Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитоморфология гриба Glomus intraradices - эффективного симбионта сельскохозяйственных культур

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Цитоморфология гриба Glomus intraradices - эффективного симбионта сельскохозяйственных культур"

РГ6 од

г.АЛ ¡:.J;J

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

РАСХН

На правах рукописи

КРАЕВА

Елена Станиславовна

ЦИТОМОРФОЛОГИЯ ГРИБА GLOMUS INTRARADICES — ЭФФЕКТИВНОГО СИМБИОНТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР

Специальности: 03.00.07 — Микробиология 03.00.24 — Микология

АВТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

/

Диссертационная работа выполнена в лаборатории почвенной микологии и лаборатории электронной микроскопии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель — академик РАСХН, доктор биологических, наум, профессор Г. С. Муромцев.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук В. Ф. Машан-ский; кандидат биологических наук Е. Г. Веденяпина.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

.часедании Специализированного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во. Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Защита состоится

час. на

Автореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

Общая характеристика работы Актуальность темы. За последние десятилетия одним из основных «правлений сельскохозяйственной науки стала агроэкология. Особенна актуальна разработка приемов снижения интенсивности химизации >емледелия. Широкое распространение получают биологические приемы ювышения.мобилизации растениями элементов фосфорного и азотного гатания с помощью почвенной и корневой микрофлоры.' Большое внима-ие уделяется везикулярно-арбускулярным микоризным (ВАМ) грибам благодаря их уникальной способности снабжать растения фосфором из очв. Выяснено, что микоризация улучшает также питание растений зотом, микроэлементами, способствует устойчивости агрокультур к аболеваниям, стабилизирует водный баланс растений в неблагопри-тных условиях. Растения, иноку'лированные эффективными штаммами ндомикоризных грибов, дают значительную прибавку урожая. Несом-энный положительный результат микоризацим растений делает перс-зктивным разработку экологически чистых биопрепаратов на основе эзикулярно-арбускулярных грибов. Исследования эндофитов и расте-ай на популяционном и организменном уровнях выявили сложный и юднозначный характер взаимодействий макро- и микросимбионтов, и эффективного использования ВАМ грибов необходимо знанйе тон-1йших механизмов взаимоотношений партнеров в симбиозе. Изучение ганенных циклов, цитологии и морфологии грибов занимает важное •сто в 'этих исследованиях и имеет фундаментальное значение для »нимания процессов симбиотических отношений и описания новых [дов. Среди ВАМ грибов - симбионтов агрокультур наибольший науч-й и практический интерес вызывают грибы семейства Glomaceae.

Цель и задачи работы. Цель данного исследования - идентифика-я и детальное ультраструктурное описание жизненного цикла эффек-вного штамма гриба Glomus sp. 7 .В работе решались следующие нкретные задачи : ,

Определение видовой принадлежности исследуемого эндофита. Подобор оптимальных условий фиксации и подготовки материала для электронной микроскопии и рентгеновского микроанализа. Исследование процессов проникновения и распространения гриба внутри корня.

Выявление фазы жизненного цикла, не связанной с корнем растения. Получение морфологических и цитологических характеристик мицелия и других структур, образуемых эндофитом в онтогенезе.

Научная новизна. Впервые описан полный жизненный цикл эндоми-коризного гриба Glome lntraradlces и даны морфологические характеристики мицелия и всех образуемых в онтогенезе структур эндофита. Обнаружена способность гриба образовывать споры вне корневой система растения - хозяина. Моди&щированы условия фиксации и препарирования для ультраструктурного анализа внутрикорневых спор эндофита. Для изучения оболочки спор Мотив lntraradlcee впервые применен рентгеновский микроанализ.

Практическая ценность и теоретическое значение работы. Штамм N '! зндомикоризного гриба Glomus lntraradlces высокоэффективен в условиях агроценозов Северо-Запада России. Изучение формирования симбиоза и поведения данного гриба в горняк сельскохозяйственных растений позволит целенаправленно применять Glomus lntraradlces при йыращивании кормовых и других агрокультур. Разработанные Методы исследования могут быть использованы при работе с другими ьозикулярно-арбускуляршми грибами. Морфологические и цитологический критерии, выработанные в результате исследований» могут .быть использованы при изучении биологии и ультраструктурной организации новых видов эндомикоризных грибов.

Апробация работы. Результаты работы доложены на VI Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре растений (Чернигов, 1988), на 11-й Ьсесоюзной конференции по биологической роли микроэлементов и их применению в сельском хозяйстве и медицине (Самарканд, 1990), на заседании ^микробиологического общества (1990), на IV международном микологическом конгрессе (Германия, 1990), на международном конгрессе по симбиозу (Израиль, 1991), на IV Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве".(Пущино на Оке, 1992), на Кнропейском микологическом конгресса (Кью, Англия, 1992).

Объем работы Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора.литературы, раздела "Материалы и методы", 6 глав, содержащих результаты экспериментальной работа и выводов. В работе I таблица, 32 рисунка. Список литературы включает 164 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I'jmpq 2. Материалы и методы Культура гриба. Эадомикоризный гриб Glomus sp. шт.7 выделен и:» корней земляники, выращенной на хорошо окультуренной дерново-

злабобоподзолистой почве Ленинградской области (Муромцев и др., 1984). Культура гриба поддерживалась в корнях суданской травы и земляники, выращиваемых в сосудах со стерильной почвой.

Получение микоризованных корней. Стерильные семена суданской рравы многоукосной (Sorghum vulgare var. sudanense) вместе с ино-сулюмом вносили в сосуда со- смесью простерилизованной слобоподзо^ гостой почвы с песком. Инокулюмом служили отмытые микоризованные (тим же грибом корни суданской травы, полученные ранее..В конт-юльные варианты гриб не вносили. Растения выращивали в течение 1-х месяцев в теплицах с освещенностью 10-12*10^ люкс и продолжительностью светового дня 10 часов. За развитием гриба наблюдали, ¡ре-парируя микоризованные корни через каждые 4-7 дней в течение ¡сего вегетационного периода.

Определение видовой принадлежности гриба Glomus sp.7. Иден-ификацию эндофита Glomus эр.Т. проводили по диагностическим тес-ам из "Определителя везикулярно-арбускулярных микоризных грибов'1 Schenck, Perez, 1988). Споры и их препараты изучали методами . втаоптической и электронной микроскопии. Подготовку объекта для зучения в светооптическом микроскопе проводили по методике Крю-эр (Крюгер, и др., 1968)..

Электронномикроскопические методы. При подборе режима фикса-п, обезвоживания и препарирования микоризованных корней для аднсмииссионной и сканирующей электронной микроскопии (ЭМ) осно-¿вались на имеющихся в литературе данных по другим ВАМ грибам irown, King, 1982; Boniante-Jasolo et al., 1986). Внесены мода-тации в существующие методики с учетом особенностей жизненного гкла эндофита. Увеличивали время фиксации в глутаровом альдегиде зависимости от возраста растений. После обычной двойной фиксации ■лутаровый альдегид - четырехокись осмия) применили постфиксацию 1% галловой кислоте (Лебский, Телепова, 1976). Данные модифи-ции общепринятой методики позволяют одновременно и полноценно фиксировать разные по плотности и составу ткани растения и ибного симбионта. Срезы делали на ультрамикротоме Relchert-ng (Австрия) с применением алмазного ножа, размещали на блендах формваровой подложкой и окрашивали уранилацетатом и цитратом инца. Исследования проводили в микроскопе Н-300 (Hitachi) при коряицем напряжении 70 kv. Для сканирующей ЭМ образцы после фикции и обезвоживания, высушивали в ^углекислоте в установке сушки л критической точке НСР-2 (Hitachi), напыляли золотом в катодно-

ионном испарителе и исследовали в микроскопе JSM-T-20Q (Jeoi) при ускоряющем напряжении 15 kY.

Рентгеновский микроанализ. Корни со спорами гриба подвергали замораживанию-высушиванию, монтировали на бериллиевые пластины, напыляли углем. Материал исследовали в сканирующем электронном микроскопе JSM Т-300, сопряженным с рентгеновским микроанализатором марки Link Mod 860-500, при ускоряющем напряжении 16 kY. Время набора сигнала - 100 сек, глубина зонда - 10 мкм. Сигналы считы-вались с точки и с площадки 10x14 мкм при увеличении 10 тыс.

Электронная цитохимия. Определение локализации Саг* в гифах эндофита проводили по методу Вика и Хелпера (Wick, Helper, 1989). Материал изучали в в трансмиссионном электронном микроскопе Н-300 (Hitachi) при ускоряющем напряжении 70 kv.

РКЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Определение видовой принадлежности штамма N 7 Glomus вр.

Исследуемый штамм эндомикоризного гриба выделен из корней земляники и отнесен к роду Glomus (Муромцев и др., 1984). Жизненный цикл и образование спор исследовали в течение 3-х вегетационных периодов. Эндофит. развивается в корнях и образует везикулы и арбускулы, типичные.для эндомикоризных грибов. Мицелий (экстрамат-рикальный и интраматрикальный) имеет диаметр гиф J-iO мкм, толщину стенок 0,08-0,2 мкм. Гифы дихотомически ветвятся и распространяются одиночно ил^ пучками по коре корня, не образуя колец. Спорокарпы не обнаружены. Споры формируются внутри корней одиночно или в виде скоплений. Предшественниками их являются тонкостенные везикулы. Споры имеют шаровидную форму диаметром-60-110 мкм. Цвет спор в светооптическом микроскопе от светло-желтого до коричневого. Несущая гифа имеет диаметр 6-10 мкм и соединяется со спорой отверстием циллиндрической формы (рис.1). Оболочка .споры имеет сложное строение (рис.2). Нарушая и внутренняя стенки оболочки не разделяются и образуют одну группу с характерной пластинчатой - В(Ю-укладкой хитиновых фибрилл. Внутренняя стенка зрелых спор состоит из нескольких слоев. У молодых спор существует внешняя тонкая оболочка - А(Е), исчезающая со временем.

Основываясь на таксономических критериях определителя везику-лнрно-арбускулирных грибов (Schenk, Perez, 1988), исследуемый эндофит отнесен к виду lntraradlces и существует в коллекции ВАМ грибов ВНИИСХМ как GlomuB lntraradicee шт.7.

цитоплазма

I 2,3,4.

оболочка

трт I

несущая гифа'1

Е L L А(Е) В(Ъ)

Рис Л. Спора Glomus Рис.2. Схема оболочки споры Glomus lntraradlces .intraradlcee. А, В - группы оболочек; Е, L - типы оболочек . ' • (К - исчезающий, L - пластинчатый):

1,?,3,4 - номера слоев.

ГЛАВА 4. Цитоморфология Glomus lntraradlces шт.7 в онтогенезе.

Первую фиксацию материала проводили на седьмые сутки после «явления ростков. Растения находились на стадии двух настоящих тстьев. Длина главного корня достигала 5-7 см, боковых'корней -,о I см. На данной стадии взаимодействия гриба и растения'- происхо-,ит контакт гиф Glomus Intraradlcee шт. 7 с наружным слоем клеток орня. Гифы из инокуляционного материала толстые, диаметром 5-10 км, дихотомически ветвятся, образуя более тонкие гифы от I до 1,8 км в диаметре. Тонкие гифы оплетают корень тест-растения, не фор-ируя плотного чехла. Наиболее часто мицелий встречается на боко-их корнях в зоне развитых корневых волосков. Кончики корней .и. )рни первого порядка остаются интактннми. Гифы на поверхности гадермальных' клеток и на корневых волосках образуют простые по эрме аппрессории размером от 3 до 10 мкм. Таким образом, система >иб - хозяин находится в состоянии "преинфекции".

Следующий этап симбиотических взаимодействий - проникновение шба в корень. Для Glomus lntraradlces шт. 7 характерно формиро-1ние инфекционных гиф из аппрессорий (рис.3). Тонкие гифы внедря-■ся по межклетникам без образования аппрессорий. От. точки проник-|вения гифн дихотомически ветвятся, увеличиваясь в диаметре до 4 мкм, и распространяются вдоль корня одиночно, попарно или тя-ми: Картина инфекции представлена отдельными-очагами в дифферен-рованной зоне корня. Из межклетников гифы постепенно проникают утрь клеток кортикального слоя, не инфицируя столлу..

Рис.3. Проникновение гриба в корень. С - спора, KB - корневой волосок, Г - гифа, ГВ -гифы внутриклеточные, ГМ - гифы межклеточные, АП - агшрессории.

Процессы внедрения гифы из межклетника и из другой клетки сходны (рис.4). В точке внедрения гриба клетка растения образует утолщении. Гифа может проникать в клетку, которая уже инфицирована. Ншюсредственно с цитоплазмой хозяина эндофит не контактирует. Проникающая гифа, за счет инвагинации плазмалеммы растительной kjiutkii оказывается окруженной со всех сторон этой мембраной. Образующееся между грибом и растительной мембраной пространство называется инторфациальним. В нем непосредственно происходят важнейшие процессы взаимодействия макро- и микросимбионтов и интегрируются функции обоих партнеров. Таким образом, за 4-7-дней, от мрет проникновения гифы расходятся по межклетникам, ветвятся, проникают внутрь клеток. Glomus lntraradlces не образует шутри клетки растения колец из гиф, типичных для многих эндоми-коризных грибов. Мицелий характеризуется плотной многослойной клеточной стенкой толщиной 0,08-0,6 мкм у внутриклеточных и 0,1-0,6 мкм у межклеточных гиф (рис.Б). Цитоплазма гиф содержит "многочисленные рибосомы, липидные-капли, небольшие включения гликогена. Характерно для гриоа наличие в цитоплазме электронно-плотных гранул, окруженных мембраной и без нее. Аналогичные

Рис.4. Проникновение гифц в клетку. Стрелками показано утолщение,

Эбозначения к рис.4;5 : ГМ - гифа межклеточная, ГВ - гифа внутриклеточная, ЯП - интерфациальное гфостранство, П - мембранные пузырьки, ПМ - перифациальная мембрана, СГ - стенка гриба, ПМТ- па-замуральные тела, Р - рибосомы, Г - электронноплотные гранулы, Л -пипидные вакуоли, ПЛ - плазмалемма, КС - клеточная стенка расте-1ия, ШЕР - шероховатый эндоплазматический. ретикулум, М - мито-юндрия, аГ .- аппарат Гольджи, В - вакуоль, Я - ядро.

включения у других везикулярно-арбускулярных грибов на 65% состоят из фосфора и кальция (White, Brown, 1979). Парамуральние тела содержат большое количество мембранных пузырьков, сходных с таковыми в интерфациальном пространстве. Цитоплазма клетки-хозяина в зоне, прилегающей к гифам богата митохондриями, шероховатым эндоплазматическим ретикулумом и свободными рибосомами. Хорошо развит в этой зоне Аппарат Гольджи.

В период Y-IO дней развития грибного мицелия Glomus intrara-dices во внутренних слоях кортикальной зоны корня образуются ар-бускулы. Они развиваются в клетках близко к проводящему пучку, что, по-видимому, связано с обменом питательных веществ- в системе гриб-хозяин. На протяжении вегетационного Периода арбускулы неоднократно образуются и разрушаются. Период развития арбускул гриба Glomus intraradlces шт. 7 занимает время до 10 дней и состоит из следующих этапов. Межклеточная гифа или гифа из-соседней клетки проникает в клетку и начинает многократно ветвиться (рис.6). От мощного ствола арбускул отходят толстые ветви, которые постепенно образуют мутовчатые окончания с тонкими веточками 0,5-1 мкм в диаметре. Каждое ответвление арбускулы окружено цитоплазматической мембраной (ЦПМ). являющейся продолжением ЦПМ клетки растения. Таким образом, формируется внутриклеточная структура грибного эндофи-тя, отделенная от цитоплазмы клетки хозяина перифациальной мембраной и интерфациалышм пространством, через которое осуществляется перенос веществ от гриба к растению и обратно. Цитоплазма вокруг ароускул богата пластидами, рибосомами и шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Ствол и ветви арбускул имеют толстую многослойную клеточную стенку, вакуолизированную цитоплазму с електрон^ пошютшми гранулами. Ультраструктура апикальных зон арбускул достигает большого разнообразия. Клеточная стенка утончается, исчезает многоедойность. Цитоплазма насыщена мембранными структурами: , пузырьками, трубочками, мультивезикулярными (парамуральными) телами. Сильно развита система замкнутых мембран. Несомненно, что развитый мембранный аппарат в цитоплазме арбускул, интерфациальном пространстве и прилегающей зоне клетки растения свидетельствует об активных процессах, идущих в системе гриб-хозяин.

Постепенно цитоплазма апикальных частей арбускул дегенерируем, ''образуется большая вакуоль. Это свидетельствует о старении арбускул. b этот момент в цитоплазме клетки-хозяина и в вакуолях оониружиьаытся неокруженныо мембрвной электронноплотные гранулы.

Рис. 6. Ароускулы Gloraas intraradicee в клетка корня (а) и поперечный срез клетки с арбускулами (0). I - максимальное развитие арбускул в клетке, 2 - разрушение апикальных зон, 3 - остаточные тела. Ас - ствол арбускул, Ав - ветви арбускул, А - апикальные зоны арбускул, ИП - интерфациальное пространство.

Пока что не установлена связь между гранулами в гифах и гранулами в цитоплазме растения. Возможно, они одной химической природы, и посредством гриба происходит перенос веществ в том числе и фосфора в ткани растения. Это согласуется с предположением о том, что транспорт веществ идет через живые арбускулы. В результате растение получает необходимые вещества, недоступные для'немикори- . зованного растения. В процессе дальнейшего старения арбускул апикальные зоны отделяются септой от активной части и постепенно разрушаются - "схлопываются", образуя скопления из инертного материала грибной стенки. Постепенно клетка растения наполняется остаточными телами, образующими в растительной клетке большие скопления из стенок гриба и электронноплотного матрикса. Арбускулы стари ют не одновременно, в одной и той же клетке можно наблюдать как активные, тык и разрушенные арбускулы. Морфологические характеристики жизненного цикла арбускул Glomus Intraradicee щт. 7 в корнях ' суданской травы стабильны на протяжении всего вегетационного пери-

одя. Различив заключается лишь в количестве клеток, заполненных арбускулами. Наибольшее число их наблюдали в первой и. второй трети всего цикла развития гриба. Для растения это периоды наиболее ак-тинного роста и увеличения зеленой массы. В последней трети цикла количество клеток, заполненных аморфной массой, превышало количество клеток с активными арбускулами.

В течение первой недели развития Glomus intraradlces шт. 7 в • корнях образуются отдельные везикулы, которые располагаются на гифах терминально или интеркалярно. Они чаще встречаются в межклеточных пространствах, чем внутри клеток корня. К 14 даю размеры их достигают 40-60 мкм. На ранних стадиях развития везикулы имекЛ оболочку толщиной 8-10 мкм и цитоплазму, .заполненную мелкими литщшми каплями.

•Второй этап цикла развития Glomus intraradlces шт.7 характеризуется распространением гиф по корню. Инфицируются практически Все тонкие корни. Старые толстые корни остаются интактними. Внутренний слой клеток кортекса интенсивно заполнен арбускулами. Много мелких везикул, распределенных по всей длине" инфицированных участков корня (рис.7). Отличительной чертой Glomus Intraradlcee является образование спор внутри корня. Споры формируются из тонкостенных везикул, как правило, сосредоточенных группами в опреде-. ленных зонах. Это позволяет рассматривать везикулы не только какзапасающие органы, но и как метаморфизированныэ споры. К концу второго месяца вегетационного периода отмечено мощное развитие внешнего мицелия, состоящего в основном из толстых ветвящихся гиф. ■ Растение контролирует количество гриба в тканях корня на протяжении всего вегетационного периода, вплоть до образования спор.

Рис. 7. Арбускулы и везикулы Glomus Intraradlces на этапе интенсивного развития гриба в корне растения. А - арбускулы, В -'везикулы.

Дня Glomus intraradices образование мощного наружного мицелия совпадает с периодом начала цветения растения. Известно, что для своего роста микориза требует много энергоемких продуктов фотосинтеза (Вагеа et al., 1984), "которых, возможно, в период цветения растения не хватает грибному симбионту, что смещает развитие мицелия в сторону образования большего количества внешних гиф. Обильное количество наружнего мицелия наблюдается в течение примерно недели. В этот период происходит реинфекция корня. Образуются новые точки инфицирования Н9 количество их намного меньше, чом в начале.

К 9-10 неделе вегетационного периода эндофит подходит к 'стадии созревания спор - третий этап развития Glomus intraradices шт.7 в корнях (рис. 8).

Рис.8. СЮтив Intraradices в корне на этапе образования спор. С -споры', В - везикулы, А - арбускулц..

Во внутренних слоях .клеток кортекса наблюдается много клеток, заполненных инертным грибным материалом. Вероятно, на данной стадии завершаются процессы мобилизации грибом фосфора и других элементов. Баланс между "платой и.выгодой" смещается в сторону эндофита, переходящего в стадию созреванйя спор. .Образование кластеров спор приводит к деформации корней . Со второй половины и до конца третьего месяца вегетации корни в зонах, где сосредоточены споры, набухают и частично разрушаются. Растение к этому сроку уже выходит в стадию созревания семян и разрушение некоторых участков корней не влияет на состояние растения. К концу третьего месяца вегетации таких участков становится больше. При дальнейшем разрушении покровов корня, зрелые споры гриба оказываются в почве.

Размеры спор Glomus intraradices шт.7 находятся в пределах • бо-по мкм. Споры многоядерны, цитоплазма заполнена большим коли-

чоством липидных капель. Цвет спор от желтого до коричневого. Зре-Jii/e споры Glomus intraradicee шт.7 имеют оболочку толщиной 3-5 мкм, состоящую из нескольких слоев. Электронномикроскопическое исследование выявило более сложный характер организации оболочки, чем при традиционном изучений в светооптическом микроскопе. Показано что оболочка может включать несколько разных по толщине и плотности слоев: более однородный наружный слой толщиной 0,8-2,1 мкм и чиредуидиеся по Электронной плотности внутренние слои суммарной толщиной 0,2-0,7 мкм, с характерной пластинчатой структурой.

Glomus lntralradices шт.7 не образует спорокарпов. На четвертый месяц от начала инфекционного цикла при влажном просеивании почвы из опытных сосудов, обнаруживаются одиночные споры и скопле-^ ния их, иногда оплетенные редкими и толстыми (до 9 мкм), сильно ветвящимися гифами. Образование сопутствующих гиф выполняет функцию защиты и сохранения спор в почве. Оболочки спор Glomus Intraradicee шт.7, выделенных из почвы и разрушающихся корней, в конце четвертого месяца содержат бактерии, которые колонизируют только наружний слой, не проникая во внутренние пластинчатые слои и в цитоплазму спор. Размеры бактерий 0,6-1,1 мкм. Содержимое цитоплазмы гранулировано, с элетронносветлыми включениями, занимающими большой объем клетки. Внутри стенки спор и гиф бактерии образуют •лакуны, находясь в которых они защищены от внешних воздействий. Бактерии в стенках спор могут играть положительную роль, поскольку в работах Мосс (Mosse, 1962) показано, что споры микоризных грибов ■ но прорастают без бактерий. Бактерии защищены в лакунах от стерилизации, отсюда спонтанное заражение чистых культур ВАМ грибов. Возможно, что бактерии в стенках Glomus intraradicee шт.7 также способствуют прорастанию спор и инфицированию растений.

. Глава 5. Рентгеновский микроанализ спор и гиф Glomus Intraradicee и локализация внутриклеточного кальция в гифах гриба.

.Рентгеновский микроанализ оболочек и внутреннего содержимого спор/Glomus intraradicee шт. 7 показал, что наружный слой оболочки додержит большое количество кальция (рис.9а), пик фосфора незначителен- По мере перехода к внутренним слоям оболочки.споры снижается количество кальция и увеличивается содержание фосфора и калия (рис.96). Спектр внутреннего содержимого споры имеет мощный пик фосфора (рис.Эв).

Рис.9. Данные рентгеновского микроанализа наружного(е), внутренних (б) слоев оболочки и (в)-содержимого спор Иотиа 1п1га-га<11се0.

Характеристический спектр оболочки спор содержит семь пиков элементов: 51, Р, Б, С1, К, Са, Мй. Для спектров стенки гиф, включающих шесть пиков элементов (Мз, 01, Р, Б, К, Са), характерно повышенное содержание кальция (48,8%) и Р (24,6%). Эндогенный кильций в гифах, определенный цитохимически, локализован, главным эбразом, на плазмалемме, непосредственно прилегающей к ободочке ;'и(1ы, на периферии больших вакуолей и в области мембранных структур и пузырьков в цитоплазме гиф.

Рентгеновский микроанализ можно использовать как важнейшие

инструмент в исследованиях взаимодействий ВАМ грибов и растений, позволяющий исследовать симбиотическую систему в состоянии, наиболее близком к прижизненному.

Глава 6. Споры Glomus Intraradlcee шт.7 в семенах Chenopodium album.

Развитие и жизнедеятельность Glomus Intraradlces, вплоть до ' образования спор, проходят в корневых тканях. Вопрос о существовании стадии жизненного цикла ВАМ грибов вне корней остается малоизученным. В наших исследованиях в конце четвертого месяца вегетации методом влажного просеивания простерилизованной почвы из сосудов с опытными растениями суданской травы выделены семена Chenopodium album (лебеда обыкновенная), часто встречающиеся в используемых в опытах луговых почвах. Семена были за полнены спорами гриба и тол- ' стымй ветвящимися гифами. По всем таксономическим и морфологическим признакам споры принадлежали Glomus intraradlces шт.7 и были сходны с кластерами спор, выделенных из корней и почвы. Вероятно, н определенный момент гриб проникает внутрь семени через оболочку и начинает там развиваться. В связи с этим следует отметить, что, цо-первых, везикулярно-арбуокулярные грибы не растут вне корня на искусственных средах, во-вторых, Glomus intraradlces практически не образует спор вне корня, в-третьих, растения сем. Chenopo-dlaceae, в том числе и лебеда принадлежат к тем немногочисленным семействам растений, которые немикотрофны. Тем не менее, нахождение спор в семенах может быть неслучайно. Сочетание таких условий, ,как наличие питательных веществ, замкнутость пространства невероятно еще каких-либо, пока неизвестных факторов, и определили возможность развития гриба в семенах Chenopodium album. Споры в таком состоянии защищены от неблагоприятных условий. Таким образом, семена Chenopodium album можно рассматривать как своеобразную.экологическую нишу для Glomus intraradlces, где проходит определенная стадия в цикле развития эндофита.

виводы

, 1 .Исследуемый эффективный штамм Мотив ар. N 7 эндомикориз-ного гриба идентифицирован как Glomus Intraradlces.

2.Модифицированы методы фиксации и препаровки микоризовашшх корней для'электронной микроскопии с учетом биологических особенностей онтогенеза эндофита.

3.Изучен жизненный цикл гриба Glomus intraradlces шт.7 с использованием светооптической и электронной микроскопии. Внедрение эндофита происходит по межклетникам или при образовании аппрессо-рий на корневых волосках и поверхностном слое клеток корня. Показано, что гриб развивается в паренхиме, не проникая в стеллу. Мнтраматрикальный мицелий представлен внутри- и межклеточными гифами. Гриб не образует кольцевых гиф, типичных для многих ВАМ грибов..Во внутренних слоях клеток коры формируются арбускули, которые неоднократно образуются и разрушаются в течение одного вегетационного периода. Отмечено наличие большого числа везикул, часть из которых превращается в толстостенные споры, образуя ' скопления внутри корня. Споры попадают в почву при старении корней в конце вегетационного периода растений. Жизненный цикл эндофита до выхода зрелых спор в почву занимает три месяца.

4. Изучена ультраструктура мицелия, арбускул, везикул и спор эндофита на разных стадиях онтогенеза. Для интраматрикального мицелия характерна элек?ронноплотная многослойная клеточная стенка, которая у арбускул постепенно утончается к апикальным частям. В цитоплазме гиф й арбускул кроме обычных для грибов клеточных органелл отмечено большое содержание рибосом, элентронноплотных включений и многочисленных мембранных структур - пузырьков, трубочек, мулътивезикулярных тел. Внутриклеточные ги$и и арбускулы отделены от цитоплазмы клетки-хозяина интерфациальным пространством и перифациальной мембраной растительного происхождения. Цитоплазма спор и везикул содержат большое количество лигощшх капель. Оболочка зрелых спор имеет сложное строение с характерной укладкой хитиновых фибрилл, формирующих наружный однородный слой и разные по электронной плотности внутренние слои оболочки.

Ь. Методом рентгеновского микроанализа показано, что характеристический спектр оболочки содержит q¿Mb элементов: SI, Р, S, 01, К, Са, Mg. В наружном слое оболочки отмечено значительное количество кальция. В цитоплазме спор преобладающим элементом является фосфор.

6.обнаружена стадия развития Glomus intraradlces шт.7 вне корня растения. Споры эндофита формируются в выделенных из почвы покоящихся семенах немикотрофного растения лебеды обыкновенной Chenopodlum album.

■ Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. В.К.ЛебскиЯ,' Е.С.Краева. Применение рентгеновского микроанализа для исследования андомикоризы и ризопланы.// Тез. докл. VI Всесоюзного симпозиума "Ультраструктура растений". Чернигов, 19-21 апр., 1988. с.244.

2. Е.С.Краева, Н.Н.Камардин, В.К.ЛебскиЯ. Ультраструктурный и элементный анализ споровых структур эндомикоризных грибов.// Тез. ' докл. II Всесоюзной конференции по биологической роли микроэлементов и их применения в сельском хозяйстве и медицине. Самарканд, 3-6 окт., 1990. Т.II, С.290.

3. Н.Н.Камардин, Е.С.Краева, Е.В.Моржина, В.К.Лебский. Исследование локализации кальция в симбиотичаских азотфикскруюющкх бак> териях и ендомикорирчых грибах.// Цитология. 1991. Т.33. *9. С.73.

4. Е.С.Краева, В.К.Лебский. Ультраструктурный и элементный анализ споровых оболочек эндомикоризных грибов.// Билл. ВНИИСХМ.

1991. Л64. С.69-61.

Б. Н.Н.Камардин, Е.С.Краева. Применение, метода замораживания-скалывания для изучения симбиотических взаимоотношений микроорганизмов и растений.// Тез. докл. IV Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Пукино на Оке, 20-24 янв.,

1992. С.61.

.6. E.S.Kraera, V.K.Lebsky, G.S.Kuromtsev. Studing the development cycle of Glomus вр.Т an efficient fungal eymbiont of crops.// Proceedings of the 4 th. International Mycologlcal Con-igress. Regensburg, Germany (P.H.G.), 28 Aug.-3 Sept., 1990. ' P.86. '

T. G.S.Muromtsev, L.Yakobi, E.Kraeva. Veeicular-arbuscular mycorrhiza : effectiveness conditions.// Proceedings of the International Symbiosis Congress. Jerusalem, Israel, 17-22 No?.,. 1991. VAA.

8. G.S.Muromtsev, E.S.Kraeva, V.K.Lebsky. Presence of Glomus lntr&radlcee spores in dormant eeeds of Chenopodlum album.// Proceedings of II Congress of European Mycologists. Kew, England, 7-11 Sept., 1992.P.30.

, РТП.Тш.ВНР.Зак.257.Тир.100. 14.04.93.