Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические аспекты оплодотворения in vitro ооцитов коров и гетерологической пенетрации яйцеклетки золотистого хомячка

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические аспекты оплодотворения in vitro ооцитов коров и гетерологической пенетрации яйцеклетки золотистого хомячка"

ч\\ ' 1нетитут роаведекня 1 генетики тварип УААН

о, ^ \

На правах рукопиеу еЛЮАРОВА 1РИНА БОРИС I ВИЛ

УДК 636.2. 082.454 + 581.16: 612. 613

"ЩЯОГЕНЕТИЧШ АСПЕКТИ ЗЛПЛ1ДШШ IN VITRO ООЩШВ KOPIB I ГЕТЕРОЛОГ1ЧШ1 ПЕНБТРАЦП ЯЙЦШНТШ1 ЗОЛОТ15СТОГО X0U' ЯЧИА-

СпеЩалыйсть 03.00.16-Генетика

Автореферат диеертацп. на эдобуття наукового ступеня кандидата бЮлопчних наук

КШв-1995

Робота виконана в даборатори гаитишю! 1нженерИ Институту роаведення 1 генетики тварин УААЕ

Науков1 кер1вники: доктор смльськогосподарських наук, академж УААН • ВУБЕЩэ Михайло Васильевич, кандидат бюлопчних наук, КУЗНЕЦОВ Валер1й бвгенович

0фЩ1йн1 опоненти: доктор'бюлопчних наук, професор

КОНОВАЛОВ Вячеслав Серпйвич, кандидат бюлопчних наук, БЕРдаЧЕВСЬКИЙ Микола Степанович

Пров1дна организация - 1нститут тваринництва УААЕ

Захист в!дбудетьоя "30" г?'^ > 1995 р.

о /У годин 1 на эас1 данн1 спец!ал1зовано1 вчено! ради 1нституту розведення 1 генетики.тварин УААН эа адресом: 266319, Украина, Кизвська обл. , Борисшльський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

3 дисертащею моиша ознайомитись у б1блютещ ¡нституту розведення 1 генетики тварин УААЕ

Автореферат роэюланий " " Гг*^- 1995 р.

Вчений секретар спещвл18овано1 вчено! Ради, кандидат бюлопчних наук

М. Ф. Павл1ченко

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

1.1. Актуальнють теми. Фундаментальш дослидження в га-луз1 бюлогп розвитку в1дкриЕають велик! перспективи и ви-користання в тваринництвь В останн1 роки все биьш поширеке застосування у в1дтворенн1 знаходить метод одержания ембр!-ohîb велико! рогато! худоби б ооцит1в kopîb, як! дозр!ли in vitro та були зашпднен! поза организмом /Reichenbach е. а , 1992; Mermillod е. а., 1993; Kruip & Boni, 1994 та iH./. Дослидження по дозр1ванню i зашидненню ооципв поза орган1эмом мозкуть- слузкити базою для розробки 1 впровадженнч метод!в KJiiTHHHOi i генетично"! ¡нженер;ï в тваринницгв! /Sreve, 1992; Techakumphu е. а, 1993; Heyrrian в. а. , 1994; Keefer е.а., 1994/, вивченню можливост! б1льш об'ективно! ощнки запл!днюючо1 вдатноетi сперматозо!Д1в с!льськогосподарських тварин на основi моделювання процессiв взаемод1i чолов1чих i ж1ночих гамет в умовах in vitro. /Eaglesoms & Miller, 1989; Le Guienne е. a, 1990; Le Guienne & Humblot, 1991; FazeIi е. a., 1993; Barandi e. a., 1903/.

Поряд 3 тим, анализ л!тературних даних показув, що бага-то AKi аспекти одержания in vitro ehföpiOHiB велико! рогато! худоби залишаютьея нез'яеованими. До ix числа момна в унести адекватнють умов культивування ооципв i eMöpiOHiB pis-них стадий умовам ix розвитку in vivo, шдготовку сперматозоидов до запл1днення поза организмом, запл1днення яйцеюн-тин in vitro та iH. В результат! цього частота зашпднення оощшв, як1 ' доз pi ли поза оргашэмом, эалишаетьея на недос-татньо високому piBHi, лише невелика к^лькють ембрюмв розвиваеться in vitro до стад1й морули-бластоцисти, при до-сягненш яких можлива Hexipypri4Ha Трансплантац1я, В1дсутн1

- z -

добре в1Дтворюван! результата; компактизован! ембрюни, от-риман1 in vitro, е б!льш чутливими до ваморожування-розморо-жування, в пор1внянн1 is ембрюнами, вимитими в рог ¡в матки.

1.2. Мета i -завдання доел1джень. Метою роботи були роз-робка методу ощнки еаплдашчо! вдатноот! сперматозо!д1в бу-raïB in vitro за допомогою гетеро- i гомолог!чно! пенетра-Ц11 та вивчення цитоморфэлог! чних характеристик ембршшв велико! рогато! худоби, отримаяих in vitro.

Виходячи з поставлено! мети, виршувались TaKi завдання:

- визначити ыорфофункцюнальн! критерп оиднки капацита-ци сперматозозд1в буга!в в умовах in vitro;

- показати можливють використання гетеро- i гомолопч-ного тестев для ощнки эашиднюючо! здатноот! сперматозоидiB 6yraiв in vitro;

- показати можливють одержання прометафазних i метафаз-них хромосом сперматоэозд!В QyraïB э використанням гетероло-пчно! пенетраци яйцеклитин хом'ячка;

- вияснити вплив методов одергкання ооцит-кумулюеких комллекс1в на дозревания i запл1днення оодит^в KopiB in vitro;

- досл1дити вплив ecTpyoHoï сироватки KpoBi KopiB на дозр1вання i запл!днення ооцйив кор!в in vitro;

- вивчити вплив часткового видалення кл!тин кумулюса та мiкрохipyprочного розсичення д1лянки прозоро! оболонки ооци-TiB KopiB на ix загшднення i розвиток еигот поза органis-мом;

- подолання блоку дробления ембрюшв велико! рогато! худоби in vitro та зх розвиток до стадп бластоцисти.

1.3. Наукова новизна роботи. В результат! проведено! ро-

боти вперше продемонстрована моисливють в1эуально! ощнки' ГОТОВНОСТ1 капацитованих sa допомогою гепарину сперматозо-1Д1В буга;в до 8апл1дкення in vitro.,

Вперше 8апропонована комплексна ощнка зашиднюючо! эдатност! сперматозоида буга!в in vitro за допомогою гете-ро- i гомологiчпого TecTiB на пенетрацио яйцекл1тин.

Показана можливють одержання прометафазних i метафазних хромосом сперматозошв буга!в.

В1дм1чено, шр спос1б видалення оощшв не впливае на частоту дозр1вання i зашиднення яйцеюнтин in vitro, euie впливае на KiJibKiCTb 1нтактних ооцит-кумулюсних комплекс!в, як! можна эдобути з одного яечника.

Показано позитивний вплив еструсно! сироватки кров1 ко-piB на дозр1вання i запл!днення ооцит1в KopiB поза оргашэ-мом.

Установлена залежнють з дат ноет! зигот до формування ранн1х ембрюн1в, як1 дробляться, В1д шлюноеп ооцит-кумулюсних комплекс1в при аашндненн! ооципв KopiB in vitro.

Вперше показана можливють нормального 8апл1днення i по-дальшого розвитку oouhtîb KopiB i3 частково розс1ченою проворою оболонкою.

Виявлено, що роэташування ЗЕцшднених m vitro яйцекл1-тин KopiB на моношарг ештел1альних руптин яйцепровод!в ко-piB та у кондищйованому на моношар1 середовищ сприяе розвитку зигот до шзньо! морули i бластоциоти, показана залежнють ефективност1 використання моношару еп1тел1альних КЛ1-тин яйцепровод1в В1Д стади статевого циклу кор!в.

Виявлена залежнють Mix стад^ею розвитку paHHix ембр1-OH1B, як! дроблятьея, i ix эдатнютю до розвитку in vitro до

етадп блаетоцисти.

1.4. Практична аначиьпеть. роароблено cnoci6 комплексно! ощнки эшшднюючо! вдатност! еперматозо!д1в бута!в в умовах in vitro для досл1Д1В по одержанню ембрюн1в велико! рогато! худоби поза оргашэмом, який може бути використаний при Ё1д-6opi буга!в для штучного ос1мен1ння. Показана можливють одержання морул i бластоцист велико! рогато! худоби э яйце-КЛ1ТИН KopiB, як1 дозр1ли та були заплдднеш in vitro.

1.Б. Реалаащя результат!в досл!джень. В Головному се-лекщйному центр! (м. Переяслав-Хмельницький) эд1йснено пере-оаджування бластоцист велико! рогато! худоби, отриманих in vitro.

1.6. Положения, як! виносятьоя на эахиот:

- обгрунтування доц1льност1 ощнки зашиднюючо! эдатнос-Ti еперматозо!Д1В буга!в в умовах in vitro sa допомогою комплексного тесту на гетеро- i гомологхчну пенетрацш;

- значения методу часткового розс!чення проэоро! оболон-ки ооцит!В KopiB в доел!дах по одержанню ембрюн!в поза ор-гашвмом при використаши С1м'я si вниженою концентрат ею спермато!д1в;

- обгрунгування необх1дност! культивування одношптинних емОрюнхв велико» рогато! худоби на Monoiuapi еп1тел!алышх кл1тин яйцепровод1в кор!в, яечник яких мютить новоутворене жовте т!ло 1 у кондиц!йованому на цьому моношар! середовиии.

1.7. Апробация робоги. Результата дослдаень викладен» в допов1дях на Республ1канськ1й наукойiй конференцН "Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве" (XapKiB, 1988), на II Республ1канськ1й науково-виробнишй коиференцп "О мерах по повышению эффективности и улучшению

организации более широкого использования биотехнологии в племенном животноводстве" (Льв1в, 1988), на науково-мето-дичн1й нарад! "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота" (ЗКодино, 1989),' на Веееоюзшй науково-техн1чн1й нара-Д1 "Проблемы развития биотехнологии в животноводстве" (Дуб-ровищ, 1990), на конференцп (науков!й дискуон) "Новое в породообразовательном процессе" (с. Чубкнское/ 1993)на на-уково-практичн1й конференцп "Генетико-селекщйн1 та техно-лопчн! проблеми в!дтворення с.-г. тварин" (Ки1в, 1994), ла Всеукра1нськ1Й кшлейней науково-практичней конференцп "Генетика продуктивное!i тварин" (Khïb, 1994).

1.8. Публ1кац1я результатов досл1джень. По матер 1алах дисертацп опубликовано 12 друкованих праць.

1.9. Особиста участь дисертанта в проведение дослоджень. Особиста участь I. Б. вл1эарово! в одержанн! наукових результатов, викладених в дкеертац!i, полягае в збор; матер!алу за тривалий период, обробщ i анализ! одержаних даних. Дисер-тант приймала участь в проведенно доследжень в лабораторп raiiTHHHoi. дниенерп 1нституту розведення i генетики тварин та Харковплемсервю! i Прилукському племпедприемствк

1.10. Об*ем i структура дисертацп. Дисертащя викладена на 157 сторднках машинописного тексту i мостить 14 таблиць i 28 малюнкев. Робота екдадаеться э вступу, огляду Л1тератури, материалу i методики доелдаень, результатов власних досл!д-яень та ix обговорення, висновкев i практичних пропозиц!й, список л!тератури мостить 185 джерел, а них 167 ¡ноземних.

2. МАТЕР I АЛ I МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ

Капацитацш заморожено-роэморожених сперматозоедов буга-ïb викликали за допомогою гепарину (200 ОД/мл, 16 хвилин).

Суперовуляцш у статевозр1лих самок золотистого хом'ячка (Mesocricetus auratus) викликали шляхом т'екцп ГСЖ га лХГ. Cniльну 1нкубацш эыльнених в!д проэоро! оболонки яй-цекл!тин is сперматозо1дами бугая эд!йснювали на протяэ! б годин. Дня о держания препарат! в метафазних хромосом сперматозоидов бугая в середовшце культивування яйцекл!тин хом'ячка додавали 0,6 мкг/мл колцем1 ду.

Ооцити эдобували з,яечник!в забитих KopiB i телиць i

культивували в середовишд 199, яке Miстило 20Z шактивовано!

Детально! сироватки теляти, 0,5 мкг/мл ¡ЮГ, 6 ОД/мл лХГ, 1

мкг/мл еетрадюлу-17 £ та антиб!отики, на протяз! 24 годин

при +38, б°С. Cпiльнy шкубацио ооцит!в KopiB is спермато-

6

80!дами бугая (1,5 - 2,0 * 10 Сп/мл) эд1йснювали на протяаi 18 годин. Пхсля ос!мен!ння яйцекл!тини культивували in vitro на протяз1 24 годин. Для одержання препарат!в метафазних хромосом eM6piOHiB велико! рогато! худоби, одержаних поза ор-ган1емом, в середовище культивування додавали 0,05 мкг/мл колцем1ду (тривеиасть експозицп - 5 годин). .

Частину 00цит1в KopiB, HKi дозр1ли in vitro, 8бер1гали у

о

1,5 М хлоридi магнш при +5 С протягом 1-21 доби. Шсля 1нкубацп i3 сперматозо!дами бугая ооцити досл1джували гид фаяово-контрастним микроскопом на" наявнють пенетраци.

Ы1крогожу i тримаючу MiKponineTKy виготовляли э скла "шрекс" на мтровуэт типу "МК" /Кузнецов, 1991/. Шсля часткового розс^чення проэорох оболонки (ЧРО) у 0,5 М розчи-Н1 цукроэи ооцити iнкубували is сперматозо!дами бугая (10е Сп/мл) на протязi 12 годин, в!дмивали В4д спермпв i культивували in vitro протягом 24 годин.

3 метою подолання блоку дробления ембрюн!в велико! ро-

гато! худоби in vitro загшднет поза орган:змом 1нтактн1 яйцегаитини KopiB культивували протягом 184 годин на моноша-pi еп!тел!альних шитин яйцепровод!в KopiB або в кондищй-ованому середовииц. Стад i í розвитку ембрююв анал1зували через SO годин гпсля зашиднення.

Для доел!дження перетворень хроматину ооцшчв i ембр1-OH1B готували сухопов1трян! препарати эа методом Тарковоько-го /Tarkowskí, 1966/, hkí фарбували роэчином барвника Пмэа.

Э метою пор^вняння цитоморфолопчних характеристик морул i бластоцист, одержаних in vitro i in vivo, зд1йснювали не-Х1рург1чне вимивання ембрюшв 13 ропв матки гормонально оброблених KopiB-flOHopiB на б 1 7 день пюля ос1мен1ння.

Матер1ал документували mí крофотограф1 ями. Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критерив Ст'юдента та Xi-квадрат /Лакин, 1990/.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ Д0СЛ1ДЖЕНЬ ТА IX ОБГОВОРЕНВД 3.1. Оценка зашиднюючо5 здатносп сперматовошв OyraiB в умовах взаемодп гамет in vitro

Як ВИЯВИЛИ Наш! ДОСЛ1ДЖеННЯ, К1ЛЬК!СТЬ П0ВН0Ц1ННИХ яй-

цекл!тин золотистого хом'ячка, отриманих в результаи супе-ровуляцп, залежить В1Д стади статевого циклу, на HKift уводиться ГСЖК, а також в!д часу наступного уведення лХГ. Най-бхльша к^лькють яйцеюитин була одержана шсля 1н'екцИ ГСЖК на стад!i метеструс I i наступного уведення лХГ через Бб годин (табл.1). При íh'екци лХГ через 48 i 72 години kí лькють яйцекл1тин в i рог i дно зменшувалаоь. Цитогенетичний анализ npenapaTiB яйцекл1тин хом'ячтв показав, щр при супе-ровуляци у самок поряд з нормальною овулящею клиин на стад!s метафаэи II мейоэу cnocTepirasTbCfl передчасний вих1д

Таблиця 1

Ятсть ооцит1Б золотистого хом'ячка,' одергканих шсля суперовуляцп, викликангй в разш стад л естрального циклу (введения лХГ через 56 годин шсля 1н'екцп ГСЖК)

Стад!5 астрального циклу ШЛЬЮСТЬ ДОСЛ1Д-жеких тварин Всього ООЦИТ1В К1лькють ооципв, М + т

в нормальною овулящею на М11 мейозу з овуляшею на стад! 1 Т1 мейозу э 1 або 2 партеногене- тичними пронуклеусами з хромосом- ними поручениями

Метеструс I 1? 696 38,3 + 1,85л (9573%) 1,9 + 0,22 (4,7%) - 4,5 + 6,47" (10,9%)

Метеструс II 1? 369 18,9 + 2,05 (85,9%) 2,8 + 0,32 (12,7%) 0,3 + 0,11 (1,4%) 13,4 +0,79 (61,8%)

Жеструе 10 76 6,2 + 1,47~л 0,8+0,2 (8176%) (10,5%) 0,6 + 0,22 - (7,9%) 4,4 + 0,54 (57,9%)

Проеструс 9 93 8,0 + 0,76 (7774%) 2,1 + 0,51 (20,4%) 0,2 + 0,15 (272%) 3,2 + 0,52 (31,2%)

Контроль (спонтанна ОВУЛЯЦ1Я) 12 ■ 101 . 9,1 + 0,51 (105%) - - 0,7 + 0,22 Г7,9%)

Р < 0,001 в пор^вняшп 13 метеструоом II; Р > 0,05 в пор!вняши 18 контролем, Р < 0,001 в пор1внянн1 13 метеструоом II

- 9 - ' .

яйцекл1тин в яйцепроводи , а також стимуляц!я яйцеюитин до партеногенетичного роэвитку.

Досл1ди показали, що капацитован! m vitro за допомогою гепарину сперматозозди бугая эдатш до пенетраци плазматич-но1 мембраяи зв!льнених в!д прозоро! оболонки яйцеюитин хом'ячка - 1нкубащя яйцеюитин хом'ячка 1з сперматозо!дами бугая протягом 5 годин приводила до пекетрацп 78,57, (п -671) jui ночих гамет. На цей час у б1льшост! яйцешитин була В1дм1чена наявнють розбухло5 головки сперматозоида з хвоо-том (60,6%), решта яйцекл!тин мостила чолов1ч! пронуклеуси з хвостами або сперматозозди без ознак деконденсац!1 хроматину. У 48,5% пенетрованих яйцекл1тин мала м!сце полюперм1я. Шдальше культивування in vitro оо1менених яйцеклтш (п 114) протягом 16 годин дозволило отримати прометафазН! х'ро-мосоми сперматозоид!в бугая у 46,5% яйцешптин. Додавання в середовище культивування яйцеpjiiтин (п - 230) колцем!ду на ваключному етап!7при /загальШй тривалост1 культивування 24 години, дозволило одержати конденсован! метафазн» хромосоми спёрматозо!д1в бугая в 25,7% яйцегаптин.

Удосконалення методов одержання ембрюгпв велико! рогато! худоби'т vitro шдвйшуе вимоги до ефективкост! капаци-тацп i ощнки зашнднюючо! здатноет! сперматозо!д1в буга!в поза орган isMOM. Нами проводились доелиджшия по визначенню ефективност! оценки запл!днюючо! эдатност! сперматозо!Д1в буга!в Пол!т 3405 i Мамонт 4719 за Допомогою гетеро- i' гомолог 1чного тест!в, при цьому характеристики спермм обох буга-!в пiсля розморожування були подiбними. Крiм тесту на пенет-рацт оолеми яйцеюлтин хом'ячка, ми використовували роэроб-лений нами способ оценки здатност! сперматозо!д!в до пенет-

ради прозоро! оболонки яйцекл!тин KOpiB, HKi довр¿ли in vitro i збер!гались у сольовому роэчиш 1,5 Ы хлориду маг-нш. Ощнка iTOfiaatiHKiB запл!днюючо! здатност! буга!в за до-помогою гетеролопчного теоту понизала В1дсутн1сть Biporifl-но5 розниц.) эа частотою пенетрацп яйцеклтга золотистого хом'ячка сперматозоидами обох буга$в, проте, була одержана рiзниця miж бугаями при пенетращi гомологично! прозоро! оболонки ooLiMTiB, HKi вбер1гались у сольовому розчин: (табл.2).

Таблица 2

Пор1вняння загипднюючозс здатност! еперматозохдхв двох буга1в поза организмом

{Гетерологгчнв} Гомологгчяа! Гомологfоде i пенетрагця ; пенетращя { заПЛ1Днення

. ' . {кхль- | % jKMb- J % !кхль- | % 1 %

Byrai ;к1сть jneHe-jKicTb ,пене-)к5:сть ¡зап- дроб-

JociMe- ¡тра- ¡ос1ме-,тра- ;oci— ;л1д- | лення

¡нених jm'i ¡нених jiui }мене- |нення ; .

;яйце- ¡ооле-;ооци- jnpo- ¡них j I

{ЮПТИН ¡МИ TIB ¡ЗОрО!(ООЦИ- ,

i } I ¡обо- ¡TIB j

_j j j jдонкиj j |

Пол it 3405 198 74,2* 121 62,0** 162 45,7*** 19,B30005

Мамонт 4719 186 65,6* - 137 37,2** 186 28,0х** 9,7****

* - P>0,05

** - P<0,001

*** -P <0,001 30905 - P<0,05

В досл!дах по еашпдненню in vitro штактних ооцитiв ко-piB була виявлена р1зниця м!ж бугаями эа частотою эашпднен-ня i дробления ооцит!в, шр в!дпов1дала р!знищ за частотою пенетрац!1 гомолог1чно! прозороI оболонки.

На наш погляд, гетерологачна пенетращя могке бути вико-ристана як тест запл!днюючо! здатност1 сперматозо!Д1в буга!в

в тих випадках, коли иизька эагшднююча адатшсгь ав'язана 1з нездатшстю сперматозо'Шв до проходження капацитаци i акросомно! реакцН га злиття з оолемою яйцешитини; цей метод дозволяв також ощнити здатнють сперматозо!Д1в бутахв до деконденсацп хроматину в ооплазм1 яйцекл!тин з формуван-ням чолов1чих пронуклеусiв. Осшеноння яйдекл1тин коров, як! дозр1ли in vitro i збер!гались в содьовому розчин!, капаци-тованими сперматоэоздами бугая дае можливють без будь-якого забарвлення вивчати вдатнють сперматоэо!д1в розних бугахв до пенетрацн nposopoi оболонки i не потребуе культивування яйцекл1тин шсля еагшднення, при цьому сперматозооди буга!в не проникали в ооплазму таких ооцитов. Тому ми вважаемо, щр Т1лька комплекений метод, який базуеться на використанн! тест 1 в на гетеро-^ i гомолог¡чну пенетрацш, може дозволити В1роПдн1ше оц1нити запл!днюючу эдатность сперматозо1Д1В бу~ raiB в умовах in vitro i може знайти застосування для выбору 6yraiB для дослав по одержанню ембрюн1в велико! рогато i худоби поза орган 1SMOM.

3.2. Загш днення in vitro оодипв коров, як! доз pi ли

поза орган1змом 1стотне значения при добувашп ооцит1в а яечшшв мае к!лькють видалених ооцит1в, збереження цолюност! ооцит-ку-мулюсних комплекс1в, тривалость видалення i Biдбору 00ЦИТ1В i час контакту ж1ночих статевих кл1тин а продуктами розр!зу тканин яечника, як! негативно впливають на життеэдатнють ооципв i ix здатшсть до подальшого запл!днення in vitro.

При acmpaqi5 i pospisaHHi фол!кул!в яечнишв под1бних . розморов нами було отримано 8,5 + 0,43 i 16,2 + 0,57 ооцит1в на один яечник, водпов!дно. Час, витрачений на одержання.

пошук, вiдбiр 1 в1дмивання ооцит^в в чотирьох яечнимв при асшрацп i розс1чеши, складав близько 20 1 40 хвилин, в1д-noBiдно, Обидва способи вид!лення ооципв не впливали на щ-Л1СН1Сть i структуру ОКК i эбереження щльного i компактного кумулюеа. Дозревания i запл!днення ооцит1в in vitro показало, що способ добування ооцитiв не впливае на частоту дозр!-вання i ревень хромосомних порушень ооцит1в, в1дсоток san-Л1днення i дробления яйцеюптин (табл.3, Р > 0,05), тому розс1чення фол1кул!в дозволяе отримати б1льшу юлькюгь ем-брюн1в s одного яечника.

Таблиця 3

Дозрхвання i зашпднення поза организмом ооцитгв кор1в, видалсних з яечникхв разними методами

Способ ! ¡"?рЕ°Л0"

видалення1 ооцитхв !яеч-!"^аль и!«, них t !"jB ! ооципв

1 !на ' 'яечник,

! !-М+м

I J

ооцитхв на ' ' TO?: мета$аэ! II loci- !зап- Iohxb.

-.мене-,л1Д- .раннхх 'у т.ч. 'них нених1стадий Гэ хро- !ооци-!ооци-[дроо-всього,,мосом- .tie, .Tib, .лення, а(%) 'ними 1 1 % . 1 % ■ Inopy- ! I I .шення- , , , мп,п(%у 11

AcnipaniH 21 8,5+0,43* 35(87,5)' 1(2,9) 144 34',7 19,4 Розс1чення 17 16,2+0,57* 52(86,7) 2(3,8) 224 37,5 22,3

* - Р<0,001

В1Домо, що наявшсть оточуючих ооцит клггин кумулюеа впливае на ефективнють зашпднення in vitro /Fukui, 1990/. Нами вивчався вплив Ц1Л1сност1 ооцит-кумулюсних комплекс1в (ОКК) KopiB на эашаднення i подальший розвиток яйцеклиин in vitro. Д0СЛ1ДИ показали, що частота формування чолов1чо-го 1 лчночого пронуклеус!в у ооципв, оточених клiтипами ку-

мулюса (n - 187), га у ооципв, чаотково зв1льнених в1д ку-мулюса (п - 176), вiрогiдно не В1др1знялась - 41,7 та 37,5%, в1дпов1дно; але высоток дробления яйцекл1тин, оточених 1н-тактним роэпушеним кумулюсом, був вiрогiдно вишлм (27,3%), нш у ооцитiв з чаотково видаленим кумулюсом (17,6%).

В досшдах по дозреванию ооцит1в KopiB in vitro найб1льш часто використовують два типи сироваток - фетальну сироватку теляти /Galli & Lazzari, 1994/ i еструсну сироватку кров1 ко-piB /Jura е. а. , 1994/. Викликае интерес пор!вняння ефектив-HocTi' впливу фетально! сироватки теляти i сироватки кровi ко-р!в в стан! окоти на розвиток ооципв кор!в in vitro i ix компетенцио до запл1днення поза оргашзмом (табл. 4).

Таблица 4

Вплив еструсно1 сироватки кров i KopiB на доэргвання i заплхднення ооциттв кор:в поза организмом

-!-

I-

,0КК э Тип сильно сироватки "Розлу-г .шеним'

кумулго-

f п\%)

\

К 1 Л Ь.к I С I Б.

т

•ооцит1в на . ; }ембрго-

MeTafasi II 'осх-'зап- '„iB

.|мене-1Л1дае-!ранн1х

у т.ч. .них .них ,стад1й всього.'э хромо-1 ооци-'ооци- !дроб-«<%> !сомними !т1в, jtib, (лення, ,порушен-, л { % • нями, 1 '

1 л (%) ! ! !

IM еструснoi

сироватки „

кров! KopiB 41(83,7) 66(87,8) 10(11,6) 138 40,6* 24,6**

20% фетально1

сироватки

теляти

(контроль) 37(80,4) 76(82,6.) 8(10,5) 352 36,9х 16,5**

* - Р >0,05

** - Р<0,05

В наших экспериментах не було в!дм!чено В1рог1дног0

впливу виготовлено! нами еструсно! сироватки KpoBi кор1в на екепанеш кумулюса, частоту дозр1вання, р!вень хромосомних порушень i частоту вагшдиення ооцотчв KopiB in vitro, в по-piBHHHHi з фетальною сировагкою теляти. Проте, подальший pos-виток зигот эалежав в1д типу сироватки, яка використовУва-лась при культивувашп ооцит!в, до, мабуть, пояснюеться тим, щр еотрусна сироватка KpoBi KopiB сприяе кращому цитоп-лазматичному доэр!ванню оодит1в.

Певне значения в досл!дах по запл1дненню ооцит1в KopiB in vitro мае визначення моменту початку ix сшльно! шкуба-щi i3 сперматозоидами. Як показали наии досл!дження, через 30 хвилин пюля центрифугування, на В1дм1ну в1д контролю, окрем1 сперматозо!ди склеюються М1Ж собою гол1вками (по 2, 3 i в подалыаому б!льшо5 к1лькост! сперматозо!д!в) 1 починають разом поступально рухатись, а надал1 (ще через 10-20 хвилин) , особливо при склеюванш велико! к1лькост1 сперматозо-!Д1в, зд!йснювати манезяп рухи. сшльне культивування таких сперматоэо!д1в з ¿нтактними ооцитами KopiB, як1 доэр1ли in vitro (n - 196), привело до зашиднення 42,9% ж1ночих гамет, що шдтверджуе те, щр при появ1 перших спермато8о!д!в 8 "липкими" гол!Вками i сл!д В1дбирати поверхневий шар npoiH-кубованих сперматозо!Д1в для ■помещения його в середовищэ 8апл1днення. Таким чином, одержат нами дан! св!дчать про можливють контролю придбання сперматозоидами бугая здатнос-Ti до аапл1днення in vitro шляхом безпосереднього в1зуально-го спостереження шд м1кроскопом.

Додатков! можливост 1 при одержашп ембрiонiв вiдкрива-ються э використанням в досл1дах по эаялидненкю in vitro ме-ТОД1Б мжромантулящй. В наших достижениях ми вивчали

вплив чаоткового розс!чення прозоро! оболонки скляною мтро-голкою на загшднення ооципв itopiB in vitro i подальший розвиток зигот поза оргапзмом. Результата дослоджень показали, шр розс!чення невелико! дишнки nposopoi оболонки у 0,5 М роэчиш цукрози значно зб1льшуе частоту запл!днення ооцитiв с1м'ям з дещо зникеною концентрац! ею сперматозошв (10^ Сп/мл) (Р < 0,001) i не в1дбиваетьоя негативно на по-дальшому розвитков1 зигот до paHHix отад1й дробления (табл. Б).

Таблиця 5

Вплив часткового розс1чення прозорог оболонки на заплгднювантсть оощтв коргв

!Всього Юлыпсть яйцеклгтинД'

' Д9С- . I-1-1-1

,л1джг?-,з од- |з двона;з трьо-. "но нм 'пронук-'ма г !ооци- !про:;у-!леусами! большою!

Групи дослхду

*

дробления

,tib i iiorey- . •ембр1-'сом 1 IOHIB . ! . !

ктль-

!

1

К1СТЮ

!пронук-! ,леус!в j

■заплгд-нення*

!

23,3 48,9х** 17,0 24,5х**

О

Дрслгдна 172 2*3 23,3 2,3'

Контрольна 212 9,4 5,7 1,9 Контроль на

партеногенез 55 5,5 7,3 1,8

к - ембрхони + я^цеюптини з двома I бгльшою к}льк1стю пронуклеус £в

- Р>0,05; - Р<0,001 Юльмсть ооцит г в, ям розвилиеь до ранн!х стадий дробления - 2-, 3- 1 4-бластом1рних ембрюн1в, - в досл!дк1й груш, була б!льшою, ник в контрольной - 23,3 1 .17%, в!дпо-в1дно. Важливим е той факт, що часткове розс!чення прозоро! оболонки яйце1Штин не шдвишувало частоти появи партеноге-нетичних зигот з одним пронуклеусом (2,3%) ! ровнл полюпер-много заплоднення (2,3%) у поргвнянн! з даними контрольно*

групи (9,4 i 1,9%,в1дпов1дно), а активован1 до партеногене-тичного роэвитку ЧР0-яйцекл1Тини не зазнавали д^лень дробления. Ki лькють кл1тин з полюпермним эшшдненням була невеликою, мабуть, тому, що як установлено на яйцеюптинах лю-дини, розчин цукрози пригн1чуе мнолшнну пенетрат ю спермато-805дами ооцитiв шсля просвердлювання або часткового posci-чення ix прозоро! оболонки /Cohen е. а., 1989; Malter е. а , 1989/.

3. 3. Подолання блоку дробления ембрюн1в велико! рогато! худоби in vitro В наших доел!дженнях показано, що культивування in vitro зигот велико! рогато! худоби на MOHomapi еп!тел!альних кл1-тин яйдепроврд!В кор!в, яечник яких мав новоутворене жовте ило (ЕКЯЖГ), та у свикоодержаному кондишйованому на цьому моношар! середовищ] дозволяе подолати блок дробления i спри-яе роэвитку до стадп морули-бластоцисти 43,1 i 44,SZ та бластоциоти 29,1 i 23,3% ембрюн1в, як1 дробились, в!дпов1д-но (табл.6). Менш придатним в цьому ыдношешн, як показали експерименти, був моношар еп1тел1альних кттии яйцепровод1в KopiB, яечник яких мав оэнаки недавньо! оиуляцп (ЕКЯО) -лише 28,2% ембрюшв, ЯК1 дробились, досягли стадп морули-бластоцисти, а 16,5% ембрюшв - стад!! бластоциоти; при культивуванн i на цьому моношарi також спостер!галась най-б1льша к1льк!сть деген.ерованих морул-бластоциет.

Цитогенетичний анализ препарат¡в одержаних in vitro ем-CpiOHiB, HKi роэвивались нормально, виявив наявн^сть морфо-лопчно нормальних ядер, HKi мостили дипло!дний Ha6ip хромосом. Наш! епостереження показали, шр на 2-бластом1рн1й стадп ядра eM6piOHiB велико! рогато! худоби мають органiза-

Таблиця 6

Розвиток in vitro в piaHHX системах культивування яйцешитин KopiB, як! дозриш та були загшднен! поза орган1зыом (тривалють культивування -184 години)~

Система культивування Всього задлхд- нених яйце- клиин Шлькють eM6pioHiB, ЯК1 дробились, п(%) ШЗН1Х морул Бластоцист

п' X Bifl К1ЛЬ-КОСТ1 eMSpio- HiB.HKi дробились К1ЛЬ- KiCTb дегене- рованих морул п г в!д К1ЛЬ- KocTi ембрхо- HiB.HKi дробились К1ЛЬ-KiC'ïb дегене-рованих бластоцист

Моношар ЕКЯЖГ 137 86 (62,8)л~ 12 14,0

Мзкошар ЕКЯО 125 71 (56,8)~ 9 12,7 Св1жоодержане кондищйоване

на моношар! ЕКЯИТ середовище 66 43 (б5,0)~~ 9 20,9

199 + 20% фетально! сироватки

теляти (контроль) 91 48 (52,7)

25 11

10

29,1' 15,5

23,3

- ооцити дозревали в середовипц з еструсною сироваткою Kpoei кор!в i шкубувались is сперматозоидами без зв1льнення в1д юатин кумулюса

" - Р > 0,05

"" - Р < 0,05 для морфолопчно нормальних бластоцист в ncpiBiraiiHi э моношаром ЕКЯО

I

е—< 43

1

pin, под!бну до орган1вац!i хроматину у пронуклеус1в, про-те, вже у ембрюн!в 8->штинно! стадп, в ядрах споотер!га-ються типовi ядерця, i вони мають структуру, под4бну до ядер Ш8ДН1Х морул та бластоцист.

Цор!вияння цитоморфолопчних характеристик бластоцист, одержаних m vitro,та in vivo (n - 35), показало, що ранн! бластоцисти, одержан! поза орган1змом, мали властив! для дано! стад!! к1лькють кл!тин (>64) i диаметр проэоро! обо-лонки (160-170 мкм), виражений бластощль, добре noMiTHi кл!тини трофектодерми i внутртшьо! юитинно! маси. В проце-ci розвитку in vitro у бластоцист, одержаних поза opraHis-мом, в!дм!чалось типове для дано! стадп розвитку зб!льшення po3Mipy i потоншення проэоро! оболонки (п кл1тин бластоцисти. > 130, д!аметр - 180-210 мкм).

Дв1 бластоцисти, одержан! in vitro на MOHOiiiapi ештел1-альних кл1тин яйцепровод!в кор!в, яечник яких мютив новоут-ворене канте т1ло, - експандована i повести експандована -буди пересаджен! телицям-рецишентам.

Таблиця 7

Вплив cTafliï розвитку ембр!он:в на ïx здаипсть до розвитку доморули-бластоцисти на MOHomapj ЁКЯЖТ (тривалгсть культивування - 160 годин)

Всього 'Кхлыасть' e.MÖpioHiB, як! досягли стадх1 Стадхя |ембр!0-|---------------------------

розвитку Н1В,як1 наступного ембрюна 'дроби- < доения ¡лись j дробления

!

ПГЗНЬО!

морули

п

бластоцисти

2-юп тонна 44

3-кл^инна 3

4-клхтинна 39

* - Р<0,001

19 43,2 9 20,5 I 2,3* I 33,3

39 100,0 3 7,7 24 61,5*

Таблиця в

Динам1ка роэвитку осiменених in vitro оощшв KopiB (n - 276) на MOHOiirapi ЕКЯЖТ

Переважакш стадп розвитку ембрюн!в, як! розвивались, на час оц1нки % '

п Biд K№KoeTi ос¡менених ООЩШВ В1Д К1ЛЬКОСТ1 eMöpiOHiB, HKi розвивались

18 годин пюля початку осшен1ння

Зигота 137 49,6 -

42 години ШС.ЛЯ початку ос!мен)ння

2-кл1Тинна стад!я 44 15,9 51,2

З-юитинна стадия 3 1,1 3,5

4-кл1тинна стадгя 39 14,1 45,3

Всього 86 31,1 100,0

66 годин ш едя початку ос1мешння

4-кл1тинна стадия 19 6,9 32,2

б-8-1Штинна стад i я 40 14,5 67,8

Всього 59 21,4 100,0

114 годин шеля початку оегменпшя

б-8-кл1тинна стадгя 16 5,8 20,6

10-16-кл1тинна стадия 35 12,7 64,8

Рання морула (>16 юитин) 3 1,1 5,6

Всього 54 19,6 100,0

162 години пюля початку осшешння (6-денн1 ембрюни)

Рання морула ' 30 10,9 71,4.

Шзня морула (32'64 12 4.31 28г6

га 1 тин)

Бластоциста • - - -

Всього 42 15,2 100,0

186 годин пюля початку ос1мен1ння (7-денн1 ембрюни)

Рання морула 7 2,5 16,7

П1зня морула 17 6,2 40,5

Бластоциста (рання,

яка роэширюеться) 18 6,5 42,8

"Всього 42 ■ 15,2 100,0

202 годкни ПЮЛЯ прчатку ос ¿менншя

Шзня морула 12 4,3 32,4

Бластоциста (рання,

яка роэширюеться, 67,6

повнютю експандована) 25 9, i

Всього 37 13,4 100,0

6-денш ембрюни, одержан! in vivo

Рання морула 16 - 84,2

Шзня морула . 3 - 15,8

Бластоциста - - 100,0

Всього 19 -

7-денн1 ембрюни, одержан! in vivo 5,8

Рання морула 4

Di зня морула 30 - 43,5

Бластоциста (рання, 50,7

яка розширклгться) 35 -

Всього 69 - 100,0

- 20 -

В пший серп експеримен'Пв показано взаемозв'язок мш стад i его розвитку, яко! дооягають ембрюни велико! рогато! худоби через 24 години шсля запл!днення ооцит1в in vitro (через 42 години пюля початку ос!меШння), i !х подальшим розвитком до стадп шзньо! морули-бластоцисти (табл.7) -4-кл!тинн1 ембр10ни мають значно крашу здатнють до розвитку in Vitro, В IIOpiBHHHHi 3 2-КЛ1ТИННИМИ.

Нами було проведено аналйЗ динам1ки розвитку in vitro paHHix ембрюн1В велико! рогато! худоби, одержаних поза организмом, на MOKomapi ЕКЯЖГ (табл.8). Порхвняння даних, одержаних через 114 i 162 години шсля початку ос!мешння in vitro, показало, що 77,8% (42/54) 6-16-кл1тинних ембрюн!в велико! рогато! худоби роэвивались нормально i подолали блок дробления на стадп 8-16 1штин. Пор1вняльний : анал!з показав, що 6- i 7-денн1 ембр!они велико! рогато! худоби, отри-ман! in vitro, перебувають на тих же стад!ях розвитку, шо i 6- i 7-детп ембрюни, вимит! з poriB матки кор1В-донор1В.

ВИСНОВКИ

1. Гетеролопчна пенетращя яйцеклцтин золотистого хом'-ячка дозволяе оде ржу ват и прометафазн! i метафаэш хромосоми сперматозо!д1в бугая, капацитованих in vitro за допомогою гепарину.

2.. Комплексний метод ощнки запл!днюючо! здатност! спер-матозо!д!в буга!в in vitro дозволяе зд!йонити селекцш буга-!в для досл1д1в по одержанню ембрюшв велико! рогато! худоби in vitro.

3. Початок cniJibHoi шкубацп in vitro ооцит1в i сперма-T030!Д1В велико! рогато! худоби слад проводити при появi сперматозо!Д1В is "липкими" головками.

- 21 -

4. Розо1чення фол!кул1в яечшшв Kopie довволяе одержати биыне ооцит1в i eMöpioHiB, в пор1вянш э аошрац!ею ооципв.

5. Встановлено позитивная вплив еструсно) сироватки гсро-в1 KopiB на дозровання i зашиднення ооцит i в кор i в in vitro та повного эбереження розпушеного кумулюса шд час зашпд-нення - на ïx дробления.

6. Часткове розс1чення прозоро! оболонки oouhtîb кор1в сприяло эб1льшенню частоти эапл!днення in vitro ооцит1в ciм' ям si эниденою концентращею сперматоэошв i не в1дби-валось негативно на подальшому розвитков! зигот до ембрюн!в paHHix стадий дробления.

7. Кухьтивування in vitro эиго? та euöpiOHiB paHHix сга-Д1й дробления на -моношар1 ЕКЯЖТ та у кондицойованому на цьо-му моношар! середовишд дозволило одержати больше морфолог 1ч-но нормальних морул та бласгоцист великоi рогато! худоби, Н1ж на MOHomapi ЕКЯО.

8. Цитоморфолопчн! характеристики морул i блаетоциет велико! рогато! худоби, одержаних in vitro, були под!бними до аналопчних показник1в морул i блаетоциет, одержаних in vivo.

ПРАКТИЧН1 ЛРОПОЗЩП

1. Комплеконий метод ощнки запл1днюючо! эдатноот1 спер-матозошв буга!в in vitro, розроблений для в!дбору буга!в для досл1д1в по одержанто ембрюн!в велико! рогато! худоби поза организмом, може бути в подальшому використаний при В1Дбор! ПЛ1ДНИЮВ ДЛЯ штучного 0С1меН1ННЯ.

2. При проведенно експериме)шв по одержанню eM6piOHiB велико! рогато! худоби in vitro треба використовувати ео-

трусну сироватку кров! nopiB при дозр1ванн! оощшв i 1н-тагст ооцит-кумулкхш комплекси для заплдаення; для одер-жання бластоцист велико! рогато! худоби in vitro культивування paHHix ембрюшв вд1йснювати на Moiiomapi еп!тел!альних кл1тин яйцепровод!в nopiB, яечник яких мае новоутворене жов-те Т1Л0, або в кондиЩйованому на цьому моношар! середрвиаи.

3. Результата досл1дшнь можучь бути використан! в учбо-вих курсах на кафедрах генетики, бштехнологи i ембрюлогн ун1верситет1в, с1льськогосподароьких i ветеринарних 1нститу-TiB.

Список оеновних праць, опубл!кованих по тем! дисертац!i

1. Кузнецов В.е., йпэарова I.E. Ровробка методу одер-жання препарат1в хромосом сперм! !в бугая /Лесник о.-г. науки. - 1988. - N 8. - С. 63-55.

2. Кузнецов В. Е., Елизарова Я Б. Визуальный метод определения готовности сперматозоидов быка к оплодотворению in vitro //Бюлл. ВНШРГЖ. - Л., 1991. - Вып. 129. - С. 18-21.

3. Редина О/Е., Амстиславский С. Я , Ыаксимовский Л. Ф., Кузнецов ЕЕ., Елизарова Л Б. Суперовуляция у двух видов лабораторных животных, при введении им гонадотропина СЖК в разные фазы астрального цикла //Сиб. биол. «урн. - 1998. - Вып. 2. - 0.24-28.

4. Кузнецов В. Е., Елизарова И. В. Партеногенетическая активация ооцитов коров, созревших in vitro //Онтогенез. 1992. - 23, 6. - С. 650-653.

б. Буркат В. Е , Кузнецов В. Е., Елизарова И. Б. Биотехнологические методы оценки и прогнозирования оплодотворяющей способности сперматозоидов быков //Bich. агр. науки. - 1992. -N il- - С. 22-26.

6. Зубец М. В., Кузнецов Е Е. , Елизарова И. В. Оплодотворение in vitro ооцитов коров с частично рассеченной прозрачной оболочкой //Bi сн. агр. науки. - 19S3. - N 7. - 0.47-54.

7. - Зубец М. В. , Куз'нецов а Е., Елизарова И. Б., Шеховцов С. КХ, Шеховцова Е. Ю. Трансплантация половинок - эффективный метод увеличения количества телят от доноров эмбрионов //BiCH. агр. науки. - 1994. - N 7. - С. 67-73.

8. Елизарова И. В. Гетерологическое оплодотворение in vitro сперматозоидами быка яйцеклеток золотистого хомячка //Тез. докл. "Всес. научно-техн. совещ. в ВИЖе, 9-10 октября 1990 г., Дубровицы, 1990, "Проблемы развития биотехнологии в животноводстве", С. 38-38.

9. Kuznetsov, V. Е., Yelizarova, I.B. In vitro production of bovine embryos using a microsurgery' method //Proo. First Eur. Conf. "Embryo Technology and Genetic Engineering in Cattle and Sheep Breeding", Krakow, Poland, 1994, P. 221.

10. йпзарова I.B. Одержання npenapaTiB хромосом eM6pi-ohib велико! рогатоi худоби, отриманих in vitro //Тез. до-пов.'наук. ^практ. конф. "Генетико-селегаийн! та технолог1ЧН1 проблема в1дтворення с.-г. тварин", Юпв, 1994, С, 80.

11. Кузнецов В, в., Опзарова I. Б., Мадюон В. В. , Мадюон JL В. Трансплантация бластоцист велико! рогато! худоби, отриманих in vitro //Тез. допов. Всеукр. юв!л. наук.-практ. конф. "Генетика продуктивное?i тварин", 20-21 грудня 1994 р., Ки-!в, 1994, С. 19.

12. ел!зарова I. Б. Динам1ка розвитку in vitro ранн1х eM6pioHiB велико! рогато! худоби, одерзканих поза организмом //Тез. допов. Всеукр. ювiл. наук, -практ. конф. "Генетика продук-тивност! тварин", 20-21 грудня 1994 р., Ки!в, 1994, 0.51.

- 24 -

Елизарова И. Б. Цитогенетичеекие аспекты оплодотворения in vitro ооцитов короь и гетерологичестй пенетрации яйцеклеток золотистого хомячка.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15-генетика, Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское, Киевской обл., 1095.

Разработан метод оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов быков in vitro с помощью гетеро- и гомологической пенетрации ооцитов, получены метафаэные' хромосомы сперматозоидов быка, изучены цитоморфологические характеристики эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro.

Yelizarova, I. В. Cytogenetic aspects of in vitro fertilization of cow oocytes and heterologous penetration of golden hamster ova

Thesis for competition of academic degree' of candidate of biological science from speciality 03.00.15-Genetics, Institute of Animal Breeding and Genetics UAAS, v: Chubinskoye, Kiev Region, 1995.

Method of estimation of bull spermatozoa fertilizing ability in vitro with the using of hetero- and homologous oocyte penetration had been work out, metaphase chromosomes of bull spermatozoa had been obtained, cytomorphological characteristics of bovine embryos produced in vitro had been studied.

Ключовi слова: ооцит, ембрюн, гетеро- i гомологична пе-нетращя, цитогенетичш аспекти.