Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические и морфологические исследования раннего эмбриогенеза при получении зародышей крупного рогатого скота in vitro

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические и морфологические исследования раннего эмбриогенеза при получении зародышей крупного рогатого скота in vitro"

-1 - -

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

КОВТУН СВІТЛАНА ІВАНІВНА

УДК 636.2:591.391/392:578.083

ЦИТОГЕНЕТИЧШ ТА МОРФОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ РАННЬОГО ЕМБРІОГЕНЕЗУ ПРИ ОДЕРЖАННІ ЗАРОДКІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ IN VITRO

03.00.15-генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

с. Чубинське, Київської області 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кузнецов Валерій Євгенович Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське, Київської області, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Коновалов В’ячеслав Сергійович

Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське, Київської області, головний науковий співробітник лабораторії генетичних основ селекції

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Стефанович Ганна Володимирівна Український науковий гігієнічний центр МОЗ України, Центр медичної генетики НАН та МОЗ України, м.Київ, завідувач лабораторії генетики раннього розвитку людини

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН

України, м.Київ, відділ біохімічної генетики

Захист відбудеться. -/гоп» р. о іР _годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення

і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська обл., Бориспільський район, с.Чубинське, вул.Погребняка, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН.

Автореферат розісланий “// ” 2000р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат сільськогосподарські наук, старший науковий І : І X співробітник (Ху^

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Методи дозрівання і запліднення in vitro ооцитів корів, культивування ранніх зародків поза організмом, разом з розробленою останнім часом методикою багаторазового вилучення незрілих ооцитів з яєчників живих генетично цінних корів і телиць за допомогою трансвагінальної пункції антральних фолікулів під контролем ультразвуку (ovum pick-up - OPU), дають можливість отримати більше придатних для нехірургічної трансплантації морул-бластоцист великої рогатої худоби та телят від одного донора порівняно з їх одержанням у схемах МОЕТ (multiple ovulation and embryo transfer), суттєво підвищити генетичний прогрес у скотарстві [Lohuis М.М., 1995; Smorag Z. е.а., 1998; Kruip Т.А.М., 1998]. Поряд з цим, аналіз літературних даних свідчить, що невисокий рівень одержання бластоцист великої рогатої худоби поза організмом, їх знижене приживлення після пересадки реципієнтам та гірша виживаність таких заморожено-відтанутих зародків порівняно з зародками, отриманими in vivo, обмежують можливість застосування цієї методики у відтворенні тварин [Massip А. е.а.,1994; VanSoom А. е.а., 1997; Thompson J.G.e.a., 1998]. Таким чином, існує ряд проблем, які стосуються раннього доімплантаційного розвитку ссавців і потребують подальшого вивчення.

Велике значення для підвищення ефективності методики одержання зародків ссавців in vitro має розробка нових та удосконалення існуючих молекулярно-цитогенетичних методів аналізу доімплантаційного розвитку зародків [Verlinsky О. е.а., 1998]. Одним із таких підходів є диференційне забарвлення хромосом ооцитів і зародків сільськогосподарських тварин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Інституту розведення і генетики тварин УААН по завданнях: “Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження високоцінних сільськогосподарських тварин” 1991-1995 pp. (№ держреєстрації UA01001476P); “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів у селекції сільськогосподарських тварин” 1996-2000 pp. (№ держреєстрації 019U016325), а також була підтримана грантом Міністерства України в справах науки і технологій № 0198U002131 (1997-1999 pp.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було удосконалення методів одержання in vitro зародків великої рогатої худоби, здатних до розвитку поза організмом до стадії морули-бластоцисти, дослідження

особливостей мейозу у корів та раннього доімплантаційного розвитку зародків в умовах in vitro, вивчення цитогенетичних та морфологічних характеристик ооцитів та зародків у великої рогатої худоби.

Згідно з метою були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити цитогенетичні особливості мейозу у корів в умовах in vitro, вплив тривалості культивування та додавання гранульози на ядерне та цитоплазматичне дозрівання ооцитів, частоту і типи хромосомних аберацій у мейозі.

2. Дослідити вплив видалення сім’яної плазми перед заморожуванням, додавання РНЕ у середовище співкультивування гамет на запліднення ооцитів корів in vitro.

3. Встановити ефективність використання для запліднення поза організмом сперматозоїдів з епідидимісів та вибракуваних еякулятів бугаїв.

4. Вивчити вплив деяких факторів на ефективність розвитку зародків великої рогатої худоби in vitro.

5. Удосконалити спосіб диференційного С-забарвлення хромосом для ооцитів та зародків великої рогатої худоби різних стадій розвитку, отримати придатні для аналізу препарати мейотичних хромосом ооцитів та метафазних хромосом зародків, одержаних in vitro.

6. Вивчити ефективність надшвидкого заморожування зародків кроля та великої рогатої худоби у розчині ЕФС40.

Наукова новизна роботи. Показана можливість використання вибракуваної (за концентрацією та рухливістю сперматозоїдів) нативної сперми бугаїв-плідників для одержання зародків великої рогатої худоби in vitro. Доведено, що видалення сім’яної плазми перед заморожуванням сперматозоїдів бугая значно покращує ефективність запліднення поза організмом. Вперше проведено порівняльний аналіз ефективності запліднення і дроблення яйцеклітин, розвитку зародків поза організмом до стадії морули-бластоцисти при використанні епідидимальних (свіжоотриманих, таких, що короткочасно зберігались при +4°С, та кріоконсервованих) та заморожено-відганутих еякульованих сперматозоїдів бугаїв, отримана тільність після попарної пересадки реципієнтам десяти ембріонів, одержаних in vitro з використанням епідидимальних сперматозоїдів. Встановлено, що середовище Менезо Б2 забезпечує більш повноцінний розвиток зародків великої рогатої худоби in vitro порівняно з середовищем 199. Доведено, що культивування зародків великої рогатої худоби на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів можна здійснювати у середовищі 199 без додавання фетальної сироватки теляти або бичачого сироваткового альбуміну.

з

Встановлено, що для отримання придатних для цитогенетичного аналізу метафазних пластинок 2-6-клітинних зародків та морул-бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro, більш доцільно застосовувати різні концентрації колхіцину. Вперше отримано С-забарвлені хромосоми ооцитів корів на різних стадіях мейозу, показано, що всі аутосоми та Х-хромосома ооцитів та зародків великої рогатої худоби містять С-сегменти центромерного гетерохроматину, Y-хромосома зародків майже повністю складається із гетерохроматину. Доведено, що вітрифікаційний розчин ЕФС40 забезпечує високу життєздатність заморожено-відтанутих 8-16-клітинних зародків кроля.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена та удосконалена методика одержання морул і бластоцист великої рогатої худоби in vitro, в тому числі при використанні епідидимальних сперматозоїдів бугаїв, може бути використана на племпідприємствах України. Визначення статі ембріонів з допомогою диференційного С-забарвлення мітозних хромосом може бути використано для отримання потомства бажаної статі. Заморожування ембріонів ссавців методом вітрифікації може бути застосовано для створення кріобанків зародків.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь С.І.Ковтун в одержанні наукових результатів, викладених в дисертації, становить близько 85% і полягає в зборі матеріалу за тривалий період, обробці і аналізі першоджерел літератури і власних експериментальних даних. Зокрема автором удосконалено метод диференційного забарвлення (С-метод) препаратів мейозних та мітозних хромосом, самостійно виконано аналіз цитогенетичних препаратів ооцитів і зародків, дослідження з вітрифікації зародків кролів і великої рогатої худоби, проведено статистичний аналіз, виготовлені мікрофотографії. Дисертант приймала участь у проведенні частини дослідів в лабораторії трансплантації ембріонів МП “Біосервіс” (м.Харків) та у відділі фізіології розмноження тварин Інституту зоотехніки м.Краків (Польща).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень викладені в доповідях на науково-виробничій конференції “Нові методи селекції і відтворення високопродуктивних порід і типів тварин” (Київ, 1996), міжнародній науково-практичній конференції “Теория и практика племенного дела в животноводстве” (Харків, 1996), міжнародній науково-виробничій конференції “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин” (Асканія Нова, 1997), міжнародній конференції “Проблеми індивідуального розвитку сільськогосподарських тварин” (Київ, 1997), міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми

ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва” (Львів, 1997), науково-виробничій конференції “Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин” (Київ, 1997), на II і III міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998, 1999), міжнародній науково-виробничій конференції “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин” - (Київ, 1999).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертації опубліковано в 4 статтях в наукових журналах, 2 збірниках наукових праць та 9 матеріалах і тезах конференцій. Всього опубліковано 15 друкованих праць.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методики досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Роботу викладено на 152 сторінках. Ілюстративний матеріал представлений 8 таблицями і 26 рисунками. Список літератури містить 183 джерел, з яких 136 іноземних.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК), одержували із яєчників забитих корів і культивували in vitro на протязі 24 годин. Капацитовані поза організмом сперматозоїди бугая та ооцити корів спільно інкубу-вали в модифікованому середовищі Тіроде протягом 18 годин. Капа-цитацію сперматозоїдів викликали за допомогою розчину гепарину (10 мкг/мл). Культивування зародків до стадії морули-бластоцисти проводили у середовищі на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів.

Для дослідження стану та перетворень хроматину ооцитів і ембріонів при їх культивуванні in vitro готували сухоповітряні препарати за модифікованим нами методом А.Тарковського [Tarkowski А.К., 1966] з наступним фарбуванням препаратів розчином барвника Гімза. Частину зародків культивували в середовищі з додаванням розчину колхіцину.

Для отримання диференційного С-забарвлення хромосом ооцитів корів використовували обробку сухоповітряних препаратів розчином гідроксиду барію за модифікованою нами методикою А.Т.Самнера [Samner А.Т., 1972], С-забарвлення метафазних пластинок мітозних хромосом зародків великої рогатої худоби, одержаних поза організмом, проводили за модифікованою нами методикою В.Ейвері та інш. [Avery В. е.а., 1991]. Препарати хромосом ооцитів та зародків великої рогатої

худоби після 1-тижневого “старіння” послідовно обробляли 0,2М розчином соляної кислоти, 5%-ним розчином Ва(ОН)г та розчином 2xSSC (0,ЗМ хлорид натрію та 0,003М цитрат натрію, pH - 7,0). Фарбування препаратів проводили 4%-ним розчином барвника Гімза.

Надшвидке заморожування 8-16-клітинних зародків кролів, одержаних in vivo, та 7-денних бластоцист великої рогатої худоби, отриманих in vitro, проводили у вітрифікаційному розчині ЕФС40 (40% етиленгліколю, 18% фіколу 70 і 0,3 М сахарози у PBS з 20% фетальної сироватки теляти). -

Матеріали документували мікрофотографіями. Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критеріїв Ст’юдента та Хі-квадрат [Лакін Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ Вплив деяких факторів на повноцінне дозрівання ооцитів корів in vitro

Відомо, що хромосоми незрілих ооцитів корів перебувають на різних стадіях диплотени мейозу: дифузної, фібрилярної та видимих бівалентів [Стефанович Г.В., 1988; Смирнова Т.А., 1991]. У наших дослідах найбільша кількість незрілих ооцитів корів перебувала на стадії видимих бівалентів (58,3 - 65,0%, 76/121), на дифузній стадії диплотени знаходилось найменше ооцитів (11,1 -15,0%, 16/121), кількість ооцитів із дегенерацією хромосом (в залежності від морфологічних характеристик ооцит-кумулюсних комплексів) складала 7,5 - 55,6% (35/121).

Таблиця 1

Вплив тривалості культивування ОКК на дозрівання ________________ооцитів корів in vitro_____________________

Час Всього Кількість (%) ооцитів на стадії Кількість

культи- ооци- діакінезу метафа- блоку тело- метас зази II (%)

вування ОКК (год) тів, п пізнього зи І ана- фази І фази І всього із хромосомними абераціями ооцитів із хромосомними порушеннями

24 173 1749,8) 9Ь(5,2) 643,5) 1146,4) 130= (75,1) 13г(7,5) 308(17,3)

26 141 19413,5) 241,4) 745,0) 946,4) 104' (73,7) 15г(10,6) 39427,7)

- р < 0,05, критерій %2. В цій та наступних таблицях різні суперскрипти у межах однієї колонки вказують на вірогідну різницю між показниками (Р не більше 0,05).

Відомо, що при культивуванні in vitro ооцитів корів часто

відбувається більш швидке ядерне дозрівання порівняно із цитоплазматичним [Yang X. е.а., 1993]. Деякі дослідники показали, що ефективним є дозрівання ооцитів корів in vitro протягом 22-24 годин [Galli С., Moor R.M., 1991]. З метою більш повноцінного цитоплазматичного дозрівання ми аналізували стадії мейозу ооцитів після 24 годин та після більш тривалого (26 годин) часу культивування (табл.1). Результати наших досліджень показали, що ефективнішим є 24-годинне культивування ОКК in vitro, так як така тривалість дозрівання дала можливість одержати крім високого відсотку ооцитів на метафазі II нижчий загальний рівень хромосомних порушень (надлишкова деспіралізація і дегенерація хромосом, часткове нерозходження бівалентів на уніваленти в метафазі І мейозу, блок анафази І).

Не встановлено значної різниці за частотою ядерного дозрівання до метафази II та за кількістю клітин з хромосомними абераціями на метафазі II при культивуванні ооцитів з додаванням гормональних добавок (0,5 мкг/мл ФСГ, 2 мкг/мл естрадіолу 17р та 6 Од/мл лХГ) (1 група) або клітин гранульози (3-5 х10б кл/мл) (2 група), проте у групі 2 спостерігався вдвічі менший загальний рівень хромосомних порушень (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив гормональних добавок та клітин гранульози на

дозрівання ооцитів корів в умовах in vitro

Група Всього Кількість (%) ооцитів на стадії Кількість (%)

ооцитів ооци- діакінезу метафа- блоку тело- метафази II ооцитів

тів, пізнього зи І ана- фази І всього із хромо- із хромо-

п фази І сомними порушен- нями сомними порушеннями

1 173 1749,8) 9b(5,2) 6=(3,5) lld(6,4) ізоа 1347,5) 30f(17,3)

(75,1)

2 124 12а(9,7) 6Ь(4,8) 544,0) - 101і 745,6) 10ч(8,1)

_________________________ (81,5)

f:q - Р < 0,05, критерій %2.

Наступні дослідження показали, що завдяки продукуванню клітинами гранульози специфічних білків, естрогенів, простагландинів, а також паракринних факторів росту [Кузнєцов В.Є., 1999], їх присутність дозволила отримати досить високий рівень розвитку поза організмом отриманих in vitro зародків великої рогатої внаслідок забезпечення кращого цитоплазматичного дозрівання ооцитів корів in vitro.

Ефективність запліднення ооцитів корів поза організмом в залежності від використання різних груп сперматозоїдів та методів обробки сперміїв

Нами показано, що вибракувана за концентрацією і рухливістю сперміїв нативна сперма бугаїв, не придатна (за вимогами ГОСТу 2603083) для заморожування, може бути використана для запліднення in vitro ооцитів корів. Частота отримання зигот (58,5%, 72/123 проти 31,8%, 27/85, Р < 0,001, критерій у} ) та 2-4-клітинних зародків (26,0%, 32/123 проти 12,9%, 11/85, Р < 0,05, критерій %2) у дослідній групі (вибракувана сперма бугаїв з концентрацією сперматозоїдів не менше 0,5 млрд./мл та рухливістю гамет не нижче 6 балів) була значно вище ніж у контролі (заморожено-розморожена сперма, яка відповідала за якістю за вимогами ГОСТу 26030-83 і була придатна для штучного осіменіння). Це пов’язано з тим, що застосовуваний нами метод відбору найбільш рухливих чоловічих гамет (“swim-up”), а також безпосереднє додавання сперматозоїдів до ооцитів при заплідненні in vitro дають можливість використовувати для осіменіння великої кількості яйцеклітин значно менше рухливих чоловічих гамет порівняно із осіменінням in vivo.

Доведено, що плазма сперми містить фактори (глікопротеїни), що перешкоджають капацитації та акросомної реакції сперматозоїдів внаслідок стабілізації їх мембран [Katska L. е.а., 1996]. Ми вивчали вплив видалення сім’яної плазми із еякульованої сперми бугая перед заморожуванням на одержання зародків великої рогатої худоби in vitro (табл. 3). Досліди показали, що використання таких заморожено-відганутих сперматозоїдів дало можливість одержати значно вищий відсоток ранніх зародків порівняно із сперматозоїдами, які були кріоконсервовані без попереднього центрифугування (у дослідній та конрольній групах використовували сперму одного і того ж бугая).

Таблиця З

Вплив сім’яної плазми на отримання зародків ^_______великої рогатої худоби in vitro________________

Центрифугуван- Кількість Кількість (%)

ня сперми до осіменених 2-6-клітинних пізніх морул-бластоцист

заморожування ооцитів зародків від осіменених ооцитів від 2-6-клітинних зародків

+ 254 155а (61,0) 41е(16,1) 41d (26,5)

- 258 128ь (49,6) 36' (13,6) 36* (28,1)

а:Ь - Р < 0,05, критерій у}.

Нещодавно показано, що гіпотаурин і епінефрин підвищують рухливість сперматозоїдів, пеніциламін в присутності епінефрину

підвищує кількість сперміїв, які здійснюють акросомну реакцію, кофеїн разом з епінефрином підвищують здатність сперматозоїдів до капацитації та акросомної реакції [Lim J.M. е.а., 1993; Miller G. F.e.a.,

1994]. Ми оцінювали вплив на запліднення і дроблення яйцеклітин та розвиток ембріонів великої рогатої худоби in vitro додавання до середовища запліднення 20 мкМ пеніциламіну, 10 мкМ гіпотаурину та 1 мкМ епінефрину (суміш РНЕ, І група) та 5мМ кофеїну і 1 мкМ епінефрину (II група). Встановлено (табл. 4), що додавання РНЕ значно підвищує рівень пенетрованих яйцеклітин (кількість зигот) порівняно із застосуванням кофеїну та епінефрину.

Таблиця 4

Вплив добавок до середовища запліднення на одержання

ембріонів великої рогатої худоби in vitro

Добавка Кількість Кількість (%)

до середо- осіме- заплідне- 2-4-клітинних зародків морул-

БИЩЗ. ЗаП- нених них яйце- відразу після всього бласто-

ЛІДНеННЯ ооцитів клітин 0СІМЄН1ННЯ цист

РНЕ 244 200»(82,0) 2148,6) 174=(71,3) 17f(7,0)

кофеїн, 191 128ь(67,0) 6d(3,l) 119^62,3) llf(5,8)

епінефрин

a:b - Р < 0,01; c:d - Р < 0,05, критерій х2-

Суттєво, що при застосуванні РНЕ було отримано у 2,8 рази більше ранніх 2-4-клітинних зародків відразу після спільної інкубації гамет - доведено, що ембріони, які розпочали перший поділ дроблення раніше, є більш компетентними до подальшого розвитку [Єлізарова І.Б.,

1995]. Отже, додавання РНЕ до середовища запліднення сприяє більш швидкій пенетрації сперматозоїдів у ооцити і тому прискорює початок дроблення зигот.

Нами показано (табл. 5), що епідидимальні свіжоотримані (ЕпС), короткочасно збережені при +4°С (ЕпЗб) та заморожено-розморожені (ЕпЗ) сперматозоїди бугаїв можуть бути ефективно використані для одержання морул-бластоцист in vitro. При цьому не спостерігалось вірогідної різниці за частотою запліднення та отримання зародків поза організмом між ЕпЗ-сперматозоїдами та заморожено-відтанутими еякульованими (ЕяЗ) гаметами. Після попарної трансплантації десяти морул і бластоцист, одержаних після запліднення in vitro ооцитів корів ЕпЗб-сперматозоїдами, п’яти телицям-реципієнтам, у одного реципієнта була зареєстрована тільність, яка була перервана на сьомому місяці в зв’язку з актиномікозом нижньої щелепи.

Таблиця 5.

Ефективність одержання зародків великої рогатої худоби in vitro _______при використанні епідидимальних сперматозоїдів_________

Група Кількість Кількість (%) зародків

досліду осіменених ооцитів зигот 2-б-клі- тинних 12-16-клі- тинних морул- бласто- цист

ЕпС-сперма- тозоїди 127 109а(85,8) 99d478,0) 39430,7) 34і(26,8)

ЕпЗб-сперма- тозоїди 99 80аЬ(80,8) 72^(72,7) 21hi(21,2) №>(17,2)

ЕпЗ-сперма- тозоїди 286 193467,5) 180f(62,9) 63ы(22,0) 5V49* (Ю,2)

ЕяЗ-сперма- тозоїди 252 168466,7) 118446,8) 38415,1) 23и(9,1)

* - культивування до стадії морули-бластоцисти проводилось в 1 досліді а:с, e:g, d:g, f:g, h:i, j:l - P < 0,001 e:f - P < 0,01

b:c, j:k - P < 0,05 (критерій Ст’юдента).

Дослідження впливу ряду факторів на ефективність культивування ембріонів великої рогатої худоби in vitro З метою подолання блоку дроблення зародків великої рогатої худоби in vitro використовують різні моношари соматичних клітин. Ми порівнювали ефективність розвитку зародків великої рогатої худоби, отриманих in vitro, на моношарі клітин яйцепроводів корів (ЕКЯК), яєчники яких мали ознаки свіжої овуляції, та на моношарі клітин кумулюсу. Більш високий рівень дроблення запліднених яйцеклітин спостерігався при культивуванні зигот на моношарі клітин яйцепроводів корів (75,2%, 100/133 проти 52,3%, 80/153, Р < 0,001, критерій у}). При цьому частота розвитку до стадії 12-16 клітин на цих моношарах (18,0 і 25,5% відповідно) вірогідно не відрізнялась. Нещодавно встановлено, що клітинами яйцепроводу та гранульози продукуються фактори росту, які підтримують розвиток зародків, зокрема епідермальний фактор росту, тромбоцитарний фактор росту та ін. [Yang В.К.е.а., 1993; Van Inren W.G. е.а., 1995].

Нами показано, що при застосуванні моношару епітеліальних клітин яйцепроводів корів середовище Менезо Б2 забезпечує більш високий рівень дроблення зигот і формування морул-бластоцист порівняно із середовищем 199 (табл. 6), хоча ця різниця була невірогідна.

Важливим є факт, що наявність ранніх бластоцист спостерігалась раніше при використанні середовища Менезо Б2 (на 6 день) порівняно із середовищем 199 (на 7 день), що свідчить про більш повноцінний розвиток зародків in vitro до стадії бластоцисти у середовищі Менезо Б2.

Таблиця 6

Ефективність використання двох середовищ для культивування

ембріонів великої рогатої худоби in vitro

Середовище для Кількість Кількість (%)

культивування осіменених 2-6-клітин- морул-бластоцист

зародків ооцитів них від від 2-6-

зародків осіменених клітинних

ооцитів зародків

199 218 99а (45,4) 22» (10,1) 22е (22,2)

Менезо Б2 609 312а (51,2) 79ь (13,0) 79е (25,3)

Результати наших досліджень показали, що культивування ембріонів великої рогатої худоби поза організмом на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів можна успішно проводити в середовищі 199 без фетальної сироватки теляти (ФСТ) та бичачого сироваткового альбуміну (БСА), що свідчить про те, що моношар ЕКЯК забезпечує достатні умови для розвитку зародків (рис.1).

2-4-кл. ембріони

12-16-кл.

ембріони

морули-

бластоцисти

Рис.1. Розвиток зародків великої рогатої худоби in vitro в середовищі з ФСТ, з БСА або без ФСТ та БСА, a:b - Р < 0,05, критерій у}.

Аналіз цитогенетичних препаратів зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, на різних стадіях розвитку (від стадії двох бластомерів до стадії бластоцисти) показав, що ембріони, які

прижиттєво були оцінені як морфологічно нормальні (п=380), містили лише морфологічно нормальні ядра із ядерцями. У зародків, які були оцінені візуально як дегенеровані (п=82), всі ядра або переважна їх частина були пікнотичними. Зародки (п=14), які за прижиттєвими морфологічними характеристиками мали незначні ознаки дегенерації (відставання у розвитку одного бластомера, лізис окремих бластомерів), поряд із морфологічно нормальними ядрами мали пікнотичні ядра (від 6,7% до 40% ядер). Таким чином, між прижиттєвими цитоморфологічними характеристиками зародків, отриманих in vitro, та станом хроматину ядер існує чітко виражений взаємозв’язок.

Відомо, що ефективність цитогенетичних досліджень ембріонів обмежена кількістю клітин та низьким мітотичним індексом у доімплантаційних зародків. Тому особливо важливе значення має удосконалення методики одержання придатних для аналізу препаратів хромосом зародків на різних стадіях розвитку. В наших дослідженнях ми вивчали вплив додавання різної концентрації колхіцину на ефективність формування метафазних пластинок у 2-6-клітинних ембріонів та у морул і бласгоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro.

□2-6-клітанні зародки □ морули-бластоциста Ь

70-

60' а

50- Л°- 39/71 ! (54,9) і

лЗО ■ І 20- і

10-

о.

4/9

(44,4)

0,05

мкг/мл

колхіцину

0,1 мкг/мл колхіцину

□2-6-кпітиннІ зародки □ морули-бластоцисти

Рис.2. Рівень формування метафазних пластинок в 2-6-клітинних зародках та морулах-бластоцистах ВРХ, одержаних in vitro

0,1 мкг/мл колхіцину

Рис.З. Частота формування придатних для підрахунку хромосом метафазних пластинок у 2-6-клітинних зародків та морул-бластоцист великої, рогатої худоби, одержаних in vitro, a:b - Р < 0,05, критерій

Нами встановлено, що культивування 2-6-клітинних зародків (протягом 10 годин) та у морул-бластоцист (протягом 5 годин) із 0,05

мкг/мл колхіцину є однаково ефективним для формування метафазних пластинок (рис. 2). При цьому більше половини одержаних метафазних пластинок 2-6-клітинних зародків були придатними для підрахунку хромосом, тоді як пізні ембріони містили лише 18,8% таких пластинок (рис. 3). Після культивування 2-6-клітинних зародків протягом 10 годин у середовищі з більш високою концентрацією мітостатика (0,1 мкг/мл колхіцину) спостерігалось незначне зростання частоти формування метафазних пластинок (рис. 2) і частоти формування пластинок, придатних для підрахунку хромосом (рис.З) порівняно із 0,05 мкг/мл колхіцину (Р > 0,05).

При 5-годинному культивуванні морул-бластоцист із 0,1 мкг/мл колхіцину рівень формуваня метафазних пластинок був подібним до цього показника для 2-6-клітинних ембріонів (рис. 2). Кількість морул-бластоцист, в жих сформувались метафазні пластинки після культивування із 0,1 мкг/мл або 0,05 мкг/мл колхіцину, не відрізнялась вірогідно, але за частотою формування метафазних пластинок, придатних для підрахунку хромосом, більш ефективним виявилось 5-годинне культивування морул-бластоцист із 0,1 мкг/мл колхіцину.

Цитогенетичний аналіз показав, що деякі 2-6-клітинні зародки (5,1%, 3/59) містили гаплоїдний набір хромосом, тобто походили від незапліднених активованих яйцеклітин. Серед морул-бластоцист гаплоїдних зародків не спостерігалось. Частина метафаз мітозу мала 5359 хромосом. Однією із причин відсутності в наборі окремих хромосом може бути викидання їх за межі метафазної пластинки при фіксації. Таким чином, для одержання метафазних пластинок 2-6-клітинних зародків можна використовувати 10-годинне культивування як із 0,05 мкг/мл колхіцину, так і з 0,1 мкг/мл мітостатика, тоді як для ембріонів 6го дня розвитку (з більш високим мітотичним індексом) більш ефективним є 5-годинне культивування із 0,1 мкг/мл колхіцину.

З метою більш детального аналізу структури хромосом у мейозі та мітозі, більш чіткого визначення ряду хромосомних аберацій вивчалась можливість застосування С-забарвлення хромосом ооцитів і доімплантаційних зародків у великої рогатої худоби. Нами доведено, що хромосоми ооцитів корів на різних стадіях мейозу потребують неоднакової тривалості обробки розчином гідроксиду барію при +50°С. Перебування препаратів хромосом ооцитів у розчині протягом 2 хвилин дало можливість одержати придатні для аналізу диференційно забарвлені хромосоми ооцитів корів на стадії діакінезу на рівні 70,4% (19/27). Така тривалість обробки препаратів ооцитів також виявилась

ефективного для хромосом (рис. 4) на стадії метафази І мейозу (84,9%, 28/33, Р > 0,05).

О 5 х

га .2

£5

03 О

<£ 2 Я о

2 5

Тривалість обробки розчином гідроксиду барію, хвилини

Рис.4. Одержання придатних для цитогенетичного аналізу препаратів С-забарвлених хромосом ооцитів корів на різних стадіях мейозу в залежності від часу їх обробки розчином гідроксиду барію. а:Ь, c:d - Р < 0,001, e:f - Р < 0,05, критерій у}.

При використанні 2-хвилинної обробки розчином гідроксиду барію спостерігався суттєво вищий рівень придатних для аналізу диференційно С-забарвлених препаратів ооцитів корів на стадії метафази І мейозу (рис. 4) порівняно із 5- та 10-хвилинною обробкою (Р < 0,001). 5-хвилинна обробка препаратів розчином Ва(ОН)2 виявилась оптимальною для ооцитів корів на стадії метафази II, тобто саме вона забезпечувала одержання вірогідно вищого рівня придатних для цитогенетичного аналізу препаратів С-забарвлених хромосом порівняно

з 2- та 10-хвилинною обробкою (Р < 0,001).

Наступні експерименти були спрямовані на отримання придатних для цитогенетичного аналізу С-забарвлених метафазних пластинок ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vitro. Нами встановлено, що для одержання якісних препаратів хромосом зародків, обробку розчином гідроксиду барію доцільно проводити при температурі +38°С протягом 20 та 25 хвилин. На одержаних нами диференційно забарвлених препаратах хромосом 2-6-клітинних зародків (п=27) та ранніх морул (п=16) всі аутосоми і Х-хромосома містили С-сегменти центромерного гетерохроматину, а Y-хромосома майже повністю складалась із гетерохроматину. Виходячи з ефективності визначення Y-хромосоми за С-забарвленням, ми вважаємо, що ця методика може

успішно використовуватись при розробці методів селекції зародків великої рогатої худоби за статтю та при розробці способів спрямованого одержання зародків in vitro бажаної статі.

Додаткові можливості використання зародків

сільськогосподарських тварин у біологічних дослідженнях відкриваються з розробкою надійних методів їх кріоконсервування. У попередніх експериментах ми використовували 8-16-клітинні зародки кролів як модельні, враховуючи те, що ембріони цих тварин добре піддаються кріоконсервуванню за повільним режимом. Після одноступеневої 5-хвилинної еквілібрації у вітрифікаційному розчині ЕФС40 і 48-часового культивування зародків після розморожування в середовищі Менезо Б2 з 20% ФСТ 92,3% зародків кролів досягло стадії вилупленої бластоцисти (12/13). В контролі (некріоконсервовані зародки) ефективність розвитку свіжоотриманих 8-16-клітинних зародків кролів до стадії бластоцисти складала 94,4% (17/18, Р > 0,05). При надшвидкому заморожуванні 7-денних бластоцист великої рогатої худоои після їх одноступеневої еквілібрації протягом 1,5; 2; 5 та 10 хвилин в розчині ЕФС40, тільки 1,5-хвилина еквілібрація забезпечила реекспансію порожнини у 42,9% (3/7) бластоцист та розвиток до стадії вилуплення 28,5% (2/7) бластоцист in vitro. Після 2-хвилинної еквілібрації у 28,5% (2/7) заморожено-відганутих бластоцист відбулась реекспансія порожнини і вони розвинулись до стадії експандованої бластоцисти, але розвитку до стадії вилупленої бластоцисти при цьому не спостерігалось; після 5- та 10-хвшшнного перебування бластоцист у розчині ЕФС40 розвитку зародків не спостерігалось. Можливо, для вітрифікації отриманих поза організмом бластоцист великої рогатої худоби більш оптимальною була б багатоступенева еквілібрація у менш концентрованих розчинах етиленгліколю.

ВИСНОВКИ

1. Проаналізовані стадії мейозу, частота і типи хромосомних аберацій у незрілих та зрілих ооцитах корів. Показано, що клітини гранульози в концентрації 3-5x10б кл/мл сприяють цитоплазматичному дозріванню ооцитів in vitro без гормональних добавок.

2. Нативні вибракувані за концентрацією і рухливістю сперматозоїдів еякуляти бугаїв можуть використовуватись для одержання зародків великої рогатої худоби in vitro.

3. Видалення сім’яної плазми перед заморожуванням сперматозоїдів та додавання РНЕ в середовище запліднення in vitro значно підвищує ефективність отримання зародків великої рогатої худоби поза організмом.

4. Для запліднення in vitro ооцитів корів можна використовувати епідидимальні свіжоотримані, короткочасно збережені при білянульо-вих температурах та кріоконсервовані сперматозоїди бугаїв. Не встановлено різниці за частотою одержання поза організмом 12-16-клітинних зародків та морул-бластоцист при використанні кріоконсер-вованих епідидимальних та кріоконсервованих еякульованих гамет.

5. Середовище Менезо Б2 забезпечує повноцінніший розвиток одноклітинних зародків великої рогатої худоби до стадії бластоцисти на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводу корови порівняно з середовищем 199; культивування зародків на цьому моношарі можна здійснювати у середовищі 199 без фетальної сироватки теляти та бичачого сироваткового альбуміну.

6. Цитогенетичний аналіз препаратів зародків великої рогатої худоби, отриманих in vitro, виявив наявність морфологічно нормальних ядер з ядерцями, які містили диплощний набір хромосом. Частина зародків (5,1%) мала гаплоїдний набір хромосом, деякі метафазні пластинки містили 53-59 хромосом. Зародки, які за прижиттєвими морфологічними характеристиками мали незначні ознаки дегенерації, поряд з морфологічно нормальними ядрами мали пікнотичні ядра.

7. Для одержання метафазних пластинок 2-6-клітинні зародки великої рогатої худоби можна культивувати протягом 10 годин із 0,05 або 0,1 мкг/мл колхіцину, тоді як для морул-бластоцист більш ефективним є 5-годинне культивування із 0,1 мкг/мл цього мітостатику.

8. Диференційне С-забарвлення мейотичних та мітотичних хромосом показало, що всі аутосоми та Х-хромосома ооцитів і зародків великої рогатої худоби містять добре помітні С-сегменти центромерного гетерохроматину, а Y-хромосома зародків майже повністю складається із гетерохроматину.

9. Хромосоми ооцитів корів на різних стадіях мейозу потребують неоднакової тривалості обробки препаратів розчином гідроксиду барію. Ефективність С-забарвлення метафазних хромосом зародків великої рогатої худоби розчином Ва(ОН)2 не залежала від стадії їх розвитку.

Ю.Одноступенева 5-хвилинна еквілібрація 8-16-клітинних зародків кроля, отриманих in vivo, у вітрифікаційному розчині ЕФС40 забезпечила високу життєздатність заморожено-відтанутих зародків. Для бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro, більш ефективною виявилась 1,5-хвилинна еквілібрація.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Вибракувані за концентрацією і рухливістю сперматозоїдів еякуляти

бугаїв-плідників, не придатні для заморожування, можна використовувати для одержання зародків великої рогатої худоби методом запліднення in vitro.

2. Для одержання поза організмом зародків великої рогатої худоби можна використовувати сперматозоїди, отримані з хвоста придатків сім’яників статевозрілих бугаїв.

3. Диференційне С-забарвлення хромосом можна застосовувати при розробці методів селекції зародків великої рогатої худоби за статтю.

4. Отримані дані щодо стадій мейозу та раннього доімплантаційного розвитку зародків великої рогатої худоби, частоти і типів мейотичних та мітотичних хромосомних аберацій можуть бути використані в учбових курсах університетів та інститутів з генетики та біології розвитку ссавців.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Кузнецова І.Б., Ковтун С.І., Мелешко Н.Я. Використання епідиди-мальних сперматозоїдів бугаїв для одержання ембріонів великої рогатої худоби поза організмом. //Агроінком. - 1998. - N 9-10. - С.38.

2. Кузнецова И.Б., Кузнецов В.Е., Ковтун С.И. Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro. IIБиополимеры и клетка. - 1999. - том 15, N 1. - С. 49-56.

3. Кузнецова І.Б., Кузнецов В.Є., Ковтун С.І. Особливості кріоконсервування ембріонів та ооцитів ссавців методом вітрифікації. IIВісн. аграрної науки. - 1999. - N 2. - С. 42-45.

4. Кузнецова И.Б., Кузнецов В.Е., Ковтун С.И., Мелешко Н.Я. Получение зародышей крупного рогатого скота методом оплодотворения in vitro. //Вісн. аграрної науки. - 1999. - N 10. - С. 52-55.

5. Ковтун С.І., Кузнецов В.Є. Одержання зародків великої рогатої худоби поза організмом. //Наук.вісн.НАУ. - 1999. - Вип.13. - С.55-57.

6. Кузнецова І.Б., Ковтун С.І. Одержання химерних ембріонів великої рогатої худоби in vitro. //Розведення і генетика тварин. - 1999. - Вип. 31-32. -С. 129-130.

7. Кузнецова И.Б., Ковтун С.И. Использование выбракованных эякулятов нативной спермы быков для получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. //Наук.-вироб. конф. "Нові метода селекції і відтворення високопродуктивних порід і типів тварин". - К., 1996.-С. 326.

8. Гайда Б., Ковтун С.И. Витрификация эмбрионов кроликов и крупного рогатого скота. //Междунар.науч.-практ.конф. "Теория и практика племенного дела в животноводстве". - Харьков, 1996. - С.64.

Ковтун С.І. Цитогенетичні та морфологічні дослідження раннього ембріогенезу при одержанні зародків великої рогатої худоби in vitro. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, с. Чубинське, Київської обл., 2000.

Розроблені та удосконалені методи дозрівання та запліднення in vitro ооцитів корів (у тому числі при використанні епідидимальних сперматозоїдів бугаїв), а також наступного розвитку зародків поза організмом, спрямовані на одержання великої кількості біологічно повноцінних морул та бластоцист великої рогатої худоби in vitro. Проведено цитогенетичний аналіз незрілих і зрілих ооцитів корів та зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, досліджена динаміка мейотичних та мітотичних перетворень хроматину, виявлені частота і типи хромосомних аберацій. З використанням модифікованої нами методики диференційного С-забарвлення мейозних та мітозних хромосом виявлена локалізація центромерного гетерохроматину у аутосомах та статевих хромосомах ооцитів корів на різних стадіях мейозу та отриманих in vitro доімплантаційних зародків великої рогатої худоби різних стадій розвитку. Показана можливість надшвидкого заморожування 8-16-клітинних зародків кролів, отриманих in vivo, та бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro.

Ключові слова: велика рогата худоба, ооцити, зародки,

запліднення in vitro, диференційне С-забарвлення хромосом, метафазні пластинки, надшвидке заморожування.

Kovtun S.I. Cytogenetic and morphological investigation of early embryogenesis of bovine embryos produced in vitro. - Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.15 - genetics. - The Institute of Animal Breeding and Genetics UAAS, v.Chubinske, Kyiv Region, 2000.

It had been worked out and improved the methods of in vitro maturation and fertilization of cow oocytes (as well with the use of bull epididymal spermatozoa) and following embryo development for the in vitro production of viable bovine morulae and blastocysts. It had been carried out the technique of cytogenetic analysis of immature and mature cow oocytes and bovine embryos produced in vitro; dynamics of meiotic and mitotic reorganizations of chromatin and frequencies and types of chromosome aberrations had been investigated. Localization of centromeric heterochromatin in autosomes and sex chromosomes of different meiotic stage cow oocytes and in vitro produced preimplantation bovine embryos had

been revealed with the use of chromosome C-banding technique with our modifications. The possibility of vitrification of 8-16-cell rabbit embryos produced in vivo and bovine blastocysts produced in vitro had been demonstrated.

Key words: cattle, oocytes, embryos, in vitro fertilization, C-banding technique, metaphase plate, vitrification.

Ковтун С.И. Цитогенетические и морфологические исследования раннего эмбриогенеза при получении зародышей крупного рогатого скота in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское, Киевской обл., 2000.

Диссертация посвящена разработке и усовершенствованию методов созревания и оплодотворения in vitro ооцитов коров, а также развития зародышей вне организма, направленных на получение большого количества полноценных морул и бластоцист крупного рогатого скота in vitro. Выявлено, что 24-часовое культивирование ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro и добавление клеток гранулезы в концентрации 3-5 х 106/мл обеспечивает не только полноценное ядерное и цитоплазматическое созревание ооцитов, но и более низкий уровень хромосомных нарушений. Отмечено, что выбракованную по концентрации и подвижности сперматозоидов нативную сперму быков-производителей, непригодную для замораживания, можно успешно использовать для получения зародышей крупного рогатого скота in vitro. Удаление семенной плазмы перед замораживанием сперматозоидов быков повышает эффективность оплодотворения ооцитов коров вне организма. Показано, что добавление смеси пеницилламина, гипотаурина и эпинефрина в среду оплодотворения значительно повышает уровень оплодотворения яйцеклеток и сокращает время от начала осеменения до пенетрации гамет. В результате отсутствия контакта с секретами придаточных половых желез, использование свежеполученных эпидидимальных сперматозоидов при получении зародышей крупного рогатого скота in vitro дало возможность получить высокий уровень оплодотворения яйцеклеток, дробления зигот и развития зародышей вне организма до стадии морулы-бластоцисты. Показана эффективность использования для оплодотворения in vitro хранившихся 24 часа при +4°С и криоконсервированных эпидидимальных сперматозоидов быков. Зарегистрирована одна стельность после попарной пересадки десяти морул-бластоцист, полученных после оплодотворения созревших in vitro

ооцитов коров эпидидимальными хранившимися сперматозоидами быков. Установлена высокая способность к развитию зародышей крупного рогатого скота in vitro при использовании среды Менезо Б2 и монослоя эпителиальных клеток яйцеводов коров. Использование этого монослоя дало возможность эффективно культивировать зародыши вне организма в средах без фетальной сыворотки теленка или бычьего сывороточного альбумина. Показано, что уровень получения пригодных для анализа метафазных пластинок зародышей крупного рогатого скота на разных стадиях развития зависит от концентрации колхицина и продолжительности культивирования с митостатиком. С использованием модифицированой нами методики дифференциального С-окрашивания мейозных и митозных хромосом выявлена локализация центромерного гетерохроматина в аутосомах и половых хромосомах ооцитов коров на разных стадиях мейоза и полученных in vitro доимплантационных зародышей крупного рогатого скота разных стадий развития. Метод С-окрашивания хромосом зародышей крупного рогатого скота является высокоэффективным при определении пола зародышей (Y-хромосома у крупного рогатого скота почти полностью состоит из гетерохроматина). Проведен цитогенетический анализ незрелых и зрелых ооцитов коров, зародышей крупного рогатого скота, полученных in vitro, исследована динамика мейотических и митотических преобразований хроматина, выявлены частота и типы хромосомных аббераций. Показана возможность сверхбыстрого замораживания 8-16клеточных зародышей кролика, извлеченных из половых путей самок, и бластоцист крупного рогатого скота, полученных in vitro.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, ооциты, эмбрионы, оплодотворение in vitro, дифференциальное С-окрашивание хромосом, метафазные пластинки, сверхбыстрое замораживание.