Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма"



На правах рукописи

МАЛЕНКО ГАЛИНА ПЕТРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВНЕ ОРГАНИЗМА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических ваук

Дубровицы - 2002

Работа выполнена в государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных РАСХН

Научный консультант академик РАСХН

М.И. Прокофьев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Л.П. Дьяконов

доктор биологических наук, профессор Н.С. Марзанов

доктор биологических яаук БЛ Ткшт

Ведущая организация

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина

Зашита состоится « ^ -и И к ¿'¿■■С^^ 2002 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 006(013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район,

п. Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Со: канд. биологических

на'

IV»**

1. Общая характеристика работы

Актиалънодтъ темы определяется тем, что создание надежного и экономичного источника эмбрионов крупного рогатого скота на ранних стадиях развития необходимо как для научно-исследовательских, так и для практических целей. Проведение работ на крупном рогатом скоте по созданию трапсгенных животных осуществимо только при возможности получения большого числа яйцеклеток и зигот. Для проведения работ по клонированию крупного рогатого скота также необходимы яйцеклетки в качестве цитопластов - реципиентов трансплантируемого ядра. In vivo яйцеклетки, зиготы и эмбрпоны крупного рогатого скота на ранних стадиях развития могут быть получены только хирургическим путем или при убое животных-доноров.

Реальной альтернативой получению зародышей крупного рогатого скота in vivo является технология получения зародышей in vitro. Для получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro а качестве женских гамет используются ооцнты из шггральных фолликулов яичников коров. Источником мужских гамет является глубоко замороженное семя быков. Технология получения зародышей крупного рогатого скота in vitro слагается из трех основных этапов:

• Ооцнты, выделенные то антральиых фолликулов яичника, должны пройти стадию дозревания. В этот период происходит возобновление мейоза, осуществление первого мейотического деления п «итоплазматическое дозревание ооцитов,

• Сперматозоиды быка должны пройти in vitro стадию кападитапии. В период совместного инкубирования дозревших in vitro ооцитов и капащггарованкых in vitro сперматозоидов должно произойти оплодотворение ооцитов.

• Необходимо создание системы культивирования зародышей крупного рогатого скота in vitro, обеспечивающей их развитие от зиготы до бластоцисты, с целью получения жизнеспособных эмбрпонов, пригодных для нехвруршческой трансплантации реципиентам.

Первое сообщение о ядерном дозревании in vitro оогоггов крупного рогатого скота, выделенных из антральных фолликулов, было сделано в 1965 году (Edvards, 1965). В 1978 году родился первый теленок, полученный в результате оплодотворения in vivo дозревших in vitro оодагтов (Newcomb et al., 1978), Brackett et aL (1982) впервые осуществили in vitro капацвтадию сперматозоидов и оплодотворение дозревших in vivo ооцитов крупного рогатого скота. В 1983 году были опубликованы данные о получении в нашей стране теленка при дозревании и оплодотворении in vitro яйцеклетки коровы (Эрнст и др., 1983). В 1986 году в нескольких зарубежных центрах, ц в 1987 в Экспериментальной научно-исследовательской базе "Горки Ленинские" ВНИИСХБ родились телята в результате трансплантации эмбрионов, полученных при проведении обоих этапов - дозревания и оплодотворения ооцитов - in vitro (Critser et al., 1986a; Hanada et al., 1986; Эрнстидр., 1987). Дальнейшему развитию технологии получения зародышей крупного рогатого

скота вне организма способствовала разработка методов культивирования эмбрионов in vitro.

В настоящее время технология получеши эмбрионов крупного рогатого скота in vitro является неотъемлемой частью проведения биотехнологических работ по созданию клонированных и трансгенных животных, и во многом именно она обусловливает прогресс при проведении этих работ на крупном рогатом скоте (Greve et al., 1993; líato et al,, 199S; Goto et al., 1999). Однако более низкая выживаемость полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота после замораживания - оттаивания пли проведения шгкромаштуляци й по сравнению с полученными in vivo эмбрионами свидетельствует, что методы технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro требуют дальнейшего совершенствования.

Работа выполнена в ГНУ ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных в течение 1980-2001гг. в рамках утвержденного тематического плана научно-исследовательских работ лаборатории клеточной инженерии и трансплантант эмбрионов.

Целью работы являлось создание системы получения зародышей крупного рогатого скота вне организма путем дозревания и оплодотворения оохщтов in vitro и культивирования эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты, пригодных для нехирургической трансплантации реципиентам, В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• Определить условия дозревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro для получения зрелых ооцитов, обладающих компетенцией к эмбриональному развитию.

• Усовершенствовать условия хранения, предварительной обработки и капашггации сперматозоидов из хвоста придатка семенника и замороженного эякулята быка, обеспечив аюыще высокий уровень оплодотворения ооцитов in vitro.

• Усовершенствовать условия культивирования зародышей крупного рогатого скота, обеспечивающее их развитие in vitro от зиготы до стадии расширенной и вылупившейся бластоцисты в системе, независимой от соматических клеток.

• Определить жизнеспособность полученных вне организма зародышей крупного рогатого скота при их нехирургической трансплантации реципиентам.

Нотная новизна работы. В результате проведенных исследований установлено:

• Фрагменты стенки фолликула, состоящие из теки интерны и прилегающего слоя гранулезы, при сокультивированни с комплексами оопнт - кумулюс удлиняют время мейотпческого дозревания ооцитов крупного рогатого скота и способствуют их цитоплазматическому дозреванию.

• Эпидидямальные сперматозоиды быка сохраняют жизнеспособность и оплодотворяющую способность в течение суток при хранении в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СОг, 5%Ог, 90% Ni в темноте при комнатной температуре. Они проходят стадию капацнтадин in vitro при совместном культивировании с эпителиальными клетками яйцевода или в среде при содержании гепарина 2-10 мкг/мл.

• Марка альбумина в среде оплодотворения наряду с влиянием на уровень оплодотворения и дробления ооцптов, может иметь отдаленные последствия, оказывая влияние на выход бластоцист и число клеток в составе бластоцист, то есть на качество получаемых in vitro эмбрионов. Сперматозоиды разных быков оказывают влияние на оплодотворяемость ооцитов in vitro, выход бластоцист и число клеток в составе бластоцист.

• Эффективность культивирования эмбрионов крупного рогатого скота в среде SOF не зависит от наличии нли отсутствия клеток кумулюса на zona pellucida зигот.

• При получении in vitro наиболее жизнеспособными являются эмбрионы крупного рогатого скота, доспсгшие стадии бластоцисты в возрасте 7*3 дней.

Практическая значимость работы. Усовершенствована система получения зародышей крупного рогатого скота вне организма путем дозревания и оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов in vitro без применения соматических клеток. В разработанной системе выход зародышей на стадии бластоцисты составляет окаю 30% от числа ооцитов. В возрасте 7-7.5 суток выявлялось от 75 до 95% от общего числа бластоцист, в возрасте 9-10 суток вылупились или находились в процессе вылупления из zona pellucida соответственно 57.6 н 16.0% зародышей от общего числа бластоцист. Показана необходимость тестировать марки альбумина в среде оплодотворения по уровню оплодотворения и дробления ооцитов, а также по выходу бластоцист и числу клеток в составе бластоцист. Установлена возможность хранения эпцдндкыальпых сперматозоидов быка в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СОз, 5%Оа, 90% Кг в темноте при комнатной температуре. Для хранения эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты в течение 4-10 часов предложено использовать среду Дюльбекко с добавлением 20% сыворотки крови. Разработано устройство для выделения ооцитов крупного рогатого скота без повреждения кумулюса из поверхностных аятральных фолликулов нужного диаметра. Усовершенствованы методы приготовления тотальных и суховоздушных препаратов предимплантационных зародышей крупного рогатого скота.

Ид защити выносятся следующие положения:

• Система получения зародышей крупного рогатого скота in vitro, обеспечивающая выход бластоцист на уровне 30% от числа ооцитов и вылупленне из zona pellucida около 60% полученных бластоцист при культивировании без применения соматических клеток.

• Показателями эффективности системы получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro и этапа культивирования зародышей, в том числе, являются выход бластоцист в возрасте 7-S дней, число вылупившихся бластоцист в возрасте 9-10 дней, количество клеток в составе бластоцист.

• Цнтоплазматическое дозревание ооцитов крупного рогатого скота in vitro может быть улучшено путем совместного инкубирования с фрагментами стенки фолликула, состоящими из теки интерны и гранулезы.

• Отдельные марки альбумина н составе среды оплодотворения TALP-Fert могут оказывать существенное влияние на количество и качество получаемых in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

Апоабаиия шботы. Материалы диссертации доложены и обсуждены ва 13 международных, всесоюзных и республиканских конференциях (Москва, Боровск, Санкт-Петербург - Пушкин, Москва - Дубровины, Львов, Москва -Пущино, Лион - Франция в 1980-2000 гг.}.

Ствуктира и объем работы. Диссертационная работа содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертация изложена на 228 страницах, содержит 44 таблицы, 30 рисунков, в том числе 26 фотографий. Список литературы включает 550 источников, из них 519 иностранных.

2. Материалы и методы исследований

Эксперименты по получению in vivo и трансплантации зародышей крупного рогатого скота проведены с использованием коров и половозрелых телок, содержавшихся в ОПХ "Ермолино* (Калужская обл.) и на комплексе по выращиванию нетелей "Ильино* ОППХ 'Каменка* (Московская обл.). Для вызывания суперовуляции у коров и телок применяли сывороточный гонадотропин. Извлечение эмбрионов крупного рогатого скота проводили нехирургичесюам методом. Эмбрионы трансплантировали реципиентам нехирур гическим способом в матку с помощью прибора Кассу или подсаживали осемененным животным в рог матки, противоположный яичнику с желтым телом, при помощи разработанного устройства (Черных В.Я., Прокофьев М.И., Петунипа В.М., Маленко Г.П., Кононов В.П. Авторское свидетельство №897224 от 14.09.81). Эти эксперименты, включая вымывание и трансплантацию эмбрионов крупного рогатого скота, проводились под руководством М.И. Прокофьева рабочей группой, в состав которой входили В.Я. Черных, В,М. Петувина и аетор.

Для получения семени, веоплодотворенных яйцеклеток и зародышей кролика и для последующей трансплантации зародышей ^вдатользовала кроликов породы шиншилла, содержавшихся на виварии института.

Яичники коров и суспензию ятта видима л?.™» сперматозоидов быка получали в убойном цехе Калужского мясокомбината. Замороженное семя быков получали на Центральной станции искусственного осеменения сельскохозяйственных животных (Быково, Московская обл).

Комплексы ооцит-кумулюс (КОК) из антрадьных фолликулов выделяли путем рассечения поверхности яичника лезвием безопасной бритвы или при помощи разработанного нами устройства (Маленко Г.П., Сметанина И.Г., Иванова Л.Б. Устройство для выделения оощггов из яичников млекопитающих. Положительное решение экспертов ВНИИГПЭ от 30.10.1995). Для экспериментов отбирали ооянты средней величины с мелкозернистой ооплдзмой, окруженные компактным многослойным хумулюсом. Фрагменты текн интерны фолликула с прилегающим слоем гранулезы помещали на культивирование в виде органной культуры.

Дозревание а оплодотворение ооцитов, культивирование эмбрионов крупного рогатого скота проводили при температуре 38.5-39°С.

Для доставки яичников и выделения ооцитов использовали раствор Дюльбекко (Юрьеэецветбиопрепарат, Россия) иди 0.9% раствор МаС1, для

дозревания ооцнтов среду Ham Р10 или среду 199 на буфере Эрла (Flow, Sigms, ISN). Среды TALP-HEPES для манипуляций с гаметами и эмбрионами, TALP-Fert для капацнтации сперматозоидов и оплодотворенкя оощггов (Bavister, Yanagimach, 1977; Parrish et al., 1986, 1958a), SOF для культивирования эмбрионов (Tervit et al., 1972) готовили в лаборатории на основе маточных растворов (табл. 1). Для приготовления сред использовали воду, полученную на установке Milli О, и, по возможности, реактивы категории "Embryo tested* или "Cell culture tested" (Sigma, Flukaj.

Таблица 1. Состав сред TALP-HEPES, TALP-Fcrl, SOF (mM)

Ингредиент Среда

TALP-11EPES TALP-Fert SOF

NaCI 120.0 110.1 102.3

HEPES to.o • -

KCl 3.2 3.2 7.16

CaCh 2.0 2.0 1.71

MeCII 0.49 0.49 0.49

Na лактат 10.0 10.0 зл

ÍNíIljPO, 0.4 0.4 -

KHiPft, - - 1.19

NaHCOi 5,0 25.0 25.0

Na пнруват 0.25 0.25 0J3

Гдугамми - - 1.00

Альбумин м г/мл 3.0 6.0 6Л

Феноловый красный г/300 мл 0.001 0.001 0.001

Для осуществления капавдтащга сперматозоидов и оплодотворения оошггов в среду TALP-Fert включали гепарин 10 мкг/мл, кофеин 5 мМ, пшотаурин 0,1 мМ. Во втором варианте в среду оплодотворения наряду с 10 мкг/мл гепарина включали РНЕ (D-penicillamine, hypotaurine, epinephrine, Bavister, 1989), В среду SOF включали по 1% (v/v) xlOO раствора заменимых аминокислот по рецептуре среды MEM и х50 раствора незаменимых аминокислот по рецептуре среды ВМЕ (Sigma). Среды стерядшоваш фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0.22 шсм. Среды использовали в течение 1-2 недель. Кроме того, среды TALP-HEPES и TALP-Fert расфасовывали, хранили при температуре -20°С и использовали после однократного размораживания. В состав всех сред включали геятамицнн 4050 мкг/мл.

Дозревание ооцитов проводили в течение 22-30 часов в атмосфере 5% СОз в воздухе. Сперматозоиды каиацитпровали по одному из методов; 1)использовалп среду с повышенным осмотическим давлением (Brackett; Olifant, 1975); 2)сперматозонды помещали на инкубирование с клетками слизистой оболочки яйцевода; 3)использовали среды, содержащие гепарин. Суспензию сперматозоидов добавляли до получения конечной концентрации от 1 до 12x10й сперматозоидов/мл. Ооциты инкубировали совместно со сперматозоидами в течение 16-20 час в атмосфере 5% СОг в воздухе. Для оценки этапа оплодотворения готовили тотальные препараты по

модифицированному нами методу (Malenko, 1994). Критерием нормального оплодотворения являлось образование мужского и женского пронуклеусов и присутствие хвоста сперматозоида в цитоплазме зиготы.

Зиготы вместе с прилегающими клетками кумулюса н лучистого венца культивировали в среде 199 с 10% астральной сыворотки крови в атмосфере 5% СОг в воздухе. Через 48 часов эмбрионы освобождали от клеток кумулюса, подсчитывали число дробившихся эмбрионов и оставляли их на дальнейшее культивирование над формирующимся монослоем клеток кумулюса, В среде SOF эмбрионы крупного рогатого скота культивировали в каплях под минеральным маслом (Flow, Sigma) в атмосфере 5% СОг, 5% Оа, 90% Na (Балашихкнский кислородный завод, Московская обл). Количество зародышей, развившихся до стадии бластощгсты, подсчитывали в возрасте 7*8 дней, количество вылупляющихся и вылупившихся из zona peUucida бластоцист в возрасте 9-10 д ней.

Для оценки качества эмбрионов готовили препараты по модифицированному нами методу (Маленко, 2000) и подсчитывали число клеток в составе зародышей. Для определенна жизнеспособности полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота зародыши в возрасте 8 дней на стадии морулы и бластоцисты трансплантировали нехнрургическим способом в матку телок-реципиентов. Подбор реципиентов и трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro, проведены А,Г, Логиновым. Часть полученных in vitro ооцитов, зигот и зародышей крупного рогатого скота на различных стадиях предимпланташганного развития использовалась в лаборатории клеточной инженерии и трансплантации эмбрионов ВНИИФБнП для проведения работ по клеточной и генной инженерия.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием таблиц и критерия t Стьюдента,

3. Результаты исследований

3.1. Влияние условий кратковременного хранения зародышей круаного рогатого скота на их жизнеспособность.

Для кратковременной работы с эмбрионами крупного рогатого скота на воздухе широко используется фосфатный буфер Дюльбекко. Мы провели эксперименты по хранению эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo, в течение 4-10 часов в среде Menezo В2 с использованием газовой атмосферы 5% COj, 5% Oí, 90% Кг и фосфатном буфере Дюльбекко в воздушной атмосфере при комнатной температуре и в условиях термостата. По результатам культивирования бластоцист крупного рогатого скота, выдержанных в течение 4-10 часов в растворе Дюльбекко с 20% эмбриональной сыворотки в атмосфере воздуха или в среде Menezo В2 в газовой смеси 5% СОг , 5% Оз, 90% N2 при 37°С или при 20-25°С, существенных различий в развитии эмбрионов не выявлено. Диаметр 7-дневных эмбрионов при культивировании в течение 24 часов увеличивался со 150-180 мкм до 185-220 мкм. Около 60% эмбрионов к этому времени вылупилось или начало вылупляться из zona peüucida. При подсадке во второй рог осемененному реципиенту зародышей, хранившихся в течение 4-

10 часов в среде Дюльбекко прп температуре 20-250С, приживляемость составляла 55.6%, при температуре .хранения 37°С 65.0% (табл. 2).

Таблица 2. Приживляем ость полученных ¡а у^оэмбр конов крупного рогатого скота при трансплантации после хранения в течение 4-10 часов при разных условиях

Среда хранения Газовая фаза Температура хранения Вид граненла» -га цк н Число эмбрионов п Прижилось

п %

Дюльбекко воздух 20 иодеял ка 9 5 55.6

Дюльбекко воздух 37 подсадка 20 13 65.0

Дюльбекко воздух 37 пересалка 20 9 45.0

Menezo В 2 5% СО( 37 пересалка 7 3 42.8

После инкубирования зародышей в течение 4-10 часов прп 37®С в среде Дюльбекко или Menezo В2 приживаемость при нехирургпческой трансплантации реципиентам не различалась и составляла 45,0 и 42.8%, соответственно. В целом, различий по поддержанию жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисгы в зависимости от среды Щюлъбекко с 20% сыворотки или Menezo В2) или температуры кратковременного хранения (20-25 или 37°С) не отмечено. При этих условиях с практической точки зрения предпочтительнее вариант кратковременного хранения эмбрионов в среде Дюльбекко, не требующей специальной газовой фазы для поддержания рН среды в интервале 7.2-7.4. Эта технология в последующем использовалась при транспортировке эмбрионов из лаборатории института в хозяйство в экспериментах по трансплантация зародышей крупного рогатого скота, полученных in vitro,

3.2. Совершенствование методов капэцитации сперматозоидов In vitro с использованием в качестве модели гамет кролика

Первые эксперименты по разработке методов капацитапии сперматозоидов щ vitro проводились с использованием кроликов в качестве лабораторных животных. Работая на этих животных мы могли иметь необходимое количество полноценных зрелых яйцеклеток для тестирования методов кападнтации сперматозоидов in vitro и оценивать качество капаиитащш сперматозоидов по конечному результату - оплодотворению яйцеклеток, дальнейшему эмбриональному развитию зародышей и рождению

приплода.

При разведении эякулята кролика фосфатным буфером Дюльбекко с 20% эстральной сыворотки крови наблюдалась агглютинация сперматозоидов от нескольких штук до нескольких десятков сперматозоидов в группе. Если суспензию сперматозоидов кролика, инкубированную в течение 12 часов в среде Дюльбекко с 20% астральной сыворотки крови, помещали в ампулу яйцевода крольчих спустя 12 часов после спаривания с вазэктомированнъш самцом, то есть после овуляции, оплодотворение яйцеклеток не происходило. Если суспензия сперматозоидов была помещена в яйцеводы крольчих за 2-3

часа до овуляции, то 81.0% вымытых через 42 часа зародышей были оплодотвореаы и находились на стадии морулы, При последующем культивировании in vitro морулы развивались до стадии бластоцисты.

Вероятно, при использованном режиме пинцирования сперматозоиды кролика сохраняли свою жизнеспособность, но не проходили стадию капацитации in vitro. Если овуляция происходила прежде, чем сперматозоиды были помешены в яйцевод, способность яйцеклеток к нормальному оплодотворению утрачивалась ко времени завершения капацгггадни сперматозоидов in vivo. В яйцеводе период пригодности яйцеклеток кролика к оплодотворению намного короче, чем in vitro (Viriyapanich, Bedford, 1981). В том случае, если сперматозоиды попадали в яйцевод самки за 2-3 часа до овуляции, они завершали стадию капацитации in vivo и оказывались способными оплодотворить овулировавшяе яйцеклетки.

Мы изменили систему капащггации сперматозоидов кролика in vitro. В качестве среды для капацитации сперматозоидов по методу Aknik et al, (1979) использовали среду ВО (Brackett, Oliphartt, 1975) с добавлением 20% эстральной сыворотки кролика. Суспензию сперматозоидов инкубировали в этой среде в течение 12 часов при 37°С в атмосфере 5%СОа, 5% Ог, 90% N2. Затем суспензию сперматозоидов помещали в ампулу яйцевода крольчих через 12 часов после их спаривания с вазэктомированпым самцом. К этому времени овуляция у всех животных уже завершилась. Зародыши вымывали спустя 2S-29 часов. При этих условиях уровень оплодотворения составил 58.6% (табл.3).

Если продолжительность периода капацитации сперматозоидов in vitro была увеличена с 12 до 17-1S часов, жизпеспособность сперматозоидов хорошо сохранялась, комочки агглютинировавших сперматозоидов активно передвигались в среде в течение всего периода инкубирования. Оплодотворяемость яйцеклеток при этом составила 59.1%. В то же время при инкубировании сперматозоидов in vitro в течение 20 часов оплодотворяемость яйцеклеток кролика in vivo снизилась до 46.7% (табл. 3).

Таблица з. Оплодотворен не яйцеклегок кролика in vivo при разной продолжительности периода капацитации сперматозоидов ¡в vitro в сред* ВО с 20% эстральной сыворотки крови кролика

Количество Длительность Вымыто зародышей

животных капацитации Всего Из них оплодотворено

п часы л п %

4 12 29 17 58,й±9.1*

3 17-18 22 13 59.1+ЮЛ'

2 20 15 7 46.7±!25ь

,ЬР<0.5

Таким образом, при инкубировании в среде ВО с 20% сыворотки крови при 37°С в атмосфере с 5% СО» сперматозоиды кролика проходят стадию капацитации в пределах 12 часов, и сохраняют способность к оплодотворению в течение последуюпшх 5-6 часов.

При последующем культивировании in vitro полученные 8-клеточные зародыши через 24 часа достигали стадии поздней морулы, к концу вторых суток культивирования у зародышей обозначалась полость ранней бластоцнсты. Стадии расширенной бластоцистьг зародыши достигали в возрасте 90-112 часов от момента спаривания с ваээктомнровашшм самцом. По морфологическим признакам в скорости развития зародыши кролика, полученные в результате оплодотворения in vivo сперматозоидами, калацнтпрованиыми in vitro, соответствовали зародышам прп естественном оплодотворении (Lewis, Gregory, 1929J.

При инкубировании в этой системе замороженного-оттаянного эякулята быка подвижность сперматозоидов быстро падала, и к концу инкубирования сперматозоиды обладали лишь слабыми колебательными движениями, В связи с этим ставилась задача подобрать методику капацитацин сперматозоидов in vitro, подходящую для обоих видов животных - быка и кролика - и подтвердить ее эффективность путем получения приплода после оплодотворения яйцеклеток кролика in vivo сперматозоидами, капацитнрованнымп in vitro.

С этой целью готовили среду ССМ, предложенную Mahi, Yanagimachi (1978J. Среда содержит 37.61 мМ бикарбоната натрия и имеет рН 7.8 в атмосфере с 5% ССЬ . В среду включали альбумин 20 мг/мл. Эта среда оказалась эффективной в поддержании жизнеспособности как сперматозоидов кролика, так и сперматозоидов быка при инкубировании в течение 18-24 часов при 37°С. Сперматозоиды кролика капацитировали в среде ССМ в течение 18 часов. Капацитированное семя помещали в ампулу яйцевода крольчих спустя 10-12 часов после спаривания их с вазэктомированньш самцом, овуляция у всех опытных крольчих к этому времени завершилась, В первой серии экспериментов лапаротомия на 14 день предполагаемой беременности показала присутствие по 1 имплантации у 3 крольчих из 4. Во второй серии экспериментов у двух крольчих к этому времени было 10 и 12 имплантаций, соответственно. В третьей серия экспериментов 3 крольчихи наблюдались до завершения беременности. Две из них окролились, пометы состояли из б и 8 нормально развитых крольчат.

Эксперименты, проведенные на кроликах, показали, что инкубирование в течение 12-18 часов в среде ВО или ССМ, содержащей 20% астральной сыворотки крови кроликов или альбумин 20 мг/мл, поддерживает жизнеспособность сперматозоидов, обеспечивает их капаиитацию in vitro и последующее оплодотворение яйцеклеток in vivo. В последующем эти методические подходы и приобретенный опыт работы с гаметами и зародышами кролика in vitro были использованы в разработке методов получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма.

3.3. Дозревание ооцитов крупного рогатого скота in vitro

При сокультявироваиии с кусочками теки интерны и прилегающим слоем гранулезы завершение ядерного созревания ооцитов задерживалось по времени по сравнению оощггамн контрольной группы. Через 25-26 часов культивирования на стадии метафаза II (МП) находилось 49,4 и 31.6% ооцитов контрольной и опытной групп, соответственно, тогда как на стадии

ыетафаэа I (MI) находилось 11.7 и 22.2% ооиитов этих трупп, соответственно. При удлинении срока дозревания до 27-30 часов стадии Mi и Mil в сумме достигало одинаковое число оощггов обеих групп, хоти и в эти сроки в опытной группе несколько больше оощггов находилось на стадии Ml и меньше на стадии Mil (табл. 4).

Таблица Дозревание ооцнтов при кулыппнровамии КОК в среде или при совместном культивировании с текой интерной к гранул мой фолликула

Длительность культивирования (час.) Добавление ткани Всего ооиитов в Достигнутая стадия дозревания, %

Ml МП М I + М II

25-26 - 162 11.7±2.5* 49.4±3.9С 61.1±З.У

+ 95 22Л±43Ь 5Z6±5.tf

27-28 - 102 б.9±2.5с 67.6+4^ 74.5±4.3

+ 71 2I.l±4.8d 53.5±5У 74.6±5.2

29-30 - 123 5.7+2.1' S2.S±4.5l 58.5+4.4

+ 75 9.3±3.4* 45J±5.7h 54.6±5.7

В пределах колонок *ЬР<0.05, ^<0.01, tfsbP<0.5

При дозревания ооиитов в условиях совместного культивирования с клетками гранулезы в форме ломтиков, выделенных с внутренних стенок фолликулов, или в форме суспензии, полученной при аспирировании фолликулов, было оплодотворено соответственно 67.2 и 65.8% оощггов. Первое деление дробления прошли соответственно 50.3 и 51.5% зародышей, два деления дробления прошли соответственно 40.4 и 40.5% зародышей (табл. 5). Таким образом, оплодотворяемость ооцнтов, а также первое и второе деления дробления не зависели от формы введения гранулезы в систему дозревания ооцнтов.

Таблица 5. Оплодотворяемость н раннее эмбриональное развитие зародышей в зависимости от вида и формы введения клеток стенки фолликула в систему дозревания ооиитов

Вид ткани Всего ооцнтов и Оплодотворено % Достигли стадии развития, %

2 клетки 4 клетки 8 клеток

Кусочки (ранулезы 431 67.2±2J* 50.3±2.4* 40.6±2.4С 15.2±1.7*

Суспензия гранулезы 353 65.8±2.5" 51.5*2.7* 40.5±2.6С 20.1+2.1'

Текя и гранулеза 193 77.7±3.0Ь 56-5+4.041 2б.9+3.2ь

В пределах колонок ^PiO.OI, "^<0.001, ас ^<0.1

Однако выход 8-клеточных зародышей оказался достоверно выше при включении в среду дозревания ооцитов гранулезы в виде суспензии (20.1%) по сравнению с ломтиками гранулезы (15,2%). Вероятно, различная эффективность клеток гранулезы в системе дозревания ооцитов в этих экспериментах связана не с формой введения этих клеток, а с тем, что клетки гранулезы в виде суспензия возможно были получены из фолликулов, находящихся на более поздних стадиях фолликулогенеза, Но по всем этим показателям использование теки интерны с прилегающим слоем гранулезы оказалось предпочтительнее по сравнению с введением в систему дозревания ооцитов только клеток гранулезы. В этом варианте было оплодотворено 77.7% ооцитов, 1, 2 и 3 деления дробления, соответственно, прошли 64.8, 56.5 и 26.9% ооцитов, что достоверно выше по сравнению с двумя другими вариантами дозревания ооцитов (табл. 5). Таким образом, включение кусочков теки интерны с прилегающими клетками гранулезы в систему дозревания, вероятно, способствовало цатоплазматическому дозреванию ооцитов. Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода времени поддерживает гистологическую и биохимическую дифференцировку (Ласнитски, 1989). Конечно, это более трудоемкий и затратный по времени метод. Однако его следует иметь в виду при необходимости максимально увеличить выход полноценных эмбрионов ш vitro на ранних стадиях развития.

Наибольший положительный эффект на дозревание ооцитов оказывает гранулеза из здоровых предо вуляторньгх фолликулов. На практике найти предовуляторный фолликул во время выделения ооцитов из яичников практически невозможно. Более простой метод состоял в инкубировании ооцитов в маленьких каплях среды под маслом. При дозревании 10-20 КОК в каплях 100 шел под маслом в газовой фазе 5% СОз, 5% Оа, 90% N3 ооциты к концу 24-часового периода культивирования оказывались с темной ооп-лазмой и темным кумулюсом. Избежать этого оказалось возможным, заменив газовую' фазу на 5% СОл 20% Оа, 75% Na. Большая часть ооцитов, дозревавших в каплях под маслом при использовании газовой фазы 5% СОз, 20% Оа, 75% N2 была нормально оплодотворена (80.8%), тогда как при дозревании в газовой фазе с 5% Ог оплодотворилась лишь незначительная часть ооцитов - 27.2% (табл. 6). В последующих экспериментах мы проводили дозревание ооцитов при использовании газовой фазы, содержащей 20% Ог,

Таблица е. Влияние концентрации кислорода s газовой фазе при дозревши к ооцитов в каплях под маслом на их оплодотворяемость

Концентрация кислорода, '/а Всего ооцитов а Оплодотворено %

5 И %72±13А*

20 26 80,8+7.7*

,ЪР<0.01

Дозревание ооцитов в каплях иод маслом было использовано нами как альтернатива системе сокультивирования с соматическими клетками стенки фолликула. По дроблению и выходу зародышей иа стадии морулы и бластоцисты самые высокие показатели 46.5% и 12.7%, соответственно,

были получены при дозревании ооцитов в каплях под маслом, а самые низкие 31,0 н 6,8%, соответственно, при дозревании ооцитов в большом объеме среды без добавления клеток гранулезы. В то же время в возрасте 8-10 дней пригодными для трансплантации по морфологическим признакам были признаны около 19% от числа дробившихся зародышей (50/264), и этот показатель не зависел от условий дозревания ооцитов (табл. 7).

Таблица 7. Развитие зародышей крупного рогатого скота до стадии морулы н бластоцнсты при разных условиях дозревания ооцитов

Условия дозревания Всего ооцнтов п Дробилось % Морула и бластоцвста Хорошего качества

п % 0 %*

Б« гранулезы 325 31.042.fi1 22 19 18.8

С гранулезой 379 из±гль 33 S.7±1.4' 25 19.2

В каплях 71 46.5±5,9С 9 12,7+4.0' 6 18.2

*Г<0.02, "'PcO.l, *р<02,"" ♦от числа дробившихся заро Р<.0.5 пышей

После установления необходимости применения газовой фазы с 20% Oj для дозревания ооцитов s каплях под маслом и при совершенствовании всех этапов технологии получения зародышей крупного рогатого скота in vitro мы вновь провели эксперименты по дозреванию ооцитов в каплях и в большом объеме среды. В этих экспериментах ооцнты, дозревавшие в чашке в объеме 2.5 мл среды или при размещении 10-20 КОК в капле среды объемом 100 мкл под маслом дробились после оплодотворения практически одинаково: 53.8 и 55.6%, соответственно. До 4-клеточной стадии развивалось несколько больше ооцитов, дозревавших в капле под маслом: 43.1% против 40.0%, соответственно (табл. 8),

Таблица 8. Раннее эмбриональное развитие зародышей после дозревание ооцитов в чашках в объеме 2.5 мл или в каплях среды под маслом

Условия дозревания Всего ооцнтов п Дробилось % Получено 4-клеточных зародышей

п %

2.5 мл 413 53.8+2.4 165 40,0+2.4*

Капля 462 55.6±2J 199 43.1±23ь

*Р<0.5

Вместе с тем по результатам развития зародышей до бластодагсты дозревание в большом объеме среда без добавления клеток гранулезы оказалось даже несколько предпочтительнее. Выход бластоцнст составил 22.0 и 27.6% при дозревании ооцитов в каплях под маслом или в большом объеме среды, соответственно (табл. 9). Следует отметить, что к этому времени повысилась эффективность всей нашей системы получения эмбрионов

крупного рогатого скота in vitro, вероятно за счет совершенствования отдельных этапов технологии и приобретения определенного опыта в целой.

Таблица 9. Влияние условий дозревания ооцнтов на развитие зародышей крупного рогатого скота до стадии бластоцисты

Условия дозревания Всего ооцитов п Получено бластоцист

(i %

2.5 мл 217 60 27.6±3.0*

Kin.it 272 60 22.0±2.5Ь

Р<0.2

Таким образом, ооциты с неповрежденным плотным многослойным кумулюсом успешно дозревают в комплексной среде 199, обеспечивая выход бластоцист свыше 20% без дополнительного введения клеток гранулезы в среду дозревания. Это упрощает и увеличивает воспроизводимость этапа дозревания ооцитов вне организма.

В Актированных яйцеводах кроликов проведено культивирование 605 оощггов крупного рогатого скота. Вымыто после культивирования 64.5% оощггов. При культивировании оощггов крупного рогатого скота в яйцеводе кролика происходит возобновление мейоза. Стадии МП с выделением первого полярного тельца достигало за 24 часа культивирования в разных экспериментах от 42 до 75% ооцитов. Эта эксперименты по дозреванию ооцитов крупного рогатого скота в яйцеводе кролика мы проводили на первом этапе работы в 1981 году, когда еще не представлялось возможным оценить их способность к оплодотворению it эмбриональному развитию.

Растущие фолликулы должны достигнуть минимум 3-4 мм в диаметре для приобретения ооцитом способности отвечать на сигналы развития (Sirard, Blondin, 1996). При дозревании и оплодотворения ооцнтов in vitro и последующем культивировании зародышей до бластоцисты развивалось 43.1% интактяых КОК, 27.1% ооцитов, имевших 4-5 слоев клеток кумулюса и только 12.6 и 0% ооцитов, имевших 2-3 слоя клеток кумулгоса или денудированных, соответственно (Yang, Lu, 1990). Для увеличения выхода наиболее подходящей для дозревания популяции ооцитов с неповрежденным кумулюсом из поверхностных антральных фолликулов заданного диаметра мы усовершенствовали метод выделения ооцитов (Маленко Г.П., Сметанияа И.Г., Иванова Л.Б. Устройство для выделения ооцитов из яичников млекопитающих. Положительное решение экспертов ВНИИГПЭ от 30.10,1995).

На поверхности яичников в среднем насчитывается по 22.0 антральных фолликула диаметром 2-6 мм. При использовании разработанного устройства из 68 яичников было выделено 1238 ооцитов, то есть по 18.2 ооцита в расчете на 1 яичник. Было отобрано 905 ооцитов с мелкозернистой ооплазмой, окруженных плотным многослойным кумулюсом, что составило 73.1% от числа всех выделенных оодагтов. Таким образом, получено на 1 яичник по 13.2 комплексов ооцит - кумулюс, пригодных по морфологическим признакам для дозревания in vitro (табл. 10).

Таблица to. Эффективность выделения ооцнтов крупного рогатого скота hi поверхностных а игральны); фолликулов янчцика с помощью разработанного устройства

Количество Количество Выделено ооцитов Отобрано КОК

яичников фолликулов на 1 яичник

на 1 яичник На 1 яичник Ог выделенных

п М±т М % М %

21 17.7±1.7 17.1 96.5 12.3 74.8

13 23J±l,6 19.2 80.8 14.2 74.0

1« 31.2*2.4 26.2 84.4 20.0 76-3

18 17.4±3.2 11.6 66.7 6.9 59.5

Всего 68 22.0±1.4 18.2 82.3 13.2 73.1

Наличие в устройстве режущего кончика позволяет избирательно вскрывать выбранные фолликулы, не вырезая их предварительно из яичника. Выступ с закругленными углами обеспечивает выделение ооцнтов с неповрежденным кумулюсом из вскрытых фолликулов. Размещение этих функциональных частей на одной рабочей стороне делает устройство удобным и высокопроизводительным. Применение разработанного устройства позволяет выделять оощггы дифференцированно из аатральных фолликулов заданного диаметра не повреждая кумулкка комплексов ооцит - кумулюс.

3.4. Капацитация сперматозоидов и оплодотворение ооцнтов крупного рогатого скота in vitro.

Первые эксперименты по in vitro оплодотворению дозревших in vitro ооцнтов крупного рогатого скота мы провели в 1983-1984 годах с использованием эпцдидвмальных сперматозоидов быка. Суспензию сперматозоидов из хвоста придатка семенника половозрелых быков помешали в виде капелек на дно пенициллинового флакона, содержащего 1-2 мл минерального масла. В лаборатории флаконы заполняли газовой смесью 5% COzi 5% Oi , 90% Ni и хранили в течение суток в темном месте при комнатной температуре. Жидкость протока придатка семенника имеет кислую реакцию рН 5.55-6.42, электропроводность жидкости придатка примерно в 10 раз ниже электропроводности жидкости семенника. В результате сперматозоиды в придатке семенника сохраняются в течение длительного времени (Мнлованов, 1962), При сборе "сухой" суспензии сперматозоидов из хвоста придатка семенника быка (без применения разбавителей) фактически не менялось окружение сперматозоидов, что обеспечивало хранение их в состоянии пониженной активности. Атмосфера 5% СОа, 5% Оз и 90% N2 в целом соответствует соотношению газов в тканях тела и способствует поддержанию рН на необходимом уровне. Минеральное масло предотвращало испарение вода из капелек суспензии в течение периода хранения, что очень важно для поддержания осмотического давления в физиологических границах при работе с такими маленькими объемами (5-10-50 мкл).

В первых экспериментах при использовании эпидидимальных сперматозоидов быка оплодотворение натнвных БОК после дозревания in vitro не происходило (0/83). Если у КОК перед оплодотворением клетки кумулюса удаляли с помощью 0.1% раствора гналуронидазы, a zona pellucida размягчали 0.1% раствором проназы и удаляли пипетированием, было оплодотворено 14% ооцитов (18/129). В экспериментах с использованием замороженной спермы оплодотворения ооцитов не было независимо от наличия (0/71) или отсутствия (0/39) у ооцитов zona pellucida.

В последующих экспериментах 55.8% ооцитов, освобожденных от zona pellucida, были оплодотворены эпидддимальными сперматозоидами быка, кападатировапными in vitro, в том числе около 11% были пеяетрнрованы более чем одним сперматозоидом (табл. 11). Большинство оплодотворенных ооцитов имели нормально сформированные мужской и женский пронуклеусы.

Таблиц* 11. Оплодотворен не ооцитов крупного рогатого скота энидиди мяльными сперматозоидами в зависимости от наличия оболочек оошгга

Состояние ооцитов Всего ооцнтов п Оплодотворено % В том числе полиспермия %

Без ободочек 276 55.S+3.0* 10.9±1.9<

КОК 167 И.б±33ь l.eil.0"

Р<0,01, "'PcO.OOl

В этой серии экспериментов впервые были оплодотворены дозревшие in vitro ооциты, поставленные на оплодотворение как комплексы ооцнт -куыулюс, хотя их оплодогворяемость оказалась примерно в два раза ниже по сравнению с ооцитами, освобожденными от блестящей оболочки (табл. 11). Проведенные эксперименты подтвердили данные Fulka at а!. (1982), которые показали, что при культивировании in vitro наряду с ядерным в определенной мере происходит и цитоилазматическое созревание ооцитов. Это обеспечивает в последующем преобразование головки пенетрировавшего сперматозоида в цитоплазме ооюгга в мужской пронуклеус.

Эпидидимальные сперматозоида быка сохраняли высокую активность при совместном инкубировании с клетками слизистой оболочки яйцевода. Уровень оплодотворения ооцитов, взятых как нагивные КОК, составлял 77.3 и 85.7% при обработке сперматозоидов гепарином или при их совместном инкубировании с клетками слизистой оболочки яйцевода, соответственно (табл. 12).

Таблица 12, Оплодотворяемость оопнтов крупного рогатого скота зп идидвм альны ми сперматозоидам и и зависимости от способа капацнтации

Способ капацитзции Всего ооцитов а Оплодотворено % В том числе нормально %

Обработка гепарином 22 77.3±8.9 72.7 ±9,5

Культи вироваиие с ЭКЯ 14 85.7±М 78.6+10.1

Было нормально оплодотворено с образованием мужского и женского пронуклеусов 72.7 и 78.6% ооцитов сперматозоидами, кападитированными обработкой гепарином нли в результате инкубирования с эпителиальными клетками яйцевода, соответственно. Хвостики сперматозоидов выявлялись в непосредственной близости к мужскому иронуклеусу при окраске лакмондом тотальных препаратов ооцитов, зафиксированных через 14-18 часов от качала оплодотворения. Эпидидимальные сперматозоиды быка проходят стадию капашггации in vitro как под воздействием гепарина, так и при совместном культивировании с эпителиальными клетками слизистой оболочки яйцевода.

Метод хранении неразбавленной суспензии сперматозоидов, выделенных из эпкдидимуса, может иметь практическое значение в работах с гаметами диких животных, так как он позволяет сохранять жизнеспособность эпщщднмальпых сперматозоидов при транспортировке на далекие расстояния.

Получение эпидцдашалзных сперматозоидов полностью зависит от наличия подходящих животных на мясокомбинате в день взятия материала, и качество его не предсказуемо в отдельных экспериментах. В то же время глубоко замороженное семя может быть подобрано от определенных быков, стабильно сохраняет свои свойства в течение практически неограниченного срока хранения, что важно для получения воспроизводимых результатов. Поэтому следующим этапом работы ставилась задача осуществить капацитацию сперматозоидов глубоко замороженного эякулята быка in vitro при сохранении их жизнеспособности и оплодотворяющей способности.

Эпидидимальные сперматозоиды проходили стадию капашггации уже при содержании гепарина в среде 0.2 мкг/мл, при этом оплодотворяемость ооцитов составила 44.1%. При увеличении концентрации гепарина до 2,0 и 10.0 мкг/мл достоверно увеличивалась оплодотворяемость ооцитов сперматозоидами эпидидимиса до 72.1 и 68.8%, соответственно, а число нормально оплодотворенных ооцитов (табл. 13). Сперматозоиды замороженного - оттаянного эякулята в среде с содержанием гепарина 0.2 мкг/мл практически не способны были проникнуть в цитоплазму ооцитов. При содержании гепарина в среде оплодотворении 2.0 мкг/мл пеяетрация ооцитов сперматозоидами эякулята составляла 46.7%, а при 10,0 мкг/мл увеличилась до 63,8%. Признаки нормального оплодотворения, то есть формирование мужского и женского пронуклеусов при наличии в ооплазме

хвостика сперматозоида наблюдались у 33,3 и 48.9% ооцитов при содержании гепарина в среде 2.0 и 10.0 мкг/мл, соответственно (табл. 13).

Таблица 13. Влияние содержании гепарин* в среде ТАЬР-ГегТ на оплодотворяющую способность сперматозоидов эпндиднмнея и эякулят* быка

Источник сперматозоидов Содержание гепарина мкг/мл Всего ооцитов D Оплодотворено % В том числе нормально %

Эпидкдиинс ол 59 44.1 ±6.5" 33.9±б.2г

2.0 43 72.1 ±6^ 41.9±7.5'

10.0 32 68.8+8.21, 5б.2±8.8ь

Эякулят 0.2 S1 3.912.7е 3.9±2.Г

2.0 30 4i.7±9.\" 33J+8.6"

10.0 47 63.8±7.0е 48.9+73*

В пределах колонки ^<0.01, «'•«р.Л.ОШ,^<0.2. ^<0,5, '"Р<0.05

Таким образом, включение гепарина в среду оплодотворения в количестве 10.0 мкг/мл обеспечило получение около 50.0% зигот на стадии двух про нуклеусов при оплодотворении созревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота сперматозоидами замороженного - оттаянного эякулята быка. Эпшшдимальные сперматозоиды быка проходят стадию кападнтацни in vitro в среде, содержащей гепарин в количестве 2.0-10,0 мкг/мл. Для капацитации сперматозоидов эякулята концентрация гепарина должна составлять 10.0 мкг/мл.

При сравнений двух уровней углекислого газа в газовой фазе концентрация 5% СОг в воздухе оказалась предпочтительнее, чем 2% СОа в воздухе. Выход зигот с двумя пронуклеусами составил 69.1% ври газовой фазе 5% СОа в воздухе и 56.2% при 2% СОа в воздухе (табл. 14).

Таблица 14. Выход зигот при оплодотворении оопитов с использованием газовой фазы, содержащей 2% яла 5% СОг в воздухе

Концентрация COi, % Всего ооцитов, п Получено зигот

п %

5 94 65 69.1 ±4.8"

г 80 45 5б.2±5.5ь

Ччо, 1

При дозревании ооцитов в среде с 10% астральной сыворотки без добавления гормонов при концентрации сперматозоидов в среде оплодотворения 1.3x106/мл было оплодотворено всего 30,8% ооцитов (табл. 15).

Таблица 15. Эффективность оплодотворения оонитов, дозревавши в среде с 14% сыворотки без добавления гормонов, ори различной кои центра ив и сперматозоидов в среде оплодотворении

Концентрация сперматозоидов х104/мл Всего ооцитов п Оплодотворено В том числе нормально

% %

1Л 26 30.819.0* 23Л±8-3С

6.0 40 67.5±7,4Ь

8.0-12.0 115 68.7±432е

•"ТсО.01,4 *Р<0.05, "Р<0.001

Доля ооцитов с признаками нормального оплодотворения увеличивалась с 23.1% до 47.5 и 68.7% при увеличении концентрации сперматозоидов с 1.3х10№/млдоб.0х106/мли8.0-12х106/мл, соответственно.

При оплодотворении ооцитов, дозревавших в среде с 10% эмбриональной сыворотки с добавлением гормонов высокий уровень оплодотворения 88.8% (103/116) был получен уже при концентрации сперматозоидов в среде оплодотворения в интервале 4.8-5.5x106/мл. Но при этом отмечен высокий уровень полиспермии, он составлял 30.2% от общего числа оошггов (35/116). Таким образом, необходимо регулировать концентрацию сперматозоидов в среде оплодотворения в зависимости от условий дозревания ооцитов.

Мы попытались повысить одлодотворяемоеть ооцитов, дозревавших в среде с астральной сывороткой крови без добавления гормонов, путем удаления части клеток кумулюса перед оплодотворением. Для этого КОК после дозревания отполаскивали в среде ТАЬР-НЕРЕЭ в присутствии небольшого количества сперматозоидов. Эти эксперименты оказались с очень большим разбросом результатов, и в общем с довольно низким выходом бластодист. Тем не менее, при оплодотворении ооцитов с частично удаленным кумулюсом были получены более высокие результаты по выходу бласгоцист - 21.6%, по сравнению с оплодотворением ооцитов в составе пнтактных комплексов ооцит-кумулюс - 8.8% (табл. 16).

Таблица 16. Влияние частичного удаления клеток кумулюса перед оплодотворением ооцитов на выход бласгоцист

Состояние кумулюса Всего ооцитов а Получено бластоциет

п %

Нативнмй 351 31 8Л±1.5*

Частично удален 218 47 21.6±2£ь

■^<0.001

В состав среды оплодотворения TALP-Fert включается сывороточный альбумин (BSA) в количестве 6-8 мг/мл. Мы проводили опенку эффективности включения п среду оплодотворения разных марок альбумина. В первой серии экспериментов мы тестировали эффективность включения в среду TALP-Fert бычьего сывороточного альбумина; I)BSA EFA-free А-7511 lot 88C-7340(Sigma); 2JBSA 11922 Control.CS (Serva); 3)BSA 11930 Control:? ( Serva). Образование зигот с нормально развитыми мужским и женским пронуклеусами составляло 50.0,30.6 и 52.7% для альбумина I, 2 или 3, соответственно.

Во второй серии экспериментов в среду TALP-Fert включали следующие марки альбумина: 1)BSA 11930 Control:F (Serva); 2)BSA 11930 Control E5 (Serva); 3)BSA 11922 ControLCS (Serva); 4)BSA A-4919 Lot58F-02665 (Sigma), В этих экспериментах полученные зиготы культивировали в течение 7-8 дней. Оценку эффективности включения разных марок альбумина в среду оплодотворения проводили по выходу бластоцист и по количеству клеток в составе бластоцист.

При включении в среду TALP-Fert альбумина марки A-4919 Lot 58F-02665 (Sigma) до бластоцисты развивалось 29.5% ооцитов от числа поставленных ка оплодотворение. При использования альбумина марки 11930 Control:F (Serva) и 11930 Control Е5 (Serva) выход бластоцист составил 20.0 и 16,2%, соответственно, что достоверно ниже, чем получено в среде с альбумином А-4919. Самые низкие результаты по выходу бластоцист, 9.1% от числа поставленных на оплодотворение ооцитов, получены при использовании в среде оплодотворения альбумина 11922 Control:C8 (Serva) (табл. 17).

Таблица 17. Влияние марки альбумина в tpeae TALP-Fert на получение бластоцист крупного рогатого скота in vitro

Марка Всего Получено бластоцист Количество

альбумина ооиотое клеток

а в % М±м

А-4919 Lot 58F-02665 149 44 29Л±3.7* 137.1 ±8.6*

11930 ControkF 175 35 20Л±3.0Ь 106.045.6'

11930 Control ES 37 6 MJtí.O1 120.Ш7.7*

11922 Control:C8 44 4 9.1±4.3d 104.7±37.3»

ГР<0.01, СЧ><0.5

Число клеток в составе бластоцист, полученных при использовании альбумина А-4919, составляло 137,1±8.б( что было достоверно больше по сравнению с другими вариантами среды оплодотворения.

Прн использовании семени быков, условно обозначенных как N1, N2, и N3, ае менее двух делений дробления прошли 32.2, 42.7, и 31.0% ооцитов, соответственно (табл. 18),

Таблица 18. ранне« развитие зародышей крупного рогатого скота, полученных прн использовании для оплодотворения ooumoa in vitro семени разных быков

Номер быка Всего OOUHTOB в Дробилось до 4-х бластомеров %

1 93 32.2±4ЛЬ

2 82 42.7±5.5*

3 toe 31.0±4.6Ь

*Р<0.2

4-б-клеточные зародыши, полученные в этих экспериментах, были поставлены на дальнейшее культивирование. До стадии бластоцисты развивалось 45.0% зародышей, полученных при оплодотворении ооцитов сперматозоидами быка N2 и по 56.7% зародышей, полученных при оплодотворении ооцитов сперматозоидами быков N1 и N3 (табл. 19).

Таблица 19. Развитие зародышей крупного рогатого скота, полученных при оплодотворении ооцитов семенем разных быков

Номер быка Всего зародышей |» Всего бластоцист Вылупилось Количество клеток на вылупи вшуюся бластоцисту, М±м

п % и

1 30 17 56.7±9.0 11 64.7±8.7Ь 29?.7±40.t*

2 60 27 45.0±6.4 16 59,2±6J* 245.1±31.24

3 30 17 56.7±9.0 8 47.0±9.1е 1853+20.5'

* Р<0.5, * Р<0.2, i'P<G.2, *i р<0.05

*от обшего числа бластоанст

В возрасте 9.5 дней вылупилось из zona pellucida 64.7 и 59.2% бластоцист,' полученных при использовании для оплодотворении ооцитов семени быков N1 и N2, соответственно. Эти показатели выше по сравнению с вылуплением бластоцист, полученных с использованием семени быка N3. Среднее число клеток было самым низким в составе вылупившихся бластопнст, полученных при оплодотворении ооцитов семенем быка N3 (185.5±20.5) по сравнению с двумя другими вариантами (табл. 19). Таким образом, дробление зародышей, выход расширенных и вылупившихся бластоцист, а также количество клеток в составе бластоцист зависят от использования для оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота in vitro семени разных быков.

3.5. Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

Метод ы сокулътивирования с соматическими клетками обеспечивают развитие зародышей крупного рогатого скота от зиготы до бластоцисты in vitro без применения метода культивирования в яйцеводе промежуточного реципиента. Мы получили в 1990-1991 годах первые зародыши крупного рогатого скота на стадия бластощгсты in vitro при использовании метода сокулътивирования с клетками кумулюса и эпителиальными клетками яйцевода.

После оплодотворения предполагаемые зиготы вместе с сохранявшимися на блестящей оболочке клетками кумулюса и лучистого венца переносили в среду 199 с 10% астральной сыворотки (Kajihara et al., 1987). Культивирование вели в течение 7-10 дней. Уже в течение первых суток клетки кумулюса прикрепляются к дну чашки и дают начало роста монослоя. Через 48 часов культивирования дао чашки Петри покрывается сетью звездчатых клеток с многочисленными отростками. В течение следующих дней формируется мошелой клеток кумулюса.

Из 647 ооцитов, поставленных на оплодотворение, дробилось 204, в среднем 31.5% [табл. 20), При культивировании на монослое клеток кумулюса дальше 1б-клеточной стадии развивались 63 зародыша, 30,9% от числа продробившихся зародышей. На 9-10 день культивирования в общей сложности 30 зародышей достигли стадии расширенной, вылупляющейся или вылупившейся бластоцисты. Каждая из этих бласто цист включала в себя свыше 100 клеток. В среднем выход морфологически нормальных бластоцист составил 4,6% от числа всех ооцитов, поставленных на оплодотворение (30/647), 14.7% от числа дробившихся зародышей (30/204), 47.5% от числа зародышей, преодолевших стадию 16 бласгомеров (30/63).

Таблица 20. Получение зародышей крупвого рогатого скота ирн дозревании и оплодотворен ни ооцитов in vitro и последующем культивированни на монослое клеток кумулюса

Эксперимент Всего Дробилось Бластоцист

ооцитов, п %

а %

{ 52 44,2+5,9 3 5.8±3.2

г 355 35.5±2.5 16 4.5±1.1

3 240 22.9Ы.7 11 4.611.4

Всего 647 31.5±lit 30 4.6±0.8

Результаты этих экспериментов показали возможность получения зародышей крупного рогатого скота на стадии бластоцисты вне организма путем дозревания и оплодотворения ооцитов и их последующего культивирования in vitro на моносдое клеток кумулюса.

В апреле 1991 года полученные при культивировании на монослое клеток кумулюса 10 зародышей в возрасте 8 дней на стадии поздней морулы и бластоцисты были трансплантированы нехирургическим способом семи реципиентам. При ректальном обследовании через два месяца три

реципиента были признаны стельными (43%). Стельность у этих реципиентов протекала нормально. В инваре 1992 года родились два бычка и одна телочка (табл. 21).

Таблица 21, Результаты трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro -

Реципиент Число Стали» Оценка Длительность Вес

m эмбрионов развития в баллах стельности телят

днп кг

2687 1 Бластоциста 5 286 36

1091 1 Бластоциста 5 - •

9265/415 2 Ранине 4 279 32

Ьластоцисты 3

9686 I Бластоциста 5 - -

1108 ! Бластоциста 5 276 60

950 2 Компактные 3 - -

морулы 4

776 2 Компактные 4 - -

иорулы 3

Возможность культивирования зародышей крупного рогатого скота начиная со стащи зиготы in vitro с использованием соматических клеток представляла большой шаг вперед по сравнению с культивированием в яйцеводах временных реципиентов. Другим подходом является создание системы культивирования эмбрионов, независимой от соматических клеток. Предложено несколько простых солевых растворов, которые поддерживают развитие эмбрионов крупного рогатого скота при включении некоторых субстратов и источников протеина: SOF (Tervit et al., 1972), НЕСМ (Schini, Bavister, 1988), CZB (Chatot et al., 1989), CDM (Seidel et al„ 1991), CRI (Rozenkrans, First, 1994). Мы использовали для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro среду SOF, разработанную на основе биохимического анализа жидкости яйцевода овцы (Tervit et al., 1972).

При культивировании в среде SOF развивались до стадии морулы и бластощгеты 14.8 и 12.6% зигот, соответственно, у которых клетки кумулюса и лучистого венца были оставлены или удалены с блестящей оболочки перед началом культивирования, или 26.5 и 30.3%, соответственно, в расчете от дробящихся зародышей (табл. 22). Таким образом, в среде SOF зародыши крупного рогатого скота могут успешно преодолевать 8-16-клеточный блок развития без сокультивироваяия с соматическими клетками или применения кондиционированной среды.

Таблица 22. Развитие зародышей крупного рогатого скота в среде БОГ в зависимости от наличии шля отсутствия клеток кумулюса на Блестящей оболочке энгот на начало кул ьти ви рова ння

Состояние кумулюса Всего ооцитов н Дробилось Морула+Сластоциста

л % и От всех, % Ог дробящихся, %

Оставлен 183 102 55.7+3.7 27 14,8 ±3.6 26.5133

Удален 73 33 41.8±5.5 10 12.6+3.7 30.3+S.Î

Нами были проведены эксперименты по культивированию полученных in vitro зародышей крупного рогатого скота от зиготы до бластоцисты s средах SOF и mTALP (Lim et al., 1994b) без сокультпвировагош с соматическими клетками. В среде raTALP дробилось 56,7% (101/178) ооцитов, в среде SOF 52.0% (90/173), в том числе до 4 бластомеров или дальше 35.6 и 41,0% соответственно. Однако в этом эксперименте до бластоцисты в среде mTALP развивалось только 9.2% 4-клеточных зародышей, тогда как в среде SO F 19,7%. Таким образом, эффективность среды mTALP в наших условиях оказалась низкой.

Абсолютной необходимости присутствия протеина в среде для развития эмбрионов крупного рогатого скота in vitro нет (Seidel et al,, 1991; Bavister et al., 1992). Однако многочисленные факты свидетельствуют о благотворном влиятш альбумина и, особенно, сыворотки крови на получение зародышей на стадии бластоцисты in vitro. При включении в среда культивирования эмбрионов SOP эстральной сыворотки крови в количестве 10 или 20% до бластоцисты развивалось 44,1 и 52.9% 4-6-клеточных зародышей, соответственно; вылупилось в возрасте 9.5 суток 40.0 и 66.7% бластоцист, соответственно. Среднее число клеток на вылупившуюся бластоцисту по .этим группам составляло 221.5 и 251.7, соответственно (табл. 23).

Таблица 23. Развитие 4-8-клеточных зародышей крупного рогатого скота в зависимости от количества эстральной сыворотки крови в среде SOF

Количество сыворотки % Всего зародыше й п Бластоииста Вылупилось %* Число клеток на вылупив шуюся бластоцисту, Mim

il %

10 34 15 44.118.5* 40-0±8.4* 221.516.«

20 34 18 52.9±8.6Ь 66.718,1" 251.7 ±38 J

л Р<0.5, Р<0.05

*-0т полученных бластоцист

В результате проведенных экспериментов нами была принята следующая схема получения зародышей крупного рогатого скота in vitro:

♦ Дозревание оощггов в среде 199 с 10% ннактивированной астральной сыворотки крови в течение 22-24 часов в атмосфере 5% СО г в воздухе.

* Совместное инкубирование гамет в среде TALP-Fert в течение 18-20 часов в атмосфере 5% СО а в воздухе.

• Культивирование зигот в течение 24-28 часов в среде SOF, включающей альбуьшн 3 мг/мл, при размещении около 30 зигот на каплю среды объемом 50 мкл. Освобождение зародышей от клеток нуыулюса и лучистого венца, подсчет дробящихся зародышей.

* Культивирование 4-6-клеточных зародышей до окончания эксперимента в среде S0F, включающей 20% эстральной сыворотки, при плотности 14-16 зародышей на каплю среды объемом 25 мкл.

• Использование газовой фазы 5% СОг, 5% Оэ, 90% Na для культивирования зародышей в среде SOF,

В принятой нами системе культивирования зародышей крупного рогатого скота в среде SOF с 20% эстральной сыворотки крови до стадии бластоцисты развивалось по сумме нескольких экспериментов 45.2% (161/356) зародышей, отобранных на культивирование в возрасте 42-48 часов на стадии 4-6 бластомеров. В возрасте 7-7.5 суток выявлялось от 75 до 95% от общего числа полученных бластоцист, в среднем 84,3%, Первые зародыши, вылупившиеся из zona peilucida, были отмечены в возрасте 7.5 суток. Вылупились и находились в процессе аылупления та zona peltucida в возрасте 9-10 суток 57.6 (83/144) и 16.0% (23/144) зародышей от общего числа бластоцист, соответственно (табл. 24), Такая кинетика развития зародышей в целом соответствует темпам развития зародышей крупного рогатого скота in vivo.

Таблица 24, Распределение но стадиям и число клеток в составе полученных in vitro зародышей крупного рогатого скота в возрасте 9,5-10 суток

Достигнутая стадия развития В«го бластоцист п Распределение л о стадиям % Количество клеток М±т

Бластоцнста 38 26.4 73±5'

Вылупляющаяся бластоцнста 23 16.0 120±6Ь

Вылупившаяся бластоцнста аз 57.6 251+14е

Всего 144 100.0 -

А ^<0.001

Мы исследовали 63 зародыша из числа тех, которые были поставлены на культивирование на стадии 4-6 бластомеров, но не достигли стадии бластоцисты. В составе 45 зародышей на цитологических препаратах нормальные ядра не выявлены. У 9 зародышей было от 2 до 8 клеток. В составе 6 зародышей было от 8 до 16 бластомеров. 3 зародыша остановились на стадии больше 16 но меньше 32 клеток. Таким образом, среди зародышей, не достигших стадии бластоцисты в возрасте 9.5 суток, цитологически нор-

мальных морул не обнаружено, зародыши или развивались до стадии бластоцисты, или остановились в развитии, не достигнув стадии компактной морулы.

При трансплантации полученных нами in vitro 8-дневных зародышей крупного рогатого скота прижились только бластоцисты. Эмбрионы, находившиеся в возрасте 8 дней на стадии морулы, не имплантировались. На основании этих данных мы считаем, что применение показателя выхода зародышей по сумме стадий морула и бластоциста для оценки культуральной системы и качества зародышей не бесспорно.

В наших экспериментах в составе вылупившихся бластоцист в возрасте 9-10 суток насчитывалась 251 клетка, в составе вылупляющихся бластоцист 120 клеток. В составе зародышей, остановившихся в своем развитии на стадии бластоцисты, насчитывалось 73 клетки, при этом некоторые из этих бластоцист имели в своем составе менее 32 клеток (от 8 до 26). Различия по числу клеток между каждой из этих трех категорий бластоцист высоко достоверны, то есть эти категории зародышей существенно различаются по качеству (табл. 24), Вероятно, наиболее точными показателями, отражающими качество системы получения и культивирования зародышей крупного рогатого скота in vitro, являются выход бластоцист в возрасте 7-8 дней, а также доля бластоцист, вылупившихся и находящихся в процессе вылупления из zona pellucida в возрасте 9-10 суток,

3.5. Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма для использования в научно-исследовательской работе

В период с марта по июнь 2001 года включительно в лаборатории клеточной инженерии и трансплантации эмбрионов ВНИИ физиологии, биохимшг и питания сельскохозяйственных животных была проведена серия экспериментов в рамках работ по получению трансгенных животных с использованием изложенной технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма. В этой комплексной работе этапы по выделению, дозреванию и оплодотворению ооцитов крупного рогатого скота in vitro, по приготовлению сред и культивированию эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты выполнены автором.

Культивирование эмбрионов проводили в среде SOF. В соответствии с поставленными задачами ооциты группы «опыт» были освобождены от клеток кумулюса к лучистого венца. Таким образом, зародыши этой труппы культивировались от зиготы до стадии бластоцисты в системе, свободной от соматических клеток. Зиготы контрольной группы при помещении на культивирование в среду SOF сохраняли на zona pellucida незначительное количество клеток лучистого венца.

После дозревания л оплодотворения in vitro на культивирование в 10 экспериментах было поставлено всего 976 одноклеточных зародышей, предположительно зигот. Уровень дробления в среднем составил 68.8 %, Было получено 289 бластоцист, что составило 29.6% от числа ооцитов, или 43,1% от дробящихся зародышей (табл. 25),

Таблица 25 Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма в рамкак экспериментов но получению трансгенных зародышей (данные Ш экспериментов)

Группа Всего ооцнтов, п Дробилось п % Получено бла стони ст, %

Всего, п От ооцнтов От дробящкхся

Опыт* 500 361 72.2 160 32Л 44.3

Контроль 476 ЗШ 65.1 129 27.1 41.6

Всего 976 671 68.8 289 | 29.6 43.1

*- использовались дня получения трансгснных зародышей крупного рогатого скота

Стадии 4 бластомеров в возрасте 42-44 часов от постановки на оплодотворение в серии из б экспериментов, в которых этот показатель был учтен, достигли в среднем 52.6% одноклеточных зародышей (табл. 26). Именно эти зародыши, по литературным данным ы собственным наблюдениям, обладают высокой способностью к дальнейшему эмбриональному развитию. В этой серии экспериментов до стадии бластоцисты развивалось в среднем 62,5% 4-6-клеточных зародышей (табл. 26).

Таблица 26. Выкод бластоцист крупного рогатого скота при культивировании зигот в среде БОГ в расчете от общего числа дробящихся н от 4-6-клсточных зародышей (данные б экспериментов)

Группа Всего 0011 итов п Дробилось спустя 42-44 часа Получено бластоцист

Всего и % До ¿4 бластомеров п % Всего п От дробщцнхея */. От 4-6- кл сточных %

Опыт* 247 182 73,7 139 56.3 85 46.7 61.2

Контроль 230 155 67.4 112 48.7 72 46.4 643

Всего 477 337 70.6 251 52.6 157 46.6 62.5

*- использовались для получения трансгенных зародышей крупного рогатого скота

При культивировании в системе, полностью свободной от соматических клеток, в возрасте 7 суток стадии бластоцисты в группе «опыт» достигло 85.2% зародышей от общего числа полученных бластоцист. В среднем в 8 экспериментах этой серип, в которых учитывали динамику развития зародышей, стадии бластоцисты в возрасте 7 едггок достигло 81.9% зародышей от числа всех полученных бластоцист (табл. 27).

Таблица 27. Динамика развития зародышей крупного рогатого скота при культивировании зигот в среде SOP без применения соматических клеток (но результатам 8 экспериментов)

Группа Всего Дробилось Достигли стадн и бластоцисты

ооцитов п п % Всего л % В том числе в возрасте 7 суток it % (от числа Гмастоцнст)

Опыт* 415 304 73.2 142 34.2 121 85.2

Контроль 433 281 64.9 11S 27.2 92 78.0

Всего 848 S8S 69.0 260 30.7 213 81.9

*- использовались для получения трансгешшх зародышей крупного рогатого скота

Такая динамика образования бластоцист свидетельствует о нормальном развитии зародышей крупного рогатого скота in vitro в данной системе получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма.

4. Выводы

1. Усовершенствована система получения зародышей крупного рогатого скота вне организма путем дозревания и оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов in vitro без применения соматических клеток. В разработанной системе выход зародышей на стадии бластоцисты составляет евшие 30% от числа ооцитов- В возрасте 7-7.5 суток выявлялось от 75 до 95% от общего числа бластоцист, в возрасте 9-10 суток вылупились или находились в процессе вылупления из zona pellucida соответственно 57.6 и 16.0% зародышей от общего числа бластоцист.

2. Включение в систему дозревакия ооцитов фрагментов стенки фолликула, состоящих из теки интерны и прилегающего слоя гранулезы, удлиняет время мейотнческого дозревания ооцитов и улучшает их раннее эмбриональное развитие. Проведение дозревания комплексов оодагг-кумулюс в открытой системе и в каплях под маслом сопоставимы по эффективности.

3. Эшщндимальные сперматозоиды быка сохраняют жизнеспособность при хранении в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СОз, 5%Ог, 90% N2 в темноте при комнатной температуре в течение суток. Уровень оплодотворения ооцитов эпидщршальньши сперматозоидами быка, хранившимися при этпх условиях, составил 6986%.

4. Эшщндимальные сперматозоида! быка проходят стадию капацнтации in vitro при совместном культивировании с эпителиальными клетками яйцевода или в среде с содержанием гепарпна в количестве 2-10 мкг/мл. Для капацитадии сперматозоидов замороженного - оттаянного эякулята быка содержание гепарина в среде должно составлять около 10 мкг/мл. Индивидуальные свойства семени разных быков оказывают влияние на оплодотворяемость ооцитов, выход расширенных и вылупившихся бластоцист, а также на число клеток в составе бластоцист.

5. Количество и качество получаемых in vitro зародышей крупного рогатого скота зависят от марки альбумина в среде оплодотворения. Эффективность отдельных марок или серий альбумина в среде оплодотворения может быть оценена по уровню оплодотворения и дробления ооцитов, а также по выходу бласгоцист ir числу клеток в составе бластоцнсг.

6. Зародыши крупного рогатого скота успешно развиваются in vitro в среде SOF независимо от наличия или отсутствия клеток кумулюса на zona pellucida на начало культивирования зигот.

7. Критерием оценкп эффективности системы получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в целом, и этапа культивирования зародышей в том числе, может являться показатель образования бла сто цист в возрасте 7-8 дней п число вылупившихся и находящихся в процессе вылупления из zona pellucida бластоцнст в возрасте 9-10 дней.

8. При нехирургической трансплантации полученных in vitro 8-дневных эмбрионов крупного рогатого скота стали стельными и отелились 42.8% реципиентов (3/7). Прнживляемость бластоцист составила 50.0% (З/б). Рождением молодняка подтверждена жизнеспособность получаемых m vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

9. Прнживляемость полученных in vivo эмбрионов крупного рогатого скота после хранения в среде Menezo В2 или Дюльбекко с 20% эмбриональной сыворотки крови составила 43.0*45.5%, Эмбрионы крупного рогатого скота на стадии бластоццсты можно хранить в течение 4-10 часов в среде Дюльбекко в атмосфере воздуха при температуре 20-25°С.

10. Разработано устройство, позволяющее выделять оошггы крупного рогатого скота без повреждения кумулюса из заданных антральных фолликулов яичников. При использовашга устройства 73.1% общего числа выделенных ооцитов представлены комплексами ооцнт - кумулюс; выход ооцитов, пригодных для дозревания и оплодотворения in vitro, составил 12-13 в расчете на 1 яичник.

11. Сперматозоиды кролика проходят стадию кадацитацни in vitro при инкубировании в среде, содержащей 37 мМ бикарбоната натрия и 20% эстральной сыворотки крови, в течение 12 часов. Увеличение продолжительности периода инкубироааши in vitro до 17-18 часов не сшшает жизнеспособность и оплодоггворяютщю способность сперматозоидов кролика.

12. Усовершенствованы методы приготовления цитологических и тотальных препаратов предимплаиташюнных зародышей крупного рогатого скота. Использование камеры, насыщенной парами фиксатора, предотвращает потерю эмбрионов, сокращает расход фиксатора, позволяет существенно улучшить условия работы при приготовлении тотальных препаратов. Камера позволяет хранить окрашенные тотальные препараты в течение необходимого времени.

5. Практические предложения

1. При получении зародышей крупного рогатого ск<*та вне организма использовать систему культивирования эмбрионов in vitro без применения соматических клеток. В данной системе выход зародышей на стадии бластонисты составляет около 30% от числа ооцитов.

2. Эффективность системы получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в целом, и этапа культивирования зародышей в том числе, оценивать по образованию бластоцист в возрасте 7-6 дней и доле вылупившихся и находящихся в процессе вылупления из zona pellucida бластоцист в возрасте 9-Ю дней.

3. Тестировать эффективность отдельных марок или серий альбумина в среде оплодотворения по уровню оплодотворения и дробления ооцитов, а также по выходу бластоцист и числу клеток в составе бластоцист.

4. В случае необходимости хранить эпидидишальные сперматозоиды быка в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СОа, 5% Оз. 90% Na в темноте при комнатной температуре.

5. Для хранения эмбрионов крупного рогатого скота ка стадии бластоцисты в течение 4-10 часов использовать среду Дюльбекко с добавлением 20% сыворотки крови.

6. Для выделения ооцитов крупного рогатого скота без повреждения вуыулюса из поверхностных антральных фолликулов нужного диаметра использовать разработанное устройство. При использовании устройства выход комплексов ооцит-кумулюс, пригодных для дозревания и оплодотворения in vitro, составляет 12-13 в расчете на 1 яичник.

7. При приготовлении и хранении тотальных препаратов предимплантацнонных зародышей крупного рогатого скота применять камеру, насыщенную парами фиксатора или просветляющего раствора, соотв етственно.

6. Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Прокофьев М.И., Белевич В.П., Рябых В.П., Бахитов К.И., Черных В.Я., Горячев B.C., Маленко Г,П., Никитина В.Н., Дроннн А.П. Технология пехирургической трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Животноводство. 1980, №12, стр. 52-54.

2. Прокофьев М.И., Вахитов К.И., Рябых В.П., Белевич В.П., Черных В.Я., Маленко Г.П. Вызывание суперовуляции у коров и телок с помощью сывороточного гонадотродина и простагландина. Труды ВНИИ

. физиологии, биохимия и питания сельскохозяйственных животных. 1981, том XXV, стр. 3-10.

3. Черных В.Я., Прокофьев М.И., Петунина В.М., Маленко Г.П., Кононов B.IL Устройство для пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. Бюллетень №2, 1982. Авторское свидетельство Ns897224 от 14,09,1981.

4. Белевич В.П., Прокофьев М.И., ., Черных В.Я., Рябых В.П, Бахитов К.И., Маленко Г.П,, Петукина В.М. Извлечение и пересадка зародышей у крупного рогатого скота нехирургическим способом. Эндокринология н транс плантация зигот сельскохозяйственных животных, Москва, 1982, стр. 53-71.

5. Маленко Г.П. Совместное культивирование ооцитов крупного рогатого скота с тканями стенки фолликула в экспериментах по получению ранних зародышей вне организма. Тезисы докладов III Всесоюзного совещания •Культивирование клеток животных и человека». Москва, Пущино, 13-15 февраля, 1990, стр. 116-117.

6. Маленко Г.П., Вильянович А.И., Логинов А.Г., Сметаннна И.Г. Получение жизнеспособных эмбрионов крупного рогатого скота путем дозревания и оплодотворения ооцитов. Материалы международного симпозиума •Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных». Санкт-Петербург, Пушкин, 24-26 мая, 1994, стр. 31.

7. Малеико Г.П., Сметанина И.Г. Развитие зародышей крупного рогатого скота in vitro от зиготы до бластописты в среде SOF. Материалы междупар одного симпозиума «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных». Санкт-Петербург, Пушкин, 24-26 мая, 1994, стр. 50-51.

8. Маленко Г.П., Вильянович Л.И., Логинов А.Г., Сметанина И.Г. Получение жизнеспособных эмбрионов крупного рогатого скота путем дозревания н оплодотворения ооцитов in vitro. Цитология, 1994, том 36, Na 6, стр. 567568.

9. Malenko G.P, An improved method for preparing whole specimens from bovine preimplantation embryos: A technique note. Thenogenology. 1994, vol. 41, Na 6, pp. 1207-1210.

10. Маленко Г.П,, Сметанина И.Г., Иванова A.B. Устройство для выделения ооцитов из яичников млекопитающих. Положительное решение экспертов ВНИИГПЭ от 30.10.1995.

11. Маленко Г.П., Сметанина И.Г, Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма для работ по клеточной и генной инженерии. Материала XV рабочего совещания «Криоконсервацця генетических ресурсов». Москва, Пушино, 13-15 октября 1998, стр. 203.

12. Malenko G.P, A new technique for chromosome preparation from bovine oocytes and preimplantation embryos. Ргос. 15л Sei. Meeting European Embryo Transfer Association. Lyon, France, 10-11 September 1999, p. 196.

13. Malenko G.P, Device to recover bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) without destroying their cumulus layers from antral ovarian follicles. Proc. 15th Sei. Meeting European Embryo Transfer Association. Lyon, France, 10-11 September 1999, p. 198.

14. Маленко Г,П. Дозревание ооцитов крупного рогатого скота вне организма. Сборник научных трудов ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных »Современные проблемы биотехнологии и биологии продуктивных животных». Боровск, 1999, стр. 22-40.

15. Столярова В.Н., Рябых В.П., Лисицына С.А., Маленко Г.П., Сметанина И.Г., Овчаренко М,П, Получение и использование сперматотоний в качестве кариопластов при реконструировании яйцеклеток. Сборник научных трудов ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных «Современные проблемы биотехнологии и биологии продуктивных животных». Боровск, 1999, стр. 13-22.

16. Маленко Г.П. Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Сборник научных трудов ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных «Современные проблемы биотехнологии и биологии продуктивных животных». Боровск, 2000, стр. 49-72.

17. Маленко Г.П. Влияние включения эстральной сыворотки крови в среду SOF на развитие эмбрионов крупного рогатого скота, полученных путем дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro. Материалы П международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва, 18-19 октября 2000, стр. 28-29.

18. Маленко Г.П. Развитие эмбрионов крупного рогатого скота, полученных при дозревании и оплодотворении ооцитов in vitro, в среде SOF с различным уровнем глюкозы и гшрувата натрия. Материалы II международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва, 18-19 октября 2000, стр. 167168.

19. Маленко Г.П. Устройство для выделения комплексов ооцит-хумулюс из антральных фолликулов яичников крупного рогатого скота. Сельскохозяйственная биология. 2001, Na4, стр. 117-119.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы Тел, (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Лицензия ЛР № 021248 от 21.12.97

Сдано о набор 22.02.2002. Подписано в печать 22.02.2002 _Запад № 1. Печ. л. 1,8. Тираж 100 эвз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Маленко, Галина Петровна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.Ю

2.1. Получение зрелых яйцеклеток крупного рогатого скота.

2.1.1. Дозревание ооцитов крупного рогатого скота in vivo.

2.1.2. Температурный режим доставки яичников и культивирования ооцитов и ранних зародышей крупного рогатого скота.

2.1.3. Выделение ооцитов из антральных фолликулов яичника.

2.1.4. Классификация ооцитов.

2.1.5. Дозревание ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

2.2. Оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

2.2.1. Капацитация сперматозоидов.

2.2.2. Предварительная обработка сперматозоидов замороженного эякулята быка.

2.2.3. Оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

2.3. Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

2.3.1. Системы культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

2.3.2. Потребность ранних зародышей крупного рогатого скота в энергетических веществах и аминокислотах.

2.3.3. Влияние альбумина и сыворотки крови на развитие эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

2.3.4. Влияние кооперативного взаимодействия ранних эмбрионов крупного рогатого скота на их развитие in vitro.

2.3.5. Динамит развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота.

2.3.6. Физико-химические условия культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Общие условия культивирования.

3.2. Реактивы и среды.

3.3. Получение in vivo и трансплантация зародышей крупного рогатого скота и кроликов.

3.4. Получение яичников крупного рогатого скота и выделение ооцитов.

3.5. Дозревание и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

3.6. Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

3.7. Приготовление эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота для использования в технологии получения зародышей вне организма.<

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Изучение влияния факторов при манипулировании во внешней среде на гаметы и зародыши крупного рогатого скота и кроликов, полученные in vivo.

4.1.1. Влияние условий кратковременного храпения зародышей крупного рогатого скота на их жизнеспособность.

4.1.2. Тестирование условий культивирования с использованием эмбрионов кролика.

4.1.3. Совершенствование методов капацитации сперматозоидов in vitro с использованием в качестве модели гамет кролика.

4.2. Дозревание ооцитов крупного рогатого скота in vtro.

4.2.1. Дозревание ооцитов крупного скота in vitro при сокультивировании с тканями стенки фолликула.

4.2.2. Эффективность дозревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro при размещении различного числа комплексов ооцит-кумулюс на единицу объема среды.

4.2.3. Влияние среды, источника сыворотки крови и сочетания гормонов в среде на дозревание ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

4.2.4. Перспективы повышения компетенции ооцитов крупного рогатого скота при дозревании in vitro.ИЗ

4.2.5. Устройство и способ для выделения ооцитов крупного рогатого скота из антральных фолликулов яичника.

4.3. Капацитация сперматозоидов и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота in vitro 121 4.3.1. Получение, хранение и использование эпидидимальных сперматозоидов быка.

4.3.2. Определение влияния концентрации гепарина на капацитацию сперматозоидов эпидидимальных и эякулята быка in vitro.

4.3.3. Влияние концентрации сперматозоидов в среде на оплодотворение ооцитов, дозревавших при разных условиях.

4.3.4. Влияние разных марок альбумина в среде TALP-Fert на результаты оплодотворения ооцитов крупного скота in vitro.

4.3.5. Влияние семени разных быков и метода подготовки сперматозоидов на результаты оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

4.4. Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

4.4.1. Получение жизнеспособных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro при использовании системы сокультивирования на монослое соматических клеток.

4.4.2. Использование простых солевых сред для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

4.4.3. Развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота в среде SOF с разным содержанием сыворотки крови и альбумина.

4.4.4. Влияние аминокислот и различных уровней энергетических веществ в среде SOF на развитие эмбрионов крупного рогатого скота.

4.4.5. Критерии оценки системы культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

4.4.6. Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма для использования в научно-исследовательской работе.

4.5. Модифицированные методы, используемые в технологии получения зародышей крупного рогатого скота in vitro.

4.5.1. Формулы для доведения осмотического давления растворов.

4.5.2. Приготовление тотальных препаратов ранних зародышей крупного рогатого скота с использованием камеры, насыщенной парами фиксатора.

4.5.3. Модифицированный метод приготовления цитологических препаратов предимплантационных зародышей крупного рогатого скота.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма"

Актуальность работы определяется тем, что создание надежного и экономичного источника эмбрионов крупного рогатого скота на ранних стадиях развития необходимо как для научно-исследовательских, так и для практических целей.

Получение эмбрионов крупного рогатого скота in vivo основывается на суперовуляции. При этом эмбрионы от морулы до стадии вылупившейся бластоцисты могут быть получены путем нехирургического вымывания. Однако яйцеклетки, зиготы и эмбрионы на ранних стадиях развития могут быть получены от животных-доноров только хирургическим путем или при убое. В связи со сложностью получения зрелых яйцеклеток и зародышей на ранних стадиях развития in vivo длительное время сдерживались фундаментальные исследования эмбриогенеза крупного рогатого скота. Интенсивное развитие работ по созданию трансгенных животных, в том числе и крупного рогатого скота, возможно только при доступности большого числа яйцеклеток и зигот. Клонирование крупного рогатого скота путем пересадки ядер является в настоящее время одним из наиболее перспективных направлений биотехнологии. В работах по клонированию также используются яйцеклетки и зиготы в качестве цитопластов - реципиентов трансплантируемого ядра.

Реальной альтернативой получению зародышей крупного рогатого скота in vivo является технология получения зародышей in vitro. Для получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в качестве женских гамет используются ооциты из антральных фолликулов яичников коров и половозрелых телок. Яичники получают на мясокомбинате. Источником мужских гамет является глубоко замороженное семя быков. Таким образом, исходный материал для получения зародышей крупного рогатого скота in vitro вполне доступен.

Технология получения зародышей крупного рогатого скота in vitro слагается из трех основных этапов:

• Ооциты, выделенные из антральных фолликулов яичника, должны пройти стадию дозревания. В этот период происходит возобновление мейоза и завершение первого мейотического деления (ядерное дозревание) и цитоплазматическое дозревание ооцитов. Основным критерием успешного дозревания ооцитов in vitro является приобретение ими способности к эмбриогенезу (Crosby et al., 1981; Leibfried et al., 1987; Khatir et al., 1996).

• Сперматозоиды быка должны пройти in vitro стадию капацитадии и приобрести способность к осуществлению акросомной реакции, проникновению через оболочки ооцита и слиянию с плазматической мембраной ооцита. В период совместного инкубирования дозревших in vitro ооцитов и капацитированных in vitro сперматозоидов должно произойти оплодотворение ооцитов. Свидетельством нормального оплодотворения является образование зигот с мужским и женским пронуклеусами.

• Необходимо создание системы культивирования зародышей крупного рогатого скота in vitro, обеспечивающей их развитие от зиготы до бластоцисты, с целью получения жизнеспособных эмбрионов, пригодных для нехирургической трансплантации реципиентам.

Мейоз ооцитов инициируется во время развития яичников плода (Russe, 1983), а затем останавливается на стадии зародышевого пузырька (germinal vesicle, GV). В 1935 году Pincus, Enzmann предположили, что структуры фолликула могут поставлять ооциту субстанции, которые прямо ингибируют ядерное созревание. Первое сообщение о ядерном дозревании in vitro ооцитов крупного рогатого скота, выделенных из антральных фолликулов, было сделано в 1965 году (Edvards, 1965).

В 1978 году дозревшие in vitro ооциты были трансплантированы хирургически в яйцевод временному реципиенту для оплодотворения in vivo. Через 7 дней зародыши были вымыты. Зародыши, достигшие к этому времени стадии бластоцисты, были трансплантированы постоянным реципиентам. В результате родился первый теленок, полученный при использовании дозревших in vitro ооцитов (Newcomb et al., 1978).

Сообщение о первом теленке, родившемся при in vitro оплодотворении созревших in vivo ооцитов, было опубликовано в 1982 году (Brackett et al., 1982). В 1983 году были опубликованы данные о получении в нашей стране теленка из дозревшей и оплодотворенной in vitro яйцеклетки коровы (Эрнст и др., 1983). В 1986 году в нескольких зарубежных центрах родились телята в результате трансплантации эмбрионов, полученных при проведении обоих этапов - и дозревания и оплодотворения ооцитов - in vitro (Critser et al., 1986a; Hanada et al., 1986). Спустя год появились телята, полученные методом дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro в Экспериментальной научно-исследовательской базе "Горки Ленинские" ВНИИСХБ (Эрнст и др., 1987).

Sreenan, Scanion (1968) показали возможность культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота в яйцеводе кролика. В последующем эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro, культивировали до стадии морулы или бластоцисты в яйцеводах овцы (Lu et al., 1987; Eyestone, First, 1989a; Leibfried-Rutledge et al., 1989; Gordon, Lu, 1990), кролика (Sirard et al., 1985; Sirard, Lambert, 1986; Fukui, Ono, 1988). Но культивирование эмбрионов крупного рогатого скота в яйцеводах временных реципиентов - это сложный и дорогостоящий метод. Дальнейшему развитию технологии получения зародышей крупного рогатого скота вне организма способствовала разработка методов культивирования эмбрионов in vitro.

В настоящее время технология получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro является неотъемлемой частью проведения биотехнологических работ по созданию клонированных и трансгенных животных, и во многом именно она обусловливает прогресс при проведении этих работ на крупном рогатом скоте (Greve et al., 1993; Kato et al., 1998; Goto et al., 1999). Однако более низкая выживаемость полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота после замораживания -оттаивания или проведения микроманипуляций по сравнению с полученными in vivo эмбрионами свидетельствует, что методы технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro требуют дальнейшего совершенствования.

Целью работы являлось создание системы получения зародышей крупного рогатого скота вне организма путем дозревания и оплодотворения оодитов in vitro и культивирования эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты, пригодных для нехирургической трансплантации реципиентам.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить условия дозревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro для получения зрелых ооцитов, обладающих компетенцией к эмбриональному развитию.

2. Усовершенствовать условия хранения, предварительной обработки и капацитадии сперматозоидов из хвоста придатка семенника замороженного эякулята быка, обеспечивающие высокий уровень оплодотворения ооцитов in vitro.

3. Усовершенствовать условия культивирования зародышей крупного рогатого скота, обеспечивающие их развитие in vitro от зиготы до стадии расширенной и вылупившейся бластоцисты в системе, независимой от соматических клеток.

4. Определить жизнеспособность полученных вне организма зародышей крупного рогатого скота при их нехирургической трансплантации реципиентам.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований установлено:

• Фрагменты стенки фолликула, состоящие из теки интерны и прилегающего слоя гранулезы, при сокультивировании с комплексами ооцит - кумулюс удлиняют время мейотического дозревания ооцитов крупного рогатого скота и способствуют их цитоплазматическому дозреванию.

Эпидидимальные сперматозоиды быка сохраняют жизнеспособность г: оплодотворяющую способность в течение суток при хранении в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СО2, 5%С>2, 90% N2 в темноте при комнатной температуре. Они проходят стадию капацитадии in vitro при совместном культивировании с эпителиальными клетками яйцевода или в среде при содержании гепарина 2-10 мкг/мл.

Марка альбумина в среде оплодотворения наряду с влиянием на уровень оплодотворения и дробления ооцитов, может иметь отдаленные последствия, оказывая влияние на выход бластоцист и число клеток з составе бластоцист, то есть на качество получаемых in vitro эмбрионор. Сперматозоиды разных быков оказывают влияние на оплодотворяемость ооцитов in vitro, выход бластоцист и число клеток в составе бластоцист.

Эффективность культивирования эмбрионов крупного рогатого скота в среде SOF не зависит от наличия или отсутствия клеток кумулюса на zona pellucida зигот.

При получении in vitro наиболее жизнеспособными являются эмбрионы крупного рогатого скота, достигшие стадии бластоцисты в возрасте 7-8 дней.

На защиту выносятся следующие положения:

Система получения зародышей крупного рогатого скота in vitro, обеспечивающая выход бластоцист на уровне 30% от числа ооцитов и вылупление из zona pellucida около 60% полученных бластоцист при культивировании без применения соматических клеток. Показателями эффективности системы получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro и этапа культивирования зародышей, в том числе, являются выход бластоцист в возрасте 7-8 дней, число вылупившихся бластоцист в возрасте 9-10 дней, количество клеток в составе бластоцист.

2. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Маленко, Галина Петровна

5. Выводы.

1. Усовершенствована система получения зародышей крупного рогатого скота вне организма путем дозревания и оплодотворения оодитов и культивирования эмбрионов in vitro без применения соматических клеток. В разработанной системе выход зародышей на стадии бластоцисты составляет свыше 30% от числа ооцитов. В возрасте 7-7.5 суток выявлялось от 75 до 95% от общего числа бластоцист, в возрасте 9-10 суток вылупились или находились в процессе вылупления из zona pellucida соответственно 57.6 и 16.0% зародышей от общего числа бластоцист.

2. Включение в систему дозревания ооцитов фрагментов стенки фолликула, состоящих из теки интерны и прилегающего слоя гранулезы, удлиняет время мейотического дозревания ооцитов и улучшает их раннее эмбриональное развитие. Проведение дозревания комплексов ооцит-кумулюс в открытой системе и в каплях под маслом сопоставимы по эффективности.

3. Эпидидимальные сперматозоиды быка сохраняют жизнеспособность при хранении в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СОг, 5%Ог, 90% N2 в темноте при комнатной температуре в течение суток. Уровень оплодотворения ооцитов эпидидимальными сперматозоидами быка, хранившимися при этих условиях, составил 69-86%.

4. Эпидидимальные сперматозоиды быка проходят стадию капацитации in vitro при совместном культивировании с эпителиальными клетками яйцевода или в среде с содержанием гепарина в количестве 2-10 мкг/мл. Для капацитации сперматозоидов замороженного - оттаянного эякулята быка содержание гепарина в среде должно составлять около 10 мкг/мл. Индивидуальные свойства семени разных быков оказывают влияние на оплодотворяемость ооцитов, выход расширенных и вылупившихся бластоцист, а также на число клеток в составе бластоцист.

5. Количество и качество получаемых in vitro зародышей крупного рогатого скота зависят от марки альбумина в среде оплодотворения. Эффективность отдельных марок или серий альбумина в среде оплодотворения может быть оценена по уровню оплодотворения и дробления ооцитов, а также по выходу бластоцист и числу клеток в составе бластоцист.

6. Зародыши крупного рогатого скота успешно развиваются in vitro в среде SOF независимо от наличия или отсутствия клеток кумулюса на zona pellucida на начало культивирования зигот.

7. Критерием оценки эффективности системы получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в целом, и этапа культивирования зародышей в том числе, может являться показатель образования бластоцист в возрасте 7-8 дней и число вылупившихся и находящихся в процессе вылупления из zona pellucida бластоцист в возрасте 9-10 дней.

8. При нехирургической трансплантации полученных in vitro 8-дневных эмбрионов крупного рогатого скота стали стельными и отелились 42.8% реципиентов (3/7). Приживляемость бластоцист составила 50.0% (3/6). Рождением молодняка подтверждена жизнеспособность получаемых in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

9. Приживляемость полученных in vivo эмбрионов крупного рогатого скота после хранения в среде Menezo В2 или Дюльбекко с 20% эмбриональной сыворотки крови составила 43.0-45.5%. Эмбрионы крупного рогатого скота на стадии бластоцисты можно хранить в течение 4-10 часов в среде Дюльбекко в атмосфере воздуха при температуре 20-25°С.

10. Разработано устройство, позволяющее выделять ооциты крупного рогатого скота без повреждения кумулюса из заданных антральных фолликулов яичников. При использовании устройства 73.1% общего числа выделенных ооцитов представлены комплексами ооцит - кумулюс; выход ооцитов, пригодных для дозревания и оплодотворения in vitro, составил 12-13 в расчете на 1 яичник.

11. Сперматозоиды кролика проходят стадию капацитации in vitro при инкубировании в среде, содержащей 37 мМ бикарбоната натрия и 20% эстральной сыворотки крови, в течение 12 часов. Увеличение

188 продолжительности периода инкубирования in vitro до 17-18 часов не снижает жизнеспособность и оплодотворяющую способность сперматозоидов кролика.

12. Усовершенствованы методы приготовления цитологических и тотальных препаратов предимплантационных зародышей крупного рогатого скота. Использование камеры, насыщенной парами фиксатора, предотвращает потерю эмбрионов, сокращает расход фиксатора, позволяет существенно улучшить условия работы при приготовлении тотальных препаратов. Камера позволяет хранить окрашенные тотальные препараты в течение необходимого времени.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. При получении зародышей крупного рогатого скота вне организма использовать систему культивирования эмбрионов in vitro без применения соматических клеток. В данной системе выход зародышей на стадии бластоцисты составляет около 30% от числа ооцитов. В возрасте 7-7.5 суток выявляется от 75 до 95% общего числа бластоцист, в возрасте 9-10 суток стадии вылупляющейся или вылупившейся из zona pellucida бластоцисты достигает, соответственно, 57.6 и 16.0% зародышей от общего числа бластоцист.

2. Эффективность системы получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в целом, и этапа культивирования зародышей в том числе, оценивать по образованию бластоцист в возрасте 7-8 дней и доле вылупившихся и находящихся в процессе вылупления из zona pellucida бластоцист в возрасте 9-10 дней.

3. Тестировать эффективность отдельных марок или серий альбумина в среде оплодотворения по уровню оплодотворения и дробления ооцитов, а также по выходу бластоцист и числу клеток в составе бластоцист.

4. В случае необходимости хранить эпидидимальные сперматозоиды быка в виде неразбавленной суспензии под минеральным маслом в атмосфере 5% СОя, 5%Ог, 90% N2 в темноте при комнатной температуре.

5. Для хранения эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты в течение 4-10 часов использовать среду Дюльбекко с добавлением 20% сыворотки крови.

6. Для выделения ооцитов крупного рогатого скота без повреждения кумулюса из поверхностных антральных фолликулов нужного диаметра использовать разработанное устройство. При использовании устройства выход комплексов ооцит-кумулюс, пригодных для дозревания и оплодотворения in vitro, составляет 12-13 в расчете на 1 яичник.

7. При приготовлении и хранении тотальных препаратов предимплантационных зародышей крупного рогатого скота применять камеру, насыщенную парами фиксатора или просветляющего раствора, соответственно.

Практические предложения более полно изложены в подготовленных автором "Методических рекомендациях по получению зародышей крупного рогатого скота вне организма".

Методические рекомендации предназначены для студентов, аспирантов, научных сотрудников и специалистов, занимающихся вопросами дозревания и оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

Утверждены Ученым советом ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных 9 июля 2001 года (протокол №6).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Маленко, Галина Петровна, Боровск

1. Абилов А.И., Эрнст Л.К., Стрекозов Н.И., Кононов В.П., Сипко Т.П.

2. Методические рекомендации по получению гибридов путем осеменения домашних коров (Bos taurus) эпидидимальным семенем диких зубров (Bizon bonasus). ВИЖ, Дубровицы. 1994 г.

3. Албертс В., Брейт Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж.

4. Молекулярная биология клетки. Москва "Мир" 1987, том 4, стр. 41-43.

5. Блинова М.И., Лысенок Л.Н. Культуральная посуда и способы ееобработки. В сб.: Методы культивирования клеток. Ленинград. "Наука". 1988, стр. 29-44.

6. Голубев А.К., Кузьмина Т.И., Ткаченко C.B. Влияние аденозина иаденилатов на созревание ооцитов коров in vitro. "Трансплантация и культивирование эмбрионов крупного рогатого скота". Сборник научных трудов ВНИИРГЖ. Ленинград. 1989, стр.48-52.

7. Гузеватый O.E., Старостка В.В., Свидерская Э.А., Ясинский В.А.,

8. Яблонский В.А. Использование яичников стельных коров в технологии оплодотворения in vitro. "Актуальные проблемы биологии в животноводстве". Материалы второй международной конференции. Боровск. 1995, стр. 177.

9. Дарлингтон С.Д., Ла Кур Л.Ф. Хромосомы. Методы работы. Москва.1. Атомиздат. 1980.

10. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Ленинград. "Наука". 1988.

11. Кауффольд П., Тамм И., Шихов И.Я. и др. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота: Руководство для работы по пересадке эмбрионов. М. Агропромиздат 1990.

12. Кривохарченко A.C., Вильянович Л.И., Татаринова Л.В., Рябых В.П. Развитие мышиных эмбрионов in vitro в среде без белка в зависимости от количества зародышей в микрообъеме среды. Онтогенез, 1993;24(6):53-60.

13. Кузьмина Т.И. Влияние возраста доноров ооцитов на качество эмбрионов коров, полученных in vitro. Доклады РАСХН. 1998,N1, стр. 35-36.

14. Кузьмина Т.И., Голубев А.К., Гойло Т.А., Ткаченко C.B. Оптимизация системы экстракорпорального созревания ооцитов коров с целью получения эмбрионов. Сельскохозяйственная биология. 1993,N6, стр. 46-52.

15. Кузьмина Т.И., Шагиахметова Г.А. Модернизация системы дозревания ооцитов коров для повышения эффективности технологии оплодотворения in vitro. Доклады РАСХН. 1995, N4, стр. 25-27.

16. Ласнитски И. Органная культура. В кн. "Культура животных клеток. Методы". Ред. Фрешни Р. "Мир" Москва, 1989, стр. 214-255.

17. Маленко Г.П., Сметанина И.Г., Иванова A.B. Устройство для выделения ооцитов из яичников млекопитающих. Заявка 95100852 от 19.01.95. Положительное решение ВНИИГПЭ от 30.10.1995.

18. Маурер Г. Разработка химически-определенных бессывороточных сред для клеток млекопитающих. В кн. "Культура животных клеток. Методы". Ред. Фрешни Р. "Мир" Москва, 1989, стр. 27-55.

19. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных. Москва. 1962.

20. Михайленко A.B., Пулина Г.А., Языков A.A., Газарян К.Г. Отдельные группы в популяции ооцитов коров, их цитогенетический анализ и способность к созреванию in vitro. Биологические науки. 1983,N9, стр. 57-62.

21. Морено Мело Вильма. Совершенствование метода культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 1992.

22. Прокофьев М.И., Букреев Ю.М., Лагутина И.С., Куртен Е.А., Секирина Г. Г. Культивирование ооцитов коровы с использованием половых гормонов. Бюлл. ВНИИФБиП с/х животных. Боровск. 1986,N4, стр. 4548.

23. Ткачева И.В., Бугров А.Д. Взаимосвязь типоразмеров яичников коров с выходом ооцитов. "Актуальные проблемы биологии в животноводстве". Материалы второй международной конференции, Боровск. 1995, стр. 226.

24. Черных В.Я., Прокофьев М.И., Петунина В.М., Маленко Г.П., Кононов В.П. Устройство для пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. Авторское свидетельство N897224 от 14 сентября 1981 г.

25. Щелкунов И.С., Щелкунова Т.И. Мытье культуральной посуды: отечественное средство "Афол" вместо импортного детергента 7х. Цитология. 1994, том 36, стр. 215-218.

26. Эрнст А.К., Прокофьев М.И., Прокофьева Е.С. и др. Получение телят из дозревших и оплодотворенных вне организма коровы фолликулярных ооцитов. Вестник сельскохозяйственной науки. 1987, N6, стр. 82-87.

27. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Макарова З.Н., Дорожилов А.Е., Кузьмина Т.Н., Царенко Р.Г., Шнур А.И., Федотов Г.П. Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной in vitro яйцеклетки коровы. Вестник сельскохозяйственной науки. 1983, N7, стр. 77-85.

28. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Макарова З.Н., Мамлеев Р.С., Кузьмина Т.И. Культивирование эмбрионов из овоцитов коров. Доклады ВАСХНИА. 1982, N12, стр. 26-28.

29. Яакма Ю.Р. Кратковременное хранение эмбрионов коров перед трансплантацией. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук. Тарту, 1991.

30. Aalseth Е.Р., Sengu P.L., Becker W.C. The relationship of sperm viability and concentration to serum-induced head-to-head agglutination of bovine spermatozoa. J. Reprod. Fert. 1978;53:193.

31. Abe S., Shioya Y. Effects of temperature and duration of preservation of ovaries of cattle in physiological saline on the development of embryos derived from follicular oocytes matured and fertilized in vitro. Anim. Sci. Technol. 1996;67:633-638.

32. Abe H., Otoi t., Tachikawa S. et al. Fine structure of bovine morulae and blastocysts in vivo and in vitro. Anal. Embryol. (Berl.). 1999b;199:519-527.

33. Abe S., Shioya Y. Effect of temperature during transportation of ovaries on the development of bovine follicular oocytes matured and fertilized in vitro. Anim. Sci. Thechnol. 1993;64:32-37.

34. Abeydeera L.R., Niwa K. Ability of in vitro maturing bovine oocytes to transform sperm nuclei to metaphase chromosomes. J. Reprod. Fert., 1992;96:565-572.

35. Ackerman S.B., Swanson R.J., Stokes G.K., Veeck L.L. Culture of mouse preimplantation embryos as a quality control assay for human in vitro fertilization. Gamete Res. 1984;9:145-152.

36. Akruk S.R., Humphreys W.J., Williams W.L. In vitro capacitation of ejaculated rabbit spermatozoa. Differentiation, 1979;13:125-131.

37. Allen R.L., Bondioli K.R., Wright R.W. The ability of fetal calf serum, new-born calf serum and normal steel serum to promote in vitro development of bovine morulae. Theriogenol. 1982;18:185-189.

38. Aman R.R., Parks J.E. Effects of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured bovine oocytes. Biol. Reprod. 1994;50:103-110.

39. Anderson G.B. Advances in large mammalian embryo culture. In: Methods in Mammalian Reproduction Ed.: Daniel J.C. New York, Academic Press. 1978; pp. 273-284.

40. Anderson S.H., Killian G.J. Effect of macromolecules from oviductal conditioned medium on bovine sperm motion and capacitation. Biol. Reprod. 1994;51:795-799.

41. Ansell J.D., Snow M.H.L. The development of trophoblast in vitro from blastocysts containing varying amounts of inner cell mass. J. Embiyol. Exp. Morphol. 1975;33:175-185.

42. Aoyagy Y., Fukui Y., Iwazumi Y., Urakawa M., Minegishi Y., Ono H. Effects of culture system on development of in vitro fertilized bovine ova into blastocyst. Theriogenol. 1989;31:168.

43. Aoyagy Y., Fukui Y., Iwazumi Y., Urakawa M., Ono H. Effects of culture system on development of in vitro fertilized bovine ova into blastocyst. Theriogenol. 1990;34:749-759.

44. Arlotto T.M., Leibfried-Rutledge M.L., First N.L. Size distribution and meiotic competence of bovine primary oocytes from two locations in the ovary. Theriogenol. 1990;33:188.

45. Arlotto T.M., Schwartz J.L., First N.L., Leibfried-Rutledge M.L. Aspects of follicle and oocyte stage that affect in vitro maturation and development of bovine oocytes. Theriogenol. 1996;45:943-956.

46. Asakawa T., Chan P.J., Dukelow W.R. Time sequence of in vitro maturation and chromosomal normality in metaphase I and metaphase II of the squirrel monkey (Saimiri sciureus) oocyte. Biol. Reprod. 1982;27:118-124.

47. Assey R.J., Hyttel P., Greve T., Purwantara B. Oocyte morphology in dominant and subordinate follicles. Mol. Reprod. Dev. 1994;37:335-344.

48. Austin C.R. Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg. Aust. J. Biol. Sci. Ser. B 1951;4:581.

49. Avery B., Jorgensen C.B., Madison V., Greve T. Morphological development and sex of bovine in vitro fertilized embryos. Mol. Reprod. Dev. 1992;32:265-270.

50. Avery B., Greve T. Impact of incubator type on the yield of in vitro produced bovine blastocysts. Acta Vet. Scand. 1992;33:341-348.

51. Azambuja R.M., Kraemer D.C., Westhusin M.E. Effects of low temperatures on in vitro produced bovine zygotes. Mol. Reprod. Dev. 1997;47:435-439.

52. Ball G.D., Bellin M.E., Ax R.L., First N.L. Glycosaminoglycans in bovine cumulus-oocyte complexes: morphology and chemistry. Mol. Cell. Endocrinol. 1982;28:113-122.

53. Ball G.D., Leibfried M.L., Lenz R.W., Ax R.L., Bavister B.D., First N.L. Factors affecting successful in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. Biol. Reprod. 1983;28:717-725.

54. Ball G.D., Wieben E.D., Byers A.P. DNA, RNA, and protein synthesis by porcine oocyte-cumulus complexes during expansion. Biol. Reprod. 1985;33:739-744.

55. Barnes F.L., Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First N.L. Morphological and molecular aspects of early development in the bovine. Theriogenol. 1987;27:210.

56. Barnes F.L., First N.L. Embryonic transcription in in vitro cultured bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 1991;29:117-123.

57. Barros C., Arrau J., Herrera E. Induction of the acrosome reaction of golden hamster spermatozoa with blood serum collected at different stages of the estrous cycle. J. Reprod. Fert. 1971;28:67-71.

58. Batt P.A., Gardner D.K., Cameron A.W.N. Oxygen concentration and protein source affect the development of preimplantation goat embryos in vitro. Reprod. Fert. Dev. 1991;3:601-607.

59. Bavister B.D. Co-culture for embryo development: is it really necessary. Human Reprod. 1992;17:1339-1341.

60. Bavister B.D. Role of oviductal secretion in embryonic growth in vivo or in vitro. Theriogenol. 1988;29:143-154.

61. Bavister B.D., Arlotto T. Influence of single amino acids on the development of hamster one-cell embryo in vitro. Mol. Reprod. Dev. 1990;25:45-51.

62. Bavister B.D., Chen A.F., Fu P.C. Catecholamine requirement for hamster sperm motility in vitro. J. Reprod. Fert. 1979;56:507-513.

63. Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extract and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster sperm in vitro. Biol. Reprod. 1977;16:228-237.

64. Bavister B.D., Mc Kiernan S.H. Evaluation of physicochemical culture conditions influencing in vitro development of hamster 2-cell embryos to the blastocyst stage. Biol. Reprod. 1990;42:Suppl.l:57.

65. Bavister B.D., Rose-Hellekant T.A., Pinyopummintr T. Development of in vitro matured/in vitro fertilized bovine embryos into morulae and blastocysts in defined culture media. Theriogenol. 1992;37:127-146.

66. Bedford J.M. Techniques and criteria used in the study of fertilization. In: Methods in Mammalian Embryology. Ed.: Daniel J.C. San Francisco, WH Freeman, 1971, pp.37-63

67. Behboodi E., Anderson G.B., BonDurant R.H. Development of in vitro fertilized oocytes from pregnant and non pregnant cows in oviductal epithelial and cumulus cells co-culture systems. Biol. Reprod. 1991;Suppl. 1:148.

68. Bernard C., Lambert R.D., Beland R., Belanger A. Laparoscopic investigation of the bovine ovary in the preovulatory phase of the cycle. Theriogenol. 1984;22:143-150.

69. Berthelot F., Terqui M. Effects of oxygen, CO / pH and medium on the in vitro development individually cultured porcine one- and two-cell embryos. Reprod. Nutr. Dev. 1996;36:241-251.

70. Betteridge K.J., Flechon J.E. The anatomy and physiology of pre-attachment bovine embryos. Theriogenol. 1988;29:155-187.

71. Bishop D.W. Oxygen concentration in the rabbit genital tract. In: Proc. Third Internat. Congr. Anim. Reprod. Physiol. Ed.: D.W. Bishop. London: Brown, Knight and Truscott Ltd 1956:53-58.

72. Blondin P., Coenen K., Guilbault L.A., Sirard M.A. In vitro production of bovine embryos: developmental competence is acquired before maturation. Theriogenol. 1997;47:1061-1075.

73. Blondin P., Guilbault L.A., Sirard M.A. In vitro production of bovine embryos: developmental competence is acquired before maturation. Theriogenol. 1995;43:168.

74. Blondin P., Sirard M.A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Mol. Reprod. Dev. 1995;41:54-62.

75. Boatman D.E. In vitro growth of non-human primate pre- and peri-implantation embryos. In: The Mammalian Preimplantation Embryo. Regulation of Growth and Differentiation in Vitro. Ed. B.D.Bavister. New York : Plenum Press; 1987:273-308.

76. Boediono A., Rajamahendran R., Saha S., Sumantri C., Suzuki T. Effect of the presence of a CL in the ovary on oocyte number, cleavage rate and blastocyst production in vitro in cattle. Theriogenol. 1995;43:169.

77. Boice M.L., Geisert R.D., Blair R.M., Verhage H.G. Identification and characterization of bovine oviductal glycoproteins synthesized at estrus. Biol. Reprod. 1990;43:457-465.

78. Boice M.L., Mavrogianis P.A., Murphy C.N., Prather R.S., Day B.N. Immunocytochemical analysis of the association of bovine oviduct-specific secretory glycoproteins with early embryos. J. Exp. Zool. 1992;263:225-229.

79. Boland M.P. Use of the rabbit oviduct as a screening tool for the viability of mammalian eggs. Theriogenol. 1984;21:126-137.

80. Bolls P.E.J., Van Soom A., Ysebaert M.T., Vandenheede J.M.M., De Kruif A. Effects of aspiration vacuum and needle diameter on cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Therogenol. 1996;45:1001-1014.

81. Bondioli K.R., Hawk H.W., Wall R.J. Effect of glycine and alanine on co-culture of bovine blastocysts. Theriogenol. 1995;43:170.

82. Bondioli K.R., Wright R.W. In vitro fertilization of bovine oocytes by spermatozoa capacitated in vitro. J. Anim. Sei. 1983;57:1001-1005.

83. Boni R., Tosti E., Roviello S., Dale B. Intercellular communication in in vivo- and in vitro-produced bovine embryos. Biol. Reprod. 1999;61:1050-1055.

84. Böttcher M., Alm H., Lange W., Kauffold P. Aktuelle Methoden der Eizellgewinnung fur in-vitro-zelltechniken. Wiss. Z. Universität Rostok N-Reihe. 1983;38:21-24.

85. Brackett B.G., Bousquet D., Boice M.L., Donawick W.J., Evans J.F., Dressel M.A. Normal development following in vitro fertilization in the cow. Biol. Reprod. 1982;27:147-158.

86. Brackett B.G., Oh Y.K., Evans J.F., Donawick W.J. Fertilization and early development of cow ova. Biol. Reprod. 1980;23:189-205.

87. Brackett B.G., Oliphant G. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro. Biol. Reprod. 1975;12:260-274.

88. Brackett B.G., Zuelke K.A. Analysis of factors involved in the in vitro production of bovine embryos. Theriogenol. 1993;39:43-64.

89. Brinster R.L. A method for in vitro cultivation of mouse ova from two-cell to blastocyst. Exp. Cell Res. 1963;32:205-208.

90. Brown B.W., Fraser I.S., Mattner P.E. Capillarly blood flow in the endometrium and myometrium of conscious sheep: Effect of catheterization of uterine arteries. Aust. J. Biol. Sci. 1985;38:209-214.

91. Callesen H., Greve T., Hyttel P. Preovulatory endocrinology and oocyte maturation in superovulated cattle. Theriogenol. 1986;25:71-86.

92. Camous S., Heyman Y., Menezo Y. In vitro culture of early bovine embryos with trophoblastic vesicles: cleavage through the block stage, followed by pregnancy after transfer. Theriogenol. 1984a;21:226.

93. Carney E.W., Bavister B.D. Regulation of hamster embryo development in vitro by carbon dioxide. Biol. Reprod. 1987b;36:155-163.

94. Carney E.W., Bavister B.D. Stimulatory and inhibitory effects of amino acids on the development of hamster eight-cell embryos in vitro. J. In Vitro Fertil. Embr. Transf. 1987a;4:162-167.

95. Carolan C., Lonergan P., Khatir H., Mermillod P. In vitro production of bovine embryos using individual oocytes. Mol. Reprod. Dev. 1996;45:145-150.

96. Carolan C., Lonergan P., Van Langenddonckt A., Mermillod P. Factors affecting bovine embryo development in synthetic oviduct fluid following oocyte maturation and fertilization in vitro. Theriogenol. 1995;43:1115-1128.

97. Carolan C., Monaghan P., Gallagher M., Gordon I. Effect of recovery method on yield of bovine oocytes per ovary and their developmental competence after maturation, fertilization and culture in vitro. Theriogenol. 1994;41:1061-1068.

98. Chatot C.L., Ziomek C.A., Bavister B.D., Lewis J.L., Torres J. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J. Reprod. Fert. 1989;86:679-688.

99. Chatot C.L., Lewis J.L., Torres J., Ziomek C.A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 1990;42:432-440.

100. Chauhan M.S., Singla S.K., Palta P., Mani K.R.S., Madan M.L. In vitro maturation and fertilization, and subsequent development of buffalo (Bubalus bubalis) embryos: effects of oocyte quality and type of serum. Reprod. Fert. Dev. 1998;10:173-177.

101. Chian R.C., Blondin P., Sirard M.A. Effect of progesterone and/or estradiol- 17YIB on sperm penetration in vitro of bovine oocytes. Theriogenol. 1996;46:459-469.

102. Choudary J.B., Gier H.T., Marion G.B. Cyclic changes in bovine vesicular follicles. J. Anim. Sci. 1968;27:468.

103. Cornett L.E., Meizel S. Stimulation of in vitro activation and the acrosome reaction of hamster sperm by catecholamines. Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 1978;75:4954-4958.

104. Cox J.E. Effect of the cumulus on in vitro fertilization of in vitro matured cow and sheep oocytes. Theriogenol. 1991;35:191.

105. Cran D.G. Qualitative and quantitative structural changes during pig oocyte maturation. J. Reprod. Fert. 1985;74:237-245.

106. Critser E.S., Leibfried-Rutledge M.L., Eyestone W.H.,Northey D.L., First N.L. Acquisition of developmental competence during maturation in vitro. Theriogenol. 1986;25:150.

107. Critser E.S., Leibfried-Rutledge M.L., First N.L. Influence of cumulus cell association during in vitro maturation of bovine oocytes on embryonic development. Biol. Reprod. 1986a;34(Suppl. 1):286.

108. Crosby I.M., Osborn J.C., Moor R.M. Follicle cell regulation of protein synthesis and developmental competence in sheep oocytes. J. Reprod. Fert. 1981;62:575-582.

109. Crozet N. Ultrastructural aspects of in vivo fertilization in the cow. Gamete Res. 1984;10:241-251.

110. Davis B.K. Timing of fertilization in mammals: sperm cholesterol/phospholipid ratio as determinant of capacitation interval. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981;78:7560-7564.

111. Davis B.K., Byrne R., Bedigan K. Studies on the mechanism of capacitation: Albumin mediated changes in plasma membrane lipids during in vitro incubation of rat sperm cells. Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 1980;77:1546-1550.

112. Dawson K.M., Baltz J.M.Organic osmolytes and embryos: substrates of the Gly and (3 transport systems protect mouse zygotes against the effects of raised osmolarity. Biol. Reprod. 1997;56:1550-1558.

113. Dawson K.M., Collins J.L., Baltz J.M. Osmolarity-dependent glycine accumulation indicates a role for glycine as an organic osmolyte in early preimplantation mouse embryos. Biol. Reprod. 1998;59:225-232.

114. De Loos F.A.M., Bevers M.M., Dieleman S.J., Kruip T.A.M. Follicular and oocyte maturation in cows treated for superovulation. Theriogenol. 1991b;35:537-546.

115. De Loos F.A.M., Bevers M.M., Dieleman S.J., Kruip T.A.M. Morphology of preovulatory bovine follicles as related to oocyte maturation. Theriogenol. 199la;35:527-535.

116. De Loos F., van Vliet C., van Mauri K.P., Kruip T.A.M. Morphology of immature bovine oocytes. Gamete Res. 1989;24:197-204.

117. De Loos F., Kastrop P., Van Maurile P., Van Beneden T.H., Kruip T.A.M. Heterologous cell contacts and metabolic coupling in bovine cumulus oocyte complexes. Mol. Reprod. Dev. 1991;28:255-259.

118. De Matos D.G., Furnus C.C., Moses D.F. Glutathione, synthesis during in vitro maturation of bovine oocytes: role of cumulus cells. Biol. Reprod. 1997;57:1420-1425.

119. Dessy F., Ferry L., Mermillod P., Massip A. Bovine embryos cultured in serum-free conditioned medium need cooperation to reach the blastocyst stage. Biol. Reprod. 1993;48(Suppl. 1): 172.

120. Deter R.L. Quantitative morphological analysis of mouse embiyogenesis in vitro. J. Embiyol. Exp. Morph. 1977;40:91-100.

121. Dieleman S.J., Blankenstein D.M. Changes in estrogen synthesizing ability of preovulatory bovine follicles relative to the peak of LH. J. Reprod. Fert. 1984;72:487-494.

122. Dieleman S.J., Blankenstein D.M. Progesterone-synthesizing ability of preovulatory follicles of cows relative to the peak of LH. J. Reprod. Fert. 1985;75:609-615.

123. Dinnyes A., Lonergan P., Fair T. et al. Timing of the first cleavage postinsemination affects cryosurvival of in vitro-produced bovine blastocysts. Mol. Reprod. Dev. 1999;53:318-324.

124. Dominco T., First N.L. Kinetics of bovine oocyte maturation allows selection for developmental competence and is affected by gonadotropins. Theriogenol. 1992;37:203.

125. Dominco T., First N.L. Relationship between the maturational state of oocytes at the time of insemination and sex ratio of subsequent early bovine embryos. Theriogenol. 1997b;45:1041-1050.

126. Dominco T., First N.L. Timing of meiotic progression in bovine oocytes and its effect on early embryo development. Mol. Reprod. Dev. 1997a;47:456-467.

127. Donnay I., Van Langendonckt A., Auquier P., Grisart B., Vansteenbrugge A., Massip A., Dessy F. Effects of co-culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryos. Theriogenol. 1997;47:1549-1561.

128. Dorland M., Gardner D.K., Trounson A.O. Serum in synthetic oviduct fluid causes mitochondrial degeneration in ovine embryos. J. Reprod. Fert. 1995; Abstr. Ser. B:70.

129. Driancourt M.A. Follicular dynamics in sheep and cattle. Theriogenol. 1991; 35:55-68.

130. Dulak N.C., Temin H.M. A partially purified polypeptide fraction from rat liver cell conditioned medium with multiplication-stimulating activity for embryo fibroblasts. J. Cell Physiol. 1973;81:153-160.

131. Dyban A.P. An improved method for chromosome preparations from preimplantation mammalian embryos, oocytes or isolated blastomers. Stain Technol. 1983;58:69-72.

132. Ealy A.D., Hansel P.J. Induced thermotolerance during early development of murine and bovine embryos. J. Cell Physiol. 1994;160:463-468.

133. Eckert J., Niemann H. Effects of platelet-derived growth factor (PDGF) on the in vitro production of bovine embryos in protein-free media. Theriogenol. 1996;46:307-320.

134. Eckert J., Niemann H. MRNA expression of leukemia inhibitory factor (LIF) and its receptor subunits glycoprotein 130 and LIF-receptor-beta in bovine embryos derived in vitro or in vivo. Mol. Hum. Reprod. 1998;4:957-965.

135. Edwards J.L., Hansen P.J. Differential responses of bovine oocytes and preimplantation embryos to heat shock. Mol. Reprod. Dev. 1997;46:138-145.

136. Edwards R.C. Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig, Rhesus monkey and human ovarian oocytes. Nature. 1965;208:349-351.

137. Ellington J.E., Carney E.W., Farrell P.B., Simkin M.E., Foote R.H. Bovine 1-2-cell embryo development using a simple medium in three oviduct epithelial cell co-culture systems. Biol. Reprod. 1990a;43:97-104.

138. Ellington J.E., Farrell P.B. Early bovine embryo development in oviduct cell co-culture versus in the cow for 6 days. Biol. Reprod. 1990b;42(Suppl. 1): 176.

139. Eppig J.J. FSH stimulates hyaluronic acid synthesis by oocyte-cumulus cell complexes from mouse preovulatory follicles. Nature 1979;281:483-484.

140. Eyestone W.H., First N.L. Co-culture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviductal tissue or in conditioned medium. J. Reprod. Fert. 1989b;85:715-720.

141. Eyestone W.H., First N.L. Variation in bovine embryo development in vitro due to bulls. Theriogenol. 1989a;31:191.

142. Eyestone W.H., First N.L. Cell cycle analysis of early bovine embryos. Theriogenol. 1988;29:243.

143. Eyestone W.H., First N.L. Characterization of developmental arrest in early bovine embryos cultured in vitro. Theriogenol. 1991a;35:613-624.

144. Eyestone W.H., Jones J.M., First N.L. The use of oviduct-conditioned medium for culture of bovine oocytes to the blastocyst stage. Theriogenol. 1990;33:226.

145. Eyestone W.H., Northey D.L., Leibfried-Rutledge M.L. Culture of 1-cell bovine embryos in the sheep oviduct. Biol.Reprod. 1985;32(Suppl. 1): 100.

146. Fanning M.D., Sawyer H.R., Anthony R.V. Ovine blastocele formation in vitro is fluenced by human sera. J. Anim. Sci. 1997;75(Suppl. 1):220.

147. Fassi-Fihri N., Chupin D., Marguant-Le Guienne B., Thibier M. Critical effect of granulosa cells from preovulatory follicles on IVM, JVF and embryonic development in cattle. Theriogenol. 1991;35:128.

148. Ferry L., Mermillod P., Massip A., Dessy F. Bovine embryos cultured in serum-poor oviduct-conditioned medium need cooperation to reach the blastocyst stage. Theriogenol. 1994;42:445-453.

149. Fischer B., Bavister B.D. Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamster and rabbits. J. Reprod. Fert. 1993;99:673-679.

150. Flood L.P., Shirley B. Reduction of embryotoxicity by protein in embryo culture media. Mol. Reprod. Dev. 1991;30:226-231.

151. Florman H.M., First N.L. Regulation of acrosomal exocytosis. II.The zona pellucida-induced acrosome reaction of bovine spermatozoa iscontrolled by extrinsic positive regulatory elements. Dev. Biol 1988b; 128:464-473.

152. Florman H.M., First N.L. Regulation of acrosomal exocytosis. I.Sperm capacitation is required for the induction of acrosome reactions by the bovine zona pellucida in vitro. Dev. Biol. 1988a; 128:453-463.

153. Fortune J.E., Hansel W. Concentrations of steroids and gonadotropins in follicular fluid from normal heifers and heifers primed for superovulation. Biol. Reprod. 1985; 32:1069-1079.

154. Fower C.J., Callingham B.A. Substrate selective activation of rat liver mitochondrial monoamine oxidase by oxygen. Biochem. Pharm. 1978;27:1995-2000.

155. Fraser L.R. Albumin is required to support the acrosome reaction but not capacitation in mouse spermatozoa in vitro. J. Reprod. Fert. 1985;74:185-196.

156. Frei R.L., Schultz G.A., Church R.B. Qualitative and quantitative changes in protein synthesis occur at the 8-16 cell stage of embryogenesis min the cow. J. Reprod. Fert. 1989;86:637-641.

157. Fry R.C., Batt P.A., Fairclough R.G., Parr R.A. Human leukemia-inhibitory factor improves the viability of cultured ovine embryos. Biol. Reprod. 1992;46:470-474.

158. Fujitani Y., Kasai K., Ohtanis S., Nishimura K., Yamada M., Utsumi K. Effect of oxygen concentrations and free radicals on in vitro development of in vitro produced bovine embryos. J. Anim. Sci. 1997;75:483-489.

159. Fukuda Y., Ichikawa M., Nato K., Toyoda Y. Birth of normal calves resulting from bovine oocytes matured, fertilized, and cultured with cumulus cells in vitro up to the blastocyst stage. Biol. Reprod. 1990;42:114-119.

160. Fukuda Y., Ichikawa M., Nato K., Toyoda Y. Normal development of bovine oocytes matured, fertilized, and cultured with cumulus cells in vitro. 11th Int. Congr. Anim. Repr. AI, Dublin 1988;3:327.

161. Fukui Y., Ono H. Effects of sera, hormones and granulosa cells added to culture medium for in vitro maturation, fertilization, cleavage and development of bovine oocytes. J. Reprod. Fert. 1989; 86:501-506.

162. Fukui Y. Effect of follicle cells on the acrosome reaction, fertilization, and developmental competence of bovine oocytes matured in vitro. Mol. Reprod. Dev. 1990;26:40-46.

163. Fukui Y., Fukushima M., Ono H. Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures. Theriogenol. 1983;20:651-660.

164. Fukui Y., Lee E.S., Araki N. Effect of medium renewal during culture in two different culture systems on development to blastocysts from in vitro produced early bovine embryos. J. Anim. Sci. 1996;74:2752-2758.

165. Fukui Y., Ono H. In vitro development to blastocyst of in vitro matured and fertilized bovine oocytes. Vet. Rec. 1988; 122:282.

166. Fukui Y., Sakuma Y. Maturation of bovine oocytes cultured in vitro: relation to ovarian activity, follicular size and the presence or absence of cumulus cells. Biol. Reprod. 1980;22:669-673.

167. Fukui Y., Sonoyama T., Mochizuki H., Ono H. Effects of heparin dosage and sperm capacitation time on in vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes matured in vitro. Theriogenol. 1990;34:579-591.

168. Fukui Y., McGowan L.T., James R.W., Pugh P.A., Tervit H.R. Factors affecting the in vitro development to blastocysts of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. J. Reprod. Fert. 1991;92:125-131.

169. Fukushima M., Fukui Y. Effect of gonadotropins and steroids on the subsequent fertilizability of extrafollicular bovine oocytes cultured in vitro. Anim. Reprod. Sci. 1985;9:323-332.

170. Fulka J., Pavlok J.A., FulkaJ. In vitro fertilization of zona free bovine oocytes matured in culture. J. Reprod. Fert. 1982;64:495-499.

171. Funahashi H., Cantley T.C., Day B.N. Synchronization of meiosis in porcine oocytes by exposure to dibutyryl cyclic adenosine monophosphate improves developmental competence following in vitro fertilization. Biol.Reprd., 1997;57:49-53.

172. Funston R.N., Nauta W.J., Seidel G.E. Culture of bovine embryos in buffalo rat liver cell-conditioned media or with leukemia inhibitory factor. J. Anim. Sci. 1997;75:1332-1336.

173. Furnus C.C., De Matos D.G., Martinez A.G., Matkovic M. Effect of glucose on embryo quality and post-thaw viability of in vitro-produced bovine embryos. Theriogenol. 1997;47:481-490.

174. Furnus C.C., De Matos D.G., Moses D.F. Cumulus expansion during in vitro maturation of bovine oocytes: relationship with intracellular glutathione level and its role on subsequent embryo development. Mol. Reprod Dev. 1998;51:76-83.

175. Gandolfi F., Brevini T.A.L., Richardson L., Brown C.R., Moor R.M. Characterization of proteins secreted by sheep oviduct epithelial cells and their function in embryonic development. Development 1989;106:303-312.

176. Gandolfi F., Moor R.M. Stimulation of early embryonic development in sheep by co-culture with oviduct epithelial cells. J. Reprod. Fert. 1987;81:23-28.

177. Gardner D.K. Mammalian embryo culture in the absence of serum or somatic cell support. Cell Biol. Int. 1994;18:1163-1179.

178. Gardner D.K., Lane M. Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol. Reprod. 1993;48:377-385.

179. Gardner D.K., Leese H,J. Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development and metabolism in vitro. J. Reprod. Fert. 1990;88:361-368.

180. Gibbons J.K., Krisher R.L., Carlin S.K., Pearson R.E., Gwazdauskas F.C. In vitro embryo production after microinjection and ovarian dynamics following transvaginal follicular oocyte aspiration. Theriogenol. 1995;43:1129-1139.

181. Gliedt D.W., Rosenkrans C.F., Rorie R.W., Munyon A.L., Pierson J.N., Miller G.F., Rakes J.M. Effects of media, serum, oviductal cells, and hormones during maturation on bovine embryo development in vitro. J. Dairy Sei. 1996;79:536-542.

182. Gordon I., Lu K.H. Production of embiyos in vitro and its impact on livestock production. Theriogenol. 1990;33:77-87.

183. Gordon I., Lu K.H., Boland M.P., Crosby T.E. In vitro fertilization of bovine oocytes matured in vitro. Anim. Prod. 1987;44:468.

184. Goto K., Kajihara Y., Kosaka S., Koba M., Nakanishi Y., Ogawa K. Pregnancies after co-culture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes. J. Reprod. Fert. 1988;83:753-758.

185. Goto Y., Nöda Y., Mori T., Nakano M. Increased generation of reactive oxygen species in embryo cultured in vitro. Free Rad. Biol. Med. 1993;15:69-75.

186. Goto Y., Kaneyama K., Kobayashini S. et al. Birth of cloned calves derived from cultured oviductal epithelial cells of a dairy cow. Anim. Sei. J. 1999;70:243-245.

187. Graves C.N., Biggers J.D. Carbon dioxide fixation by mouse embryos prior to implantation. Science 1970;167:1506-1508.

188. Greve T., Bousquet D., King W.A., Betteridge K.J. In vitro fertilization and cleavage of in vivo matured bovine oocytes. Theriogenol. 1984;22:151-165.

189. Greve T., Madison V. In vitro fertilization in cattle: a review. Reprod. Nutr. Dev. 1991;31:147-157.

190. Greve T., Madison V., Avery B. et al. In vitro production of bovine embryos: A progress report and the consequences on the genetic upgrading of cattle populations. Anim. Reprod. Sei. 1993;33:51-69.

191. Grisart B., Massip A., Dessy F. Cinematographic analysis of bovine embryo development in serum- free oviduct-conditioned medium. J. Reprod. Fert. 1994;101:257-264.

192. Grisart B., Massip A., Collette L., Dessy F. The sex ratio of bovine embryos produced in vitro in serum-free oviduct cell-conditioned medium is not altered. Theriogenol. 1995;43:1097-1106.

193. Gutteridge J.M.C. A method for removal of trace iron contamination from biological buffers. FEBS Lett. 1987;214:362-364.

194. Guyader C., Chupin D. Capacitation of fresh bovine spermatozoa on bovine epithelial oviduct cell monolayers. Theriogenol. 1991;36:505-512.

195. Hagemann L.J., Weilert L.L., Beaumont S.E., Tervit H.R. Development of bovine embryos in single in vitro production (SINP) systems. Mol. Reprod. Dev. 1998;51:143-147.

196. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. 2 nd ed. Oxford: Oxford University Press; 1989.

197. Hamano S., Koikeda A. Developmental capacity of F1 Hybrid embryos produced by in vitro fertilization between different breeds of Japanese beef cattle. J. Reprod. Dev. 1995; 41:149-152.

198. Hamano S., Kuwayama M. In vitro fertilization and development of bovine oocytes recovered from the ovaries of individual donors. A comparison between the cutting and aspiration method. Theriogenol. 1993;39:703-712.

199. Hamilton W.J., Laing J.A. Development of the egg of the cow up to the stage of blastocyst formation. J. Anat. 1946;80:194-204.

200. Hanada A., Suzuki T., Shioya Y. Birth of calves originated from nonsurgical transfer of blastocysts originated from in vitro fertilized oocytes matured in vitro. Proc. 78 Th. Meet. Jpn. Soc. Zootech. Sci. 1986:18.

201. Handrow R.R., Lenz R.W., Ax R.L. Structural comparisons among glycosaminoglycans to promote an acrosome reaction in bovine spermatozoa. Biochem. Biophys. Rec. Comm. 1982;107:1326-1332.

202. Handrow R.R., First N.L., Parrish J.J. Calcium requirement and increased association with bovine sperm during capacitation by heparin. J. Exp. Zool. 1989;252:174-182.

203. Harper K.M., Brackett B.G. Bovine blastocyst development after in vitro maturation in a defined medium with epidermal growth factor and low concentration of gonadotropins. Biol. Reprod. 1993;48:409-416.

204. HaslerJ.F., Henderson W.B., Hurtgen P.J. et al. Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenol. 1995;43:141-152.

205. Hawk H.W., Wall R.J. Improved yields of bovine blastocysts from in vitro-produced oocytes. I. Selection of oocytes and zygotes. Theriogenol. 1994;41:1571-1583.

206. Hawk H.W., Wall R.J. Improved yields of bovine blastocysts from in vitro produced oocytes. II. Media and co-culture cells. Theriogenol. 994b;41:1585-1594.

207. Hazeleger N.L., Stubbings R.B. Developmental potential of selected bovine oocyte cumulus complexes. Theriogenol. 1992;37:219.

208. Henault M.A., Killian G.J. Synthesis and secretion of lipids by bovine oviduct mucosal explants. J. Reprod. Fert. 1993;98:431-438.

209. Henderson K.M., Mc Neilly A.S., Swanston I.A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. J. Reprod. Fert. 1982;65:467-473.

210. Henderson K.M., Mc Natty K.P., Gibb M., O'Keeffe L.E., Lun S., Heath D.A., Prisk M.D. Influence of follicular health on the steroidogenic and morphological characteristics of bovine granulosa cells in vitro. J. Reprod. Fert. 1987;79:185-193.

211. Hendriksen P.J., Vos P.L., Steenweg W.N., Bevers M.M., Dieleman S.J. Bovine follicular development and its effect on the in vitro competence of oocytes. Theriogenol. 2000;53:11-20.

212. Henriks D.M., Dickey J.F., Niswender G.D. Serum luteinizing hormone and plasma progesterone levels during the estrous cycle and early pregnancy in cows. Biol. Reprod. 1970;2:346-351.

213. Hernandez-Ledezma J.J., Villanueva C., Sikes J.D., Kubisch H.M. Increasing the rate of blastocyst formation and hatching from in vitro-produced bovine zygotes. Theriogenol. 1996;46:961-969.

214. Herrler A., Lucas-Hahn A., Niemann H. Effect of insulin-like growth factor I on in vitro production of bovine embryos. Theriogenol. 992;37:1213-1224.

215. Heyman Y., Menezo Y., Chesne P., Camous S., Gamier V. In vitro cleavage of bovine and ovine early embryos: improved development using coculture with trophoblastic vesicles. Theriogenol. 1987;27:59-68.

216. Heyman Y., Menezo Y. Interaction of trophoblastic vesicles with bovine embryos developing in vitro. In: The Mammalian Preimplantation Embryo. Regulation of Growth and Differentiation in Vitro. Ed. B.D.Bavister. New York : Plenum Press; 1987:175-191.

217. Hill J.L., Wade M.G., Nancarrow C.D., Kelleher D.L., Boland M.P. Influence of ovine oviductal amino acid concentrations and ovine estrus-associated glycoprotein on development and viability of bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 1997;47:164-169.

218. Hillensjo T., Channing C.P. Gonadotropin stimulation of steroidogenesis and cellular dispersion in cultured porcine cumuli oophori. Gamete Res. 1980;3:233-240.

219. Holm P., Shukri N.N., Vajta G., Booth P., Bendixen C., Callesen H. Developmental kinetics of the first cell cycles of bovine in vitro produced embryos in relation to their in vitro viability and sex. Theriogenol. 1998;50:1285-1299.

220. Ireland J.J., Roche J.F. Development of antral follicles in cattle after prostaglandin-induced luteolysis: Changes in serum hormones steroides in follicular fluid, and gonadotropin receptors. Endocrinology, 1982;111:2077-2086.

221. Ito k., Takahashi M., Kawahata K., Goto T., Takahashi J., Yasuda Y. Supplementation effect of early pregnancy factor-positive serum into bovine in vitro fertilization culture medium. Am. J. Reprod. Immunol. 1998;39:356-361.

222. Iwasaki S., Nakahara T. Incidence of embryos with chromosomal anomalies in the inner cell mass amouns bovine blastocysts fertilized in vitro. Theriogenol. 1990b;34:683-690.

223. Iwasaki S., Nakahara T. Cell number and incidence of chromosomal anomalies in bovine blastocysts fertilized in vitro followed by culture in vitro or in vivo in rabbit oviducts. Theriogenol. 1990a;33:669-675.

224. Iwasaki S., Kono T., Fukatsu H., Nakahara T. Production of bovine tetraploid embryos by electrofusion and their developmental capability in vitro. Gamete Res. 1989;24:261-267.

225. Iwasaki S., Kono T., Nakahara T., Shioya Y., Fukushima M., Hanada A. New methods for the recovery of oocytes from bovine ovarian tissue in relation to in vitro maturation and fertilization. Jpn. J. Anim. Reprod. 1987;33:188-192.

226. Jagiello G.M., Miller W.A., Ducayen M.B., Lin J.S. Chiasma frequency and disjunctional behavior of ewe and cow oocytes matured in vitro. Biol. Reprod. 1974;10:354-363.

227. Javed M.H., Wright R.W. Determination of pentose phosphate and embden-meyerhof pathway activities in bovine embryos. Theriogenol. 1991;35:1029-1037.

228. Jiang H.S., Wang W.L., Lu K.H., Mc Carthy D., Gordon I. In vitro culture of early bovine embryos derived from in vitro fertilization comparison with in vivo culture. J. Reprod. Fert., Abstr. Ser. 1989;No3:50.

229. Jiang U.S., Wang W.L., Lu K.H., Gordon I. Effects of PMSG, insulin, osmolality and estrous cow serum on development of IVM early bovine embiyos cultured on granulosa cell monolayers. Theriogenol. 1990;33:258.

230. Jiang H.S., Wang W.L., Lu K.H., Gordon I., Polge C. Roles of different cell monolayers in the co-culture of IVF bovine embryos. Theriogenol. 1991a;35:216.

231. Jiang S., Yang X., Chang S., Heuwieser W., Foote R.H. Effect sperm capacitation and oocyte maturation procedures on fertilization and development of bovine oocytes in vitro. Theriogenol. 1991a; 35:218.

232. Johnson M.H., Nasr-Esfahani M.H. Radical solutions and culture problems: could free oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embiyos in vitro? Bioassays. 1994;16:31-38.

233. Johnson S.K., Jordon J.E., Dean R.G., Page R.D. The quantitation of bovine embryos viability using a bioluminescent assay for lactate dehydrogenase. Theriogenol. 1991;425-433.

234. Ju J.C., Parks., Yang X. Thermotolerance of IVM-derived bovine oocytes and embryos after short-term heat shock. Mol. Reprod. Dev. 1999;53:336-340.

235. Kajihara Y., Goto K., Kosaka S., Nakanishi Y., Ogawa K. In vitro fertilization of bovine follicular oocytes and their development up to hatched blastocysts in vitro. Jpn. J. Anim. Reprod. 1987;33:173-180.

236. Kamiguchi Y., Funaki K., Mikamo K. A now technique for chromosome study of murine oocytes. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. 1976;52:316-319.

237. Kanagawa H. Recovery of unfertilized ova from slaughtered cattle. Jap. J. Vet. Res. 1979;27:72-76.

238. Kane M.T. In vitro growth of preimplantation rabbit embryos. In: The Mammalian Preimplantation Embryo. Regulation of growth and differentiation in vitro. Ed.: Bavisster B.D. Plenum Press, 1987; 193-219.

239. Kato Y., Tani T., Sotomaru Y. et al. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science. 1998;282(11).

240. Katska L. Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from slaughter cattle. Anim. Reprod. Sci. 1984; 7 461-463.

241. Katska L., Smorag L. Number and quality of oocytes in relation to age of cattle. Anim. Reprod. Sci. 1984;7:451-460.

242. Kay G.W., Hawk H.W., Waterman R.A., Wall R.J. Identification of pronuclei in in vitro fertilized cow embryos. Anim. Biotech. 1991;2:45-59.

243. Keefer C.L., Paprocki A.M. Effect of Percoll following sperm separation on in vitro fertilization of bovine oocytes. Theriogenol. 1995;43:244.

244. Keefer C.L., Stice S.L., Maki-Laurila M. Bovine embryo development in vitro: effect of in vitro maturation conditions on fertilization and blastocyst development. Theriogenol. 1991;35:223.

245. Keefer C.L., Stice S.L., Paprocki A.M., Golueke P. In vitro culture of bovine IVM/IVF embryos: Cooperative interaction among embryos and the role of growth factor. Theriogenol. 1994;41:1323-1331.

246. Khatir H., Lonergan P., Carolan C., Mermillod P. Prepubertal bovine oocytes: A negative model for studying oocyte developmental competence. Mol. Reprod. Dev. 1996; 45: 231-239.

247. Killian G.J., Chapman D.A., Kavanaugh J.F., Deaver D.R., Wiggin H.B. Changes in phospholipids, cholesterol and protein content of oviduct fluid of cows during the estrus cycle. J. Reprod. Fert. 1989;86:419-426.

248. Kim J.H., Funahashi H., Niwa K., Okuda K. Glucose requirement at different developmental stages of in vitro fertilized bovine embryos cultured in semi-defined medium. Theriogenol. 1993b;39:875-886.

249. King W.A., Bousqet D., Greve T., GoffA.K. Meiosis in bovine oocytes matured in vitro and in vivo. Acta Vet. Scand. 1986; 27:267-279.

250. King W.A., Bousqet D., Greve T., Betteridge K.J. The pronuclei of bovine ova fertilized in vitro. Hereditas. 1985;102:293-296.

251. King W.A., Linares T., Gustavsson I., Bane A. A method for preparation of chromosomes from bovine zygotes and blastocysts. Vet. Sci. Comm. 1979;3:51-56.

252. King W.A., Xu K.P., Sirard M.A., Greve T., Leclerc P., Lambert R.D., Jacques P. Cytogenetic study of parthenogenetically activated bovine oocytes matured in vivo and in vitro. Gamete Res. 1988;20:265-274.

253. Konishi M., Aoyagi Y. Studies on synthetic media for development into blastocysts of in vitro fertilized bovine oocytes. J. Reprod. Dev. 1994;40:11-14.

254. Kreysing U., Nagai T., Niemann H. Male-dependent variability of fertilization and embryo development in two bovine in vitro fertilization systems and the effects of casein phosphopeptides (CPPs). Reprod. Fert. Dev. 1997;9:465-474.

255. Kruip A.M., van Beneden H., Dieleman S.J., Bevers M.M. The effect of oestradiol-17 on nuclear maturation of bovine oocytes. 11th Int. Congr. Anim. Reprod. A.I. 1988, Dublin, v.3, abstr.336.

256. Kurzrock R., Estrov Z., Wetzler M., Gutterman J.V., Talpoz M. LIF: Not just a leukemia-inhibitory factor. Endocr. Rev. 1991;12:208-217.

257. Lane M., Gardner D.K. Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of preimplantation mouse embryos in vitro. Hum. Reprod. 1992;7:558-562.

258. Larson M.A., Kubisch H.M. The effects of group size on development and interferon-tau secretion by in vitro fertilized and cultured bovine blastocysts. Hum. Reprod. 1999;14:2075-2079.

259. Larson R.C., Ignotz G.G., Currie W.B. Defined medium containing TGFp and bFGF permits development of bovine embryos beyond the "8-cell block". J. Reprod. Fert. 1990; Abstr. Ser. No.5. p. 16.

260. Larson R.C., Ignotz G.G., Currie W.B. Plateled derived growth factor (PDGF) stimulates development of bovine embryos during the fourth cell cycle. Development. 1992a; 115:821-826.

261. Larson R.C., Ignotz G.G., Currie W.B. Transforming growth factor-p and basic fibroblast growth factor synergistically promote early bovine embryo development during the fourth cell cycle. Mol. Reprod. Dev. 1992b;33:432-435.

262. Larson S.F., Parks J.E. In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes in defined medium. Biol. Reprod. 1990;42(Suppl. 1):92.

263. Laurincik J., Hyttel P., Baran V., Schmoll F., Niemann H., Brem G., Schellander K. Corona radiata density as a non-invasive marker of bovine cumulus-corona-oocyte complexes selected for in vitro embryo production. Theriogenol. 1996;46:369-377.

264. Lawson R.A.S., Rowson L.E.A., Adams C.E. The development of cow eggs in the rabbit oviduct and their viability after re-transfer to heifers. J. Reprod. Fert. 1972;28:313-315.

265. Lee C.N., Ax R.L. Concentrations and compositions of glycosaminoglycans in the female reproductive tract. J. Dairy Sci. 1984;67:2006-2009.

266. Lee E.S., Fukui Y. Synergistic effect of alanine and glycine on bovine embryos cultured in a chemically defined medium and amino acid uptake by in vitro-produced bovine morulae and blastocysts. Biol. Reprod. 1996;55:1383-1389.

267. Leese H.J. Metabolic control during preimplantation mammalian development. Hum. Reprod. Update. 1995;1:63-72.

268. Leese H.J. The formation and function of oviduct fluid. J. Reprod. Fert. 1988;82:843-856.

269. Legge M., Sellens M.H. Free radical scavengers a meliorate the 2-cell block in mouse embryo culture. Hum. Reprod. 1991;6:867-871.

270. Leibfried M.L, First N.L. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. J. Anim. Sci. 1979;48:76-86.

271. Leibfried M.L, Bavister B.D. Effects of epinephrine and hypotaurine on in vitro fertilization in the golden hamster. J. Reprod. Fert. 1982;66:87-93.

272. Leibfried M.L, Bavister B.D. The effects of taurine and hypotaurine on in vitro fertilization in the golden hamster. Gamete Res. 1981;4:57-63.

273. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L., First N.L. Development potential of bovine oocytes matured in vitro and in vivo. Biol. Reprod. 1987; 36: 376-383.

274. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., First N.L. Fertilization potential of follicular oocytes classified by stage of cycle and size of follicle. Theriogenol. 1985;23:753-759.

275. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Parrish J.J., First N.L. In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes. Theriogenol. 1989;31:61 -74.

276. Lenz R.W., Ax R.L., Grimek H.J., First N.L. Proteoglycan from bovine follicular fluid enhances an acrosome reaction in bovine spermatozoa. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1982;106:1092-1098.

277. Lenz R.W., Ball G.D., Leibfried M.L., Ax R.L., First N.L. In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes are temperature-dependent processes. Biol. Reprod. 1983a;29:173-179.

278. Lenz R.W., Bellin M.E., Ax R.L. Rabbit spermatozoa undergo an acrosome reaction in the presence of glycosaminoglycans. Gamete Res. 1983b;8:ll-19.

279. Levesque J.T., Sirard M.A. Resumption of meiosis is initiated by the accumulation of cyclin B in bovine oocytes. Biol. Reprod. 1996;55:1427-1436.

280. Lewis W.H., Gregory P.W. Cinematographs of living developing rabbit eggs. Science. 1929;69:226.

281. LimJ.M., Rocha A., Hansel W. A serum-free medium for use in a cumulus cell co-culture system for bovine embryos derived from in vitro maturation and in vitro fertilization. Theriogenol. 1996;45:1081-1089.

282. Lim J.M., Kim J.H., Okuda K., Niwa K. Effect of the presence of glucose during fertilization and/or culture in a chemically semi-defined medium on the development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. J. Reprod. Dev. 1993;39:237-242.

283. Lim J.M., Kim J.H., Okuda K., Niwa K. The importance of NaCl concentration in a chemically defined medium for the development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenol. 1994b;42:421-432.

284. Lim J.M., Okutsu O., Okuda K., Niwa K. Effects of fetal calf serum in culture medium on development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenol, 1994a; 41:1091-1098.

285. Lindner G.M., Wright R.W. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenol. 1983;20:407-416.

286. Liu Z., Foote R.H. Effects of O2 concentrations and superoxide dismutase on the development of IVM/IVF bovine embryos in KSOM with 2.5 mM HEPES. Theriogenol. 1995a;43:268.

287. Liu Z., Foote R.H. Development of bovine embryos in KSOM with added superoxide dismutase and taurine and with five and twenty percent O2. Biol. Reprod. 1995b;53:786-790.

288. Liu Z., Foote R.H. Effects of amino-acids and alpha-amanitin on bovine embryo development in a simple protein-free medium. Mol. Repr. Dev. 1997;46:278-285.

289. Liu Z., Foote R.H. Sodium chloride, osmolyte, and omolarity effects on blastocyst formation in bovine embryos, produced by in vitro fertilization (IVF) and cultured in simple serum-free media. J. Assisted Reprod. Genetics. 1996;13:562-568.

290. Liu Z., Foote R.H., Yang X. Development of early bovine embryos in co-culture with KSOM and taurine, superoxide dismutase or insulin. Theriogenol. 1995;44:741-750.

291. Lonergan P., Carolan C., Mermillod P. Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions. Reprod. Nutr. Dev. 1994b;34:329-339.

292. Lonergan P., Carolan C., van Langendonkt A., Donnay I., Khatir H., Mermillod P. Role of epidermal growth factor in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development in vitro. Biol. Reprod. 1996;54:1420-1429.

293. Lonergan P., Vergos E., Kinis A., Sharif H., Gallagher M., Gordon I. The effect of recovery methods on the type of bovine oocyte obtained for in vitro maturation. Theriogenol. 1991b;35:231.

294. Lonergan P., Khatir H., Carolan C., Mermillod P. Bovine blastocyst production in vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24 h. J. Reprod. Fert. 1997;109:355-365.

295. Lonergan P., Monaghan P., Rizos D., Boland M.P., Gordon I. Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation, fertilization and culture in vitro. Mol. Reprod Dev. 1994a;37:48-53.

296. Lonergan P., Sharif H., Monaghan P., Wahid H., Gallagher M., Gordon I. Effect of cooling bovine oocytes to room temperature before inseminationon the subsequent fertilization rate and embryo yield. J. Reprod. Fert. 1991a; Abstr. Ser. No.7:53.

297. Lopata A., Patullo M.J., Chang A., James B. A method for collecting motile spermatozoa from human semen. Fert. Ster. 1976;27:677-684.

298. Lu K.H., Gordon I. Effect of heparin on the capacitation of frozen-thawed bovine spermatozoa used in the in vitro fertilization (IVF) of oocytes matured in vitro. 11th Int. Congr. Anim. Reprod. A. I. Dublin. 1988;3:339.

299. Lu K.H., Gordon I., Gallagher M., Mc Govern H. Pregnancy established in cattle by transfer of embryos derived from in vitro fertilization of oocytes matured in vitro. The Veterinary Record. 1987;121:259-260.

300. Lu K.H., Mac Donnell H.F., Gordon I. Birth of calves after in vitro maturation and fertilization of follicular oocytes. Theriogenol. 1989;31:222.

301. Lu K.H., Shi D.S., Jiang H.S., Goulding D., Boland M.P., Roche J.F. Comparison of the developmental capacity of bovine oocytes from superovulated and non stimulated heifers. Theriogenol. 1991;35:234.

302. Lutterbach A., Koll R.A., Brem G. In vitro maturation of bovine oocytes in co-culture with granulosa cells and their subsequent fertilization and development. Zuchthygiene. 1987; 22:145-150.

303. Machatkova M., Jokesova E., Petelicova J., Dvoracek V. Developmental competence of bovine embryos derived from oocytes collected at various stages of the estrous. Theriogenol. 1996;45:801-810.

304. Madison V., Avery B., Greve T. Selection of immature bovine oocytes for developmental potential in vitro. Anim. Reprod. Sci. 1992;27:1-11.

305. Madison V., Greve T., Avery B., Wamberg T. The effect of endotoxin-contained medium on in vitro fertilization and development of bovine oocytes matured in vitro. Reprod. Nutr. Dev. 1991;31:159-165.

306. Mahi C.A., Yanagimachi R. Capacitation, acrosome reaction and egg penetration by canine spermatozoa in a simple defined medium. Gamete Res. 1978;1:101-109.

307. Mahi C.A., Yanagimachi R. The effects of temperature, osmolality and hydrogen ion concentration on the activation and acrosome reaction of golden hamster spermatozoa. J. Reprod. Fert. 1973;35:55.

308. Malayer J.R., Hansen P.J., Buhi W.C. Secretion of proteins by cultured bovine oviducts collected from estrus through early diestrus. J. Exp. Zool. 1988;248:345-353.

309. Malenko G.P. An improved method for preparing whole specimens from bovine preimplantation embryos: A technique note, Theriogenol. 1994;41:1207-1210.

310. Massaque J., Kelly B., Mottola C. Stimulation by insulin-like growth factor is required for cellular transformation by type p-transforming growth factor. J. Biol. Chem. 1985;260:4551-4554.

311. Massip A., Mermillod P., Van Langendonckt A., Reichenbach N.D., Lonergan P., Berg U., Carolan C., De Roover R., Brem G. Calving outcome following transfer of embryos produced in vitro in different conditions. Anim. Reprod. Sci. 1996;44:1-10.

312. Mastroianni L., Jones R. Oxygen tension within the rabbit tube. J. Reprod. Fert. 1965;9:99-102.

313. Matsuyama K., Miyakoshi H., Fukui Y. Effect of glucose levels during the in vitro culture in synthetic oviduct fluid medium on in vitro development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenol. 1993;40: 595- 605.

314. Mattioli M., Bacci M.L., Galeati G., Seren E. Developmental competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenol. 1989;31:1201-1207.

315. Mattioli M., Galeati G., Barboni B., Seren E. Concentration of cyclic AMP during the maturation of pig oocytes in vivo and in vitro. J. Reprod. Fert. 1994;100:403-409.

316. Mattioli M., Galeati G., Seren E. Effect of follicle somatic cell during pig oocyte maturation on egg penetrability and male pronuclear formation. Gamete Res. 1988;20:177-183.

317. Maurer R., Onuma H., Foote R., Viability of cultured and transferred rabbit embiyos. J. Reprod. Fert. 1970;21:417-422.

318. Mc Caffrey C., Mc Evoy T.G., Diskin M.G., Gwazdauskas F.C., Kane M.T., Sreenan J.M. Successful co-culture of 1-4 cell cattle ova to the morula or blastocyst stage. J. Reprod. Fert. 1991;91:119-124.

319. Mc Caffrey C., Sreenan J.M. The effect of cell to ovum contact on the development of 1-4 cell cattle ova during co-culture with oviductal cells. Theriogenol. 1991;35:239.

320. Mc Laughlin K.J., Ashman R.J., Mc Lean D.M., Stevens G., Bartsch B.D., Seamark R.F. Viability of one cell bovine embiyos cultured in synthetic oviduct fluid medium. Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol. 1989;21:36.

321. Mc Laughlin K.J., Mc Lean D.M., Stevens G., Ashman R.J., Lewis P.A., Bartsch B.D., Seamark R.F. Viability of one-cell bovine embryos cultured in synthetic oviductal fluid medium. Theriogenol. 1990;33:1191-1199.

322. Mc Natty K.P., Heath D.A., Lun S., Fanning J.M., Mc Diarmid J.M., Henderson K.M. Steroidogenesis by bovine theca interna in am in vitro perfusion system. Biol. Reprod. 1984;30:159-170.

323. Meizel S. The mammalian sperm acrosome reaction. A biochemical approach. In: Development in Mammals. Ed. Johnson M.H. Amsterdam-New York-Oxford. North-Holland publishing Company. 1978;v3:1-64.

324. Meizel S., Working P.K. Further evidence suggesting the hormonal stimulation of hamster sperm acrosome reactions by catecholamines in vitro. Biol. Reprod. 1980;22:211-216.

325. Mermillod P., Mourmeaux J.L., Wils C., Massip A., Dessy F. Protein free oviduct conditioned medium for complete bovine embryo development. Vet. Ree. 1992;130:13.

326. Mermillod P., Van Steenbrugge A., Wils C., Massip A., Dessy F. Study of the bovine embryotrophic activity of serum free oviduct conditioned medium. Theriogenol. 1993b;39:267.

327. Mermillod P., Van Steenbrugge A., Wils C., Mourmeaux J.L., Massip A., Dessy F. Characterization of the embryotrophic activity of exogenousprotein-free oviduct-conditioned medium used in culture of cattle embryos. Biol. Reprod. 1993a;49:582-587.

328. Merton J.S., van Dillen J.A.W., Hasler J.F., den Daas J.H.G. Effect of culture media and C02 concentration on embryo development in a bovine embryo in vitro production system. Theriogenol. 1995;43:280.

329. Miller J.G.O., Schultz G.A. Amino acid content of preimplantation rabbit embryos and fluids of the reproductive tract. Biol. Reprod. 1987;36:125-129.

330. Mizoguchi H., Dukelow W.R. Effect of timing of hCG injection on fertilization in superovulated hamster. Biol. Reprod. 1980;23:237-241.

331. Mizoguchi H., Dukelow W.R. Gradual fixation method for chromosomal studies of squirrel monkey oocytes after gonadotropin treatment. J. Med. Primatol. 1981;10:180-186

332. Mochizuki H., Fukui Y., Oho H. Effect of the number of granuloza cells added to culture medium for in vitro maturation, fertilization and development of bovine oocytes. Theriogenol. 1991;36:973-986.

333. Moor R.M., Trounson A.O. Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes in vitro and their subsequent developmental capacity. J. Reprod. Fert. 1977; 49:101-109.

334. Moore K., Bondioli K.R. Glycine and alanine supplementation of culture medium enhances development of in vitro matured and fertilized cattle embryos. Biol. Reprod. 1993;48:833-840.

335. Mrsny R.J., Waxman L., Meizel S. Taurine maintains and stimulates motility of hamster sperm during capacitation in vitro. J. Exp. Zool. 1979;210:123-128.

336. Nagao Y., Saeki K., Hoshi M., Kainuma H. Effect of oxygen concentration and oviductal epithelial tissue on the development of in vitro matured and fertilized bovine oocytes cultured in protein-free medium. Theriogenol. 1994;41:681-687.

337. Nakagava A., Martino A., Pollard J.W., Leibo S.P. Stage of nuclear maturation of bovine oocytes at insemination influences sperm penetration and zygote development. Theriogenol. 1995;43:286.

338. Nakao H., Nakatsuji N. Effects of co-culture, medium components, and gas phase on in vitro culture of in vitro matured and in vitro fertilized bovine embryos. Theriogenol. 1990;33:591-600.

339. Naqvi S.M.K., Mc Gown L.T., Thompson J.G., Tervit H.R. Effect of amino acid supplementation in culture media on development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Indian J. Anim. Sci. 1996;66:457-460.

340. Nasr-Esfahani M.H., Aitken J.R., Johnson M.H. Hydrogen peroxide levels in mouse oocytes and early cleavage stage embryos developed in vitro or in vivo. Development. 1990;109:501-507.

341. Newcomb R., Christie W.B., Rowson L.E.A. Birth of calves after in vivo fertilization of oocytes removed from follicles and matured in vitro. Veterinary Record. 1978;102:461-462.

342. Niwa K., Ohgoda O. Synergistic effect of caffeine and heparin on in vitro fertilization of cattle oocytes matured in culture. Theriogenol. 1988;30:733-741.

343. Niwa K., Ohgoda O., Yuhara M. Effects of caffeine in media for pretreatment of frozen-thawed sperm on in vitro penetration of cattle oocytes. 11th Int. Congr. Anim. Reprod. A. I. Dublin. 1988;3:346.

344. Niwa K., Park C.K., Okuda K. Penetration in vitro of bovine oocytes during maturation by frozen-thawed spermatozoa. J. Reprod. Fert. 1991;91:329-336.

345. Noda Y., Matsumoto H., Umaoka Y., Tatsumi K., Kishi J., Mori T. Involvement of superoxide radicals in the mouse two-cell block. Mol. Reprod. Dev. 1991;28:356-360.

346. Olds D., Van Demark N.L. Luminal fluids of bovine female genitalia. J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1957; 31:555-556.

347. Olson S.E., Thomas W.K., Seidel G.E. Effects of gonadotropins during in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent embryonic development. Theriogenol. 1991;35:250.

348. Osborn J.C., Moor R.M. Cell interactions and actin synthesis in mammalian oocytes. J, Exp. Zool. 1982;220:125-129.

349. Paria B.C., Dey S.K. Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of preimplantation mouse embryos in vitro. Hum. Reprod. 1992;7:558-562.

350. Park C.K., Ohgoda O., Niwa K. Penetration of bovine follicular oocytes by frozen-thawed spermatozoa in the presence of caffeine and heparin. J. Reprod. Fert. 1989;86:577-582.

351. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., First N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenol. 1986;25:591-600.

352. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin is correlated with 3-H-heparin binding and is blocked by protamine sulfate. Biol. Reprod. 1988b;38(Suppl. 1):59.

353. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH. Biol. Reprod. 1989;41:683-699.

354. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod. 1988a;38:1171-1180.

355. Parrish J.J., Vredenburgh W.L., Lavin C.L. Increases in bovine sperm intracellular calcium (Cai) and pH (pHi) during capacitation. Biol. Reprod. 1993;48(Suppl. 1): 106.

356. Partridge R.J., Leese H.J. Consumption of amino acids by bovine preimplantation embryos. Reprod. Fert. Dev. 1996;8:945-950.

357. Pavlok A., Lucas-Hahn A., Niemann H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Mol. Reprod. Dev. 1992;31:63-67.

358. Peters R.M., Reed M.L. Addition of taurine and hypotaurine to culture medium improves development of one- and two-cell pig embryos in vitro. Theriogenol. 1991;35:253.

359. Petr J., Tepia C., Rozinek J., Jilak F. Effect of testosterone and dibutyiyl c-AMP on the meiotic competence in pig oocytes of various size categories. Theriogenol. 1996;46:97-108.

360. Peura T. et al. Pregnancies from bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Acta Vet. Scand. 1989;30:483-485.

361. Peura T., Aalto J. Pregnancies resulting from bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Suomen Elainlaakarileheti. 1989;95:69-73.

362. Pickering S.J., Braude P.R., Johnson M.H., Cant A., Currie J. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte. Fertil. Steril. 1990;54:102-108.

363. Pickering S.J., Johnson M.H. The influence of cooling on the organization of the meiotic spindle of the mouse oocytes. Hum. Reprod. 1987;2:207-216.

364. Pincus G., Enzmann E.V. The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro. I. The activation of ovarian eggs. J. Exp. Med., 1935;62:665-675.

365. Pinyopummintr T., Bavister B.D. In vitro matured/in vitro fertilized bovine oocytes can develop into morulae / blastocysts in chemically defined, protein-free culture media. Biol. Reprod. 1991;45:736-742.

366. Pinyopummintr T., Bavister B.D. Effect of amino acids on development in vitro of cleavage-stage bovine embryos into blastocysts. Reprod. Fert. Dev. 1996b;8:835-841.

367. Pinyopummintr T., Bavister B.D. Energy substrate requirements for in vitro development of early cleavage-stage bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 1996a;44:193-199.

368. Pinyopummintr T., Bavister B.D. Minimum energy substrate requirements for early cleavage stages of bovine embryo development in vitro. Theriogenol. 1995;43:299.

369. Pinyopummintr T., Bavister B.D. Development of bovine embryos in a cellfree culture medium: Effects of type of serum, timing of its inclusion and heat inactivation. Theriogenol. 1994;41:1241-1249.

370. Pinyopummintr T., Bavister B.D. Optimum gas atmosphere for in vitro maturation and in vitro fertilization of bovine oocytes. Theriogenol. 1995;44:471-477.

371. Plante L., King W.A. Effect of time to first cleavage on hatching rate of bovine embryos in vitro. Theriogenol. 1992;37:274.

372. Plante L., King W.A. In vitro development of spontaneously activated bovine oocytes. J. Assisted Reprod. Genet. 1996;13:435-446.

373. Pollard J.W., Martino A., Rumph N.D., Songsasen N., Plante C., Leibo S.P. Effect of ambient temperatures during oocyte recovery on in vitro production of bovine embryos. Theriogenol. 1996;46:849-858.

374. Quinn P., Harlow G.M. The effect of oxygen on the development of preimplantation mouse embryos in vitro. J. Exp. Zool. 1978;206:73-80.

375. Quinn P., Warnes G.M., Kerin J.F., Kirby C. Culture factors in relation to the success of human in vitro fertilization end embryo transfer. Fert. Ster. 1984;41:202-209.

376. Rail W.F., Leibo S.P. Production of sexed bovine pregnancies by cytogenetic analysis of cultured demi-embryos. Theriogenol. 1987;27:269.

377. Rehman N., Collins A.R., Suh T.K., Wright J.R. Development of IVM/IVF produced 8-cell bovine embryos in simple, serum-free media after conditioning or co-culture with buffalo rat liver cells. Mol. Reprod. Dev. 1994;38:251-255.

378. Renard J.P., Philippon A., Menezo Y. In vitro uptake of glucose by bovine blastocysts. J. Reprod. Fert. 1980;58:161-164.

379. Revel F., Mermillod P., Peynot N., Renard J.P., Heyman Y. Low developmentally capacity of in vitro matured and fertilized oocytes from calves compared with that of cows. F. Reprod. Fert. 1995;103:115-120.

380. Rexroad C.E., Powell A.M. Co-culture of sheep ova and cells from sheep oviduct. Theriogenol. 1986;25:187.

381. Richard F.J., Sirard M.A. Effects of follicular cells on oocyte maturation. I: Effects of follicular hemisections on bovine oocyte maturation in vitro. Biol. Reprod. 1996a;54:16-21.

382. Richard F.J., Sirard M.A. Effects of follicular cells on oocyte maturation. II: Theca cell inhibition of bovine oocyte maturation in vitro. Biol. Reprod. 1996a;54:22-28.

383. Rieger D. Relationship between energy metabolism and development of early mammalian embryos. Theriogenol. 1992;37:75-93.

384. Rieger D., Loskutoff N.M., Betteridge K.J. Developmentally related changes in the metabolism of glucose and glutamine by cattle embryos produced and co-cultured in vitro. J. Reprod. Dev. 1992;95:585-595.

385. Rieger D., Loskutoff N.M., Betteridge K.J. Developmentally related changes in the uptake and metabolism of glucose, glutamine and pyruvate by cattle embryos produced in vitro. Reprod. Fert. Dev. 1992;4:547-557.

386. Robl J.M., Dobrinsky J.R., Duby R.T. The effect of protein supplements on the in vitro development of IVM/IVF bovine oocytes. Theriogenol. 1991;35:263.

387. Romero-Arredonto A., Seidel G.E. Effects of follicular fluid during in vitro maturation of bovine oocytes on in vitro fertilization and early embryonic development. Biol. Reprod. 1996;55:1012-1016.

388. Rorie R.W., Lester T.D., Miller G.F., Gliedt D.W., McNew R.W. Effects of protein source and co-culture on bovine embryo development in synthetic oviductal fluid medium. Theriogenol. 1994;42:385-395.

389. Rose T.A., Bavister B.D. Effect of oocyte maturation medium on in vitro fertilized bovine embryos. Mol. Repr. Dev. 1992;31;72-77.

390. Rosencrans C.F., Davis D.L., Milliken G. Pig blastocyst development in vitro is affected by amino acids. J. Anim. Sci. 1989;67:1503.

391. Rosencrans C.F., First N.L. Culture of bovine zygotes to the blastocyst stage: Effects of amino acids and vitamins. Theriogenol. 1991;35:266.

392. Rosencrans C.F., First N.L. Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro. J. Anim. Sci. 1994;72:434-437.

393. Rosencrans C.F., Leng G.Q., Mc Namara G.T., Schoff P.K., First N.L. Development of bovine embiyos in vitro as affected by energy substrates. Biol. Reprod. 1993;49:459-462.

394. Rubes J., Zak M., Horinova Z. A method of cytogenetic examination of early embryos of cattle. Vet. Med. 1987;32:655-658.

395. Russe I. Oogenesis in cattle and sheep. Bibl. Anat. 1983;24:77-92.

396. Saeki K., Nagao Y., Hoshi M., Kainuma H. Effects of cumulus cells on sperm penetration of bovine oocytes in protein-free medium. Theriogenol. 1994;42:1115-1123.

397. Saeki K., Nagao Y., Hoshi M., Nagai M. Effects of heparin, sperm concentration and bull variation on in vitro fertilization of bovine oocytes in a protein-free medium. Theriogenol. 1995;43:751-759.

398. Sanbuissho A., Threlfall W.R. The effects of estrous cow serum on the maturation and fertilization of the bovine follicular oocytes in vitro. Theriogenol. 1985;21:226.

399. Sanbuissho A., Threlfall W.R. The effects of estrous cow serum on the in vitro maturation and fertilization of the bovine follicular oocytes. Theriogenol. 1989;31:300-309.

400. Sato T., Iritani A., Nishikawa Y. Maturation and activation of cattle follicular oocytes cultured in vitro. Jap. J. Zootech. Sci. 1978;49:236-242.

401. Sato E., Iritani A., Nishikawa Y. Effects of energy sources on oocyte maturation in pig and cattle. Jap. J. Zootechn. Sci., 1977b;48:333-335.

402. Sato E., Iritani A., Nishikawa Y. Factors involving in maturation of pig and cattle follicular oocytes cultured in vitro. Jap. J. Anim. Reprod. 1977a;23;12-18.

403. Satoh T., Kobayashi K., Yamashita S., Kikuchi M., Sendai Y., Hoshi H. Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-1) produced by granulosa and oviduct cells enhances in vitro development of bovine embryo. Biol. Reprod. 1994;50:835-844.

404. Schellander K., Fuhrer F., Brackett B.G., Korb H., Schleger W. In vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes matured in medium supplemented with estrous cow serum. Theriogenol. 1990;33:477-485.

405. Schini S.A., Bavister B.D. Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose. Biol. Reprod. 1988;39:1183-1192.

406. Scodras J.M., Pollard J.W., Plante ., Betteridge K.J. Establishment of a bovine trophoblast cell line supporting the development of in vitro matured and fertilized oocytes. Biol. Reprod. 1990;42(Suppl. 1): 167.

407. Seidel G.E., Larson L.L., Spilman C.H., Hahn J., Foote R.H. Culture and transfer of calf ova. J. Dairy Sci. 1971;54:923-925.

408. Seidel G.E., Glass T., Olson S.E. Culture of 1-cell bovine embiyos to blastocysts in chemically defined media. Biol. Reprod. 1991:44(Suppl. 1): 155.

409. Seike N., Utaka K., Kanagawa H. Production and development of calves from sexed-bisected bovine embiyos. Jpn. J. Vet. Res. 1990;38:1-9.

410. Semple E., Loskutoff N., Leibo S.P., Betteridge K.J. Effects of culture medium and maturation time on in vitro development of bovine oocytes into blastocysts. Theriogenol. 1993;39:307.

411. Senger P.L., Saacke R.G. Serum-induced head to head agglutinations of bovine spermatozoa. J. Reprod. Fert. 1976;47:215-219.

412. Shamsuddin M., Larsson B., Gustafsson H., Gustaiy S., Bartolome J., Rodriquez-Martinez H. Comparative morphological evaluation of in vivo and in vitro produced bovine embryos. 12th Intern. Congr. Anim. Reprod. 1992;3:1333-1335.

413. Shamsuddin M., Larsson B., Gustafsson H., Rodriquez-Martinez H. In vitro development up to hatching of bovine in vitro-matured and fertilized oocytes with or without support from somatic cells. Theriogenol. 1993;39:1067-1079.

414. Sharif H., Monaghan P., Gordon I. Influence of amino acids and vitamins on the development of early bovine embryos in the isolated mouse oviduct system. Theriogenol. 1993;39:308.

415. Sharif H., Vergos E., Lonergan P., Gallagher M., Kinis A., Gordon I. Development of early bovine embryos in the isolated mouse oviduct maintained in organ culture. Theriogenol. 1991;35:270.

416. Shaver E.L., Yanagimachi R. The effect of in vitro storage of hamster sperm on fertilization and early development. Gamete Res. 1978; 1:235245.

417. Shea B.F., Janzen R.E., Mc Alister R. Recovery and fertilization of bovine follicular oocytes. Theriogenol. 1983;19:385-390.

418. Shioya Y., Kuwayama M., Fukushima M., Iwasaki S., Hanada A. In vitro fertilization and cleavage capability of bovine follicular oocytes classified by cumulus cells and matured in vitro. Theriogenol. 1988;30:489-496.

419. Shipman C. Control of culture pH with synthetic buffers. In: "Tissue Culture. Methods and Applications ". Eds.: P.F. Kruse, M.K. Patterson. Academic Press New York San Francisco London 1973, pp. 709-712.

420. Sirard M.A., Coenen K. Effects of inhibition of meiotic resumption upon the subsequent development of bovine oocytes in vitro. J. Reprod. Dev. 1995;41:256-261.

421. Sirard M.A., Coenen K. The co-culture of cumulus-enclosed bovine oocytes and hemi-sections of follicles: effects on meiotic resumption. Theriogenol. 1993;40:933-942.

422. Sirard M.A., Coenen K., Bilodeau S. Effects of fresh or cultured follicular fractions on meiotic resumption in bovine oocytes. Theriogenol. 1992;37:39-57.

423. Sirard M.A., Florman U.M., Leibfried-Rutledge M.L., Barnes F.L., Sims M.L., First N.L. Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes. Biol. Reprod. 1989; 40:1257-1263.

424. Sirard M.A., ParrishJ.J., Ware C.B., Leibfried-Ruthledge M.L., First N.L. The culture of bovine oocytes to obtain developmentally competent embryos. Biol. Reprod. 1988;39:546-552.

425. Sirard M.A., Bilodeau S. Granulosa cells inhibit the resumption of meiosis in bovine oocytes in vitro. Biol. Reprod. 1990;43:777-783.

426. Sirard M.A., Blondin P. Oocyte maturation and IVF in cattle. Anim. Reprod. Sci. 1996;42:417-426.

427. Sirard M.A., Lambert R.D. Birth of calves after in vitro fertilization using laparoscopy and rabbit oviduct incubation of zygotes. Vet. Rec. 1986;119:167-169.

428. Sirard M.A., Lambert R.D., Menard D.P., Bedoya M. Pregnancies resulting from in vitro fertilization of bovine follicular oocytes following their incubation in rabbit's oviduct and their transfer to the cow's uterus. Biol. Reprod. 1985;32(Suppl. 1):99.

429. Skinner M.K., Osteen K.G. Developmental and hormonal regulation of bovine granulosa cell function in the preovulatory follicles. Endocrinology. 1988;123:1668-1675.

430. Smith A.G., Hooper M.L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity wih inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embiyonic stem cells. Dev. Biol. 1987;121:1-9.

431. Sreenan J., Scanlon P.F. Continued cleavage of fertilized bovine ova in the rabbit. Nature. 1968;217:867.

432. Staigmiller R.B., Moor R.M. Effect of follicle cells on the maturation and developmental competence of ovine oocytes matured outside the follicle. Gamete Res. 1984; 9:221- 229.

433. Staigmiller R.B., Webb R., England B.G., Bellows R.A., Short R.E. Steroidogenic function of individual bovine follicles during estrus. J. Anim. Sci. 1979;49(Suppl. 1):339.

434. Steeves T.E., Gardner D.K. Temporal and differential effects of amino acids on bovine embryo development in culture. Biol. Reprod. 1999;61:731-740.

435. Stojkovic M., Zakhartchenko N., Brem G., Wolf E. Support for the development of bovine embryos in vitro by secretions of bovine trophoblastic vesicles derived in vitro. J. Reprod. Fert. 1997;111:191-196.

436. Stubbings R.B., Liptrap R.W., Betteridge K.J., Walton J.S., Armstrong D.T., Basrur P.k. Requirements for bovine oocyte maturation in vitro. Reprod. Dom. Anim. 1990;25:158-166.

437. Stubbings R.B., Wosik C.P. Glass wool versus swim up separation of bovine spermatozoa for in vitro fertilization. Theriogenol. 1991;35:276.

438. Stubbings R.B., Betteridge K.J., Basrur P.K. Investigations of culture requirements for bovine oocyte maturation in vitro. Theriogenol. 1988;29:313.

439. Sumantri C., Boedino A., Ooe M., Murakami M., Saha S., Suzuki T. The effect of sperm-oocyte incubation time on in vitro embryo development using sperm from a tetraparental chimeric bull. Anim. Reprod. Sci. 1997;48:187-195.

440. Susco-Parrish J.L., Wheeler M.B., Ax R.L., First N.L., Parrish J.J. The effect of penicillamine, hypo taurine, epinephrine and sodium metabisulfite on bovine in vitro fertilization. Theriogenol. 1990;33:333.

441. Susco-Parrish J.L., Parrish J.J., Handrow R.R. Glucose inhibits the action of heparin by an indirect mechanism. Biol. Reprod. 1985;32(Suppl. 1):80.

442. Suss H., Wuthrich K., Stranzinger G. Chromosome configurations and time sequence of the first meiotic division in bovine oocytes matured in vitro. Biol. Reprod. 1988;38:871-880.

443. Suss H., Wuthrich K., Stranzinger G. Potential for in vitro fertilization and embryonic development of in vitro matured bovine oocytes. Theriogenol. 1987;27:281.

444. Suss H., Stranzinger G. In vitro maturation and fertilization of cattle oocytes. Zuchthygiene. 1987;22(3): 114.

445. Szollosi D. On the role of gap junctions between follicle cells and oocyte in the mammalian ovarian follicle. Research in Reproduction. Ed: R.G. Edvards. 1978;10(2):3-4.

446. Tajik P., Wang W.-H., Okuda K., Niwa K. In vitro fertilization of bovine oocytes in a chemically defined, protein-free medium varying the bicarbonate concentration. Biol. Reprod. 1994;50:1231-1237.

447. Takagi Y., Mori K., Tomizawa M., Takahashi T., Sugawara S., Masaki J. Development of bovine oocytes matured, fertilized and cultured in a serum-free, chemically defined medium. Theriogenol. 1991;35:1197-1207.

448. Takahashi H., Tabara Y., Yoshida Y. (In vitro developmental ability of bovine oocytes matured in a serum free medium using the open culture system.) J. Reprod. Dev. 1995;41:66-69.

449. Takahashi M., Nagai T., Hamano S., Kuwayama M., Okamura N., Okano A. Effect of thiol compounds on in vitro development and intracellular glutathione content of bovine embryos. Biol. Reprod. 1993;49:228-232.

450. Takahashi Y., First N.L. In vitro culture of bovine one-cell embryos fertilized in vitro using synthetic oviduct fluid medium with and without glucose and supplemented with fetal calf serum. Anim. Reprod. Sci. 1993;31:33-47.

451. Takahashi Y., First N.L. In vitro development of bovine one-cell embryos: Influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids, and vitamins. Theriogenol. 1992;37:963-978.

452. Takahashi Y., Hishinuma M., Matsui M., Tanaka H., Kanagawa H. Development of in vitro matured/fertilized bovine embryos in a chemically defined medium: influence of oxygen concentration in the gas atmosphere. J. Vet. Med. Sci. 1996;58:897;902.

453. Takahashi Y., Kanagawa H. Effect of oxygen concentration in the gas atmosphere during in vitro insemination of bovine oocytes on the subsequent embryonic development in vitro. J. Vet. Med. Sci. 1998a;60:365-367.

454. Takahashi Y., Kanagawa H. Effects of glutamine, glycine and taurine on the development of in vitro fertilized bovine zygotes in a chemically defined medium. J. Vet. Med. Sci. 1998b;60:433-437.

455. Tan S.J., Lu K.H. Effects of different estrus stages of ovaries and sizes of follicles on generation of bovine embryos in vitro. Theriogenol. 1990;33335.

456. Tarkowski A.K. An air-drying method for chromosome preparation from mouse eggs. Cytogenetics. 1966;5:394-400.

457. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J. Reprod. Fert. 1972;30:493-497.

458. Thibodeaux J.K., Del Vecchino R.P., Hansel W. Role of platelet-derived growth factor in development of in vitro matured and in vitro fertilized bovine embryos. J. Reprod. Fert. 1993;98:61-66.

459. Thibodeaux J.K., Myers M.W., Goodeaux L.L., Menezo Y., Rousell J.D., Broussard J.R., Godke R.A. Evaluating an in vitro culture system of bovine uterine and oviduct epithelial cells for subsequent embryo culture. Reprod. Fert. Dev. 1992;4:573-583.

460. Thibodeaux J.K., Myers M.W., Hansel W. The beneficial effects of incubating bovine embryos in groups are due to platelet-derived growth factor. Theriogenol. 1995;43:336.

461. Thomas W.K., Seidel G.E. Effects of cumulus cells on culture of bovine embryos derived from oocytes matured and fertilized in vitro. J. Anim. Sci. 1993;71:2506-2510.

462. Thompson J.G. Defining the requirements for bovine embryo culture. Theriogenol. 1996; 45:27-40.

463. Thompson J.G., Gardner D.K., Pugh P.A., Mc Millan W.H., Tervit H.R. Lamb birth weight is affected by culture system utilized during in vitro pre-elongation development of ovine embryos. Biol. Reprod. 1995;53:1385-1391.

464. Thompson J.G., Partridge R.J., Houghton F.D., Cox C.I., Leese H.J. Oxygen uptake and carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos. J. Reprod. Fert. 1996;106:299-306.

465. Thompson J.G., Simpson A.G., Pugh P.A., Donnelly P.E., Tervit H.R. Effect of oxygen concentration on in vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos. J. Reprod. Fert. 1990;89:573-578.

466. Thompson J.G., Simpson A.G., Pugh P.A., Tervit H.R. Requirement for glucose during in vitro culture of sheep preimplantation embryos. Mol. Reprod. Dev. 1992;31:253-257.

467. Tiffin G.J., Rieger D., Betteridge K.J., Yadav B.R., King W.A. Glucose and glutamine metabolism in pre-attachment cattle embryos in relation to sex and stage of development. J. Reprod. Fert. 1991;93125-132.

468. Tsunoda J., Sugie F. Survival of rabbit eggs preserved in plastic straws in liquid nitrogen J. Reprod. Fert. 1977;49:173-174.

469. Uguz C., Vredenburgh W.L., Parrish J.J. Heparin-induced capacitation but not intracellular alkalinization of bovine sperm is inhibited by Rb-Adenosine-3',5'-Cyclic Monophosphorothioate. Biol. Reprod. 1994;51:1031-1039.

470. Umaoka Y., Noda Y., Narimoto K., Mori T. Effects of oxygen toxicity on early development of mouse embryos. Mol. Reprod. Dev. 1992;31:28-33.

471. Van Langendonckt A., Donnay I., Schuurbiers N., Auquier P., Carolan C., Massip A., Dessi F. Effects of supplementation with fetal calf serum on development of bovine embryos in synthetic oviduct fluid medium. J. Reprod. Fert. 1997;109:87-93.

472. Van Soom A., Boerjan M.L., Bols P.E.J., Vanroose G., Lein A., Coryn M., de Kruif A. Timing of compaction and inner cell allocation in bovine embryos produced in vivo after superovulation. Biol. Reprod. 1997b;57:10411049.

473. Van Soom A., Van Vlaenderen I., Mahmoudzadeh A.R., Deluyker H., de Kruif A. Compaction rate of in vitro fertilized bovine embryos related to the interval from insemination to first cleavage. Theriogenol. 1992;38:905-919.

474. Van Soom A., Boerjan M.L., Ysebaert M.T., de Kruif A. Cell allocation to the inner cell mass and the trophectoderm in bovine embryos cultured in two different media. Mol. Reprod. Dev. 1996;45:171-182.

475. Van Soom A., de Kruif A. A comparative study of in vivo and in vitro derived bovine embryos. Proc. 12th Internat. Congr. Anim. Reprod. Hague. 1992;3:1363-1365.

476. Van Soom A., Mahmoudzadeh A.R., de Kruif A. timing of blastocyst formation and cell number of early blastocysts derived from in vitro techniques. J. Reprod. Fert. 1993; 12:117.

477. Van Soom A., Ysebaert M.T., de Kruif A. Relationship between timing of development, morula morphology, and cell allocation to inner cell mass and trophectoderm in in vitro produced bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 1997a;47:47-56.

478. Vansteenbrugge A., Van Langendonckt A., Scutenaire C., Massip A., Dessy F. In vitro development of bovine embryos in buffalo rat liver- or bovine oviduct-conditioned medium. Theriogenol. 1994;42:931-940.

479. Vergos E., Kinis A., Gallagher M., Gordon I. Development of bovine embryos on an oviductal monolayer in relation to cell stage reached at 48h after in vitro fertilization. J. Reprod. Fert. 1989;Abstr. Ser. No.4:21.

480. Vergos E., Kinis A., Lonergan P., Sharif H., Gallagher M., Gordon I. The effect of culture system on the in vitro development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenol. 1991;35:290.

481. Viriyapanich P., Bedford J.M. The fertilization performance in vivo of rabbit spermatozoa capacitated in vitro. J. Exp. Zool. 1981;216:169-174.

482. Voelkel S.H., Hu I.X. Effect of gas atmosphere on the development of one-cell bovine embryos in two culture systems. Theriogenol. 1992;37:1117-1131.

483. Walker S.K., Lampe R.J., Seamark R.F. Culture of sheep zygotes in synthetic oviduct fluid medium with different concentrations of sodium bicarbonate and HEPES. Theriogenol. 1989;32:797-804.

484. Wall R.J., Hawk H.W. Development of centrifuged cow zygotes cultured in rabbit oviducts. J. Reprod. Fert. 1987;82:673-680.

485. Wang W.L., Jiang H.S., Lu K.H., Gordon I. Effect of condition medium and glucose concentration on the in vitro development of early bovine embryos. Theriogenol. 1990;33:343.

486. Wassarman P.M., Letourneau G.E. RNA synthesis in fully grown mouse oocytes. Nature. 1976;261:73-74.

487. Watson A.J., Hogan A., Hahnel A., Wiemer K.E., Schultz G.A. Expression of growth factor ligand and receptor genes in the preimplantation bovine embryo. Mol. Reprod. Dev. 1992;31:87-95.

488. Waymouth C. Determination and survey of osmolality of culture medium. In: "Tissue Culture. Methods and Applications ". Eds.: P.F. Kruse, M.K. Patterson. Academic Press New York San Francisco London 1973, pp. 703-709.

489. Whittingham D.G. Culture of mouse ova. J. Reprod. Fert. 197 l;Suppl. 14:7-21.

490. Wiemer K.E., Watson A.J., Polanski V., Mc Kenna A.I., Fick G.H., Schultz G.A. Effects of maturation and co-culture treatment on the developmental capacity of early bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 1991;30:330-338.

491. Wiley L.M., Yamamis S., Van Muyden D. Effect of potassium concentration, type of protein supplement and embryo density on mouse preimplantation development in vitro. Fertil. Steril. 1986;45:111-119.

492. Wilson J.M., Zalesky D.D., Leoney C.R., Bondioli K.R., Magness R.R. Hormone secretion by preimplantation embryos in a dynamic in vitro culture system. Biol. Reprod. 1992;46:295-300.

493. Wright R.W. Successful culture in vitro of swine embryos to the blastocyst stage. J. Anim. Sci. 1977;44:854-858.

494. Wu Guang Ming, Li Xue Feng, Yin Jing et al. Technical modifications of in vitro production of bovine embryos. Acta Vet. Zootechn. Sinica. 1996;27:1-6.

495. Xiaoxia Z., Zhanqun J., Shie J., Jianmin L., Yuding Z. In vitro co-culture of in vitro fertilized (IVF) bovine embryos with different cell monolayers. Theriogenol. 1991;35:295.

496. Xu K.P., Yadav B.R., King W.A., Betteridge K.J. Sex-related differences in developmental rates of bovine embryos produced and cultured in vitro. Mol. Repr. Dev. 1992;31:249-252.

497. Xu K.P., Greve T. A detailed analysis of early events during in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. J. Reprod. Fert. 1988a;82:127-134.

498. Xu K.P., Greve T., Callesen H., Hyttel P. Birth of calf following in vitro fertilization of in vitro matured oocytes. J. Reprod. Fert. 1988c;Abstr. Ser. No.1:14.

499. Xu K.P., Greve T., Callesen H., Hyttel P. Pregnancy resulting from cattle oocytes matured and fertilized in vitro. J. Reprod. Fert. 1987;81:501-504.

500. Xu K.P., Greve T., Smith S., Hyttel P. Chronological changes of bovine follicular oocyte maturation in vitro. Acta Vet. Scand. 1986a;27:505-519.

501. Xu K.P., Greve T., Smith S., Liehman P., Callesen H., Hyttel P. Parthenogenetic activation of cattle oocytes matured in vitro and cultured in rabbit oviducts. Theriogenol. 1986b;25:218.

502. Xu K.P., Hoier R., Greve T. Dynamic changes of estradiol and progesterone concentrations during in vitro oocyte maturation in cattle. Theriogenol. 1988b;30:245-253.

503. Xu K.P., King W.A. Effects of oviductal cells and heparin on bovine sperm capacitation in vitro. Biol. Reprod. 1990;42(Suppl.l):89.

504. Xu K.P., King W.A., Goff A.K., Picard L., Yacques P. Birth of a calf from bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Can. Vet. J. 1988a;29:923-924.

505. Xu K.P., Pollard J.W., Rorie R.W., Plante L., King W.A., Betteridge K.J. Pregnancy rates following transfer of bovine embryos produced by in vitro maturation, fertilization and co-culture. Theriogenol. 1990;33:351.

506. Yadav M.C., Walton J.C., Leslie K.E. Timing of the onset and duration of ovulation in superovulated beef heifers. Theriogenol. 1986;26:501-521.

507. Yadav B.R., King W.A., Xu K.P., Pollard J.W., Plante L. Chromosome analysis of bovine oocytes cultured in vitro. Genet. Sel. Evol. 1991;23:191-196.

508. Yanagimachi R., Phillips D.M. The status of acrosomal caps of hamster spermatozoa immediately before fertilization in vivo. Gamete Res. 1984;9:1-19.

509. Yang B.K., Gilles J.R., Yang X., Foote R.H. Development of in vitro matured / in vitro fertilized bovine oocytes in a simple defined (KSOM) medium. J. Reprod. Dev. 1995; 41:213-218.

510. Yang B.K., Yang X., Foote R.H. Early development of IVM/IVF bovine embryos cultured with or without somatic cells in a simple serum-free medium with different concentrations of CO2 and O2 . J. Reprod. Dev. 1994; 40: 197-205.

511. Yang N.S., Lu K.H., Gordon I. In vitro fertilization and culture of bovine oocytes from stored ovaries. Theriogenol. 1990;33:352.

512. Yang Y.B., Lu K.H. The influence of bovine oocyte type on in vitro fertilization and subsequent development in vitro. Theriogenol. 1990;33:355.

513. Yochim J.M., Mitchell J.A. Intrauterine oxygen tension in the rat during protestation: Its possible relation to carbohydrate metabolism and the regulation of oxidation. Endocrinology. 1968;83:706-713.

514. Yoshioka K., Othman A.M., Taniguchi T., Yamanaka H., Sekikawa K. Differential patterns of blastulation in bovine morulae cultured in224synthetic oviduct fluid medium containing FCS or BSA. Theriogenol. 1997;48:997-1006.

515. Younis A.I., Brackett B.G. Importance of cumulus cells and insemination intervals for development of bovine oocytes in to morulae and blastocysts in vitro. Theriogenol. 1991;36:11-21.

516. Younis A.I., Brackett B.G., Fayrer-Hosken R.A. Influence of serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in vitro. Gamete Res. 1989;23:189-201.

517. Zhang X., Armstrong D.T. Fertilization of rat oocytes is enhanced by FSH during in vitro maturation of oocyte-cumulus complexes. Theriogenol. 1989;31:277.

518. Zuelke K.A., Brackett B.G. Luteinizing hormone-enhanced in vitro maturation of bovine oocytes with and without protein supplementation. Biol. Reprod. 1990;43:784-787.1. У а --|? ь ?

519. Рисунок 5. Схема изготовления из лезвия безопасной бритвы устройства для выделения ооцитов крупного рогатого скота из антральных фолликулов яичника. Пунктирные линии показывают контуры устройства различной конфигурации: а, Ь, с.

520. Рисунок 6. Устройство для выделения ооцитов крупного рогатого скота из антральных фолликулов яичника, конфигурация с: 1) режущие кончики; 2) выступы с закругленными углами.-УГ^Ч. Л .г Л«■■• '^•ч.ч*^*"*"' ^ V.л"'*'^. . • и-л»*-'' •

521. Уровень оплодотворения ооцитов, взятых как нативные КОК, составлял 77.3 и 85.7% при обработке сперматозоидов гепарином или при их совместном инкубировании с клетками слизистой оболочки яйцевода, соответственно (табл. 23).