Усовершенствование технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота

Васько, Валерий Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усовершенствование технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота"

На правах рукописи

РГБ ОД

*к®

ВАСЬКО ВАЛЕРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТЕЙЛЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЩЕЛКОВО-1999

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности в отделах культивирования клеток и автоматизации. Научные руководители: -доктор ветеринарных наук, -профессор, академик РАСХН, -доктор биологических наук Официальные оппоненты: -доктор ветеринарных наук, -профессор (ВГНКИ) -доктор биологических наук (ВНИТИБП)

А.Я. Самуйленко Е.А. Рубан

Б.А. Тимофеев С.В. Кузнецова

Ведущее учревдение: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я.Р. Коваленко.

Защита диссертации состоится «13» января 2000 г. в 12 часов на заседании Специализированного совета К 120.17.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, п/о Кашинцево Московская область, Щелковский район, ВНИТИБП С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан «__»_1999 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук К).Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами - одна из главных задач ветеринарной службы России. Огромная роль в решении этих задач отводится биотехнологии - управляемому получению целевых продуктов полезных для народного хозяйства, в том числе и для ветеринарии с помощью биологических агентов: микроорганизмов, клеток животных и растений, вирусов, ферментов и антител.

Тейлериоз - остро и подостропротекающее протозойное заболевание крупного рогатого скота, буйволов, зебу и др. диких животных. Возбудители заболевания относятся к семейству Theileriidae, которые имеют овальную, кольцевидную и др. формы, локализуются внутри эритроцитов, а размножаются множественным делением или шизогонией в ретикулоэндотелиальной системе с образованием внеклеточных или внутриклеточных скоплений. Наиболее часто встречаются виды Th.annulata, Th. parva, Th sergenti, Th. mutans. При тейлериозе повышается температура тела, наблюдается увеличение лимфатических узлов, расстройство сердечнососудистой и пищеварительной систем, отмечают паразитемию лимфатических узлов, паренхиматозных органов и крови. Возбудители передаются от больных или переболевших животных к здоровым пастбищными клещами сем. Ixodidae. (Dolan Т.Т., 1989).

Тейлериоз - это наиболее опасная из протозойных болезней крупного рогатого скота. Она наносит большой экономический ущерб животноводству республик Средней Азии, Закавказья, юга Казахстана и РФ (Нораев Р.Х., 1983; Кущенко З.В., Яременко Т.Г., Досжанов Д.Г., 1989; Тяженов A.A., 1989; .Бадалов Э.Т., Нораев Р.Х., 1981; Тяженов A.A., 1989; Нораев Р.Х., 1996).

За пределами нашей страны тейлериоз зарегистрирован в Африке (Алжир, Египет, Тунис, Марокко, Судан, Ливия, Кения, Танзания, Уганда и

др.), в Центральной и Юго-Восточной Азии (Турция, Иран, Афганистан, Ирак, Сирия, Израиль, Индия, Китай, КНДР и др.) и, наконец, в Европе (Болгария, Румыния, Югославия, Греция, Испания, Италия, Кипр, Франция и др. Т.Т. Оо1ап, 1989; Е. Крапо, 1989; НазЬепи-РевЬагИ Я., 1986; .ШепЬегя в., 1990; ШепЬе^ БаЬгепсЗег В., БПауо Я., 1990).

В связи с этим в течение 60 лег ведутся интенсивные исследования в области разработки более эффективной вакцины против данной^ инвазии (Моггапа Э.Р. е1 а!., 1988; Нораев Р.Х.,1987; Нораев Р.Х., 1988; Сахимов М.Р., Нораев Р.Х., Бадалов Э.Т., 1991;Оо1ап Т.Т., 1987).

Учеными Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им Я. Р. Коваленко создана культуральная высокоэффективная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, профилактическая эффективность которой при производственном применении достигает 98-100%. Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности поддерживать оптимальные значения параметров культивирования. Был использован метод глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппиЫа. Метод глубинного культивирования клеток для приготовления вакцины является перспективным, снижает себестоимость вакцины, повышает гарантию надежности и экологическую безопасность.

Многие вопросы данного направления не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику .Работа выполнена в связи с программой Государственного комитета по науке и техрике по решению научно-технической проблемы «Разработать и внедрить новые методы и средства, обеспечивающие стойкое ветеринарное благополучие сельскохозяйственных животных».

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилась разработка современной промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ. аппиЫа.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: -проанализировать существующую промышленную технологию производства вакцины против тейлериоза;

- научно обосновать методы глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ. аппиЫа;

-разработать современную промышленную технологию производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ. аппиЫа.

Научная новизна. Научно обоснован, разработан и внедрен в промышленное производство метод глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями. Разработан алгоритм оптимального управления параметрами процесса глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями. Разработана современная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ. ашш^а.

глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа. Разработаны изменения и дополнения к действующей инструкции по изготовлению вакцины против тейлериоза, утверждены директором ВНИТИБП 25 ноября 1991 года. Получен патент на изобретение №:1838915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13окгября 1992 г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на Всесоюзной конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов", г. Москва, 1991г.,

-на конференции "Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ", посвященной 30-летаю Покровского завода биопрепаратов, 27-28 мая 1999 г.;

-на международной научно-практической конференции , посвященной 80-летию МАВМ и Б им. К.Й. Скрябина - «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» - Москва, июнь, 1999 г.

-Получен патент на изобретение №: 183 8915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13октября 1992 г.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, получен патент на изобретение №:1838915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13 октября 1992 г.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Теоретическое обоснование и практическое использование метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями в биореакторах;

2. Разработка алгоритма управления параметрами процесса глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями;

3. Разработка современной промышленной технологии глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных Th. annulata при производстве вакцины против тейлериоза;

4.Результаты сравнительных испытаний ранее существующей и предлагаемой промышленной технологии производства вакцины;

5. Практические предложения по разработанной оптимизированной современной технологии.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение результатов, практические предложения, список литературы, включающий 237 источников, приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 16 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Основной объем исследований выполнен в 1989-1992 гг. во кероссийском научно-исследовательском и технологическом институте ¡иологической промышленности (ВНИТИБП) совместно со специалистами осударственного Щелковского биокомбината (ПЦБК).

Штаммы. При проведении исследований был использован ^ырдарьинский штамм ТЬ. аппиЫа. Производственный штамм СУ-1 [редставляет собой стабилят размельченных инвазированных тейлериями

клещей в криозащитной среде и замороженный в жидком азоте при -196°С. Высылается ВГНКИ биопредприятиям в замороженном виде на основании «Временной инструкции по изготовлению и конгролю вакцины (ВИЭВ) против тейлериоза крупного рогатого скота жидкой культуральной».

Культура клеток и питательные среды. Для получения вакцины использовали лимфоидные клетки теленка, полученные трипсинизацией лимфоидной ткани, инвазированной ТЪ. аппиШа. согласно существующей инструкции. Культивирование клеток осуществлялось с использованием питательной среды Игла и ФГМС, сыворотки крупного рогатого скота Московского мясокомбината в концентрации 20% (для ростовой среды). Для трипсинизации лимфоидной ткани теленка использовали 0,25%-ный раствор трипсина («Дифко», США).

Процессы. Культивирование первично - трипсинизированных клеток теленка, инвазированных ТЪ.ашшЫа, осуществляли в роллерных 5 - литровых флаконах в течение 20-40 дней до образования суспензионной популяции клеток. Затем клетки культивировали глубинным периодическим суспензионным способом в биореакгоре.

Технологическое оборудование. Для проведения экспериментов по совершенствованию и оптимизации промышленной технологии получения вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота использовано оборудование: рамный фильтр типа ЕКО-А-40/28 фирмы «Кофран», Франция ; биореактор емкостью 25 л разработки ВНИТИБП; автоматизированная система управления технологическим процессом (АСУ ТП); включающая микропроцессорный управляющий комплекс «Биоцикл МП 01.01».; микропроцессорный управляющий комплекс «Биоцикл МП 01.06.»; центрифуга К-70 на 6000 об/мин; холодильник бытовой +4°С, холодильник емкостью 250 л на-40-60°С; сосуд Дьюара СДС 50.

Для культивирования клеток был выбран экспериментальный образец биореактора емкостью 25 литров. Биореактор был снабжен рубашкой для обогрева и охлаждения среды, перемешивающим устройством с нижним приводом мешалки через магнитную муфту, трубой для передавливания жидкости, барботером.

Для контроля и управления процессами культивирования клеток были использованы микропроцессорные комплексы «Биоцикл». Язык программного управления - Ассемблер. Программа работы АСУ ТП была составлена на основе снятия и анализа динамических характеристик реального процесса культивирования.

2.2.РЕЗУЛЫАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка в бутылях емкостью 5 литров. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности поддерживать оптимальные значения технологических параметров культивирования.

Для разработки современной промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза было предложено использовать метод глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ. ашшЫа.

При глубинном культивировании скорость пролиферации и максимально достигаемая плотность клеток достаточно сильно зависят от сравнительно небольших изменений рН среды. Хотя стандартные среды и стандартные

условия культивирования рассчитаны на одинаковые значения рН, имеются данные, что для различных линий клеток оптимум ы рН отличаются.

Также на скорость пролиферации и плотность клеток в культуре влияет концентрация растворенного кислорода среды. Для культур животных клеток концентрация кислорода должна составлять приблизительно 25-40% от насыщения, поэтому к биореакторам для культивирования клеток животных кроме основных, перечисленных выше требований, предъявляются особые дополнительные, хотя они могут быть несколько снижены благодаря низким скоростям роста клеток животных и протекания в них метаболических процессов. Таким образом, теоретическое, аналитическое обоснование перевода процесса культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями, с роллеров в биореактор является также и практически обоснованным, что позволяет резко повысить производительность и снизить себестоимость технологического процесса производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота.

Разработка современной промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка ннвазированных ТЬ. аппиЫа.

Предлагаемая промышленная технология получения вакцины против тейлериоза включает заражение тейлериями животного донора, отбор у него лимфоидной ткани с последующей ее трипсинизацией, выращивание культур лимфоидных клеток теленка в монослое до образования суспензионной популяции клеток, дальнейшее суспензионное культивирование клеток в биореакторе, их центрифугирование, криоконсервирование и расфасовку. Схема технологии изготовления вакцины представлена на рис. 1.

с=>

ТП, ТП2 ТПз

о-43 к ^-а/л

ТП4

-196 С

ТП5 ТПб

Рис.1. Схема разработанной промышленной технологии изготовления вакцины против тейлериоза.

ТП] _ инвазирование телят проводили заражением суспензией клеток крови, хранившейся в криобанке, полученной на 5-7 -й день после максимального проявления клинических признаков заболевания;

ТПг -извлечение и трипсинизация селезенки и лимфоидной ткани инвазированных телят;

ТПз -выращивание культуры клеток теленка, инвазированных ТЪ.аппиЫа (аттенуация патогенного штамма);

ТГЦ - выращивание суспензионной культуры лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями в биореакторе;

ТП5 - .криоконсервирование;

ТПб- контроль вакцины.

По разработанной технологии изготовления вакцины на стадии ТП) инвазирование телят проводили суспензией клеток крови, полученной от больных телят на 5 -7-й день после максимального проявления клинических признаков заболевания. Инвазированностъ эритроцитов телят, зараженных по данному методу, на 20-25 % превышала таковую по сравнению с методом

подсадки клещей - переносчиков, принятым в ранее существующей технологии изготовления вакцины. Использование в качестве исходного материала крови больных телят позволяло проводить контроль инвазирующего материала и его стандартизацию. Стадии изготовления вакцины ТПг, ТП3, ТП5 ТПб не отличаются от ранее существующей технологии изготовления. На стадии ТГЦ культивирование суспензионной популяции лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ аплиЫа, проводили методом глубинного периодического суспензионного культивирования в биореакгоре емкостью 25 лтров.

Поддержание оптимальных значений параметров культивирования

При переходе на глубинное культивирование клеток необходимо решение следующих задач:

-отклонение основных биохимических и физико-химических параметров от оптимальных для данной культуры значений;

-лимитирование одного или нескольких компонентов субстрата;

-наличие токсичных продуктов процессов метаболизма в окружающей среде;

-гидродинамическое воздействие;

-запрограммированная гибель клеток.

Для определения технологических параметров культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппи1а1а, проводились опыты по неуправляемому глубинному суспензионному культивированию лимфоидных клеток теленка в 25 литровом биореакгоре при поддержании постоянной температуры культивирования 37±0,1°С и скорости перемешивания 40-60 об/мин. При неуправляемом глубинном суспензионном

культивировании лимфоидных клеток теленка рН среды снижалось с 7,2 в начале культивирования до 6,6 через 12 часов и оставалось на этой отметке до конца культивирования. Концентрация растворенного кислорода (рОз) снижалась с 21 кПа до 0 за 20 часов культивирования. Недостаток растворенного кислорода в культуральной жидкости при неуправляемом глубинном культивировании отразился на скорости роста клеток и их конечной концентрации. Так, за 48 часов культивирования при посадочной концентрации 200-250 тыс. клеток на мл индекс пролиферации составил 2-2,5 и конечная концентрация 400-500 тыс. клеток на мл. Концентрация растворенной углекислоты (рССЪ) изменялась от 1 до 5 кПа, а окислительно -восстановительный потенциал (еН) - от +30 до +10 мв. Данные опыты дали возможность определить технологические параметры культивирования лимфоидных клеток теленка в биореакторе и поддерживать их оптимальные значения в дальнейших опытах по управляемому культивированию. Оптимальным значением рН при культивировании лимфоидных клеток теленка, инв аз иро ванных тейлериями, является 7,2.

В дальнейших опытах по управляемому культивированию лимфоидных клеток теленка поддержание оптимальных значений параметров культивирования рН и рОг осуществлялось как поверхностной аэрацией биореактора смесью воздуха и СО2, так и барботажем питательной среды этой же смесью.

Так как растворенный кислород играет ключевую роль в процессе клеточного дыхания, необходимо рассчитать оптимальную концентрацию рОг на всех фазах роста клеток.

Фаза задержки клеточного роста длилась 8-9 часов и характеризовалась падением рОг с с 21 кПа до 12 кПа . В логарифмической фазе роста при интенсивном клеточном дыхании удавалось поддерживать рОг не ниже 10 кПа барботажем питательной среды. Снижение рОг ниже 10 кПа вело к снижению

скорости клеточного роста. По истечении логарифмической фазы роста в течение нескольких часов наступала фаза отмирания, характеризовавшаяся гибелью всех клеток популяции. Концентрация растворенной углекислоты (рС02) зависела от значений рН, рОг, и процента СОг в газовой смеси при аэрации и изменялась от 4 до 1 кПа.

Значение еН изменялось от +50 до +35 мв в процессе культивирования. Изменение параметров при управляемом глубинном суспензионном культивировании лимфоидных клеток теленка представлено на рисунке 2.

В таблице 1 приведены сравнительные экспериментальные данные по значениям основных параметров при глубинном суспензионном культивировании лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ ашш!а(а. Из таблицы видно, что максимальный выход клеток и наивысший процент жизнеспособности был получен при значениях рН - 7,2; рОг-10 кПа; рС02- 3,5 кПа; еН- +50 мв, при скорости перемешивания 40-60 об/мин и температуре 37+0,1° С.

В таблице 2 представлены сравнительные данные по технологии производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота

Осуществление способа получения вакцины при различных значениях поддерживаемых параметров

№ рн Число р02 рсо2 еН Концен- Процент

п/п среды ед. оборотов мешалки об/мин КПА КПА мв трация клеток, тыс/мл жизнеспо собности клеток

1 7,1 40 15 3 +20 1000 90

2 7,2 50 10 3,5 +50 1200 90

3 7,4 60 21 4,4 +80 1000 90

4 7,0 30 9 2 +10 800 80

5 7,5 70 21 5 +100 700 80

6 7,2 — Не контроля руется Не контроли руется Не контроли руется 600 80

Рис 2. Динамика изменения параметров при управляемом глубинном культивировании лимфоидных клеток теленка, ннвазированных ТЬ.аппиМа.

Сравнительные данные по технологическим стадиям производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота

№ п/п Существующая промышленная технология Разработанная промышленная технология

1. Инвазирование телят проводят стабилятом инвазированных тейлериями клещей или их подсадкой теленку Инвазирование телят проводят заражением суспензией клеток крови, хранившейся в криобанке, полученной на 5-7 -й день после максимального проявления клинических признаков заболевания

2. Извлечение селезенки и лимфоидных органов теленка, инвазированного тейлериями и трипсинизация тканей Тоже

3. Выращивание культур клеток в монослое То же

4. Выращивание суспензионной популяции клеток с использованием роллерной технологии Глубинное оптимизированное промышленное периодическое суспензионное культивирование клеток в биореаеторе

5. Криоконсервирование То же

6. Контроль вакцины То же

Контроль вакцины, изготовленной по существующей технологии и предложенной нами, не выявил отличий в показателях контроля качества вакцин.

Сравнительный анализ существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза показал, что по разработанной технологии, благодаря оптимизации основных параметров культивирования, устранению лимитирования роста клеток по растворенному кислороду и снижению влияния гидродинамических воздействий на рост клеток, за 72 часа культивирования, при объеме питательной среды 15 литров, удалось получить биомассу 18 млрд клеток, что соответствует 180 тыс. доз при иммунизирующей дозе 0,1 млн клеток. Для достижения аналогичного результата при роллерном культивировании потребовалось бы более 40 пятилшровых флаконов и время культивирования 2 недели. Сравнительные данные по времени культивирования и производительности процессов роллерного и глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ ашш1а1а, представлены в таблице 3.

Следующим этапом дальнейшей работы по данной технологии может явиться перевод глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЪ аппи1а1а, в культивирование методом хемостата, что позволит еще больше повысить производительность процесса и снизить себестоимость продукции.

Обобщая результаты исследований можно заключить , что разработанная технология промышленного производства вакцины против тейлериоза обеспечивает снижение трудоемкости и себестоимости производства вакцины, повышает гарантию надежности технологического процесса и его экологическую безопасность.

Сравнительные данные по роллерному и суспензионному культивированию лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ аппи1а1а

№ п/п Способ культивирования

В роллерах В биореакторе

1. Количество посуды

40 штук 5-лигровых флаконов 1 биореакгор емкостью 25 литров

2. Контроль и регулирование параметров

Температура культивирования Ручная, визуальная, подгитровка рН Температура культивирования, температура стерилизации, рН, рСЬ, еН, рСО:, давление, скорость вращения мешалки..

3. Время культивирования

360 часов 72 часа

4. Конечная концентрация клеток

бхЮ5 1,2x10*

5. Производительность

700 мл х 40 флаконов=28 литров 15 литров

6. Трудоемкость

10 человек 3 человека

7. Качество, стерильность

Качественно стерильно Качественно стерильно

з.выводы

1. Научно обоснован метод глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппиЫа.

2. Определены оптимальные значения технологических параметров культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппиЫа.

3. Разработаны алгоритмы управления технологическим процессом культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппи!а1а.

4. Разработана современная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппи1а1а. Технология защищена патентом Российской Федерации.

5. Сравнительный анализ существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза показал, что предложенная технология обеспечивает снижение трудоемкости и себестоимости производства вакцины, повышает гарантию надежности технологического процесса и его экологическую безопасность.

¿ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

инвазированных Th. annulata. Разработаны изменения и дополнения к действующей инструкции по производству вакцины против тейлериоза утверждены директором ВНИТИБП 25 ноября 1991 года. Получен патент на изобретение №:1838915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13окгября 1992 г.

5.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Соловьев Б.В., Скичко Н.Д., Васько В.Е., Степанова Н.И., Заблоцкий В.Т., Рубан В.А., Гребенев Г.М. Культивирование лимфоцитов теленка, инвазированных Th.annulata, в биореакгоре емкостью 25 литров с применением АСУ ТП. //Тезисы. Всесоюз. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» Москва -1991.

2.Васько В.Е., Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Разработка современного способа* производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота. // Конферен., посвящен. 80-летию МАВМ и Б им. К.И. Скрябина. Москва , июнь, 1999 г.

3. Рубан Е.А., Васько В.Е., Самуйленко А.Я. Управляемое глубинное культивирование лимфоидных клеток теленка, инвазированных Th.annulata, в биореакторе. // Конференция "Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ", посвященная 30- летаю Покровского завода биопрепаратов, 27-28 мая 1999 г.

4. Патент на изобретение SU №: 1838915 A3 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13октября, 1992 г- Скичко Н.Д.,Соловьев Б.В., Рубан В.А., Степанова Н.И., Заблоцкий В.Т., Самуйленко АЛ., Васько В.Е., Гребенев Г.М.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васько, Валерий Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .Материалы и методы.

2.2. Изучение существующей технологии промышленного производства.

2.3. Научное обоснование метода глубинного культивирования клеток в биореакторах.

2.4. Усовершенствование промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. атшЫа.

2.5. Разработка алгоритма оптимального управления процессом глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка инвазированных тейлериями.

2.6.Сравнительный анализ существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота"

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами - одна из главных задач ветеринарной службы России. Огромная роль в решении этих задач отводится биотехнологии -управляемому получению целевых продуктов полезных для народного хозяйства, в том числе и ветеринарии с помощью биологических агентов: микроорганизмов, клеток животных и растений, вирусов, ферментов и антител.

Тейлериоз - остро и подостропротекающее протозойное кровопаразитарное заболевание крупного рогатого скота, буйволов, зебу и др. диких животных. Возбудители заболевания относятся к семейству Theileriidae, которые имеют овальную, кольцевидную и др. формы, локализуются внутри эритроцитов, а размножаются множественным делением или шизогонией в ретикул оэндотелиальн ой системе с образованием внеклеточных или внутриклеточных скоплений. Наиболее часто встречаются виды Th.annulata, Tb. parva, Th sergenti, Th. mutans. При тейлериозе повышается температура тела, наблюдается увеличение лимфатических узлов, расстройство сердечнососудистой и пищеварительной систем, отмечают паразитемию лимфатических узлов, паренхиматозных органов и крови. Возбудители передаются от больных или переболевших животных к здоровым пастбищными клещами сем. Ixodidae. (DolanT.T. 1989)(110).

Тейлериоз - это наиболее опасная из протозойных болезней крупного рогатого скота. Она наносит большой экономический ущерб животноводству республик Средней Азии, Закавказья, юга Казахстана и РФ (Р.Х. Нораев, 1983; З.В. Кущенко, Т.Г. Яременко, Д.Г. Досжанов 1989; A.A. Тяженов 1989; .Баданов Э.Т., Нораев Р.Х. 1981; Тяженов A.A. 1989 ; Р.Х.Нораев 1996) (5;35;44;54;75).

За пределами СНГ тейлериоз зарегистрирован в Африке (Алжир, Египет, Тунис, Марокко, Судан, Ливия, Кения, Танзания, Уганда и др) в Центральной и Юго-Восточной Азии (Турция, Иран, Афганистан, Ирак, Сирия, Израиль, Индия, Китай, КНДР и др.) и, наконец, в Европе (Болгария, Румыния, 5

Югославия, Греция, Испания, Италия, Кипр, Франция и др.) Т.Т. Dolan, 1989; Е. Pipano 1989; Hashemi-Fesharki R., 1986; Uilenberg G.; Uilenberg G., Sahrender В., Silayo R., 1978; Hashemi-Fesharki R., 1978; Hashemi-Fesharki R., 1986 ; Morzaria S.P.; Nene V., 1990 (110;134; 136; 137;164; 181; 227;228).

Из 175 стран мира тейлериоз К PC встречается постоянно в 57 странах, при этом в 40 странах - спорадически (14 стран Африки, 18 - Азии, 3 - Европы, 4 - Океании и России, Казахстана, Узбекистана), в 7 странах наиболее часто (5 стран Африки и 2 - Азии) и в 10 странах в форме энзоотии (4 страны Африки, 5 - Азии и 1- Океании). Однако по многим странам мира отсутствуют данные по этому заболеванию. Для некоторых стран тейлериоз имеет большое экономическое значение, поскольку смертность достигает 60% и более (Эфиопия, Марокко, Корея, Иран, Тайвань, Уганда, Замбия, Зимбабве). Потери от тейлериоза определяются высокой смертностью (30-90%) заболевших животных, абортами, яловостью и снижением молочной продуктивности коров, уменьшением массы и ухудшением качества мяса убойных животных, расходами на содержание и лечение больных животных (Hashemi-Fesharki R. et. al., 1988(138).

Профилактика и меры борьбы с тейлериозом основаны на проведении мероприятий против клещей путем купания животных в специальных ваннах с акарицидами или опрыскивания животных этими препаратами. Практическую иммунизацию животных против тейлериоза проводят в следующих странах: Иран, Израиль, Россия, Казахстан, Узбекистан, Замбия и др. Для лечения больных животных применяют парвакон, диминазин, тетрациклин, окситетрациклин и др. антибиотики широкого спектра действия. Dolan Т.Т 1989; Subramanian G.; Bansal G.C., Ray D.; Srivastava R.V.N. 1989 ;Subramanian G.; Srivastava R.V.N., Bansal G.C.; Ray D. 1988; Subramanian G., Ueitheni R., 1978, ;Shukla P.C., Sharma R.D.,. 1991 ; Subramanian G., Bansal G.G., Ray D., Srivastana R.V. N ; Young A., Brown С. Burridge M., Cunningham M, Kirimi I., h-vin A, 1973; Шахматов Г.М., 1966. (78;110;203;204;205;206;211;233). 6

Экономический анализ показал неэффективность проведения акарицидной обработки крупного рогатого скота против тейлериоза без ее сочетания с вакцинацией (Е. Pipano 1989). В связи с этим в течение 60 лет ведутся интенсивные исследования в области разработки более эффективной вакцины против данной инвазии. (Morzaria S.P. et. al., 1988; Нораев Р.Х., 1987 ; Нораев Р.Х., 1988; Сахимов М.Р., Нораев Р.Х., Бадалов Э.Т., 1991; Dolan Т.Т., 1987 (47;49;66;109;166).

Большой экономический ущерб тейлериоз причиняет станциям искусственного осеменения при заболевании племенных быков-производителей, у которых нарушаются половая активность и сперматогенез. В условиях Казахстана, где все районы в эпизоотическом отношении отнесены к латентной зоне наиболее тяжело болеет завезенный высокопродуктивный скот породы лебединской улучшенной со швицкой, аулиеатинской и с наименьшими потерями мясного направления - казахской белоголовой. (Досжанов Д.Т. и др 1987)(19).

Об экономическом ущербе, наносимом этим заболеванием можно судить хотя бы по тому, что, например, в Кении ежегодно гибнет от тейлериоза (Th parva ) 60-85 тыс.голов крупного рогатого скота. Ежегодные расходы Кении на обработку скота отклещей составляют 6-10 млн американских долларов (Pearson Т., et. al, 1979) ( 172).

Учеными Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им Я.Р. Коваленко создана культуральная высокоэффективная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, профилактическая эффективность которой при производственном применении достигает 98-100%. Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности 7 поддерживать оптимальные значения параметров культивирования. Метод глубинного культивирования клеток для приготовления вакцины является перспективным, снижает себестоимость вакцины, повышает гарантию надежности и экологическую безопасность.

Многие вопросы данного направления не были решены и нуждались в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику. Работа выполнена в связи с программой Государственного комитета по науке и технике по решению научно-технической проблемы «Разработать и внедрить новые методы и средства, обеспечивающие стойкое ветеринарное благополучие сельскохозяйственных животных».

Цель и задачи исследований.

Целью исследований явилась разработка современной промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. атш1а1а.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: -провести анализ существующей промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза;

-обосновать методы глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. атш1а1а;

-разработать современную технологию производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. амшЫа.

Научная новизна. Обоснован, разработан и внедрен в промышленное производство метод глубинного периодического суспензионного 8 культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями. Разработан алгоритм оптимального управления параметрами процесса глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями. Разработана современная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашш1а1а, защищенная патентом Российской Федерации (№1828915).

Практическая значимость. На основе проведенных исследований и практики разработана современная оптимизированная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа. Разработаны изменения и дополнения к инструкции по изготовлению вакцины против тейлериоза, утверждены директором ВНИТИБП 25 ноября 1991 года.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», г. Москва, 1991г.;

-на конференции "Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ", посвященной 30- летаю Покровского завода биопрепаратов, 27-28 мая 1999 г.;

-на международной научно-практической конференции , посвзпценной 80-летию МАВМ и Б им. К.И. Скрябина - «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» - Москва, июнь, 1999 г.;

-получен патент на изобретение №:1838915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13октября 1992 г. 9

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, получен патент на изобретение №: 1838915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13 октября 1992 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование и практическое использование метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями в биореакторах;

2. Разработка современной промышленной технологии глубинного периодического суспензионного культивирования в биореакторах лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа при производстве вакцины против тейлериоза;

3. Разработка алгоритма управления параметрами процесса глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями;

4. Результаты сравнительных испытаний ранее существующей и предлагаемой промышленной технологии производства вакцины;

5. Практические предложения, вытекающие из разработанной оптимизированной современной технологии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Учеными Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Коваленко создана высокоэффективная культуральная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, эффективность которой составляет- 98-100% (24).

Основной мишенью иммунного ответа крупного рогатого скота при тейлериозе являются инвазированные макрошизонтами лимфоциты. Антител к инвазированным лимфоцитам у больных тейлериозом и иммунных животных не обнаруживали. Клеточный иммунитет связан при данной инвазии с активацией цитотоксических клеток, в том числе и естественных киллеров

В большинстве случаев тейлериоза наблюдают 2 пика повышения активности клеточного иммунитета. Важную роль в иммунитете животных при тейлериозе играют цитостатистические клетки. Максимальной концентрации эти клетки достигают через 3-4 недели, после иммунизации крупного рогатого скота спорозоитами или инвазированной макрошизонтами клеточной линией, а затем в течение 2 недель их количество постепенно снижается. У иммунных животных после заражения отмечают второй пик концентрации цитостатических клеток. Одним из основных иммуногенов макрошизонтов тейлерий оказался гликозилированный белок с молекулярной массой 95-120 кДт. Сыворотка крови животных, инвазированных тейлериями в первый раз, ингибирует проникновение паразита в лейкоциты. Этот эффект характеризуется видоспецифичностью и его выраженность одинакова дня всех штаммов тейлерий. Данные об иммунном ответе на пироплазмы и микромерозоиты тейлерий отсутствуют (Hall F.R., 1988) (132).

Морфологическую структуру мерозоитов Theileria sergenti в эритроцитах, взятых биопсией из костного мозга и селезенки экспериментально инвазированных тейлериозом телят в возрасте 8-10 мес. живой массой 150 кг, изучали методом электронной микроскопии. Проведенными исследованиями

11 опыт продолжался 90-120 дней) выявлено, что длина мерозоитов Th. sergenti составила 1,0-2,5 мкм, они содержали ядро, рибосомы, вакуоли и хорошо выраженную эндоплазматическую сеть. Были обнаружены митохондриоподобная структура и экскреторноподобный феномен канальцев. У паразита выявлены 2 функции: питательная - выполняется через цитоплазму и экскреторная - через канальцы. (Higuchi S. et. al., 1984) (141).

Проблема иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза издавна интересовала многих исследователей. В различное время для иммунизации скота против тейлериоза применяли: кровь переболевших или больных животных; суспензию клеток селезенки, лимфатических узлов и других органов больных тейлериозом животных, содержащую гранатные тела -тканевую стадию развития тейлерий (шизонты); слабовирулентные штаммы паразита, полученные путем пассирования тейлерий через теплокровного хозяина без участия клещей-переносчиков; инактивированные вакцины; дозированную суспензию клеток слюнных желез инвазированных клещей; метод двойной иммунизации, когда вначале вводят кровь донора, зараженного слабовирулентным штаммом, а спустя определенное время инокулируют более вирулентный местный штамм возбудителя; тейлерии, подвергнутые воздействию ионизирующего излучения; метод введения стабилята тканей инвазированных клещей с одновременной обработкой животных антибиотиками тетрациклинового ряда и, наконец, живые вакцины, приготовленные из гранатных тел тейлерий, выращенных в культурах лимфоидных клеток крупного рогатого скота.

В 1903 г. R.Koch впервые с целью иммунизации применил кровь от переболевших тейлериозом животных (возбудитель Th. parva) (154) . Однако привитые животные не давали никакой реакции на введение крови, оставались восприимчивыми к тейлериозу, заболевали при выпасе на пастбище и часто погибали. Theiler A., Stockmen S., в 1905 сообщили о том, что все без исключения животные, многократно привитые кровью по методу Коха

12 заболели тейлериозом при выпасе на заклещеванных пастбищах (214). Theiler А (1911-1912 ) применил с целью иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза материал, состоящий из клеток селезенки и лимфатических узлов, пораженных гранатными телами тейлерий (215). Со времени первых опытов Тейлера и до сентября 1912 г. по его методу было привито более 130000 животных, но только 50-60% животных приобретали иммунитет. Е. Sergent, A.Donation and F.Lestoguard (1945) выделили слабовирулентный штамм тейлерий (Th dispar), названный "Куба", который был использован после 174 пассажей на крупном рогатом скоте без участия клещей - переносчиков. Его вирулентность была настолько слаба, что из 484 телят, через которых он проводился, пало только 12 (197). По данным Е. Sergent с соавторами (1945) с 1924 по 1942 г, в Алжире, Тунисе и Марокко тейлериями штамма «Куба» было вакцинировано 36631 животное. Заболевание среди иммунизированных животных наблюдалось в 0,5-9% случаев, а среди не вакцинированных переболевало до 40% (197). Adler S., Ellenbogen V., ( 1934-1936) разработали метод двойной иммунизации скота против тейлериоза, который в дальнейшем усовершенствовали и применили в Израиле Tsur I., с соавторами (1941-1959) ( 87-89; 220-226). Вакцинированным телятам вначале вводили кровь донора, зараженного слабовирулентным штаммов «Куба» и др., а спустя 2-4 мес. инокулировали более вирулентный местный штамм Th. ammlata ("Това"). При такой иммунизации смертность среди телят 0,6-3% (S Adler, V.Ellenbogen, 1935; L.Tsur 1949). Благодаря систематической иммунизации телят в энзоотических зонах потери от спонтанного тейлериоза снизились (88; 224).

Г.А.Оболдуев, И.Г.Галузо, З.М.Бернадская в 1926,1927 гг. для иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза (Th annulata) использовали дефибринированную кровь и суспензии, приготовленные из лимфатических узлов, селезенки, печени от больного животного. Среди привитых животных падеж составил в среднем 37,7% (55).

Исследования по использованию маловирулентных штаммов ТЬ ашшШа для иммунизации провел Д.В.Богородицкий (1946-1955). Для ослабления вирулентности через организм теплокровного хозяина без участия клещей-переносчиков пассировали четыре штамма возбудителя (937, 489, и Ватан). Наиболее пригодным для иммунизации оказался Ватан. В производственном опыте в Узбекистане иммунизировали 499 и бычков. Отход в процессе иммунизации составил 2,6% - за счёт тейлериоза, остальные животные легко переболели и приобрели стойкий иммунитет (12-15).

Е.А.Муратов (1955) изучал возможность иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза, пироплазмоза и бабизиоза в Таджиской ССР. Автор брал кровь от больных животных и разводил её изотоническим раствором хлористого натрия Разведенную кровь он вводил животным в подхвостовую складку. Этот метод был применен в 1952 г на 20 телятах, а в 1953 г. - на 25 коровах. На основании своих опытов автор сделал вывод, что иммунизация скота против смешанных форм пироплазмидозов методом введения под кожу постепенно возрастающих доз вирулентной крови безопасна и создает нестерильный иммунитет (43).

Р1рапо Е. е! а!. (1969) для иммунизации использовали гранатные тела ТЬ. ашш1а1а из культуры лимфоидных клеток после инактивирования ультразвуком в течение 5 минут и добавления адъюванта Фрейнда. Получены положительные результаты при иммунизации телят в возрасте 3-5 месяцев. Телята приобрели напряженный иммунитет и не реагировали на контрольное заражение инвазированной кровью (175). Спустя 6 лет и Р1рапо Е., др., (1977) провели опыт по изучению возможности иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза вакцинами из убитых гранатных тел ТЬ. ашш1а!а. В опыте использовали три местных штамма тейлерий, которые вызывали смертность у восприимчивых животных в пределах 20-52%. Для приготовления вакцины использовали гранатные тела тейлерий, выращенные в культуре лимфоидных клеток крупного рогатого скота. Инвазированные лимфоидные клетки

14 отмывали буферным солевым раствором, концентрировали, затем лиофилизировали и восстанавливали до первоначального объема деионизированной водой. И в завершении полученный материал подвергали воздействию ультразвука, а затем длительному центрифугированию, в результате которого получали опалесцирующий супернатант названный авторами "растворимой" вакциной, и осадок - "корпускулярная" вакцина. В результате эксперимента, проведенного на 57 животных, авторы пришли к выводу, что наивысшая степень защиты от заболевания при контрольном заражении инвазированной кровью обнаруживается у телят, привитых вакциной в смеси с адъювантом. Корпускулярная часть разрушенных паразитов являлась более эффективной, чем растворимая. Привитые инактивированной вакциной телята, которые противостояли контрольному заражению инвазированной кровью, оставались полностью восприимчивыми к тейлериозу, передаваемому инвазированными клещами-переносчиками (179). Результаты исследований Е. Pipano et. al., (1977) полностью совпадают с результатами, полученными Wilde et. al., (1967) и Wagner G. et.al., (1974) которые с целью иммунизации также использовали инактивированные вакцины (Th. parva) в смеси с адъювантом. В их опытах все привитые телята оказались восприимчивыми к тейлериозу при питании на них инвазированных клещей, несмотря на то, что в сыворотке крови многих животных антитела обнаруживались в очень высоких титрах (179;231;232).

Опыты по применению инактивированных вакцин против тейлериоза (возбудитель Th. annulata) проводили в 1966-1970 гг в лаборатории протозоологии и арахнологии ВИЭВ Л. П. Дьяконов, Н. И. Степанова, Э.М. Аскаров (1975) . Изучали превентивные свойства инактивированных гранатных тел тейлерий и их комбинированное действие в сочетании с заключительной иммунизацией живыми (нативными) гранатными телами. Авторы пришли к выводу о принципиальной возможности иммунизации против тейлериоза путем одновременного или последовательного применения инактивированных

15 нативных гранатных тел (макрошизонтов), полученных из органов больных тейлериозом животных (20).

W. Jarret et. al., (1966) для иммунизации скота применили суспензию из органов животных, зараженных Th. parva приготовленную в последней гиперпластической фазе болезни. Результаты опытов оказались неудовлетворительными, так как все привитие животные заболели, и часть из них пала (131).

Brocklesby D., et. al., (1965) с целью иммунизации против восточно-береговой лихорадки восприимчивым телятам внутривенно вводили кровь или суспензию из пораженных органов, взятых от больного животного. Большинство телят приобрели достаточно напряженный иммунитет. (94).

H. Pirie, et. al., (1970) использовали для иммунизации шизонты в дозированном количестве. Восприимчивый скот вакцинировали против тейлериоза путем внутривенного введения суспензии из лимфатических узлов больных животных, содержащей макрошизонты Th. parva в дозе 2x108, 2x109, 2x1010 на одно введение. После контрольного заражения выжило 80% животных. Из 22 контрольных животных пало 20. В дальнейшем авторы установили (1977), что убитые шизонты тейлерий Th. annulata непригодны для иммунизации скота против тейлериоза (182).

Д.А.Мирзабеков, А.К.Мовсун-заде и А.Н.Годдаев (1971) предложили способ ослабления вирулентности возбудителя тейлериоза, который заключается в том, что восприимчивым животным вводится смесь селезеночной суспензии (ослабляющий компонент) и инвазированной тейлериями крови (инвазионный материал). Указанный способ был проверен на 44 нетелях, завезенных из Прибалтийских республик. Из них одно животное переболело тейлериозом в тяжелой форме, а 27 перенесли инвазию бессимптомно, а остальные на ведения материала не реагировали (38).

Исследователи из Кении Cunningham et. al. (1970, 1974) использовали для вакцинации животных против тейлериоза инвазивные формы Th. parva выделенные из зараженных клещей и сохраняемые в жидком азоте (103-106).

С целью получения материала, пригодного для вакцинации крупного рогатого скота против тейлериоза, многие исследователи применили ионизирующее излучение, являющееся мощным фактором воздействия на биологические объекты. Г.Н.Шахматов, 1969,1972; В.Д.Баранников, 1970; Cunningham М., et. al., 1970 ; И.В.Абрамов, В.Т.Заблоцкий, 1971;1972;1973 ; W. Munyua et. al, 1973 ;Р. Srivastava et. al., 1977;D. Singh et. al., 1979;S. Samantaray et al., 1980 ;Srivastava P., Sharma N. 1977 и другие в своих исследованиях показали, что как спорозонты, так и гранатные тела Th. annulata и Th.parva, подвергнутые воздействию радиации в определенной дозе, способны вызывать у зараженных ими животных слабую реакцию и прочный иммунитет (1-4;8;9;78;79;103;168;198;193;199;200).

Gill В. et. al., (1976,1977) для иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза (возбудитель Th. annulata) использовали метод "заражения-лечения". Авторы для иммунизации телят применили стабиляты, приготовленные из тканей только одного или 10 клещей, с одновременным введением хлортетрациклина в дозе 16 мг/кг. Обработку антибиотиками одной группы животных продолжали 4 дня, другой - 8 дней. Все опытные телята оказались иммунными и не заболели при питании на них инвазированных клещей, хотя среди 5 контрольных животных 4 погибли от тейлериоза(118;119). В последующие годы Gill В. et. al,. (1977,1978) расширили исследования по отбору антибиотиков, ослабляющих клиническое проявление тейлериоза у животных, зараженных стабилятами из тканей инвазированных клещей. Так, помимо хлортетрациклина они испытали пролонгированную форму окситетрациклина, который вводили в дозе 20 мг/кг подкожно однократно или двукратно с 3-дневным интервалом. Все животные, привитые по методу В Gill., а с соавторами, оказались иммунными и не заболели тейлериозом при

17 контрольном заражении, хотя среди 4 непривитых телят 3 пало от тейлериоза (паразитемия у них достигала 47,5%). Е. Pipano (1981) также испытали метод "заражения-лечения" для иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза. Животным подкожно вводили стабилят инвазированного клеща и одновременно внутривенно - окситетрациклин гидрохлорид в дозе 10 или 20 мг/кг S. Jagdish et. al., (1979,1980) с той же целью использовали риверин, Dölau Т. Et al, (1980) пролонгированную форму тетрациклина в дозе 20 мг/кг. Аналогичную работу провели Radley D. et. al., (1975) ; Mchardy N., Haigh A., Dolan Т., (1976) (111;121;122;129;130;160;185;186).

Полевые испытания эффективности вакцинации зебу против тейлериоза тремя изолятами Th. parva провели в Уганде I. Robson et. al (1977) (190).

Brown С. et. al., (1977) изучали возможность иммунизации против тейлериоза (возбудитель Th. parva) путем введения стабилятов тейлерий из слюнных желез инвазированных клещей и N-пирролидинометил-тетрациклина в дозе 5 мг/кг. На основании проведенных экспериментов авторы пришли к выводу, что тейлерии наиболее чувствительны к действию тетрациклиновых препаратов в первые 5 дней развития в организме животных, поэтому предлагаемый метод может быть эффективен для проведения иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза. Подобные исследования проводились так же в Танзании В. Schrender et. al,. (1977) и G. Uilenberg et. al., (1978) в Кении Radley D„ et. al., (1975)(97;194;185;229).

Важным фактором в дальнейшем изучении возбудителей тейлериоза крупного рогатого скота явилась установленная I.Tsur., возможность культивирования гранатных тел Th. annulata вне организма теплокровного хозяина.

Можно проследить три этапа в истории изучения культивирования тейлерий in vitro. Первый этап относится к середине 40-х годов, когда ряд исследователей наблюдали непродолжительный рост гранатных тел в плазменных культурах эксплантатов различных органов больных тейлериозом

18 животных. Так, в первых опытах, Tsur I (1946) небольшие кусочки печени или селезенки, полученные от больных тейлериозом животных культивировал на дне культуральных сосудов, используя для этого бычью плазму и экстракт куриного эмбриона. Питательная среда состояла из солевого раствора Тироде с добавлением глютамина, пиридоксина, рибофлавина и телячьей сыворотки. Эти культуры оставались жизнеспособными только в течение 1-3 недель. С использованием более сложной питательной среды №199 D. Brocklesby.et. al., (1958) удалось продлить рост таких культур до двух месяцев (93;222).

Второй этап начался с усовершенствования метода культивирования клеток (новые методы диспергирования клеток, сложные синтетические питательные среды и т.д.). Большой прогресс был достигнут при использовании различных ферментов, в частности трипсина, для дезагрегации тканей. Это позволило получать монослойные первично-трипсинизированные культуры инвазированных лимфоидных клеток теленка, инвазированных Th. annul ata. лимфоидных клеток (Tsur I., Adler S., 1962; L. Hulliger et. al., 1964, 1965; Заблоцкий В. Т., 1966 ; Hocshmand -Red et al., 1971; Gaur S. et. al., 1978 ; Gill В., Bhattacharyulu Y., Kaur D., Singh A., 1977) (9;25;117;134;144;148;149).

Преимущество этих культур заключалось в том, что их рост можно было поддерживать в течении нескольких месяцев и, следовательно, появилась возможность получать большую массу паразитов. Уже на этом этапе были предприняты попытки субкультивирования клеток, инвазированных тейлериями. Для этих целей Hulliger et. al., (1964) предложили метод совместного культивирования In vitro пораженных гранатными телами лимфоидных клеток больного тейлериозом скота с клетками перевиваемой линии ВНК-21, которая, не будучи зараженной протозоа, использовалась в целях обеспечения благоприятных условий для размножения инвазированных клеток крупного рогатого скота. Данная клеточная ассоциация, а вместе с ней и тейлерии, обладали способностью культивироваться на протяжении нескольких месяцев (148).

Третий этап относится к концу шестидесятых, началу семидесятых годов, когда ряду исследователей в Советском Союзе, Иране и Кении удалось получить перевиваемые линии клеток лимфатического узла и селезенки, инвазированных гранатными телами Th ammlata которые размножаются в суспензии (Hooshmand-Rad Р. et. al.,1971, Van den Ende et. .al., 1971; Hooshmand-Rad P. et. al., 1975; Мутузкина З.П. 1977). Успешно размножаются в суспензионных культурах и гранатные тела Th parva (Moulton J. et. al., 1971). Почти 100% лимфобластов в этих культурах были инвазированы гранатными телами тейлерий (41;144;146;167;230).

Использование культур тканей при изучении тейлерий открыло широкие возможности в выяснении таких сторон жизнедеятельности паразита, которые до этого были слабо изучены или совсем неизвестны. Так, например, с помощью этого метода был прослежен In vitro цикл развития тейлерий, который происходит в организме теплокровного хозяина, изучена характеристика иммуногенных и вирулентных свойств паразита в процессе роста вне организма хозяина; получен антигенный материал, пригодный для серологических реакций и иммунизации; выяснена роль клеточных факторов в иммунитете при тейлериозе; выявлена возможность отбора лекарственных препаратов тейлериоцидного действия; осуществлена гибридизация инвазированных тейлериями клеток крупного рогатого скота с клетками других видов животных; расширен поиск лабораторной модели для изучения тейлериоза; а также проведены исследования некоторых сторон обмена веществ у паразита и изучено много других вопросов.

Для изучения цикла развития тейлерий Brown С., Stagg D. et. al., (1973), Brown C„ Radley D. et. al., (1979) предложили оригинальный способ получения культур лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных гранатными телами Th parva и Th annulata. Вначале готовят культуры лимфоидных клеток от здорового крупного рогатого скота, использовав для этого лейкоциты периферической крови и клетки лимфоидных органов,

20 которые выравнивали на "кормящем" слое фибробластов в питательной среде, обычно используемой для культивирования лимфоидных клеток человека. Затем получали суспензию спорозоитов тейлерий из слюнных желез, предварительно питавшихся на кролике инвазированных клещей. После центрифугирования фильтрат вносили в лимфоидную культуру. Обычно первые внутриклеточные паразиты обнаруживались через 24 часа, а гранатные тела - на второй день после заражения. В культуре наблюдалась бластгрансформация лимфоцитов, которая, по мнению авторов, была связана с присутствием паразитов. Удвоение популяции паразитов происходило через 18-21 час. Пораженность клеток в культурах достигала 90-100%. Количество ядер в гранатных телах оставалось постоянным на протяжении 300 пассажей, в течение 3 лет непрерывного культивирования. В результате опытов стало доступным изучение In vitro той части жизненного цикла тейлерий, которая протекает в организме крупного рогатого скота с момента внедрения спорозоитов и до появления шизонтов (96;97).

Действие лимфы теленка и неинвазированных эритроцитов крупного рогатого скота на культивирование лимфоидных клеток, пораженных гранатными телами Th parva , наблюдали D. Danskin et. al., (1976). Добавление лимфы во всех случаях стимулировало деление клеток и шизонтов паразита. Наиболее благоприятное действие оказало внесение 10% лимфы и 1020% фетальной сыворотки. В культуре наряду с макрошизонтами обнаруживали микрошизонты, а также микромерозоиты. Авторы наблюдали внедрение паразитов в эритроциты крупного рогатого скота при их внесении в культуру. Пораженность эритроцитов тейлериями составляла 0,1%. Таким образом, была доказана возможность развития внутриэритроцитарной стадии тейлерий In vitro ,что позволило, с учётом работ Брауна, изучить весь жизненный цикл паразита вне организма теплокровного хозяина (108). Как известно, выращивание гранатных тел тейлерий в культурах клеток позволяет получать большие количества однородного инвазионного материала.

Воспользовавшись этой возможностью, многие исследователи, как у нас в стране, так и за рубежом, стали использовать выращенных In vitro паразитов для приготовления антигенов с целью использования их во всевозможных серологических реакциях. Так, Hooshmand-Rad Р., Hashemi-Fesharki (1971) в Иране впервые успешно использовали гранатные тела Th annulata , выращенные в культуре лимфоидных клеток для крупного рогатого скота, в качестве антигена в реакции связывания комплемента (РСК) (143). Значительные исследования по применению гранатных тел Th parva и Th lawrencei, выращенных в культурах клеток, в качестве антигена в непрямой реакции иммунофлюоресценции для диагностики тейлериоза провела группа исследователей под руководством Burridge М., Kimber С., (1972); Burridge М., et. al., (1973;1974). Положительный результат был также получен при использовании культуральных тейлерий в качестве антигена в реакции длительного связывания комплемента (Мутузкина З.П., 1977). Была подтверждена высокая чувствительность и специфичность РДСК при диагностике паразитоносительства у переболевших тейлериозом и анаплазмозом животных. (Сахимов, 1986)(41;65;98;99;100).

Pearson Т et. al., (1979), установили, что длительно культивируемые инвазированные тейлериями клетки имеют на своей поверхности специфические антигены, которые распознавались лимфоцитами ответчиками, выделенными из крупного рогатого скота иммунных к тейлериозу сингенных животных, в результате чего образовались цитотоксические лимфоциты, способные убивать пораженные тейлериями клетки. Авторы считают, что введение восприимчивым животным инвазированных тейлериями клеток вызывает сенсибилизацию иммунной системы организма. Вторичное воздействие антигена вызывало цитотоксический эффект и гибель инвазированных клеток. Таким образом, по мнению Пирсона с соавторами, в основе невосприимчивости к тейлериозу лежит клеточный иммунитет (172).

Культуры лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированные гранатными телами тейлерий, широко используются для отбора различных химиотерапевтических соединений, эффективных при лечении тейлериоза (Мс Hardy et. al., 1976)(161).

С начала первых работ по выращиванию тейлерий in vitro и до настоящего времени, в основном, используются культуры клеток различных органов и тканей крупного рогатого скота. В 1974 г. ряду исследователей удалось получить несколько перевиваемых линий клеток, инвазированных гранатными телами Tn lawrencei возбудителя тейлериоза буйволов Stagg D et. al., 1974; Burridge M., Young A., Stagg D. et. al, 1974. Для получения первичной культуры использовали лейкоциты крови инвазированных тейлериями буйволят ( Syncerus caffer), которые выращивали на монослое клеток эмбриона коровы. Без этих клеток лейкоциты буйволов не развивались (101;201).

Malmquist W. Е et. al., (1974) при получении клеточных линий, инвазированных Th parva в качестве питающего слоя использовали перевиваемую культуру клеток селезенки эмбриона коровы (BE Р) (159).

Позднее Young et. al.,(1978) установили, что процент получения культур из материала от прирученных южноафриканских буйволов был значительно выше, чем от диких. Исследователи объясняют этот факт тем, что экстенсивность поражения буйволов, содержавшихся в неволе, значительно выше (235).

В 1975 г. Hooshmand-Rad P., Hawa N применив метод, который обычно используется для культивирования гранатных тел Th annulata, получили две перевиваемые линии клеток овцы, инвазированные шизонтами Th annulata. Клетки этих линий размножались в суспензии (суспензионное культивирование). Одна линия клеток прошла 80 пассажей, другая - 60. Антиген, приготовленный из этих шизонтов, был с успехом применен (Hawa N. Et. а1.,(1976) в непрямой реакции флуоресцирующих антител для диагностики тейлериоза овец. Позднее эти авторы (Hawa N., Latif В., et al, 1981) испытали

23 на овцах превентивные свойства шизонтов, выращенных в культурах клеток. Для иммунизации использовали паразитов, прошедших 3, 30 и 63 пассажа in vitro (139;140;145;147).

Stagg D et. al., (1976) впервые получил от больной антилопы ( Taurotragus oryx) 5 клеточных линий, зараженных тейлериями рода Cytarotragus . В четырех линиях шизонты тейлерий развивались в лимфобластоподобных клетках, которые росли в виде суспензионной культуры. Пятая линия росла как монослой, и шизонты содержались в макрофагоподобных моноцитарных клетках, к 5 пассажу до 96% которых содержали шизонты (202).

З.П.Мутузкина (1977) изучала в сравнительном аспекте кариотип инвазированных лимфоидных клеток в процессе 6-7 и 16-20-месячного их культивирования. Инвазированные гранатными телами лимфоидные клетки из лимфатических узлов и селезенки через 6-7 месяцев культивирования, имели диплоидный набор хромосом. Процент диплоидных клеток в этих культурах составлял 74,7-81,8. Остальные клетки имели в преобладающем большинстве кариотип с гиподиплоидным набором хромосом. При изучении пораженных тейлериями лимфоидных культур на более поздних этапах культивирования (16-20 месяцев) цитогенетичеекая характеристика была иной. В этих культурах отмечали резкое возрастание метафаз с увеличенным числом хромосом (гипердиплоидные и полиплоидные) и уменьшение до 33,9-57,4% диплоидных клеток. Значительно увеличивалось количество полиплоидных метафаз, которые были представлены наборами из 120, 180, 240 хромосом. Цитоморфологические изменения некоторых из этих культур характеризовались также наличием большого количества гигантских и многоядерных ретикулярных клеток, напоминающих иногда клетки Березовского-Штернберга (40).

Основным достижением в работе по выращиванию разных видов тейлерий в культурах клеток животных явилось установление того факта, что паразит в процессе культивирования вне организма хозяина снижает свою вирулентность

Pipano E., Tsur I., 1966). Это послужило отправным моментом к проведению в некоторых странах мира исследований по изысканию различных способов аттенуации возбудителя и изучению возможности использования таких паразитов для целей специфической профилактики тейлериоза (174).

Pipano Е., Tsur I. (1966) установили, что после двух лет непрерывного культивирования in vitro паразит (Th armulata) теряет свою патогенностъ и при введении восприимчивому скоту не вызывает появления какой-нибудь клинической или паразитарной реакции. Однако такой скот обнаруживает полную защиту против контрольного заражения вирулентным гомологичным штаммом тейлерий, поддерживаемым путем пассажей на крупном рогатом скоте без участия клещей-переносчиков (173).

В лаборатории протозоологии Всероссийского института экспериментальной ветеринарии были проведены исследования по выяснению возможности использования тейлерий, выращенных в культуре ткани, для целей специфической профилактики тейлериоза (В.Т.Заблоцкий, 1966; 1967; 1968;1969; В.Абрамов, В.Т.Заблоцкий, 1973; В.Т. Заблоцкий, Н.А., Казаков 1975. Проведенные исследования показали, что гранатные тела тейлерий при культивировании in vitro снижают свою вирулентность, сохраняя иммуногенные свойства, что позволяло использовать их для иммунизации. Свойства не изменялись при хранении в жидком азоте (-196°С) (4;23;25-29).

Н.И. Степановой и др (1977) на основе выращивания шизонтов в культурах клеток разработана методика получения живой культуральной противотейлериозной вакцины. Ее испытание в хозяйствах Узбекистана показали, что она слабореактогенна и формирует у всех привитых животных стойкую невосприимчивость к тейлериозу. Л.П. Дьяконов и др (1975) изучали в экспериментах клинические и иммунологические показатели у крупного рогатого скота, вакцинированного различными дозами нативных шизонтов с целью выбора оптимальной дозы (20;68).

По сообщению R. Hashemi-Fesharki (1978) в Иране за последние 7 лет в различных климатических зонах страны вакцинировано 10 тыс. голов крупного рогатого скота в возрасте 2-12 месяцев. Использовали живую ослабленную вакцину из местных штаммов, выращенных в культуре лимфоидных клеток. Побочных явлений не было отмечено, за исключением незначительного повышения температуры тела у отдельных животных. По сообщению автора вакцинированный скот был устойчив к спонтанному заражению, в то время как невакцинированный тяжело переболевал и были случаи его падежа (135).

Pipano Е., et., aL, (1969,1973) при изучении реактогенных свойств противотейлериозной вакцины в лабораторных опытах использовали 59 спленэктомированных телят 2-5-месячного возраста, а в производственных условиях - 3650 коров разного возраста. Каких-либо симптомов болезни и осложнений у привитого скота при наблюдении в течение 27-35 месяцев не отмечено. Антитела к тейлерийному антигену после вакцинации выявляли в разведении сыворотки от 1:128 до 1:2048 (174; 176).

В Израиле, по сообщению Pipano Е., (1974), за 5-летний период привито вакциной из культуральных тейлерий приблизительно 4,5 тыс. голов крупного рогатого скота всех возрастных групп, причём в крови привитых животных эритроцитарные формы тейлерий не обнаруживали. Появление таких форм у иммунизированных животных рассматривалось как показатель нападения на них инвазированных клещей (естественное заражение). Вакцина, по мнению автора, создавала удовлетворительный иммунитет у молодняка и взрослого мясного скота, а также у животных в ранней стадии стельности (177).

Brown С., Malmquist W, et. al., (1971) с целью выяснения возможности заболевания животных тейлериозом после введения им выращенных вне организма хозяина тейлерий использовали три инвазированные Th. parva (штамм Мугуга) клеточные линии, полученные Malmquist W et. al., (1970). При этом было установлено, что телят можно заразить, если вводить им подкожно или внутривенно 10 млн. или более лимфобластов, содержащих

26 макрошизонты. Путем предварительной титрации инвазионного материала было установлено, что большинство телят, которым вводили от 105 до 109 инвазированных лимфобластов, слабо или совсем не реагировали на заражение, хотя титр антител повышался у всех животных. Все телята, привитые тейлериями в указанной дозе, оказались устойчивыми к контрольному заражению с помощью клещей (95; 157).

Существует мнение (Brown, 1971 - цитата , по R. Purneil 1980), что большие различия в проявлении поствакциональной реакции связаны с групповой принадлежностью лимфоцитов животного реципиента и исходных лимфоцитов донора. Учитывая, что материал, обладающий остаточной вирулентностью, не пригоден для применения в качестве вакцины, были предприняты исследования по ослаблению паразита путем продолжительного культивирования его in vitro. Длительное выращивание шизонтов Th parva (штамм Мугуга) в культуре клеток привело к постепенному снижению их вирулентности, однако это сопровождалось потерей иммуногенности. Освобождение шизонтов из лимфобластов различными физическими и химическими методами не привело к усилению их иммуногенности (183).

Young А., Brown et. al., (1973) установил, что крупный рогатый окот, вакцинированный шизонтами Th. lawrencei, выращенными в культурах клеток, легко переболевал тейлериозом при контрольном заражении клещевым материалом, содержащим Th. lawrencei . Авторы считают, что культуральные шизонты могут быть использованы в целях иммунизации скота против тейлериоза (234).

В последние годы развернулись исследования по созданию культуральной вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота в Индии, где это заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству. Так, Gill В., et., al.,. (1976), для профилактики тейлериоза, использовали шизонты вирулентного штамма тейлерий - Гиссар, выращенные в культуре лимфоидных клеток крупного рогатого скота. G Subramanial et. al., (1978)

27 провели испытание иммуногенных свойств шизонтов Th. annulata, выращенных в культурах лимфоидных меток крупного рогатого скота. В опыте использовали помесных бычков в возрасте 5-6 мес., которым ввели подкожно по 4-6 млн. инвазированных клеток четвертого субпассажа. Спустя I, 2 и 6 месяцев после иммунизации шесть привитых телят заразили тейлериозом (по два животных на каждый срок). У всех животных наблюдали легкую лихорадку, которая продолжалась в течение 3-4 дней и увеличение лимфатических узлов. Паразитемия достигла 2-3%. Шесть контрольных телят заболели тейлериозом. Пораженность эритроцитов крови тейлериями у них достигла 20-25%. Два контрольных животных из шести погибли от тейлериоза (119;206).

В своих исследованиях Shukla P.C., Sharma R.D., (1988) провели биопсию увеличенных лимфатических узлов телят, экспериментально инвазированных Th. annulata. Затем фракцию лимфоцитов биопсированного материала и крови инвазированных животных культивировали in vitro. Ростовой средой служила среда RPMI-1640. На первых пассажах в нее добавляли 20% сыворотки крови плодов коров, а затем заменили ее сывороткой крови безмолозивных телят, которая поддерживала репродукцию лимфобластоидных клеток на высоком уровне. Провели 139 пассажей культур - их перевивали вначале с интервалом в 5-19 дней, а затем, после обнаружения трансформации лимфоцитов, - 3 раза в неделю. В этих культурах митотический индекс составлял 7%, а инвазированностъ достигала 99,98%. Концентрация клеток в суспензионных культурах на 3 день культивирования варьировала от 1,2 х 106 до 2 х 106 кл / мл при исходном уровне 2 х 105 кл / мл. Хронически инвазированные тейлериями культуры клеток использовали для иммунизации крупного рогатого скота (208).

По данным Pipano Е., (1989) культивирование штаммов Th. annulata в первичных культурах клеток различных органов телят (почки, печени, селезенки и др. ), а также в лейкоцитарных культурах привело к аттенуации возбудителя и полной потере им вирулентности. У привитого аттенуированной вакциной КРС развивался выраженный гуморальный иммунный ответ,

28 мерозоиты в эритроцитах не образовывались. Это исключало возможность передачи возбудителя с клещами. В опытах на коровах, спленэктомированных телятах и хомяках показана безвредность вакцины. Испытание препарата в полевых условиях свидетельствовало о его эффективности как для местных, так и для экзотических пород КРС. За последние 20 лет около 3000 гол. КРС было завезено в Израиль из Западной Европы. Однократная их вакцинация аттенуированной вакциной создавала пожизненный протективный иммунитет у всех привитых животных. В опытах G.Subramanian (1989) использовали 55 помесных (Bos taurus, Bos indicus) серонегативных к Th. annulata новорожденных телят. Животным подкожно вводили по 0,5-2,0 х 10б инвазированных макрошизонтами тейлерий лимфобластов, выращенных в условиях культивирования in vitro. Инвазированные лимфобласты инокулировали животным в области левого преддопаточного лимфатического узла. Поствакцинальных осложнений не наблюдали, за исключением 3 случаев падежа от тейлериоза привитых (181;207).

Большинство зарубежных исследователей, работающих над созданием и испытанием культуральной противотейлериозных вакцин, отмечают, что их препараты не обеспечивают полной защиты иммунизируемых животных от заболевания тейлериозом, передаваемым инвазированными клещами (Cunninghem М., et. al., (1974); Pipano Е. et. al., 1976) Учеными Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им Коваленко создана культуральная высокоэффективная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота. Профилактическая эффективность вакцины при производственном ее применении на поголовье 2230 тыс животных - 98-100 % (105;178).

Технология культивирования in vitro лимфоидных клеток инвазированных тейлериями (Th annulata) состоит из следующих этапов : получения культур клеток инвазированных тейлериями, трипсинизации ткани, выращивания культур клеток , пересева суспензионных культур, контроля за интенсивностью

29 размножения гранатных тел в культурах клеток, сбора выращенных клеток. Этот метод использован для получения небольших объемов вакцины.

По данным В.Т. Заблоцкого (1983) поствакцинальный иммунитет при тейлериозе сохраняется 3,5 года (срок наблюдения). В.Т. Заблоцкий, И.К. Расулов (1983) сообщают о возможности иммунизации противотейлериозной вакциной нетелей (21;24).

Противотейлериозная вакцина ВИЭВ слабореактогенна и надежно предохраняет привитых животных от заболевания при естественном заражении через клещей переносчиков в период пастбищного содержания скота (Р.Х. Нораев). По данным Р.Х. Нораева (1985), противотейлериозная вакцина ВИЭВ как годичного так и пятилетнего срока хранения в жидком азоте не теряет свою иммуногенность и надежно предохраняет привитых животных от тейлериоза (45).

В.Т. Заблоцким (1985)обобщены материалы по технологии получения противотейлериозной вакцины ВИЭВ, методика проверки ее безвредности, реактогенности и иммуногенности, а так же применения в животноводстве (22).

Р.Х. Нораев (1986) установил, что противотейлериозная вакцина является слабореактогенной для телят 4-5 месячного возраста и надежно предохраняет привитых животных от заболевания тейлериозом (46).

Н.И. Степанова и др. (1987) в течение ряда лет в неблагополучных по тейлериозу крупного рогатого скота хозяйствах Средней Азии и Казахстана иммунизировали противотейлериозной вакциной более 25 тыс. голов молодняка, причем среди вакцинированных животных заболевания тейлериозом не было зарегистрировано (70).

Установлено, что иммунитет у однократно вакцинированных телят сохраняется пожизненно.

По сведениям Р.Х. Нораева (1987), И.Х. Расулова, Н.И. (1992), Степановой и др (1987), Б. Диванова (1987), Д.Т. Досжанова и др. (1987) применение противотейлериозной вакцины в условиях Таджикистана,

Узбекистана, Туркмении и Южного Казахстана дало положительные результаты (18;19;48;60;69;70).

Культуральная противотейлериозная вакцина (серия №4, изготовленная 10.11.1982 г. Щелковским биокомбинатом) у привитых телят 2-3 месячного возраста вызывала слабую реакцию и надежно предохраняла привитых животных от тейлериоза (Р.Х. Нораев 1987)(53).

В работах Р.Х. Нораева, (1991), Э.Т. Бадалова, Р.Х. Нораева, (1988), Э.Т. Бадалова и др., (1989) сообщается об эффективности специфической профилактики тейлериоза крупного рогатого скота противотейлериозной вакциной ВИЭВ в отдельных районах Таджикистана и вариантах совмещения вакцинации с обработкой скота акарицидами (6;7;52).

По данным R. Hashemi-Fesharki, (1986) в последние 14 лет в Иране иммунизировано причем без осложнений более 100 тыс. голов чистопородного и помесного скота с помощью аттенуированной вакцины из трех местных изолятов Theileria annulata, выращенных в культуре лимфоидных клеток. Два штамма (S-11 и S-15) составляют основу вакцины, они поддерживаются пассированием в суспензионной культуре тканей. Аттенуация достигнута в результате пассирования инвазированных шизонтами лимфоидных клеток в культуре ткани. Третий штамм (S-3) является стандартным проверочным штаммом и поддерживается заражением телят, этот пггамм очень вирулентный (отход до 80% восприимчивых чистопородных телят). Инвазированные шизонтами лимфоидные клетки размножают в стандартной суспензионной культуре с 10% сывороток лошади или овцы, клетки собирают, концентрируют (6 мл, 12 мл концентрата помещают в ампулы объемом 20 мл с 9,5% глицерина для криопрезервации и замораживают при - 70°С до применения). Каждая партия вакцины содержит 4000-7000 доз, по 6 доз в ампуле (137).

По сообщению (Sharma R.D.; Shukla P.C.; Nichani A.K. 1987) тропический тейлериоз крупного рогатого скота представляет для Индии серьезную проблему, поэтому актуальна разработка эффективной

31 культурально-клеточной вакцины. С этой целью макрошизонты Th. annulata размножали in vitro в среде RPMI 1640, обогащенной фетальной сывороткой, сывороткой новорожденных телят, козлят и ягнят, не получавших молозива. Перечисленные сывороточные препараты обладали по отношению к тейлериями приблизительно одинаковыми ростовыми свойствами, но стоимость сыворотки крови безмолозивных животных была значительно ниже, чем фетальной сыворотки. В среде, обогащенной сывороткой крови безмолозивных телят, макрошизонты T. annulata прошли 135 пассажей. На 10, 50 и 100 пассажах исследовали патогенность и иммуногенность возбудителя для телят. С этой целью культивированные in vitro макрошизонты

4 6 8 соответствующего пассажа вводили телятам в дозах 10, 10 и 10. У телят, f\ Q зараженных 10 и 10 макропшзонтов 100 пассажа, наблюдали слабую клиническую реакцию, отсутствие паразитологической реакции и выявили в реакции иммунофлуоресценции высокие титры специфических антител. Перевозку вакцины осуществляют в сухом льду или жидком азоте (192).

В опытах Ouhelth H.; Innés Е.А.; Brown C.G.D (1989), использовали серонегативных к Th. annulata помесных телят (голштинская и фризская) в возрасте 8-14 мес. Животных опытных групп (31 голов) привили различными

2 4 6 8 дозами (10% 10", 10°, 10й) лимфобластоидных клеток 4 линий, инвазированных марокканским изолятом Th. annulata. Контрольное заражение спорозоитами тейлерий высокопатогенного штамма "Стеб 35" показало, что вакцинация создавала у привитых животных иммунитет к инвазии, напряженность которого зависела от дозы и линии лимфобластоидной вакцины. В течение 2-летнего периода наблюдений у привитых животных сохранялся высокий уровень продуктивности. Все контрольные (непривитые) телята пали в течение 2 дней после экспериментального заражения спорозоитами тейлерий (171).

По данным З.В. Кущенко и др. (1989) у вакцинированных животных иммунитет сохраняется в течение 4 лет (срок исследований) Ouhelth H.; Innés Е.А.; Brown C.G.D. S.P. 1989 ,Morzazia, V.Nene (1990), Young A.S., Leitch B.L.,

Dolan T.T. (1990); H.T. Koch et. al., (1990); F.R. Hall (1990); P.C. Shukla, R.D. Sharma, (1991) сообщают об иммунизации скота вакцинами против Th.annulata, Th parva в отдельных странах Африки и Азии (35;152; 170;163;164;208;236).

По данным Ш.Ж. Кутлымуратова, (1991) в условиях Каракалпакии наиболее эффективной является профилактика тейлериоза культуральной вакциной ВИЭВ и последующие прививки против других болезней не оказывают отрицательного влияния на напряженность противотейлериозного иммунитета ( по результатам клинических наблюдений) (34).

Н.М Ширинов и др., (1991) сообщают о положительных результатах четырехлетнего производственного испытания противотейлериозной вакцины ВИЭВ в Азербайджане (80).

Р.Х.Нораевым, X. Георгиу, (1991); М. Сахимовым и др., (1991); Р.Х. Нораевым (1995) изучена реактогенность и иммуногенность противотейлериозной вакцины для стельных коров. Выявлено, что в Таджикистане, где тейлериоз КРС широко распространен, особенно в зонах отгонного скотоводства, применение вакцины экономически и экологически оправдано (52;52;66).

И.Х. Расуловым, (1992) приводятся данные многолетних исследований по применению противотейлериозной вакцины ВИЭВ в условиях Узбекистана (60).

Как считает Б.Ш. Ибрагимов, (1992) противотейлериозную вакцину можно применять для специфической профилактики тейлериоза у молодняка КРС с 2 -месячного возраста (30).

Р.Х. Нораевым, Х.Георгиу, (1992) установлена возможность передачи антител от привитых противотейлериозной вакциной потомству через молозиво (53).

Климатические условия жаркого времени года (июнь-июль) не оказывают отрицательного влияния на течение поствакциональной реакции и формирование иммунитета достаточной напряженности с высоким титром

33 антител у привитых противотейлериозной вакциной телят (Р.Х. Нораев 1993X50).

По сведениям Р.Х. Нораева, (1995) и Ибрагимова Б.Ш., (1992) у иммунизированных противотейлериозной вакциной клинически здоровых коров поствакцинальная реакция не оказывает отрицательного влияния на молочную продуктивность (30;51).

История изучения тейлериоза насчитывает около 100 лет. Метод выделения и культивирования тейлерий был разработан более 30 лет назад и только сравнительно недавно была получена вакцина против этой болезни.

Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности поддерживать оптимальные значения параметров культивирования. Был использован метод глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных Th. annulata. Метод глубинного культивирования клеток для приготовления вакцины является перспективным, снижает себестоимость вакцины, повышает гарантию надежности и экологическую безопасность.

Управляемое культивирование клеток животных, как метод биотехнологии, находит все более широкое применение при производстве культуральных вакцин.

Среди первых работ по культивированию клеток животных необходими отметить работы Карреля (Carrel, 1912, 1913, 1914,). Далее исследования продолжили Свим (Swim, ), Паркер ( Parker) ( 1957), Хейфлик (Hayflik), Морхед (Moorhead) (1961), Смит (Smith), Хейфлик (Hayflik) (1974), Мец (Mets) (1980), Оно (Ohno) (1980), Гринберг , Витковский (1982).

Основы теории глубинного культивирования даны в работах :

Моно (Monod) (1942,1950), Пирт (Pirt)(1957), Работнова (1957), Иерусалимский (1964), Аиба (Aiba) (1965), Уэб (1965), Диксон, Уэб (1966), Басканьян (1974), Позмогова (1978).

Различают два основных способа культивирования - выращивание на поверхности твердой фазы (монослой) и глубинное культивирование.

Существует несколько методов глубинного культивирования статическое и динамическое. При статическом культивировании массоперадача между клетками, питательной средой и газом осуществляется за счет диффузии.

Система статического культивирования в основном применяется для всех типов клеток при небольших масштабах производства.

Динамическое глубинное культивирование в свою очередь подразделяется на три основных метода: при первом методе поверхность для культивирования клеток (матрица) движется, а питательная среда (жидкость) находится в статическом состоянии; при втором методе поверхность (матрица) находится в статическом состоянии, жидкость движется и , наконец, при третьем способе в движении находятся все фазы культивирования (клетка -жидкость - газ).

Всю аппаратуру для поверхностного и глубинного культивирования клеток животных можно подразделить на следующие группы: -культурально -тканевые контейнеры; -качалки, роллеры, (спиннер), инкубаторы; -биореакторы.

Принципиальным шагом в развитии методов выращивания клеток стал переход к суспензионному культивированию (Cherry W.R., et., al., 1960; Rightsel W.A. et. al. 1960; Moore G.E. et., al., 1968; Fontanges, R.,1971; Girard H.C., et. al.,. 1973; Zwerner. R. K., et. al., 1975; Acton R. T., et. al., 1977 (86;107;168;114;123;188;237).

Системы суспензионного культивирования подразделяются на замкнутые и открытые (Перт С. Дж. 1978). Замкнутыми являются системы

35 периодического (циклического) культивирования и периодического культивирования с подпиткой (отьемно-доливное)(57).

К открытым системам культивирования относятся диализная ( с фильтрацией), перфузионная (гетерогенная) перфузионная с рециркуляцией (квазигомогенная), непрерывная гомогенная (хемостат) и непрерывная гетерогенная (турбидостат).

К биореакторам для культивирования предъявляются ряд требований: обеспечение стерильности процесса культивирования; обеспечение стерильности посева и взятия проб; гомогенность культуральной среды и культуры; оптимальные массобменные характеристики по потреблению питательных веществ и отвод продуктов метаболизма; простота наладки и обслуживания; стандартность блоков оборудования для культивирования; возможность осуществления масштабного перехода; возможность автоматического контроля регулирования основных параметров культивирования (Рубан Е.А., 1999). В зависимости от системы культивирования биореакторы подразделяются на биореакторы с механическим перемешиванием; эрлифтные биореакторы, биореакторы с биофильтром и протоком среды; барбатажные реакторы (колонны); биореакторы для культивирования в микрокапсулах; с пористыми ячейками; с полыми волокнами; мембранные биореакторы (Биотехнология клеток животных, под редакцией Р.Д. Спира и Дж. Грифитса 1989, Биотехнология клеток в культуре/ Под редакцией АС Трошина, 1984. Откинсон Б. Биологические реакторы, 1979 (16;17;56;64).

Большинство работ в области суспензионного культивирования клеток животных было выполнено на биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией. Позднее эти биореакторы были модифицированны с учетом особенностей клеток животных (Telling, R. С . et. al., 1971). Опубликованные данные (Tolbert W.R. et. al., 1981) показывают, что выбор подходящей системы перемешивания должен быть в каждом конкретном случае всесторонне

36 обоснован. Были испытаны реакторы с виброперемепшванием и с мешалкой импеллером типа морского винта (Pollard D.M. et. al., 1981). Так же были испытаны реакторы эрлифтного типа для культивирования клеток в суспензии (Katinger H.W.D. et. al., 1979). Другой системой является биореактор для культивирования с вращающимся фильтром (Feder J. et. al .,1983; ,Hemmelfard P., Thayer P.S. 1969; Tolbert W. R., Peder J.m, Kimes R.C. 1981). Этот биореакгор относится к реакторам перфузионного типа, где клетки удерживаются в реакторе и только среда удаляется из суспензии посредством фильтрации через вращающийся патрон. Важным шагом в усовершенствовании методов выращивания клеток и вирусов является использование мембранных биореакгоров (NilssonK.,Scheirer. W.,et.a.l.,1983) (113;149;151;169;183;212;215).

Иммобилизированные культуральные системы с использованием мембранных биореакторов обеспечивают более высокий выход клеток.

Наиболее часто и широко для культивирования клеток используются реакторы промышленного типа с механическим перемешиванием. Данные реакторы не удовлетворяют всем требованиям и не могут считаться оптимальными, но нашли широкое применение при культивировании клеток животных. Физические функции стандартных реакторов изучены достаточно подробно и описаны во многих публикациях (Cherry W.R., et. al., 1960; Rightsel W.A. et. al., 1960 ; Moore G.E. et. al, 1968; Fontanges, R.,1971; Girard H.C., et. al., 1973; Zwerner. R. К et. al., 1975; Acton R. T., e.t al., 1977).Биореакторы данного типа были выбраны автором для проведения работы (86;107;114;123;168;188;237).

Современные требования к промышленному производству вакцин для профилактики болезней животных в том числе и против тейлериоза включают санитарно-экологические аспекты: защита готовой продукции; защита сырья и промежуточных, конечных продуктов; защита обслуживающего персонала; защита окружающей среды. Требования к чистоте биологического

37 производства регулируются на основе общих правил GMP . ( Richtlinien der IKS vom 13 Mai 1982 betreffend die Herstellung von Arzneimittein in verwendungsfahiger Form; Interkantonale Kontrollstelle für Heilmittel IKS, Berne, Switzerland.(l 87)

Как показал литературный обзор, метод глубинного периодического суспензионного культивирования клеток для приготовления вакцины против тейлериоза является перспективным, позволит снизить себестоимость вакцины, повысит гарантию надежности и экологическую безопасность, его разработка представляется весьма актуальной.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Васько, Валерий Евгеньевич

4. ВЫВОДЫ

1. Научно обоснован метод глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа.

2. Определены оптимальные значения и величины допустимых отклонений технологических параметров культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа.

3. Разработан алгоритм управления технологическим процессом культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашш1Ма.

4. Разработана современная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппиЫа. Технология защищена патентом Российской Федерации.

5. Сравнительный анализ существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза показал, что предложенная технология обеспечивает значительное снижение трудоемкости и себестоимости производства вакцины, повышает гарантию надежности технологического процесса и экологическую безопасность.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных исследований и практики разработана современная оптимизированная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка инвазированных ТЬ. ашшЫа. Разработаны изменения и дополнения к действующей инструкции по производству вакцины против тейлериоза утверждены директором ВНИТИБП 25 ноября 1991 года. Получен патент на изобретение №: 1838915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13октября 1992 г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васько, Валерий Евгеньевич, Москва

1. Абрамов И.В., Заблоцкий В. Т. Действие ионизирующего излучения на возбудителя тейлериоза крупного рогатого скота. В сб. Материалы 1 съезда ВОПР. Баку, 1971, с.182-183.

2. Абрамов И.В., Заблоцкий В.Т. Влияние лучей рентгена на вирулентность ТкашшЫа Ветеринария, 1972, и 10, с.91-93.

3. Абрамов И.В., Заблоцкий В .Т. Изменения вирулентности ТЬ.ашшЫа под действием ионизирующего излучения. В сб.:1У Международный конгресс протозоологов, 1973, с. 458.

4. Абрамов И.В., Заблоцкий В. Т. Культивирование тейлерий в культуре тканей и испытание их иммуногенных свойств. В кн.:Иммунитет сельскохозяйственных животных. 1973, с.351-355.

5. Бадалов Э.Т., Нораев Р.Х. Профилактика тейлериоза крупного рогатого скота// Сельское хозяйство Таджикистана.-1981.-№6.-С.23-25.

6. Бадалов Э.Т., Нораев Р.Х., Сахимов М.Р. Пути ликвидации тейлериоза крупного рогатого скота //Сельское хозяйство Таджикистана.-1988.-№4,-С.38-39.

7. Бадалов Э.Т., Сахимов М.Р Нораев Р.Х. Эпизоотическая ситуация по пироплазмидозам крупного рогатого скота в Таджикистане и принципы борьбы с ними //Сб.науч.тр. ТаджНИВИ.-1989.-С63-74.

8. Баранников В.Д. Действие ионизирующего излучения на возбудителя тейлериоза крупного рогатого окота в клещах. Труды ВИЭВ. 1970, т.38, 0.70-72.

9. Баранников В. Д. Использование лучей рентгена для ослабления вирулентности ТЬ.ашшЫа Труды ВИЭВ, 1970, т.38, | с.73-77.

10. Бейли. Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии/ч. 1.-М.: Мир,-1989.-692С.91

11. П.Бейли. Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии/ч.2.-М.: Мир.-1989.-590С.

12. Богородицкий A.B. Кровепаразитарные болезни животных. -Ветеринария, 1946,4, с,12.

13. Богородицкий А. В. Иммунизация молодняка крупного рогатого скота против тейлериоза Th.annulata, Dachun. et Lühs, 1934. Автореф.канд.дисс., 1949.

14. Богородицкий A.B. Значение возраста при заболевании гемоспоридиозами. -Ветеринария, 1950, и П, с.24-25.

15. Богородицкий A.B. Иммунизация молодняка крупного рогатого скота против тейлериоза, пироплазмоза и франсаиеллеза. В кн.: Протозойные болезни сельскохозяйственных животных. М., 1955, с.200-207.

16. Биотехнология клеток в культуре/ Под редакцией АС Трошина, Л.: Наука, 1984-279С.

17. Биотехнология клеток животных, под редакцией Р.В. Спира и Дж.Б. Гриффитса; Т1,-М: ВО, Агропромиздат, -1989. 365с.

18. Диванов Б. Иммунопрофилактика тейлериоза крупного рогатого скота в Туркмении //Тез. доклад, и сообщ. IV съезда Всес. о-ва протозоологов,-Л.,1987.-С.170.

19. Досжанов Д.Т., Хван М.В., Ананьев О.П. и др. Специфическая биопрофилактика, тейлериоза крупного рогатого скота на юге Казахстана. //Тез.докл. и сообщ. 1 V съезда Всес. о-ва протозоологов.- Л., 1987,- С. 170.

20. Заблоцкий В. Т. Использование культуры тканей при изучении возбудителя тейлериоза. Ветеринария, 1967, и 9, с.66-69.

21. Заблоцкий В.Т. Изучение возбудителя тейлериоза крупного рогатого скота m vitro . -.3 сб.: Животноводство и ветеринария (работы молодых учёных). -М.: Колос, 1968, 0.382-389.

22. Заблоцкий В.Т. Биологические свойства возбудителя тейлериоза крупного рогатого скота, выращенного в культуре клеток В сб.: Успехи протозоологии, 1969, с.277-278.

23. Заблоцкий В.Т. Опыты по культивированию Theileria annulata в культуре тканей. В сб.: Природно-очаговые болезни и вопросы паразитологии в республиках Средней Азии и Казахстана, 1969, с. 103.

24. Ибрагимов Б.Ш. Вакцинопрофилактика тейлериоза у телят: Автореф.дис. канд. биол. наук.-М., 1992.-22с.

25. Зенин В В., Никольский H.H., Сконичева В.И., Сорокина Ф.Б. Зависимость пролиферации клеток ЗТ6 от концентрации сыворотки в среде/Щитология, Т.24-№8-1982.-С.547-953.

26. Каталог российско-германской фирмы "Технвест" Устройства и системы техники чистых помещений с технологией фирмы "БабкокБах"

27. Кафаров В.В. Основы массопередачи. М. Химия, 1972.93

28. Кутлымуратов Ш.Ж. Эпизоотология тейлериоза крупного рогатого скота и меры борьбы с ним в Республике Каракалпакистан: Автореф.дис. канд.вет.наук.-Самарканд, 1991 .-17с.

29. ЗЗ.Кущенко З.В., Яременко Т.Г., Досжанов Д.О. Эпизоотологическое состояние по тейлериозу крупного рогатого скота и профилактика заболевания.-Чимкент, 1989.-3с.-(Информ. Листок/Южно-Казахстанский ЦНТИ; №56-89).

30. Лавровская В.П., Лежнев В.И. Балансово динамический способ определения объемного коэффициента массопередачи в системе газ жидкость ИБФ АН СССР, 27 апреля 1976 г.

31. Ленинджер А. Основы биохимии, т. 1-3, М. Мир, 1985

32. Мирзабеков Д.А., Мовсум-заде А.К., Годдаев А.Н. Опыты по ослаблению патогенных свойств Theileria annulata Материалы I съезда Всесоюзного общества протозоологов. Баку, 1971, с.241-243.

33. Милушин В.Н. Научные основы производства вакцин и сывороток, с 125,1. М., Медицина 1966.

34. Мутузкина З.П. Культивирование и морфогенетическая характериеййШ инвазированных Theileria annulata клеток. Антигенные свойства паразита в РДСК. Бюллетень ВИЭВ, 1977, в. 31, с. 13-18.

35. Мутузкина З.П. Методика получения антигена из культуральных тейлерий для РДСК. Бюллетень ВИЭВ, 1977, в.31, с.20-21.

36. Мутузкина З.П. Культуральная и морфогенетическая характеристика инвазированных Theileria annulata (DschuiL et Lühs, 1904) клеток иантигенные свойства паразита в РДСК. Автореф.канд. дисс. М., 1978.

37. Муратов Е.А. Результаты двухлетней работы по иммунизации крупного рогатого скота против гемоспородиозов,- Труды АН Таджикской ССР ,1955.-T.33.-C.43-45.

38. Нораев Р.Х. Пираплазмидозы крупного рогатого скота Юго-Востока Таджикистана и основы их профилактики: Автореф. Дис. . канд.вет.наук. М., 1983.-С.21.94

39. Нораев Р.Х. Профилактика тейлериоза крупного рогатого скота культуральной вакциной ВИЭВ.-Душанбе, 1985.-3с.-(Информ. листок /ТаджикНИИНТИ; №38-85).

40. Нораев Р.Х. Реактогенность и профилактиктическая эффективность культуральной противотейлериозной вакцины ВИЭВ для молодняка 4-5-месячного возраста // Сб.науч.тр.ТаджНИВИ.-Душанбе, 1986.-С.34-37.

41. Нораев Р.Х. Результаты испытания культуральной противотейлериозной вакцины на молодняке 2-3 месячного возраста // Сб.науч.тр.ТаджНИВИ-Душанбе, 1987.-С.24-27.

42. Нораев Р.Х. Эпизоотология и профилактика тейлериоза крупного рогатого скота на Юго-Востоке Таджикистана // Тез.докл. и сообщ. IV Всес. съезда о-ва протозоологов.-Л., 1987.-С. 149-150.

43. Нораев Р.Х. Вакцинопрофилактика телят раннего возраста против тейлериоза // Материалы науч.-произв .конф., посв.25-летию ветеринарного факультета ТСХИ.-Душанбе, 1988.-С.21-22.

44. Нораев Р.Х. Влияние жаркого климата на течение поствакциональной реакции и формирование иммунитета у телят, иммунизированных противотейлериозной вакциной.-Душанбе. 1993.-3с .-(Информ. листок / ТаджикНИИНТИ;№4~93).

45. Нораев Р.Х. Совершенствование иммунизации коров противотейлериозной вакциной Н Сб. науч.тр.ТаджНИВИ.-Душанбе, 1995.-С.42-45.

46. Нораев Р.Х. Георгиу X. Изучение реактогенности противотейлериозной вакцины для стельных коров // Сб.науч.тр.ТаджНИВИ.-Душанбе, 1991.-С.56-58.

47. Нораев Р.Х. Георгиу X. О возможности передачи антител от привитых противотейлериозной вакциной коров потомству // Сб. науч.тр.ТаджНИВИ.-Душанбе, 1992.-С59-64.95

48. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток М: . Мир, 1978.-3.

49. Путалова В.П. Клиника, лечение и профилактика бруцеллеза. Омск, 1957.

50. Расулов И.Х. Профилактика и терапия пираплазмидозов (тейлериоз, пираплазмоз, бабезиоз) крупного рогатого скота в Узбекистане: Автореф.дис. . докт.вет.наук.-Самарканд, 1992.-30с.

51. Рубан Е.А. Биотехнология производства препаратов для защиты животных/ЛВестник Российской Академии сельскохозяйственных наук №1 М.: 1995,- стр.69-71.

52. Рубан Е.А., Мельник Н.В. и др. Опыт эксплуатации волоконно-оптического преобразователя оптической плотности культуральной жидкоети/УТез. Докл.96

53. На 1Всесс. Конф. «теория и практика электронно-оптических исследований коллоидных систем» Велогож, 1990.-С.21-22.

54. Рубан Е.А. Культивирование клеток животных и вирусов. (Способы, материалы, оборудование.) //Вестник Российской Академии С-Х наук. 1999.-№1.

55. Сахимов М.Г. Пираплазмидозы и анаплазмоз крупного рогатого скота Юго-Западного Таджикистана (эпизоотология и меры борьбы): Автореф.дис. .канд.биол. наук.-М., 1986.-24с.

56. Сахимов М.Р., Нораев Р.Х., Бадалов Э.Т. Вакцинация коров против тейлериоза.-Душанбе, 1991 .-Зс.-(Информ.листок /ТаджикНИИНТИ; №21-91)

57. Степанова Н.И. РСК-метод диагностики и дифференциации кровопаразитов .// Ветеринария.-1969,-№1.-С.55-56.

58. Степанова Н.И., Заблоцкий В.Т. Влияние дозы тейлерий, выращенных в культурах лейкоцитов крови, на образование иммунитета у телят. //Бюл.ВИЭВ.-1977.-Вып.31 .-С.21-23.

59. Степанова Н.И., Заблоцкий В.Т., Мутузкина З.П. Вакцинопрофилактика -основа борьбы с тейлериозом крупного рогатого скота // Тез.докл.и сообщ. 1УВсес. съезда о-ва протозоологов.-Л., 1987.-С.157-158.

60. Степанова Н.И., Заблоцкий В.Т., Мутузкина З.П. и др. Иммунопрофилактика тейлериоза крупного рогатого скота // Ветеринария.-1987.-№3.-С.69-70.

61. Система чистых помещений для фармацевтической промышленности. По материалам фирмы "Лштга". Ж. Технология чистоты N 1, 96, с 15-27.

62. Тарасов В.Н. Управляемое культивирование и непрерывное культивирование вирусов и клеток позвоночных Итоги науки и техники ВИНИТИ, серия Микробиология- 1975г-4 с152-207

63. Тарасов В.Н. Клеточные культуры в производстве биологически активных веществ. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Серия Вирусология. 1979 с 135189/97

64. Трошин A.C. Биология клетки в культуре. Под ред. A.C. Трошина, Л.: Наука, 1984, 279 с.

65. Тяженов A.A. Тейлериоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним в Кзыл-Ординской области // Диагностика, лечение и профилактика паразитарных и ассоциативных болезней животных в Казахстане.-Алма-Ата, 1989.-С.54-59.

66. Хаптеев Ц.Ц., Лукьянова З.И. Тканевые культуры и их применение в вирусологии. 1974. 179с.

67. Шахматов Г.М. Лечение тейлериоза крупного рогатого скота гипериммунной сывороткой. Сельское хозяйство Таджикистана, 1966, 10. с.54-56.

68. Шахматов Г.Н. Влияние ионизирующих излучений на возбудителей нутгалиоза мышей и тейлериоза крупного рогатого скота. -В сб.: Успехи протозоологии. М.: Наука, 1969, с.304-305.

69. Шахматов Г.Н. Способ получения слабовирулентного штамма Theileria arm iilata, с помощью ионизирующего излучения для активной иммунизации крупного рогатого скота. В сб.: Вопросы зоологии Таджикистана. Душанбе, 1972, С.26-28. .

70. Ширинов Н.М., АгаевА.А., Мирзабеков К.Д. и др. Производственное испытание противотейлериозной вакцины ВИЭВ в Азербайджане // Ветеринария. -1991 .-№11 .С.37-38.

71. Федосеев К.Г. Механизм переноса питательных веществ к клетке.- В кн.: Математическое моделирование микробиологических процессов. Пущино, с 30-56,1973.

72. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М. Мир, 1978.

73. Уэбб Э. Биохимическая технология и микробиологический синтез. М. Медицина, 1969.

74. Уонг Д, Кооней Ч, Демайн Р, Хемфри А, Л ил л и М Ферментация и технолгия ферментов, М. Пищевая промышленность, 1983, 336 с.98

75. Юсупов К.А. Серебряков В.А., Розгон М.И. и др. В кн.: Научные основы производства вакцин и сывороток, с 79, М., Медицина, 1965.

76. Adler S., Ellenbogen V. A note on the pre-immunisation of calves against Theilerie annulata. Vet. Ree. 1934, N 14, P.91-93.

77. Adler S., Ellenbogen V. Observations on theileriosis in Palestine. Arch. Inst. Pasteur d Algerie, 1935, N 13, p. 451-471.

78. Adler S., Ellenbogen V. Remarks on the relationship between the Palestinian and Algerian pathogenic Theileria. -Arch. Inst. Pasteur d'Algerie, 1936, N 14, p.66.

79. A11-Rubeani M., Sing R.,P., Goldman M. H., Emery A. N. Death mechanisms of animal cells in conditions of intensive agitation. Biotechnol. Biong.-45.-1994.-P.463-472.

80. Baker J.B, Semmer R.L., Glenn K.C., Cunnigham D.D. Binding EGF with cell membrane. Nature. 1979., 278. P.743.

81. Boraston ,R., Thomson, P.W., Garland, S., and Birh, J.R. Growth and oxygen requirements of cells in suspension culture. Dev. Biol. Stand 55, 103-111,1984.

82. Brocklesby D., Hawking F. Growth of Theileria annulata and. Theileria parva in tissue culture. Tr, Roy, Soc. Trap. Med. end Hyg., 1958, N 52, p.414-420.

83. Brocklesby D., Beiley K., Jarrett W., Martin W., Miller H„ Nderito P., Urquhert G. Experiments in immunity to East Coast fever. Vet. Ree., 1965, v.77, N 18, p.512.

84. Brown C., Malmquist W, Cunningham M., Radley D., Burridge M. Immunization against East Coast fever. Inoculation of cattle with Theileria parva schizonts grown in cell culture. -J. Parasit., 1971, v.57, N 4, p.59.99

85. Brown C., Stagg D., Purnell R., Kanhai G., Payne R. Infection and transformation of bovine lymphoid cells in vitro by infective particles of Theileria parva. -Nature, 1973, v. 245, N 5420, p.101-103.

86. Burridge M., Kimber C. The indirect fluorescent antibody test for experimental East Coast fever (Theileria parva infection of cattle). Evaluation of a cell culture schizont antigen. Res. Vet. Sci., 1972, v. 13, N 5, p.451-455.

87. Burridge ML, Kimber C., Young A. Use of the indirect fluorescent antibody technique in serologic studies of Theileria lawrencei infections in cattle. Amer. J. Vet. Res.9 1973, v. 34, N 7, p.897-900.

88. Burridge M., Brown C., Kimber C. Theileria annulata cross-reactions between a cell culture schizont antigen and antigens of East African species in the indirect fluorescent antibody test. Exp. Parasitol., 1974, v.35, N 3, p.374-380.

89. Coffer T.G., Al-Rubea. M. Cell death (apoptosis) in cell culture systems. Tip Tech., 13, 1995, P.150-155.

90. Cunningham M., Brown C., Purnell R., Branagan D The preservation at low temperature of infective particles of Theileria parva, Proc. 2 hit, congr, Parasit,, Washington, 1970, part 4, p.60,100

91. Cunningham M., Brown С., Burridge M., Musoke A., Pumeli R., Radley D., Sempebwa C. East Coast fever, Titration in cattle of suspensions of Theileria parva derived from ticks. Brit. Vet, J. 1974, v.130, N 4, p.336-345.

92. Cunningham M. A report on the activities of the F.A.O. immunological research on tick-borne cattle diseases and tick control project. Ball. Off. int. Epiz., 1974, 81 (1-2), p. 161-166.

93. Cherry, W. R., and Hull, R. N. Studies and observations on the growth of mammalian cells agitated in fluid medium. Biochem. Microbiol. Technol. Eng. 3, 1960, P. 267—285.

94. Danskin D., Wilde J. The effect of calf lymph and bovine red blood cells on in vitro cultivation of Theileria parva-infected lymphoid cells. Trop. Anim. Health and Prod., 1976, v.8, N 3, p.175-185.

95. Dolan T.T. Immunization to control east coast fever Значение иммунизации в борьбе с тропическим тейлериозом. (Кения) . 1987, 3 (1) р. 46.

96. Dolan T.T . Theileriosis: A comprehensive review Тейлериоз крупного рогатого скота в различных странах мира. Обзор. (Кения) . 1989, 8 (1) р. 1136 Rev. scient. techn. Off. Intern. Epizoot, 1989; T. 8. N 1 1989, 8 (1)

97. Dolan Т., Radley D., Brown C., Cunningham M., Morzaria S., Young A. East Coast fever; 4. Further studies on the protection of cattle immunized with a combination of Theileria strains. Vet. Parasitol., 1980, v.6, N 4, p.326-332.

98. Eagle H. The effect of environmental pH on the growth of normal and malignant cells //J. Cell. Physiol.-vol.82.-1973.P. 1-8.

99. Feder, J., and Tolbert W. R. The large scale cultivation of mammalian cells. Sci. Am. 248., 1983, 36-^3.

100. Fontanges, R., Deschaux, P., and Beaudry, Y. Apparatus for continuous, largevolume suspended cell culture. Biotechnol. Bioeng. 13,1971,p. 457—470.

101. Gail L.: Aerosol-Abscheidung; Chemie-Ingenieur-Technik 52, 1, p 39-45. 1980.

102. Gaur S, Yadav M. In vitro cultivation of Theileria annulata in bovine lymphoid cell culture. Indian J. Miorobiol., 1978, v. 18, N 1, p. 16-18.

103. Gill B., Bhettacbarynlu Y., Kaur D, Immunization against bovine tropical theileriosis (Theileria annulata infection) Rev. Yet. Soi., 1976, v21, N 2, pl46-149.

104. Gill B., Bhattacharyulu Y., Kaur D., Singh A, Vaccination against bovine tropical theileriosis (Theileria annulata), Nature. 1976, v.264, N 5584, p.355-356.

105. Gill B., Bhattacharyulu Y., Kaur D, Studies on the relationship between the quantum of infection and the ensuing reaction of cattle infected with Th. annulata. Ani. Soc. beige med. trap., 1977, v.57, N 6, p.557-567,

106. Gill B., Bhattacharyulu Y., Kaur D., Singh A. immunization of cattle against tropical theileriosis (Theileria annulata infection) by "infection-treatment" method. Ann. Rech. vet., 1977, v.8. N 3, p.285-292.

107. Gill B., Bhattacharyulu Y., Kaur D., Singh A. Chemoprophylaxis with tetracycline drugs in the immunization of cattle against Theileria annulata infection. Inter. J. Parasitol., 1978, v.8, N 6, p,467-469.

108. Girard, H. C., Okay, G., and Kivilcim, Y. Use of the vibro fermentor for multiplication of BHK cells in suspension and for replication of FMD virus. Bull. Off. Int. Epizoot, 79, 1973, p. 805—822.

109. Grander H.: Uber ein neues System der gezielten Anwendung von Laminar-Flow; Reinraumtechnik 4; Swiss Society for Contamination Control (SRRT), Zurich, p 7-10,1980.

110. Guideline on Sterile Dmg Products produced by Aseptic Processing, June 1987; US Public Health Service; FDA., Rockville MD102

111. Guide to Good Manufacturing Practice, PIC-Document PH 5/89 (September 1989)

112. Guide to Good Pharmaceutical Manufacturing Practice 1983;Her Majesty's Stationery Office, London.

113. Griffiths, J.B. Oxidation reduction potential. Dev. Biol. Stand. 55, 113-116, 1983.

114. Jagdish S., Singh D., Gautam 0., Dhar S. Chemoprophylactic immunization against bovine tropical theileriosis, Vet. Ree., 1979, v.104, N 7, p. 140-142.

115. Jagdish S., Singh D., Gautam 0., Chemoprophylactic immunization against bovine tropical theileriosis, Indian Vet. J., 1980, v.57, N 2, p.177-178.

116. Jarrett W., Pirie H„ Sharp N. The transmission of East Coast Fever using cell from infected animals. Proc, 1st Int. Congr. Parasitol., Milano, 1966, p,105-106.

117. HallF.R. Antigens and immunity in Theileria annulata Антигены Theileria annulata и иммунитет при данной инвазии. (Великобритания) . Parasitol. Today, 1988; Т. 4. N 9 р. 257-261.

118. Hashemi-Fesharki R. Seven years study on immunization of cattle against Theileria annulata infection with lymphoid cell suspension culture vaccine in Iran, 4th Int, Congr. Parasitol. Warsaw, 1978, Short commun. Sec, E, Zodz., 1978, p.lll.

119. Hashemi-Fesharki R., Hedegati H., Ahourai P., Seighali H. Delayed skin hypersensitivity test in calves infected with different strains of Theileria annulata. Progress in Protozoology, 6th Inter. Congr, Protozoology, Warszawa, 1981.

120. Hashemi-Fesharki R. Control of theileria annulata in Iran 1986, 56 (2) p. 36-40103

121. Hashemi-Fesharki R. Control of Theileria annulata in Iran . Parasitol. Today J 1988, N4,2, P36-40

122. Hawa N., Latif В., Bakir F. Application of the indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Theileria hirci infection of sheep.- Trop. Anim. Health and Prod., 1976, v8, N2, p.97-101.

123. Hawa N., Latif В., Ali S. Immunization of sheep against Theileria hirci infection with schizonts propagated in tissue culture. Vet. Parasitology, 1981, v.9, N2, p.291-97.

124. Hortig H.P. Clean room technology-aspects ofbioclean liness; m Proceedings of the 8th International Symposium on Contamination Control;Associazionc per lo Studio ed il Controllo della Contaminazione Ambientale, Milan, p 920,1986.

125. Hooshmand-Rad P., Hashemi-Fesharki R. Complement-fixing antibodies in cattle experimentally infected with Theileria annulata or vaccinated with tissue cultures. Brit. Vet. Jour., 1971. v. 127, N 5, p.244-249.

126. Hooshmand-Rad P. Blood protozoan diseases of ruminants. Bull. off. int. Epiz., 1974, v,81, N 9-10, p.779-792.

127. Hooshmand-Rad P. The growth of Theileria annulata infected cells in suspension culture. Trop, Anim. Hith. Prod., 1975, N 7, p.23-28.104

128. Hooshmand-Rad P., Hawa N. Cultivation of Theileria hirci in sheep lymphoid cells. Trop. Anim. Hith. Prod., 1975, N 7. p.121-122.

129. Hulliger L., Wilde J., Brown C., Turner L. Mode of multiplication of Theileria in cultures of bovine lympocyte cells. Nature, London, 1964, N 203, p.728-730

130. Hulliger L. Cultivation of three species of Theileria in lymphoid cells in vitro. J. Protozoology, 1965, N 12, p.649-655.

131. Hemmelard P., Thayer P.S. (1969) Spin filter cultyre. The propagotion of mammalion cells in suspension. Science 104. 555-557.

132. Henzler H.J., Kauling D.J. Oxygenation of cell cultures. Bioproc. Eng.-9.-1993-P.61-75.

133. Katinger, H. W. D., Scheirer, W., and Kromer, E. Bubble column reactor for mass propagation of animal cells in suspension culture. Ger. Chem. Eng. (Engl. Transl.) 2,1979, p.31—38.

134. Koch H.T. , Kambeva L., Osama J.G.R. Immunization of cattle against Theileria parva bovis and their exposure to natural challenge.- Veter. Parasitol. 1990, Vol.37,N 3/4, P. 135-195.

135. Koch R, Second report on Rhodesian Redwater or African coast fever. J. Comp, Pathol., 1903, v. 16, p.280-284.

136. Kromcnaker S.J., Sriens F. Cell cycle dependent protein assimilation by producer and nonproducer murine hybridoma cell lines: a population analysis. Biotechnol. Bioeng. 33. 1991.-p.665-677.

137. Kruger D., Melchert H.: Hygienetechnologisehe Gesichtspunkte bei der Pplanung und Überwachung von Klimaanlagen fur Räume mit besonderen Reinheitsanforderungen; Die pharmazeutische Industrie 37 (1975) 3, N. 4, p 167271.

138. Kruger D.: Die Bedeutung der Remraumtechnik für die Pharmaproduktion und Qualitätssicherung; Reinraumtechnik 1, SRRT, Zurich (1973), p 167-171.105

139. Malmquist W., Nyindo M., Brown C. East Coast fever: cultivation in bovine spleen cell lines infected and transformed by Theileria parva. Trop. Animal Health and production, 1970, N2, p.139-145.

140. Malmquist W., Brown C. Establishment of Theileria parva-infected lymphoblastoid cell lines using homologous feeder layers. Res. Vet. Sci., 1974, v.16, Nl,p.l34-135.

141. Melchert H., Preis W., Schafer E.: Staubfreies Arbeiten bei der Entwicklung von Arzneimittein; Die Pharmazeutische Industrie 45 (1983), p 812-814.

142. Mchardy N., Haigh A., Dolan T. Chemotherapy of Theileria parva infection.-Nature, 1976, N 5562, p.698-699.

143. Mckeehan, W.L. Mckeehan K.A., Hammond, S.L., and Ham, R.G. Improved medium for clonal growth of human diploid fibroblasts. In vitro 13, 399-416. 1977).

144. McLimans, W.F. The gaseous environment of the mammalian cell in culture. In "Growth Nutrition and Metabolism of Cells in Culture, Vol.1, pp 137-170, 1972.

145. Morzaria S.P. Nene V. Bovine theileriosis: Progress in immunization methods.- Intern . J. anim Sc. 1990. Vol.5, N1 Pl-14.

146. Morzaria S.P.; Nene V. Bovine theileriosis: Progress in immunisation methods Успехи в разработке методов иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза. Обзор. (Кения) . 1990, 5 (1) р. 1-14.

147. Moulton J., Kreuss Н., Melnqaiat W. Transformation of reticulum cells to lymphoblasts in cultures of bovine spleen infected with Theileria parva. Lab. invest., 1971, N 24, p. 187-196.106

148. Munyua W., Mugera G., Bitakaramire P. Pathogenesis and pathology of east coast fever induced by irradiated ticks,- Bull, Epizoot. Diseases Air., 1973v.21, N 1, p.75-85.

149. Moore, G. E., Hasenpusch, P., Gerner, R. E., and Burns, A. A. A pilot plant for mammalian cell culture. Biotechnol. Bioeng. 10,1968, p. 625— 640.

150. Nilsson, K., Scheirer, W., Merten, O.-W., Ostberg, L., Liehl, E., Katinger, H. W. D., and Mosbach, K. (1983). Entrapment of animal cells for production of monoclonal antibodies and other biomolecules. Nature (London) 302, 629—630.

151. Pearson Т., Lundin L., Dolan Т„ Stegg D. Cell-mediated immunity to Theilerie-transformed cell-lines. Nature. 1979, v.281, N 5733t p.678-680.

152. Pipano E. Bovine theileriosis in Israel Тейлериоз крупного рогатого скота в Израиле. р. 79-87 Rev. scient. techn. Off. Intern. Epizoot, 1989; T. 8. N 11,31(3/4).

153. Pipano E., Tsur I. Expenmental immunization against Theileria annulata with a tissue culture vaccine. Refuah Vet., 1966, N 23, p. 188-194

154. Pipano E. Immunological response to killed Theileria annulata schizonts in calves. J. Protozool., 1969,16 (Suppi), P.37.

155. Pipano E., Klopfer U., Cohen R. Inoculation of cattle with bovine lymphoid cell lines infected with Theileria annulate. Res. Vet. Sci., 1973, v.15, N 3, p.388-389

156. Pipano E. Immunological aspects of Theileria annulata Infection. Bull. Office Int. Epizoot., 1974, v.81. N 1-2, p. 139-159

157. Pipano E. Basic priciples of Theileria annulata control. Theileriosis. Report of a workshop held in Nairobi, Kenya, 7-9 December 1976.107

158. Pipano E., Goldman M., Samish M., Priedhoff К. Immunization of cattle against Th. annulata using killed schizont vaccine, Vet. Parasitol., 1977, v.3, pi 1-14.

159. Pipano E., Samish M., Kriegel Y., Yeruhem I. Immunization of Friesian cattle against Theileria annulata by the infection-treatment method, Brit, vet, J., 1981, v,137,N 4, p 416-420.

160. Pipano E. Bovine theileriosis in Israel Тейлериоз крупного рогатого скотав Израиле. Rev. scient. techn. Off. Intern. Epizoot, 1989; T. 8. N 1 p. 79-87

161. Pirie H., Jerrett W. Grighton G. Studies on vaccination against East coast fever using macro-schizonts, Exp. Parasitol., 1970, v.27, N 3, p.343-349.

162. Purnell R. Vaccines against piroplasms. Sympos. Brit. Society for Parasitology, 1980, К 18, p.25-55

163. Pollard D.M. And Stenbridge E.J. Anchorage independent growth of normal human fibroblasts. Iros. Watt. Acod. Sci. USA, 38,1981, p. 3053-3057.

164. Radley D., Brown C., Burridge M. Cunningham M., Kirimi Т., Purnell R., Young A. East Coast fever: 1. Chemoprophylactic immunization of cattle against Theileria parva (Muguga) end five theileria! strains. Vet. Parasitol., 1975, 1, N 1, p.35-41.

165. Radley D., Brown C., Cunningham M., Kimber C., Musisi F., Purnell R. East Coast fever: 3 Chemoprophylactic immuniztion of cattle using oxytetracycline and a combination of theilerial strains. Vet. Parasitol., 1975, v.l, p.51-60.

166. Ramkrishna D. Statistical models of cell populations. Advanc. Biochem. Ehg.-2.-1979.-P.1-47.

167. Richtlinien der IKS vom 13 Mai 1982 betreffend die Herstellung von Arzneimittein in verwendungsfahiger Form; Interkantonale Kontrollstelle fur Heilmittel IKS, Berne, Switzerland.

168. Rightsel. W. A., McCalpin, H., and McLean, I. W. Studies on large-scale methods for propagation of animal cells. J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng. 2, 1960, P.313—325108

169. Robson I., Pedersen V., Odeke G., Kamya E., Brown C. East coast fever immunization trails in Uganda: field exposure of zebu cattle immunized with three isolates of Theileria parva. Trap. anim. Health Product., 1977, v.9, N 4, p.219-231.

170. Roels J.A. Energetics and Kinetics biotechnology. Elsevier Biomedical, Amsterdam, 1983.

171. Samantaray S., Bhattacharyulu Y., Gill В, Immunization of calves against bovine tropical theileriosis (Th. annul ata) with graded doses of sporozoites and irradiated sporozoites. Int. J. Perasitol., 1980, v. 10, N 5-6, p.355-358.

172. Schrender В., Silayo R., Uilenberg G., Mpangala C., Sanga H. Studies on thelleriidae (sporozoa) in Tanzania, VI, Second field trial on immunization against cattle theileriosis. Tropenmed. und Paraeitol., 1977, v.28, N I, p.26-34.

173. Schatzmann H.: Manufacture of sterile products official aspects;Swiss Pharma 5 (1983) 1 la, p 23-25.

174. Schuier E., Arpagaus G.R.: Beispiel einer Anwendung dersterilen Fergtigung von hitzelabilen Infusionslasungen; VDl-Berichte, Nr 386. VdiVerlag Dusseldorf(1980), p 221-224.

175. Sergent Ed., Donation A., Parrot L., Lestoquard F, Plantureux E., Ducros-Rougebief H. Les piroplesmoses bovine. Inst. Pasteur d Algeria, 1945, v.23f p.816-819.

176. Singh D., Jagedish S. Gantam 0. Immunization against bovine tropical Theileriosis, using Coirradiated infective particles of Th. annulata derived from ticks, Arner. J. Vet. Res., 1979, v.40, N 6, p.767-769.109

177. Srivastava P., Sharma N. Studies on the potential of immunoprophylaxis using Theileria annulata attenuated by cobalt-60 irradiation in bovine lymphocytes. -Vet. Parasitol.,1977, N 3t p.23-31.

178. Stagg D. Brown C. Crawford J., Kanhai G., Young A, In vitro cultivation of Theileria lawrencei-infected lymphoblastoid cell lines derived from e buffalo (Syncerus caffer). Kes. Vet. Sci., 1974, v.16, N 1, p.125-127.

179. Stagg D., Kanhei G., Young A, Brown C. Theaestablishment of Theileria-infected cell lines from an eland (Taurotragus oryx, Lydekker, 1906). Res. Vet. Sci., 1976, v.20, W 2, p,122-126.

180. Subramanian G., Ueitheni R. Immunization against bovine tropical theileriasis. Asian congress of parasitology, I Abstracts, Bombay, 1978, p.60

181. Subramanian G.; Bansal G.C.; Ray D.; Srivastava R.V.N. Effect of live schizont (Theileria annulata) vaccine in neonatal crossbred bovines Оценка эффективности применения живой вакцины, приготовленной из шизонтов110

182. Theileria annulata, для иммунизации новорожденных помесных телят. (Индия) . Indian J. anim. Sc, 1989; Т. 59. N 1. p. 9-13

183. Shukla P.C.; Sharma R.D. Immunization of bovine calves with culture vaccine against Theileria annulata Иммунизация телят культуральной клеточной вакциной против Theileria annulata. (Индия) . Acta Veter. Brno, 1991; Т. 60. N 11991,60(1): p. 79-86.

184. Shukla P.C., Sharma R.D. Immunization of bovine calves with cultural vaccine against Theileria annulata. Acta veter. Brno. 1991. Vol. 60.60 N 1, P. 7986.

185. Suzuki, Ollis D.F. Cell cycle model antibody production. Biotechnol and Bioeng. 34.-1989.-p. 1398-1402.

186. Subramanian G., Bansal G.C., Ray D., Srivastana R.V. N Effect of rive schizonc (Tueileria annulata) vaccine in. Neonatal crossbred boviness. Indian Journal if Animal Sci.,V59.

187. Telling, R. C., and Radlett, P. J. (1971). Large scale cultivation of mammalian cells. Adv. Appl. Microbiol. 13, 91-—119.

188. Theiler A., Stockmen S. Further experiments to determine how long an area remains infected with East Coast fever, -J. Сотр. Path, and Therap., 1905, v. 18, N 2, p.l 63-171.

189. Theiler A, The immunization of cattle against East coast fever, 2 Rep. Director Vet. Research Dept. Agric. Union South Africa (1912) p.266-308.

190. Tolbert, W. R., Peder, J., and Kimes. R. C. Large-scale rotating filter perfusion system for high density growth of mammalian suspension cultures. In Vitro 17, 1981, 885—890.

191. Tolbert W.R. Hitt M.U. (1980) Cell aggregate suspension culture for large-scale production of biomolecules in vitro 16, p 486-490.

192. Tsur I., Neitz W., Pols J, The development of Koch bodies of Theileria parva in tissue culture. Refuah vet., 1957. Y.14. N 1.

193. Tsur I., Adler S. Cultivation of Theileria annulata schizonts in monolayer tissue cultures. Refuah vet, 1962, N 19, p.224-225.

194. Tsur-Tchernomoretz I. The Preimmunization against Piroplasmos in Cattle, -Refuah vet., 1941, vi, N 7 p. 147-152.

195. Tsur-Tchernomoretz I. Multiplication in vitro of Koch bodies of Theileria annuleta. Nature, London, 1945, N 156, p.391.

196. Tsur-Tchernomoretz I. The Chemotherapy of Piroplasma. Refuah vet., 1946, v,3,N2, p.45-62.

197. Tsur-Tchernomoretz I. Multiplication in vitro of Koch Bodies of Theileria annuleta. Refuah vet., 1947, v.4, W 2, p.86-88,

198. Tsur-Tchernomoretz I. Immunization against Th. annulata. Refueh vet., 1949, К 5, p.69.

199. Tsur I., Dreyfus S. An Outbreak of Theileriasis. -Refuah vet., 1953, v. 10, N 3, p.135

200. Tsur I., Zaga. I. Problems of Piroplasms in Israel. Refuah vet., 1955. N 12, p.243.

201. Typprufung von Schwebstoffiltem; Deutsche Industrienonn DIN 24 184 (Bee. 1990).

202. Uilenberg G., Sahrender В., Silayo R. Immunization against East coast fever -Tick-borne diseases and their vectors, 1978. p.307-314.112

203. Van den Ende M., Ediinger E. Culture of bovine lyaphocyte cell lines parasitized by Theileria annulata. Vet. Bull., 1971, N 41, p.844.

204. Wagner G., Duff us D., Buixidge M. The specific immunoglobulins response in cattle immunized with isolated Theileria parva antigens, Parasitology, 1974, V.69, N1, p.43-53

205. Wilde J. East Coast Fever. Adv. vet. Sci., 1967, N 11, p.207-259.

206. Wyltie.AH., Kerr. J. F.R. , Curris A. R. Cell death: The significance of appoptosis. Int. Rev.- Cytol. -68.-1980.-p. 151 -303.

207. Young A., Brown C. Burridge M., Cunningham M, Kirimi I., Irvin A, Observations on the cross-immunity between Theileria parva (Mugyga) in cattle. -Int, J, Parasitol,, 1973, v.3, N 6, p.723-728.

208. Young A., Brown C., Burridge M. Grootenhuis J., Kanhai G., Purnell R., Stagg D. The incidence of Theilerial parasites in East African buffalo (Syncerus caffer), Tropenmed, und Parasitol., 1978, Bd.29, N3 p.281-288.

209. Young A.S., Leitch B.L., Dolan T.T. Evaluation of inflection and treatment methods in immunization of improved cattle aganst theileriosis in an endemic area of Kenya.- Veter. Parasitol., 1990. Vol.35, N 3, P. 239-257.

210. Yan A., Pardee A.B. Exponent 3T3 cells escape in midge from their high serum requirement//Exp.Cell Res., vol.116, 1978, P. 103-113.

211. Zwerner. R. K., Runyan, C. Cox, R. M., Lynn, D., and Acton, R. T. (1975). An evaluation of suspension culture system for the growth of murine lymphoblastoid lines expressing TL and THY-1 alloantigens. Bio. technol. Bioeng. 17, 629—657.113

Информация о работе

Васько, Валерий Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 1999
ВАК 03.00.23

Диссертация

Усовершенствование технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы