Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА НА МОДЕЛИ PYRICULARIA ORYZAE CAV. — ORYZA SATIVA L.

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА НА МОДЕЛИ PYRICULARIA ORYZAE CAV. — ORYZA SATIVA L."

/из 09óS

ГОСКОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

ГЛАВАГРОПРИБОР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи

МОРОЗОВ Юрии Михайлович

УДК 632.4:633.18

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА НА МОДЕЛИ PYRICULAítIA ORYZAE CAV. — ORYZA SATIVA L.

Специальность: 06.01.11 —защита растений от вредителем и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Московская область 1991

Работа выполнена по Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии.

Научный руководитель— кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник Джавахия В. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Дьяков Ю. Т., кандидат биологических наук Проценко М, Л.

Ведущая организация — Северо-Кавказский ПИИ фитопатологии.

Защита состоится . 1991 г. на за-

седании специализированного совета К. 120.66.01. во Всес< ном научно-исслсдонательском институте фитопатологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВПИИФ.

Автореферат разослан « » .UfGrfbA. . . . 1991 г.

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

И. Н. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

/№туальность_темы

Исследование механизмов взаимодействия паразита и хозяина относится к числу основных вопросов современной фитопатологии. Болезни растений активно изучаются методами биохимии, молекулярной биологии, генетики. Однако для более глубокого понимания проблемы требуется также изучение взаимодействия конкретных, к лоток паразита и хозя;иа, что достигается методами гистологии и цитологии.

Шфикуляриоз риса является наиболее вредоносным заболеванием в большинстве регионов возделывания этоЛ культуры. Создание эффективной системы защитных мероприятий наталкивается из многочисленные трудности, связанные с недостатком знаний о физиологии патогенеза и механизмах устойчивости растений к заболеванию. Особенно мало информации опубликовано об исследованиях шрикуля-риоза на гистологическом и ультраструктурном уровнях. Изучение пирикуляриоза, как и других заболеваний надземных органов риса, с помощью просвечивающей электронной микроскопии затруднено по причине сложности получения ультратонких срезов. Ото обусловлено тем, что клеточные стенки стебля, метелки и листовых пластинок риса обладают большой механической прочностью, связанной с их импрегнацией кремнием. Особенно это характерно для внешни, оболочек клеток эпидермы и стенок проводящих пучков.

Многие исследователя обходят методические трудности, применяя для изучения пирикуляряоза способы инокуляции некоторых растений -не хозяев, удобных для микроскопирования (АгаМ, 1974; На-shloka, 1975; Homma et al., 1983; Woloshuk et al». Í983). Хотя такие работа дзли определенную информацию по отдельным направлениям исследования пиринуляриоза. этот подход нельзя прпзнэть Приемлемым для изучения взаимодействия паразита и хозяина.

Гистологические я цитологические исследования гщрикуляриозо часто проводятся с применением метода инокуляции внутренней эпидермы листового влагалища {Arase et al., 1983: Klyosawa, Leo, 1975; Koga, Horlno, 1934; íofflita, Yamanato, 1983). Популярность такого подхода основана на том, что клетки влагалища риса, в отличие от клеток листовой пластинки, имеют тонкие стенки и не содержат больших количеств кремния. Это значительно облегчает подготовку материала для просвачиваэдей электронной микроскопии, а наблюдения в световой микроскоп позволяет вести без иэготовле-

Г ' ЦЕНТРАЛЬМwit

HAvffi Ь^ЛИОТЕКА

ния срезов. Однако информация, получаемая с помощью этого метода, может иметь только ограничоиную ценность, поскольку в природшх условиях конидии возбудителя пирикуляриоза не попадают на поверхность внутренней эпидермы листового влагалища, а реакции клеток этой ткани отличаются от реакций клеток листовой пластинки (Koga, Kobayashl, 1982).

It гистологическому изучению гшрикуляркоая существует другой подход - разработка метода просветлений листовой пластинки риса и дифференцирующей окраски мицелия патогена (Koga, KobayasM, 19в0; Peng et al,, 1986). Несомненно, такой метод межет Оытъ полезен в количественных исследованиях, так как с наименьшей трудоемкостью позволяет анализировать большие площади листа. Однако от него трудно ожидать высокого качества получаемых изображений■

работы являлось гистологическое и-цитологическое изучение взаимодействия ьозбудктвля пирикуляриоза с клетками и тканями листовой пластинки риса.

Для реализации этой цели необходимо было решить следующие задачи :

1) поэтапное исследование взаимодействия паразита и хозяина в совместимой комбинации ;

2) исследование взаимодайсТЕия возбудителя пирикуляриоза ' о устойчивым к нему сортом риса

3) исследование взаимодействия некоторых непатогекшх мутантов P.oryzae с восприимчивым сортом риса ;

л) сопоставление пирикуляриоза с другими грибными болезнями растешш и выявление их общих, свойств.

Научиая^ноЕШЗна jjjijm^

Применение методов ггросвечивзщей электронной мик|ч>скошти позволило нам впервые впялить ряд особенностей взаимодействия гиф возбудителя пирикуляриоза с живыми клетками растення-хоаяшш; изучить ультра структуру клеток гриба, находящкея в тканях р колония . на ранней и поздней стадиях патогенеза; оОнэрулмть ¡¡г ошч-сашше ранее патологические измене:™« ультрзструктуры kjhtck риса. Применение методик сканирущей электронж.й микроскопии и световой мжроскопад пену тонких срезов ио&уодйло „с овдоветь распространение патогена ¡го тканям листовой пл я owl-lci! риса а продемонстрировать спороношение возбудителя пирикуляриоза внутри тканей растения-хозяина. Проведенное изучение совместимой комбинации паразита и хозяина открыло возможности для применения цито-

логических методов к познанию меяагшзмов иммунитета риса к пкря-куляриозу. Это позволило нам осуществить цитологическое исследование развития пирикуляриоза на одном из устойчивых сортов риса. Шло выяснено, что устойчивость сорта ГйЛаг к использованному в раОоте штамму Р.огугае связана с некрозом клеток хозяина в начале патогенеза. Впервые выяаленные наш различия ультра структуры гибнущих клеток восприимчивого и устойчивого сортов указывают на то, что некроз у них может иметь разные причины и механизму.

В ходе анализа литературы по грибным Оолезням растений и собственник данных было вилснено, что закономерности патогенеза достаточно хорошо сообщены только для облитатных Сиотрофов и облнгатных некротрофов. Однако существуют фитопатогенные грибы, начинающе патогенез подобно биотрофам, а на поздних стадиях проявляющие некротрофные свойства. ¡Именно к таким паразитам относится объект нашей экспериментальной работы, гриб Руг1си1аг1а огугае Сат. Для обозначения этих патогенов применяется термин "гемибиотрофы" {1лтгеП, 1974). Мы комплексно рассмотрели работы по цитологии биотрофов, некротрофов и гемибиотрофов. Наш впервые анализируются некоторые общие и частные свойства гемибиотрофов. На основании выявленных закономерностей мы разделили изученные к настоящему моменту гемибиотрофы на 5 типов.

Результаты нашей работы могут найти применение в исследовательской и научно-педагогической практике. Полученная информация о патогенезе лирикуляриоза может оказаться полезной при создании научно обоснованных систем защиты риса от болезней. Отработанные нами методики световой и электронной микроскопии могут использоваться для исследования механизмов действия средств зашиты растений и отработки режимов их применения .

Апробацияработы. Результаты исследования докладывались и обсуждались на заседаниях научного семинара лаборатории молекулярной биологии ЗНШФ (Московская область, 1987,(988,1989)и на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Ультрэструктура растений" (Чернигов И даЗ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано в работ.

Отри«щ>а__И__Диссертация излом на на 156

страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, иллюстрирована 25 световыми, 50 электронными микрофотографиями и 6 рисунками, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литература, включающего 46 отечественных и 164 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава_К Обзйр литературы

В этой главо рассмотрен!! работы, касающиеся морфологии и ультраструктури конидии Р.огувае, их прорасти еш я и образования агтрессориев, конидиадьного и полового спороиошения гриба. Отмечена недостаточна« изученность вопросов распространения патогена по тканям растения-хозяина и изменения структуры пораженных клеток листа риса.

TíaSíbSi Объекты и метода исследования

Б работе использовались восприимчивые к применявшемуся штамму возбудителя гшрикул.чриоза сорта рисэ Клейкий, Йубовский и Sha-tlao-taao, а такш устойчивый к нему сорт Bular, Растения ияокулировали природном изолятом P.orysae Н-5--3, выделетшм в Приморском крае, или искусственно полученными из него непатогенными мутантами с нарушенным меланиногенезом ños-i и Л1Ь-7, Культуры гриба были взяты из коллекции лаборатории молекулярной биологии МВД. Ультра структура конидий Когузае исследовалась на изоляте ХК-40, выделенном в Херсонской области, и полученном нами из коллекции лаборатории генетики факультативны к паразитов ВНШФ.

Гриб культивировали в~ чашках Петри, на поверхности полной агаризованной среди. Образующиеся конидии смывали водой. Концентрацию суспензии доводили до 100 тыс. кокидий па 1 мл и наносили ее на растения риса в фазе 4-го листа или на средние части срезанных 4-х листьев. Через 2,3.4,6,8 суток после инокуляции с мест нанесения ииокулюма вырезали кусочки листа и фиксировали их 53.-ным раствором глутарового альдегида на О.Ш фосфатном буфере (рН 7,3), постфиксироаали 2%-ным водным раствором тетроксида осмия, обезвоживали серией растворов атанола возрастающей концентр а ц-;п и пропиленоксидом. ткани пропитывали эшжскдшми смолами, которые полимеризовали при повышенной температуре (Гс?ер, 1074).

Полутонкив срази для сватовой микроск^лги г-.'тиьилк с ¡юмощыи Ультратома 4801 к фирмы JÍKB (Швеция). 0криш>1»!!л;* чх смесья азу ре-Г И метиленоьой сини в течение 1-2 минут и фотографировали под микроскопом Стандарт Фот-2 фирмы Оптон (ФРГ). Ультратонкие срезы изготавливали на тем ка ультратоме. Презы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца (Reynolds, 1963) и исследовали под алектронпны микроскопом Хитачи Н-600 (Япония).

Ma установили, что для получения качественных -ультра-тонких срезов листовой пластинки риса образцы необходимо затачивать, во-первых, так, чтобы длина и ширина срезов не превышали примерно 40 мкм, во-вторых, чтобы в плоскость среза не попадали наружное стенки эпидермзльных клеток и стенки проводящих пучков особенно толстые и богатые кремнием. Для стабильного выполнения этих требований важно изготавливать пробные полутонкие срезн и просматривать их под световым микроскопом.

Для сканирующей микроскопии образцы фиксировали 5%-тм глу-таровым альдегидом и 2?-нам тетроксидом осмия, промывали дистиллированной водой, замора »si воля жидким азотом й высушивали в лио-фильной установке Эхрист (ФРГ). Применялась также фиксация параш те трок си да осмия и после лущее подсушивание на воздухе (Quattie-bam, Сагпег, 1980). Зафиксированные и высушенные образцы покрывали золотом и палладием в установке ионного напыления Зико ИВ-3 (Япония) или серебром с помощью вакуумного испарителя ХУС-5Ж6 (Япония). Исследование проводил!! под электронным микроскопом Хитачи Н-600 со сканирующей системой Н-6010 (Япония).

Кроме того, с помощью гистохимических реакций изучалось распределение белков, углеводов и литти до в в тканях пораженного листа риса, а также под люминесцентным микроскопом ш наблюдали изменения флуоресценции клеток растения при развитии патогена.

Глава^З^ Строение тканей и клеток листовой пластинки риса

Листовая пластинка риса имеет морфологию характерную для злаков И Сд-растешгЯ (Эзау, 1980). Она состоит из трех типов тканей : эпидермы, проводящей системы и мезофилла. 0 составе эпидерма кроме основных эпидермальных клеток имеются устьица, пузыревидна» клетки, волоски, микроволоски и короткие окремневев-шие клетки. На поверхности листа наблюдаются многочисленные . бугорки - локальные утолщения наружных стенок эпидермальшх клеток. Ряда пузыревидных клеток на верхней стороне листа чередуются с мелкими проводящими пуадамк, окруженными двойными обкладка™. С верхней и нкгкней сторон к проводящим пучкам приминают клетки склеренхим, кентштгрумщда с коротки«!! клетками :эпило>гМ>. Проводящая система .якстовоЯ пластинки риса состоит из центрального, крупных и молк:к про дольних проводила пучков, -гпяпанных sv и у С.'боЛ еще мелкими зсш:™«.

Клетки ^¿шлла риса имес1» лиИ'хчпю малчо ¡:.wp; не

данию с клетками других злаков (Tsmoda, 1984), а их поверхность образует многочисх-чи-ша сирости. Мезсфиллышэ клетки листових пластинок рис и содержат крупную центральную вакуоль, ядро с элек-троноплогпим ядриа'н/ом, длоропласты о гранулами крахмала, митохондрии, эвдоплмзмаг'ичзский ретикулум, сеюОоднж и с ья в агаме с мембранами рийоооми, иикротельца. Иногда встречается миелиновыа фигуры. Диаметр ндор около 5 мкм. Кфтал ; к.: pnuyiuie арного г!рост-

Рис.1. Здоромая мезофиллькая клетка листовой пласта и риса.

: а- штресеорий. аг - алиарат Гольдам, в- вакуоль, вг- вакуолдрная гранула, виг- внутриклеточная гифа, г- гранули гликоген. гэр- гранулярная эадоттлазчугичйс-кий ротикулум, ипх- шва г чш: | те г- ¿Ш--- я плагмалэгаа хс^я.-.»;!. н-конидия, кс- клеточная стенка г^моа, ксх- меточная стеяи.--. лсадина, л- ломасомоподоОная структура, як- шпидиал капля, и- митохондрий, мвт- мупьтивезикулярноо телш>, ш-шелакскчя Гшу;'П, мк- ыезофилльная клетка, мш1- межклге точная гифа, ним- г.^и-

роввнная клетка мезофилла, п пореви ггрс'кь, цт- ¡.ил .»июмш Гриба, пк- щгзир!?Ш1Дная клетка, ш- пчо.-.одймий .(. > лемма хозяйка, р - риОосош, рт- ррсткаься т оуок'-. т ■ ти: огипст, тв- тельце Воронина, у- устькие, х- глорошл«, ^р »ндюлйазмата-чоскиЯ ретшсулум, я- ядро, ид- ядршко, ям- лдермэ мембраны, ^ -отложения элект{х)1юшютного материала м-шду плазм ала мой и клеточной стенкой хозяина.

рэнства приблизительно 0,1 мкм. Хлоропласта имеют электроноплот-ную строму. Ламелли в них плотно упакованы и ориентированы преимущественно вдоль длинной оси хлоропласта (Рис.1>.

Взаимодействие возбудителя пирикуляриоза риса и растения-хозяина в совместимой комбинации

4.1. Прорастание конидий и внедрение патогена в ткани восприимчивого сорта риса

Типичные конидии Р.огугае трехклеточны е, веретеновидной (£орш, размером приблизительно 25-30 х 7-8 мкм. В оводненных конидиях на срезах под электронным микроскопом выявляются по одному ядру в каждой клетке, многочисленные липидные капли, глыб-ки гликогена, округлые митохондрии диаметром около 0,5 мкм, цистерны эндоплазмагического ретикулумэ, автофэговые вакуоли. Клетки конидий разделены септами, в центре которых имеются поры аскоми-цетного типа.

' Конидии возбудителя пирикуляриоза, прорастающие на поверхности листа риса, дают начало ростковым трубкам, на концах которых формируются округлые аппрессории диаметром около 15 мкм. В случав успешного заражения на нижней стороне аппрессория образуется инфекционный вырост, проникающий в клетку эпидермы (Рис.2).

Рис.2; Внедрение Р.огугае в ткани листовой пластинки риса и внутриклеточные ги$и в эта!дермальны! клетках. 2 сутск после инокуляции.

4.2. Развитие паразита ь тканях растения-хозяина в начале па тоге но э о"

В период до 2 су ток после инокуляции гриб згшвляог несколько клеток эпидермы (рис.1 2), а позднее разрастается по мезофиллу, образуя мажнлоточные и внутриклеточные ги^и (рис. 3).

Ранее японские исследователи.Иго и Сзк'змото, а позднее и другие (Бииик1, 1965} методами юкжулянни листового влагэллщя и световой микроскопии доказали, что в совместимой комбинации паразита и хозяина в течение первых 2 суток не происходит некроза клеток растения. На этом основании было висказано предположение о том, что шрикуляриоз в начало патогенеза имеет биотрофную Фазу. ■ Наша работа подтвердила это и непосредственно показала существование биотрофтого ¡±з.у имо действий клеток риса с возбудителем пири- . куляриоза. На это указывает, во-первых, сохранешна интштшх ядер в клетках, подвергшим внедрении грибе {ркс.2), ьо-вторих, сохранение в -лтих клешах целостности плазызл^мглы, инвьгинируемой внедряш-Иол ги'1сй

К; ю.м^-» того ми ы^шили ряд оооооншеГгП фазы лири-

ку ляриоза .

Порьоо. Известно, что Руг1зи1аг1а огуаае не имеет гаустарцев , а в Ю5Вцо клетки хозяина внедряется его неспециализированные гифи; Наши результата показывают, что это осуществляется посредством локального лизи:а клеточной стекки и инвагинации гит э мало м-ми растения. На большей площади поверхности контакта клеток. паразита и хозяина штагкгшроваиная плазмалемма довольно ндогнм прилегает к стенке гриба. Однако местами она образует комплексы, состоящие из многочислен! аи с к л г. .док {рис.4). Нодоошд; структуры ранее выявлялись вокруг гаусчгриев облигмтннх биотрс.фпь ■.Вгаскег, ЫШеЛеМ, 1573) , но не наблщдались при шедрышн и■? эированшх гиф патогияа в живые клетки хозяина.

Вторая особенность: ггродо.^апельнозть бистро «Ню го -.а^мед^й-

СТВИЯ КЛеТОК растения, Подвергшихся ЬГвД -:Н>1Ю ПЭТоГРм:,, . ту1; клеточными гифзми сильно ьзршрует, очей:» .у ¡о, ж ¡.¡и гетеро-

генности клеток пэрауита и хозяина, Позтоаду, /.- .чарлэд мо 3-4 суток после инокуляции носит преимуществен» Оиотрофний характер, в это время отдельные клетки растения кекротиацруыт {рис.3). Причем их некроз, по-видимому, не оказывает реишщаго влияния на раавтие гриба, поскольку ьнутриклеточние ги$ы и текроигеироьан-, ных клетках иметт ульчраструктуру, характерную для активно функ-

Ь

Рис.З. Развитие Г.огугае в тканях растения-хозяйка через 3-4 суток поел? инокуляции.

Рис,4, ультраструктура клеток мицелия Р.огугае и пораженной мезо<1шльноЙ клетки листовой гтетинки восприимчивого сорта риса. 3-4 суток после кнокуляцшг.

о

ционируищего мицелия и не отличаются от гиф в живых клетках растения. Это отличает пирикуляриоз от болезней, вызываемых облигат-нцми бкотрофами, У которых некроз клеток хозяина сопровождается деградацией гаусториев.

На этой стадии патогенеза в каждой клетке мицелия Р.огугае наблюдается по одному интерфаэному ядру с крупным ■ электроноплот-ным ядрышком. На продол ышх срезах гиф выявляются длинные ветвящиеся митохондрии с многочисленными кристами. В клетках гриба имеется множество цистерн гладкого и гранулярного эндоплазмати-ческого ретикулума. Часто можно наблюдать многочисленные мелкие вакуоли с электрон оплотами отложениями, миелиновые фигуры и ломасомоподоОные структуры (Рис.4). ■

Третья особенность заключается в том, что при- пирикуляриозе # не наблвдается ультраструктурных проявлений повышения синтетической активности пораженных клеток, имепцих место при развитии обдигатных биотрофов. Г>иотро$ная фаза пирикуляриоз а характеризуется ускоренным старением клеток хозяина к постепенным автолизом их органелл. На старение клеток указывает рост электроноплотнах , глобул в центральной вакуоли - так называемых вакуолярных гранул, V разрыхление ламедлярной системы и просветление строш хлоропластов, отложение мелких липидашх капель в митохондриях, образование инвагинация ядерной оболочки и вздутий перинуклеарного прострак- ' ства (рис.4). Если бистрофмое взаимодействие не прерывается гибелью клетки растения. ее органеллы постепенно распадаются, а полость заполняется растущей вакуолью. Со временем в клетке вокруг внутриклеточной гифы остаются инвагинировзнная плазмалемма, тонкий слой цитоплазмы и тоноиласт растения-хозяина.

4.3. Взаимодействие паразита и хозяина на стадии спороноагения

Через 6-8 суток после инокуляции типичные инфекционные пятив, вызываемые пирикуляриоэом на листовых нлзстинкях восприимчивых сортов риса, имеит овальную форму и размеры оъоло 8x3 мм. Центр пятна представляет собой шсохвую побурвш;ч) ткэьь растения. С мелкими островками зеленых тканей. По периферии инфекционное " пятно окружено более или менее широкой зоноЛ хлороза. В это время тифы гриба обнаруживаются в клетках эпидерыц, мезофилла и црово-. дгакх пучков (Рис.5).

Известно, что поздняя стадия пирикуляриозе является дакро-трофиоК. Результаты наше* работы уточняют это положение. Действи-

Ю

тельно, через 6-8 суток после инокуляции в середине инфекционного пятна большинство клеток растения-хозяина некротизировано. Их цитоплазма и оргонеллы дозированы, даже клеточные стенки и вакуоляр-ные гранулы частично разрушены (рис.б). Интенсивность гистохимических реакций в этих клетках значительно кике, чем в контроле, что, очевидно, говорит оД утилизации патогеном питательных веществ хозяина.

Основная- масса клеток мицелия на поздней стадии болезни обнаруживает признаки естественного старения и деградации. Это выражается в просветлений и вакуолизации цитоплазмы, образовании в ней миелиповых <№гур, а в ядрах - глыбок гетерохроматина при просветлении кариоплазмы. Ядрышки в старевдих клетках не выявляются (Fue,6). Очевидно, эти особенности ультраструктуры отражают процессы автолиза цитоплазмы мицелия и транспорт питательных веществ к формирующимся конидиям. Методами сканеру щей электронной микроскопии и ; световой микроскопии мы показали, что образование когашК Р .oryzae может протекать не только на поверхности растения, ко и :внутри его тканей - в воздушной полости центрального проводящего пу<лса. •

По нашди данным, на поздней стадии патогенеза наряду О -1некро-трофиеЯ вмеет место взаимодействие триба с живыми клетками растения.

то есть - элементы биотрофии. На это указывают две особенности ультраструктуры клеток паразита и хозяина.

Первое: в инфекционном пятне, в окружении некрогазированных тканей сохраняются, так называемые, зеленые островки - грушш мезсфил.ньних клеток, которые по неизвестной причине не подверглись некрозу, но имеют ультра с тру к туру, характерную для ранне (1 -Окотрофнсй фази патогенеза. Внутриклеточных гиф в этих клетках мы не обнаружили. Гифы, расположенные в непосредственноЛ близости от них, кг.« ют ульТраструктуру, с виде те ль с гву мну ю об активном функционировании. Очевидно, эти гифы продолжают биотрофное питание ■ за счет этих клеток хозяина.

Второе свидетельство биотрофии на поздней стадии патогенеза. Периферия инфекционного пятна, вызываемого гшрикуляриозом на листьях восприимчивых сортов риса, представляет собой более или менее широкую зону хлороза тканей растения. Гриба в этой зоне мм не обнаружили. Очевидно, патоген не способен нормально развиваться или преодолевать ату зону. Органеллы клеток хозяина здесь лизироваш. Наблюдаются только клеточные стенки и вакуолярные

Рис.6. Ультраструктура клеток мицелия Р.огугае и пораженной мезофилльной клетки листовой пластинки восприимчивого сорта риса через 6-8 суток посла инокуляции.

\г

гранулм. Однако иногда встречаются клетки, в которых плазмал«мча и тонопласт сохраняют целостность, хотя цитоплазма и ядро в них лизированы. Центральная вакуоль при этом занимает весь объем клетки, так что тонопласт почти вплотную прилегает к плазмалемме. По нашему мнении, это говорит в пользу того, что клетки на периферии инфекционного пятна подвергаются ускоренному старению без некроза. Это отличает позднюю стадию пирикуляриога от болезней, вызываемых некротрофами. при которых, как известно, некроз клеток хозяина опережает распространение мицелия.

ГлавуПроявление устойчивости риса к пирикуляриозу

Устойчивость риса к лирикуляриозу мы исследовали на примере взаимодействия сорта Ш1аг с авирулентным к нему штаммом Р.огугае Н-5-3.

Через 4 суток после инокуляции на листьях этого сорта проявляются симптомы заболевания В виде бурых пятен размером не более 0,5 мм. Мы установили, что эти пятна представляют собой небольшие группы некротизированкых клеток хозяина. Развивающегося гриба не обнаруживается. Это дает основание предполагать, что внедрение возбудителя пирикуляриоза в ткани сорта Оа1аг вызывает у последнего защитную реакцию, проявляющуюся -быстрым некрозом клеток растения, то есть - блокированием биотрофной фазы патогенеза.

Ранее Пенг и Шиш яма еш основании световой микроскопии сделали вивод о том, что чем устойчивее сорт, тем раньше проявляются реакции его клеток на внедрение возбудителя пирикуляриоза, но морфологическое проявление этих реакций у разных сортов одинаково (Репе, Б тай! у ала, 1939). Проведенные нами исследования ультраструктуры клеток устойчивого и восприимчивых сортов выявили морфологические различия их. реакций, указывающие на существование разных механизмов некроза.

Так, в живых клетках сорта ШИаг. находящихся вблизи некро-тизировашшх, размер гите то глобул в хлоропласта* увеличивается, но разрыхления лкмеллярной системы, подобного происходящему в клетках воспришчигах сортов, не происходит. Перинуклеарноа пространство ядер клеток мезофилла атого сорта сжимается до' шириш примерно 0,ю мкм, с то время как в совместимой комбинации оно расширяется. Ь клетках устойчивого сорта наблюдаются 'более толстые отложения алактроноплотного материала между клеточной стенкой и плазмаледаоЯ (Рис, Т).

Рис. 7. Ультраструктура мезсфшльной клетки листовой пластинки сорта Bular, инокулированной эвирулентшм штаммом P.oryzae. 4-8 суток после инокуляции.

Поведение меланиндефицитных мутантов Р.oryzae на поверхности листа риса

Работами многих авторов установлено, что меланин, содержащийся в апцрессориях, обусловливает способность гриба проникать сквозь искусственные полимерные мембраны. На этом основании было сделано предположение, что он необходим для внедрения патогене в ткани растения-хозяина (КиЪо, Furusawa, 1986 : Sisler et al., 1934). Данные, полученные с применением инокуляции листовой плзс- , тэшкн риса, немногочисленны и противоречивы. Так, методом микро-манипулировэния л сканирущей электронной микроскопии показано, что ингибировзние биосинтеза меланина блокирует формирование инфекционного выроста у агорессоривв, образовавшихся на поверхности листа риса (Klrooka et al., 1962). В другш работах сообщалось, что методом просветления листовой пластинки удалось наблюдать проникновение инфекционных гиф из аппрвссориев меланиндефицитных мутантов Р.огугае (Лапикова, Дягааахия, 1987;Д*авахия и лр. ,1990).

По нашим данным, концдш меланиндефщитных мутантов Ros-4 • ■ и А1Ь-7, прорастающие на поверхности листовой пластики универ-

Н Л ■

сально восприимчивого сорта ряса Клейкий, формируют росткоше трубки и аппрессории. Через 2 суток после инокуляции аппрессории этих штаммов на срезах выглядят пустыми. Внутриклеточных гиф в эпвдармальных клетках под ними не обнаруживается.

При просмотре поверхности листьев риса под люминесцентным микросколом обычно насличается сине-зеленое свечение тенгенталь-mix стенок эпидермальных клеток на красном фоке, обусловленном хлорофиллом. Иногда встречаются аномалии флуоресценции отдельных клеток или грухш клеток. Мы наблюдали два типе аномалий. Первое -яркое желтое свечение, свидетельствующее о повреждении клеток 4BeСедовекий, йвселова, 1990). Второе - аномально яркое свечение тангентальных стенок эпидерм ал ьных клеток, которое, судя по литературным данным, может являться ранней реакцией на распростране-ше возбудителя гарикуляриоза (Heath et al., J990; Peng, Shlshl-

Таблица 1 .

Плотность аномалий флуоресценции на листьях риса сорта Клейкий при инокуляции конидиями возбудителя пирикуляриоза.

Штамм Плотность нанесения конидий, ит/ом^ Срок после инокуляции, су т. Плотность аномалий 1 Флуоресценции. 5> шт/см

Н--5-3 192,6*24.9 г 10.4*1,7 * ** 19,3*3,3

192,6*24,9 3

Ноз-4 113,9±18,4 2 4,0*1,3

113,9i1&,4 3 4,2*0,9 ***

Alb-7 2 3,7*0.6 ***

200,4*22,8 3 5,5*0,8 |

Контроль 0 Q 2 3 6,5*0,5 6,5*1,5 |

* - Величина достоверно отл*1ЧоетСя от- контроля С надежностью -0,95.

«* - Величала достоверно отличается от контроля с надежностью В2=0,99.

»** - Отличка от контроля нэ достоверно.

yama., 1989). При инокуляции конидиями штамма Н-5-3 ка листьях сорта Клейкий появляется значительное количество аномалий флуоресценции. при инокуляции штаммами flos-4 и Alb-7, как и на листьях контрольных растений, обнаруживается небольшое число подобных аномалий. Их плотность остается низкой во всех вариантах опкта и практически не отличается от контрольной (таол.1). Очевидно, эти аномалии флуоресценции не связаны с инокуляцией, а исследованные нами мелaiиндефинитные мутанты Р.огу"яе не развиваются в тканях листовой пластинки риса.

Глава_?0 разновидностях систем паразит-хозяин

Закономерности патогенеза обычно трактуют, исходя из разделения фи топа тоге нннх грибов на биотрофы и некротрофы (ТаррИ 975).

- это паразиты, получающие питательные вещества от живых клеток хозяина. Некротрофы - это паразиты, получающие питательные вещества от мертвых клеток хозяина ( Thrower, 1966). однако современные экспериментальные данные показывают недостаточность такого разделения. Существует1 фитопатогенные грибы, начинающие свое развитие в тканям хозяина как биотрофы, а позднее переключающиеся на некротрофное питание. Для таких патогенов предложено наименование гешбиотро$ы {Luttrell, 1974).

Цитологические исследования взаимодействия облигатных бмо-трофов с их растениями-хозяевами рассмотрены нами на примере некоторых хорошо наученных болезней (ржавчина, мучнистая роса и Др.).

В качестве примера облигатного некротрофа приведен возбудитель корневой губки деревьев Heterobaaidion annosum (Ho<iges, 1569). Обсуждаются механизмы некроза клеток хозяина,в частности -роль пектолитических ферментов патогена {Васильева и др.,1984 ; Cooper, }983).

Описаны цитологические и некоторые Физиологические свойства патогенеза гемиби ^рофных грибов. Анализируются пх сходства и различия с. облигатными Оиотрофзми и некротрофами. Показано, что у каждого гемконотрофа имеются особенности патогенеза.

Так, грис Piiytophthora Infestan.s ь первой пораженной клетке листа К']ртг;|еля фор.здрует инфекционную везикулу, от ко то [ oil растут Енутр^клочочныр гпфи, Они проходят через живне клетки палисадной паренхимы и ходят в губчатую napoimn/y. Taw патегун рздр.'шт^етол я м nv глоточного мицелия и }>■;;;)( гпуоторв-■

ев трубчатой формы. В начале патогенеза изменения ультраструктуры клеток хозяина минимальны. Признаков повышения метаболической активности (увеличения количества мембран эндоплазматического ре тику л ума и аппарата Гольджи) не наблюдается. Примерно через 2 суток после инокуляции начинается некроз клеток растения, но на этой стадии он не ограничивает дальнейшего роста гриба и его спору л яшм. Устойчивость хозяина проявляется ранним началом некроза клеток растения, модификацией клеточных стенок, образованием вокруг гаусториев более толстых матриксов, содержащих каллозопо-добнШ материал, выделением фитоалексинов (СоГГеу, В'Пзоп, )983).

Прорастающие конидии СоПесо1г1о!иип ИпйетигМапит образуют ростковые трубки с агшрессориями, с помощью которых гриб внедряется в эпидермальные клетки листа фасоли. В первой заселенной клетке патоген формирует инфзкщюкную везикулу, от которой растут толстые первичные гифы. Эти гифы распространяются по тканям хозяина, переходя из клетки В клетку в местах их контактов. При этом гриб локально лидирует клеточную стенку и инвагинирует плаз-малемму растения. Каждая клетка, подвергшаяся внедрению патогена, остается жизнеспособной приблизительно 24 часа. Однако массовая гибель клеток хозяина начинается через 6-7 суток после инокуляции- Начало некротрофяой фазы совпадает по времени с ростом активности пектинлиазы, секретируемой грибом в ткани растения. При атом гриб формирует тонкие вторичные гифы, растущие межклеточно и внутриклеточно (О'СоппеИ, Ва11еу.1990; киезипбега е1 а1.,1989).

Гриб С1а(1оарог1ит сисшпег1пит внедряется а ткани листьев восприимчивых сортов огурца между тангентальными стенками эпидермы и разрастается по межклетникам,' не вызывая некроза клеток растения. Позднее патоген заселяет погибающие клетки хозяина (ЬаЬогйа, МахжеП, 1976).

В течение биотрофной фазы развития возбудителя парсш яблони уепШПа ШаефлаИа (2-3 недвла)гифц распространяются между кутикулой и наружными клеточными стенками пораженного органа. Внедрение в клетки хозяина начинается только при переключении патогена на некротрофию (Сог1еи ¿1 а!.. 19Т6).

На основании литера турки и< собственных экспериментальных данных мы разделили изученные к настоящему моменту гемибиотрофы на 5 типов. В качество критерия разделения была ¡грииятб локализация гриба в ткадчх растения-хозяина в течение биотрофной Фазы патогенеза (Твбл.2).

Таблица 2.

Типы гемибиотрофных болезней растений.

Г™ геми-биотрофов Характер биотрофкой фазы ........— ■ ■ Пример

патоген xo3jnm литературный источник

"подкутику лярннв" гифу между кутикулой и наружными стенками клеток эпидермы Venturis lnaequalle Malus "Hopa" Corlett, et al., 1976.

"межклеточные" гифы в межклеточном пространстве Сladospor1-ura cucume-Г1ПШ1 Drectolera dietyeldes Leptosphse-ría macu-lana Cucumis satlvua lollum perenne Brassica napus Labórela, Maxwell, 1976. Cromey, Cole,>985. Hammond et al..1965.

"мэккле-точно-внутриклеточные " гифы в межклеточном пространстве и в живых клетках Pyrlcularla oryzae Orysa sativa Морозов, (990.

"внутриклеточные" ГИфЫ в живых клетках Colletotrichum llnde-muthlanma Blpolarls ravenelii Phaseo-lus vulgaris Sporot»-lus poi-retll O'Connell« ealley.1990. lAiUPell. 1976.

"гэусто-ркальныа" гифы и гаустории в живых клетках phytoputho-ra Inles-tana Albugo tra-gopogonls Solanum tuberosum Senecio äqualIdus Coffey, Wilson,1983. ffhlpps, Cooke,19T3. .

выводы

1. При поражении восприимчивых сортов риса грибом P.oryzao начало патогенеза (период до 3-4 суток после инокуляции) имеет биотрофный характер, хотя отличается от патогенеза облигатных Сиотрофов. Поздняя стадия пирикуляриоза (6-8 суток после инокуляции) является преимущественно некротрофной. То есть, возбудитель пирикуляриозэ риса является гемибиотрофшм паразитом.

2. Развитие возбудителя пирикуляриоза в тканях восприимчивых сортов риса ускоряет старение клеток растепия-хозяина, о чем свидетельствует рост вакуолярных гранул и гластоглобул, просветление строки я разрыхление ламаллярной системы хлоропластов, появление в митохондриях лигщдных капель, образование инвагинаций ядерной оболочки и круга шх вздутий перинуклеарного пространства.

3. Устойчивость сорта Bular к природному изоляту P.orysae К-5-3 связана с ранним началом некроза клеток, подвергшихся внедрению патогена, а также расположенных вблизи некротизированных клеток.

4. Отсутствие разрыхления ламеллярной система и просветления стромы хлоропластов, а также сжатие перинуклеарного пространства отличают некроз клеток сорта Dular от некроза, протекающего при поражении восприимчивых сортов риса. Следовательно, некроз в совместимой и несовместимой комбинациях паразита и хозяина, может иметь разные причины и механизмы.

5. Конидии меланиндефищтшх мутантов P.orysae Roa-4 и Alb-'Г прорастают и образуют аппрессорки на поверхности листовой пластинки универсально восприимчивого сорта риса Клейкий, но не развиваются в em тканях. По-видимому, это обусловлено тем, что ап-тгрессорил, не ммекщ;е меланина, не обеспечивают проникновение гриба сквозь клеточные стенки растения.

6. Пирикуляриоз риса сочетает в себе свойства патогенеза болезней, вызываемых гемиСиотрофами, ги£и которых в течение био-трофной фазы распространяются по межклеточному пространству пораженного органа, и гемибиотрофами, гифа которых растут внутри кибых клеток хозяина, поскольку P.cryzae образует как межклеточные, так и внутриклеточные ги$ы в живых клетках растения.

Работы 4 лико вашшв _по _теш j^iççe ртации

t. Морозов Ю.М. Ультраструктура клеток паразита и хозяина при развитии пирикуляриоза риса // Ультраструктура растений : Тез. докл. 6 Всесоюз. симп. - Киев,1988. С.216.

2. Морозов Ю.М., Плотникова Ю.М. Цитологические исследования развития гриба Pyrlcularla oryzae Сат. в тканях листа риса // Микол. и фитопатол. 1989. Т.23. Вып.2. С.113-117.

3. Морозов Ю.М.» Плотникова D.H. Гистологическое исследование растений риса, пораженных пирикуляриозом // Мккол. и фитопатол. 1989. Т.23. Вып.6. С.576-580.

Морозов Ю.М., Джавахия В.Г. Проявление устойчивости риса к пирпкуляриозу на цитологическом уровне // Микол. и фитопатол. 1990. Т.24. ВШ-2. С,161-165.

5. Морозов Ю.М. Взаимодействие мицелия Pyrlcularla oryzae я клеток растения-хозяина до проявления видимых симптомов // Микол. и фитопатол. 1990. Т.24. Втт,5. C.44t-445.

5. Морозов Ю.М. Ультраструктура гиф возбудителя пирикуляриоза риса и поражении клеток^растения-хозяина на стадии спсроноше-ния // Микол. и фитопатол. 1991. Т.25. (В печати)

Объем 3 '/4 п. л.

Заказ 1296.

Тираж ЮО

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно