Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитомегаловирусная инфекция: действие интерферонов и их индукторов в комбинации с химиопрепратами in vitro и системе интерферона у больных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Цитомегаловирусная инфекция: действие интерферонов и их индукторов в комбинации с химиопрепратами in vitro и системе интерферона у больных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи Villi 578. 325. 12: 578. 245+615. 281+616-022. 6

ФАТХУТДИНОВА Ноиля Гусмановна

ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ: ДЕЙСТВИЕ ИНТЕРФЕРОНОВ И ИХ ИНДУКТОРОВ В КОМБИНАЦИИ С ХИМИ0ПРЕПАРАТАШ1 IH VITRO И СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНА У БОЛЬНЫХ

03. 00. 06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена б НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Директор Института - Академик РАМН, профессор Д. К. Львов

Научный руководитель - доктор медицинских наук II. Н. Носик

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор В. 1.1 Стаханова

- доктор медицинских наук, профессор В. Я Кицак

Ведущее учреждение - НИИ эпидемиологии и микробиологии

им. 11 Ф. Гамалеи РАМН

Оащита диссертации состоится " " ^О/^Л 1992 г. е -Щ часов на заседании Специализированного совета Д 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН ( Москва, 123093, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАЖ

Автореферат разослан " £ " НбЛ&А 1992 г.

Ученый секретарь 'Специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

■ппртт^шлр

DU Д i-i 1 ¿J1 CJ

Актуальность проблемы.

Несмотря па значительный прогресс,достигнутый в предупреждении и лечении вирусных заболеваний, они продолжают занимать ведущее место среди инфекционной патологии. Одним из широко распространенных вирусных заболеваний, в лечении которых пока не получено ощутимых результатов является цитомегаловирусная ( ЦМВ) инфекция. В мире вирусом цитомегалии инфицировано около 80% взрослого населения.

ЦМВ инфекция является серьезной проблемой для больных с дефектом системы иммунитета и основной причиной смерти иммуносу-прессированных лиц,особенно реципиентов костного мозга (Erice А., et.al.,1939 ). Интерес к цитомегалии в последнее время возрос в связи с частым проявлением этой инфекции у больных СПИДом (Qu mann G. V. ,et. al. ,1934; Jacobson MA. ,et. al. ,1983). ЦМВ известен как внутриутробный вирус. Большую опасность представляет эта инфекция для беременных женщин с физиологическим снижением активности иммунной системы. Обычно ЦМВ инфекция протекает без клинических проявлений и часто остается нераспознанной, но у женщин в период беременности вирус может активироваться и инфицировать плод, что нередко приводит к невынашиванию плода, преждевременным родам, мертворождениям и различным аномалиям развития с высокой летальностью. Среди новорожденных ЦМВ инфекция выявляется в 0,22,2% случаев. Летальность детей достигает 20-30%, а у более чем 90% выживших проявляются различные осложнения (психоневрологические нарушения, торможение психомоторных реакций, задержка интеллектуального и речевого развития, глухота, хориоретиниты с атрофией зрительного нерва) (Stagno S. , Whitley R.J. , 1985).

Учитывая, что в основе патогенеза ЦМВ инфекции лежат иммунологические сдвиги, такие как снижение активности Т-хелперов, мак-

рофагов и естественных киллеров (ЕЮ ( Rook Н. Н. ,et. al. ,1985; Ци-ронкайте Э. Ф. , Палайкене 3. И. ,1987), функции которых также зависят от состояния системы интерферона, можно предположить важную роль иммуномодулятороЕ - интерферона и его индукторов - в комплексном лечении этой инфекции.

Одними из наиболее эффективных химиопрепаратов избирательного действия против ЦМВ являются ганииклоЕир и фоскарнет. Однако высокая токсичность препаратов ограничивает их широкое применение. Есть данные о применении лейкоцитарного о^-ИФН в лечении и профилактики ЦМВ инфекции, свидетельствующее oö эффективности его профилактического использования (Hirsch М. S. at. al. , 1933; Meyers J. D. et. al. ,1987). Одним из направлений профилактики и лечения вирусных инфекций является комбинированное использование химиопрепаратов с различным механизмом противовирусного действия, другими -применение индукторов ИФН, а также сочетанное использование химио-препаратов с ИФН или индукторами ИФН. Получены первые положительные результаты применения индуктора природного дсРНК. - ларифана при лечении рецидивирующего герпеса (Самгин М. А. , Носик Н. Н. и др. , 1991). Впервые дано экспериментальное обоснование эффективности комбинированного применения аналогов пирофосфата или ациклогуано-зина отечественного синтеза с индукторами ИФН ларифаном или ри-достином на различных экспериментальных моделях герпесвирусной инфекции (Л1.ВОЕ НД., Самойлович Е. О. и др. ,1939).

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение противоцитомегаловирусной активности ряда новых отечественных препаратов ИФН. индукторов ИФН и химиопрепаратов, разработка их комбинаций и схем применения для усиления противовирусного эффекта: оценка функционального состояния системы интерферона у боль-

ных ЦМВ инфекцией, в том числе у контингентов повышенного риска -беременных и детей раннего возраста.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- разработать наиболее эффективные комбинации химиопрепара-тов с И'ГН или индукторами И'ГН;

- определить ряд показателей интерферонового статуса в зависимости от формы заболевания и оценить их значимость с целью разработки подходов к возможной коррекции функций системы ИФН и иммунитета.

Научная новизна.

Впервые была показана антииитомегаловирусная активность индукторов ИФН - до РНК ¡'ларнфана и ридостина) в системе ш у^го п проведено сравнительное изучение их действия в профилактической и лечебной схемах. Установлена высокая противовирусная эффективность комбинаций ациклогуанозина (Ацг) и ганцикловира с ИФН и их индукторами, позволяющая при снижении доз препаратов получить си-нергидный эффект.

Выявлены нарушения в системе ИФН у больных ЦМВ инфекцией: повышение уровня циркулирующего ИФН и снижение способности лейкоцитов периферической крови к продукции ИФН, изменения уровней ин-терферонзависимых ферментов. Установлена обратная корреляционная зависимость уровня циркулирующего ИФН и активности ЕК у беременных женщин с ЦМВ инфекцией. У детей, матери которых имели активную инфекцию обнаружены повышенный уровень циркулирующего ИФН в сыворотке крови и тенденция к снижению иммунного ИФН.

Практическая ценность. 1. Эффективность комбинированного применения химиопрепаратов с ИФН или индукторами ИФН в культуре клеток позволяет рекомендовать ис-

пользование таких сочетаний препаратов для клинического изучения.

2. У Сольных женщин с активной формой ЦМВ инфекции отмечается повышение уровня циркулирующего ИФН в сыворотке крови,снижение способности лейкоцитов к продукции »/-и /'-ИФН,снижение активности ин-терферонзависимой протеинкиназы и ЕК, наиболее выраженная у беременных. 'Эти показатели могут быть рекомендованы в качестве дополнительных критериев сценки активности, характера течения ЦМВ инфекции и контроля за эффективностью профилактики и коррегирующего лечения.

3. Установлено, что у детей, родившихся от матерей с активной инфекции наблюдается повышенный уровень сывороточного ИФН и тенденция к снижению активности лимфоцитов продуцировать иммунный ИФН.

Положения. выносимые на защиту.

1. Индукторы ИФН (ридостин и ларифан) и ИФН оказывают эффективное противовирусное действие в культуре инфицированных ИМВ фибро-бластов. преимущественно при профилактическом применении.

2. Отечественные препараты Ацг, ФУК, Ара-А обладают противоцито-мегаловирусной активностью in vitro.

3. Сочетания Ацг, ганцикловира. ФУК с ИФН или с индукторами - ла-рифаном и ридсстином - обладают синергидным противоцитомегалови-русным эффектом.

4. Обнаружены нарушения функционирования системы интерферона при 11МВ инфекции, проявляющиеся повышенным содержанием циркулирующего ИФН в сыворотке периферической крови, снижением продукции о/-и f-ИФН in vitro в отЕет на специфическую стимуляцию, снижением активности ЕК и изменением уровней интерферонзависимых ферментов: снижением протеинкиназы и тенденцией к повышению 2-5А синтетазы.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены и обсуждены на

2-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991 г.), на международном симпозиуме по интерферону (Торонто, Канада,1992 г.).

Диссертация апробирована 13 октября 1992 г. на заседании Окепертного Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского.

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав собственных исследовании, обсуждения результатов и выводов. Список использованной литературы включает 235 источников, из них 200 зарубежных. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 23 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки. В работе использовал:! диплоидную культуру кожно-мы-шечных фибробластов эмбрионов человека, штамм М-19 С 9-22 пассажей) , полученные из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов и. клетки миелолейкоза человека К-562 в качестве мишеней для ЕК, полученные из лаборатории культуры клеток Института вирусологии им. Д. И. Ивановского.

Среды. В качестве ростовой и поддерживающей среды для фибробластов человека использовали среду Игла,содержащую 2-10% телячь-

о

ей сыворотки, инактивированной нагреванием до 56 С в течение 30 минут, глютамин, пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл.

Для культивирования миелолейкозных клеток использовали среду

RPMI-1640 с 10% инактивированной фетальной сьшороткой (Flow lab.).

Вирусы. В работе использовали ЦМВ человека, штамм Ad 169; вирус везикулярного стоматита ( ВВС), штамм Индиана; вирус болезни Цьюкастла (ВЕН), штамм "И", полученные из музея вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского. Инфекционность вирусов определяли методами титрования по ЦПД и бляшкообразованию.

Препараты.

Интерфероны: человеческий лейкоцитарный °/-ИФН ( "Egij",Венгрия); рекомбинантные ы^-ИФН (реаферон) и /-ИФН ( Минмедбиопром.НПО "Фермент"); рекоыбинантный_^-ИФН ( ШФ,"Диагностикум". Львов) ;

Индукторы ИФН: ларифан (дсРНК фага f2) синтезирован в Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна АН Латвии): ридостин (дсРНК дрожкей Saccharomyoes cerevisiae ( НИКТИ BAB. Еердск); фитогемаг-глютинин (Ф'ГА) (кооператив "Наследственность и лаборатория",РНМГЦ АМН, МоскЕа) ;

Химиопрепараты: аииклогуанозин ( 9-( 2-гидроксиэтоксиметил) гуанин) (Институт органического синтеза АН Латвии), любезно предоставлен Г. А. Галеговым; ганцикловир (9 -(1,3 -дигидрокси-2-про-поксиметил) гуанин) ( Syntax Pharm AG. All Schwill. Switzerland); фосфоноуксусная кислота (ФУК) синтезирована в Институте физиологически активных вешеств РАМН, любезно предоставлен Н. Д. Львоеым; видарабин ( Э^-О-арабинофуранозиладенин. Ара-А) (!.!инский институт Пиорганической химии, АН Белоруссии); цитарабин ( l-^-D-арабино-фуранозилцитозин, Ара-Ц ( "Calbiochem",США).

Использовали культуральные. вирусологические методы, подробная характеристика которых представлена в соответствующих разделах работы.

Титрование интерферона проводили с помощью микрометода по подавлению ЦПД тест-вируса - ВВС (Campbell J. ,Grunberg-er T. et. al.

Носик Д. IL .. Лспетсв Р. Д. и др. 1982).

Интерфероновую реакцию лейкоцитов tИРД) оценивали в пробах цельной крови (Соловьев В. JL ,Еектимиров Т.Д. .1981: Григорян С. С. , Майоров И. Л. и др. , 1938).

Тестирование пнтерферонзависимых ферментов проведено Соколовой Г. 14. 1 Buffrt-Janvresse С. .Hovanessian Л. G. , 1934; Соколова Т. М. и др. 1987.1988).

Активность естественных киллерОЕ определяли in vitro с помощью клеток-мишеней.меченных Н^-уридином по методике Рыкова МП. , Странде IIB. и др. 11981).

СРАВНИТ ЕЛЬНАЯ ОПЕНКА ПРОТИВОПИТОМЕГАЛОЕИРУСНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИШ1СПРЕПАРАТОВ. ИНТЕРФЕРОНОВ И ИХ ИНДУКТОРОВ.

Изучение токсичности химиопрепаратов. интерферонов и их индукторов в культуре клеток.

Изучение цитотоксического действия (ЦТД) химиопрепаратов проводили в неинфицированных клетках по изменению морфологии и по подавлению синтеза клеточной ДНК. В изученных нами высоких концентраций 100 мкг/мл Ацг и ганцикловир не вызьшали видимых изменении монослоя клеток. Включение Н -тимидина в макромолекулы клеток ингибировалось на 50% под влиянием ганцикловира уже в концентрации 40 мкг/мл. Ацг оказался менее токсичным соединением, чем ганиикловир, и даже в концентрации 200 мкг/мл не выявлена ин-гибиция синтеза ДНК клеток. ФУК не проявляла цитотоксического действия на морфологию и синтез ДНК клеток в концентрациях 200-250 мкг/мл. Увеличение концентрации препарата до 500 мкг/мл вызывало деструктивное изменение 50°. клеток на 2 день наблюдения и охватывало весь монослой клеток на 4 день. Антипролиферативный эффект Ара-Д был более, ярко выражен, чем у Ара-А: ЦТД50 составила

0,02 мкг/мл и 20 мкг/мл, соответственно. В тоже время оба препарата не оказывали видимого токсического эффекта на морфологию клеток в концентрации до 250 мкг/мл. Следовательно, для аномальных нуклеозидов определение иитотоксичности по синтезу ДНК является более чувствительным методом.

Природный о^-ИФН не оказывал токсического действия на морфо-

' 5

логию клеток в концентрации 10 ед/мл. тогда как рекомбинантный <4-ИНФ в 10 раз меньшей концентрации вызьтал деструкцию 50% клеток. Однако, по ингибишш клеточной пролиферации ЦТД50 о^-ИФН была выше, чем ЦТД50 о/-и /-ИФН, а в концентрации 100 ед/мл наблюдалась стимуляция клеточного синтеза. Незначительное стимулирующее действие на синтез клеток проявлял и /-ИФН в концентрации 10 ед/мл. Ридостин не оказывал цитотоксического действия на морфологию клеток е дозе 1000 мкг/мл.но ингибироЕал синтез клеточной ДНК в'концентрации 150 мкг/мл. ЛариФан не оказывал ингибирующего эффекта на пролиферацию клеток в концентрации 250 мкг/мл, а при 5 мкг/мл даже усиливал их пролиферацию. Вместе с тем, в дозе 500 мкг/ мл вызывал цитодеструктивные изменения в монослое.

Изучение противовирусной активности химиопрепаратов.

В зараженную ЦМВ (инфицирующая доза 31g ТЦИД50/0,1мл) культуру фибробластов добавляли химиопрепараты (Ацг,ФУК и Ара-А) сразу после адсорбции вируса (йчаса),через 4, 16 и 24 часа. Все препараты достоверно подавляли репродукцию вируса только при внесении на ранних сроках инфекции (2,4 часа).

Нами определена зависимость антивирусного эффекта химиопрепаратов от длительности воздействия на инфицированные клетки. Результаты показали, что ганцикловиру достаточно 24 часов присутствия е культуре инфицированных клеток для достоверного подавления репродукции вируса, а через 43 часов наблюдалось полное ингибиро-

вание репродукции вируса. Антивирусная активность после 43 часового воздействия на инфицированные клетки проявлялась у Ацг,тогда как ФУК, Ара-А и Ара-Ц были еще неэффективны. Однако все препараты максимально снижали инФекнионный титр вируса, когда их вносили сразу после адсорбции без последующего удаления до учета результатов опыта (через 72 часа). Следовательно, эффект антивирусного действия химиопрепаратов достигается ранним и длительным воздействием на инфицированные клетки. Необходимо отметить, что удаление препаратов из культуральной среды инфицированных клеток способствует возобновлению ЦПД и повышению инфекционного титра вируса, т. е. наблюдается обратимый тип ингибишш.

Исследованные нами химиопрепараты (Ацг, ганцикловир, ФУК) достоверно и полностью ингибировали репродукцию ЦМВ in vitro в нетоксических концентрациях не только при низкой, но при высокой множественности инфекции (21г и 41g ТЦИД50/0,1мл. ). Ара-А и Ара-Ц были эффективны лишь при низкой множественности инфекции, а при увеличении инфицирующей дозы вируса эти препараты ингибировали репродукцию вируса в субтоксических и токсических концентрациях.

Несмотря на сходство структуры ганцикловира и Аиг, ганцикло-вир способен активнее ингибировать репликацию ЦМВ в культуре клеток, что связано с выработкой высокого уровня ганиикловир-трифос-фата f ТФ): ганцикловир-ТФ является более стабильным и дольше персистириует в инфицированных ЦМВ клетках после удаления препарата, чем Ацг. Ганцикловир обладает в 20 раз большей активностью против ЦМВ, чем Ацг: в одинаковых дозах О,005 мкг/мл ганцикловир ингибировал репликацию вируса на 4 lg при низкой множественности инфекции, а Ацг был неэффективен. Для достижения той же степени ингибиции при высокой инфицирующей дозе вируса (41g ТЦИД50/0,1мл) требовалось 10-ти кратное увеличение концентрации Ацг, а ганцик-

ловира - в 2 раза. Для получения достоверного ингибирующего эффекта требовалось 10-20 мкг/мл ФУК при низкой множественности инфекции и 50-100 мкг/мл - при высокой дозе вируса. Минимальные эффективные концентрации Ара-А составляет от 4 до 10 мкг/мл в зависимости от инфицирующей дозы вируса. Ара-Ц обладает выраженной антивирусной активностью в токсической концентрации 0,1мкг/мл при высокой множественности и в 10 раз меньше токсической Г 0,01 мкг/мл) при низкой множественности инфекции.

лимиотерапевтический индекс (ХТИ), расчитанный по отношению дозы препарата,ингибирующей на 50% синтез клеточной ДНК к 50% ви-русингибирующей дозе показал,что химиопрепараты можно расположить в порядке убывания противовирусного эффекта следующим образом: ганцикловир(8000) > Ацг(2000) > ФУК (10) > Ара-А (5) > Ара-Ц (4). Противовирусный эффект интерферонов и их индукторов на репродукцию ЦМВ в профилактической и лечебной схемах. Профилактическая схема.

Для определения зависимости профилактического противовирусного эффекта ИФН от времени воздействия, культуру клеток обрабатывали в различные сроки до инфекции. Сравнительное изучение антивирусной активности природного о/- ИФН и рекомбинантногоо^-ИФН, показало, что ИФН максимально ингибировали вирус при обработке ими клеток за 16-24 часа до инфекции.

Природный с^-ИФН достоверно ингибировал вирус начиная с концентрации 50 ед/мл при множественности инфекции 2 ТЦИД50/0,1мл и в концентрации больше 100 ед/мл при высокой инфицирующей дозе вируса. Следовательно,чем выше инфицирующая доза вируса.тем больше препарата необходимо для его подавления. Подобные результаты были получены для рекомбинантных о/г-и /-ИФН ( рис.1). При низкой множественности инфекции оба ИФН проявляли подобную антиви-

Рис.1 .Сравнение противовирусной резистентности клеток пос.ле н обработки рекомбинантными и Г интерферонами до инфекции в :! зависимости от концентрации и инфицирующей дозы ЦМВ.

ЦМВ,ингибиция,1£ ;!

10 100 1000 0 10 100 г>00

о/о -ИФН ед/мл /-ИФН

ЕЗЭ Н, И Не ТЦИДЬО/О,1мл

Рис.2.Сравнение противовирусной резистентности клеток после обработки индукторами Сридостином и ларифаном) в зависимости от концентрации и инфицирующей дозы ЦМь.

ЦМВ.ингибиция,^ ....... - .

10 50 100 ¿00 500 о 10 100 1000

ларифан мкг/мл ридостин

1,'ЕЭ 111; ИВ ТЦИД50/0,1мл

вирусную активность, а при высокой множественности - 1000 ед/мл с^-ИФН подавляли репликацию вируса на 41g, тогда как 500 ед/мл /-ИФН - полностью. Действие ридостина было несколько сильнее,чем ларифана при низкой множественности инфекции, но сравнимо при высокой инфицирующей дозе вируса: в концентрации 100 мкг/мл индукторы с одинаковой активностью подавляли репликацию вируса (рис.2).

Лечебная схема.

Параллельно с профилактической схемой нами исследована зависимость эффекта интерферонов и индукторов от времени обработки, концентрации и инфицирующей дозы ЦМВ в лечебной схеме применения.

Изучение динамики развития противовирусного действия ИФН при их внесении в разное время после инфекции показало, что природный J -ИФН С100 ед/мл) и рекомбинантный «^-ИФН (1000 ед/мл) ингибиро-Еали развитие ЦПЭ вируса на ранних этапах репродукции вируса: на i00% при обработке клеток в течении 4 часов и на 50% до 16 часов.

Ридостин и ларифан в концентрациях 100 и 200 мкг/мл существенно задерживали развитие ЦПД Еируса ( ЦПД составило 25%) при воздействии на клетки сразу после адсорбции вируса (2 часа) и через 4 часа после инфицирования. Ридостин оказывал более длительный антивирусный эффект, чем ларифан и частично задерживал ЦПД вируса при более позднем внесении препарата через 16-24 часа.

Сравнение активности рекомбинантных o/s -и У-ЖШ представлена на рис. 3. Если рекомбинантный с/,-ИФН подавляет репродукцию ЦМВ на 2.51g в концентрации 100-150 ед/мл при инфицирующей дозе 21g ТЦИД50/0.1мл, то для достоверного подавления вируса при дозе 41g ТЦИД50/0.1мл необходимо 1000 ед/мл су^-ИФК Гамма-ИНФ оказался активнее: в одинаковых концентрациях ( 500 ед/мл) /^ИФН подавляет урожай вируса в 100 и 1000 раз сильнее, чем о^-ИФН.

При высокой множественности инфекции эффект антивирусного

Рис.3.Сравнение,ингибиции урожая ЦМВ после обработки рекомби--нантными <¿2 и ■) интерферонами инфицированных клеток в зависим мости от концентрации и инфицирующей дозы вируса. ЦМВ,ингибиция,1£

100 500

■ о/о -ИФН

ед/мл ЕШ 'Н1; КЖЗ 21ц ЩИДЬОУОДмл

/ -ИФН

юо яоо

Рис.4.Сравнение ингибиции урожая ЦМВ индукторами ларифаном и ридостином в зависимости от концентрации и множественности инфекции (лечебная схема).

ЦМВ,ингибиция,1§ ...... . . .

г) о 100 ^.'00 500 10 100 1000

ларифан мкг/мл ридостин ТЦИДЬО/О,1мл

о

о

г. о

действия рекомбинантного ^-ИФН в концентрации 10 ед/мл соответствовал эффекту природного сУ-ИФН в такой же концентрации.

Ридостин и ларифан оказывали эффективное лечебное антивирусное действие на ЦМВ при высокой множественности инфекции только в субтоксических дозах (500 мкг/мл - ларифан и 1000 мкг/мл - ридостин) (рис.4), тогда как в профилактической схеме применения индукторы проявляли антивирусный эффект в концентрациях ниже токсических.

По терапевтической активности интерфероны и индукторы расположились в следующем порядке: </^ИФН > с/-ИФН > о^-ИФН > ^,-ИФН и ридостин > ларифан.

Профилактическое применение ИФН и индукторов ИФН эффективнее, чем лечебное, хотя выраженный противовирусный эффект отмечался и при внесении препаратов в первые часы после инфекции. Кроме того, для достижения лечебного эффекта сравнительно с профилактическим требуется использование препаратов ИФН и индукторов е более еысоких или субтоксических концентрациях, ингибирующих синтез клеточной ДНК. Вероятно, что их лечебное действие не является строго антивирусным, а возможно связано с антипролифератив-ным эффектом и опосредовано участием репликации клеточной ДНК в ранних индуцированных вирусом процессах.

Эффект комбинированного применения химиопрепаратов с интерферонами и их индукторами на репродукцию ЦМВ.

Профилактическая схема.

Для изучения антивирусной активности комбинаций препаратов клетки предварительно (за 24 часа до инфекции) обрабатывали ИФН или индукторами и сразу после адсорбции вируса добавляли химио-препараты (профилактическая схема; (таблица 1). Антивирусный эффект комбинаций препаратов оценивали по значению индекса частич-

Таблица 1

Э^рект комбинированного действия ациклогуанозина (Ацг), ганцикловира и фосфоноуксусной кислоты 1ф'.Ж1 с интерферонами и их индукторами на рнпродукцпга ЦМВ в профилактической схеме.

1 I

химнопррр.аратп | Интерфероны в ед/мл | Индукторы в мкг/мл

! : , : на ;еО-1 \ НИР 1 кпнц. МКГ/ мл титр вируса в 1в ь/-ИФН /-ИФН ридостнн ларпфон | 1

юн 10 100 10 100 10 100 10 50 10 |

! ! | ! 6.0 5.0 6.0 5.0 6.0 3.5 5.0 4.0 6.0 5.5 6.0

I 1 ! ' Оцг 1 ! 1 1 0,05 5.0 1.0 1: 1 £ 1 . ■ 2.0 2.0 Г. 0 1.0 С 0 г 3.0 с 0 С 1.0

0.005 6.0 2.0 с 5.0 с 4.0 с 5.5 0 2.0 Г. 3.0 г. 2.0 С 5.0 3.0 с 5.5 й

I 1 1 ! ! Ганцик-ловир ! 0,025 4.0 0 с 0 С 0 с 0 С 0 с 0 с 0 с 2.0 Г 0 с 1.0 С

0,005 6.0 2.0 1: 3.0 с 3.0 г. 4.0 с 2.0 с 3.0 с 2.0 с 5.0 3.0 с 3.0 С

1 ! ФУК 1 ! 1 50,0 4.0 0 1' н.и. 1.0 3.0 о н.и. н.и. 2.0 Г 4.0 й н.и. н.и.

Примечание: С - выраженный синерпщный эдект; с. - слабый синергидный; П - аддитивный; н.и. - не исследовано.

ного выхода вируса ( Индулен М. К , Калныня В. А. , 1986).

Все комбинации Ацг и ганцикловира с ИФН и индукторами ИФН достоверно снижали инфекционный титр вируса вплоть до полного подавления с синергидным эффектом, кроме комбинаций Ацг с ФН или ларифаном, где эффект сочетаний препаратов в низких дозах снижался до аддитивного. Таким образом, сочетанное применение этих нук-леозидов с ИФН или индукторами ИФН позволяет добиться высокого противовирусного эффекта при снижении концентраций компонентов е 5 и 10 раз.

Синергидный эффект сочетания нуклеозидов и ИФН на ЦМВ, по-видимому, основан на комбинации эффектов двух направлений вирусной ингибиции. Интерферон подавляет Еирусную репликацию на уровне трансляции, но не оказывает прямого воздействия на вирусную ДНК-полимеразу,ингибиторами которой являются нуклеозиды. Следовательно, синергидный антивирусный эффект нуклеозидов в сочетании с ИФН основан на ингибиции ЦМВ на уровне трансляции и репликации вирусной ДНК.

Комбинации ФУК с ИФН или ридостином ингибировали урожай вируса с антивирусной активностью синергидного характерам при снижении концентрации ридостина в сочетании эффект оценивался как аддитивный.

Сочетанное действие Ара-А в концентрации 4 мкг/мл в комбина-' ции с ИФН или ридостином было аддитивным. Только сочетание Ара-А с ларифаном подавляло репродукцию вируса с синергидным эффектом.

Лечебная схема.

Эффект лечебного антивирусного действия комбинаций химиопре-паратов с ИФН или индукторами ИФН оценивали по индексу частичного " выхода вируса (аналогично эффекту в профилактической схеме). Препараты вносили одновременно и сразу после адсорбции вируса.

Таблица 2

Эффект комбинированного действия ациклогуанозина (йцг), ганцикловира и фосфоноуксусной кислоты «ФУК) с интерферо-нами и их индукторами на репродукцию ЦМВ в лечебной схеме.

Химпопрепаратн Интерферона в ед/мл Индукторы в мкг/мл

Название конц. мкг/ / мл титр вируса в Мт ^-ИФН /-ИФН ридос ларифан

100 100 100 10 100 50 10

6,0 5.0 5.5 4.0 6.0 6.0 6.0 6.0

Оцг 0,05 5.0 2.0 С 2.0 С 2.0 С 3.0 с 1.0 С 1.0 С 1.0 с

0,005 6,0 5.0 И 6.0 Ин 3.0 с 4.0 Г 4.0 Г. 3.0 с 6.0 и

Ганцнк-ллвир 0,025 4.0 1.0 п 0 С 0 с 1.0 с 1.0 С 0 с 1.0 с

0,005 6.0 2.0 С 4.0 с 2.0 С 2.0 С 4.0 С 2.0 С 5.0 с

Ф!1К 50,0 4.0 1.0 С 2.0 С 2.0 С 3.0 с 5.0 Ин 3.0 с 4.0 И

10.0 6.0 4.0 Г. 5.0 0 3.0 П 5.0 с н.и. 4.0 Г. 6.0 И

Примечание: С - выраженный синергидннй эффект; с - слабни синергидннй; й - аддитивный; И - индифферентный; Ян - интерференция; н.и. - не исследовано.

Для сравнения антивирусного эффекта комбинированного действия химиопрепаратов с ИФН или индукторами ИФН в профилактической и лечебной схемах применения, в лечебной схеме были использованы те же концентрации препаратов и множественность инфекции (41е,ТЦИД 50/0,1 мл) (таблица 2).

Все сочетания Ацг в концентрации 0.05 мкг/мл и ганциклоЕира с ИФН пли индукторами ИФН обладали синергидным характером антивирусного действия. Однако,сочетанное действие Ацг в низкой концентрации с о/ - ,о/г-ИФН или ларифаном было неэффективным. Надо отметить, что сочетание низкой концентрации Ацг с высокой концентрацией /-ИФН, и наоборот, равнозначно ингибировали урожай вируса с синергидным эффектом. Следовательно, в данном случае,уменьшая или увеличивая концентрацию одного из компонентов в комбинации можно достичь одинакового результата.

В концентрации 50 мкг/мл ФУК достоверно подавляет репродукцию вируса,а е сочетании с малоактивными и неактивными концентрациями ИФН наблюдалось усиление ингибиции вируса на 1-3 с синергидным эффектом. Синергизм отмечался и в комбинациях неэффективной концентрации ФУК с о/-ИФН, /-ИФН или ларифаном ( 50мкг/мл). Комбинации ФУК с ридостином или ларифаном ( 10 мкг/мл) оказались неэффективными.

Комбинации Ара-А с »/-ИФН снижали репродукцию инфекционного 'вируса на 3-51^ ТЦИД50/0,1мл проявляя синергизм. Сочетанное действие при снижении доз препаратов было неэффективным. Максимальный эффект комбинации Ара-А с /-ИФН или индукторами в лечебной схеме - аддитивный.

Ара-Ц в концентрации 0,001 мкг/мл снижал урожай вируса со слабым синергидным эффектом в сочетании с /-ИФН или ларифаном. Более выраженный эффект был получен при сочетании субтоксической

дозы Ара-Ц (0,01 мкг/мл) с 100 ед/мл о/-и /-ИФН. Комбинация Ара-Ц в этой концентрации с ридостином была неэффективна.

Таким образом, результаты сравнительного изучения эффективности ИФН и индукторов ИФН на ЦМВ в зависимости от концентрации в профилактической и лечебной схемах показали, что предварительная обработка клеток позволяет снижать концентрации препаратов до 10 раз для получения такого же антивирусного эффекта как и при лечебном применении. Комбинированное применение химиопрепаратов и ИФН или индукторов ИФН в культуре инфицированных ЦМВ фибробластов человека было более эффективным,чем использование этих препаратов в отдельности,а также предпочтительнее применение сочетаний в профилактической схеме, т.к. еозможно снижение концентраций препаратов в 4-10 раз, что уменьшает их токсичность, сохраняя синергизм антивирусного действия сочетаний. Полученные данные указывают на перспективность применения ИФН и их индуктороЕ в сочетании о химиопрепаратами для повышения антивирусного эффекта последних.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ШГГЕРФЕРОНОВОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ ЦМВ

ИНФЕКЦИЕЙ *

Изучение интерферонового статуса у женщин с ЦМВ инфекций.

Интерфероновый статус определяли по уровню циркулирующего ИФН в сыворотке крови, способности лейкоцитов периферической крови, продуцировать о/-и /-ИФН у практически здоровых лиц и 109 больных женщин с ЦМВ инфекцией,в том числе у 26 беременных,и 41 ребенка, рожденных от инфицированных ЦМВ матерей. Кроме того, у Езрослых определяли уровни интерферонзависимых ферментов ( 2-5А

а- больные наблюдались в отделе клинической вирусологии Института вирусологии ( 1-ая городская инфекционная больница).

синтетазы и протеинкиназы) и активность естественных киллеров.

У всех обследованных больных инфекция протекала без клинических проявлений. Диагноз установливался на основании тяжелого акушерского анамнеза и данных лабораторных исследований. Основным критерием для определения активности инфекции было обнаружение специфических антител к ЦМВ методом иммуноферментного твердофазного анализа. Наличие в сыворотке 1дМ антител на фоне антител или 4-х кратное повышение антител свидетельствовало о реактивации латентной инфекции или. что менее вероятно, повторном инфицировании ЦМВ,т.е. активной инфекции. Латентная инфекция характеризовалась наличием невысокого титра антител к ЦМВ.

Известно, что ЦМВ инфекция у беременных протекает клинически в бессимптомных латентных формах с реактивацией в условиях физиологической иммуносупрессии. В сеязи с этим,нас интересовало изменение состояния интерфероновои системы у беременных в период ремиссии и активации инфекции по сравнению с небеременными. С этой целью беременные и небеременные были разделены на группы с активной и латентной формами инфекции.

Интерфероновый статус у практически здоровых доноров характеризуется фоновыми значениями сывороточного ИФН (1.64 1ое2ед/мл) и выраженной способностью мононуклеарных клеток периферической крови продуцировать о^-и /-ИФН (2.6 1од)0ед/мл и 6.0 1ос2ед/мл).

Определение уровня циркулирующего ИФН в сыворотке крови у больных позволило выявить его повышение в 2,6 раза по сравнению с уровнем ИФН у здоровых лиц и составило 3.04 ^¿ед/мл. У беременных содержание сывороточного ИФН было выше контрольных значений независимо от формы инфекции, а у небеременных с активной инфекцией содержание сывороточного ИФН было достоверно (р<0.02) выше (3.16 1ог9ед/мл), чем с латентной (2.84 1од„ед/мл) (таблица 31.

Таблица О

Показатели интерферонового статуса у больных ЦМВ инфекцией.

} |Группы 1 1 1 1 Уровень j Т7~ л*с133тэли ИРЛ в ел/мл 1

¡обследо- |Форма сывИНФ в ед/мл| с/-ИНФ /-ИНФ 1

!ванных ¡инфекции чис ср. геом. зн |чис |ср. геом. зн чис ср. геом. зн!

| женщин наб в logj |наб| в 1о^0 наб в 1ое2 |

! п M+m ! п 1 М+т п M+m 1

¡небере- |активная 36 |3. 16±0. 17*| 38 12. 07±0. 09* л о ± О 3. 77+0. 39* |

| менные 1 | латентная 145 2. 84Ш. 20*! 46 1 |2. 1 46+0. 08 16 5. 31 ±0.25 |

1 |беремен- | активная 10 | 3. 20+0. 19*|10 1 Ц. 93t0. 21* о 1 3. 00±0. 71*1

| ные | |латентная 16 3. 31+0. 28*|15 1 12. 1 42+0. 10 5 4. 40+0. 46* |

! \доноры 1 | здоровые 1 ! 1. 6410. 20 |22 i 1 |2. 1 60i0. 09 10 6.00+0.40 | ]

Примечание: Ар-о. 01 • достоверность отличия от контроля

Показатели ИРЛ у больных женщин с ЦМВ инфекцией были статистически достоверно снижены по отношению к норме. Кроме того.выявлено, что способность лейкоцитов к продукции о/-ИФН у беременных ниже, чем у небеременных е период активации инфекции и средние значения соответственно составили 1.93 и 2.07 ед/мл. Значение титров ИФН в группе больных с хронической инфекцией у беременных и небеременных не отличались между собой.

Лейкоциты периферической крови больных с активной инфекцией, стимулированные митогеном, продуцировали иммунный ИФН в титрах 3.77 1о~,,ед/мл (у небеременных) и 3.0 1ог2ед/мл (у беременных), что статистически достоверно f р<0.01) отличались от показателей практически здоровых лиц. У беременных с латентной инфекцией также отмечается снижение в 3 раза способности лейкоцитов к продукции if-ИФН. У небеременных женщин с латентной инфекцией аетивность лейкоцитов к продукции f-ИФН почти не изменяется: 5,31*0. 25 против 6. ОЮ. 4 log „ед/мл в норме.

Таким образом, изучение интерферонового статуса у больных с ЦМВ инфекцией выявило: выраженное повышение уровня циркулирующего ИФН в сыворотке крови, е особенности у беременных; снижение способности лейкоцитов, стимулированных вирусным и митогенным индукторами, продуцировать J- и /-ИФН. наиболее выраженное у беременных с активной инфекцией.

Активность интерферонзависимых ферментов.

Определены уровни интерферонзависимых ферментов - 2-5А синте-тазы и протеинкиназы у практически здоровых лиц и у больных ЦМВ инфекцией. У всех больных наблюдается тенденция к повышению уровня 2-5А синтетазы, но достоверность из-за значительных индивидуальных колебаний не выявляется. Протеинкиназная активность плазмы у непеременных с активной инфекцией достоверно (р<0.051 ниже, чем у доноров: О. 62 и 0. 78 пкМ/50мкг гистонов. Подобное различие с донорами в уровне активности протеинкиназы отмечается и у беременных в латентной форме ЦМВ инфекции (0.55+0.1 пкМ/50 мкг гистонов).

Активность естественных киллеров (ЕЮ.

Среднее значение индекса цитотоксичности (ИЦ) у здоровых лиц соответствует 55. 9%. Активность ЕК определена у 68 больных женщин с ЦМВ инфекцией. В период активации инфекции значения ИЦ у небеременных (45. 9% ) и у беременных женщин (30,8%) достоверно снижаются по сравнению с донорами ( р<0. 05 и р<0. 01, соответственно). Кроме того,установлено достоверное различие (р<0. 01) между показателями активности ЕК у беременных и небеременных в активной фазе инфекции. При хроническом течении цитомегалии у беременных тоже имеет место снижение ИЦ до 40,4% .

Таким образом, в активной форме ЦМВ инфекции значение ИЦ у беременных снижается в 1,5 и 1,8 раза по сравнению с небеременными и донорами, соответственно.

Изучение интерферонового статуса у детей.

Интерфероновнй статус был изучен у 41 ребенка в возрасте от 1 месяца до 1 года (37 человек') и от 1,3 до 3 лет ( 4 человека).

Дети были подразделены на 3 группы на основании клинико-лабораторных исследовании. В первую группу включили детей с врожденной ИМВ инфекцией, в две другие - детей без клинических проявлений заболевания, но с наличием впрусспецпфпчэскил 1еМ (2 группа) и 1да (3 группа) антител к ЦМВ.выявленных методом иммунофлюо-реецентного анализа, а также вирусспецифических комплементсвязы-ваюншх антител и цитомегал в слюне п моче. Контрольную группу составили 16 детей без каких-либо проявлений ПМВ инфекции.

Значительное повышение уровня циркулирующего ИФН в сыворотке крови обнаружены у всех 5 детей в 1 группе с колебанием значений титра 16-32 ед/мл, а средняя величина составила 4.6+0.2 1оа'2ед/мл. В контрольной группе 14 детей имели низкий уровень сывороточного ИФН ( 2-3 ед/мл) и только у двоих его уровень достигал 16 ед/мл. Различие между этими группами по содержанию сывороточного ИФН было статистически достоверным (р<0. 01). Подобный результат получен

Таолица 4

Сравнительные данные интерферонового статуса у детей с врожденной ЦМВ инфекцией и инфицированных ЦМВ.

! |Группы 1 |число 1 |сШ1 в вд/ш 1 11 показатели ИРЛ в ед/мл !

¡обследованных |набл. [ е 10с'^ ¡^/-ИФН в 1осот 1 п 1 Г ИФН в lc.ro |

I 1 группа 1 5 I 4. 6010. 20* | 2.8610.10а- | - I 1

] 2 группа 1 5 | I 2. 00±0.28 | 2. 74Ю. 15 1 1 1 6. 0010. 00 |

I 3 группа 1 1 15 1 1 [ 3. 06-Ю. 44А 1 | 2. 73±0. 03 | 1 | 6 1 1 3. 3310. 23 1

! ! контроль 1 | 16 i 1 I 2.001-0.26 | 1 ! | 2.701-0.09 ! | 1 6 I 1 4. 1710. 60 ! i

Примечание: а р<0. 01 к контролю: группы: 1 врожденная инфекция, 2-е наличием 1£М антител, 3-е наличием 1д6 антител.

при сравнении уровней ИФН у детей 1 и 2 групп (р<0.01 К таблица 4).

В результате стимуляции лейкоцитов вирусным индуктором получены равные значения уровней о/ -ИФН у детей во всех исследованных группах: 2.36,2.73,2.38 1ое^0ед/мл и в контроле - 2.72 1ое,0 ед/мл. Способность лейкоцитов к продукции /-ИФН, стимулированных ФГА, у детей с наличием антител не отличалась от контрольной группы.

Таким образом, при изучении интерфероноЕого статуса выявлено повышение уровня циркулирующего ИФН в сыворотке крови детей с врожденной ЦМВ инфекцией. Показатели ИРЛ не отличались от значений контрольной группы.

Теслинз 5

Сравнительные данные интерферонового статуса у больных женщин с ЦМВ инфекции и их детей с контрольной группой.

| УрОЕень |сыв. ИНФ в ед/мл

Группы

обследованных | чис | ср. геом. зн.

I наб I 1 п ]

в log Mim

3казЭ.Т6ЛИ ИРЛ Б G л/ мл

Г-шеф

чис наб п

ср. геом. зн. |чис | ср. геом. зн. |

в log M+m

10

I наб| в log |

I п |

М±ш

I

1. матери : (активная форма) |15

дети 118

2. матери ! (латентная форма|19

TT-.fT!rf IOO

ДС i. ti I

|3. 40Ю.23** 13. 66±0. 30AA

I

|2. 58±0. 30a* 12. 09i0. 26

16

19

20 21

2. 39+0, 10a* | 2. 80±0. 07 I

|4. 80+0. 48**| |3. 70±0. 26 |

2. 44±0.12* 2. 70Ш. 07

I 7 |

5. 86+0. 36 | 14. 70±0. 56 |

4-H

Контрольн. группа ¡

матери I дети

122 I "1. 64i0. 20 |16 |2. OOíO. 26

22 16

2. 6010. 09 2. 70+0. 09

|10 |6. 00±0. 40 |

I 6 14.17±0. 60 | _i_i_i

Примечание: лрси. 05,A*p<0. 01 - достоверность отличия от контроля

При изучении интерферонового статуса у 35 матерей с ЦМВ инфекцией и их 37 детей ( среди них 2 пары близнецов) установлено достоверное повышение уровня сывороточного ИФН и снижение продукции с/-ИФН у женщин как с активной, так и с латентной инфекцией. У детей повышение уровня сывороточного ИФН отмечается только в 1 группе, а способность лейкоцитов к продукции о/-ИФН не изменяется по отношению к контролю. Уровень иммунного ИФН у женщин в I группе снижен более чем в 2 раза по сравнению с контролем I 4. 7 и 6. и ¡оа-^ед/мл, соответственно). У их детей также отмечается тенденция к снижению этого показателя. У матерей с латентной инфекцией и их детей изменений в продукции /-ИФН не наблюдается (таблица 5).

Таким образом, у женщин с активной и латентной формами ЦМВ инфекции наблюдается значительное повышение уровня сывороточного ИФН, снижение активности лейкоцитов к продукции ИФН, кроме того.у женщин с активной инфекцией снижена способность лимфоцитов продуцировать /-ИФЕ В сыворотке детей, матери которых имеют активную инфекцию обнаружено высокое содержание ИФН и отмечается тенденция к снижению продукции иммунного ИФН.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что отечественные индукторы интерферона (ИФН) -дсИЖ - ридостин и ларифан - ингибируют репликацию цитомегалови-руса I ЦМВ) человека в культуре фиброоластов человека, наиболее выраженно в профилактической схеме применения.

2. Показано,что природный и рекомбинантные ИФН всех трех типов угнетают репликацию ЦМВ человека. Противовирусная активность наиболее выражена у рекомбинантного /-ИФН.

3. Химиопрепараты отечественного синтеза - аииклогуанозин (Лцг), фосфоноуксусная кислота (ФУК), аденинарабинозид (Ара-А ) в неток-

сических концентрациях обладают антицитомегаловирусной активностью, менее выраженной,чем активность зарубежного препарата ганцик-ловира. По противовирусной активности препараты расположились в следующем порядке: ганцикловир ; Ацг > ФУК > Ара-А. •4. Впервые установлено, что комбинированное применение ИФН и их индукторов с химиопрепаратами ( в концентрациях неэффективных при индивидуальном их использовании) позволяют получить выраженный антивирусный эффект епнергидного и аддитивного характера.

5. Разработаны эффективные комбинации ИФН и индукторов с химиопрепаратами, позволяющие получить синергизм противовирусного действия при снижении концентраций компонентов сочетаний в 5-10 раз. Наиболее эффективные комбинации: ацикловира или ганцикловира с -ИФН, ридостином или ларифвном.

6. Установлено нарушение функции системы ИФН у женщин, больных 1MB инфекцией, проявляющееся: в повышении уровня сывороточного ИФН и активности 2-5А синтетазы, в снижении способности лейкоцитов in vitro к продукции "/-и /-ИФН, протеинкиназы плазмы и активности естественных киллеров (ЕЮ,наиболее выраженное у беременных с активной формой инфекции. Обнаружена обратная корреляционная зависимость уровня сывороточного ИФН и активности ЕК у беременных женщин с активной формой ЦМВ инфекции.

7. Выявлено повышение сывороточного ИФН и тенденция к снижению ' продукции иммунного ИФН у детей, матери которых имели активную

форму ЦМВ инфекции.

3. Показатели функционирования состояния системы ИФН у больных ЦМВ инфекцией могут быть рекомендованы в качестве дополнительных критериев оценки активности инфекции и контроля за эффективностью коррегирующей терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Эффект двухспиральных РНК и интерферонов типа 1 на репродукцию цитомегаловируса в фибробластах человека. / Соколова Т. М. , Фатхут-динова II. Г. , Носик Н. Н.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1991. -!!7. -с. 30-83.

С. Влияние интерферонов и их индукторов в сочетании с химиопрепа-ратами на репродукцию цитомегаловируса человека. / Фатхутдинова Н. Г. .Носик Н. Н. , Соколова Т. М. // Тезисы докладов 2-го Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Самарканд, 1991.

3. Sinergetic antiviral effect of acyclovir and ganciclovir combined with interferons or dsRMA on the reproduction of human cytomegalovirus. /Nossik N. N. , Fathutdinova N. G. , Sokolova Т. M // International Society for Interferon Research, 1992, Toronto, Canada, Annual meeting of ISIR.

4. Двунитевые РНК - индукторы интерферона: экспериментальное и клиническое изучение. / Носик Н. Н. .Лаврухина JL А. .Фатхутдинова Н. Г. , Соколова Т. М. .Крылов В. Ф. ,Носик Д. Н. и др.// Интерферон - 92 (сборник научных трудов), Москва, 1992, с. 131-137.

Подо, в леч. 4/ХГ 1992 г. Формат 60x84 I/I6 Объем 1,75 п.л. 1,36 уч.-изд.л.

БНИЭРХ. 101925, Москва, ул. Архипова, 4/2

Тира* 80 Заказ 1194