Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительный стресс и антиоксидантная роль сахаров при гипотермии у растений картофеля

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Окислительный стресс и антиоксидантная роль сахаров при гипотермии у растений картофеля"

На правах рукописи

□03058372

СИНЬКЕВИЧ Максим Сергеевич

Окислит ельный стресс и антиоксидантпая роль Сахаров при гипотермии у растений картофеля

03 00 12 - Фичиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандида га биологических наук

Москва 2007

003058372

Работа выполнена в лаборатории зимостойкости Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Трунова Тамара Ильинична

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Носов Александр Владимирович

доктор биологических наук, профессор Лукагкин Александр Степанович

Ведущая организация РГАУ-МСХА им К А Тимирязева

Защита состоится__22_мая__2007 г в _12_ часов на заседании

Диссертационного сове-ia К 002 210 01 при Институте физиологам растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, ул Ботаническая, 35 Факс (495) 9778018, e-mail ifr@ippras ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Автореферат разослан___2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета, 1

Кандидат биологических наук (г<\/1/ М И Азаркович

Актуальность. Температура окружающей среды является важным фактором, определяющим географическое распространение растений и их продуктивность [Туманов, 1979, Дроздов и др, 1984, Sakai, Larther, 1987] Вымерзание и повреждение посевов и насаждений наносит сельскому хозяйству большой ущерб, чю усугубляется снижением урожайности тех растений, которые выживают В силу "»того внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии [Левигт и др , 1983, Саидухадзе и др , 2003]

Поскольку у растений отсутствуют поведенческие механизмы защиты от действия низкой температуры, основные адапшвные изменения происходят на организ-менном, и особенно на клеточном уровнях В ходе целого ряда исследований выявлена группа неспецифических реакций, к которым относя гея, прежде все! о, изменение проницаемости клеточных мембран, внутриклеточно1 о рН, накопление защитных веществ, в частности, растворимых углеводов [Туманов, 1979, Трунова, 1984, 2007] При эюм показано, что одним из самых ранних эффектов при охлаждении paeiciiuM является окислительный стресс, обусловленный накоплением активных форм кислорода (АФК) [Scandahos, 1993, Мерзляк, 1989, Лукаткин, 2002] Для защиты от него в растениях существует антиоксидантная система, состоящая из ферментов (суперок-сиддиемутаз, каталазы, иероксидаз и др) и низкомолекулярных ангиоксидашов (ас-корбата, 1лютатиона, каротиноидов, флавинов и др) Однако, способностью к нейтрализации АФК, характерной для низкомолекулярных антиоксидантов, обладает ряд выполняющих и другие функции веществ полиамины [Кузнецов и др , 2006J, стероиды [Кузьменко и др , 1997], полиспирты Имеются данные, полученные в модельных опытах, о способности растворимых углеводов к перехвату АФК [Аверьянов, Лапикова, 1989]

Особенности окислительного стресса и антиоксидантной системы при гипотермии у холодостойких растений, в отличие от теплолюбивых, изучены недостаточно При jtom роль растворимых Сахаров в связи с окислительным стрессом, индуцированным гипотермией, почти не рассматривается, чему, по-видимому, в числе прочих причин, препятствует многообразие их функции в живых клетках В связи с этим

представляет интерес изучить возможность участия растворимых углеводов в нейтрализации окислительного стресса в качестве низкомолекулярных перехватчиков АФК Решению этой задачи может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом, вызванным введением гена дрожжевой инвергазы [Боппе^'аШ с1 а1,1997]

Цель и задачи исследования Целью нашей работы было изучить окислительный стресс, вызванный гипотермией, и роль Сахаров в системе антиоксидантной защиты на примере типичного представителя группы холодостойких растений - картофеля - с измененным углеводным метаболизмом вследствие экспрессии гена инвертазы дрожжей В соответствии с заявленной целью были поставлены следующие задачи

1 Подтвердить экспрессию встроенного гена инвертазы дрожжей в листьях растении картофеля по изменению активностей различных типов инвертаз, содержанию Сахаров и их связь с устойчивостью к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией,

2 Сравнить развитие окислительного стресса, индуцированного гипотермией, у контрольных и трансформированных растений по содержанию активных форм кислорода и интенсивности перекисного окисления липидов,

3 Оценить эффективность антиоксидантной системы при низкотемпературном стрессе у изучаемых генотипов по активности ключевых ферментов суперок-сиддисмутазы, каталазы и гваякол пероксидазы,

4 Определить вклад Сахаров в сохранение функциональной активности мембран, а также ферментов антиоксидантной системы варьированием их содержания в листовой ткани посредством

а) использования трансгенных растений с введенным геном инвертазы дрожжей (апопластная локализация фермента),

б) выращивания растений на МС-среде с 0,2,4 и 6% сахарозы,

в) длительной экспозиции при адаптирующей температуре,

5 Выявить роль Сахаров в иротиродействии окислительному стрессу, индуцированному гипотермией или экзогенными оксидантами (модельные опыты), в т ч сис темой Фентон

Научная новизна. Впервые проведено комплексное из>ченис окислительною стресса, индуцированного гипотермией, и роли Сахаров в системе антиоксицашнои защиты холодостойких растений, на примере картофеля, как типичного представителя этой группы

Впервые установлено, что экспрессия введенного гена инвертазы дрожжей (апо-пластная локализация фермента), сопровождающаяся повышением активности всех типов инвертаз (особенно кислых) и накоплением Сахаров, приводила к увеличению размера крахмальных зерен в хлоропластах, повышению содержания реакционных цепгров ФС1, накоплению восстановленных эквивалентов в хлоропласте (ИАОРМ, Рс1 и др ), усилению темнового дыхания, а также торможению роста растений и ингпби-рованию фотосинтеза (по принципу обраIной связи)

Впервые выявлено, что ферменты антиоксидашной системы при действии гипотермии менее активны в растениях с высоким содержанием Сахаров при сходном уровне окислительных процессов, что свидетельствует о более эффективном противодействии таких растений окислительному стрессу за счет низкомолекулярных ан-тиоксидаитов

Применение трансформантов позволило экспериментально показать, что обогащенные сахарами растения обладали большей стабильностью клеточных мембран и функции одного из ключевых ферментов антиоксидантной системы - цитоплазмаги-ческой супероксид дисмутазы - к действию низкой температуры, чем контрольные растения

С использованием модельных опытов экспериментально подтверждена способность растворимых углеводов к участию в антиоксидантной системе клетки в качестве перехватчиков активных форм кислорода (АФК)

Благодаря использованию трансформантов с введенным геном инвертазы дрожжей, впервые выявлена важная роль Сахаров в устойчивости холодостойких растений

к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией, проявившаяся в стабилизации клеточных мембран и СОД и перехвате АФК

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные о роли Сахаров в защите от окисли гельного стресса, вызванного гипотермией, имеют существенное значение для понимания механизмов адаптации и устойчивости холодостойких растений к абиотическим стрессорам Выявлено участие Сахаров в системе антиоксидантной защиты клеток, что может привести к созданию новых методов повышения устойчивости растений Совокупность экспериментальных данных может быть использована для сравнения адаптивного потенциала представителей группы холодостойких растений, а теоретические обобщения - в курсах лекций для студентов биологических специальностей ВУЗов

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на конференциях «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезонасности» (Москва, 2004), «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, 2005), I Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), научной конференции молодых ученых в Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН (Москва, 2006), а также на семинарах лаборатории зимостойкости ИФР РАН Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ Структура и объем диссертации. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания обьекта и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов Список цитируемой литературы включает 149 наименований, из них 91 иностранных Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 04-04-48476)

Объекты и методы исследования Объектом исследования служили растения картофеля (Solanum tuberosum L, cv Desirie), экспрессирующие ген инвертазы дрожжей, находящийся под контролем клубнеспецифичного пататинового промотора ВЗЗ класса I и содержащий последовательность лидерного пептида ингибитора протеиназы II для обеспечения апопластной

локализации фермента (далее по тексту ВЗЗ-inv растения) 1рапсформангы также содержали маркерный ген устойчивости к канамицину nptll, находящийся под контролем конститутивного 35S нромогора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) Контролем служили ^трансформированные растения картофеля сорта Дезире (дикий тип) Приносим глубокую благодарность всем согрудникам Лаборатории росга и развития им М X Чайлахяна ИФР РАН за предоставленные растения из коллекции клонов, полученных в совместной работе с Институтом молекулярной физиологии растений им Макса Планка (Golm, Germany)

Растения размножали микрочеренкованием и выращивали in vi It о в камере фитотрона ИФР РАН при 22°С и 16 ч освещении люминесцентными лампами белого света (ЛБ-80, освещенность 4 клк) в течение 5 недель в пробирочной кутьтуре на 10-13 мл агаризовашгой питательной среды по прописи Мурасиге и Скуга [Murashige, Skoog, 1962] с добавлением 0, 2, 4 или 6% сахарозы и витаминов (тиамина и пиридоксина -по 0,5 мг/л, мезоинозита - 60 мг/л)

Окислительный стресс вызывали, помещая растения в пробирках (без ватно-марпевых пробок) в холодильную камеру с температурой от -7°С до -12"С на различные промежутки времени (15-60 мин) В экспериментах испочьзовались листья без черешков, взятые из средней части растений

Количество образовавшегося супероксида (CV) определяли по методу [Часов и др, 2002] с модификациями, основанному на окрашивающей реакции с адреналином (с превращением в адренохром) Измеряли оптическую плотность гомогепата листьев с добавлением адреналина против гомогената с водой при Х=480 им на спектрофотометрах СФ-46 («JIOMO», Россия) либо Spekol-11 («Carl Zeiss»), используя кювету с

длиной оптического пути 1 см Скорость генерации Ог" рассчтывали по формуле —

(где AD - разница поглощения между гомогенатом с адреналином и гомогенатом с водой, t - время инкубации, мин) Специфичность реакции подтверждена добавлением супероксиддисму газы (100 ед акт)

Содержание перекиси водорода (Н2Ог) измеряли по цветной реакции с хлоридом титана (TiCl4), согласно методу [Kumar, Knowles, 1993] Абсорбцию раствора измеря-

ли при >,=415 нм против 2N раствора H2S04 Содержание Н2Ог рассчитывали по стандартной калибровочной кривой концентрации перекиси водорода в ацетоне (от ОД мМ до 1 мМ)

Степень устойчивости исследуемых генотипов картофеля к гипотермии оценивали по электропроводности водных экстрактов из растительных тканей - метод Дек-стера [Hepburn et al, 1986] Электропроводность выражали в Ом"1 см"1 10"4, используя значения для вычисления индекса тканевого повреждения по формуле . 100(Z,,-L.)

1 = —-————, где I - индекс повреждения ткани в %, L - электропроводность об-

At ~Ч

разца до воздействия холода (L0) и после (£,), Lk - электропроводность после кипячения [Flint et al, 1967] За значение холодостойкости (Я) принимали величину, комплиментарную индексу повреждения (Н= 100 -1) и выраженную в %

Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию одного из конечных стабильных продуктов - малонового диальдегида (МДА) в листьях растении до и после охлаждения в холодильной камере В основе метода лежит окрашивающая реакция МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием комплекса желтого цвета Расчет концентрации МДА проводили после измерения поглощения (молярной экстинкции) при Х=532 нм по формуле С = —, содержание МДА

el

выражали в мкмоль/г сырой массы [Жиров и др , 1982]

Активность цитозольной фракции супероксиддисмутазы (СОД), представляющей собой Си,2п-СОД [Scandahob, 1993, Bowler et al, 1992], определяли по методике [Kumar, Knowles, 1993] с модификациями Метод основан на ингибировании растительным гомогенатом восстановления п-нитросинего тетразолия до формазана за счет присутствия СОД Контролем служила смесь, не содержащая растительного экстракта (максимальный уровень образования формазана) За единицу активности принимали 50% ингибирование образования формазана Активность СОД выражали в единицах активности на г сырой массы листьев

Активность каталазы измеряли по скорости деградации Н2О7 согласно методике [Kumar, Knowles, 1993] Активность фермента выражали в ммоль разложившейся перекиси/г сырой массы в мин

Активность гваякол пероксидазы определяли по модифицированному меч оду [Kumar, Knowleb, 1993], основанному на реакции окисления ароматического соединения (гваякола) до окрашенного соединения (тетрагваякола) Активность гваякол пероксидазы выражали в ммоль окисленного гваякола/г сырой массы в мин

Активность инвертаз в тканях листьев определяли как описано у Туркиной и Соколовой [1971] Осадок, полученный пос ic центрифугирования и диализа гомогената, использовали для определения активности инвертазы в клеточных стснках (при pH 4,7), в супернатаите определяли активность цитогшазматическою (при рП 7,4) и ва-куопяриого (при pH 4,7) типов фермента Об акт ивности фермента судити по количеству образовавшейся глюкозы в инкубационной среде (ммоль/r сырой массы)

Для определения содержания Сахаров в листьях навеску массой 0,3 i фиксировали кипящим 96%-ным этиловым спиртом и гомогенизировали в фарфоровой схупке Сахара извлекали трехкратной экстракцией 80%-ным раствором этанола ß полученных экстрактах определяли глюкозу глюкозооксидазиым методом, сахарозу и фруктозу - по методу Roe et al, описанным у Туркиной и Соколовой [1971]

Интенсивность процессов фотосинтеза и дыхания определяли по нескольким параметрам приросту сухой массы ( ■ ■мг ) и длины растений (мм), а также скорости

г сут

СОг-газообмена (мг С02/г сух массы сут) Изучение газообмена проводили путем измерения скоростей ассимиляции и выброса COj на установке открытою типа с инфракрасным газоанализатором URAS 2Т фирмы «Hartmann und Braun» и сопутствующими приборами юй же фирмы [Климов, 2003]

В модельных опытах для инициирования окислительного стресса в тканях листьев исследуемых генотипов картофеля испочьзовали оксидапты - перекись водорода и реактив Фентон [Fenton, 1899], содержащий Н2О2 и FeS04 Определяли влияние указанных оксидантов на скорость образования супероксидного аниона и ишенсивносгь ПОЛ в цитоплазматической фракции грубого экстракта

Измерения кинетики поглощения света с Х.-830 нм (АА830) у листьев растений картофеля проводили с помощью специализированного прибора РАМ ("Walz", Германия) [U Schreiber et al, 1986], используя пару эмиттер-детектор ED-P700DW-E, и регистрировали на компьютере с помощью РАМ Data Acquisition System PDA-100 той же фирмы Скорость сбора информации составляла 3 мс'точку или 0 3 мс/точку Белый действующий свет получали от осветителя KL-1500 ("Schott", Германия) Дальний красный свет с дтиной волны 730 нм получали от осветителя FR-102 ("Walz") Поскольку листья исследуемых генотипов картофеля различались по размерам, сигналы изменений поглощения измеряли, закрывая часть входного конца световода черной диафрагмой, что позволяло нормировать их амплитуду

Для исследования ультраструктуры клеток мезофилла листья из средней части растений (в возрасте 5 недель) отчленяли и фиксировали в течение 4 ч 2,5%-ным глу-таровым альдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7 4) Затем, после 4-кратной промывки тем же буфером, материал рефиксировали 1%-ным раствором OsC>4 и заливали смолой Ероп-812 Ультратонкие срезы палисадной паренхимы получали на ультрамикротоме 1 KB 3 фирмы "LKB" (Швеция) и контрастировали сначала насыщенным водным раствором уранилацетата при 37°С в течение 30 мин, а затем лимоннокислым свищом при температуре 20-22°С в течение 15 мин Срезы просматривали в электронном микроскопе "TEMSCAN 100СХ2" ("JEOL", Япония) Морфометрические исследования клеток и хлоронластов проводили на приборе MOP-VIDEOPLAN фирмы "Reichert" (Австрия) Для электронно-микроскопических исследований брали пробы из пяти листьев четырех растений каждого варианта Для морфометрических измерений просматривали 70 хлоропластов

Данные обработаны статистически с использованием программы «T-test» и графопостроителя «Origin» со встроенным статистическим анализом (применяли критерий Стьюдента для парных и непарных выборок, Р=0 05) Представлены средние значения типичного опыта, состоящего из трех биологических повгорностей и их стандартные ошибки Каждая биологическая повгорносгь состояла из листьев, взятых со

средней части растений. Обсуждаются различия, достоверные при 95%-ном уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И «КС.'УЖДЕНИК i. Характеристика Объекта исследования. Ранее в нашей лаборатории было показано, что экспрессия гена ннвертазы дрожжей (агюпластная локализация фермента) приводила к снижению оттока сахарйа из клеток листьев [Дерябин и др., 2003]. Нам необходимо было подтвердить эффективность встроенного гена у ИЗЗ-тт трансформантов, для чего были прозвал из ированы алсгивнос-ги иивертаз различных типов а га к же содержание основных растворимых углеводов - ГЛЮКОЗЫ, сахарозы и фруктозы - в листьях контрольных и трансформированных растений.

Рис. I. Активность инвертйз (а) и содержание caiccipoe (б) а листьях кШлфояьных (!) и трансформщк*-№.иных (2) растений.

Показано, что активности всех форм инвергазы у ВЗЗ-шу растений были заметно выше, чем у контрольные (рис. 1а). При л ом общее содержание сахарое в листьях трансформантов было также на 30% больше, причем в основном за счет сахарозы И глюкозы (рис. 16). Отсутствие существенных изменений в содержании фруктозы, скорее ш;е-го, объясняется большей степенью вовлечения се в метаболизм.

Следствиями измененного содержания Сахаров в листовой ткани были снижение скорости прироста длины и биомассы 633»/яv растении, интенсивности фотаспнтещ-

шело'пгая кислая кислая

инвертзза инвертаза

фруктоза сахароза сумма сумма

глюкоза моносахаров сахарив

I I

ческих процессов, с одновременным увеличением размеров крахмальных зерен в хдо-ропластах и усилением дыхания

2. Определение относительной устойчивости контрольных и ВЗЗ-ту растений к низкой температуре. Как уже упоминалось, введение гена инвертазы дрожжей вызывало целый ряд изменений, которые могли отразиться на устойчивости растений к гипотермии, что и было изучено при сравнении исследуемых генотипов Применение прямого метода, тс определение выживаемости после действия положительной температуры не могло дать результатов, т к при снижении до температуры 0°С все растения картофеля выживали, а при минусовой - погибали от образования льда, поэтому в качестве индикаторов устойчивости использовали оценку выхода электролитов из клеток после воздействия отрицательными температурами, но небольшой продолжительности (в пределах 1 часа), чтобы избежать образования льда, но вызвать начальные процессы повреждения растений В результате применения нескольких режимов охлаждения были выявлены условия, при которых наблюдалось наиболее значительное различие в холодостойкости исследуемых генотипов (табл 1)

Таблица 1 Холодостойкость контрольных и ВЗЗ-щу растений картофеля при различных режимах охлаждения, %

Как вытекает из данных табл 1 охлаждение растений до температуры -8°С в течение 30 мин не вызывало повреждения клеточных мембран и, соответственно, невозможно было сравнить устойчивость трансформантов и контроля Снижение температуры охлаждения до -12°С (30 мин) позволило выявить существенное различие в холодостойкости, достигавшее 40% Более длительное действие

Температура (°С) и длительность охлаждения (мин) Растения

контроль ВЗЗчт

22°С 57 59

-8°С, 30 мин 64 63

-12°С 30 мин 16 59

-12°С, 50 мин 11 13

гипотермии (~12°С) до 50 мин снова приводило к одинаково сильным повреждениям обоих исследуемых генотипов

Известно, что в ответ на различные «рессорные воздействия, в том числе гипотермию, в клетках растении происходит увеличение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), связанное с активацией свободно-радикальных реакций с участием АФК Для регистрации изменений интенсивности ПОЛ, связанных с окислительным стрессом у растений картофеля, необходимо было применить воздействие отрицательными температурами небольшой продолжительности, что помогло бы избежать необратимых повреждений листовой ткани и образования внутриклеточного льда В результате был подобран режим температурного воздействия для регистрации ранних эффектов гипотермии (-7°С, 30 мин), связанных с проявлением окислительного стресса У ВЗЗ-гот растении наблюдалась меньшая интенсивность ПОЛ как в оптимальных условиях (22°С), так и после охлаждения Мы предположили, чю большая устойчивость к окислительному стрессу обобщенных сахарами В33-гт> растений, связана с меньшим образованием АФК

3. Интенсивность окислительного стресса у контрольных и ВЗЗ-тг растений при действии гипотермии. Одним из самых ранних результатов действия холода на растение является развивающийся окислитетьный стресс, обусловленный изменением количества образующихся активных форм кислорода (АФК) и ростом процентной доли 02, превращающегося в АФК, по сравнению с нормальными условиями существования [Скулачев, 1999] Реакции перекисного окисления мембранных липидов индуцируются за счет радикальных форм кислорода, поэтому их интенсивность в растительных тканях, наряду с содержанием перекиси водорода и супероксидного аниона, являются индикаторами развития окислите гтыюго стресса [Лукаткин, 2002] Уже в оптимальных для роста условиях (22°С) между растениями исследуемых генотипов наблюдалось различие в интенсивности ПОЛ В результате охлаждения интенсивность ПОЛ в листьях контрольных растении увеличивалась, тогда как у ВЗЗ-ту растений даже снижалась (рис 2) Спустя сутки после возвращения в оптимальные для роста условия (22°С) восстановления ПОЛ до исходных значений не происходило у

обои.% ис еле дуемых генотипов, оставаясь более высоким у контроля п низким у ВЗЗ-!>п> растений.

Рис 2. Интенсивность ПОЛ в листьях контрольных (I) и В33-т> (2) растений картофеля при действии краткосрочном жесткого охлаждения 1-7"С, 30 мин), щкмель МДА/г сырой .массы

Различие между ¡контролем и трансформ актами в интенсивности ПОЛ, при гипотермии достигавшее почти 50%, скорее всего, связано с уровнем ЛАЖ. Для проверки этого предположения измеряли скорость образования наиболее долго-живущих АФК: Супер.оксидног о аниона (рис. 3) и перекиси водорода.

Рис. 3. Скорость генерации сунер-окШ/дного аниона в листьях контрольных (1):/ В33-¡т> (2) растений картофеля при действии жесткого краткосрочного охлаждения ( Т'С. 30 мин)

Измерение скорости образования супероксидного аниона (одной из основных АФК) выявило, что повышенное у В33-н№ растений содержаний йнутриклеточных Сахаров не приводило к снижению продукции АФК в оптимальных для роста условиях. Исходная скорость образования О/ в листьях трансформированных растений, наоборот, была значительно выше, чем у контроля. Однако, в результате действия холода и после возвращения в оптимальный условия выращивания скорость генерации супероксида у транс генных

5 и

§

о О

1

1 г !

1

Я

i:\-f

111 ¡¡511, с.!'-.» ЕЗЙЯ '■■Г:'!. _ 1 «

>2° С

охлаждение спустя сутки

после охлаждении

растений практически не изменялась; При этом и листовой ткани контрольных растений образование супероксида, наоборот, повышалось и при гипотермии, и дополнительно при обратном переносе в Оптимальные условия (22°С). Рост скорости образования супероксидного аниона у контрольных растений свидетельствует о развитии окислительного стресса, сначала вызванной охлаждением, а затем - обратным воз-юрашенксм в 22"С Этй объясняет увеличение интецсишости ПОЛ, зафжеяровакн^е у контроля ранее (рис.2), Таким образом, трансгенные растения испытывали большую окислительную нагрузку на аптиокепдантмук) систему, чем растения диког о типа, но, в отличие от «ш фольпы.х, не повреждались получасовым охлаждением (ртсугство-яалО накопление перекиси водорода и МДА). Поскольку ВЗЗ-/«'.- растения отличались от контрольные большей активностью кавергаз и высоким содержанием сахарой» которые не оказали ожидаемого стабилизирующего влияния на продукцию АфК, следует предположить, что должна быть причина повышенной устойчивости В33-/»и-' растений, не связанная со снижением продукции АФК. Наиболее вероятно, что трансгенные растения обладали высокой устойчивостью к окислительному стрессу за счет более развитой ашисжепдантиой системы защиты кясток.

4. Влияние г ипотермии на активность антиойеидангаых систем исследуемых генотипов, Эффективность антиоксидшггной системы оценивали по актииности ключевых ферментов -- супероксиддисмугазы (СОД, рис. 4), каталазы (рис. 5) и псроксида-зы гваякола. В связи с полученными нами данными по скорости образования супер оксидного аниона, можно было предположить, что у Но ^-¡до растений активность СОД будет выше, чей у контрольных.

Рис. 4. Активность СОЛ в листьях контрольных (I) и ВЗЗ-тУ растений (2) при действии жесткого краткосрочного охлаждения (-ТС. 30 мин), един¡111 сжтивиости/г сы-

рой массы

Ьх,1|ЭжДсиие спустя сутки после охлаждения

Согласно облученным данным в оптимальных для роста условиях различие в активности СОД между генотипами отсутствовали (рис. 4). Измеренная сразу после охлаждения активность фермента СОД у ВЗЗ-дат растений, практически не менялась, тогда как у контроля - резко издала. Спустя сутки после возвращения в нормальные Температурные условия картина была той же; у трансгенных растений актишюсть фермента была близка к исходной, у контрольных - вдвое ниже. Такой резкий спад активности суперокойд дисмутази и отсутствие цоСпедующеш вооставдвишйй (у контроля) означает необратимую инактивацию фермента, возможно за счет накапливающихся ЛФК (цитозольная СОД очень чувствительна к концентрации перекиси водорода и даже супероксида [С1ю1 с1 а!., 2002]).

Рис. 5. Активность шталазы в листьях контрольных (I) и ВЗЗчт? растений (2) при действии жесткого краткосрочного охлаждения (-7'С, 30 мин), единиц активности/г сырой массы

В отличие от СОД, активность катализы (активность гваякол пероксидазы менялась сходным образом) при действии краткосрочного охлаждения возрастала. Поскольку рост концентрации перекиси в листья х исследуемых генотипов происходил без дополнительной активации СОД можно предположить существование альтернативного пути образования перекиси (без участия СОД). Таким источником, скорее всего, являются пизкомолекул ирные аитиокси-данты - альтернативная ферментам линия защиты,

5. Влияние различного углеводного питания на аитирксида итну ю систему контрольных и В33-/т' раШиий, Для подтверждения важной роли Сахаров в антйокси-дантной системе были применены другие способы изменения их содержания в клетках, в частност и, выращивание растений на средах с различным содержанием сахаро-

зы. В результате были получены растения с автотрофным (без сахарозы в среде), гетеротрофным (4%) и смешанным (2%) типами углеводного метаболизма.

Из данных рис. 6 становится очевидно, что содержание внутриклеточных Сахаров растет с увеличением концентрации сахарозы В питательной среде как у контрольных, так и у ВЙЗ-шу растений, при этом; у 'граггефор мантов к большей степени, чем у растений дикою типа, что объясняет ся активностью введенного ¡ сна шшертазй.

снижение при увеличении содержания сахарозы в среде выращивания и и самих рис-гениях (рис. 7а). Этот факт позволяет предположить невысокое содержаний перекиси водорода, образующейся при оптимальных условиях, что должно приводить к меньшей активности катализы. Вопреки ожиданиям, активность катал азы. наоборот, повышалась при выращивании на средах с большей концентрацией сахарозы (рис. 76). Как уже упоминалось выше, гти бол ее вероятно, что перекись поступала из .реакций нейтрализации АФК низкомолекулярными штиоксидантами.

Рис. 6. Содержание Сахаров е листьях контрольных (1) к ВЗЗ-'.пу растений (2) н оптимальных для роста условиях (22"С) при выращинании но средах с различной концентрацией сахарозы

: 14.с пчтателышМ %

При определении активности СОД у В33-111V растений выявили ее

Ifom^çHTpavîWft tasa^îu s tp&kü, Y-,

Рис 7. Активность СОД (а) и катализы (6) « листьях контрольных ( i ) и /ЗЗЗ-inv растений (2) при выращивании на средах с различной концентрацией сахарозы б, В.тнияие сахар«», накопленных ia счет длительного действия адаптирующих температур, на янтиоксидат nyio систему контрольных и B33~f/ít' ¡jae гений

ИзпесаЖ), что ь метках нас гений» способных к адаптации под действием холода, при понижении температуры окружающей среды происходя г различные биохимические процессы, яодготзадиваго щие их к преодолению низкотемпературной? стресса [Туманов, '979; Levitt, 1986; Гималой и др., 2004]. К таким процессам относят рост концентрации Сахаров, сопровождающий адаптацию к некритическим температурным режимам ¡Трушуиа, 2006]. Очевидно, что увеличение содержания внутриклеточных Сахаров может быгь достигнуто за счет действия адаптирующих (не повреждающих) температур. Для достижения этого эффекта растения пом с пиши в камеру с температурой и выдерживали « течение 6 сут.

Как и ожидалось, в динамике адаптация происходило постепенное увеличение содержания внутриклеточных Сахаров у обоих исследуемых генотипов (рис. 8). Однако, и большей степени данный эффект проявлялся у B33-¡«v растений: как по скорости накопления мовдеахарое, так и по сумме Сахаров они превосходили контрольные. Максимум накопления достигален уже к 3 суткам, далее происходили малозначимые колебания.

Рис 8 Содержание Сахаров в листьях контрольных (1) и ВЗЗню растений (2) при действии охлаждения 5°С, 6 сут (мг/г сырой массы)

После адаптивного воздействия у растений обоих исследуемых генотипов также изучали изменения активности антиоксидантных ферментов, интенсивности процессов ПОЛ и фотосинтеза, морфометрических параметры ультраструкгуры хлоропластов ВЗЗ-ту обнаружили большую резистентность фого-синтетического аппарата, проявились отличия в морфологии хлоропластов Как и при использовании друг их методов обогащения сахарами, снижение активности СОД (см рис 9а) наблюдалось при росте активности каталазы (рис 96)

длительность охлаждения, сутки

25203 о

115-

>5 О О.

¡5 ю-

6 л

г

0-

5

ш 63

8 ГО 2

>5 4-

х™

£

0

1 О,

2 3 4

время сут

Рис 9 Активность СОД (а) и ка-тапазы (б) в листьях контрольных вззчт (1) и ВЗЗ-ту растений (2) при дей-контроль ствии адаптирующих температур 5°С, 6 сут (единиц активности/г сырой массы)

0 13 6

Продолжительность охлаждения, сут

Таким образом, независимо от способа повышения концентрации внутриклеточных углеводов, у растений с большим их содержанием защита от окислительного стресса за счет антиоксидантных ферментов проявлялась в меньшей степени, т е

большая устойчивость ВЗЗ-оту растений объясняется повышенным содержанием низкомолекулярных антиоксидантов Имеющиеся литературные данные позволяют предположить, что эту роль могут выполнять сами растворимые углеводы [Аверьянов, 1989]

7. Моделирование окислительного стресса. В предыдущих опытах для индукции окислительного стресса использовали жесткое, но кратковременное охлаждение Однако, для полного отделения эффектов гипотермии от последствий окислительного стресса был необходим модельный опыт С этой целью гомогенизированные листья рас1ений подвертали действию эквивалентных количеств оксидантов различной силы, после чего измеряли интенсивность ПОЛ (табл 3) Указанные вещества (Н202 и реактив Фентон, постоянно генерирующий радикал ОН ) вызывали у исследуемых растений количественно одинаковый окислительный стресс, что позволяет непосредственно сравнить эффективность антиоксидантной защиты

Таблица 3 Интенсивность ПОЛ в листьях контрольных и ВЗЗ-гт растений при добавлении окси-дантов различной силы, мкмоль МДА/г сырой массы

Гак как не существует ферментативных путей защиты от радикальных АФК, большую устойчивость ВЗЗ-шу растений к искусственному окислительному стрессу можно объяснить только повышенным количеством низкомолекулярных антиоксидантов Более выраженный, по сравнению с перекисью, эффект реактива Фентон вызван дополнительным повреждающим действием радикалов ОН

Авторами [Аверьянов, Лапикова, 1989, Аверьянов, 1991] установлено, что ман-нит, манноза, глюкоза, фруктоза и сахароза резко ослабляют токсичность модельной ОН генерирующей системы, являясь перехватчиками радикалов ОН, что позволяет предположить участие этих Сахаров и спиртов в системе антиоксидантной защиты в качестве низкомолекулярных антиоксидантов При этом вполне возможно происхо-

Растение Без оксидан- ТОВ Оксиданты

ИгОг ОН- (реактив Фентон)

Контроль 4,41*0,05 5,08±0,06 5,78±0,07

В33-гт> 3,42±0,04 3,95±0 05 5,00±0,06

дит окисление Сахаров до кисло'], альдегидов, кстсшов, лактонов и ряда стабильных Сз-соединений (см. рис. 10). Перечисленные вещества не будут вступать в классические реакции на сахара, в частности, в реакцию с резорцином. В таком случае существует возможность выявить подобное песпецифическое окисление стандартными реакциями по изменению содержания углеводов. Дня тгоги растения подвергали действию жесткого краткосрочного охлаждения, после чего измеряли содержание в листьях растворимых углеводов (рис. 1 \).

«ООН

C6H12Os + АФК

hoch

---*

неон

неон

('НО

/он

: О

ОЖ

\g_ н/ он о и

Стабильные Лактоны альдегиды, кетоны и кислоты

сш

HOCH

I

fHCOOH]

неон

С = 0

HOCH

сн ,он \

Стабильные С., соединения

Рис. 10. Потенциальны? пути окисления сахарок радикальными АФК

я з

R о

Ii

и 3

■

■ днн

22° С охлаждение, охлаждение,

-7°С, ЗС мин -ГС, 1 час

Рис. Л. Содержание Сахаров и листьях контрольных (1) и ВЗЗ-1 т растений (2) при действии жесткого кратко-срочного охлаждения -Т'С с течение ЗОмнн и I часа

Действительно, при охлаждении до -7°С в течение 1 часа происходило снижение содержания внутриклеточных Сахаров на 15%, что не может быть объяснено ни вовлечением в метаболизм (при такой температуре скорости всех реакций снижаются в десятки раз), ни активацией альтернативного дыхания

Заключение

Несмотря на большое количество работ посвященных исследованию окислительного стресса, возникающему при охлаждении теплолюбивых растений, особенности этого процесса и механизмы защиты от него у холодостойких растений практически не изучены, при этом данные о роли Сахаров в системе антиоксидантной защиты клеток при гипотермии не найдены В связи с этим нами проведено комплексное изучение особенностей развития окислительного стресса, вызванного гипотермией, и антиоксидантной системы у картофеля, как типичного представителя холодостойких растений

Использование трансформированных растений картофеля с углеводным метаболизмом, измененным путем введения гена инвертазы дрожжей, позволило не только изучить роль Сахаров в защите растений от окислительного стресса, вызванного гипотермией, но и выявить их функцию в качестве низкомолекулярных антиоксидантов В дополнение к этому, содержание Сахаров модифицировалось путем выращивания на средах без сахарозы (автотрофный тип питания), с 2-мя, 4-мя и 6% (смешанный и гетеротрофный 1ипы питания), а также длительной экспозицией при низкой адаптирующей температуре Все эти приемы позволили выявить прямую связь между содержанием Сахаров в листьях исследуемых генотипов и устойчивостью растений к окислительному стрессу, который определяли по содержанию веществ-индикаторов активных форм кислорода и малонового диальдегида, а также по активности ключевых ферментов антиоксидантной системы (СОД, каталазы, гваякол пероксидазы)

Показано, что окислительный стресс у холодостойких растений, в отличие от теплолюбивых, при тех же температурах выражен слабее Поэтому для выявления различий между генотипами были применены более жесткие, но краткосрочные режимы охлаждения

Проведенные исследования позволили выявить, что, в отличие oi теплолюбивых растений, для которых противодействие окислительному сгрсссу связано с повышенной активностью антиоксидантных ферментов, у пшичною представителя холодостойких растений - картофеля - акцепт смещается в сторону низкомолекулярных веществ, на фоне стабилизации активноеш СОД Данные, полученные как па растениях in vitro, так и в модельных опьпах, позволяют считать, что такими веществами могут быть растворимые углеводы (например, глюкоза и сахароза), альтернативно участвующие в перехвате АФК

Выводы

1 Экспрессия встроенною гена инвертазы дрожжей (анонластная локализация фермента) в лист ьях растении картофеля подтверждена возрастанием активности всех типов инвертаз (особенно кислых) Следствием этою было накопление Сахаров, увеличение размера крахмальных зерен в хлоропластах, повышенное содержание реакционных центров ФС1, накопление восстановленных эквивалентов в хлоропласте (NADPII, Fd и др ), усиление темнового дыхания, а также торможение роста растения и ингибирование фотосинтеза (по принципу обратной связи)

2 В условиях жесткого (-7°С), но кратковременного (30 мин) охлаждения у растений дикого типа развивался окислительный стресс, проявлявшийся в увеличении

содержания активных форм кислорода (02~ и Н202) и усилении ПОЛ В отличие от контроля, у растений, содержащих ген инвертзы дрожжей, при таком режиме охлаждения окислительный стресс был менее выражен

3 В условиях гипотермии у контрольных растений наблюдали инактивацию ключевого фермента антиоксидантной системы - супероксиддисмутазы (цитозольной СОД), тогда как у трансформаптов ее активность сохранялась на уровне неохлажденного варианта При этом активности кагалазы и пероксидазы у обоих генотипов повышались

4 В оптимальных для роста растений условиях (22°С) с увеличением концентрации Сахаров в среде выращивания (0, 2, 4 и 6%) в тканях листьев исследуемых генотипов наблюдали снижение содержания АФК, интенсивности ПОЛ и активности

СОД за счет обогащения сахарами По всем показателям трансформанты проявляли большую степень устойчивости к окислительному стрессу

5 С использованием модельной системы, генерирующей оксиданты (Н2О2 и ОН*) подтверждено, что трансформанты обладали большей устойчивостью к окислительному стрессу Учитывая, что трансформанты отличались от контроля в первую очередь большим содержанием Сахаров, данные подтверждают их участие в антиок-сидантной системе клетки в качестве низкомолекулчрных антиоксидантов

6 Сравнительный анализ полученных данных rio влиянию низких температур на исследуемые генотипы картофеля благодаря использованию трансформантов с введенным геном инвергазы дрожжей выявил важную роль Сахаров в устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией, проявившуюся в стабилизации структуры и функции мембран, активности СОД и перехвате АФК

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 АН Дерябин, М С Синькевич, Т И Трунова 2007 Влияние Сахаров на развитие окислительного стресса, вызванною гипотермиеи (на примере растений картофеля экспрессирующих ген инвертазы дрожжей) Физиология растений Т 54, №1, с 39-46

2 А Н Дерябин, MC Синькевич. НГ Бухов, ТИ Трунова 2006 Особенности альтернативных путей ФС-1 — зависимого электронного транспорта у двух генотипов картофеля в условиях in vitro Физиоюгиярастений. Т 53, №4 , с 485-492

3 MC Синькевич. АН Дерябин, С В Климов, HB Астахова, ТИ Трунова 2007 Особенности С02-газоо6мена и структурной организации хлоропластов растении картофеля, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей, в условиях гипотермии Физиология растений Т54,№4, с 511-516

4 AN Deryabm, IМ Dubimna, Е A Burakhanova, N V Astakhova, Е Р Säbel'niko va, M S Sinkevich. TI Trunova 2004 Tolerance to low temperature of potato plants transformed with yeast mvertase gene Acta Agrobotamca V 57 №1-2 P 31-39

5 A Deryabin, I Dubimna, E Burakhanova, N Astakhova, E Sabel'mkova, M Sinkevich, Г Trunova 2004 Studying of cold tolerance of potato plants transformed with yeast invertase gene. Agriculture V 2 №86 P 22-29

6 АН Дерябин, M С Синькевич, H В Астахова, ТА Суворова, 1И Трунова 2006 Экспрессия гена инвертазы дрожжей в листьях картофеля изменяет устойчивость растений к окислительному сгрессу Труды Региональной конференции Орел, с 36-41

7 M С Синькевич, А Г Машковский, А H Дерябин, Е Б Сальникова, Трунова I И 2006 Экспрессия 1ена дрожжевой ннвертазы в листьях картофеля влияет на активность ферментов ашиоксндашной системы при гипотермии. Труды Региональной конференции Орел, с 8-11

8 А H Дерябин, H В Астахова, И M Дубинина, E А Ьураханова, M С Синькевич, Г П Алиева, Т И Трунова 2004 Влияние трансформации растении картофеля геном инвер1азы дрожжей на индукцию устойчивости к гипотермии Тезисы докладов Международной конференции «Проблемы физиологии растений Севера» Петрозаводск, с 59

9 A Deryabin, I Dubmina, E Burakhanova, N Astakhova, E Sabelnikova, M Sinkevich, T Trunova 2004 1 olerance increase of potato plants (Solatium Tuberosum L cv Desiree) expressing yeast-derived invertase to low temperature Abst Int Sc Conf «Growth and development of plants Theoretical and practical problems», Babtai, p 34

10 M S Sinkevich, A N Deryabin, TI Trunova 2004 Potato plants transformation with yeast invertase gene increase resistance to low temperatures Abst International symposium «Transgenic plants and biosafety», Moscow, p 22

11. M С Синькевич, АН Дерябин, И M Дубинина, E А Бураханова, Т И Трунова 2005 Роль продуктов экспрессии гена дрожжевой инвертазы в формировании устойчивости к гипотермии трансформированных растений картофеля Материалы VI Международного симпозиума (г Пущино) «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва, изд-во РУДН Tic 370-373

12. МС Синькевич, А Н Дерябин, И М Дубинина, Е А Бураханова, Н В Астахова, Е Б Сальникова, Т И Трунова 2005 Влияние трансформации растений картофеля геном инвертазы дрожжей на перекисное окисление липидов и активность су-пероксиддисмутазы при гипотермии Тезисы Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, с 157

13. А Н Дерябин, М С Синькевич. 2005 Роль Сахаров в низкотемпературной адаптации растений картофеля, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей Тезисы Международной научной конференции студентов и аспирантов «Экологические проблемы устойчивого развития агросферы», Харьков, с 7

14 М С Синькевич. АН Дерябин, ТИ Трунова 2006 Особенности окислительного стресса растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы Материалы I (IX) Международной Конференции молодых ботаников, С -Петербурге 197

15 АН Дерябин, МС Синькевич, Е11 Сабельникова, ЕА Бураханова, ИМ Дубинина, ТИ Трунова 2006 Роль Сахаров в устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией Ростов-на-Дону Тезисы конференции «Физиология растений - фундаментальная оспова современной фи-тобиотехнологии» (годичное собрание ОФР), с 77

16. М С Синькевич, А Г Машковский, А Н Дерябин, Т И Трунова 2006 Влияние гипотермии на активность СОД, каталазы и содержание перекиси водорода в растениях картофеля, экспрессирующих ген дрожжевой инвертазы Тезисы конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехно-логии» (годичное собрание ОФР), с 150

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Синькевич, Максим Сергеевич

I. Введение

Список сокращений

II. Обзор литературы

2.1. Механизмы холодостойкости

2.2. Современные концепции повреждающего действия холода

2.3. Окислительный стресс и антиоксидантная система

2.4. Трансгенные растения как объект исследования

III. Объекты и методы исследования

3.1. Объекты исследования

3.2. Культивирование растений

3.3. Измерение скорости генерации супероксидного аниона

3.4. Определение содержания перекиси водорода

3.5. Определение интенсивности перекисного окисления липидов

3.6. Определение активности супероксиддисмутазы

3.7. Определение активности каталазы

3.8. Определение активности гваякол пероксидазы

3.9. Определение содержания различных форм Сахаров (в тканях листьев растений)

3.9.1. определение содержания глюкозы

3.9.2. определение сахарозы и фруктозы

3.10. Определение интенсивности фотосинтеза

3.10.1. чистая продуктивность фотосинтеза

3.10.2. определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по скорости СОг-газообмена

3.11. Модельная система

3.11.1. Накопление МДА при действии реактива Фентон

3.11.2. Скорость генерации супероксидного аниона при действии реактива Фентон

3.12. Определение устойчивости по выходу электролитов

3.13. Измерение функциональной активности элементов ЭТЦ хлоропла-стов

3.14. Определение активности различных форм инвертаз

3.15. Измерение скорости роста

3.16. Метод электромикроскопического и морфометрического исследования ультраструктуры хлоропластов

3.17. Статистическая обработка данных 51 Приборы и реактивы

IV. Результаты и обсуждение

4.1. Характеристика объекта исследования

4.1.1. Активность инвертаз

4.1.2. Содержание внутриклеточных Сахаров

4.1.3. Скорость роста

4.1.4. Интенсивность фотосинтеза и дыхания 58 4.1.5 Ультраструктура хлоропластов

4.2. Определение относительной устойчивости контрольных и ВЗЗ-inv растений к низкой температуре

4.2.1. Влияние гипотермии на проницаемость клеточных мембран контрольных и ВЗЗ-inv растений

4.2.2. Влияние гипотермии на интенсивность перекисного окисления липидов в листьях контрольных и ВЗЗ-inv растений

4.3. Развитие окислительного стресса в растениях картофеля при действии гипотермии

4.3.1. Влияние гипотермии на интенсивность перекисного окисления липидов

4.3.2. Влияние гипотермии на скорость образования супероксидного аниона

4.3.3. Влияние гипотермии на содержание Н£>

4.4. Активности ферментов антиоксидантной системы исследуемых генотипов при гипотермии

4.4.1. Активность супероксид дисмутазы

4.4.2. Активность каталазы

4.4.3. Активность пероксидазы гваякола

4.5. Влияние углеводного питания на антиоксидантную систему контрольных и ВЗЗ-inv растений

4.5.1. Содержание растворимых внутриклеточных углеводов при различной концентрации сахарозы в питательной среде

4.5.2. Скорость роста контрольных и ВЗЗ-inv растений на средах с 0%, 2% и 4% сахарозы при 22?С

4.5.3. Функциональная активность ЭТЦ хлоропластов

4.5.4. Влияние углеводного питания на скорость генерации супероксидного аниона

4.5.5. Влияние углеводного питания на интенсивность ПОЛ

4.5.6. Влияние углеводного питания на активность супероксид дисмутазы в листьях контрольных и ВЗЗ-inv растений

4.5.7. Влияние углеводного питания на активность каталазы в листьях контрольных и ВЗЗ-inv растений

4.6. Влияние Сахаров, накопленных под действием адаптирующих температур, на антиоксидантную систему контрольных и ВЗЗ-inv растений

4.6.1. Изменения содержания внутриклеточных Сахаров при адаптации

4.6.2. Интенсивность С02-газоо6мена при пониженных положительных температурах

4.6.3. Влияние адаптирующих температур на ультраструктуру хлоропластов

4.6.4. Динамика интенсивности ПОЛ при адаптации

4.6.5. Влияние адаптирующих температур на активность супероксид ди ему тазы

4.6.6. Влияние адаптирующих температур на активность катал азы

4.7. Моделирование окислительного стресса

4.7.1. Применение модельной системы Фентон для сравнения устойчивости к окислительному стрессу

4.7.2. Изменение содержания растворимых внутриклеточных Сахаров при краткосрочном охлаждении

Введение Диссертация по биологии, на тему "Окислительный стресс и антиоксидантная роль сахаров при гипотермии у растений картофеля"

Действуя на растительный организм, неблагонриятные факторы среды вызывают в нем разнообразные ответные реакции. Многие из них, к которым растение эволюционно не приснособлено, могут оказывать стрессовое воздействие на организм, нриводящее к различным физико-химическим аномалиям, новреждению их структур и метаболических функций [Левитт, 1983]. К одним из наиболее значимых факторов, определяющих географическое распространение и продуктивность растений, относится температура [Туманов, 1979; Дроздов и др., 1964; Sakai, Larcher, 1987]. Действие низких температур, вымерзание посевов и насаждений наносят сельскому хозяйству большой ущерб, что усугубляется снижением урожайности тех растений, которые выживают. Пшеница, кукуруза, рис, картофель и соя пять самых употребляемых человеком в пишу растений. Все они подвергаются воздействию пониженных температур различной длительности, причем из них только пшеница обладает относительно высокой степенью устойчивости к низким температурам [Levitt, 1980; Сандухадзе и др., 2003]. В силу этого внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии. На основании ряда исследований выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизм повреждений от мороза, а также устойчивость и адаптацию некоторых видов к отрицательным температурам [Levitt, 1980; Lyons, 1973; Туманов, 1979], тогда как устойчивость группы холодостойких растений к низким положительным температурам изучена гораздо меньше [Дроздов и др., 1984]. По этой причине исследованиям физиологических и молекулярных основ холодостойкости следует уделить больше внимания. Существует также потребность в точной оценке адаптивного потенциала этих растений, которая невозможна без изучения их устойчивости и повреждений при стрессовых воздействиях окружающей среды.Общий адаптационный синдром, чаще называемый как стресс, представляет собой комплекс ответных реакций организма на внещние воздействия, по силе превосходящие обычные физиологические и при длительном воздействии заканчивающиеся развитием патологий [Селье, 1972]. Представления о действии на клетки низких температур и морозов значительно изменились и расщирились в связи с установлением взаимосвязей между различными видами стресса и выделения группы нсспецифических реакций. Одной из таких общих ответных реакций на понижение температуры, является накопление защитных веществ, в частности, растворимых углеводов [Туманов, 1979]. Углеводный метаболизм и функции Сахаров были изучены практически только на морозостойких растениях, для которых характерно накопление больших количеств Сахаров (до 50% от сухой массы), что необходимо для противодействия морозу, а не низким положительным температурам [Levitt, 1980]. Применительно к теплолюбивым и холодостойким растениям при низкотемпературном стрессе в основном рассматривалась роль липидов, тогда как у последних, в том числе типичного представителя картофеля, в период адаптации тоже происходит увеличение содержания Сахаров, но в гораздо меньшей степени [Дерябин и др., 2003]. К неспецифическим реакциям относится также обусловленный накоплением активных форм кислорода (АФК) окислительный стресс, который зафиксирован как один из самых ранних эффектов охлаждения [Scandalios, 1993]. Он развивается у холодостойких растений сильнее, чем у морозоустойчивых, и в ряде случаев служит причиной повреждения растений [Мерзляк, 1989; Лукаткин, 2002, а]. Для защиты от этого стресса в растениях существует антиоксидантная система, состоящая из ферментов (супероксиддисмутаз, каталазы, пероксидаз и др.) и низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбата, глютатиона, каротиноидов, флавинов и др.). Однако, способностью к нейтрализации АФК, характерной для низкомолекулярных антиоксидантов, обладает ряд выполняющих и другие функции веществ: полиамины [Кузнецов и др. 2006], стероиды [Кузьменко и др., 1997], полиспирты [Duncan, Widholm, 1991]. Имеются данные, полученные в модельных опытах, о способности растворимых углеводов к перехвату АФК [Аверьянов, Лапикова, 1989]. Тем не менее, особенности окислительного стресса и антиоксидантной системы при гипотермии у холодостойких растений, в отличие от теплолюбивых, изучены недостаточно. Роль растворимых Сахаров в связи с окислительным стрессом почти не рассматривалась, чему, возможно, в числе прочих причин, препятствовало многообразие их функций в живых клетках, В связи с выше изложенным, целью нашей работы было изучить особенности окислительного стресса, вызванного гипотермией, и роль Сахаров в системе аптиоксидантной защиты на примере типичного представителя группы холодостойких растений картофеля, с углеводным метаболизмом, измененным вследствие экспрессии гена инвертазы дрожжей, В задачи работы входили: подтверждение экспрессии введенного гена инвертазы дрожжей,, сравнительная оценка ранних физиологических реакций растений картофеля на действие низкой температуры, оценка интенсивности окислительного стресса и эффективности антиоксидантной системы исследуемых генотипов, выявление роли Сахаров в противодействии окислительному стрессу. Решению этих задач может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом [Sonnewald et al,,1997].с п и с о к СОКРАЩЕНИЙ АФК активные формы кислорода АТФ аденозинтрифосфат ДКС дальний красный свет ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота МДА малоновый диальдегид НАДФ никотинамидадениндинуклеотид фосфат ПОЛ перекисное окисление линидов ПЦР полимеразная ценная реакция СОД сунероксиддисмутаза ФС1, ФСП фотосистемы I и II, соответственно ЧПФ чистая продуктивность фотосинтеза ЭТЦ электрон-транснортная цепь

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Синькевич, Максим Сергеевич

V. выводы

1. Экспрессия встроенного гена инвертазы дрожжей (апопластная локализация фермента) в листьях растений ВЗЗ-mv картофеля подтверждена высокой активностью всех типов инвертаз (особенно кислых). Следствием этого было накопление Сахаров, увеличение размера крахмальных зерен в хлоропластах, торможение роста растения. В отличие от нетрансформированного контроля, в оптимальных для роста условиях в листьях трансформантов наблюдали ингибирование фотосинтеза (по принципу обратной связи), повышенное содержание реакционных центров ФС1, накопление восстановленных эквивалентов (NADPH, Fd и др.), усиление темнового дыхания.

2. В условиях жесткого (-7°С), но кратковременного (30 мин) охлаждения у растений дикого типа развивался окислительный стресс, выражавшийся в увеличении содержания активных форм кислорода (02" и Н202) и усилении интенсивности ПОЛ. В отличие от контроля, у ВЗЗ-mv растений окислительный стресс был менее выражен по всем этим показателям.

3. В условиях гипотермии у контрольных растений наблюдали инактивацию ключевого фермента антиоксидантной системы - супероксиддисмутазы (СОД), тогда как в листьях трансформанта ее активность сохранялась на уровне неохлажденного варианта. При этом активности каталазы и пероксидазы у обоих генотипов повышались.

4. В оптимальных для роста растений условиях (22°С) с увеличением концентрации сахарозы в среде выращивания (0, 2,4 и 6%), и соответственно в тканях листьев исследуемых генотипов, наблюдали снижение образования АФК, интенсивности ПОЛ и активности СОД, причем у трансформантов это проявлялось в большей степени.

5. С использованием модельной системы, генерирующей оксиданты (Н202 и ОН*) подтверждена большая устойчивость трансформантов к окислительному стрессу. Учитывая, что трансформанты отличались от контрольных растений в первую очередь большим содержанием Сахаров в клетках листьев, полученные результаты опытов подтверждают их участие в антиоксидантной системе клетки в качестве низкомолекулярных антиоксидантов.

6. Сравнительный анализ полученных данных по влиянию низких температур на исследуемые генотипы картофеля, благодаря использованию трансформантов с введенным геном инвертазы дрожжей выявил важную роль Сахаров в устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией, проявившуюся в стабилизации клеточных мембран и перехвате АФК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на большое количество работ посвященных исследованию окислительного стресса, возникающему при охлаждении теплолюбивых растений, особенности этого процесса и механизмы защиты от него у холодостойких растений практически не изучены, при этом данные о роли Сахаров в системе антиоксидантной защиты клеток при гипотермии не найдены. В связи с этим нами проведено комплексное изучение особенностей развития окислительного стресса, вызванного гипотермией, и антиоксидантной системы у картофеля, как типичного представителя холодостойких растений.

Использование трансформированных растений картофеля с углеводным метаболизмом, измененным путем введения гена инвертазы дрожжей, позволило не только изучить роль Сахаров в защите растений от окислительного стресса, вызванного гипотермией, но и выявить их функцию в качестве низкомолекулярных антиоксидантов. В дополнение к этому, содержание Сахаров модифицировалось путем выращивания на средах без сахарозы (автотрофный тип питания), с 2-мя, 4-мя и 6% (смешанный и гетеротрофный типы питания), а также длительной экспозицией при низкой адаптирующей температуре. Все эти приемы позволили выявить прямую связь между содержанием Сахаров в листьях исследуемых генотипов и устойчивостью растений к окислительному стрессу, который определяли по содержанию веществ-индикаторов: активных форм кислорода и малонового диальде-гида, а также по активности ключевых ферментов антиоксидантной системы {СОД, каталазы, гваякол пероксидазы).

Показано, что окислительный стресс у холодостойких растений, в отличие от теплолюбивых, при тех же температурах выражен слабее. Поэтому для выявления различий между генотипами были применены более жесткие, но краткосрочные режимы охлаждения.

Проведенные исследования позволили выявить, что, в отличие от теплолюбивых растений, для которых противодействие окислительному стрессу связано с повышенной активностью антиоксидантных ферментов, у типичного представителя холодостойких растений - картофеля - акцент смещается в сторону низкомолекулярных веществ, на фоне стабилизации активности СОД. Данные, полученные как на растениях in vitro, так и в модельных опытах, позволяют считать, что такими веществами могут быть растворимые углеводы (например, глюкоза и сахароза), альтернативно участвующие в перехвате АФК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синькевич, Максим Сергеевич, Москва

1. Аверьянов А.А., Лапикова В.П. (1989) Взаимодействие Сахаров с гидро-ксильным радикалом в связи с фунгитоксичностью листьев. Биохимия. 54 (10): 1646-1651.

2. Аверьянов А.А. (1991) Активные формы кислорода и иммунитет растений. Успехи современной биологии, 111 (5); 722-736.

3. Аверьянов А.А., Николаев О.Н., Лапикова В.П. (2000) Антиокислительная защита возбудителя пирикуляриоза необходима ему для преодоления окислительной обороны растений риса. Журнал Русского общества фитопатологов. 1(1): 4550.

4. Александров В.Я. (1963) Цитофизиологические и цитоэкологические исследования устойчивости растительных клеток к действию высоких и низких температур. Труды БИНАН СССР. 4(16): 234-280

5. Александров В.Я. (1975) Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 330с. ■

6. Барабой В.А. (1991) Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. Успехи современной биологии, 111 (6): 923-931.

7. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. (1982) Труды Московского общества испытателей природы. Изд. «Наука», т. 57,240 с.

8. Боровский Т.Б., И. В. Ступникова, А. И. Антипина,О. С. Анучина, В. К. Войников (2005) Ассоциация дегидринов с митохондриями пшеницы при низкотемпературной адаптации. Физиология растений, 52(2): 221-226.

9. Бутенко Р.Г. (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Уч. пособие, Москва, «РБК-пресс» (МГУ), 159 с.

10. Бухов Н.Г., Егорова Е.А. (2005) Идентификация ферредоксин-зависимого циклического переноса электронов вокруг ФС I в интактных листьях с помощью кинетики темнового восстановления Р700+. Физиология растений. 52,325-330.

11. Владимиров Ю.А. (2000) Свободные радикалы в биологических системах. Соросовский образовательный журнал, 6 (12): 13-19.

12. Генкель П.А., Кушниренко С.В. (1966) Холодостойкость растений и термические способы ее повышения. М. Наука, с.223I

13. Гималов Ф.Р., Баймиев А.Х., Матниязов Р.Т., Чемерис А.В., Вахитов В.А.2004) Начальные этапы низкотемпературной индукции экспрессии гена белка хо-лодового шока капусты. Биохимия, 69 (5): 706-711.

14. Гудвин. Э., Мерсер Т. (1986) Введение в биохимию растений; в 2-х тт., т.1. Пер. с англ. М., Мир. 393 с.

15. Деви С.Р., Прасад М.Н.В. (2005) Антиокислительная активность растений Brassica juncea, подвергнутых действию высоких концентраций меди. Физиология растений, 52 (2): 233-237.

16. Дроздов С.Н., Сычева З.Ф., Будыкина Н.П., Курец В.К. (1977) Эколого-физиологические аспекты устойчивости растений к заморозкам. JI. Наука, 228 с.

17. Дроздов С.Н., Курец В.К., Титов А.Ф. (1984) Терморезистентность активно вегетирующих растений. Л. Наука, 186 с.

18. Егорова Е.А., Николаева М.К., Бухов Н.Г. (2005) Природа многокомпонентного восстановления Р700+ у листьев бобов после освещения дальним красным светом. Физиология растений. 52,492-498.

19. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов JI.B. (1982) Перекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами. Физиология растений, 29, 1045-1052.

20. Жолкевич В.Н. (1955) К вопросу о причинах гибели растений при низких положительных температурах. Труды ИфР АН СССР, 9, 3-28

21. Касперска-Палач А. (1983) Механизм закаливания травянистых растений. Холодостойкость растений, под. Ред. Г.А. Самыгина, М.: Колос, с. 112-123.

22. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. (1993) Роль низкомолекулярных ан-тиоксидантов при окислительном стрессе. Успехи современной биологии, 113 (4): 456-470.

23. Климов С.В., Трунова Т.И., Мокроносов А.Т. (1990) Механизм адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды через изменение до-норно-акцепторных отношений. Физиология растений, 37: 1024-1035.

24. Климов С.В. (2003) Холодовое закаливание растений результат поддержания повышенного отношения фотосинтез/дыхание при низких температурах. Известия АН, сер. биол. 1:57-62.

25. Колупаев Ю.В., Трунова Т.И. (1992) Особенности метаболизма и защитные функции углеводов растений в условиях стрессов. Физиология и биохимия культурных растений, 24 (6): 523-533.

26. Красавцев О.А. (1988) Свойства плазмалеммы морозостойких растительных клеток. Успехи современной биологии. 106 (1): 143-157.

27. Кретович В.Л. (1952) Учебник «Основы биохимии растений» М.; изд. Наука, 218 С.

28. Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николенко И.А., Корпиец Г.В., Холодова

29. Ю.Д. (1997) Влияние витамина Дз и экдистерона на свободно-радикальное окисление липидов. Биохимия, 62 (6): 712-715.

30. Курсанов А.Л. (1984) Эндогенная регуляция транспорта ассимилятов и до-норно-акцепторные отношения у растений. Физиология растений, 31 (3 ): 579-595.

31. Левитт Дж. (1983) Холодостойкость растений, под. ред.: сборник, пер. с англ.; изд-во «Колос», 318 с.

32. Лось Д.А. (2005) Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений. Вестник РАН, 75 (4): 338-345.

33. Лукаткин А.С., Шаркаева Э.Ш., Зауралов О.А. (1993) Динамика изменения экзоосмоса электролитов из листьев кукурузы при различной интенсивности холо-дового стресса. Физиология растений, 40,770-775.

34. Лукаткин А.С. (1998) Влияние экзогенных антиоксидантов на холодовое повреждение теплолюбивых растений. V Международная конф. «Биоантиоксидант» (Москва), тез. докл., с. 293-294.

35. Лукаткин А.С. (2002, а) Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс, изд-во Мордовского университета, Саранск, 208 с.

36. Лукаткин А.С. (2002, б) Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 1. Образование активированных форм кислорода при охлаждении растений. Физиология растений. 49,697-702

37. Лукаткин А.С. (2003) О развитии повреждений у растений кукурузы при внезапном и постепенном охлаждении. Сельскохозяйственная биология 5, 63-68.

38. Лукаткин А.С. (2005) Инициация и развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. Физиология растений. 52(4): 608-613.

39. Мерзляк М.Н. (1989) Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. Итоги науки и техники. ВИНИТИ сер. Физиология растений, 6, 1-168.

40. Мерзляк М.Н. (1999) Активированный кислород и жизнедеятельность растений. Соросовский образовательный журнал, 9,20-26

41. Николаева М.К., Бухов Н.Г., Егорова Е.А. (2005) Активности нециклического и альтернативных путей фотосинтетического транспорта электронов у листьев бобов, выращенных при различных интенсивностях света. Физиология растений, 52,485-491.

42. Пескин А.В., Столяров С.Д. (1994) Окислительный стресс как критерий оценки окружающей среды. Известия АН сер. биол., 4,588-595.

43. Сандухадзе Б.И., Рыбакова М.И., Морозова З.А. (2003) Научные основы селекции озимой пшеницы в нечерноземной зоне России. Москва МГИУ, 426 с.

44. Селье Г. (1972) На уровне целого организма. М.: Наука, 122 е.

45. Скулачев В.П. (2001) Явления запрограмированной смерти. Митохондрии, клетки, органы: роль АФК. Соросовский образовательный журнал, 7 (6): 4-10.

46. Тарчевский И.А. (2001) Метаболизм растений при стрессе, изд-во «Фэн», Казань, 448 с.

47. Тарусов Б.Н. (1970) О механизме холодо- и жароустойчивости растений. Сельскохозяйственная биология. 5(5): 674-679.

48. Третьяков Н.Н., Паничкин JI.A., Кондратьев М.Н. и др. (2003) Сельскохозяйственная биотехнология, под. ред. Третьякова Н.Н. Высшая школа. 472 с.

49. Трунова Т.И. (1984) Физиологические и биохимические основы адаптации растений к морозу. Сельскохозяйственная биология, 4, 3-10.

50. Трунова Т.И. (2007) Растение и низкотемпературный стресс, М.; изд. Наука,60 с.

51. Туманов И.И. (1979) Физиология закаливания и зимостойкости растений. М.: Наука, 350 с.

52. Туркина Н.В., Соколова С.В. (1971) Методы определения моносахаридов и олигосахаридов. Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука, С. 734.

53. Фердман Д.Л. (1966) Учебник «Биохимия». М.; изд. Наука, 588 с.

54. Хочачка П., Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация, пер. с англ.; изд-во «Мир», 508 с.

55. Часов А.В., Гордон Л.Х., Колесников О.П., Минибаева Ф.В. (2002) По клеточной поверхности генератор супероксид-аниона в корневых клетках пшеницы при раневом стрессе. Цитология, 44 (7): 691-696.

56. Чиркова Т.В. (2002) Физиологические основы устойчивости растений. Учебное пособие, 240 с.

57. Кузнецов Вл.В., H.JI. Радюкина, Шевякова Н.И. (2006) Полиамины при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция. Физиология растений. 53(5): 658-683

58. Alam В., Jacob J. (2002) Overproduction of photosynthetic electrons is associated with chilling injury in green leaves. Photosynthetica. 40: 91-95

59. Alberdi M., Corcuera LJ. (1991) Cold acclimation in plants. Phytochemistry, 30 (10): 3177-3184.

60. Aragao F.J.L., Brasiliero A.C.M. (2002) Positive, negative and marker-free strategies for transgenic plant selection. Brazilian journal of plant physiology, 14 (1): 110

61. Arnon D.I., Chain P.K. (1977) Regulation of ferredoxin-catalized photosynthetic photophosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 102, 133-138.

62. Bowler C., Van Montagu M., Inze D. (1992) Superoxide Dismutase and Stress Tolerance. Annual review of plant physiology and plant molecular biology. 42: 83-116.

63. Bowler C., Camp W. van, Montague M. van, Inze D. (1994) Superoxide dismutase in plants. Critical Rev. Plant Sci., 13,199-218.

64. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants, chap. 22 In: Responses to abiotic stresses. American society of plant physiologists, Rockville, Mariland.

65. Bukhov N.G., Carpentier R. (2004) Alternative Photosystem I-Driven Electron Transport Routes: Mechanisms and Functions. Photosynth. Res. 82, 17-33.

66. Bussis D., Heineke D., Sonnewald U., Willmitzer L., Raschke K., Heldt H.-W. (1997) Solute accumulation and decreased photosynthesis in leaves of potato plants expressing yeast-derived invertase either in the apoplast or cytosol. Planta, 202, 126-136.

67. Caffery M., Tonseca V., Leopold A.C. (1988) Lipid-sugar interactions, reveaauce to anhydrous biology. Plant physiology, 86,754-758.

68. Charles S.A., Halliwell B. (1980) Effect of hydrogen peroxide on spinach (Spinacia oleracea) chloroplast fructose bisphosphatase. Biochem J. Aug 1; 189(2):373-6.

69. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. (1983) Involvement of abscisic acid in potato cold acclimation. Plant Physiol. 71 (2): 362-365.

70. Choi S.M., Jeong S.W., Jeong W.J., Kwon S.Y., Chow W.S., Park Y.I. (2002) Chloroplast Cu/Zn-superoxide dismutase is a highly sensitive site in cucumber leaves chilled in the light. Planta Dec; 216 (2):315-24.

71. Cohen C.K., Norvell W.A., Kochian L.V. (1997) Induction of he root cell plasma membrane ferric reductase. Plant Physiol., 114,1061-1069.

72. Couee I., Sulmon L., Gouesbet G., Amrani A. el. (2006) Involvment of soluble sugars in reactive oxygen species balance and responces to oxidative stress in plants. Journal of experimental botany, 57(3): 449-459

73. Delaney T.P., Uknes S., Vernooij В., Friedrich L., Weymann K., Negrotto D., Gaffney Т., Gutrella M., Kessmann H., Ward E., Ryals J. (1994) A central role of salicylic acid in plant-disease resistance. Science. 266,1247-1250.

74. Dickinson C.D., Altabella Т., Chrispels J.MJ. (1991) Slow-growth phenotype of transgenic tomato expressing apoplastic invertase. Plant Physiology, 95,420-425.

75. Ding C.K., Wang C.Y., Gross K.C., Smith D.L. (2002) Jasmonate and salicylate induce the expression of pathogenesis-related-protein genes and increase resistance to chilling injury in tomato fruit. Planta. 214 (6): 895-901

76. Duncan D. R., Widholm J. M. (1991) Proline is not the primary determination of chilling tolerance induced by mannitol or abscisic acid in regenerable maize callus cultures. Plant Physiol. 95 (4): 1284-1287.

77. Eaks I.I. (1980) Effect of chilling on respiration and volatiles of California Lemon fruit. J. Am. Soc. Hortic. Sci, 105,445-466.

78. Fenton H.J.H. (1894) Oxidation of tartaric acid in the presence of iron. J. Chem. Soc., 65,899.

79. Fenton H.J.H. (1899) Oxidation of certain organic acids in the presence of ferrous salts. Proc. Chem. Soc., 25,224.

80. Flint H.L., Boyce B.R., Beattie D.J. (1967) Index of injury a useful expression of freezing injury to plant tissues as determined by the electrolytic method. Can. J. Plant Sci. 47,229-230.

81. Frankel E.N. (1985) Chemistry of free radical and singlet oxidation of lipids. Progress in lipid research. 23: 197-221.

82. Fridovich I. (1975) Superoxide dismutases. Annual review of biochemistry. 44, 147-159.

83. Fridovich I. (1986) Superoxide dismutase.; Adv Enzymol В 58, 62-97.

84. Fork D.C., Herbert S.K. (1993) Electron Transport and Photophosphorylation by Photosystem I in vivo in Plants and Cyanobacteria Photosynth. Res. 36, 149-168

85. Foyer C. (1993) Ascorbic acid. In: Antioxidants in higher plants. R.G. Alscher, J.L. Hess (edits). CRC Press, Boca Raton, p. 31-58.

86. Foyer C.H., Harbinson. (1994) Oxygen metabolism and the regulation of photo-synthetic electron transport. In: Foyer C, Mullineaux P. editors. Causes of Photooxidative

87. Stresses and Amelioration of Defense Systems in Plants. Boca Raton, FL: CRC Press; p. 1-42.

88. Gechev Т., Willekens H., Montagu M. Van, Inze D., Camp W. Van, Toneva V., Minkov I. (2003) Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress. J. Plant Physiol. May; 160(5); 509-515.

89. Gomez L.D., Vanacker H., Buchner P., Noctor G., Foyer C.H. (2005) Intercellular distribution of glutathione synthesis in maize leaves and its response to short-term chilling.

90. Gonzales-Meler M.A., Ribascarbo M., Giles L., Siedow J.N. (1999) The effect of growth and measurement temperature on the activity of the alternative respiratory pathway. Plant Physiol. 120 (3): 765-772.

91. Graham D., Patterson B.D. (1982) Responses of plants to low, nonfreezing tem-perarures: proteins, metabolism, and acclimation. Annu. Rev. Plant Physiol, 33,347-372.

92. Haber F., Weiss J. (1934) The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts. Proc. Royal Soc. A., 147,332

93. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. (1989) Free radicals in biology ^nd medicine. Oxford, Clarendon press.

94. Нага M., Terashima S., Fukaya Т., Kuboi Т. (2003) Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco. Planta Jun; 217 (2): 290-8.

95. Hedden P. (2001) Hormones at Mendel's birthplace. Trends in plant science, 6 (11); 498-500.

96. Hepburn H.A., Nayllor F.L., Strokes D.I. (1986) Electrolyte leakage from winter barley tissue as indicator of winterhardiness. Ann. Appl. Biol. 108,164-165.

97. Herbert S. K., Sacksteder C., Kramer D. M. (1997) Accelerated cyclic electron transport is an early effect of chilling in chilling sensitive plants. Plant. Physiol. 114(3): 1104.

98. Klenell M., Morita S., Tiemblo-Olmo M., Muhlenbock P., Karpinski S., Kar-pinska B. (2005) Involvement of the Chloroplast Signal Recognition Particle-cpSRP43 in

99. Acclimation to Conditions Promoting Photoxidative stress in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. Jan; 46(1): 118-29.

100. Klimov S.V., Astachova N.V., Trunova T.I. (1999) Changes in Photosynthesis Dark Respiration Rates and Photosynthetic Carbon Partitioning in Winter Rye and Wheat Seedlings during Cold Hardening. J. Plant Physiol. 155,734-739.

101. Kratsch H.A., Wise R.R. (2000) The Ultrastructure of Chilling Stress. Plant, Cell Environ. 23,337-350.

102. Kumar G.N., Knowles N.R. (1993) Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers. Plant Physiology. 102, 115-124.

103. Markowski A., Augustyniak G., Janowiak F. (1990) Sensitivity of different spiecies of field crops to chilling temperature: III ATP content and electrolyte leakage from seedling leaves. Acta Physiol. Plant. 12,167-173.

104. Matthews D., Jones H., Gans P., Coates S., Smith L.M. (2005) Toxic secondary metabolite production in genetically modified potatoes in response to stress. J. Agric. Food Chem., 53 (20): 7766-7776.

105. McKersie B.D. (1996) Oxidative stress. Dept of Crop Science, University of Guelph. 38 p.

106. Minorski P.V. (1985) An heuristic hypothesis of chilling injury in plants: A role for Calcium as the primary physiological transducer of injury. Plant Cell environ. 8,75-94.

107. Morris G.J., Clarke A. (1981) Effects of low temperatures on biological membranes. Academic Press, London, 432 p.

108. Murashige Т., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15,473-497.

109. Neil S.J., Desikan R., Clarke A., Hurst R.D., Hancock J.T. (2002) Hydrogen peroxide and nutric acid as signaling molecules in plants. Journal of experimental botany, 53 (372): 1237-1247.

110. Okane D., Gill V., Boyd P., Burdon B. (1996) Chilling, oxidative stress and antioxidant responses in Arabidopsis thaliana callus. Planta, 198 (3): 371-377.

111. Pauli W. (1925) Uber den Zusammenhang des Abschlusses der Elektronengruppen im Atom mit der Komplexstruktur der Spektren. Z.f. Phys., 31,765-783.

112. Platt-Aloia K.A., Thompson W.W. (1987) Freeze-fracture evidence for lateral phase separation in the plasmalemma of chilling-injured avocado-fruit. Protoplasma, 136,71-80

113. Prasad Т.К., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. (1994) Evidence for chilling induced oxidative stress on maize seedlings and regulatory role of hydrogen peroxide. Plant Cell, 6 (1): 65-74.

114. Pray or W.A. (1979) Why is the hydroxide radical the only radical that commonly adds to DNA. Free Rad. Boil. Med., 4,219-223.

115. Raison J.K., Berry J.A., Armond P.A., Pire C.S. (1980) Membrane properties in relation to the adaptation of plants to temperature stress. Adaptation of plants to water and high temperature stress: 261-273.

116. Reverberi M., Fanelli C., Zjatic S., Briganti S., Picardo M., Ricelli A., Fabri A.A. (2005) Relationship among lipoperoxides, jasmonates and indole-3-acetic acid formation in potato tuber after wounding. Free rad. Res., Jan., 39(6): 637-647.

117. Rocha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W., Stratmann M., Schell J., Will-meitzer L. (1989) Both Developmental and Metabolic Signals Activate the Promoter of a Class I Patatin Gene. EMBO /.; 8,23-29.

118. Roitsch Т., Balibera M.E., Hoffmann M., Proels R., Sinha A.K. (2003) Extracellular invertase: Key metabolic enzyme and PR protein. Journal of experimental botany. 54,513-524.

119. Roitsch Т., Gonzalez M.-C. (2004) Function and regulation of plant invertases: sweet sensations. Trends in plant science, 9 (12): 606-613.

120. Sakai A., Larcher W. (1987) Frost Survival of Plants. Responses and Adaptation to Freezing Stress. 321 p.i

121. Scandalios J.G. (1990) Response of plant antioxidant defense genes to environmental stress. Adv. Genet., 28,1-41.

122. Scandalios J.G. (1993) Oxygen Stress and Superoxide Dismutases. Plant Physiology. 101,7-12.

123. Scandalios J.G. (2005) Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res. Jul; 38 (7): 9951014.

124. Schreiber U., Schliwa U., Bilger W. (1986) Continious Recording of Photochemical and non-photochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching with a new type of modulation Fluorometer. Photosynth. Res. 10, 51-62.

125. Schweinichen C. v., Buttner M. (2005) Expression of a plant cell wall invertase in roots of Arabidopsis leads to early flowering and increase in whole plant biomass. Plant biol. 7,469-475.

126. Senaratna Т., Touchell D., Bunn E., Dixon K. (2000) Acetyl salicylic acid (aspirin) and Salicylic acid induce multiple stress tolerance in bean and tomato plants. Plant growth regul., 30 (2): 157-161.

127. Seppanen M.M., Majaharju M., Somersalo S., Pehu E. (1998) Freezing tolerance, cold acclimation and oxidative stress in potato: paraquat tolerance is related, to acclimation but is poor indicator of freezing tolerance. Physiol. Plant., 102,454-460.

128. Sonnewald U., Hajirezaei M.-R., Kossmann J., Heyer A., Trethewey R.N., Willmitzer L. (1997) Increased potato tuber size resulting from apoplastic expression of yeast invertase. Nature biotechnology, 14,794-797.

129. Stallings W.C., Patteridge K.A., Strong R.K., Ludwig M.L. (1984) Manganese and iron superoxide dismutase are structural homologs. J. Biol. Chem. 259, 1069510699.

130. Stefanowska M., Kuras M., Kacperska A. (2002) Low Temperature-induced Modifications in Cell Ultrastructure and Localization of Phenolics in Winter Oilseed Rape (Brassica napus L. var. oleifera L.) Leaves. Ann. Bot. 90, 637-645.

131. Strauss G., Hauser H. (2006) Stabilization of lipid bilayer vesicles by sucrose during freezing. Acad. Sci. USA, April, 83,2422-2426.

132. Sturm A. (1999) Invertases. Primary structures, functions, and rojes in plant development and sucrose partitioning. Plant physiol., 121,1-7.

133. Sturm A., Tang G.-Q. (1999) The sucrose cleaving enzymes of plants are crucial for development, growth and carbon partitioning. Trends in plant science, 4(10): 401-407

134. Terzaghi W.B., Fork D.C., Berry J.A., Field C.B. (1989) Low and high temperature limits to PSII: a survey using transparinatic acid, delayed light emission and F0 chlorophyll fluorescence. Plant Physiol. 91,1494-1500.

135. Thompson G.A. (1989) Molecular changes in membrane lipids during cold stress // Environmental stress in plants: biochemical and physiological mechanisms. NATO ASI ser. G: Ecol. Sci. Berlin: Springer-Verlag. 19,249-257.

136. Tjus S.E., Scheller A.V., Birger B.A., Moller L.B. (2001) Active oxygen produced during selective excitation of photosystem II. Plant Physiol., 125,2007-2015.

137. Vranova E., Inze D., Breusegem F.V. (2002) Signal transduction during oxidative stress. Journal of experimental botany, 53 (372): 1227-1236

138. Wei Chi. (2006) Enhancement of NADP-malik enzyme in transgenic rice induced the accumulation of reactive oxygen species. Russian Journal of Plant physiology, 53(3): 364-370.

139. Winter H., Huber S.C. (2000) Regulation of sucrose metabolism in higher plants: localization and regulation of activity of key enzymes. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 5,253-289.

140. Whitmarsh J. (2000) Electron Transport and Energy Transduction. Photosynthesis: A Comprehensive Treatise./ Ed. Radhavendra AS. Cambrige Univ. Press, P. 87-107.1. VII. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

141. А.Н. Дерябин, М.С. Синькевич, Н.Г. Бухов, Т.Н. Трунова. 2006. Особенности альтернативных путей ФС-1 зависимого электронного транспорта у двух генотипов картофеля в условиях in vitro. Физиология растений. Т. 53, №4 , с. 485492

142. А.Н. Дерябин, М.С. Синькевич. Т.Н. Трунова. 2007 Влияние Сахаров на развитие окислительного стресса, вызванного гипотермией (на примере растений картофеля экспрессирующих ген инвертазы дрожжей). Физиология растений. Т. 54, №1, с. 39-46

143. A.N. Deryabin, I.M. Dubinina, Е.А. Burakhanova, N.V. Astakhova, E.P. Sa-bel4nikova, M.S. Sinkevich. T.I. Trunova. 2004. Tolerance to low temperature of potato plants transformed with yeast invertase gene. Acta Agrobotanica. V.57. №1-2. P.31-39.

144. A. Deryabin, I. Dubinina, E. Burakhanova, N. Astakhova, E. Sabernikova, M. Sinkevich, T. Trunova. 2004. Studying of cold tolerance of potato plants transformed with yeast invertase gene. Agriculture. V.2. №86. P.22-29.

145. M.S. Sinkevich, Deryabin A.N., Trunova T.I. 2004 Potato plants transformation with yeast invertase gene increase resistance to low temperatures. Abst. International symposium «Transgenic plants and biosafety», Moscow, p.22.

146. М.С. Синькевич, Дерябин А.Н., Трунова Т.И. 2006. Особенности окислительного стресса растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы. Материалы I (IX) Международной Конференции молодых ботаников, С.-Петербург, с. 197