ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ У ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ

Лукаткин, Александр Степанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ У ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ У ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ"

ЛУКАТКИН Александр Степанович

ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ У ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ /

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории цитофшиологни и клеточной инженерии кафедры ботаники п физиологии растений биологического факультета Мордовского государственного университета им Н П Огарева

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Г.И. 1р}нова доктор биологических наук, профессор МЛ. Рыбакова, доктор биологических наук Е.Б. Кириченко

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт удобрений и агропочвоведения им Д Н Прянишникова

на заседании диссертационного совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева Адрес 127550, г Москва, Тимирязевская ул , д 49, V ченый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА

Автореферат разослан Сч+^тЛ 1998 г

Защита состоится

1998 г в

часов

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических на» к

$ ^^¿С, А.С. Лосева

Актуальность проблемы. Условия внешней среды претерпевают периодические и случайные колебания, и отклонения от благоприятных для жизни растений норм часто достигают опасных амплитуд (Библь, 1965; Лархер,1978; Chapin,1991; Bohnert et al.,1995). Многие факторы среды, к которым растение эволюционно не приспособлено, оказывают стрессовое воздействие на организм, приводящее к физико-химическим нарушениям в клетках, повреждению их структур и метаболических функций (Levitt, 1980) и снижению или полному подавлению образования органического вещества (Timmennann,Sleelin, 1984).

Для средней полосы России одним из основных сдерживающих развитие растениеводства является температурный фактор (Коровин, 1984). Теплолюбивые растения, родиной которых являются тропики и субтропики, интродуцированы в более высоких широтах, и в этих условиях не могли выработать способность противостоять пониженным положительным температурам. Ряд культур, такие как рис, кукуруза, томат, огурец, хлопчатник, соя и др., повреждается в ходе выдерживания при температурах выше точки замерзания тканей, но ниже 15°С; такое повреждение называют Холодовым (Levitt,1980; Raison,Lyons,1986).

Действие пониженных температур в умеренном климате приводит к снижению или полной потере урожая теплолюбивых растений - либо за счет прямого повреждения, либо замедленного созревания (Wilson, 1985). Даже небольшие понижения температуры, не вызывающие видимых повреждений таких растений, снижают их продуктивность до 50% (Коровин,1969). Очевидно, что проблема устойчивости к пониженным положительным температурам, часто действующих на растения в весенний и осенний периоды во многих регионах нашей страны, имеет важное значение для практического растениеводства.

Для успешного выращивания многих культурных растений в средней полосе России и дальнейшего продвижения зоны их возделывания на север необходимо комплексное исследование физиологического действия пониженных температур на теплолюбивые растения с целью повышения их холодоустойчивости (Генкель, Кушниренко,1966; Дроздов и др.,1984). При этом обязательно четкое понимание процессов, посредством которых пониженные температуры приводят к повреждению, и механизмов, лежащих в основе устойчивости к охлаждению (Lyons et al., 1979). На этой основе возможна разработка методик определения и повышения устойчивости к пониженным температурам с последующим их использованием в программах селекции.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было выяснение закономерностей влияния пониженных положительных температур на цито-физиологические процессы у теплолюбивых растений и разработка подходов к направленному повышению холодоустойчивости. Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- раскрытие механизмов инициации холодового повреждения с участием ионов кальция, активированных форм кислорода (АФК) и функционированием ан-тиоксидантных систем защиты клетки;

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧ'-'-Я Г' ¡5ЛИОТЕКА Моек, . . •> <демии

- выяснение закономерностей шмененнн ннгофи точогнчееких процессов при различной тшгетыюетн п интенсивности охл ia тении и скорости понижения температуры

- выяснение скорости ретр шии иовре/кдений на клеточной и органнзмен-hovi уровнях в noc leichcibiivi uOjaтения различной интенсивности,

- из>чение онтогенетических и сортовых особенностей изменении цитофи-зиотогичееких процессов при \otojobom повреждении у теплолюбивых растений,

- построение физио югической и математических модетеи инициации и развития холодового повреждения на клеточном и тканевом \ровнях,

- разработка методов опрететення интенсивности холодового повреждения и сравнительной оценки холодочетойчивости сортов ку льтивирчечых растений и клеточных тиннй,

- изучение действия экзогенных соединений разтичной природы на патофизиологические процессы при холодовом повреждении,

- выяснение возможности направленного повышения резистентности теплолюбивых растений к действию пониженных температур посредством скрининга m vitro холодоустойчивых клеточных тиннй

Основные положения работы, выносимые нл laminy

1 В основе нарушений физиологических процессов у теплолюбивых растений, вызываемых действием пониженных температур, лежат изменения цитофизиологических параметров на уровне клеточных мембран Первичными индукторами холодового стресса являются внутриклеточные реакции, связанные с образованием АФК и участием ионов кальция

2 Наблюдаемые цитофизиологические изменения нелинейно зависят от длительности, напряженности и скорости возникновения холодового стресса При действии пониженных температур, не приводящих к гибели растений, наблюдается преимущественно трехфазная реакция изменений цитофизиологических процессов, отражающая ответ на шоковое воздействие, акклимационные перестройки и повреждение

3 Цитофизиологические реакции на охлаждение имеют генетические (сортовые), онтогенетические и эпигенетические (в культуре in vitro) различия, чувствительность к пониженным температурам может быть изменена температурными и химическими (регуляторы роста, аитиоксиданты) воздействиями

4 На основании изменений цитофизиологических параметров возможна диагностика холодового повреждения и холодоустойчивости сортов и селекционного материала теплолюбивых растений, а также клеточных пиний в культуре in vitro

5 Клеточная селекция на холодоустойчивость дает возможность получения линий теплолюбивых растений с пониженной чувствительностью к охлаждению

Научная новизна Получены фундаментальные научные результаты, позволяющие понять первичные механизмы реакции клеток на холодовой стресс, проследить последующее развитие повреждения (вторичные эффекты охлаждения), выяснить «клад эндо- и экзогенных факторов в повышение холодоустойчивости

интактных растений и клеточных популяций. Выявлены сортовые и онтогенетические различия изменений цнтофизиологических процессов при охлаждении. При этом впервые изучено влияние пониженных температур на активность - и

Са -ЛТФаз в листьях растений проса, огурца и кукурузы. Показана роль ионов Са2* и супероксидного анионрадикала в инициации холодового повреждения. В динамике охлаждения установлена трехфазная реакция клеток на холодовой шок, отражающая стрессовые ответы, акклимационные изменения и обратимое повреждение. Выявлены различия по длительности сохранения нарушений (в последействии охлаждения) в зависимости от интенсивности холодового стресса. Рассчитаны математические закономерности изменений цитофизиологических параметров при рахчичных режимах охлаждения. Разработана концепция инициации и развития холодового повреждения теплолюбивых растений на клеточном и тканевом уровне.

Выявлены ключевые этапы холодового повреждения (связанные с повышением уровня АФК), воздействие на которые приводит к изменению реакции растений на пониженные температуры. Разработана стратегия подбора соединений, повышающих холодоустойчивость. Дано физиологическое обоснования протекторного действия регуляторов роста при охлаждении растений.

Практическое значение работы. Результаты настоящей работы использованы для разработки методов оценки холодоустойчивости сортов и селекционного материала теплолюбивых растений, основанных на изменениях цитофизиологических показателей (проницаемости мембран, интенсивности перекисного окисления липидов - ПОЛ, внутриклеточного рН), на один из которых получено авторское свидетельство (А.с. СССР N 1732857, 1992 г.).

Разработано практическое обоснование подбора химических соединений, способных снизить чувствительность к холодовому повреждению у различных видов теплолюбивых растений. Экспериментально показано антистрессовое действие различных синтетических регуляторов роста, в основном цитокининовой природы.

Показана принципиальная возможность направленного повышения холодоустойчивости теплолюбивых растений на основе клеточной селекции (скрининга клеточных культур после охлаждения).

Полученные данные могут быть использованы для создания новых технологий возделывания теплолюбивых растений в зонах риска пониженных температур, а также при конструировании холодоустойчивых растений методами клеточной и генной инженерии.

Материалы диссертационной работы использованы при чтении общих курсов "Физиология растений", "Цитология и клеточная инженерия" и спецкурсов "Экологическая физиология" и "Экология растений" в Мордовском госуниверситете, а также в лабораторных практикумах по этим и другим курсам.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены и доложены на Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984), межвузовских семинарах-

совещаниях Ьноисмбрлны (CipmcK 1484 |4S>) конференции Ф1иио юго биохимические оеновп иммунитет к |рийиым ooieuniM р к.пнии (Уфз 1488) IV конференции микпых \ченых ИГ1ФС (Ilviiumo ll,Sl>) XII м íviuoii конференции Изучение о\рлт и рщионтдыюе испо 1ыов шис нриро шыч ресурсов' [Уфа 1989) конференции мо m 1ыч ученых Оеиошп ie н írip ib 1ения ее 1екции и семеноводства овощных к\тьт\р (С) шниово 1484) н iy ню пр ичтическои кон ¡¡^реншш 'Молодые ученые - сельскому \о)чиегв\ Не ирноклиюи ¡сны (Немчиневка

1989) Ш и IV Всесоюзных конференциях мо ю гых \ icmix гю физио югии раеги тельной клетки (Москва, 1489, 1990) XIV luvinou конференции молодых v leiiux

Повышение эффективности произволе!м овощей и оахчевых кл 1ьтлр (Мытищи,

1990) Втором съезде Веееою inoro ебшествт физиотешв рае гении (Минек, 1940), Третьем съезте Всероссийского общества фиши ююв растении (Ciiikt Петербург 1993), Ежегодных симпошумах ОФР РАН Фишко-чнушческие основы физио ю-гии растении' (Пущино, 1945, Пенза 1406 Москва 1497), Третьей и Четвертой Международных конференциях Регмяторы роетт и ривития растении (Москва,1995 1497) Международном совет шии Лыхамие рае гений Физио ю-гические и экологические аспекты (Сыктывкар, 1445), Второй межвузовской конференции Влияние физических и химических факторов на роет и развитие сетьскохозяйственных растении (Орехово- Кево 1946) XII - XWII Огаревеких чтениях (Саранск, 1983 - 1998), научных семинарах Мордовского отдетсния Вее-союзного и Российского общества фи ¡пологов р игтении (Саранск, 1989 - 1947)

Публикации Основные резутьгаты диссертации представлены в 61 печатной работе Получено 1 авторское свидетельство

Структура и объем работы Диссертация изложена на 323 стргнидах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, рекомендаций по использованию результатов исследования, выводов списка литераторы (522 наименования, в том числе 385 иностранных) Работа содержит 55 таблиц и 44 рнсунк i

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Основными объектами исстедования служили растения нескольких сортов огурца (Cucumis sativus L ), проса (Panicum rmhaceum L ) и кук-vpv ¡ы (Zea imvs L ) отличающиеся по холодоустойчивости В качестве относительно устойчивых использовали сорта Алтайский ранний 166 и Вязниковский 37 (orvpeu) Горьковское 43 и Быстрое (просо), чувствительных - Неросимый 40 и Нежинский 12 (огурец). Саратовское 2 и Скороспелое 66 (просо) У кукурузы применяли сорт Днепропетровская 247 и гибрид Буковннский 1

Растения выращивали в условиях вегетационного опыта (использовали также растения, выращенные в полевых условиях) в сосудах с почвой при температуре 22-25°С, освещенности люминесцентными лампами 5000 ik при непрерывном световом дне или фотопериоде 12-14 ч (этиотированные проростки - в темноте) влажности почвы 60-80% от полной влагоемкости и влажности eoiivxa около 80% Растения кукурузы также выращивали методом водной kv ibrvpbi в pv ioiux

(Журбицкий,Илыи1,1968) при температуре 25"С без освещения и па свету (освещенность 5000 лк) на полном питательном растворе Кнопа и его вариантах с изменением концентрации кальция от 0 до 30 мМ.

Охлаждение- растений проводили в холодильных камерах при двух температурных режимах: 1) в течение 3 д по 16 ч в сутки (с промежуточным отогревом) при температуре 1-2"С (просо) и 3-4"С (огурец); 2) при температурах от -1 до 3"С для кукурузы, от 2 до 4°С для огурца и 2"С для проса с варьированием экспозиции от 0,5 до 24 ч. Контролем служили растения, находившиеся в это время в темноте при температуре 25"С. Различную скорость понижения температуры создавали помещением сосудов с растениями в холодильную камеру с температурой 1°С (внезапное охлаждение) или 22-24"С с последующим ее снижением со скоростью 5,6°С/ч (медленное охлаждение). Физиологические определения проводили до охлаждения, сразу по его окончании и спустя 1, 3, 7, 10 суток после возврата растений в тепло, только на растениях, не проявлявших видимых повреждений.

В качестве объектов использовали также каллусные линии, полученные от стерильных пробирочных растений огурца сорта Вязниковский 37 и кукурузы сорта Буковинский 2 на среде Мурасиге-Скуга с различным содержанием фитогор-монов. Реакцию каллусных тканей на холодовой стресс определяли после охлаждения в темноте при температуре ГС в течение 4 ч (огурец) или 24 ч (кукуруза) по выходу электролитов из клеток, приросту каллусной ткани за 10 сут после охлаждения или восстановлению трифенилтетразолий-хлорида (ТТХ) (То\уШ,Магиг, 1975; Еникеев и др., 1995).

При обработке семян и растений использовали экзогенные регуляторы роста, эффективную концентрацию которых определили в экспериментах по низкотемпературному прорастанию (мг/л): индолилуксусную кислоту (ИУК, 0,5), индолил-масляную кислоту (ИМК, 0,5), нафтилуксусную кислоту (НУК, 1), гибберелловую кислоту (ГК, 0,1), кинетин (0,5), 6-бензиламинопурин (БАЛ, 0,1), картолин 2 (0,1), квартазин (0,1), полистимулин К (0,1), оксикарбам (0,1), дифенилмочевину (ДФМ, 0,5), гидрел (1), хлорхолинхлорид (ССС, 0,5). Препараты применяли путем предпосевной обработки семян (замачиванием в течение 8 ч) или опрыскивания растений за 1 сут перед охлаждением дозой 2 мл раствора/растение. Оценку степени холодового повреждения проводили визуальным способом (по количеству поврежденных и погибших растений после охлаждения при ранжирующих температурах), а также по изменениям цитофизиологических параметров: проницаемости клеточных мембран и интенсивности ПОЛ.

Для модификации ПОЛ в высечках и отделенных листьях в качестве проок-сиданта использовали Ге2+-аскорбат (500 мкМ), антиокидантов (АО) - аскорбиновую кислоту (750 мкМ), глутатион (100 мкМ) и бензойную кислоту (50 мкМ).

Проницаемость мембран и степень холодового повреждения определяли по выходу электролитов из листьев в дистиллированную воду при 4-часовой экспозиции на кондуктометре ОК-Ю2 с расчетом в процентах от полного выхода электролитов (определенного после разрушения мембран кипячением). Степень холодового повреждения клеток оценивали по величине "коэффициента повреждаемо-

сти ' (КП) по формуле Ld-Ui

КП ----------ч |()0 "о

100-Ц,

где Li> - выход электролитов из охлажденной ikhui Lo - из контрольных растений При этом рассчитанные ¡на letina повреждения (KII) отражают выход электролитов вызванный действием охлаждения

Активность Мц*''-зависимой. к" активир\емои АТФиы определяли по методике (Leonard Ho!chloi>s,1976) с некоторыми модификациями в гомогенате листьев или во фракции клеточных стенок с плазмллеммои Отщепленный фосфат определяли по модифициров «тому метолу (Fi^ke bubbarow, 1425) При определении субстратной специфичности АТФаз испольювали ГТФ, УТФ, Р-глицерофосфат, фруктозо-1,6-дифосфат в концентрациях, равных АТФ (3 мМ), в ингибиторноч анализе - азид натрия (1 мМ), ортованадат натрия (50 мкМ) или ovaoami (10 мкМ) Активность Са**-АТФазы определяли по отщеплению Р„ в средах с добавлением СаС1г (2,25 мМ) или ЭГТА (0 5 мМ) по модифицированному методу Фиске-Суббароу

Содержание белка определяли по модифицированному методу Лоури (Lowry et al ,1951) после осаждения белка 30% ТХУ

Внутриклеточный рН определяли прижизненным окрашиванием 0 05% нейтральным красным (Зауралов,Зауралова,1Ч68) с количественной оценкой по шкале растворов индикатора, приготовленного на трис HCI буферах в диапазоне рН 5,88,0, и расчетом средних значений рН (по 200-300 клеткам каждого опыта)

Интенсивность ПОЛ в высечках листьев определяли по накоплению малонового диальдегида (МДА) реакцией с тиобарбитуровои кислотой (Жиров и др , 1982) .

Содержание супероксидного анион-радикала (О;) определяли по окислению адреналина в адренохром (Прайор,1979)

Активность супероксид-дисмупзы определяли по модифицированной методике (Knmar,Kno\vles,1943) в неочищенной цитозолыюй фракции, полученной центрифугированием при 7000g в течение 15 мин

Содержание кальция в растительном материале определяли трилонометриче-ским титрованием озоленной навески (Радов и др ,1985) или кальций-селективным электродом, содержание кальция в тканевых комлартментах определяли экстракцией ионов из высечек на качалке

Ростовые параметры организма (высоту растения, площадь листовой поверхности, сырую и сухую массу надземной части) определяли на 15 растениях каждого варианта перед охлаждением и спустя 10 суток после него Определения клеточного роста проводили на постоянных препаратах верхней части стебля с конусом нарастания Фиксацию и проводку материала проводили по 3 П Паушевой (1970) с некоторыми модификациями, окрашивание препаратов гематоксилином -по М Н Прозиной (1960), на препаратах подсчитывали число делящихся клеток с расчетом митотического индекса и измеряли длину клеток в стадии растяжения

Содержание свободных Фитогормонов определяли по биотестам: ауксинов -по приросту отрезков колсоитилей пшеницы, цитокиннновпо синтезу хлорофилла в семядолях огурца (Зауралов.Путаев, 1990).

Повторности и статистическая обработка результатов. Все опыты проводили в нескольких биологических повторностях, каждый опыт повторяли не менее 3 раз. В таблицах и на графиках представлены средние значения из всех опытов с их стандартными ошибками (Лакин,19&0). Достоверность различий между вариантами оценивали по (-критерию Стыодента.

Проницаемость клеточных мембран. Одной из причин повреждения растений при действии неблагоприятных факторов среды, в том числе пониженных температур, является нарушение клеточных мембран, проявляющееся в повышении их проницаемости (усилении выхода электролитов). В результате трехдневного охлаждения, не вызывавшего видимых повреждений растений проса и огурца, проницаемость мембран увеличивалась; при этом величина КП, показывающего выход электролитов, индуцированный охлаждением, зависела от фазы развития (рис.1). Поскольку усиление выхода ионов при действии повреждающего фактора указывает на низкую устойчивость растения к этому стрессору (Lyons, 1973; Simon, 1974; Pauli,1981; Wang,1982), то в те фазы, когда КП велик, ткани растения менее устойчивы к действию пониженных температур. Это означает, 4to минимальная холодоустойчивость листьев у растений проса наблюдается в фазу трех листьев и у огурца - в фазу первого настоящего листа; максимальная - в фазу выхода в трубку у проса и цветения у огурца.

Рис. 1. Величина коэффициента повреждаемости после трехдневного о.хла-ждения растений проса (А) и огурца (Н) в разные- фазы развития. Цифрами на графике обозначены сорта: А: I - 1'орьковское 43; 2 - Саратовское 2; 3 - Скороспелое 66; Б: / - Алтайский ранний 166; 2 - Иязниковскии 37; 3 - Нежинский 12; 4 - Неросимын 40.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. ИЗМЕНЕНИЯ ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА

1 . 4 фазы развития

1- три листа, 2- выход в трубку, 3- выметывание, 4- цветение

Фазы развития

I- первый лист, 2- три листа, 3-бутоннзация, 4- цветение

При анхлизе сортовой релкиии на охлллдснне обнаружено что величина КП \ растений \стоичивы\ сортов проса и огурца достоверно ниже чем V более теплолюбивых После вотрата охлажденных растений в оптимальную температуру происходило быстрое снижение величины КП у устойчивых сортов и замедленное снижение, а иногда небольшое увеличение - у теплолюбивых

Экзоосмос электролитов в динамике охлаждения при 2 С Ч-дневных растений проса сорта Саратовское 2 сильно возрастал в первые 1-2 ч охлаждения, несколько снижался к 4 ч, после чего вновь увеличивался до 24 ч охлаждения Быстрое увеличение в начальный период охлаждения можно рассматривать как шоковую реакцию клеток на внезапное охлаждение, небольшое последующее уменьшение эк-зоосмоса отражает перестройку мембран в измененных условиях существования, и наконец, медленное возрастание выхода электролитов в последние 12 24 ч охлаждения указывает на исчерпание акклимационных возможностей растения и начало холодового повреждения

У растений кукурузы самое сильное и быстрое повышение проницаемости было при температуре -1°С, вызывающей гибель растений при экспозициях свыше 4 ч (рис 2) Температура (ГС оказала сходное действие на экзоосмос электролитов, выдерживание растений при этой температуре свыше 12 ч приводило к их гибели При температуре 1"С гибели растений не набиодали.

вмаоа »л«*трол*гов % ОТ ПОЛНОГО

I 0 12 1* 16 1в 22 2»

Гоейэлжи вльность о>л«»дания ч

Рис 2 Эктапсмас хкктрои/теш tu высечек »//стьев м/п }ы сорта Днепропетржсьая 24" ахюмгденмых при /жвачных тс мт/xtntypc и дтпк тыкктн жинпицнп

первоначальное резкое увеличение выхода электролитов (в первые 2 ч охлаждения) сменилось линейным участком до 12 ч охлаждения, после чего проницаемость вновь возрастала В ходе охлаждения при 2"С повышение проницаемости в первый час сменилось небольшим спадом после 2 ч охлаждения, затем выход электролитов почти линейно возрастал В последействии пониженных температур экзоосмос электролитов постепенно снижался, при этом прослеживалась прямая зависимость изменении проницаемости от длительности холодовой экспозиции Очевидно, необратимых повреждений мембран не происходило т к нормализацию функции или тенденцию к этому наблюдали: во всех вариантах опыта

Изменения экзоосмоса электролитов отражающие нарушения функционирования мембран при охлаждении, могут происходить вследствие повышения пассивной проницаемости мембран - в результате возникновения пор или разрывов мембран (Simon,1974, Quinn,l988), открывания ионных каналов вследствие изменений мембранного потенциала (Nelles Laske,1982, Полевой и др,1Ч90) или мо-

дификации липидного микроокружения каналов (Simon, 1974; Lyons et al., 1979), или подавления активного транспорта ионов, направленного в клетку (Kasamo, 19S8; Yoshida ct al.,1989; Matsuura-Endo et al.,1992). Вероятно, первоначальное увеличение выхода электролитов связано с деполяризацией мембран, открывающей ионные каналы и усиливающей тем самым пассивную утечку ионов по градиенту концентрации, и инактивацией ЛТФаз. Возрастание экзосмоса электролитов при длительном охлаждении может быть отнесено к повреждению мембран.

Активность К+,Мй2+-ЛТФазы. Пониженные температуры влияют на активность многих ферментов. В растениях проса и огурца активность K+,Mg"+-АТФазы, связанной с плазмалеммой (показано ингибиторным анализом), при температурах инкубации 2-10°С практически отсутствовала.

После 3-дневного охлаждения растений проса активность АТФазы у сорта Горьковское 43 была повышена в 6,5 раз, а у сортов Скороспелое 66 и Саратовское 2 снижена .относительно контроля. В последействии охлаждения активность фермента в листьях устойчивого сорта постепенно уменьшалась до 10-го дня после возврата в тепло, но всегда оставалась выше неохлажденного контроля. У растений чувствительных сортов наблюдали постепенное небольшое возрастание активности К*,М^*-АТФазы.

Активность фермента во фракции клеточных стенок с плазмалеммой из листьев огурца сразу по окончании трехдневного охлаждения была снижена, более значительно - у теплолюбивого сорта (рис.3). В последействии охлаждения наблюдали быстрое повышение активности АТФазы у холодоустойчивого сорта Алтайский ранний 166, и сниженную активность у растений сорта Нежинский 12.

Таким образом, пониженные температуры, инактивируя

K^.Mg2*- АТФазу, тем самым ин-гибируют активное поступление К+ в клетку; в результате возрастает нетто-утечка через клеточные мембраны. По окончании охлаждения у более устойчивых сортов активность АТФазы резко возрастала, что свидетельствует о раннем начале нормализации со-

Сразу 'з 7 10

после '

охлажд. Дни после охлаждения Рис. 3.8. Влияние трехдневного охлаждения на активность К"-АТФ-азы ф/юкцнн клеточных стенок с тазмалемлюп мз листьев конпцюстных по холодоустончнкоспт сортов огурца: I - Алтайский ранний 166; 2 - Нежинский 12.

держания К* (и 1Г) в клетке и, следовательно, упорядочении ее метаболизма; это совпадало со снижением величины КП. В то же время активность фермента у растений чувствительных сортов после окончания охлаждения оставалась пониженной, указывая на более сильное повреждение.

Пну I рмкл сточный |>11 После грех шовного вытерживания тептотюбивых растении в человиях пониженных гемператчр в тканях тнетьев обтрчжено ¡начи-тельное снижение внутриклеточного рН У проса он уменьшался на 0 6 - 1,5 ел рН в фазу грех листьев (наибольшее смешение рН н юлюдали в клетктх меюфил-ла, самое малое - в проводящих пучктч), в фазу выметывания снижение рН бьпо минимальным, и в фазу цветения ветчина смешения рН сновз вофаеттла У огурца снижение внутриклеточного рН было максимальным в фазу первого настоящего чиста (на 0,3 - 1,1 сд рН) и по мере прохождения фаз развития ветчина смешения постепенно уменьшаллсь, достигая минимума в фазы бутонизации и цветения Различия между контрастными по чочодочстончнвости сорпми проса и огурца были достоверными во все фазы развития

Посте переноса охлажденных растений в гепло происходил постепенный возврат внутриклеточного рН к уровню неохлажденного контроля, однако скорость этого процесса тависета от фазы развития и чувствнтечьности сорта (у более устойчивых сортов потная нормализация внутриклеточного рН наблюдалась на 310-й дни после охлаждения, тогда как у менее устойчивых она была цепочной)

Известно, что даже неботьшне изменения внутриклеточного рН влияют на проницаемость клеточных мембран, транспорт ионов, активность ферментов (Иост.1975), те на функции клетки, нарушающиеся пол влиянием пониженных температур (Генкель,Кушниренко,1966, Chnstiansui,1979) Очевидно, ботьшее смешение внутриклеточного рН при охлаждении отражает более значитечьное повреждение, оно совпадало с сортовыми и онтогенетическими зависимостями чувствительности к пониженным температурам

Рис 4 Ветчина ниутриклеточно о рН к тстьях проса (А) и огхрца (П) в динамике охлалсдепия Ткани I - эпидермис 2 - провидящие пучки 3 - иечофгая

В динамике холодового выдерживания растений проса, огурца и кукурузы набчюдали тканеспецифичное, прогрессирующее со временем снижение в»гутри-клеточного рН в листьях, наиболее быстрое в мезофилле и эпидермисе и зачед-эенное - в проводящих пучках (рис I) В последействии охлаждения обнаружена тенденция к восстановлению внутриклеточного рН до уровня неохлажденного контроля во всех вариантах иным, однако скорость этого процесса зависела от

О 2 4 6 < 10 12 1« 16 19 20 22 -4 Длительность ошвжденмя ч

О 2 4 « 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Д/жта/ънйстъоялалдания ч

длительности и температуры экспозиции: удлинение периода охлаждения и более низкая температура замедляли нормализацию pli. '

Значительное закисление цитоплазмы при охлаждении может быть следствием как увеличения проницаемости тонопласта для протонов и кислот (Yoshida et al.,1979), так и инактивации мембраносвязанных АТФаз, в основном I Г-помпы (Zocchi et al.,1983; Kasamo,1988; Yoshida et al.,1989; Кияшко,Кияшко,1990; Yoshida,1991; Brauer et al.,1991; Yoshida,Matsuura-Endo,1991; Matsuura-Endo et al.,1992; Kasamo,1994, Takcda et al.,1995). С закислением цитоплазмы тесно сопряжено возрастание вакуолярного рН (Yoshida, 1995).

Измерения транспорта протонов из высечек листьев огурца во внеклеточную среду (определяемого деятельностью 1 Г-насосов) показали, что скорость этого процесса, константная при температуре 24°С, линейно понижалась при 2°С, причем это снижение прогрессировало с удлинением холодовой экспозиции. Это является существенной, хотя и не единственной, основой снижения цитопдазмати-ческого рН при охлаждении теплолюбивых растений.

Перекисное окисление лппидов. После 3-дневного охлаждения растений проса и огурца содержание МДА в листьях значительно увеличивалось, причем изменения по фазам развития растений совпадали с таковыми, выявленными при изучении проницаемости мембран (наиболее сильное повышение - в фазу трех листьев у проса и в фазу первого настоящего листа у огурца). Низкотемпературное усиление ПОЛ у чувствительных сортов во все фазы развития было значительно выше, чем у устойчивых. В последействии длительного охлаждения растений содержание МДА в листьях снижалось, что указывает на отсутствие необратимых нарушений липидного комплекса; скорость процесса была неодинаковой у разных сортов (быстрее у устойчивых) и в разные фазы.

В динамике охлаждения 9-дневных растений проса при температуре 2°С интенсивность ПОЛ усиливалась после кратковременного (0,5-1ч) выдерживания,

Содержание МДА, мкМ/г сырой массы

! 4 е • 10 12 14 « И 20 22 24

Длительность охлаждения, ч. Рис.5. Hiuiiime длительности охлаждения при ТС на интенсивность ПОЛ в листьях проса: I - Саратовское 2; 2 - быстрое

несколько снижалась спустя 2 ч охлаждения, после чего монотонно увеличивалась до 24 ч охлаждения (рис.5). Сходные изменения содержания МДА отмечены в ходе охлаждения молодых растений огурца и кукурузы. После возврата охлажденных растений в тепло наблюдали тенденцию к снижению интенсивности ПОЛ, при этом скорость нормализации содержания МДА практически не зависела от длительности хо-лодового стресса, но зависела от температуры.

Очевидно, что холодоустойчивость растений связана с их способностью противостоять интенсифицирующему

ПОЛ действию охлаждения tu средством повншеннои АО imhrhocih к ictc к В норме чт! активность не проявлялась (песко 1ьку уровеш МЛЛ в листьях рнных сортов в контра 1С прчктичсски us. рчзчичался) но при охлал iciihh УВе in leime содержания перекисен v \о юдоустоичивых торгов с 1еря ив Lit u> И >ско п ку МЛ V образуется при перекисном окислении и' iiiH(.iiUbiuiuiiiu\ жирнпх кислот а большая часть ацичсодсрж ш^их липидов с двойными связями вхолит в ci став мембран то Уве шчение продуктов ПОТ при действии пони^нных техшершур свидетельствует о серьеишх повреждениях меУшранных структур

Ростовыс параметры к ictkii и оргаптма Polt растений при деи.л&ии i о-ниженных техтерлтхр замедляется, особенно это касается деления и рчеляжения клеток У 11-дневных растении кукхру $ы охлаждение при теушерзтхрах 0 и 2'С вызывало снижение митотического индекса меристема гически.ч юелок Koiivea на раетания (сильнее при О С) прогрессирулоше^ с удлинением хочодово.1 iKcnoiii ции в результате чего к концу периола охлаждения он был в 3 2 разi ник чем v растений контрочьного варианта После во1врата в оптимальные условия обнлру-жена тенденция к усилению роста лечением в апикальной меристеме охлажденных растений, и в последействии коротких холодовых экспозиции наблюдали нормализацию митотической активности Сходная зависиуюсть ог длительности холодовой экспозиции обнаружена и для ух1еньшсния ра¡меров клеток в Сталин растяжения после 24-часового охлаждения при 2°С рачмеры клеток в >той era ;ни были в 1,4 раза меньше конлроля, а после 12 часового выдерживания при О-'С - в 2 paäa В последействии охлаждения происходило постепенное увеличение размеров клеток во всех вариантах опыта но с различной скоростью Митотичесная ткгнвность более чуствительна к охлажтению по сравнению с pocroxi растяжением

В качестве интегрального показателя действия пониженных lysine с • 4 J^ ¿J^JJ^^l,'' * paTvp на целое растение иес 1-ловхли P»ic6/tinni tun пны i numi прирост за 10 су гок после хололово- Г/','?," 7 £Г/ ы М V, го выдержирлния OviaATCHite рае /v/^m« ' - ni щ i >ь т^ты,« тений проса огурца и кукурузы приводило к п рможению роста 1авиеяшечу от длительности холоювой экспо пиши до<ло«»рппе рахли шя прочвчячись начиная с 0 5 4 ч охлаждения (для различных параметров) и уси швхлись с удлинениеч! периода охлаждения (рис 6)

2 ПЬРВИМНЫЬ МЕ\\111ПМЫ ШШКЦ1Ш ЧОЛОДОВОГО ПОВРЬ/КДГНИЯ

Роль эндогенно! о и эклогенно! о ка м.цпи и повреждении Соглчсно гипоте зе Р Minorsky (198S) реакция рклитспыюн клетки на хочодовой слреес определя

ется нарушениями Са:+-гомеостаза (увеличением концентрации цитозолыюго Са:* - [Са2*],„гг ). Для проверки этого положения исследовали влияние охлаждения на активность Са"*-АТФазы и степень холодового повреждения у растений кукурузы с различным кальциевым статусом.

Активность Со2'-АТФазы. Активность Са^-АТФазы из листьев растений кукурузы сорта Днепропетровская 247 при температурах инкубации 5-10"С была очень низкой. 24-часовое выдерживание растений при температуре Г'С приводило к резкому снижению активности фермента. В последействии охлаждения наблюдалось восстановление активности Са^-АТФазы при pli 6,0 и отсутствие этого у фермента при рН 8,0. Вероятно, эти ферменты принадлежат к различным клеточным компарт.ментам и неодинаково реагируют на пониженные температуры.

Пониженные температуры, резко снижая активность Са2*-АТФазы, приводят к торможению выкачивания ионов Са~* через плазмалемму в апопласт и/или секвестрования цитозолыюго кальция во внутриклеточные депо (митохондрии, эн-доплазматический ретикулум, вакуоль), что повышает [Са2+]Ш(Т и усиливает повреждение. Сниженная активность Са2*-АТФазы в течение длительного времени после возврата охлажденных растений в тепло свидетельствует о том, что даже в отсутствие внешних проявлений холодового повреждения нарушения кальциевого обмена будут резко отрицательно влиять на метаболизм клетки. Таким образом, инактивация Са2+-АТФазы играет важную роль в холодовом повреждении теплолюбивых растений; повышение ее активности, направленное на снижение уровня цитозольного кальция, является элементом системы зашиты клетки от повреждения.

Влияние кальциевого статуса растений кукурузы на холодовое повреждение. При выращивании проростков кукурузы в водной культуре с варьируемым содержанием кальция в среде они имели рахтичный кальциевый статус, т.к. уровень этого иона в растениях изменялся пропорционально дозе кальция в питательном растворе. Оптимальной для роста и развития кукурузы была концентрация 6 мМ. Холодовое повреждение этиолированных растений кукурузы после 24-часового выдерживания при 2°С было самым высоким в вариантах без кальция, с 0,6 мМ и 30 мМ кальция, и минимальным - в варианте с дозой 6 мМ. Таким образом, увеличение или уменьшение содержания кальция в растении снижает холодоустойчивость. Видимо, повышенная концентрация кальция усиливает повреждение, а недостаток Са2+ неблагоприятно влияет на состояние клеточных мембран при охлаждении, т.к. вызывает нарушение белок-липидных взаимодействий, электрофизиологических и других свойств мембраны (Poovaiah,Reddy,1987).

Содержание подвижной формы кальция (ионов, локализованных в апопласте и цитозоле) в неохлажденных проростках увеличивалась от 0,01 до 0,17 мг/г сухой массы с повышением кальциевого статуса растений. После охлаждения подвижный пул кальция значительно возрастал, в результате доля подвижного кальция в общем увеличивалась: в бсскальцисвом варианте - от 0,14 до 0,55%; при концентрации кальция в среде 6 мМ - от 0,57 до 2,99%; в варианте с 30 мМ наиболее существенно - с 1,17 до 5,79%. Это указывает на значительное увеличение концен-

трлини Cj'' в цнтоюле при охлаждении При >том юетка не способна поддерживать кальциевый гомсостаз, поскольку Са^-АТФазы отвечающие за активное выкачивание Са:\ инактивироваиы охлаждением

Участие окислитетыюго стресса в \о та ктом повреждении При охлаждении теплолюбивых растений возникает окислительный стресс (>силение образования свободных радикалов и перекисей, вызывающих повреждения мембранных липидов и др>гих клеточных компонентов) (Harivadi,Parkin, 1493 Prasad et al, 1994a Okane et al ,1996) Низкотемперттлрное \сипение ПОЛ, обнаруженное в листьях огурца, проса, кукурузы, указывает на то, что при действии холодового стресса АО-системы перестают 'справляться с возрастающим уровнем АФК, что и является начальным звеном повреждений Гели путем повышения АО-активности можно будет снизить степень хотодового повреждения клеток, то это явится подтверждением пусковой роли окислительного стресса в реакции на пониженные температуры

И пинте экзогенных модификаторов ПО I на хоюдоаое покреждение Выдерживание отделенных листьев огурца в течение 4 ч в растворах прооксиданта (Ре:''-аскорбат) или антиоксидантов (аскорбат, глугатион, бензоат) с последующим 16-часовым охлаждением при 3"С приводило к изменениям интенсивности ПОЛ и степени холодового повреждения (рис 7) При этом наибольшее усиление отмечено в вариантах с обработкой прооксидантом, а минимальное - после обработки антиоксидантами Такое же действие оказали одновременное действие модификаторов ПОЛ и пониженной температуры в течение 4 ч, а также последовательная обработка листьев модификаторами ПОЛ и охлаждение в течение 24 ч Между низкотемпературным усилением ПОЛ и величиной КП выявлена высокая корреляция (г - 0,929 - 0,997) Полученные результаты подтверждают гипотезу об

выход »ЛМТфОЛИГМ

% ОТ ПОЛНОГО

г*" г1- г*-

ill XX

■ Ft-асштбот автобат пуппвн бамюаг

I 1 э«с

I I 25»С СЭ >*С ■■ КП

Рис 7 Пившие 16 часового охлаждения при 3"С отделенных листьев огурца предооработанных про- и антиоксидантами на интенсивность ПОЛ (А), экзоос-мое л/сктро штов и стспснь хаюдоаого повреждения - КП (Ь)

участии окислительного стресса в холодовом повреждении теплолюбивых растений Путем экзогенной модификации процессов ПОЛ можно существенно изменить степень чувствительности клеток к охлаждению

Поскольку различные антиокснданты снижали интенсивность ПОЛ и величину КП не в одинаковой степени, предположено, что основное повреждающее действие при охлаждении оказывают 'О2 и О/, и что подавление их образования будет повышать устойчивость мембран к холодовому стрессу.

' Стационарная концентрация супероксидного анион-раОикаш при охлажОе-нии различных растений и ее связь с интенсивностью ПОЛ и повреждением. Взаимосвязь образования О2" с Холодовым повреждением растений и усилением ПОЛ исследовали на нескольких видах растений, различающихся по чувствительности к пониженным температу рам. После 1-часового охлаждения растений уровень супероксидного радикала в листьях теплолюбивых растений возрастал в 2,47,5 раза, но при дальнейшем холодовом выдерживании постепенно понижался. Спустя сутки после 24-часового охлаждения содержание радикала возвращалось к уровню неохлажденного контроля у проса и этиолированных растений кукурузы и несколько превышало контроль у огурца и зеленых проростков кукурузы. В этиолированных побегах холодоустойчивого картофеля наблюдали обратную картину (небольшое снижение концентрации Ог" при охлаждении).

Во время холодового выдерживания уровень МДА в листьях возрастал с максимумом после 24 ч, более значительно - в листьях наиболее чувствительных растений, и оставался повышенным в последействии охлаждения. В побегах картофеля наблюдали лишь тенденцию к повышению интенсивности ПОЛ.

Экзоосмос электролитов из клеток с удлинением холодовой экспозиции возрастал, при этом величина холодового повреждения (КП) была максимальной в листьях огурца и, что довольно парадоксально,- в этиолированных побегах картофеля (рис.8). Однако спустя сутки после 24-часового охлаждения уровень КП у проса и картофеля был практически таким же, как у неохлажденных проростков, что указывает на отсутствие повреждений или их быструю репарацию. В то же время КП оставался довольно высоким в листьях кукурузы и огурца, т.е. процессы репарации растений в ходе охлаждения при _ - - ТС и его последействии: / - кукуруза повреждении у этих растении оыли (зелеиые растения); 2 - огурец; 3 - просо;

замедлены. 4 . кукуруза (этиолированные растения);

Из представленных результатов 5 - картофель (отитированные побеги). видно, что выдерживание теплолюбивых растений в условиях пониженной температуры, наряду с увеличением образования супероксидного анион-радикала, индуцировало повышение интенсивности ПОЛ и экзоосмоса электролитов в их тканях, однако эти процессы развивались разновременно. Если вспышка образования О2" отмечена после первого часа охлаждения с последующим постепенным зату-

КЛ. * ог погною выход« элоятролмто*

спусти 24 ч

Длительность ОХЛЙЖДОНИЯ, ч

Рис.8. Величина КП в листьях и по-

чанием, го увеличение \1Д\ и степень \owioboki повре кленич спре илешкио по состоянию клеточных мечбр m бы ш млкснмлл! ni 1чи v всех видов после 24-часового охлаждения ')то можно о'и чежтгь разли шоп скорое(ью (формирования и функционирования внч гриклею шых механизмов, направленных на пимит-цию нлрчшений и решршшо повреждении (окне шге 1ьншо стресса и вытекающих из него повреждении мембрлн)

Лмниышсть cwitpou. ч> tluc \п>ча,ы (( О, (/ при ш шш<)аши Основным клеточным компонентом л шминируюшим О., являе<сч СОЛ котерая снижает его концентрацию в 10"1 рал ^Mcpt 1чк 11>81> Seandalu s 1Ч1Ъ) 1 tacoBoe выдерживание теплолюбивых растении при 2"С шилш активность нигоютыни СОД относите ibno контроля, наиболее значительно - в листьях огурца (глб i 1) Удлинение чо-лодовой экспозиции привело к увеличению активности СОД спустя сутки пос ie охлаждения активность фермента быта ó никои к уровню неохлажденного контроля У холодоустойчивого картофеля активность СОД в этиолированных побегах в ходе охлаждения изменялась очень слабо Изменения активности СОД согласуются с чувствительностью видов растении к охл ькдению

Таблица 1

Активность суперокситднему газы в тистьях 1еплолюбивых растении поете охлаждения при 2 С, ед активности

Объект Контрочь (без ох, 1ж-денич) Дтительность охлаждения, ч Сутки спустя 24 час охлаждения

1 4 24

Kyicvpvia (геленые раст) Просо Огурец Кукуруза (эти01ир раст) Картофель** 3 82±0 К) 2 9S±0 11 3 13+0 12 4,91 К) 09 2 80±0 07 I 36+0 09 1 00+0 05 о ™±о 03 2,14 »-0 08 2 84 *-0 10* 1,78±0 06 2 25+0 09 1,55±0 07 2,47±0,10 2 32+0 12 3 34+0 07 3 65±0,12 2 06+0 08 3,96±0,12 3 41+0 16 2,83±0 06 2,67±0,10* 3 00+0,11* 4,67±0,14* 3 25+0 23*

* - различия с неохлажденным контротем недостоверны при Р 0 05 ** - у клртофеля анализировали активность в этиолированных побегах

Сопоставляя данные по влиянию охлаждения на уровень О; и активность СОД, можно набиолать высокую огрицательнчто корреляцию между этими параметрами у теплолюбивых растении (г -0,794 - 0,982) и ее отсутствие в побегах картофеля (г 0 175) Резонно предположить, что чолодовое повреждение теплолюбивых растении включает в качестве одного из первичных механизмов увеличение продукции О;, а повышенная устойчивость связана с высокоактивной СОД Вофастзние активности СОД при удлинении холодовой экспозиции носит адап-тивнни чарлктер и нчправ 1ено на снятие окислительного стресса и тем самым -ХОЮ1СВОГО повреж 1снич Виты и сорта проявляющие млл\ю степень инактивации СОД при охл |ждеиии и и Н1 быстрое восстановление активности булут более чолоточетои швыми

i. ФП IIIO IOI ПЧЬСКОЬ МОДЬ IIIPOBMIIIt \() ЮДОВО! О

поигьжлышя

Buiuinie скорое ni снижении температуры на pajBiiine тжреждиши Pe акция тепло зюбивпх растении на зсиствне неблагоприятных темпер тр дв |чс1сч ф\нмшси не только напряженноеги стреееора но и скорости понижения темпер 1-тлры (V1mor*kv,1989) Па 9 тневных растениях к\к\рузы copia Ь\ковнпекии Л сравнивали развитие \оао швого повреждения при дв\х режимах снижения 1см-ператхры внезапном охлаждении (помещении сосудов с растениями в темпер rrv-pv 1 С) и медленном охлаждении со скоростью снижения земператлрп ~> 6 С i

Окзооемос электролитов в ходе медленного снижения темнертры ло 1 С вначале понижался, затем возрастал до \ровня контроля bi ыержив шив picreiiiin при температуре 1 С привозило к повышению выхода пекгро штов ло 40 мин охлаждения с последующим выходом на плато В ходе внезапного охлаъаемия отмечено резкое возрастание выхода )лсктролитов в первые М> минут действия хо шла небольшое снижение спустя 2 ч и дальнейшее уве ш icane, на шн зя с 4 ч Сравнение изменений зкзоосмоса в ответ на медленное и вне и и нос охлз-кдение показывает, что в первом случае происходят постепенные изменения ф\нкции мембран, отражающиеся в медленных кратковременных изменениях выхода пек-тролитов, а во втором - резкий и более сильный подъем v зечки ионов

Изменения интенсивности ПОЛ в динамике ме зленного и быстрого охлаждения подлвердили закономерности, отмеченные по экзоосмосу электролитов При постепенном понижении температуры от 21 до 1С наб подали преходящее повышение уровня МДА, а выдерживание при температуре I С приводило к трехфазным изменениям интенсивности ПОЛ, ее увеличение бьпо выражено значительно слабее относительно быстрою режима охлаждения (рис 9) Видимо, первоначальное возрастание продуктов ПОЛ с 1Ужит сигналом для з туска синтеза ферментативных и низкомолекулярных АО (Prasad et al ,1994а, 1994b) В резупьтзте к моменту снижения температуры до ГС в растениях функционир\ет система зашиты от АФК, вследствие чего последующее выдерживание проростков при пониженной температуре слабее активирует ПОЛ по сравнению с внезапным охлажтени-ем, когда в клетках листьев возникает окис штельныи стресс

Рис 9 Впияние скорости сиияссния температуры на динамику интенсивности ПОЛ в листьях кукуру!ы I - при скорости снижения температуры 5 6"С чин 2 - при помещении растении в температуру ¡'С 3 - температура

Волос сильное действие внезапного охлаждения па нарушение физиологических функций проявлялось и на уровне организма (изменений роста). При медленном понижении температуры ростовые параметры спустя 10 д после кратких Холодовых экспозиций зачастую превышали значения неохлажденного контроля, тогда как после внезапного охлаждения всегда наблюдали подавление роста.

Временная динамика хо.тодового повреждения. Суммируя данные, приведенные в главе 1, можно видеть разновременное появление физиологических изменений в динамике охлаждения. У растений проса отмечены быстрые изменения на клеточном уровне и более поздние - на организменном (ростовые процессы). Стрессовая реакция на охлаждение начиналась с изменений ПОЛ и рН и замедления роста растений в высоту, что является суммарной реакцией роста клеток. Далее наблюдали увеличение проницаемости мембран, позднее - нарушение водного режима (снижение сырой массы), уменьшение площади листьев, и в конце концов - снижение сухой массы проростков.

У растений кукурузы охлаждение при температуре 0"С вызывало быстрые (уже после 0,5-часовой экспозиции) изменения большинства исследованных ци-тофизиологических параметров. Мягкий режим охлаждения растений кукурузы (2°С) приводил к замедленному проявлению нарушений некоторых физиологических функций относительно температуры 0°С (табл.2).

Таблица 2

Время появления физиологических изменений от начала охлаждения растений кукурузы при температуре 2°С_

Физиологический параметр Длительность охлаждения, ч

0.5 I 2 4 8 12 16 20 24

Выход электролитов • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• ••••

Интенсивность ПОЛ • ••• • ••• • ••• • ••• •••• ••••

Внутриклеточный рН:

эпидермис • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• ••••

проводящие пучки • ••• • ••• • ••• •••• ••••

Ростовые параметры:

митотический индекс • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• •••• ••••

величина клеток • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• •••• ••••

высота растений • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• ••••

площадь листьев • ••• • ••• • ••• •••• ••••

Водный режим:

содержание воды • ••• • ••• •••• ••••

транспирация • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• •••• ••••

водный потенциал • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• •••• ••••

Математические закономерности зависимости цнтофизиологическнх изменении от длительности и температуры охлаждения. В исследовании взаимосвязей растение-среда большое значение имеет моделирование. Для расчета количественных зависимостей между температурой или длительностью охлаждения, с одной стороны, и цитофизиологичсскими изменениями в листьях кукурузы, с другой, использовали регрессионный анализ. Установлено, что связь между длительностью охлаждения (I) и проницаемостью клеточных мембран можно выразить

степенной функцией у а!ь (\ - вычот ) 1<,кгро лигон) где коэффициенты а и Ь равны соответственно 12,4 и О ЧУЗ (при -1С) 11 32 и О I ^7 (при ОС) 9 5 и 0,078 (при 1С) 6 85 и О 235 (при 2 С) Зависимость \к,А 1\ длительностью охлаждения (I) и КП (у) при фиксированной температуре вырлжал 1еь гиперболической кривой v а + Ы *- с I Связь межт\ величиной холоадвого повреждения (у) и температурой (\) при фиксированной длительности охллжления выражалась функцией V -кт\ где параУ1етры к и т возрастали с удлинением холодовой экспозиции

Зависимости интенсивностью ПОЛ от длительности холодовой экспозиции выражалась гиперболической функцией у а + Ы + с/1, где у - содержание МДА, или степенной функцией у Цт

Связь между величиной внутриклеточного рН (у) и длительностью охлаждения (I) можно выразить несколькими уравнениями, наиболее подходящее из которых у а + Ьх1п I Величина изменений внутриклеточного рН в последействии охлаждения выражается логарифмической кривой вида у = + Ь, где у - величина смещения рН, х - дни после охлаждения Рассматривая возвращение величин внутриклеточного рН V растении после охлаждения к уровню контрольного варианта, можно отметить, что в этом случае повышение рН представляет экспоненциальную функцию вида у ахЬ' + с, где у - величина смещения рН, I - длительность охлаждения, ч

Для выражения зависимостей изменений параметров роста от длительности выдерживания растений на холоде использовали логарифмическую кривую общего вида у - а - Ьх1п i, где у - линейный параметр (разУ1ер клетки, высота растения, площадь листьев) или митотическии индекс, I - продолжительность охлаждения

Таким образом, изменения цитофизиологических параметров в динамике охлаждения могут быть описаны несколькими основными регрессионными функциями степенной логарифушческой гиперболической экспоненциальной, причем в зависимости от измеряемого параметра более применима та или иная за-висмость Расчет коэффициентов» произведенный для каждого процесса, позволяет моделировать поведение функции при изменении параметров эксперимента

Качественная сторон! изменений цитофизиологических параУ1етров при выдерживании теплолюбивых растений в условиях пониженных температлр включает в себя взаимную согласованность различных процессов Обнаружена высокая корреляция между изменениями цитофизиологических показателей (КП, сдвигахш внутриклеточного рН, увеличением сотержания МДА) у проса и огурца после 3-дневного охлаждения и у кукурузы в динамике холодового выдерживания, что указывает на взаимосвязь этих процессов

Физиологическая модель индукции и развитии холодового повреждения При создании модели холодового повреждения теплолюбивых рлстений учитывали зависимости между изменениями физиологических процессов в том числе -развитие реакции во времени и пространстве, детерминистические (причинно-следственные) связи, возуюжные общие причины В основе модели лежит снижение теущературы как сигнал для злпуска изменении в растении Медленное ее понижение, как и охлаждение при относительно высоких для данного ряда течпера-

турах, вызывает изменения физиологических процессов, имеющие адаптивный (акклимационпый) характер. В результате внезапного охлаждения наблюдается преимущественно трехфазная реакция, когда первоначальное резкое изменение параметра сменяется временной нормализацией процесса; длительность этой фазы зависит от физиологических и генетических особенностей растения и от интенсивности действующего фактора. Третья фаза - повторное, уже более выраженное и монотонно усиливающееся изменение параметра, свидетельствующее о повреждении функции. Однако изменения процессов в последействии охлаждения позволяют считать, что в подавляющем большинстве случаев (за исключением действия низких температу р, приводящего к быстрой гибели растений, которое не исследовалось в данной работе) повреждения были обратимыми, т.к. после возврата охлажденных растений в тепло у них наблюдали нормализацию нарушенных функций; это восстановление до уровня неохлажденных растений происходило с различной скоростью в зависимости от физиологических особенностей организма, с одной стороны, и интенсивности охлаждения, с другой.

Инициация холодового повреждения имеет в своей основе изменения содержания АФК и резкое повышение концентрации свободного (ионизированного) ци-тозольного кальция ([Са2+]шп). В начальный период внезапного охлаждения происходит блокирование или разобщение систем переноса электронов, что приводит к образованию 02* и на его основе других АФК (Pow!es,1984; Wise,Naylor, 1987b; Мерзляк, 1989), вызывая окислительный стресс; этому способствует резко выраженная холодовая инактивация СОД. С другой стороны, повышение уровня Ог" будет индуцировать синтез de novo изоферментов СОД (Tsang et al.,1991; Scandal-ios,1993) и других AO (Jahnke et al., 1991; Fan.Guo.1992; Hariyadi,Parkin,1993; Walker,McKersie,1993). При длительном охлаждении это приведет к снижению содержания АФК и снятию окислительного стресса. Однако АФК повреждают ДНК, белки, липиды, вызывая их перекисное окисление (Bowler et al.,1992); усиление ПОЛ вызывает изменения структуры мембран (Владимиров,Арчаков,1972) и нарушает протекание физиологических процессов в клетке. Говоря другими словами, повышение АО-защиты растительной клетки, направленное на снятие возникающего при охлаждении теплолюбивых растений окислительного стресса, несколько запаздывает по времени и выполняет свою функцию, когда уже включились цепные механизмы ПОЛ и начались нарушения на мембранном уровне. Вероятно, основное отличие холодоустойчивых растений от теплолюбивых заключается в том, что у первых образование АФК при охлаждении не носит взрывной характер и не приводит к возникновению окислительного стресса.

Во время медленного понижения температуры образование Ог" и других АФК, действуя как слабый окислительный стресс, активирует синтез АО-ферментов, в результате которого клетка формирует комплекс для сопротивления окислительному стрессу. Подтверждением этому служит резкое снижение холодовой чувствительности у трансгенных растений - свсрхпродуцентов СОД (Gupta et al., 1993), у растений, обработанных экзогенными АО (Wang,Baker, 1979; Wise.Naylor, 1987; Zeim ct al.,1991; Jennings, 1994) или 11;0>, индуцирующей слабый окисли-

1е Ы1Т H cl| CCC (Pi Ь 111 el ll l'')4)

Друшч МеМсшоч имiMireMiap mpiu и ииимш \<> овгаю I 01 ре к 1енич 4S^I4elC4 У1 i. ШЧСНИС [С 1 'I КОН 111. при О 1ИГ К ОЬП^-ПЧ IHMelielllUM Mill ro-ЧНе ЮПИ IX ЦП П <¡-11 11IO И ГИ ICCKHX lipOllCCCOB (Ml 11 Г^ку 1 ТаК-КС И IMtlltHHO-

ЧУ j i. J , ll llipi В IIUI О И 1 ¡Л HKUHOHlipi ГЛ1И1 1 14. IKl В II ip\ LlltlUlMM P 11 U1J CIlclcM

rp hick, ншши и п нстчшш (I'oi \ и 'l ReiiJy f l'S7) И ¡UUICHH4 Ca * iccho ci ч i чн I с i м iiiic и мим cijvccou кон pi in iicmc Liciiiio у и 1111 ier [( i ] Jrr (Price ct 1 1>U) ic »ic гп\ я I к kc к iK к mi »1 u i и шок (Km 11 ci al |49(i) В cut ю

i гер^ц \i с in ilhii» [(_a | u, вы ii в cr sciiicmie okii„ mre ibiiei o cipx-eca (lick I1 ' 1) и inn in i p\cr uctiimk cih C< >Л (Pr u ct ! Il)t>l) re i pi i-e\o nrni-К I 14 с \l И 1СШ1С CHI 11 Ll 1 ИН^УЦирУКИЦеГО ЧО ЮТОЧ с иоврежтспие

Л ..и пекшее p nunitic ru i рел- 1епич может и пи го \iiii шм н н р-влеиичч cm i IIIIHM I V.H енпем in Гч> HI p 1 икиыкгоПО! С 1Ч1КШ CT1 pOIILI, II 11 iMCHC HHeM VHKiiiioiivipi влип k jhibb к likmo i\ |ин-лаьиеи\ч i\ i"eiKi к e ipvriii Bee )Iil lip eccll F mMUBJilHIl И Mill \ Г УеИ ШЫГЬ О 1ИН ipVIOH Г IK, IIH'KTIIBI 1ИЯ

If АГФи {"л ji г iipniio ипь к снижению внутриклего пнчо pU ii рутен им ком 11„ргменг 1 шн р юти римых be icciBiiioicB ргч Ca * (Ye~-!nJ i ct i! IW) а панн Kvime imro 1 и hoi о pll vbc ш iiip i^r уровень Ингою нлкчо Ca * (Oehriii^ ct ii l'< 'О) С ни senile pH iiiMe 1чег кинетику ферчентапшных реакции, iro ириведег к ни 1коп.\1Пер 1г\рному горчолюпно ckc|_i cih Юего шых npi еесов 1аких к к кле го пне iciiiie (В irlow Ad п|'<41>1) Усичение ПОЛ иовышict vre ik\ i 1ектр i ш-roe us кл<.го шнч коми фтменгов Pinmic процеесев нарушении ф цио ioi и k ских функции при ни (koicmi ерапрн >м ni ppw ьденпн те i и к. fit l х [_JvT._h.in приведено на рис Ю Ci pi клшкчль Hip\uieHitii на iceto том \fii-ne вьныеаег e\nuci ванные изменения фи то югн icckiix функции растения - фогсеннгеи дыхания, попшценич минеральных веществ и во1Ы, транспорта органи 1ееких соединений роста и развигич в коне ш >м im re мог\ г нзбчюдатьсч витичые прочв-1енич хито'очот погре к.»спич и гибель растения Даже в шсУгстьие внешних повреждении ovier lipi исходить снижение проективности

Псхохя ит представленной ми icin индукции и развития хо ю ювого поврек-д„нич можно Rbi 1слить >1 ты на копрых вУ1ен агетьство позвозит резко повы-еИ1Ь устоичивоеть к пони кенпыУ! KAinepatvpayi Г i шным образом, )то н i шьные участки евоботнор шикальнсго 1аиуска окис штетышго стресса Повышач уровень ни {коми 1екузчрных или ферментативных АО (обртогкон соединеннчми е АО-лктнвиосгыо и ш в rpjiieiemibix растениях - сверхпродуцептах СОД и трутих АО-ферментов) можно снизить xirio io 1Уветвитетьноеть растений или их клегок Подобным АО- 1сисгвием об л чают и некоторые аналоги фитогормонсв Кроме того предваригельнаи потготовка растения к перенесению стресса пототнт снизить индунировишое охл 1жтением iiipyuiemie фтио югичееких функции Наконец при не id алымм охлзждении тк »лм енш ie обработки (в том числе аналогами физо-горуюнов) помогу г Ускорить воест ннчменне псе ic стресет

Инактивация АТФаэ

Ингибирование активного транспорта (К% Н*,Са2*)

Деполязизация мембран

ХОЛОДОВОЙ СТРЕСС"

' I "

Открывание ионных каналов

Инактивация СОД_

[Утечка К+ | [Увеличение Юа2*)*

Усиление ПОЛ

Смещение рН цитоплазмы ¡>

Снижение тургора

Изменение активности Са-зависимых ферментов и |\ фосфорилирования белков

Увеличение проницаемости у ■ *■ мембран (выход ионов.

I воды, неэлектролитов)

Инактивация

мембраносвяз.

ферментов

Нарушение компартией-■ тации. Изменение активности ферментов. Дисбаланс метаболизма.

Изменение структуры мембран

Образование 01

1 I

Повышение образования СР - и перекисей

Снижение АО-активности

Нарушения структуры ДНК, белков и липндов

Деструкция линилов

Изменения транскрипции и трансляции. Нарушения

Цитофизиологические изменения (остановка движения цитоплазмы, изменения вязкости, торможение деления и растяжения клеток)

Торможение роста. Нарушения дыхания, фотосинтеза, окислительного фосфорилирования (снижение АТФ). Ультраструктурные нарушения, •_

Возврат в тепло после сублетального холодового стресса; Постепенное восстановление нормального метаболизма

Длительное выдерживание; Повреждение и гибель клеток и тканей

Рис. 10. Схема инициации и развития холодового повреждения в клетках тетолюбивых растений.

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦПТОФ11ШОЛОГИЧЕ( MIX ПАР \ МЕТРО В

И МОДЫЕН ЧОЛОДОВО! О ПОИРЬЖДЬ имя Мстолм сравнительной оценки иолодоустоичивостн сортов и гибридов тсплолюоппих pjciciuui ,lia определения возможности применения цитофи-зиологическик методов опре теления сравнительной холодоустойчивости сортов и селекционного материалл теплолюбивых растений проведены исследования in коллекции сортов проса (16 сортов из 10 экоюго географических групп и 2 образ-i ца из лаборатории селекции проса ВНИИЗБК) По выживаемости проростков по-

сле 3 д при температуре 1 С образцы разде 1ены на три группы устойчивости высокой, средней и низкой (Коструони 1984) Цитофизиолотнческие показатели сравнивали у сортов в фазе кущения (табл 3)

Таблица 3

Относительная холодоустойчивость сортов и селекционного члтериала проса _после охлаждения при геушературе I С в течение 3 суток_

°о выжив- кп",г; МД\"о

Сорт, образец ших рас- выхода к конт- Ствнг внутриклето того рН

тений ионов ротю ~>пндсрчнс 1 мез >фип гров ПУЧМ1

Сорта с высокои холодоустойчивостью

Мироновское 51 100 1,82 134 6 0 44 0 6S 0,48

оу1ское 9 83,1 0 90 144 6 041 0 67 0 33

Орловское 92 82,5 3,29 141,3 0.4Э 0,65 0,52

Горьковское 43 77,1 1,61 1390 0 48 0,68 0,40

К-3359 (.Таджи¥лстак1 76 3 2,89 149 3 0 53 0,74 0,53

Казанское 2 72,1 1,53 143,8 0 67 0,75 0 55

Сорта со средней холодоустойчивостью

Долинское 86 6э,5 1,00 162,6 0,э5 0,68 0,51

Бескарагзиское мест 65,4 5,22 159,1 0,54 0.72 0,54

к-1647 (Иран) 63,0 4,26 169,9 0,72 0,87 0,77

Саратовское 2 62,5 4,59 183,6 0,79 0,92 0,82

к-8629 (Кирпгяо) 58 7 4,30 168 4 0,72 0,83 0.76

К-1436 (Утбеиктан) 49,8 5,20 180,2 0,85 0,91 0,86

Сорта и ооразцы с низкой холодоустойчивостью

Саратовское 853 41,7 S.03 184,8 0,79 0,92 0S2

Коуювос 1020 40,0 5 59 174 8 0 87 1,09 0,76

K-7633 (Киргичи«) 30 4 5.35 197,2 0,92 1,03 0,86

кЮббдЗ 153 30 0 6,05 181.9 0,94 0,92 0,90

Ставропочьское 12 15 9 6,58 197 8 0 89 1,05 1.07

к-1 152 (у вдскиста») 9,5 6,08 194,8 0,90 1,06 1,05

Пониженные температуры усиливали жзоосмос электролитов, интенсивность ПОЛ и снижхлн внутриклеточный рН в листьях проса, при этом сорта с высокой холодоустойчивостью, выявленной прямым методом оценки, имели минимальные величины индуцированных охлаждением изменений, а сорта с низкой устойчивостью, наоборот, отличались наиболее высокими значениями этих показателей Остальные сорта занимали промежуточное положение, которое в основном соответствовало етепени их холодоустойчивости Между выжнваеуюстью на стадии проростков и цитофизиологичеекими ишененияуш после охлаждения обнаружена высокая отрицательная линейная корреляция, колффициситы которой равны

для КП -0,886, возрастания МДЛ -0,920, сдвигов рМ эпидермиса -0,899, мезофилла -0,894, проводящих пучков -0,903. Коэффициент ранговой корреляции Спирмэ-иа (по относительной устойчивости сортов) равен 0,925 при определении по экзо-осмосу электролитов, увеличению МДЛ и сдвигу рН в клетках эпидермиса, 0,932 -по сдвигу рН проводящих пучков и 0,966 - в клетках мезофилла.

Высокая корреляционная зависимость между холодоустойчивостью сортов и селекционных образцов проса, определенной методами прямого охлаждения и по изменениям цитофизнологических параметров при действии пониженных температур, позволяет предложить использование цитофизнологических методов в диагностике сравнительной холодоустойчивости сортов теплолюбивых растений.

Обоснование способов подбора соеднненнн, повышающих холодоустойчивость. В качестве соединений, повышающих холодоустойчивость растений, анализировали регуляторы роста различной природы. На первом этапе определяли прорастание семян при оптимальных и пониженных (12-140С) температурах, что позволило выявить потенциальную способность препаратов повышать устойчивость и оптимальные их концентрации. В большинстве случаев испытуемые регуляторы усиливали прорастание семян в широком диапазоне концентраций (от 0,01 до 10 мг/л); наиболее эффективными оказались препараты цитокининового типа действия. Экзогенные регуляторы также активировали рост корня и побега в условиях пониженной температуры.

Однако чувствительность к холоду растений и прорастающих семян может сильно различаться (Jano\viak,Markowski,1987; Bertin et al.,1996а), поэтому необходима проверка устойчивости на последующих стадиях развития. На втором этапе работы определяли внешние проявления холодового повреждения молодых растений, обработанных растворами препаратов за сутки до охлаждения, или выращенных из семян, обработанных регуляторами роста. Следует отметить, что эти два варианта приводили к сходным результатам, поэтому в последующем приведены только некоторые из них.

3-дневное охлаждение растений кукурузы при температуре 0-1 "С и огурца (2-3"С) приводило к сильному повреждению и гибели растений; обработка различными соединениеми снижала степень холодового повреждения (рис.11). В вариантах с карто-лином 2 и полистимулином К гибели растений кукурузы не происходило; повышение выживаемости проростков огурна наблюдали в вариантах с кинетином, кварта-зином и хлорхолинхлоридом. '

На третьем этапе проверяли действие регуляторов роста на холодоустойчивость 26

1 I Ивповрвждв!»»« 1| I ПОЦМЯДОМвЮ ■■ ГЮТби»»

Рис. 11. Влияние обработки растений кукурузы сорта Днепропетровская 247 регуляторами роста перед охла.исОашсм на степень повреждения. Варианты: I - контроль (пода): 2 • картами 2; 3 - полистиму.чин К; 4 -оксикароаи: 5 - кеартазин; 6 -ПАП: 7 -ДФМ.

растении по цитофишологическич критериям - изменениям проницаемости мембран и интенсивности ПОЛ Выдерживание растении кчкурупи и сччрца при пониженных температурах привоаи ю к шачителыюму повышению выхота элсктро-ттов, при утом веаичина КП была с>и1ественно пи*е v растении в вфиантах с обрабо!кои регуляторами роста В послеаеиетвии охлаждения происходило неуклонное снижение КП в вариантах с обработкой регулятор пш роста, что укатывает на снятие неб 1агоприятного вошенствия пониженной температуры У контро !ь-ных растении такое снижение бьпо ша ште 1ыш кшетденныч Лучшие ре 1у 1ьта-ты для кук\ру!ы отмечены при обработке по шетнму тиком К, ЬЛИ и к фютнном 2, огурца - кинетином, квартазином и ССС

Интенсивность ПОТ шачительно во»-растала нос 1е длите 1ьного охлаждения растении кукурузы Обработка цитокининовы-уш препаратами за сутки до охлаждения снижала низкотемпературное увезичеиие уровня МДА (рис 12) Ду ксиновые препараты на кукуруз, как и ГК и гидреа на огурце слабо влияли на интенсивность ПОЛ, индуцированную охлаждением

Таким образом, обработка сеУ1ян и проростков гептоаюбнвых растении синтетическими ретуаяторами роста (особенно цитокининового типа действия) шачитель-но повышает стабильность клеточных мембран при охлаждении

Физиологическое действие экзогенных регуляторов роста при повышении холодоустойчивости Наряду со снижением \о юдоиндуцированного усиления экзоосмоса >лектролитов и интенсивности ПОЛ, жзогенные препараты с цитокининовои активностью влияют на различные физиологические параметры в охлажденных растениях Обработка семян и проростков огурца и кукурузы кинетином (0,1 мг/т) повышала в охлажденных растениях биологическую активность ауксинов и цитокининов, интенсивность дыхания тканей тистьев ростовые параметры (высоту растении, площадь листовой поверхности, сырую и сухую массу растений) относительно водного контроля В у!ежоде-ляночных опытах обработка семян теплолюбивых растении (кукурузы, огурца, проса) синтетическими аналогами цитокининов (кинетином, БАП) увеличивала потев)к> всхожесть, ускоряла прохождение фенологических фаз и повышала продуктивность, особенно при раннем посеве При этом у кукурузы увеличилось число растений со фелыми початками и число )ерен в початке, бочьше у растении раннего посева в сравнении с самым поздним (что является косвенным показате-леУ1 повышенной холодоустойчивости) Значительно вофое уро-каи 1ерна проса на 12 14% птодов огурца на 17-18%, ¡стеноп массы кукурузы на 16-32% У проса сорта С фатовское 2 и предпосевная обрабогка, и опрыскивание растении в фазе

юилаждеч >му

Рис 12 Нншние оораичтки растсшш к\к\р\ 1ы сорта , (нспрп-пстрогсках 241 на интсисичность ПО I ч шетьчх пчеле ох-ПшчКния Партийны 1 - < oila 2 - И\1К 3 -//VA" 4 - И\К J - KiipmotUH 2 6 -noiucmuMVam К 7 - аксикарбам, 8 -кварта ihn V - И ill 10-ДФМ

трех листьев раствором картолииа увеличивали высоту растений, число проду ктивных стеблей и сухую массу растений, а также урожайность (на 14,7-17,7%). Из этих данных видно, что обработка цитокининовыми препаратами, положительно влияя на устойчивость растений к пониженным температурам, одновременно повышает их продуктивность, и может быть использовапа в практических целях.

Использование клеточных культур для изучения н повышения холодоустойчивости. Клеточные культуры могут быть удобным модельным объектом при изучении холодового повреждения; однако при этом необходимо модифицировать методы оценки клеточных повреждений, учитывать особенности реакции на охлаждение клеток, полученных от разных эксплантов, и действие ряда внешних факторов (света, уровня цитокининов в среде) на холодоустойчивость.

Самая низкая чувствительность к охлаждению отмечена у каллусных линий, полученных от семядольных листьев огурца и колеоптиля кукурузы, более высокая - у каллусов, полученных при эксплантации гипокотиля и меристемы стебля (огурец), листа и конуса нарастания (кукуруза). Наблюдалась тенденция к снижению холодового повреждения с увеличением возраста исходного растения и к его повышению с возрастом культуры: максимальная жизнеспособность клеток после охлаждения отмечена для пересадочной культуры кукурузы в возрасте 2 недель, после чего она прогрессирующе снижалась. Таким образом, эпигенетические и физиологические особенности клеточных культур играют значительную роль в их холодоустойчивости. Условия культивирования также влияли на степень холодового повреждения каллусных линий; оно снижалось при выращивании культуры в темноте и повышении уровня цитокининов в среде.

Выявленные зависимости реакции клеточных линий на охлаждение использованы в экспериментах по повышению холодоустойчивости клеточных линий, основанных на сомаклональной изменчивости культивируемых in vitro клеточных популяций. После 24-часового выдерживания при температуре 1°С каллусных линий огурца различного происхождения количество выживших клеток, определенное по восстановлению ТТХ, составило от 12 до 28%. Пересадка участков каллусов на свежую питательную среду и их отрастание позволило получить ряд линий с существенно повышенной холодоустойчивостью. Возможно, что регенерация растений из каллусных культур с последующим клонированием и оценкой устойчивости к пониженным температурам растений и их потомства позволит получить селекционный материал, пригодный для практического повышения устойчивости.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании проведенной работы предлагаются следующие рекомендации по использованию результатов исследования:

1. Использовать разработанные методы оценки сравнительной чувствительности клеток и тканей теплолюбивых растений к действию пониженных температур, основанные на изменениях цитофизиологических параметров - проницаемости мембран (выхода электролитов), интенсивности перекисного окисления липи-

дов, ВНуЗрикЛсЮЧНОГО pli

2 Выявление зкзогенных препаратов индуцирующих повышенную холодоустойчивость геппоноонвых растении, проводить по схеме, включающей низкотемпературное проращивание семян, вт\а1ыюе опрезеление холозового поярек-дения, анализ ннзкотеузпературного попреж 1ения мембран (.по выходу тлекзроли-тов и интенсивности ИОЛ)

3 Для снижения чувствительности теплолюбивых растений к действию пониженных температур могут использоваться жзогенные антионсидзнты и регуляторы роста различной природы н шболее >ффсктивние из которых - синтетические аналоги нитокининов и хлорхолинхлорид (в концензраииях от 0 01 до 1 мг/л)

4 При предпосевной обработке регуляторами роста наибо iee эффективна длительность контакта семян с препаратом окало S ч

5 Для повышения всхожестзз семян и продуктивности растений в полевых условиях предлагается предпосевная обработка кинетином и другими жзогенны-ми препаратами цитокининового типа действия

6 В целях направленного повышения холодоустойчивости предлагается использовать скрининг клеточных кульгур in yitro после сублетального охлаждения Последующая регенерация растении из клеточных попу зяции позволит получить более устойчивый к действию пониженных температур селекционный материал

ВЫВОДЫ

1 В основе первичных механизмов реакции клеток теплолюбивых растений на холодовое воздействие лежат дисбаланс Са" "-обмена, увеличение уровня свободных радикалов, инактивация ион-гранспортирующих систем, приводящие к нарушению функций мембранной системы клетки Это приводит к измез1ениям физиологических процессов как на клеточном уровне - повышению пронззцаемо-сти меузбран и интенсивности перекисного окисления липидов, снижению внутриклеточного рН и ростовых параметров клетки так и на организменном, интегральным показателем которых является торможение роста В динамике охлаждения изменения имеют трехфазный характер, отражающий шоковую реакцию на стресс, акклимационные перестройки и холодовое повреждение

2 Зависимости изменений цитофизиологических параметров от температуры зз длительности охлаждения в общем виде описываются регрессионными функциями различных видов (гиперболической, степенной, экспоззеззциальной, логарифмической) В последействии пониженных температур проявляется обратзз-мость холодового повреждения скорость нормализации нарушезшых функций зависит от интенсивности холодового воздействия

3 В защите клетки or холодового стресса участвуют низкомолекулярные и ферментативные знтиокенланты, ключевую роль среди которых играет суперок-сиддисмугзл а в нормализации клеточного метаболизма после окончания охлаждения - К* M g и Са Л ГФ ны У теплолюбивых растений в отличие от холодо-

устойчивых, не обнаружены эффективные механизмы, способные полностью остановить действие холодового стресса.

4. Изменения физиологических процессов при медленном понижении температуры имеют отличный от внезапного охлаждения характер, что проявляется в перестройке реакций в период постепенного понижения температу ры и меньшей амплитуде изменений во время холодового выдерживания.

5. Величина физиологических изменений при охлаждении коррелирует с чувствительностью растений к пониженным температурам; она более значительна у теплолюбивых сортов и менее выражена у устойчивых. Обнаружены онтогенетические изменения реакции растений на охлаждение: максимальная устойчивость наблюдалась в фазы выхода в трубку и выметывания (просо) и цветения (огурец), минимальная - в фазы трех листьев (просо) и первого настоящего листа (огурец).

6. На основе выявленных регрессионных закономерностей и корреляционных связей в совокупности с хронологической последовательностью физиологических нарушений создана модель инициации и развития холодового повреждения теплолюбивых растений.

7. Выявлена высокая степень гетерогенности каллусных линий огурца и кукурузы по чувствительности к охлаждению, в основе которой лежат эпигенетические и физиологические особенности. Максимальная холодоустойчивость отмечена для линий, полученных из семядольных листьев огурца и колеоптиля кукурузы, а также из более зрелых растений и молодых пересадочных культур. Посредством скрининга выживших клеток после охлаждения возможно направленное повышение холодоустойчивости в культуре in vitro.

8. Чувствительность теплолюбивых растений к охлаждению может быть снижена экзогенными антиоксидантами и регуляторами роста различной природы, наиболее эффективные из которых - синтетические аналоги цитокининов и хлор-холинхлорид. Обработка регуляторами роста изменяет протекание физиологических реакций при действии пониженных температур: снижает величину индуцированных охлаждением усиления выхода электролитов, интенсивности перекис-ного окисления липидов и подавления дыхания; повышает активность эндогенных фитогормонов и интенсивность ростовых процессов; в полевых опытах обработка кинетином повышает всхожесть семян и продуктивность растений.

СПИСОК ПУ БЛ И КАЦП И ПО ТЕМ Е Д11ССЕРТАЦ1111

1. Лукаткин A.C. Диагностика холодоустойчивости теплолюбивых растений по изменению мембранной проницаемости клеток листьев растений// Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений: Тез. Всесоюзн. конф,- Иркутск, 1984,- С.126-127.

2. Лукаткин А.С.,Зауралов O.A. Проницаемость мембран цитоплазмы у теплолюбивых растений в онтогенезе//Биомембраны: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск, 1984,-С. 143-146.

3. Заурапов О.А.,Лукаткнн A.C. Кинетика экзоосмоса электролитов у теплолюбивых растений при действии пониженных те.чператур//Фнзиология растений.- 1985.-Т.32, вып.2.- С.347-354.

4 (прпон ОЛ Пукаткин АС Изменение активной кислотности тканей листьев рчетении прост и огчрш поя влиянием пониженных температур//Доклалы ВАСХНИЛ -19%6- Ч 9 - С 9 10

¡.пр 1 юи О А Лукагкин АС Роль фитогормопов и ферментов в регуляции ус-гои швости растении/ Регу ляция ферментативной активности у растений Межву» со нлч 1 гр I орькии 19ЬЬ-С69 73

6 Зауралов О А Лукаткин А С Костру бин М М ЛахановА П Цитофизиологичес-кая дизгноетика хотодоустоичивости сортов проса/ С -х биология - 1987 - N 5 - С 70-74

7 ЗпрлловОА Луктгкин А С Цитофизнологические методы оценки четойчнво-стн растении в генетике и се лекции// Генетические основы интродукции и селекции растении Межвуз со науч тр - Саранск 1987 - С 56 64

8 Лукаткин А С Костру бин М М Лаханов А П Перекисное окисление липидов у растении проса при действии пониженных температур//Физиология устойчивости растении и рег\ тяторы роста Межвуз со науч тр - Саранск, 1987-С 31-36

9 Зауралов О А Лукаткин АС Модель влияния пониженных температур на теплолюбивые растения (на примере проса)//Физиология устойчивости растении и регуляторы роста Межвуз сб науч тр-Саранск, 1987 -С 61-67

10 }ауралов О А , Лукаткин А С Цитофизнологические критерии стрессоустоичи-вости/ Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений Тез Всееогозн конф - Уфа 1988 - С 31

11 Лукаткин А С , Голованова В С Интенсивность перекисного окисления липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений// Физиология растений - 1988 - Т 35 выл 4-С 773 780

12 Лукаткин А С .Воскова ТА Лаврина М Н Активность АТФаз листьев теплолюбивых растении при охлажденииЛВопросы биологин растений при их интродукции и в естественных фитоценозах в условиях Нечерноземной зоны РСФСР Межвуз сб науч тр - Саранск, 1988 - С 67-77

13 Зауралов О А, Лукаткин АС Внутриклеточный рН листьев теплолюбивых растении при действий пониженных температур/ Физиол и биохимия культурных растении - 1988 - Т 20 N 6 - С 586-592

14 Лукаткин АС Жидкин В И Корреляция фотосинтетической продуктивности и внутриклеточных изменений у теплолюбивых растении после охлаждения/» IV конф молод уч Ин та почвоведения и фотосинтеза Тез докл - Пушино 1989 - С 116-117

15 Лукаткин АС Действие неповреждающих пониженных температур на физиологе биохимические процессы в клетках листьев теплолюбивых растений//Изу чение, охрана и рациональное использование природных ресурсов Тез науч конф - Уфа 1989 - Ч 2 - { 9

16 Юмаева Л А Лукаткин А С Влияние синтетических регуляторов роста на термоустои швость и продуктивность зерновых ку тьтурЛИзучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов Тез науч конф - Уфа 1989-Ч 2 - С 49

17 Зауралов О А Лукаткин АС Цитофизнологические методы диагностики теп-лолюоивыч растении/ 'Ученые Мордовского ордена Дружбы народов государственного университета имени Н П Огарева - научно-техническому прогрессу Каталог научных разраооток Саранск, 1989 - С 48-49

Зауралов О А Лукаткин АС Грунюшкин ИП Электрическое сопротивление тканей яистл теплолюбивых рлстениш/Доклады ВАСХНИЛ - 1990 - N 3 - С 19 22

19 Лукаткин А С Юмаева Л А Цитофизнологические основы селекции растении огурца нл холодоустойчивость//Молодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны Тез докл науч-практ конф-Москва 1490 С 140 142

20 Юмаева Л А Лукаткин А С Устойчивость и продуктивность растении проса и пшеницы при действии регулятора роста картопина Молодые ученые - сельскому хо-зянству Нечерноземной зоны Тез докл науч-практ конф-Москва, 1990-С 191

21. Лукаткин Л.С.Юмасва Л.Л.,Ласкова Е.А. Влияние цитокнниновых препаратов на прорастание семян ку курузы при оптимальной и пониженной температуре// Устойчивость растений и се регуляция: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск. 1990,- C.22-2S.

22. Юмаева Л.Л.,Лукаткин A.C. Влияние длительности обработки регуляторами роста на прорастание семян огурцов//УстойчивЪсть растений и ее регуляция: Межвуз. сб. науч. тр.-Саранск. 1990,-С. 100-104.

23. Юмаева Л.Л.,Лукаткнн А.С.,Ласкова Е.А. Действие экзогенных регуляторов роста на состояние клеточных мембран при охлаждении растений//1У Всесоюзн. конф. мол. ученых по физиологии растит, клетки. - Москва, 1990,- С. 149.

24. Лукаткин А.С.,Илюшова С.М. Активность K*,Mg2"-ATOa3bi листьев огурца при действии пониженных температур/ЛУ Всесоюз. конф. мол. ученых по физиологии растит. клетки,- Москва, 1990,- C.I50.

25. Зауралов O.A..Лукаткин А.С.,Илюшова С.П. Действие пониженной температуры на активность АТФаз фракции клеточных оболочек, выделенных из листьев огурца// Регуляция ферментативной активности у растений: Межвуз. сб. науч. тр.- Горький, 1990,-С.31-35.

26. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Кострубин М.М.,Лаханов А.П. Генетически обусловленные различия цитофизиологических качеств у сельскохозяйственных расте-ний/Л1ндуцированная изменчивость в интродукции и селекции: Межвуз. сб. науч. тр.-Саранск, 1991.-С. 72-81.

27. Зауралов O.A.,Лукаткин A.C. Цитофизиологические аспекты холодоустойчивости теплолюбивых растений//Второй съезд Всесоюзн. об-ва физиологов растений: Тех докл.- М, 1992,- 2 ч.- С.77.

28. Лукаткин A.C. Перекисное окисление мембранных липидов у теплолюбивых растений при охлаждении//Второй съезд'Всесоюзн. об-ва физиологов растений: Тез. докл.-М„ 1992.-2 ч-С.121.

29. Лукаткин A.C. Способ оценки холодоустойчивости растений.- Авторское свидетельство СССР N 1732857, кл. А 01G 7/00 // А 01Н 1/04, 15.05.92 // Б. и. N 18, 1992.

. 30. Зауралов О.А..Лукаткин А.С.,Кадеркаева Л.А. Критерии эффективности регуляторов роста для повышения холодоустойчивости теплолюбивых растений//Третий съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл.- С.-Пб, 1993,- Вып.6,- С.570.

31. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Шаркаева Э.Ш.,Шестакова A.C. Временная динамика изменения клеточных параметров при развитии холодового повреждения//Третий съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл.- С.-Пб, 1993,- Вып.6,- C.57I.

32. Лукаткин А.С.,Зауралов O.A. Сравнение методов оценки холодового повреждения и холодоустойчивости теплолюбивых растений//Третий съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл.- С.-Пб, 1993.- Вып.6.- С.658.

33. Лукаткин А.С.,Сапуненкова Е.Е. Кальциевый статус и Са-АТФаза в проростках кукурузы при охлаждении/ЛГретий съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл.-С.-П6, 1993.- Вып.6.- С.659.

34. Лукаткин А.С.,111аркаева Э.Ш.,Зауралов O.A. Динамика изменения экзоосмоса Электролитов из листьев кукурузы при различной интенсивности холодового стресса// Физиология растений,- 1993,- Т.40, N 5.- С.770-775.

35. Зауралов О.А.,Шаркаева Э.Ш.,Лукаткин А.С.,Шестакова А. Развитие холодового повреждения теплолюбивых растений в ходе ©хлаждения//ХХ1 Огаревские чтения: Матер, науч. конф,- Саранск, 1993,- С.37-38.

36. Лукаткин А.С.,Сапуненкова Е. Экзогенный кальций и Са-АТФаза в листьях теплолюбивых растений при охлаждении//ХХ1 Огаревские чтения: Матер, науч. конф.-Саранск, 1993,-С.42.

37. Лукаткин A.C., Кадеркаева Л.А. Термопротекторное действие экзогенных фи-тогормонов при обработке теплолюбивых растений//ХХН Огаревские чтения: Тез. науч. конф,-Саранск, 1993.-С. 101-102.

iS InpiiuB О \ Луникнн \C Чернова E \ В шяпие ox i likiuina pii.111 imoii длите ibnoeni па появление повременим у проростков прост/ Фи ino tor ия растении -

1994 - T4I \ 4 - С 603 608

39 ¡зурповО \ Луклткин \С Кадсркаева Л \ Пнтхкция чо юлоустой швости у тсплолгаонв!ix ¡rillliiми жзотснныуш ретулягорачи роета/ Инлмшровапнля HixienMii-воеть и адлпгшия растении Межвуз со туч гр - С чртек. 1995 -С 4Ь М

40 Злхриов ОЛ IIIтрк.чена ) Ш Лукчгкин \С Индуинрованные ох пждением изменения интофизиоюги lecMix параметров в шетьяч кукурузы/ Индуцированная изменчивость и лдаптншя растений Межву) со науч тр - Странск. 199S . С ^2

41 Луклткин Л С "iavpvioR О \ Влияние синтетических шалотов фитогормонов на цитофизиолотичекне процессы при охлаждении теплолюоивыч растении// Третья Междунтролная конференция "Регуляторы роста и развития раетешш* Тез .к.ю - N1,

1995 - С 27 2S

42 5аурллов О \ Лукаткин А С Повышение чототоустойчивости геплочюбнвыч растений при обрлоотке еемян цитокининовыуш преплратаут/ Третья Me клу нлроипя конференция "Регуляторы роетл и развития растении" Тез дою - \1 |99> - С 97 98

43 Л\катким Д С Шлрклева О Ш ЗаураловОА Изменения перскисното окисления тшшдов в тистьяч теплолюбивых рлстешш при различно» длительности \о мдово-го стресса/Физиология растении - 1995 Т42 Ч4-С5~8 542

44 ¡ауралов О \ Туkitkmh АС Втиянне пониженных течперлтур на тыханне проростков теичолюоивыч рлстении/ Между народное совещание Дыхлние растении Физиологи iCCKiie и >ко югические аспекты Пршрамма и тез - Сыктывкар 1995 С 54 61

45 Лукаткин Л С .Тямкина О Н Генерация су пероксидного анионрадикала в клетках листьев ку курузы при развитии чолодовото OTpeccV/WIV Огаревские чтения Гез докл нау i конф В 3 ч - Ч 2 - Слранск Над во Мордов ун-та, 1995 - С 26-27

46 Шаркаева Э Ш Лукаткин А С Влияние очлаждения рлзлнчнон длительности и интенсивности на рост черистечатическич клеток конуса нарастания кукурузы//XXIV Огаревские чтения Тез докл науч конф В 3 ч - Ч 2 - Саранск Изд во Мордов ун та, 1995 - С 37-3S

47 Lukatkin A S Use of cell cultures chilling sensitive plants for studying of chilling damages//Physical Chemical Basis of Plant Physiology Annual symposium (i 8 Febr, 1996 Penza) Abstracts - Pushchino 1996-P 103

48 Lukatkm A S Tyamkina О N Lipid peroxidation in the leaves of chilling senttvite plants as a factor of chilling stress / Physical-Chemical Basis of Phnt Physiology Annual symposium (5 8 Febr, 1996, Penza) Abstracts - Pushchino, 1996 - P 103

49 Zauralov О A Lukatkm A S Slnrkaeva E Sh The effect of chilling duration and intensivity on physiological processes in maize plants//Physical-Chemical Basis of Plant Physiology Annual symposium (5 S Febr , 1996 Penza) Abstracts - Pushchino 1996-P 117

50 ¡ауралов OA Лукаткин AC Влияние жгагенных аналогов фитогорчонов на холодоустойчивость теплолюбивых растений//Агрохимия - 1996 - V 1 - С 109-119

51 "¡ауралов О А Лукаткин А С Калинина И В .Шарклева ') Ш Физиологические процессы в проростках кукуру5ы под влиянием продолжительности охлаждения// Доклады Росс Акад с -х наук - 1996 - Ч 2 - С 15-17

52 Зауралов OA, Шаркаева 111, Апарин С В , Лукаткин А С Ростовые реакции у растений кукурузы на разных уровнях организации материи при пониженной течпера-туре/ТВлияние физических и чичикскич факторов на рост и развитие сельскохозяйственных ку 1 ыу р Тез второй межвуз конф - Оречово-Зуево 1996-С 29

53 *iауралов О А Лукаткин А С Тканевые и клеточные аспекты чолодоустоичнво-сти и чолодовото повреждения теплолюбивых растений /'Уепечи современной биологии-1946-Т 116 вып 4-С 418-431

54 ¡ауралов О А Лукаткии А С Шаркаева ) III Внутриклеточный рИ тканей юс-га кукуруш в динамике охлаждения рлзличнои интенсивности/ Известия РАН Сер

биологическая,- 1997,- N 1.-С.96-99.

55. Зауралов О.А.,Колмыкова Т.С.,Лукаткин A.C. Влияние продолжительности предпосевной обработки семян регуляторами роста на прорастание и содержание в них фитогормонов//С.-х. биология,- 1997,-N 1,-С.80-84.

56. Лукаткин А.С.,Исайкина Е.Е. Кальциевый статус и холодовое повреждение проростков кукурузы//Физиология растений,- 1997,- Т.44, N 3.C.392-396.

57. Лукаткин А.С.,Левина Т.Е. Влияние экзогенных модификаторов перекисного окисления липидов на холодовое повреждение листьев огурца//Физиология растений,-1997,-Т.44, N 3,-С.397-403.

58. Лукаткин A.C.,Зауралов O.A. Сравнение способов применения регуляторов роста для повышения холодоустойчивости теплолюбивых растений//Четвертая Между-нар. конф. "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г.): Тез. докл.- М., 1997.- С.197-198.

59. Лукаткин A.C. Влияние различных классов регуляторов роста на индукцию холодоустойчивости теплолюбивых растений/УЧетвертая Междунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г.): Тез. докл.М., 1997.- С.198-199.

60. Лукаткин A.C., Зауралов O.A., Шаркаева Э.Ш., Апарин C.B., Тямкина О.Н., Аверкина В.И. Физиология холодового повреждения теплолюбивых растений//Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология: 3-й ежегодный симпозиум, 27т28 июня 1997,- М„ 1997,- С. 83.

61. Зауралов О.А.,Колмыкова Т.С.,Лукаткин A.C. Зависимость роста проростков и содержания в них фитогормонов от продолжительности обработки семян регуляторами роста//Доклады Росс. акад. с.-х. наук,- 1997,- N 3.- С. 6-7.

62. Зауралов O.A.,Лукаткин A.C. Последействие пониженных температур на дыхание теплолюбивых растений//Физиология растений,- 1997,- Т.44, N 5,- С. 736-741.

Подписано в печать 22.04. 9а Объем 2.0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ Н 326.

Типография Издательства Мордовского университета 430000, Саранск, ул. Советская, 24.

Информация о работе

Лукаткин, Александр Степанович
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы