Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Цитологические исследования взаимодействия паразита и хозяина на модели PYRICULARIA ORYZAE CAV.-ORYZA SATIVA L.

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Цитологические исследования взаимодействия паразита и хозяина на модели PYRICULARIA ORYZAE CAV.-ORYZA SATIVA L."

ГОСКОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

ГЛАВАГРОПРИБОР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи

МОРОЗОВ Юрий Михайлович

УДК 632.4 :633.18

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА НА МОДЕЛИ PYRICULARIA ORYZAE CAV. — ORYZA SATIVA L.

Специальность: 06.01.11 — защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Московская область 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии.

Научный руководитель—кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Джавахия В. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Дьяков Ю. Т., кандидат биологических наук Проценко М. А.

Ведущая организация — Северо-Кавказский НИИ фитопатологии. у « л

Защита состоится Рг^?^. 1991 г. на за-

седании специализированного совета К-120.66.01. во Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИФ.

Автореферат разослан «/У »

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

И. Н. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность_темы

Исследование механизмов взаимодействия паразита и хозяина относится к числу основных вопросов современной фитопатологии. Болезни растений активно изучаются методами биохимии, молекулярной биологии, генетики. Однако для более глубокого поннмания проблемы требуется также изучение взаимодействия конкретных клеток паразита и хозяина, что достигается методами гистологии и цитологии.

Пиршуляриоз риса является наиболее вредоносным заболеванием в большинстве регионов возделывания этой культуры. Создание эффективной системы защитных мероприятий наталкивается на многочисленные трудности, связанные с недостатком знаний о физиологии патогенеза и механизмах устойчивости растений к заболевании. Особенно мало информации опубликовано об исследованиях пирикуля-риоза на гистологическом и ультраструктурном уровнях. Изучение пирикуляриоза, кзк и других заболеваний надземных органов риса, с помощью просвечивающей электронной микроскопии затруднено по причине сложности получения ультратонких срезов. Это обусловлено тем, что клеточные стенки стебля, метелки и листовых пластинок риса обладают большой механической прочностью, связанной с их импрегнацией кремнием. Особенно это характерно для внешних оболочек клеток эпидермы и стенок проводящих пучков.

Многие исследователи обходят методические трудности» применяя для изучения пирикуляриоза способы инокуляции некоторых растений-нехозяев, удобных для микроскопирования (Araki, 1974; На-shioka, 1975; Нсггапа et al., 1983; Woloshuk et al., 1983). Хотя такие работы дали определенную информацию по отдельным направлениям исследования пирикуляриоза, этот подход нельзя признать йриемлемым для изучения взаимодействия паразита и хозяина.

Гистологические и цитологические исследования пирикуляриоза часто проводятся с применением метода инокуляции внутренней эпидермы листового влагалища (Arase et al., 1983; Klyosawa, Lee, 1975; Koga, Horlno, 1984; Tomita, Yananaka, 1983). Популярность такого подхода основана на том, что клетки влагалища риса, в отличие от клеток листовой пластинки, имеют тонкие стенки и не содержат больших количеств кремния. Это значительно облегчает подготовку материала для просвечивающей электронной микроскопии, а наблюдения в световой микроскоп позволяет вести без изготовле-

ния срезов. Однако информация, получаемая с помощью этого метода, может иметь только ограниченную ценность, поскольку в природных условиях конидии возбудителя пирикуляриоза не попадают на поверхность внутренней эпидермы листового влагалища, а реакции клеток этой ткани отличаются от реакций клеток листовой пластинки (Koga, Kobayashl, 1982).

К гистологическому изучению пирикуляриоза существует другой подход - разработка метода просветления листовой пластинки риса и дифференцирующей окраски мицелия патогена (Koga, Kobayashl, 1980; Peng et al., 1986). Несомненно, такой метод может быть полезен в количественных исследованиях, так как с наименьшей трудоемкостью позволяет анализировать большие площади листа. Однако от него трудно ожидать высокого качества получаемых изображений.

Шлью_нащей_Еаботы. являлось гистологическое и-цитологическое изучение взаимодействия возбудителя пирикуляриоза с клетками и тканями листовой пластинки риса.

Для реализации этой цели необходимо было решить следующие задачи :

!) поэтапное исследование взаимодействия паразита и хозяина в совместимой комбинации ;

2) исследование взаимодействия Возбудителя пирикуляриоза ' с устойчивым к нему сортом рйса' ;

3) исследование взаимодействия некоторых непатогенних мутантов P.oryzae с восприимчивым сортом риса ;

4) сопоставление пирикуляриоза с другим грибными болезнями растений и выявление их общих сеойств.

Н§22н§я_ношзна_м_ПЕактическая^

Применение методов просвечивающей электронной микроскопии позволило нам впервые выявить ряд особенностей взаимодействия гиф возбудителя пирикуляриоза с живыми клетками растения-хозяша; изучить ультраструктуру клеток гриба, находящихся в тканях растения, на ранней и поздней стадиях патогенеза; обнаружить но описанные ранее патологические изменения ультраструктуры клеток риса. Применение методик сканирующей электронной микроскопии и световой микроскопии полутонках срезов позьо.ыло последовать распространение патогена по тканям листовой пластинки риса и продемонстрировать спороношение возбудителя пирикуляриоза внутри тканей растения-хозяша. Проведенное изучение совместимой комбинации паразита и хозяина открыло возможности для применения цито-

логических методов к познанию механизмов иммунитета ряса к пири-куллрпозу. Это позволило нам осуществить цитологическое исследование разеития шгрикуляриоза на одном из устойчивых сортов риса. Било выяснено, что устойчивость сорта Dular к использованному в работе штамму Р.сгугаз связана с некрозом клеток хозяина в начало патогенеза. Впервые внявлешшо нами различия ультраструктуры гибнущих клеток восприимчивого и устойчивого сортов указывают на то, что некроз у них может иметь разные причины и механизмы.

В ходе анализа литературы по грибшм болезням растений и собственник данных было выяснено, что закономерности патогенеза достаточно хорошо обобщены только для облиготннх биотрофов и облигатных некротрофов. Однако существуют фктопатогешше грибы, начинающие патогенез подобно биотрофам, а на поздних стадиях проявляют«? некротрофные свойства. Ммешю к таким паразитам относится объект нашей экспериментальной работы, гриб Pyrlcularia oryzae Cav. Для обозначения этих патогенов применяется термин "гемибиотрофы" (buttrell, 1974). Ш комплексно рассмотрели работы по цитолог®! биотрофоз, некротрофов и гемиОиогрофэв. Нами впервые анализируются некоторые общие и частные свойства гемибиотрофов. На основании выявленных закономерностей ми разделили изученные к настоящему моменту гемибиотрофы на 5 типов.

Результаты нашей работы могут найти применение в исследовательской и научно-педагогической практике. Полученная информация о патогенезе пирикуляриоза может оказаться полезной при создании научно обоснованных систем защиты риса от болезней. Отработанные наш методики световой и электронной микроскопии могут использоваться для исследования механизмов действия -средств защиты растений и отработки режимов их применения .

Апробация_работал Результаты исследования докладывались и обсуждались на заседаниях научного семинара лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ(Московская область, 1987,1988,1939)и на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" (Чернигов,1988).

Ойликации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Стр^ктура__и-_д0ъем__работы^ Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, иллюстрирована 25 световыми, 50 электронными микрофотографиями и б рисунками, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 46 отечественных и 164 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава_К Обзбр литературы

В этой глава рассмотрены работы, касающиеся морфологии и ультраструктуры конидий P.oryzae, их прорастания и образования аппрессориев, конидиального и полового спороношения гриба. Отмочена недостаточная изученность вопросов распространения патогена по тканям растения-хозяина и изменения структуры пораженних клеток листа риса.

Глава_2.. Объекты и методы исследования

В работе использовались восприимчивые к применявшемуся штамму возбудителя пирихуляриоза сорта риса Клейкий, 'Дубовский и Sha-tlao-tsao, а также устойчивый к нему сорт Dular. Растения инокулировали природным изолятом P.oryzae Н-5-3, выделенным в Приморском крае, или искусственно полученными из него непатоген-ними мутантами с нарушенным меланиногенезом Ros-4 и А1Ь-7. Культуры гриба били взяты из коллекции лаборатории молекулярной биологии ВНШФ. Ультраструктура конидий P.oryzae исследовалась на изоляте XK-4Q, виделеннои в Херсонской области, и полученном нами из коллекции лаборатории генетики факультативных паразитов ВНМЙФ.

Гриб культивировали в" чашках Петри, на поверхности полной агаризованной среда. Образующиеся конидии смывали водой. Концентрацию суспензии доводили до 100 тыс. конидий на 1 мл и наносили ее на растения риса в фазе 4-го листа или на средние части срезанных 4-х листьев. Через 2,3,4,6,8 суток после инокуляции с мест нанесения инокулюма вырезали кусочки листа и фиксировали их 5%-ным раствором глутарового альдегида на 0.1М фосфатном буфере (pH 7,3), постфиксировали 2%-ным водным раствором тетроксида осмия, обезвоживали серией растворов этанола возрастающей концентрации и ' пропиленоксидом. Ткани пропитывали эпоксидными смолами, которые полимеризовали при повышенной температуре (Гайер, 1974).

Полутонкие срезы для световой микроскопии готовили с помощью Ультратома 4301А фирмы ЛКБ (Швеция). Окрашивали «х смесью азура-2 и метиленовоИ сини в течение 1-2 минут и фотографировали под микроокопом Стандарт Фот-2 фирмы Оптон (ФРГ). Ультратошага срезы изготавливали на тем же ультратома. Срезы контрастировали уранил-ыдвтатом и цитратом свинца (Reynolds, 1963) и исследовала под электронным микроскопом Хитачи Н-600 (Япония).

Мы установили, что для получения качественных ультратонких срезов листовой пластинки риса образцы необходимо затачивать, во-первых, так, чтобы длина и ширина срезов не превышали примерно 40 мкм, во-вторых, чтобы в плоскость среза но попадали наружные стенки эпидермальннх клеток и стенки проводящих пучков особенно толстые и богатые кремнием. Для стабильного выполнения этих требований важно изготавливать пробные полутонкие срезы и просматривать их под световым микроскопом.

Для сканирующей микроскопии образцы фиксировали 5%-ным глу-таровым альдегидом и 2%-ным тетроксидом осмия, промывали дистиллированной водой, замораживали жидким азотом и высушивали в лио-фильной установке Эхрист (ФРГ). Применялась также фиксация парами тетроксида осмия и последующее подсушивание на воздухе (Quattle-baum, Carner, 1980). Зафиксированные и высуиенные образцы покрывали золотом и палладием в установке ионного напыления Эико ИБ-3 (Япония) или серебром с помощью вакуумного испарителя ХУС-5ЖБ (Япония). Исследование проводили год электронным микроскопом Хитачи H-6Q0 со сканирующей системой Н-6010 (Япония).

Кроме того, с помощью гистохимических реакций изучалось распределение белков, углеводов и липидов в тканях пораженного листа риса, а также под люминесцентным микроскопом мы наблюдали изменения флуоресценции клеток растения при развитии патогена.

Глава_3^ Строение тканей и клеток листовой пластинки риса

Листовая пластинка риса имеет морфологию характерную для злаков и С3-растений (Эзау, 1980). Она состоит из трех типов тканей : эпидермы, проводящей системы и мезофилла. В составе эпидермы кроме основных эпидермальннх клеток имеются устьица, пузыревидные клетки, волоски, микроволоски и короткие окремневев-щие клетки. На поверхности листа наблюдаются многочисленные бугорки - локальные утолщения наружных стенок эпидермальннх клеток. Ряды пузыревидных клеток на верхней стороне листа чередуются с мелкими проводящими пучками, окруженными двойными обкладками. С верхней и нижней сторон к проводящим пучкам примыкают клетки склеренхимы, контактирующие с короткими клетками эпидермы. Проводящая система листовой пластинки риса состоит из цен трального, крупных и мелких продольных проводящих пучков, ?вязаяпих f.v*ay собой еще Оодвв мелкими жшслми.

Клетки мезгфилл риса им^ют лояашю малые р.чглеры гга ор'н<-

нению с клетками других злаков (Уаипойа, 1984), о их поверхность образует шогочисдашшз выросты. Шзо$«ллыше клетки листовых пластинок рисы содержат крупную центральную вакуоль, ядро с элек-троношютшя ядршсом» хлоропласта с гранулами крахмала, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, свободны!.- и связанные с мембранам;-! рибосомы, микротельца. Иногда .встречаются миелшюше фигуры. Диаметр ядер около 5 ыкм. Шар'.ша поринуклеарного прост-

Обозначения з^есь и далее : а- аппрессорий, аг- аппарат •• Гольдки, в- вакуоль, вг- векуоллриая гранула, вкг- внутр^чл.'точная гифа, г- гранулы гликогена, гэр- гранулярный эвдошшз.,<птечас-кий ретикулум, инх- инБэглш'-роьзнш.я плазмалеша хоз*. у., к-конидия, кс- клеточная с-генка триба, ксх- клеточная стенк- / на, л- ломасомоподобная структура, лк- липидаая капля, м- '.;ч\>-хондрин, мвт- мультивезикулярисо тельцз, ьга-миеликоьй». мк- мвзофилльная клетка, мкг- иежклвточ.тл гифа, икм- т. [ .-¡..л-рованыая клетка мезофилла, п- порога; ир^пьа, пг- ила. .и' '¡-ип гриба, пк- пузыревидная клетка, от- п>';.-~<дг-ч«а .<.:«,- -ы.-

лемма хозяина, р- рибосош, рт- ростпоь1.« трубка, ч - гиьоа тв- тельце Воронина, устьице, х- хлоропласт, ар ; лдош:-?.о;-атц-чэский ретикулум, я- ядро, яд- ядрышко, ям- ядерные мембрана, | -отложения электрононлотного материала меаду плазмалеммой и клеточной стенкой хозиша.

о

ранства приблизительно 0,t мкм. Хлоропласта имеют электроноплот-ную строму. Ламоллы и них плотно упакованы и ориентированы преимущественно вдоль длинной оси хлоропласта (Рис.1).

Взаимодействие возбудителя пирикуляриоза риса и растения-хозяина в совместимой комбинации

4.1. Прорастание конидий и внедрение патогена в ткани восприимчивого сорта риса

Типичные конидии Р.огугае трехклеточные, веретеновидной формы, размером приблизительно 25-30 х 7-8 мкм. В оводненных конидиях на срезах под электронным микроскопом выявляются по одному ядру в каждой клетке, многочисленные липидные капли, глнй-ют гликогена, округлые митохондрии диаметром около 0,5 мкм, цистерны эндоплззматического ретикулума, автофаговые вакуоли. Клетки конидий разделены септами, в центре которых имеются поры аскоми-цетного типа.

' Конидии возбудителя пирнкуляриоза, прорастающие на поверхности листа риса, дают начало ростковым трубкам, на концах которых формируются округлые алпрессории диаметром около 15 мкм. В случае успешного заражения на нижней стороне аппрессория образуется инфекционный вырост, проникающий в клетку эпидермы (Рис.2).

Рис.2. Внедрение Р.огугае в ткани листовой пластинки риса и внутриклеточные гифы в. эпидэрмзльннх клетках. 2 суток после инокуляции.

4.2. Развитие паразита в тканях растения-хозяина в начало патогенеза

В период до 2 суток поело инокуляции гриб заселяет несколько клеток эпидермы (рис.'2), а позднее разрастается по мезофиллу, образуя межклеточные и внутриклеточные гифц (рис. 3).

Ранее японские исследователи Кто и Сакамото, а позднее и другие (5игок1, 1965) методами инокуляции листового илзгомщи и световой микроскопии показали, что в совместимой комбинации паразита и хозяина в течение первых 2 суток но происходит некроза клеток растения. На этом основании было высказано предположение о том, что гирпкулярноз в начала патогенеза имеет Сиотрофную фазу. Наша работа подтвердила ото и непосредственно показала существование биотрофюго взаимодействия моток риса с возбудителем лирику ляриоза. На это указывает, во-первых, сохранение интактных ядер в клетках, подвергшихся внедрению гриба (рис.2), во-вторых, сохранение в утих клетках целостности плазмаломма, инвагинируемой внедряют- • йен п! 1о1!.

Кромг того ьш эдяьдли ряд особенностей баотрофноЯ Фазы юфи-куляриоза.

Иирпое. Нзьо<;т1К>, что Руг1еи1аг1а ог^г.не Но имеет гаустори-ев. а ь киьца клетки хозяина внедряются его коспециьлизмровашше гифы: Наши результаты показиваот, что это осуществляется посредством локального лизиса клеточной стенки и инвагинации плазмалем-ш растения. На большей площади поверхности кентакта ¡слитон паразита и хозяина шшагишровйкная плазмалемма довольно плотно прилегает к стенке гриба. (:>лхю местами она образует юпшлаксц, состоящие из миогочислиг'л:. (рис.4). Подойшо ,;:р>ктура

ранее сыл&шышсь вокруг- гаусюриев облигьтних Оиотрофоь (вгпског, ГЛъиеПоМ, 1973) , но не наблюдались при внедрении ь^.Шстк-чК-зироьашшх гиф патогена в кивые клетки хозяина.

Вторая особенность", продсллЭТблыюслъ гмотрефь.го ъъ. ..к-ьей-

СТВИЯ КЛвТОК рссТОЫМ, ерГШИХСЯ ЬИеД^-Ч'»» о ьнугеп-

клеточными гиф^ка сипы: • ъзрьирувт, е.у,г«..-., гч причли..- ге:ср-о-гошости клеток иьралит5» » хозяйка. Поьч-;-ку, /л.¡а глрлод до 3-4 суток после инокуляция носит преимущественно сиотрофннй характер, в это время отдельные клетки растения некротизнрувт (рис.3). Причем их некроз, по-видалому, не оказывает решающего влияния па развитие гриба, поскольку внутриклеточные гиф« в ьекротизироьан-них клетках имеют ультрьструктуру, характерную для активно функ-

Рис.3. Развитие р.огугае в тканях растения-хозятга черпп 3-4 суток после инокуляции.

Рис.4. Ультраструктура клеток мицелия Р.огуеае и пораженной мезофилльной клетки листовой пластинки восприимчивого сорта риса. 3-4 суток после инокуляции.

циошгрующего мицелия и не отличаются от гиф в живых клетках растения. Это отличает пирмкуляриоз от болезней, вызываемых облигат-ными биотрофами, у которых некроз клеток хозяина сопровождается деградацией гаусториев.

На этой стадам патогенеза в каждой клетке мицелия Р.огугае наблюдается по одному интерфазному ядру с крупным ■ электроноплот-ным ядрышком. На продольных срезах гиф выявляются длинные ветвящиеся митохондрии с многочисленными кристами. В клетках гриба имеется множество цистерн гладкого и гранулярного эндоплазмати-чаского ретикулума. Часто можно наблюдать, многочисленные мелкие вакуоли с электроноплотными отложениями, миелиновые фигуры и ломасомоподобные структуры (Рис.4).

Третья особенность заключается в том, что при' пирикуляриозе ( нз наблюдается ультраструктурных проявлений повышения синтетической активности пораженных клеток, имеющих место при развитии облигатных биотрофов. Биотрофная фаза пирикуляриоза характеризуется ускоренным старением клеток хозяина и постепенным автолизом их органелл. На старение клеток указывает рост алектроноплотных глобул в центральной вакуоли - так называемых вакуолярных гранул, разрыхление ламоллярной системы и просветление стромы хлороплас-тов, отложение мелких липидных капель в митохондриях, образование инвагинаций ядерной оболочки и вздутий перинуклоарного пространства (рис.4). Если бпртрофное взаимодействие не прерывается гибелью клетки растения, ее органеллы постепенно распадаются, а полость заполняется растущей вакуолью. Со временем в клетке вокруг внутриклеточной гифы остаются инвагшшрованная плазмалемма, тонкий слой цитоплазмы и тонопласт растения-хозяина.

4.3. Взаимодействие паразита и хозяина на стадии спороношения

Через 6-8 суток поело инокуляции типичные инфекционные пятна, вызываемые пирикуляриозом на листовых пластинках воспрлимчм-вых сортов риса, имеют овальную форму и рнзм^ры около йхЗ да. Центр пятна представляет собой высохшую побуревшую Тдаьь растения с мелкими островке:« золеных тканей. По периферии инфекционное нятно окружено более или менее широкой зоной хлороза. В &то время гиф! гриба обнаруживаются в клетках эпидерма, мезофилла и проводящих пучков (Рис.5). ■

Известно, что поздняя стадия пирикуляриоза является некро-трофной. Результаты нашей работы уточняют ото положение. Действи-

телыю, через 6-8 суток после инокуляции в середине инфекционного пятна большинство клеток растения-хозяина нэкротизировано. Их цитоплазма и органеллы лизированы, даже клеточные стенки и вакуоляр-ше гранулы частично разрушены (рис.6). Интенсивность гистохимических реакций в этих клетках значительно ниже, чем в контроле, что, очевидно, говорит об утилизации патогеном питательных веществ хозяина.

Основная масса клеток мицелия на поздней стадии болезни обнару-игеает признаки естественного старения и деградации. Это выражается в просветлении и вакуолизации цитоплазмы, образовании в ней миели-нових фигур, а в ядрах - глыбок гетерохроматина при просветлении кариоплазмы. Ядрышки в стареющих клетках не выявляются (Рис.6). Очевидно, эта особенности ультраструктуры отражают процессы автолиза цитоплазмы мицелия и транспорт питательных веществ к формирующимся конидиям. Методами сканирующей электронной микроскопии и световой микроскопии мы показали, что образование конидий Р.огугае .может протекать не только на поверхности растения, но и внутри его тканей - г. воздушной полости центрального проводящего пупса. •

По наши данным, на поздней; стадии пбтогоысоо наряду о некро--трофией имеет место взаимодействие гриба с живыми клетками растения,

то есть - элементы биотрофии. На это указывают две особенности ультраструктуры клеток паразита к хозяина.

Первое: в инфекционном пятне, в окружении некротизированных тканей сохраняются, так называемые, зеленые островки - группы мезофилльных клеток, которые по неизвестной причине но подверглись некрозу, но имеют ультраструктуру, характерную для ранней -биотрофной фазы патогенеза. Внутриклеточных гиф в этих клетках мы не обнаружили. Гифы, расположенные в непосредственной близости от них, имеют ультраструктуру, свидетельствующую об активном функционировании. Очевидно, эти гифы продолжают биотрофное питание за счет этих клеток хозяина.

Второе свидетельство биотрофии на поздней стадии патогенеза. Периферия инфекционного пятна, вызываемого пирикуляриозом на листьях восприимчивых сортов риса, представляет собой более или менее широкую зону хлороза тканой растения. Гриба в этой зоне ш не обнаружили. Очевидно, патоген не способен нормально развиваться или преодолевать эту зону. Органеллы клеток хозяина здесь лизированы. Наблюдаются только клеточные стенки и вакуолярные

Рис.6. Ультраструктура клеток мицелия Р.огугае и пораженной мезофилльной клетки листовой пластики восприимчивого сорта риса через 6-8 суток после инокуляции.

гранул!. Однако иногда встрочаются клетки, в которых пласмалемма и тононласт сохраняют целостность, хотя цитоплазма и ядро в них лизироваки. Центральная вакуоль при этом занимает весь объем клетки, так что тонопласт почти вплотную прилегает к шшсмалемме. По нашему млению, это говорит в пользу того, что клетки на периферии инфекционного пятна подвергаются ускоренному старению ' без некроза. Это отличает позднюю стадию пирикуляриоза от болезней, вызываемих некротрофами, при которых, как известно, некроз клеток хозяина опережает распространение мицелия.

Глава_5. Проявление устойчивости риса к пирикуляриозу

Устойчивость риса к пирикуляриозу мы исследовали на примере взаимодействия сорта Dular с авирулентним к нему штампом P.oryzae И-5-3.

Чере:< 4 суток после инокуляции на листьях этого сорта ¡грояв-..шются симптомы заболевания в виде бурых пятен размером не более 0,5 мм. Мы установили, что эти пятна Представляют собой небольшие группы шжротизироьанных клеток хозяина. Развивающегося гриба не обнаруживается. Это дает основание предполагать, что внедрение возбудителя пирикуляриоза в ткани сорта Dular вызывает у последнего защитную реакцию, проявляющуюся -быстрым некрозом клеток растения, то есть - блокированием биотрофной фазы патогенеза.

Ранее Пенг и Шишияма на основании световой микроскопии сделали вывод о том, что чем устойчивее сорт, тем раньше проявляются реакции его клеток на внедрение возбудителя пирикуляриоза, но морфологическое проявление этих реакций у разных сортов одинаково (Peng, stilshiyama, 1989). Проведенные нами исследования ультраструктуры КЛоТС.К устойчивого и восприимчивых сортов выявили морфологические различия их реакций, указывающие на существование разных механизмов некроза.

Так, в живых клетках сорта Dular, находящихся вблизи некро-тпзированных, размер пластоглобул в хлоропластах увеличивается, но разрыхления льмеллнрной системы, подобного происходящему в клетках восприимчивых сортов, не происходит. Пвринуклеарное пространство ядер клеток мезофг.пла атого-сорта снимается до' ширины примерно 0,05 '.та,1, в го время как в совместимой комбинации оно расширяется. В клетках, устойчивого сорта наблюдаются 'более толстые отложения слэктроношютного материала между клеточной стенкой и пдазмалсьтеой (Рис. 7),

Рис. Т. Ультраструктура мезофилльной клетки листовой' пластинки сорта Маг, инокулированной авирулентным штаммом Р.огугае. 4-8 суток после инокуляции.

Поведение меланиндефицитных мутантов Р.огугае на поверхности листа риса

Работами многих авторов установлено, что меланин, содержащийся в аппрессориях, обусловливает способность гриба проникать сквозь искусственные полимерные мембраны. На этом основании было сделано предположение, что он необходим для внедрения патогена в ткани растения-хозяина (КиЬо, Ритизаг/а, 1986 ; Б1с1ег еЬ а1., 1984). Данные, полученные с применением инокуляции листовой пластинки риса, немногочисленны и противоречивы. Гак, методом микроманипулирования и сканирующей электронной микроскопии показано, что ингибирование биосинтеза меланина блокирует формирование инфекционного выроста у аппрессориев, образовавшихся на поверхности листа риса (Шгоокя et а1., 1982). В других работах сообщалось, что методом просветления листовой пластинки удалось наблюдать проникновение инфекционных гиф из аппрессориев меланиндефицитных мутантов Р.огугае (Лапикова, Джавахия, 1987;Дкзвахия и др., 1990).

По нашим данным, конидии меланиндефицитных мутантов Иоз-4 и А1Ь-7, прорастающие на поверхности листовой пластинки универ-

сально восприимчивого copra риса Клейкий, формируют ростковые трубки и annpoccopira. Через 2 суток после инокуляции аппроссории этих штаммов на срезах выглядят пустыми. Внутриклеточных гиф в апидермалышх клетках г.од шдам не обнаруживается.

При просмотре поверхности листьев риса под люминесцентным гмфоскопом обычно наблюдается сине-зеленое свечение тангенталь-них стенок эпидермальных клеток на красном фоне, обусловленном хлорофиллом. Иногда встречаются аномалии флуоресценции отдельных клеток или групп клеток. Мл наблюдали два типа аномалий. Первое -яркое желтое свечение, свидетельствующее о повреждении клэток (ВеселоЕсккй, Ееселова, 1990). Второе - аномально яркое свечение тангенталышх стенок эпидермалышх клеток, которое, судя по лите-ратуршм данным, монет являться ратей реакцией на распространение возбудителя лирикуляряоза (Heath et al., 1990; Peng, Shlalil-

Таблица 1 .

Плотность аномалий флуоресценщш на листьях риса сорта Клейкий при инокуляции конидиями возбудителя тгрикуляриоза.

j Штамм Плотность нанесения конидий, шт/см2 Срок после инокуляции. Плотность аномалий флуоресценции,

j сут. о шт/см

Н-5-3 192,6t24,9 192,6±24,9 2 ' 3 10,4+1 ,Т * 19,3±3,3

Ros-4 113,9*18,4 2 4,0±1,3 ***

'113,9+18,4 3 4,2+0,9 ***

Alb-7 208,4+22,8 208,4+22,8 2 3 3,7±0,б *** 5,5±0,8

j Контроль 0 2 5,5+0,5

j 0 3 б,5±1 ,5

» - Величина достоверно отличавтЬя от- контроля с надежностью

-0,95.

*» - Ветчина достоверно отличается от контроля с надежностью В2=0159.

*** - Отличие от контроля не достоверно.

yarn., 1989). При инокуляции конидиями штамма Н-5-3 на листьях сорта Клейкий появляется значительное количество аномалий флуоресценции. При инокуляции штаммами Ros-4 и А1Ь-7, как и на листьях контрольных растений, обнаруживается небольшое число подобных аномалий. Их плотность остается низкой во всех вариантах опыта и практически не отличается от контрольной (табл.1). Очевидно, эти аномалии флуоресценции не связаны с инокуляцией, а исследованные нами меланиндефицитные мутанты P.oryzae не развиваются в тканях листовой пластинки риса.

Глава_7л О разновидностях систем паразит-хозяин

Закономерности патогенеза обычно трактуют, исходя из разделения фитопатогенных грибов на биотрофы и некротрофы (Tapp,1975). Биотрофы - это паразиты, получающие питательные вещества от живых клеток хозяина. Некротрофы - это паразиты, получающие питательные вещества от мертвых клеток хозяина ( Thrower, 1966). Однако современные экспериментальные данные показывают недостаточность такого разделения. Существуют фитопатогенные грибы, начинающие свое развитие в тканях хозяина как биотрофы, а позднее переключающиеся на некротрофное питание. Для таких патогенов предложено наименование гемибиотрофы (Luttreil, 1974).

Цитологические исследования взаимодействия облигатшх био-трофов с их растениями-хозяевами рассмотрены нами на примере некоторых хорошо изученных болезней (ржавчина, мучнистая роса и др.).

В качестве примера облигатного некротрофа приведен возбудитель корневой губки деревьев Heterobasidion annosum (Hodges, 1969). Обсуждаются механизмы некроза клеток хозяина,в частности -роль пектолитических ферментов патогена (Васильева и др.,1984 ; Cooper, 1983).

Описаны цитологические и некоторые физиологические свойства патогенеза гемиби~трофных грибов. Анализируются их сходства и различия с облигатными биотрофами и некротрофами. Показано, что у каждого гемибиотрофа тлеются особенности патогенеза.

Так, гриб Phytophthora Infes tans в первой пораженкой клетке листа картофеля формирует инфекционную везикулу, от которой растут внутриклеточные mju. Они проходят через живые клетки палисадной паренхшлы и выходят в губчатую паренхиму. Там патоген разрастается в виде ver-uieточного мицелия и г^гаддердо* гаусторв-.

ев трубчатой формы. В начале патогенеза изменения ультраструктуры клеток хозяина минимальны. Признаков повышения метаболической активности (увеличения количества мембран эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольдки) не наблюдается. Примерно через 2 суток после инокуляции начинается некроз клеток растения, но на этой стадии он не ограничивает дальнейшего роста гриба и его споруляции. Устойчивость хозяина проявляется ранним началом некроза клеток растения, модификацией клеточных стенсж, образованием вокруг гаусториев более толстых матриксов, содержащих каллозопо-добный материал, выделением фитоалексинов (Coffey, Wilson, 1983).

Прорастающие конидии Colletotrichum lindemuthlanum образуют ростковые трубки с ашгрессориями, с помощью которых гриб внедряется в эпидермальные клетки листа фасоли. В первой заселенной клетке патоген формирует инфекционную везикулу, от которой растут толстые первичные гифы. Эти гифы распространяются по тканям хозяина, переходя из клетки в клетку в местах их контактов. При этом гриб локально лизирует клеточную стенку и инвагинмрует плаз-малемму растения. Каждая клетка, подвергшаяся внедрению патогена, остается жизнеспособной приблизительно 24 часа. Однако массовая гибель клеток хозяина начинается через 6-7 суток после инокуляции. Начало некротрофной фазы совпадает -по времени с ростом активности пектинлиазы, секретируемой грибом в ткани растения. При этом гриб формирует гонкие вторичные гифы, растущие межклеточно и Енутриклеточно (O'Cormell, Bailey,1990; Wljeaundera et al.,1989).

Гриб Cladosporium cucumerlnum внедряется в ткани листьев восприимчивых сортов огурца мевду тангентальными стенками эпидермы и разрастается по межклетникам, не вызывая некроза клеток растения. Позднее патоген заселяет погибающие клетки хозяина (Laborda, Maxwell, 1976).

В течение биотрофной фазы развития возбудителя парии яблони Yenturia lnaequalls (2-3 недели)гифы распространяются меаду кутикулой и наружными клеточными стенками пораженного органа. Внедрение в клетки хозяина начинается только при переключении патогена на некротрофию (Corlett et al., 1976).

На основании литературных и- собственных экспериментальных данных мы разделили изученные к настоящему .моменту гемибиотрофы на 5 типов. В качестве критерия разделения, была принята локализация гриба б тканях■растения-хозяина в течение биотрофной фазы патогенеза (Табл.2).

Таблица 2.

Типы гемибиотрофшис болезней растений.

Типы Г8МИ-биотрофов Характер биотрофной фазы Пример

патоген X03AHH литературный источник

"подкути-кулярные" гифы между кутикулой и наружными стенками клеток эпидермы Venturia lnaequalls Malu3 "Hopa" Corlett, et al., 1976.

"межклеточные" гифы в межклеточном пространстве Gladoapori-um cucume-rinum Drechslera dietyoides Leptosphae-ria macu-lans Cucumis satlvus Lolium perenne Brassica napus Labonla, Maxwell. 1976. Cromey, Cole,1985. Hammond et al.,1985.

"меккле-точно-внутри-клэточные" гифы в межклеточном пространстве и в живых клетках Pyrlcularla oryzae Oryaa sativa Морозов, 1990.

"внутриклеточные" гиЕи в живых клетках Colletotrichum linde-muthianum Bipolarls гатепеШ Pliaseo-lus vulgaris Sporobolus poi-retii 0'Cornell. Bailey, 1990.; Luttrell, 1976.

"гаусто-риальные" гифы и гаустории в живых клетках Phytophtho-ra Inies-tans Albugo tra-gopogonis Solanum tuberosum Senecio squalidus Coiiey, Wilson,1983.j Whipps, i Cooke, 1978. .

выводы

1. При поражении восприимчивых сортов риса грибом Р.огугае начало патогенеза (период до 3-4 суток после инокуляции) имеет биотрофный характер, хотя отличается от патогрнеза облигатных биотрофов. Поздняя стадия лирикуляриоза (6-8 суток после инокуляции) является преимущественно некротрофкой. То есть, возбудитель пирикуляриоза риса является гемибиотрофным паразитом.

2. Развитие возбудителя пирикуляриоза в тканях восприимчивых сортов риса ускоряет старение клеток растения-хозяина, о чем свидетельствует рост вакуолярных гранул и пластоглобул, просветление стромы и разрыхление ламэллярной системы хлоропласгов, появление в митохондриях липидных капель, образование инвагинаций ядерной оболочки и крупных вздутий перинуклеарного пространства.

3. Устойчивость сорта Ш1аг к природному изоляту Р.огугае Н-5-3 связана с ранним началом некроза клеток, подвергшихся вне-дрешта патогена, а также расположенных вблизи некротизированных клеток.

4. Отсутствие разрыхления ламеллярной системы и просветления стромы хлоропластов, а также сжатие перинуклеарного пространства отличают некроз клеток сорта ШЯаг от некроза, протекающего при поражении восприимчивых сортов риса. Следовательно, некроз в совместимой и несовместимой комб1шациях паразита и хозяина может иметь разные причины и механизмы.

5. Конидии мэланиндефицитных мутантов Р.огугае йоз-4 и А1Ь-7 прорастают и образуют аппрессории на поверхности листовой пластинки универсально восприимчивого сорта риса Клейкий, но не развиваются в его- тканях. По-видимому, это обусловлено тем, что ап-•прессории, не имеющие меланина, не обеспечивают проникновение гриба сквозь клеточные стенки растения.

6. Пирикулярноз риса сочетает в себе свойства патогенеза болезней, вызываемых гемибиотрофами, гифы которых в течение био-трофной фазы распространяются по межклеточному пространству пора-жошюго органа, и гемибиотрофами, гифы которых растут внутри живых клеток хозяина, поскольку Р.огугае образует как межклеточные, так и внутриклеточные гифы в живых клетках растения.

Работых_опублшовашшв_по_теме_дассеЕтацш

1. Морозов ¡D.M. Ультраструктура клеток паразита и хозяина

при развитии пирикуляриоза риса // Ультраструктура растений : Тез. докл. б Всесоюз. симп. - Киев,1988. С.216.

2. Морозов Ю.М., Плотникова Ю.М. Цитологические исследования развития гриба Pyricularla oryzae Cav. в тканях листа риса // Микол. и фитопатол. 1989. Т.23. Вып.2. С.113-117.

3. Морозов Ю.М., Плотникова Ю.М. Гистологическое исследование растений риса, пораженных пирикуляриозом // Микол. и фитопатол. 1989. Т.23. Вып.6. С.576-580.

4. Морозов Ю.М.„ Дкавахия В.Г. Проявление устойчивости риса к пирикуляриозу на цитологическом уровне // Микол. и фитопатол. 1990. Т.24-. ВЫП.2. С.161-165.

5. Морозов Ю.М. Взаимодействие мицелия Pyricularla oryzae и клеток растения-хозяина до проявления видимых симптомов // Микол. и фитопатол. 1990. Т.24. Вып.5. С.441-445.

6. Морозов Ю.М. Ультраструктура гиф возбудителя пирикуляриоза риса и пораженных клеток растения-хозяина на стадии спороноше-ния // Школ, и фитопатол. 1991. Т.25. (В печати)