Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И THEILERIA ANNULATA

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И THEILERIA ANNULATA"

Л-

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ ЛЕНИНА

На правах рукописи КОЗЫРЕЙ КО Тимофей Иосифович

ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И ТНЕ|ЬЕ1*1А ДЫМЧАТА

(03.00.06 — ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидат а ветеринарных наук

всесоюзный ордена ленина институт

экспериментальной ветеринарии

всесоюзной ордена ленина академии сельскохозяйственных наук имени ленина

На правах рукописи КОЗЫРЕНКО Тимофей Иосифович

ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК ЛИМФОИДНОИ ТКАНИ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ'АУЕСКИ И ТНЕ1ЬЕ1?1А АЫМиЬАТА

(03.00,06 — ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на" соискание ученой степени кандидата'ветеринарных наук

Работа выполнена в лабораториях культур ткани и питательных сред и биофизики Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии в период 1972 — 1975 гг- Директор института — академик ВАСХНИЛ, заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, ■профессор Я- Р. КОВАЛЕНКО.

Диссертация изложена на 188 страницах машинописи и состоит из: введения — 2 стр., обзора литературы — 25 стр., собственных исследований — 116 стр„ обсуждения полученных результатов — 20 стр., выводов — 3 стр., литературного указателя — 23 стр., содержащего 181 наименование на русском и 109 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 129 рисунками и 6 таблицами.

Научный консультант — доктор биологических на vif, .профессор С. Я. ЗАЛКИНД

Научные руководители:

Кандидат ветеринарных .наук Л. С. РАТНЕР

Кандидат ветеринарных наук В. А- ГОРБАТОВ

Официальные оппоненты■

1. Доктор биологических наук Д. Ф. ОСИДЗЕ

2. Кандидат ветеринарных наук В. С. АВИЛОВ

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии. •• ' 1 :

Автореферат разослан « *â » ¿У'fiDj?Jf 1975 г.

Защита состоится « ЛЛ* OrCTjJ>fl4 1975 г.

в 14 час. на заседания Ученого Совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (109472, Москва, Кузьмин«и, ВИЭВ).

С диссертацией .можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ-

Ученый секретарь ВИЗВ,

кандидат биологических наук В. В. КАЛУГИН-

ВВЕДЕНИЕ

Культуры клеток млекопитающих широко используются при биологических исследованиях, в tojh числе и в ветеринарной вирусологии, для изучения развития клеточных популяций in vitro, взаимодействия клеток с вирусами, простейшими, а также для создания вакцинных препаратов и диаг-ностнкумов.

Несмотря на большие успехи, достигнутые в культивировании in vitro .клеток почечной и кожно-мышечной ткани разных видов млекопитающих, менее изученными оставались вопросы получения однослойных культур из лимфоидной ткани, играющей весьма важную 'роль в иммуногенезе как здорового, так и больного организмов, а также пригодности их для повседневных научных и практических целей.

Особый интерес представляет всестороннее .познание процессов, происходящих в системе клетка—вирус, поскольку вирусы, взаимодействуя с клеткой, репродуцируются в цитоплазме или ядре, используя ¿при этом питательные вещества и биосинтетические системы клеток. В результате функции одних -систем клетки активизируются, других—/подавляются, что приводит к существенной перестройке метаболизма клетки или к ее гибели (А. Г. Букринская, 1962; В. М. Жданов, 1963; Ф. В. Сушков и др., 1964; Г. А. Кудрявцева и др;, 1965; А Л. Шабадаш и др., 1966; С. Я- Залкинд, 1967; Я. Е. Хесин и др., 1967; Ф. И. Ершо® .и др., 1968; Б. А. Ермак и др., 1974 и др.).

Наряду с этим, недостаточно выяснен характер взаимодействия 'возбудителей лротозоиных болезней сельскохозяйственных животных, в частности, тейлериоза крупного рогатого скота — Theileria annulata с лимфоидньши клетками в культуре ткани. Культивирование тканевой стадии развития этого возбудителя (отечественных штаммов) в Советском Союзе стало возможным, благодаря исследованиям, проведенным впервые в лаборатории протозоологии и арахнологии

виэв.

Результаты этих исследований послужили предпосылкой для получения .перевиваемых штаммов хронически инъазиро-

ванных Т. annulata лимфоидных клеток крупного рогатого скота в лаборатории культур ткани и питательных сред ВИЭВ, которые были предоставлены нам для цитологического изучения,

В свете изложенного представляется важным изучение обмена веществ в клетках пораженных вирусами, тейлерия-ми, а также при смешанной инфекции, с попользованиелг морфологических и цитохимических методов. Это позволит расширить представления об интимных механизмах, лежащих в основе взаимодействия вирусов и (простейших с клет-калш.

В задачу наших исследований входило:

Получить однослойные культуры и субкультуры клеток из тимуса и селезенки морской свинки, теленка и эмбриона коровы- Изучить в сравнительном аспекте морфологическую характеристику нормальных культур и подвергшихся воздействию вируса болезни Ауески.

Изучить с ^помощью цитохимических реакций некоторые звенья метаболизма культур клеток лимфоидной ткани в процессе их развития и при заражении вирусом болезни Ауески,

Изучить чувствительность культур клеток лимф<отдной ткани к вирусу болезни Ауески.

Изучить морфологическую и цитохимическую характеристики культур клеток селезенки, лимфоузла и тимуса хронически янвазированных тейлериямн (Т. annulata), а также при инфицировании этих культур вирусом болезни Ауески.

Материалы и методы

В опытах были использованы: тимус и селезенка (ТМС, CMC) 78 морских свинок 1—3-месячного возраста; 30 эмбрионов коров (ТЭК, СЭК) в возрасте 2— 4 месяцев; 16 селезенок телят (СТ) 3—5-месячного возраста; 9—11-дневные ку-гриные эмбрионы; культуры клеток лимфоузла (ЛТт), селезенки (СТт) и тимуса (ТТт), хронически и-ивазиро-ван-ные тейлериямн (26—40 пассажей) и вирус—вакцина ГНКИ против болезни Ауески (серия 71, контроль 71).

Для получения и выращивания однослойных культур клеток применяли: среду 199; Игла и 0,5% гидролизат лакталь-бумИ'Нз (ГЛ AJ на растворе Хен.кса; 0,25%-лый раствор трипсина; 0,02%-шый раствор версена; 5%-ный раствор бикарбоната натрия; раство_р антибиотиков — 100 ЕД пенициллина и 200 ЕД стрептомицина на мл питательной среды и сыворотку крупного рогатого скота (КРС). 4

Тимус н селезенку в асептических условиях извлекали из организма и -помещали в стерильные 200 -мл банки. Промывали их трижды раствором Хенкса с антибиотиками и измельчали ножницами. Эти ткани дезагрегировали .при t 37° 0,25%-нЫ|м раствором трипсина на магнитной мешалке. Один цикл трипсинизации продолжался 10—15 минут. Клетки отделяли от трипсина центрифугированием при 800 — 1000 об/мин. в течение 10 минут. Осадок ресуопендировали в питательной среде 199 н фильтровали через четырехслойный стерильный марлевый фильтр. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Взвесь клеток в концентрации 2— 6X10® на мл среды с 10% сыворотки КРС засевали в 50— 1000 мл сосуды, в пробирки и в пенициллиневые флаконы с покровными стеклами.

■Первичные культуры тимуса и селезенки, выращенные в матрасах, снимали для субкультивирования на 8—15, а субкультуры на 5—7-й дни инкубирования, используя смесь растворов 0,02%-ного версена н 0,25%-ного трипсина <в соотношении 9:1, Полученную суспензию клеток из одного сосуда высевали на два—три аналогичные матраса.

С целью изучения чувствительности культур клеток лим-фоидной ткани, их подвергали инфицированию вирус—'вакциной ГНКН против болезни Ауески (ВБА), предварительно освеженной на культуре куриных фнбробластов (КФ). Вирус болезни Ауески поддерживали в лабораторных условиях .путем пассирования в чувствительных 'клетках КФ > по обще* принятой методике. Вирус титровали в гомологичных и гете-рологичных -клеточных культурах, выращенных в пробирках. Титры вируса вычисляли по Риду и Менчу (1938) и выражали в логарифмах (]£) ТЦД 50/мл.

При цитологических исследованиях нормальных и инфицированных культур тимуса и селезенки, инфицированных ВБА, а также ннвазированных тейлернями и при смешанном их инфицировании нами разработана специальная кассета, позволяющая одновременно окрашивать серию, подлежащих сравнению цитологических препаратов. Морфологию клеток-изучали на фиксированных метиловым спиртом и окрашенных по Романовскому—Гимза тканевых препаратах. Митоти-ческую активность (МА) выражали числом делящихся клеток <на 1000 подсчитанных (в каждом случае подсчитывали 4000—5000 клеток). Результаты обрабатывали статистичес-^ ки по методу Фишера—Стъюдента. Гликоген выявляли по* Шабадашу (1949), активность кислой фосфатазы (АКФ) по Гомори (1959). Препараты на нуклеиновые кислоты (НК)

фиксировали в жидкости Карнуа и окрашивали акридиновым оранжевым. Интенсивность реакции на гликоген и АКФ в части культур учитывалась визуально полуколичественным методом. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) выводили ло формуле G. AstaJdi и L. Verga (1957).

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Морфологическое изучение динамики развития первично трипсинизированных культур и субкультур клеток лимфоидной ткани

Клетки дезагрегированной лимфоидной ткани, высаженные во флаконы, обладали различной адгезивной способностью. Большая часть из них не -прикреплялась к стеклу и дегенерировала- Прикрепившиеся клетки формировали однослойную культуру, состоявшую .из фибробластоподобных (ФП), эпителиоподобных и многоядерных клеток, а также макрофагов.

В процесе культивирования морфологический состав клеток изменялся; культуры проходили три фазы развития, которые наблюдали А. А, Максимов (1916), Р. К. Чайлахян (1970), L. Berman a oth (1955), Н. Woodliff (1958).

Цитоморфологический анализ клеток ТМС доказал, что уже через 12—15 час, после начала культивирования в культуре'Преобладали ФП элементы и к пятым-шестым суткам из них образовывался .монослой. Среди них встречалось небольшое количество макрофагов, многоядерных элементов и колонии зпителнеподобных клеток. Последние клетки отличались большой устойчивостью и сохранялись в культуре до 15 суток культивирования. Феномен ранней вакуолизации, ФП клеток, в отличие от всех остальных культур,о культуре ТМС выражен слабо.

Динамика развития культуры клеток ТЭК и её морфологический состав в основном совладали с культурой клеток ТМС. В этой культуре также преобладали ФП элементы, однако, число макрофагов на 5—6-е сутки иногда достигало 30% общего числа клеток. Обращает на себя внимание и развитие большого числа очагов элител неподобных, интенсивно размножавшихся клеток- Показательна также высокая продолжительность жизни культуры ТЭК (до 30 суток). Возможно, что в данном случае мы сталкиваемся с той высокой потенцией к размножению и длительному культивированию, которая неоднократно описывалась для культур эмбриональной ткани (Е. М, Доссер и др., 1968). 6

Культуры клеток селезенки в некоторых отношениях существенно отличаются от культур клеток тимуса. Прежде ЕСего, морфологические различия обнаружены в исходной клеточной взвеси. Так, еслн в ТМС был» в основном тимоци-ты и ретикулярные клетки стромы, то в клеточной взвеси селезенки выявлялись еще и форменные элементы крови. Эти различия особенно отчетливо 'проявлялись при культивировании, В первые четверо суток культивирования преобладающими элементами CMC и СТ являлись макрофаги н многоядерные клетки с небольшим числом ФТ% элементов. Число последних возрастало лишь на 6—7-е сутки культивирования. Росли они в виде очагов. Очаги, постепенно разрастаясь, увеличивались в размерах, соединялись между собой с образованием монослоя после 15 суток культивирования.

Характерной особенностью селезеночных культур являлось также присутствие значительного числа многоядерных клеток и полное отсутствие эгштелиоподобных элементов. Развитие этих культур также характеризовалось тремя фазами; но содержание их отличалось от того, что наблюдалось при развитии культур тимуса. В тертой фазе в CMC и СТ сохранялись исходные элементы органа; во второй фазе преобладали макрофаги и только в третьей фазе культура состояла в основном из ФП клеток, что согласуется с данными Р- К. Чайлахян (1970).

Что касается динамики изменения клеточного состава культуры клеток СЭК, то в данном случае она не отличалась ст культуры ТЭК. Фаза ■ макрофага л ь-н ого роста в ней отсутствовала и клетки неонатального донора обладали высокой адгезивной способностью in vitro.

Таким образом, как морфология, так и динамика развития культур тимуса и селезенки, несмотря на наличие сходства, имеют и отличия, определяемые органными и возрастными особенностями донора. Видовых различий в морфологии культур установить не удалось.

Морфологический состав субкультур ТМС, ТЭК, CMC, СЭК н СТ был сходен, хотя в первых пяти пассажах .присутствовало еще некоторое число макрофагов. Они располагались, как и в ¡первичных культурах, изолированно, о при плотном слое — на поверхности ФП клеток. Последние клетки в субкультурах тимуса имели полигональную форму, а в селезеночных культурах были представлены вытянутыми элементами. Это наблюдение заставляет предполагать, что в зависимости от органного .происхождения, в субкультурах развитие 'получают разные стволовые клетки.

Изучавшиеся первичные культуры обладают низкой мито-

тической активностью. Наиболее .высокая МА наблюдалась в ^культуре клеток ТЭК, в которой число митозов к пятым— шестым суткам достигало 16—]9,6%0, затем постепенно число митозов снижалось и к 10™ суткам их обнаруживалось лишь 3%о. Сходные, но немного более низкие, цифры получены для культур клеток ТМС и значительно меньшее число митозов встречалось в культурах клеток СЗК, CMC и СТ.

В субкультурах МА была более высокой уже с первых суток и достигала максимума 15—20 %0 к третьим—четвертым суткам культивирования.

Изучавшиеся культуры отличались и по количеству многоядерных элементов. Так, в культурах ТМС и ТЭК число их не превышало 20—24%о, тогда как в культурах CMC и СТ к пятым—шестым суткам их насчитывалось больше 50%0. Параллелизм числа многоядерных элементов к числа макрофагов в культурах заставляет предполагать, что именно последние дают начало многоядерным элементам. Возможно также, что обратная зависимость между высотой МА и числам многоядерных клеток не случайна, но этот вопрос требует дальнейших исследований.

При изучении динамики отложения гликогена, выявления АКФ и НК в первично трнпсинизироваиных (ПТР.) культурах и субкультурах .клеток, .полученных от неонатальных и постна та льных доноров, обнаружены общие закономерности в морфологии и локализации конечных продуктов реакции в зависимости от категорий клеток.

В ПТР культурах, начиная с первых двух суток культивирования, цитохимические реакции были очень интенсивными © макрофагах и многоядерных клетках, В ФП клетках, даже в 'Период расцвета культуры, реакция на гликоген и АКФ выражена слабо.

Таблица [

Средни!« цитохимический коэффициент гликогена в ПТР культурах на 5—7-« сутки культивирования

Культуры клеток н дни культивирования

Типы ТМС ТЭК CMC СЭК

клеток 5-й 6-й 7-й 5-й 6-й 7-й 5.Й 6-й 7-й 5 й 6-й 7-й

ФП М мн 1,10 2,55 2,31 1,П 2,57 2,31 J ,24 2,66 2,35 1.05 2,30 ■J.06 1,08 2,44 2,10 1,09 2.49 2,32 1,19 2,71 2,50 1,26 2,62 2,31 1,28 2,67 2,38 1,18 2.45 2,42 1,24 2,55 2,51 1,25 2,81 2,66

ФП—фибробластоподобные, М — макрофаги и ЛШ — многоядерные клетхи.

Из таблицы видно, что СЦК в макрофагах и многоядерных клетках выше, чем в фиброблаегоподобных.

Гликоген в подавляющем большинстве клеток выявлялся в десмоформе, Некоторые макрофаги н плотные очаги из ФП клеток, кроме зернистого гликогена, содержали и глыбчатые его скопления. На пятые—шестые сутки интенсивность реакций на гликоген и АКФ возрастала и в ФП клетках.

Интенсивность реакций с стареющих культурах понижалась. Во многих клетках гликоген выявлялся в лиоформе и число гранул кислой фосфатазы уменьшалось.

Результаты наших исследований совпадают с данными Л. П. Изаковой (1965), изучавшей другие клеточные культуры и хорошо объясняются с позиций представления об адаптации культивируемых вне организма .клеток (С. Я. Залкпнд, В. Г, Заславский, 1964).

Наши исследования .показали, что различия в содержании того или иного вещества наблюдались не только среди разных категорий клеток, но и внутри одной категории ФП элементов и были связаны со стадией их дифференцирования. Установлено также, что в ФП клетках, собранных в очаги, реа.кция на гликоген, АКФ и НК более интенсивна, чем в изолированно лежащих элементах.

Имелись различия и между культурами разного органного происхождения, но они выражены "менее резко, чем различия между отдельными категориями клеток. Отмечено большее количество выявляемых веществ в однотипных ФП клетках культур селезенки, чем в культурах тимуса. Вместе с тем, в изолированно лежащих ФП клетках культур СМС и СТ повышение содержания гликогена наблюдалось на три— четыре дня позже, чем в соответствующих .клетках ТМС и ТЭК. Наши данные показывают, что обмен веществ в макрофагах и .многоядерных клетках значительно выше, чем в ФП элементах, что связано, вероятно, с большой физиологической активностью клеток этих категорий. Следует отметить, что в субкультурах процессы обмена 'веществ происходят значительно интенсивнее, чем в первичных культурах, что указывает на большую адаптацию клеток субкультур к новым условиям существования .вне организма.

Изучение культур клеток лимфоидной ткани, инфицированных вирусом болезни Ауески

Цитоморфологические исследования окрашенных препаратов позволили выявить неодинаковую чувствительность к вирусу болезни Ауески разных категорий .клеток и проследить

в динамике за -морфологическими изменениями, происходящими при взаимодействии вируса с клеткой.

В однослойных культурах клеток лимфоидной ткани наиболее чувствительными к ВБА оказались ФП клетки. В них через 4—б час. после заражения наступали изменения, выражавшиеся в перераспределении хроматина ядра, утолщении ядерной оболочки и исчезновении ядрышек. Через '9—12 час. цитопатический эффект резко нарастал, клеточный .пласт разрыхлялся и увеличивалось количество клеток с измененными ядрами. К 18 час большинство ФП клеток подвергалось дегенеративным изменениям. Очаги деструкции расширялись. Увеличивалось число клеток с ма-ргинацией хроматина. Через сутки часть пораженных клеток сморщивалась к сливалась в своеобразные скопления -в виде «гроздьев винограда», другая часть клеток отделялась от стекла. К 36 — 48 час, все ФП клетки погибали, в то время как часть макрофагов—-гистиоцитов и единичные многоядерные клетки оставались ¡по внешнему виду морфологически неизмененными. В этих двух категориях клеток первые морфологические изменения появлялись через 12 час, после заражения. Ядра их шкнотизировались, ослабевала базофилия цитоплазмы и несколько усиливалась вакуолизация по периферии цитоплазмы. Появлялись шаровидные цитоплазм этические выпячивания (клазматоз),

В эннтелиоподобных клетках ТМС и ТЭК отмечалось более позднее проявление цитопатическош действия (ЦПД) и более медленное его развитие по сравнению с ФП клетками. Первые признаки дегенерации этих клеток появлялись только через 12—15 час. после заражения. Ядра и ядрышки незначительно увеличивались в размерах и затем как бы растворялись в кариоплазме. В более пшдние сроки (30 — 48 час*) их инфицирования наблюдалось сморщивание, округление и слияние отдельных групп клеток с наследующим образованием хорошо выраженных си мш ластов.

Характерной особенностью инфицированных э-пителнеподобных клеток являлось наличие митозов. Если во Бсех изучавшихся культурах митозы в ФП клетках отсутствовали уже спустя 3—6 час. после заражения, то в колониях эпите-лислодабпы.ч клеток их насчитывалось до 16 % о и через 18 часов.

При морфологическом исследовании других клеточных культур выявлены некоторые отличия. Так, в культуре СМС изменения наступали через 6—9 час. и к 12 час, поражалось только 30—40% ФП клеток- Через 24 час. глыбки хроматина в ФП клетках укрупнялись и были соединены между собой. 10

Ядра таких клеток напоминали «сеть с узелками», в петлях которой выявлялась гомогенная эозинофильная ядерная масса. К 48 час. наступала гибель ФП клеток. Слияния цитоплазмы ФП клеток не происходило.

. В культурах ТЭК, СЭК и СТ, хотя первые признаки дегенерации наступали через 6 часов, но в последующие -сроки не было выражено такого синхронного поражения ФП клеток, как в идентичных клетках культур ТМС н CMC. Следует также отметить, что изолированные ФП клетки поражались быстрее, чем находящиеся в очагах- В последних ФП клетки сохранялись более продолжительное время. В очагах первыми гибли ФП клетки верхнего слоя и лежавшие по краю очага, постепенно поражая клетки, находящиеся в центре очага.

Изучение чувствительности первичных культур и субкультур клеток к вирусу болезни Ауески

Сравнительное изучение показало, что вирус болезни Ауескн; размножался как в первичных культурах ТМС, ТЭК, CMC, СЭК и СТ, так и в субкультурах." В .первичных культурах ВБА прошел по 5 серийных пассажей и вызывал однотипные морфологические изменения, выражавшиеся в появлении гроздье видных скоплений округлившихся клеток. Хорошо зыражениое ЦПД обычно наступало в первые сутки после заражения, одна.ко в разных культурах оно несколько варьировало. Так, в культуре ТМС рызрыхленне монсслоя наблюдалось через 12—15 час., в то время как в остальных культурах через 16—>18 часов, В большинстве клеток всех изучавшихся культур полная деструкция монослоя наступа-

Таблица 2

Сравнительные данные титрования вируса Золезни Ауески на клетках культур лимфондной ткани и куриных фибробластов

Культуры клеток Титр вирус» в Ijj ТЦД 50/мл

пас с а ж. и

пассир, вирус титров, вирус о £? ы с. О Е ^ ей 1 11 JH IV V

СЭК СЭВ КФ 5,05 6.94 5.4 6.5 5.7J 5,99 5,61 6,11 5,39 6,27 5.77 6.28

ТЭК ТЭК КФ 4,88 6,94 5,22 6,32 5.0 5,88 5,0 5,88 5,22 6,0 5,11 6,21

СТ ст КФ 5,0 7.0 5.0 6 А 5,0 6,33 5.33 6.5 5,33 6,5 5,66 6.0

ТМС CMC ТМС CMC 5.0 5,0 5,33 5,33 5.0 5,66 5.33 5.66

ла к 36 часам. Начиная со второго пассажа, вирус приобретал способность вызывать морфологические изменения в более ранние сроки и к 24 час. наступала полная дегенерация культур. Уровень размножения вируса в культурах .клеток лпмфоидной ткани и культур клеток из куриных эмбрисноз определяли в течение пяти последовательных пассажей.

Представленные данные сравнительного титрования ВБА показали, что в клетках лпмфоидной ткани вирус размножался без предварительной адаптации и после нескольких пассажей титр его имел тенденцию к повышению.

Цитохимическое исследование культур клеток лпмфоидной ткани, инцифированных вирусом болезни Ауескн

Б наших исследованиях уже с первых шести часов после инфицирования обнаруживалась тенденция к незначительному усилению содержания гликогена во всех категориях клеток. При этом реакция ФП клеток культур СЭК, СТ и CMC на гликоген была выражена интенсивнее, чем в аналогичных клетках культур ТМС и ТЭК. Одновременно отмечалось и изменение характера отложения гликогена—появление аморфного лногликогена. По мере увеличения сроков инфицнрова-ния, содержание гликогена прогрессивно уменьшалось в ФП и энителиоподобиых клетках, тогда как в сохранившихся макрофагах его выявлялось млого.

В инфицированных .культурах наблюдали сдвиги в интенсивности реакции и на кислую фосфатазу. Начиная уже с трех часов после ннокуляцин вируса .гранулы в клетках укрупнялись, увеличивалось их число. В последующие три часа интенсивность реакции аналогична наблюдавшейся в контроле, а .после 12 час. отмечалось её ослабление. Наиболее интенсивно реакция на АКФ была .выражена в макрофагах и многоядерных , клетках. По-видимому, в данном < лучае происходит мобилизация лизосомного аппарата, что, возможно, н служит одной из причин меньшей чувствительности этой категории клеток к воздействию ВБА. Разницы в реакции клеток разного ■возрастного л видового .происхождения не обнаружено.

При изучении реакции на РНК клеток культур, подвергнутых возде®гвию ВБА, отмечено отсутствие свечения РНК ядрышек через 3—12 час. лосле заражения. Интенсивность свечения РНК цитоплазмы через 12—24 часа ослабевала. Одновременно отмечались и существенные изменения в ядрах ФП клеток, появление глыбок ДНК темно-зеленого цвета и располагавшегося между ними РНК материала. В макрофагах реакция на ДНК в течение всего срока наблюдения не отличалась от реакции нормальных культур. 12

Изучение культур лнмфондных клеток, хронически инвазированных ТЬеМеп'а аппиШа

Настоящий раздел работы посвящен цитоморфологическо-му и цитохимическому изучению культур лимфоузла (ЛТт), селезенки (СТт) и тимуса теленка (ТТт) хронически инвази-рова-нных тенлериями, Изучавшиеся культуры на уровне ■26—40-го пассажей, получены от лаборатории культур ткани и питательных сред ВИЭВ, имели сходный морфологический состав и состояли из четырех категорий клеток. Клетки типа лимфоцитов, моноцитов и ретикулярные клетки содержали тейларии в виде шизонтов—«гранатных тел». В ФП «летках они отсутствовали. Количество «гранатных тел» колебалось в зависимости от категории клеток и сроков культнвировз-нкя,

В первые три часа после начала культивирования в большинстве клеток имелось по одному шизонту, содержащему до 10 ядер. К 18-му часу число ядер.возрастало до 50 и более. Через 4—5 суток в некоторых клетках количество «гранатных тел» увеличивалось до 20 и более и они заполняли всю цитоплазму в виде скоплений шизонтов, имевших форму розеток- В каждом таком шизонте обнаруживалось до 10 и более ядер.

Клетки, несмотря на наличие паразитов, -интенсивно размножались и сохранялись без смены среды до 14 суток. В данном случае, возможно, имела место своеобразная форма симбиоза однослойных ¡культур с паразитами." Клетки размножались митотическим путем. Митозы наблюдались, начиная уже с 3-го часа культивирования (3—7%о). Наиболее высокая МА 24—26%0 отмечалась на третьи—четвертые сутки культивирования, затем она понижалась. В культурах наблюдались и патологические митозы — отставание хромосом, двух—трехполюсные митозы, мосты.

При цитохимическом исследовании инвазированных тей-лериями клеток культур ЛТт, СТт и ТТт десмогликоген выявлялся, начиная с третьего часа культивирования и количество его в разных категориях клеток было неодинаковым. К 18—24-му часу отложение гликогена увеличивалось не только в инвазированных клетках, но и в ФП элементах. По мере увеличения числа тейлерий в клетке количество гликоге-рна уменьшалось, особенно это было заметно в моноцитах. Падение уровня гликогена в пораженных клетках, 'по-видимому-следует рассматривать как результат присутствия тейлерий, которые интенсивно расходуют питательные вещества хозяина, В стареющих культурах (на. 13-е сутки .культивирования) отмечалось уменьшение содержания гликогена во всех кате-

гсрпях клеток, что являлось, очевидно, следствием неспособности клеток утилизировать питательные вещества.

Изучение АКФ в культурах ЛТт, СТт и ТТт показало, что число гранул в процессе культивирования увеличивалось и зависело от количества тейлернй в клетке. * При этом установлена обратная зависимость между интенсивностью реакции на АКФ и количеством в клетке «гранатных тел». Так, клетки с 10—20 ядрами «гранатных тел» содержали 30 и более гранул, а клетки, в которых выявлялись шизонты, имевшие форму «розеток», содержали единичные гранулы осадка сульфида свинца- Во многих клетках гранулы локализовались группами около ядра, а тейлерии располагались ближе к краю цитоплазмы. Можно предположить, что интенсивная реакция лизосомного аппарата препятствовала развитию в клетке значительного числа паразитов.

Изучение культур клеток лимфоидной ткани хронически инвазированных ТИеМепа аппк^а и инфицированных вирусом болезни Ауески

При изучении смешанной инфекции характер ЦПД (маргиналия хроматина, исчезновение ядрышек, появление внутриядерных включений) напоминает ЦПД, вызванное только одним вирусом Ауески. В культурах ЛТт, ТТт и СТт при воздействии ВБА деструкции подвергались все клетки, независимо от присутствия в них «гранатных тел», однако первыми поражались и к 24 час. гибли клетки, ннвазированные тейлериями. Кроме того, в инфицированных клетках наблюдалась своеобразная инверсия цитопатического эффекта по сравнению с ФП клетками. Клетки, содержавшие тейлерии, поражались и -к 24 час. гибли, в то время как ФП клетки, наиболее чувствительные к воздействию ВБА в нормальных культурах, в этом случае оказывались менее чувствительными.

При смешанной инфекции в культурах наблюдалось угнетение митозов; через три часа после заражения МА была равна !5%о. к шести часам — II—13%о. Через 9—12 час. МА резко падала и достигала 8%0, а к 18—24 час. на 5—8 тыс. клеток иногда встречался один митоз.

Цитохимические исследования показали, что при смешанной инфекции повышенное отложение гликогена наблюдалось в ФП .клетках, т- е. в тех элементах, которые оказались более устойчивыми к воздействию вируса, однако, при этом гликоген откладывался в лиоформе, что свидетельствует о нарушении его способности связываться со струк-14

турным'н элементами цитоплазмы. Через шесть часов после заражения лиогликоген стал появляться н в измененных моноцитах под действием вируса. По мере развития ЦПД количество* гликогена в поврежденных клетках резко уменьшалось, что согласуется с данными, полученными лрн воздействии других вирусов на клеточные культуры.

Наиболее резкое усиление реакции на АКФ также наблюдалось в ФП клетках, более устойчивых к воздействию вируса. С наступлением видимых патологических изменений наблюдалось резкое снижение реакции на АКФ. При этом происходило и слияние гранул в крупные образования, что, возможно, явилось результатом повреждения лизосом >под влиянием вируса.

При смешанной инфекции реакция на РНК оказалась измененной, прежде всего в моноцитах, содержавших тейлерии; показано ослабление реакции, буро-красное свечение цитоплазмы и отсутствие свечения ядрышек. Одновременно отмечались и существенные изменения реакции на ДНК во всех категориях клеток — изменение окраски с желто-зеленой па зеленую и появление гльибок, светившихся желто-зеленым цветом. По-видимому, двойная инфекция приводила к более выражненому повреждению всех клеток, в том числе и тех (макрофаги), которые были устойчивы только к одной вирусной инфекции, но оказывались чувствительными к ней в случае инвазии паразитами.

Таким; образом, рассмотрение приведенного выше материала показывает, что в однослойных культурах лимфоидной ткани наблюдается определенное дифференцирование, связанное с присутствием нескольких клеточных категорий, существенно отличающихся как по .морфологии, так и по характеру процессов метаболизма. В процессе развития постепенно происходит изменение морфологии культуры, выражающееся в ее унификации с постеленным преобладанием фиб-робластоподобных клеток.

Общие закономерности обмена веществ в культуре клеток из лимфоидной ткани в основном совпадают с теми, какие наблюдались га других однослойных культурах, хотя энергично фагоцитирующие элементы типа макрофагов обнаруживают особенности своего обмена. Установлены некоторые особенности динамики морфологических и цитохимических изменений, связанные с органным и видовым происхождением клеток культуры, а также со стадией онтогенетического развития донора.

Воздействие патологических факторов: вируса, паразитических простейших поражает, в первую очередь, клетки оп-

ределенной категория. Наблюдаемое при этом изменение обмена веществ на первых этагпах воздействия связано, очевидно, со стимуляцией метаболизма и защитных механизмов клетки, а на более поздних этапах ослаблением протекающих в .клетке процессов-

При воздействии патологических факторов, исходные отличия культур по происхождению не играют существенной роли и реакция во всех случаях оказывается более или ме-гее одинаковой.

Полученные в работе данные показывают, что однослойные культуры клеток лимфоидной ткани в силу возможности получения простыми Методами большого количества клеточного материала могут быть широко попользованы для различных вирусологических и биологических исследований.

ВЫВОДЫ

1. Широкими экспериментами подтверждена возможность культивирования вне организма первично трипсинизирован-ных клеток лимфоидных органов животных — тимуса и селезенки морской свинки, эмбриона коровы и селезенки теленка. В динамике изучена морфологическая характеристика культур.

Показано, что в процессе развития однослойных культур происходит замена первоначально разнообразного состава лимфоидных элементов более однородным составом, состоящим преимущественно из фибробластоподобных клеток.

2. Сравнительное цитохимическое исследование однослойных культур клеток лимфоидной ткани позволило выявить в .каждой нз" категорий клеток (макрофаги, многоядерные элементы, эпителиоподобные н фибробластоподобные клетки) всех изучавшихся культур однотипную реакцию на гликоген, активность кислой фосфатазы н нуклеиновые кислоты, что свидетельствует о сходстве уровня различных звеньев .метаболизма в одноименных категориях клеток.

Отмечено, что показатели реакций были наиболее интенсивно выражены в макрофагах, многоядерных клетках и слабее всего в фнбробластоподобных элементах.

3. Экспериментально подтверждена возможность получения клеточных штаммов из лимфопднон ткани животных, В условиях наших опытов культура клеток тимуса морской свинки прошла 11 пассажей, селезенки морской свинки — 17, тимуса эмбриона коровы — 31, селезенки эмбриона коровы — 29 н селезенки телят — 15 пассажей.

4. Установлена чувствительность к вирусу болезни Ауес-

кн (ВБА) как первичных клеточных культур, так к субкультур клеток лимфоидной ткани. Титры вируса в инфицированных культурах достигали 5,77 ТЦД5{/мл. В процессе взаимодействия вируса с клетками была выявлена различная степень чувствительности разных категорий клеток- В первую очередь .поражались фибробластоподобные клетки, значительно позже эпителиолодобные. Макрофаги обладали наибольшей устойчивостью к действию виру-са и сохранялись даже после полной дегенерации фибробластоподобных клеток.

о. При цитологическом изучении инфицированных -вирусом болезни Ауески культур из лимфоидных органов выявлены хорошо выраженные морфологические изменения в фибробл астоп од о бных клетках, которые на ранних стадиях воздействия вируса характеризовались перераспределением хроматина ядра с последующей его маргинацией, разрыхлением и появлением базофильных включений в ядре. На более поздних стадиях наступало округлени« клеток, полная дегенерация и отслаивание их от стекла. Эпителн о подобные клетки под воздействием вируса образовывали симпласты.

6. Цитохимическими исследованиями инфицированных ВБА клеточных культур из лимфодных органов установлено некоторое усиление реакции на гликоген и активность кислой фосфатазы на первых этапах после заражения, с последующим угасанием реа.кцни на более поздних стадиях развития инфекции.

. 7. В ряде сравнительных опытов изучена морфологическая характеристика клеточных культур лимфоузла, тимуса и селезенки крути ото рогатого скота, хронически инвазиро-ванных возбудителем тейлериоза — ТЬеПепа апгш!а1а.

Показано, что тейлерии в виде шизонтов — «.гранатных тел», как правило, хорошо размножались в цитоплазме клеток только типа лимфоцитов, моноцитов и в ретикулярных элементах, в то время, как фибробластоподобные клетки оказались весьма устойчивыми к возбудителю тейлериоза.

При цитохимическом изучении иивазировакных тейлерия-ми клеточных культур установлено, что в процессе размножения паразитов и увеличения числа шизонтов в клетках интенсивность реакции на гликоген и активность кислой фосфатазы уменьшалась,

8. Впервые изучен характер воздействия вируса болезни Ауески на клеточные культуры, инБазированные ТКеПепа аппи!а1а. При этом установлено, что дегенеративным изменениям подвергались ^зсе клетки, независимо от присутствия в них «гранатных тел», однако первыми поражались и гибли к 24 часам инвазированные тейлериями клетки типа

лимфоцитов, моиоцитов и ретикулярные элементы. В то время как ф и броб л ас т о п о д о б и ы е клетки, обычно весьма чувствительные в нормальных культурах к вирусу болезни Ауес-ки, в условиях смешанной инфекции и инвазии оказались более устойчивыми к вирусу и подвергались его воздействию в более поздние сроки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Проведенные с положительным результатом исследования по получению, цнтоморфологическому и цитохимическому изучению первичных культур и клеточных штаммов из тиму-са и селезенки морской свинки н крупного рогатого скота .позволяет их рекомендовать для использования в вирусологических исследованиях.

2. Предложенная нами кассета для одновременной окраски серии препаратов однослойных культур может способствовать лавы'шению произвоантельности труда в научно-исследовательских лабораториях и дать возможность (проведению сравнительного цитологического анализа окрашиваемых препаратов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Однослойная культура клеток из тимуса и селезенки. Бюллетень экоперкм. биол. и медиц. М., 1972, Ms. 11, 120— 123 (в соавторстве с Л. С. Ратнером, А. А. Поздняковым, А. П. Головченко, 3. П. Мутузкиной),

2. Кассета для одновременной окраски серии препаратов клеточных культур. «Ветеринария», М., 1972, № 10, 121 (в соавторстве с А. А, Поздняковым, А. П, Головченко).

3. Получение монослойных культур из лимфоидной ткани. Бюллетень ВИЭВ, М., 1972, XIV 64—66 (в соавторстве с А. А. Поздняковым, Л- С. Ратнером, А, П. Головченко, 3. П. Мутузкгшой).

4. Однослойная культура тимуса и селезенки, В кн.-. «Механизмы управления размножением и дифференнировкой клеток животных тканей». Красноярск, 1973, 256—257 (в соавторстве с А. А, Поздняковым, Л. С. Ратнером, С. Я. Зал-кнндом),

5. Цитохимическое изучение культур клеток лнмфондной ткани в норме и при .вирусной ин-фекшии- Материалы Г научной конферендии молодых ученых морфологов Москвы. 1975.

1S

Материалы диссертации доложены:

На межла бора тор ной и лабораторной конференциях (БИЗВ, 23 марта и 10 июня 1973 г.).

На III Всесоюзной конференции по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (г. Красноярск, 1973 г.).

На заседании общества анатомов, гистологов и эмбриологов (22 мая 1973 г., Москва).

На научной конференции молодых ученых—морфологов Москвы (21—22 мая 1974 г.).

На Ученом совете ВИЭВ (1974 г.).

Ответственный за выпуск — кандидат ветеринарных наук В. А. Горбатов.

Заказ 721 Тираж 180

Типография Московской ордена Трудового Краевого Знамеаи ветерянарноб академии имени К. И. Скрябина