой кислоты на накопление дегидринов в проростках ячменя, подвергнутых водному стрессу / С. Сан, Д. X. Си, X. Фен, Ц. Б. Ду, Т. Лей, X. Г. Лиан // Физиология растений. 2009. -Т.56, №3 - С.388-394.

24. Селье, Г. На уровне целого организма / Г. Селье // М., 1972. 268 с.

25. Сказкин, Ф.Д. Летние практические занятия по физиологии растений / Ф.Д. Сказкин, М.С. Миллер, Г.А. Обухова, В.В. Аникиев, В.П. Новиков, О.В. Редман //- М.: Просвещение. 1973. - 208 с.

26. Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров. Минск: «Наука и техника», 1977. 152с.

27. Тян, С.Р. Физиологические ответные реакции проростков пшеницы на засуху и облучение УФ-Б. Влияние нитропруссида натрия / С.Р. Тян, Ю.Б. Лей // Физиология растений. 2007. - Т.54, №5 - С.763-769.

28. Холодова, В.П. Физиологические механизмы адаптации аллоцитоплазматических гибридов пшеницы к почвенной засухе / В.П. Холодова, Т.С. Бормотова, О.Г. Семёнов, Г.А. Дмитриева, В л.В. Кузнецов // Физиология растений. 2007. - Т.54, № 4. - С.431-436.

29. Чжан, X. Влияние обработки листьев пшеницы донором окиси азота на антиокислительный метаболизм при стрессе, вызванном алюминием / X. Чжан,

30. Я.Х. Ли, Л.Ю. Ху, С.Х. Ван, Ф.К. Чжан, К.Д. Ху // Физиология растений. -2008. Т. 55. - №4. - С. 523-628.

31. Шмаль, В.В. Государственный реестр селекционных достижений,гдопущенных к использованию // http://www.gossort.com/xrcts/xrct20.html # 9905693

32. Яруллина, Д.Р. Детекция NO-синтазной активности лактобацилл методом флюорисцентного окрашивания / Д.Р. Яруллина, О.Н. Ильинская // Микробиология. 2007. - Т.76.№4. - С. 570-572.

33. Adawi, D. Effect of Lactobacillus supplementation with and without arginine on liver damage, bacterial translocation in an acute liver injury model in the rat / D.Adawi, F.B.Kasravi, G.Molin, В.Jeppsson // Hepatology. 1997. - V.25, N 3. -P. 642-647.

34. Asada, K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipaton of excess protons / K. Asada // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. - V.50. - P.601-639.

35. Arasimowicz, M. Nitric oxide, induced by wounding, mediates redox regulation in. pelargonium leaves / M. Arasimowicz, J. Floryszak-Wieczorekl, G. Milczarek, T. Jelonek Plant Biology. -2009. -V.ll.-P.650-663.

36. Aruoma, O. Antioxidant and prooxidant properties of active rosemary constituents: carnosol and carnosic acid /О.1. Aruoma, B. Halliwell, R. Aeschbach, J. Loliger // Xenobiotica. 1992. - V.22 - P.257-268.

37. Bethke, P. Dormancy of Arabidopsis seeds and barley grains can be broken by nitric oxide /Р. Bethke, F. Gubler, J.V. Jacobsen, R.L. Jones // Planta. 2004. - V. 219, N 5. - P.847-855.

38. Bethke, P. Apoplastic syntesis of nitric oxide by plant tissues / P. Bethke, R. Jones, M. Badger // Plant Cell. 2004. - №16. - P.332-341.

39. Beligni, M.V. Nitric oxide counteracts cytotoxic processes mediated by reactive oxygen species in plant tissues / M.V. Beligni, L. Lamattina // Planta. — 1999. V.208. - P.337-344.

40. Beligni, M. V. Nitric oxide acts as an antioxidant and delays programmed cell death in barley aleurone layers /M. V. Beligni, A. Fath, P.C. Bethke, L. Lamattina, R.L. Jones. // Plant Physiol. 2002. - V.129. - P.1642-1650.

41. Blatt, M. Ca signaling and control of guard-cell volume in stomatal movements /M.R. Blatt //Curr. Opin. Plant Biol. 2000. - V.3. - P. 196-204

42. Bright, J. ABA-induced NO generation and stomatal closure in Arabidopsis are dependent on H202 synthesis / J. Brightl, R. Desikanl, J. Hancockl, I.S. Weir, S.J. Neilll // The Plant Journal. 2006. - V.45. - 113-122.

43. Chen, Y. A bacterial nitric oxide synthase from a Nocardia species /Y.Chen, J.P.N.Rosazza //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V.203 - P. 12511258.

44. Cheng, F.Y. Nitric oxide counteracts the senescence of detached rice leaves induced by dehydration and polyethylene glycol but not by sorbitol / F.Y. Cheng, S.Y. Hsu, C.H. Kao //Plant Growth Regulation. 2002. - V.38. - P.265-272.

45. Conner, E.M. Inflammation, free radicals and antioxidants / E.M. Conner, M.B. Grisham // Nutrition. 1996. - V. 12. - P.274-277.

46. Cragan, J.D. Teratogen update: methylene blue / J.D. Cragan // Teratology. -1999. V.60. - P.42-48.

47. Crawford, N.M. Response to Zemojtel et al.: plant nitric oxide synthase: back to square one / N.M. Crawford, M. Galli, R. Tischner, Y.M. Heimer, M. Okamoto, A. Mack // Trend Plant Sci. 2006. - V. 11 - P.526-527.

48. Cueto, M. Presence of nitric oxide synthase activity in roots and nodules of Lupinus albus / M. Cueto, O. Hernandez-Perea, R. Martin, M.L. Benrtura, J. Rodrigo, S. Lama, M.P. Golvano // FEBS Lett. 1996. - 398. - P. 159-164.

49. Creus, C.M. Nitric oxide is involved in the Azospirillum brasilense-'mduced lateral root formation in tomato / C.M.Creus, M.Graziano, E.M.Casanovas,

50. M.A.Pereyra, M.Simontacchi, S.Puntarulo, C.A.Barassi, L.Lamattina // Planta. -2005.-221.-P. 297-303.

51. Curry, J. Unusual sequence of group 3 LEA (II) mRNA inducible by dehydration stress in wheat / J. Curry, M.K. Walker-Simmons // Plant. Mol. Biol. -1993. V.21. -P.907-912.

52. Dangl, J. Innate immunity. Plants just say NO to pathogens / J. Dangl // Nature. 1998. - V.394, N 6693. - P.525-527.

53. Dean, J.V. Nitric oxide and nitrous oxide production by soybean and winged bean during in vivo nitrate reductase assay / J.V. Dean, J.E. Harper // Plant physiol. -1986. V.82. -P.718-723.

54. Delledone, M. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistsnce / M. Delledone, Y. Xia, R. A. Dixon, C. Lamb // Nature. 1998. - V. 394. - P.585-588.

55. Dhindsa, R.S. Protein synthesis during rehydration of rapidly dried Tortula ruralis. Evidence for oxidation injury / R.S. Dhindsa // Plant Physiol. 1987. -V.85. -P.1094-1098.

56. Dhindsa, R.S. Glutathione status and protein synthesis during drought and subsequent rehydration in Tortula ruralis / R.S. Dhindsa // Plant Physiol. 1987. -V.83.- P.816-819.

57. Dhindsa, R.S. Drought stress, enzymes of glutathione metabolism, oxidation injury, and protein synthesis in Tortula ruralis / R.S. Dhindsa // Plant Physiol. — 1991. V.95. -P.648-651.

58. Ding, A.H. Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages / A.H. Ding, C.F.Nathan, D.J. Stuehr // The Journal of Immunology. 1998. - V.141. - P.2407-2412.

59. Durner, G. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMF and cyclic ADP-ribose / G. Durner, D. Wendehenne, D. F. Klessig // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.10328-10333.

60. Garci'a-Mata, C. Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress / C. Garci'a-Mata, L. Lamattina // Plant Physiol.-200 l.-V. 126.-P. 1196-1204.

61. Garcia-Mata, C. Nitric oxide and abscisic acid cross talk in guard cells / C.Garcia-Mata, L. Lamattina // Plant Physiol. 2002. - V.128 - P.790-792.

62. Gay, C. Critical evaluation of the effect of sorbitol on the ferric-xylenol orange hydroperoxide assay / C. Gay, J.M. Gebicki // Analytical Biochemistry. -2000. V.284. - P.217-220.

63. Gong, M. Heat shock-induced changes in intracellular Ca2+ in tobacco seedling in relation to thermotolerance / M. Gong, A.H. Luit, M.R. Knight, A.J. Trewavas // Plant Physiology. 1998. - V.l 16. - P.429-437.

64. Gould, K. Nitric oxide production in tobacco leaf cells: a generalized stress response? / K.S. Gould, O. Lamotte, A. Klinguer, A. Pugin, D. Wendehenne // Plant, Cell and Environ. 2003. - V.26. - P. 1851-1862.

65. Graziano, M. Nitric oxide internal iron availability in plants / M. Graziano, M.V. Beligni, L. Lamattina//Plant Physiol. -2002. V.l30. - P. 1852-1859.

66. Grossi, L. Sodium nitroprusside: mechanism of NO release mediated by sulfhydryl-containing molecules / L. Grossi, S. D'Angelo // J. Med. Chem. 2005. -V.48.-P. 2622-2626

67. Guo, F.Q. Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling / F.Q. Guo, M. Okamoto, N.M. Crawford // Science. -2003. -V.302. -P.100-103.

68. Guo, F.Q. Arabidopsis nitric oxide synthase 1 is targeted to mitochondria and protects against oxidative damage and dark-induced senescence / F.Q. Guo, N.M. Crawford // Plant Cell. 2005. - V.17. - P.3436-3450

69. Gupta, K.J. In higher plants, only root mitochondria, but not leaf mitochondria reduce nitrite to NO, in vitro and in situ / K.J. Gupta, M. Stoimenova, W.M. Kaiser // Journal of Experimental Botany. 2005. - V.56. - P.2601-2609

70. Hara, M. Metal binding by citrus dehydrin with histidine-rich domains / M. Hara, M. Fujinaga, T. J. Kuboi // Journal of Experimental Botany. 2005. - V.56. -P.2695-2703.

71. Fath, A. Enzymes that scavenge reactive oxygen species are down-regulated prior to gibberellic acid-induced programmed cell death in barley aleurone / A. Fath, P.C. Bethke, R.L. Jones // Plant Physiol. 2001. - V.126. - P. 156-166.

72. Foyer, C. The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism / C. Foyer, B. Halliwell // Planta. 1976. - V.133. - P.5-21.

73. Foissner, I. In vivo imaging of an elicitor-induced nitric oxide burst in tobacco /1. Foissner, D. Wendehenne, C. Langebartels, J. Durner // Plant J. 2000. - V.23. -V.817-823.

74. Furchgott, R.F. Special topics: nitric oxide / R.F. Furchgott // Annu Rev Physiol. 1995. - V.57. - P.659-682.

75. Hallivel, B. Ascorbic acid, metal ions and the superoxide radical / B. Halliwell, C.H. Foyer // Biochem J. 1976. - V. 155, N 3. - P.697-700.

76. Hallivel, B. Free Radicals in Biology and Medicine, Ed 2. / B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge // Clarendon Press, Oxford, UK, 1989.

77. Haramathy, E. Ethylene regulation by nitric oxide (NO) free radical: a possible mode of action endogenous NO / E. Haramathy, Y.Y. Leshem // Biology and biotechnology of the plant hormone ethylene. Dordrecht: Kluwer, 1997. -P.253-258.

78. Heath, R.L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. 1. Kinetics and stochiometry of fatty acid peroxidation / R.L. Heath, L. Packer // Arch. Biochem. Biophys. 1968. - V.125. - P.189-198.

79. Hu, X. NO-mediated hypersensitive responses of rice suspension cultures induced by incompatible elicitor / X. Hu, J. Fang,W. Cai, Z. Tang // Chinese Science Bulletin. 2003. - V.48. - P.358-363.

80. Hu, X. Nitric oxide mediates gravitropic bending in soybean roots / X. Hu, S. Neill, Z. Tang, W. Cai // Plant Physiol. 2005. - V.137. - P.663-670.

81. Huang, X. Nitric oxide induces transcriptional activation of the nitric oxidetolerant alterative oxidase in Arabidopsis suspension cells / X. Huang, U. von Rad, J. Durner // Planta. 2002. - V.215 - P.914-923.

82. Hung, K.T. Paraquat toxicity is reduced by nitric oxide in rice leaves / K.T. Hung, C.J. Chang, C.H. Kao // Journal of Plant Physiology. 2002. - V.159. -P.159-166.

83. Jasid, S. Chloroplasts as a Nitric Oxide Cellular Source. Effect of Reactive Nitrogen Species on Chloroplastic Lipids and Proteins / S. Jasid, M. Simontacchi, C.G. Bartoli, S. Puntarulo // Plant Physiol. 2006. - V.142. - P.1246-1255.

84. Jiang, M. Role of abscisic acid in water stress induced antioxidant defense in leaves of maize seedlings / M. Jiang, J. Zhang // Free Radical Research. 2002. -V.36. - P.1001-1015.

85. Jimenez, A. Role of the ascorbate-glutathione cycle of mitochondria and peroxisomes in the senesence of pea leaves / A. Jimenez, J.A. Hernandez, G. Pastori, L.A. Del Rio, F. Sevilla.// Plant Physiol. 1998. - V.l 18. - P.1327-1335.

86. Ignarro, L.J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide / L.J. Ignarro, G.M. Buga, K.S. Wood, R.E. Byrns, G. Chaudhuri // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.9265-9269.

87. Iturbe-Ormaetxe, I. Oxidative damage in pea plants exposed to water deficit or paraquat / I. Iturbe-Ormaetxe, P.R. Escudero, C. Arrese-Igor, M. Becana // Plant Physiol. 1998. - V.l 16. - P.173-181.

88. Klepper, L.A. Evolution of nitrogen oxide gases from herbicide treated plant tissues / L.A. Klepper// WSSA Abstracts. 1975. - V.l 84. - P.70.

89. Klepper, L.A. Nitric oxide (NO) and nitrogen dioxide emissions from herbicide treated soybean plants / L.A. Klepper // Plant Physiol. 1979. - V.13. -P.537-542.

90. Kopyra, M. Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth of Lupinus luteus / M. Kopyra, E.A. Gwóídi // Plant Physiology and Biochemistry. 2003. - V.41. -P.1011-1017.

91. Kosma, D.K. The impact of water deficiency on leaf cuticle lipids of Arabidopsis / D.K. Kosma, B. Bourdenx, A. Bernard, E.P. Parsons, S. Lu, J. Joube's, M.A. Jenks // Plant Physiol. 2009. - V.l51. - P. 1918-1929.

92. Lamb, C. The oxidative burst in plant disease resistanse / C. Lamb, R. Dixon. // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1997. - V.48. -P.251-275.

93. Lanteri, M.L. Calcium and calcium-dependent protein kinases are involved in nitric oxide- and auxininduced adventitious root formation in cucumber / M.L. Lanteri, G.C. Pagnussat, L. Lamattina//J. Exp Bot. -2006. -V.57-P. 1341-1351.

94. Lanteri, M.L. Nitric Oxide Triggers Phosphatidic Acid Accumulationvia Phospholipase D during Auxin-Induced Adventitious Root Formation in Cucumber / M.L. Lanteri, A.M. Laxalt, L. Lamattina // Plant Physiol. 2008. - V.147. - P. 188198.

95. Laspina, N. Nitric oxide protects sunflower leaves against Cd-induced oxidative stress / N. Laspina, M. Groppa, M. Tomaro, M. Benavides // Plant Sci. -2005.-V. 169.-P. 323-330.

96. Leshem, Y.Y. The characterization and contrasting effects of the nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum L. foliage / Y.Y. Leshem, E. Haramathy // Journal of Plant Physiol. 1996. - V.148. - P.258-263.

97. Leshem, Y.Y. Evidence for the function of the free radical gas-nitric oxide (NO") as an endogenous maturation and senescence regulating factor in higher plants / Y.Y. Leshem, R.B.H. Wills, V.V. Ku // Plant Physiol Biochem. 1998. -V.36. -P.825-833.i

98. Lin, D.I. Effects of abscisic acid on ozone tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedlings / D.I. Lin, H.S. Lur, C. Chu // Plant Growth Regulation. 2001. - V.35. -P.295-300.

99. Lu, S. Effects of ABA and S-3307 on drought resistance and antioxidative enzyme activity of turfgrass / S. Lu, Z. Guo, X. Peng // Journal of Horticulture Science and Biotechnology. 2003. - V.78. - P.663-666.

100. Loggini, B. Antioxidant defense system, pigment composition, andphotosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected to drought / B. Loggini, A. Scartazza, E. Brugnoli, F. Navari-Izzo // Plant Physiol. 1999. - V.l 19. - P.1091-1099.

101. Menconi, M. Activated oxygen production and detoxification in wheat plants subjected to a water-deficit program / M. Menconi, C.L.M. Sgherri, C. Pinzino, F. Navarri-Izzo // Journal of Experimental Botany. 1995 - V.46. - P. 1123-1130.

102. Mitteler, R. Oxidative stress, Antioxydants and stress tolerance / R. Mitteler // Trends Plant Sci. 2002. - V.7. - P.405-409.

103. Morillon, R. The role of ABA and the transpiration stream in the regulation of the osmotic water permeability of leaf cell / R. Morillon, M.J. Chrispeels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-V.98.-P.14138-14143.

104. Morita, H. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidine nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum / H. Morita, H. Yoshikawa, R. Sacata, Y. Nagata, H. Tanaka // Bacteriol. 1997. - V.179, N 24. - P.7812-7815.

105. Neill, S.J. Nitric oxide is a novel component of abscisic acid signaling in stomatal guard cells / S.J. Neill, D. Desikan, A. Clarke, J.T. Hancock // Plant Physiol. 2002. - V.128. - P.13-16.

106. Neill, S.J. Nitric oxide signalling in plants / S.J. Neill, R. Desikan, J.T. Hancock // New Phytologist. 2003. - V. 159. - P. 11 -35.

107. Neill, S.J. Nitric oxide, stomatal closure, and abiotic stress / S. Neill, R. Barros, J. Bright, R. Desikan, J. Hancock, J. Harrison, P. Morris, D. Ribeiro, I. Wilson // J. Exp. Bot. 2008. - V.59. - P.165-176.

108. Noctor, G. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. / Noctor G., Foyer C.H. // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1998.-V.49.-P.249-279.

109. Noritake, T. Nitric oxide induces phitoalexine accumulation in potato tuber tissues / T. Noritake, K. Kawakita, N. Doke // Plant Cell Physiol. 1996. - V.37. -P.113-116.

110. Orozco-Cardenas, M.L. Nitric oxide negatively modulates wound signaling in tomato plants / M.L. Orozco-Cardenas, C.A. Ryan // Plant Physiol. 2002. -V.130. -P.487-493.

111. Pagnussat, G.C. Nitric oxide is required for root organogenesis / G.C. Pagnussat, M. Simontacchi, L. Lamattina // Plant Physiol. 2002. - V.129 - P.954-956.

112. Passioura, J. The drought environment: physical, biological and agricultural perspectives / J. Passioura // Journal of Experimental Botany. 2007. - V. 58, No.2. — P. 113-117.

113. Pastori, G.M. Natural senescence of pea leaves: an activated oxygen-mediated function for peroxisomes / G.M. Pastori, L.A. del Ri'o // Plant Physiol. -1997. V.l 13.-P.411-418.

114. Pitzschke, A. Mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species signaling in plants / A. Pitzschke, H. Hirt // Plant Physiol. 2006. - V.141. - P.351-356.

115. Pitzschke, A. Disentangling the complexity of mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species signaling / A. Pitzschke, H. Hirt // Plant Physiology. 2009. - V.149. - P.606-615.

116. Rockel P. Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro / P. Rockel, F. Strube, A. Rockel, J. Wildt, W. M. Kaiser // J. of Exp. Bot. 2002. - V.53. - P. 103-110.

117. Ruan, H. Protective effects of nitric oxide on salt stress-induced oxidative damage to wheat (Triticum aestivum L.) leaves / H. Ruan, W. Shen, M. Ye, L. Xu // Chinese Science Bulletin. 2002. - V.47. - P.677-681.

118. Rucinska, R. Influence of lead on membrane permeability and lipoxigenase activity in lupin roots /R. Rucinska.// Biol. Plant. 2005. - V.49. - P.617-619.i

119. Scandalios, J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases / J.G. Scandalios // Plant Physiol. 1993. - V.101. -P.7-12.

120. Song, L. Nitric oxide protects against oxidative stress under heat stress in the calluses from two ecotypes of reed / L. Song, W. Ding, M. Zhao, B. Sun, L. Zhang // Plant Science. 2006. - V. 171. - P.449-458.

121. Sokolovski, S. Nitric oxide block of outwardrectifying K+-channels indicates direct control by protein nitrosylation in guard cells / S. Sokolovski, M.R. Blatt // Plant Physiol. 2004. - V. 136. - P.4275-4284.

122. Stohr, C. Formation and possible roles of nitric oxide in plant roots / C. Stohr, S. Stremlau // J. of Exp. Bot. 2006. - V.57. - P.463-470.

123. Tunnacliffe, A. The continuing conundrum of the LEA proteins /A. Tunnacliffe, Wise M.J. // Naturwissenschaften. 2007. - V.94. - P.791-812.

124. Uchida, A. Effects of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice / A. Uchida, A.T. Jagendorf, T. Hibino, T. Takabe // Plant Science. 2002. - V. 163. - P.515-523.

125. Wang, J.W. Nitric oxide is involved in methyl jasmonate-induced defense responses and secondary metabolism activities of taxus cells / J.W. Wang, J. Y. Wu // Plant Cell Physiol. 2005. - V.46, N6. - P.923-930.

126. Wang, Y.S. Nitric Oxide reduces aluminium toxicity by preventing oxidattive stress in the roots of Cassia tora L. / Y.S. Wang, Z.M. Yang // Plant Cell Physiol. -2005. Y.12, N.46.-P.1915-1923.

127. Wodala, B. In vivo target sites of nitric oxide in photosynthetic electron transport as studied by chlorophyll fluorescence in pea leaves / B. Wodala, Z. Dea'k,

128. Vass, L. Erdei, I. Altorjay, F. Horva'th // Plant Physiol. 2008. - V. 146. - P. 1920-1927.

129. Wojatszek, P. Oxidative burst: an early plants response to pathogen infection /P. Wojatszek//Biochem J. 1997. - V.322. -P.681-692.

130. Xu, D. Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice / D. Xu, X. Duan, B. Wang, B. Hong, T.D. Ho, R. Wu // Plant Physiol. 1996. — 110. — P.249-257.

131. Xuan, W. The heme oxygenase/carbon monoxide system is involved in the auxin-induced cucumber adventitious rooting process / W. Xuan, F.Y. Zhu, S. Xu, B.K. Huang, T.F. Ling, J.Y. Qi, M.B. Ye, W.B. Shen // Plant Physiol. 2008. -V.148. -P.881-893.

132. Yamasaki, H. An alternative pathway for nitric oxide production in plants: new features of an old enzyme / H. Yamasaki, Y. Sakihama, S. Takahashi // Trends Plant Sci.- 1999.- V.4.-P.128-129.

133. Yamasaki, H. Simultaneous production of nitric oxide and peroxynitrite by plant nitrate reductase: in vitro evidence for the NR-dependent formation of active nitrogen species / H. Yamasaki, Y. Sakihama // FEBS Lett. 2000. - V.468. - P.89-92.

134. Zottini, M. Nitric oxide affects plant mitochondrial functionality in vivo / M. Zottini, E. Formentin, M. Scattolin, F. Carimi, F. Lo Schiavo, M. Terzi // FEBS Letters. 2002. - V.515. - P.75-78.

135. Zemojtel, T. Plant nitric oxide synthase: a never-ending story? / T. Zemojtel, A. Frohlich, M.C. Palmieri, M. Kolanczyk, I. Mikula, L.S. Wyrwicz, E.E. Wanker, S. Mundlos, M. Vingron, P. Martasek et al. // Trends Plant Sci. 2006 - V.ll. -P.524-525.

136. Zhang, J. Drought-stress-indused changes in activités of superoxide dismutase, catalase and peroxidase in wheat species / J. Zhang, M.B. Kirkham // Plant cell physiol. 1994. - V.35. - P.785-791.

137. Zhang, H. Effects of nitric oxide on the germination of wheat seeds and its reactive oxygen species metabolisms under osmotic stress / H. Zhang, W.B. Shen, L.L. Xu // Acta Botanica Sinica. 2003. - V.45. - P.901-905.

138. Zhao, M.G. Nitric oxide synthase-dependent nitric oxide production is associated with salt tolerance in Arabidopsis / M.G. Zhao, Q.Y.Tian, W.H.Zhang // Plant Physiology. 2007. - V.144. - P.206-217.

139. Zhao, M.G. Nitric reductase-dependent nitric oxide production is involved in cold acclimation and freezing tolerance in Arabidopsis / M.G. Zhao, L.Chen, L.L. Zhang, W.H. Zhang // Plant Physiology. 2009. - V. 151. - P.755-767.

140. Zhou, B. Nitric oxide is involved in abscisic acid-indused antioxidant activities in Stylosanthes guianensis / B. Zhou, Z. Guo, J. Xing, B. Huang // Journal of Exp.Bot. 2005. - V.56. - P.3223-3228.

141. Zhou, B. Effects of abscisic acid on antioxidant systems of Stylosanthes guianensis (Aublet) Sw. under chilling stress/ B. Zhou, Z. Guo, Z. Liu // Crop Science. 2005. - V.45. - P.599-60

Информация о работе

Бояршинов, Андрей Владимирович
кандидата биологических наук
Уфа, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Участие и защитная роль оксида азота в стрессовых реакциях растений яровой пшеницы на обезвоживание - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы