Цитофизиологические механизмы холодового повреждения и защитных реакций у теплолюбивых растений

Лукаткин, Александр Степанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цитофизиологические механизмы холодового повреждения и защитных реакций у теплолюбивых растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Цитофизиологические механизмы холодового повреждения и защитных реакций у теплолюбивых растений"

ЛУКАТКИН Александр Степанович

ЦИТОФШИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ У ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории цитофизнологни 1| клеточной инженерии кафелры ботаники и физиологии растений биологического факультета Мордовского государственного университета им.Н.П.Огарева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.Н. Трунова;

доктор биологических наук, профессор М.И. Рыбакова;

доктор биологических наук Е.Б. Кириченко.

Ведущая организация - Всероссийский научно исследовательский институт удобрений и агропочвоведения им Д.Н. Прянишникова.

Защита состоится •{ и 1998 г. в ^часов

на заседании диссертационного совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева. Адрес: 127550, г. Москва, Тимирязевская ул., д.49, Ученый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научне библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан ^у^^ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^ ^ Л.С.Лосев!

AH'iya.iMiorii» проблемы. Условия внешней среды претерпевают периодиче-:кие и случайные колебания, и отклонения от благоприятных для жични растений юрм часто достгают опасных амплитуд (Бмбль, 1965; Jlapxep,l978; Chopin, 1991; Jolinert et al-, 1995). Многие факторы среды, к которым растение эволюционно не фнспособлено, оказывают стрессовое воздействие на организм, приводящее к эизико-химичсским нарушениям в клетках, повреждению их структур и метабо-[ических функций (Levitt, 1980) и снижению или полному подавлению образована органического вещества (Timmermaiin,Steelin,1984).

Для средней полосы России одним из основных сдерживающих развитие рас-сниеводства является температурный фактор (Коровин, 198-1). Теплолюбивые астения, родиной которых являются тропики и субтропики, ннтродуцированы в олее высоких широтах, и в этих условиях не могли выработать способность про-ивостоять пониженным положительным температурам. Ряд культур, такие как ис, кукуруза, томат, огурец, хлопчатник, соя и др., повреждается в ходе выдергивания при температурах выше точки замерзания тканей, но ниже 15°С; такое овреждение называют Холодовым (Levitt,1980; Raison,Lyons,1986).

Действие пониженных температур в умеренном климате приводит к сниже-ию или полной потере урожая теплолюбивых растений - либо за счет прямого овреждения, либо замедленного созревания (Wilson, 1985). Даже небольшие по-ижения температуры, не вызывающие видимых повреждений таких растений, нижают их продуктивность до 50% (Коровин,1969). Очевидно, что проблема ус-эичивости к пониженным положительным температурам, часто действующих на астения в весенний и осенний периоды во многих регионах нашей страны, имеет 1жное значение для практического растениеводства.

Для успешного выращивания многих культурных растений в средней полосе оссии и дальнейшего продвижения зоны их возделывания на север необходимо эмплексное исследование физиологического действия пониженных температур ä теплолюбивые растения с целью повышения их холодоустойчивости (Генкель, ушниренко,1966; Дроздов и др.,1984). При этом обязательно четкое понимание хщессов, посредством которых пониженные температуры приводят к повреждено, и механизмов, лежащих в основе устойчивости к охлаждению (Lyons et al., )79). На этой основе возможна разработка методик определения и повышения ггойчивости к пониженным температурам с последующим их использованием в гаграммах селекции.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было выясне-ie закономерностей влияния пониженных положительных температур на цито-«иологические процессы у теплолюбивых растений и разработка подходов к травленному повышению холодоустойчивости. Для достижения этой цели были доделены следующие задачи:

- раскрытие механизмов инициации холодового повреждения с участием но-IB кальция, активированных форм кислорода (ЛФК) и функционированием ан-оксидаатных систем защиты клетки;

- выяснение •закономерностей изменений цитофизиологических процессо при различной длительности п интенсивности охлаждении и скорости пониженн: температуры;

- выяснение скорости репарации повреждений на клеточном и организме» ном уровнях в последействии охлаждения различной интенсивности;

- изучение онтогенетических и сортовых особенностей изменений цитофи зиологических процессов при холодовом повреждении у теплолюбивых растений;

- построение физиологической и математических моделей инициации : развития холодового повреждения на клеточном и тканевом уровнях;

- разработка методов определения интенсивности холодового повреждения сравнительной оценки холодоустойчивости сортов культивируемых растений клеточных линий;

- изучение действия экзогенных соединений различной природы на цитофи экологические процессы при холодовом повреждении;

- выяснение возможности направленного повышения резистентности тепле любивых растений к действию пониженных температур посредством скрининга i vitro холодоустойчивых клеточных линий.

Основные положения работы, выносимые на защиту.

1. В основе нарушении физиологических процессов у теплолюбивых раст( ний, вызываемых действием пониженных температур, лежат изменения цитоф1 зиологических параметров на уровне клеточных мембран. Первичными индуьстс рами холодового стресса являются внутриклеточные реакции, связанные с образе ванием АФК и участием ионов кальция.

2. Наблюдаемые цитофизиологические изменения нелинейно зависят от дл1 телыюст-и, напряженности и скорости возникновения холодового стресса. Пр действии пониженных температур, не приводящих к гибели растений, наблюдае' ся преимущественно трехфазная реакция изменений цитофизиологических npi цессов, отражающая ответ на шоковое воздействие, акклимационные перестрой« и повреждение.

3. Цитофизирлогические реакции на охлаждение имеют генетическ! (сортовые), онтогенетические и эпигенетические (в культуре in vitro) различи чувствительность к пониженным температурам может быть изменена температу] ными и химическими (регуляторы роста, антиоксиданты) воздействиями.

4. На основании изменений цитофизиологических параметров возможна Д1 агностика холодового повреждения и холодоустойчивости сортов и селекционш го материала теплолюбивых растений, а также клеточных линий в культуре vitro.

5. Клеточная селекция на холодоустойчивость дает возможность получен! линий теплолюбивых растений с пониженной чувствительностью к охлаждению.

Научная новизна. Получены фундаментальные научные результаты, позп ляющие понять первичные механизмы реакции клеток на холодовой стресс, пр следить последующее развитие повреждения (вторичные эффекты охлаждена выяснить «клад эндо- и экзогенных факторов в повышение холодоустойчивое!

тактных растений и клеточных популяций. Выявлены сортовые и онтогепетиче-кис различия изменений цитофизиологических процессов при охлаждении. При гом впервые изучено влияние пониженных температур на активность K/\Mg2+ - и а2+ -АТФаз в листьях растений проса, огурца и кукурузы. Показана роль ионов а"* и супероксидного анионрадикала в инициации холодового повреждения. В инамикс охлаждения установлена трехфазная реакция клеток па холодовой шок, гражающая стрессовые ответы, акклимационные изменения и обратимое повре-депие. Выявлены различия по длительности сохранения нарушений (в последей-гвии охлаждения) в зависимости от интенсивности холодового стресса. Рассчи-1ны математические закономерности изменений цитофизиологических парамет-эв при различных режимах охлаждения. Разработана концепция инициации и азвития холодового повреждения теплолюбивых растений на клеточном и ткане-эм уровне.

Выявлены ключевые этапы холодового повреждения (связанные с повыше-яем уровня АФК), воздействие на которые приводит к изменению реакции кггений на пониженные температуры. Разработана стратегия подбора соедине-ш, повышающих холодоустойчивость. Дано физиологическое обоснования зотекторного действия регуляторов роста при охлаждении растений.

Практическое значение работы. Результаты настоящей работы использова->i для разработки методов оценки холодоустойчивости сортов и селекционного ггериата теплолюбивых растений, основанных на изменениях цитофизиологиче-:их показателей (проницаемости мембран, интенсивности перекисного окисле-1я липидов - ПОЛ, внутриклеточного pH), на один из которых получено автор-:ое свидетельство (A.c. СССР N 1732857, 1992 г.).

Разработано практическое обоснование подбора химических соединений, юсобных снизить чувствительность к холодовому повреждению у различных ви->в теплолюбивых растений. Экспериментально показано антистрессовое дейст-ie различных синтетических регуляторов роста, в основном цитокининовой при-

1ДЫ.

Показана принципиальная возможность направленного повышения холодо-тойчивости теплолюбивых растений на основе клеточной селекции (скрининга еточных культур после охлаждения).

Полученные данные могут быть использованы для создания новых техноло-й возделывания теплолюбивых растений в зонах риска пониженных температур, также при конструировании холодоустойчивых растений методами клеточной и нной инженерии.

Материалы диссертационной работы использованы при чтении общих курсов >изиология растений", "Цитология и клеточная инженерия" и спецкурсов кологическая физиология" и "Экология растений" в Мордовском госуниверси-ге, а также в лабораторных практикумах по этим и другим курсам.

Апробацпя работы. Основные положения работы были представлены и до-жены на Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным фактом среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984), межвузовских семинарах-

совещаниях "Гмюмембраны" (Саранск, 1984, 1985), конференции "Физиолого-био-химическне основы иммунитета к грибным болезням растений" (Уфа, 1988), IV конференции молодых ученых ИГ1ФС (Ilyminio,I9S9), XII научной конференшп "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа 1989), конференции молодых учёных "Основные направления селекции и семепо водства овощных культур" (Одинцово, 1989), научно-практической конфереицш "Молодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны" (Немчиновка

1989), III и IV Всесоюзных конференциях молодых ученых по физиологии расти тельной клетки (Москва, 1989, 1990), XIV научной конференции молодых учены: "Повышение эффективности производства овощей и бахчевых культур" (Мытищи

1990), Втором съезде Всесоюзного общества физиологов растении (Минск, 1990) Третьем съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербхрг 1993), Ежегодных симпозиумах ОФР РАН "Физико-химические основы фнзиоло гии растении" (Пущино, 1995; Пенза,1996; Москва,1997), Третьей и Четверто! Международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений (Москва, 1995, 1997), Международном совещании "Дыхание растений: Физиолс гические и экологические аспекты" (Сыктывкар, 1995), Второй межвузовско конференции "Влияние физических й химических факторов на рост и развити сельскохозяйственных растений" (Орехово-Зуево, 1996), XII - XXVII Отаревски чтениях (Саранск, 1983 - 1998), научных семинарах Мордовского отделения Вес союзного и Российского общества физиологов растений (Саранск, 1989 - 1997).

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 61 печатно работе. Получено 1 авторское свидетельство.

Структура II объем работы. Диссертация изложена на 323 страницах маин полисного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, рекомендаций по и< пользованию результатов исследования, выводов, списка литературы (522 наим< новация, в том числе 385 иностранных). Работа содержит 55 таблиц и 44 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Основными объектами исследования служили растения нескольких сортс огурца (Cucumis sativus L.), проса (Panicum miliacetim L.) и кукурузы (Zea mays L. отличающиеся по холодоустойчивости. В качестве относительно устойчивых и пользовали сорта Алтайский ранний 166 и Вязниковский 37 (огурец), Горьковскч 43 и Быстрое (просо); чувствительных - Неросимый 40 и Нежинский 12 (огурет Саратовское 2 и Скороспелое 66 (просо). У кукурузы применяли сорт Днепропе ровская 247 и гибрид Буковинский 2.

Растения выращивали в условиях вегетационного опыта (использовали таю растения, выращенные в полевых условиях) в сосудах с почвой при температу] 22-25°С, освещенности люминесцентными лампами 5000 лк при непрерывне световом дне или фотопериоде 12-14 ч (этиолированные проростки - в темнот« влажности почвы 60-80% от полной влагоемкости и влажности воздуха око. 80%. Растения кукурузы также выращивали методом водной культуры в рулон

1Сурбицкий,Идыш,1968) при температуре 251'С без освещения и на свету жвешеппость 5000 лк) па полном питательном растворе Киопа и его вариантах с зменением концентрации кальция от 0 до 30 мМ.

Охлаждение растений проводили в холодильных камерах при двух темпера-урных режимах: 1) в течение 3 д по 16 ч в сутки (с промежуточным отогревом) ри температуре 1-2"С (просо) и 3-4"С (огурец); 2) при температурах от -I до 3"С ля кукурузы, от 2 до 4"С для огурца и 2СС для проса с варьированием экспозиции г 0,5 до 24 ч. Контролем служили растения, находившиеся в по время в темноте ри температуре 25"С. Различную скорость понижения температуры создавали эмешенпем сосудов с растениями в холодильную камеру с температурой Г'С шезапное охлаждение) или 22-24"С с последующим ее снижением со скоростью ,6°С/ч (медленное охлаждение). Физиологические определения проводили до ох-шдения, сразу по его окончании и спустя 1,3, 7, 10 суток после возврата расте-ий в тепло, только на растениях, не проявлявших видимых повреждений.

В качестве объектов использовали также каллусные линии, полученные от герильных пробирочных растений огурца сорта Вязниковский 37 и кукурузы сор-I Буковинский 2 на среде Мураснге-Скуга с различным содержанием фитогор-онов. Реакцию качлусных тканей на холодовой стресс определяли после охлаж-:ния в темноте при температуре 1°С в течение 4 ч (огурец) или 24 ч (кукуруза) по лходу электролитов из клеток, приросту каллусной ткани за 10 сут после охлаж-!ния или восстановлению трифенилтетразолий-хлорида (ТТХ) (То\уП1,Магиг, >75; Еникеев и др., 1995).

При обработке семян и растений использовали экзогенные регуляторы роста, ^фективную концентрацию которых определили в экспериментах по низкотем-:ратурно.му прорастанию (мг/л): индолллуксусную кислоту (ИУК, 0,5), индолил-1сляную кислоту (ИМК, 0,5), нафтилуксусную кислоту (НУК, 1), гибберелловую юлоту (ГК, 0,1), кинетин (0,5), 6-бензиламинопурин (БАП, 0,1), картолин 2 (0,1), ¡артазин (0,1), полистимулин К (0,1), оксикарбам (0,1), дифенилмочевину (ДФМ, 5), гидрел (1), хлор.холинхлорид (ССС, 0,5). Препараты применяли путем пред-»севнои обработки семян (замачиванием в течение 8 ч) или опрыскивания расте-щ за 1 сут перед охлаждением дозой 2 мл раствора/растение. Оценку степени кодового повреждения проводили визуальным способом (по количеству повре-1ешшх и погибших растений после охлаждения при ранжирующих температу-х), а также по изменениям цитофизнологических параметров: проницаемости еточных мембран и интенсивности ПОЛ.

Для модификации ПОЛ в высечках и отделенных листьях в качестве проок-данта использовали Ре2+-аскорбат (500 мкМ), антиокидантов (АО) - аскорбино-ю кислоту (750 мкМ), глутатион (100 мкМ) и бензойную кислоту (50 мкМ).

Проницаемость мембран и степень холодового повреждения определяли по 1ходу электролитов из листьев в дистиллированную воду при 4-часовой экспо-ции на кондуктометре СЖ-102 с расчетом в процентах от полного выхода элек-олитов (определенного после разрушения мембран кипячением). Степень ходового повреждения клеток оценивали по величине "коэффициента повреждаемо-

сти" (КГ1) по формуле: Ьо - Ьо

КП =------------х 100%,

100-Ц,

где Ьо - выход электролитов из охлажденной ткани; Ц> - из контрольных рас тений. При этом рассчитанные значения повреждения (КП) отражают выход элеь тролитов, вызванный действием охлаждения.

Активность Мц^-завнснмой. К*-активир\емой АТФазы определяли по мете дике (1.со[1агс1,}1о1сЬк15я,1976) с некоторыми модификациями в гомогенате листьс или во фракции клеточных стенок с плазмалеммой. Отщепленный фосфат опред< ляли по модифицированному методу (ГчБке^иЬЬагслу, 1925). При определени субстратной специфичности АТФаз использовали ГТФ, УТФ, р-глицерофосфа фруктозо-1,6-дифосфат в концентрациях, равных АТФ (3 мМ), в ингибиторно анализе - азид натрия (1 мМ), ортованадаг натрия (50 мкМ) или оуабаин (10 мкМ

Активность Са2*-АТФазы определяли по отщеплению Р„ в средах с добавл( нием СаСЬ (2,25 мМ) или ЭГТА (0,5 мМ) по модифицированному методу Фиск< Суббароу.

Содержание белка определяли по модифицированному методу Лоури (Ьо\У1 е1 а1.,1951) после осаждения белка 30% ТХУ.

Внутриклеточный рН определяли прижизненным окрашиванием 0,05% не! тральным красным (Зауралов,Заурапова,1968) с количественной оценкой по шкаг растворов индикатора, приготовленного на трис-НС1 буферах в диапазоне рН 5,! 8,0, и расчетом средних значений рН (по 200-300 клеткам каждого опыта).

Интенсивность ПОЛ в высечках листьев определяли по накоплению малош вого диальдегида (МДА) реакцией с тиобарбнтуровой кислотой (Жиров и др 1982). .

Содержание супероксидного анион-радикала (Ог~) определяли по окислент адреналина в адренохром (Прайор,1979).

Активность супероксид-дисмутазы определяли по модифицированной мст< дике (Китаг,Юю\у1ез,1993) в неочищенной цитозолыюй фракции, получение центрифугированием при 7000g в течение 15 мин.

Содержание кальция в растительном материале определяли трилонометрич! ским титрованием озоленной навески (Радов и др.,1985) или кальций-селективны электродом; содержание кальция в тканевых компартментах определяли экстра! цией ионов из высечек на качалке.

Ростовые параметры организма (высоту растения, площадь листовой повер: ности, сырую и сухую массу надземной части) определяли на 15 растениях кажд| го варианта перед охлаждением и спустя 10 суток после него. Определения кл< точного роста проводили на постоянных препаратах верхней части стебля с кон; сом нарастания. Фиксацию и проводку материала проводили по З.П.Паушевс (1970) с некоторыми модификациями, окрашивание препаратов гематоксилином по М.Н.Прозиной (1960); на препаратах подсчитывали число делящихся клеток расчетом митотического индекса и измеряли длину клеток в стадии растяжения.

Содержание свободных фптогормонов определяли по биотестам: ауксинов -о приросту отрезков колсонтилей пшеницы, цитокишшовпо синтезу хлорофилла семядолях огурца (Зауралов,Г1угаев,1990).

Приторности и статистическая обработка результатов. Все опыты проводили нескольких биологических повторностях, каждый опыт повторяли не менее 3 аз. В таблицах и на графиках представлены средние значения из всех опытов с их гаидартнымн ошибками (Лакин,1980). Достоверность различий между варианта-и оценивали по t-критсрню Стыодента.

РЕЗ УЛ ЫАТЫ 11ССЛ Е ДО ВЛИП П 1. И ЗМЕНЕНИЯ ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА

Проницаемость клеточных мембран. Одной нз причин повреждения расте-ий при действии неблагоприятных факторов среды, в том числе пониженных гмператур, является нарушение клеточных мембран, проявляющееся в повыше-ни их проницаемости (усилении выхода электролитов). В результате трехдневно-э охлаждения, не вызывавшего видимых повреждений растений проса и огурца, роницаемость мембран увеличивалась; при этом величина КП, показывающего ыход электролитов, индуцированный охлаждением, зависела от фазы развития шс.1). Поскольку усиление выхода ионов при действии повреждающего фактора казывает на низкую устойчивость растения к этому стрессору (Lyons, 1973; Simon, 974; Paul!, 1981; Wang, 1982), то в те фазы, когда КП велик, ткани растения менее стойчивы к действию пониженных температур. Это означает, 4to минимальная олодоустойчивость листьев у растений проса наблюдается в фазу трех листьев и огурца - в фазу первого настоящего листа; максимальная - в фазу выхода в трубу у проса и цветения у огурца.

j 4

Фазы развития

I- три листа, 2- выход в трубку, 3- выметывание, 4- цветение

з 4

Фазы развкгтмя

I- первый лист, 2- три листа, 3-бутошпация, 4- цветение Рис. I. Величина коэффициента повпе.ж-даемости посж трехдневного ох.ш-сдеиия растений проса (Л) и огурца (1>) в разные фазы развития. Цифрами на ->афике обозначены сорта: Л: I - 1'орькожкое 43; 2 - Саратовское 2; 3 - Скоро-че.юе 66; />: I - Атшиский ранний 166; 2 - Вязниковскии 37; 3 - Нежинский 12; - Нероашый 40.

При анализе сортовой реакции на охлаждение обнаружено, что величина К у растений устойчивых сортов проса и огурца достоверно ниже, чем у более те! лолюбивых. После возврата охлажденных растений в оптимальную температур происходило быстрое снижение величины КП у устойчивых сортов и замедление снижение, а иногда небольшое увеличение - у теплолюбивых.

Экзоосмос электролитов в динамике охлаждения при 2°С 9-дневных растени проса сорта Саратовское 2 сильно возрастал в первые 1-2 ч охлаждения, нескольь снижался к 4 ч, после чего вновь увеличивался до 24 ч охлаждения. Быстрое ув> личение в начальный период охлаждения можно рассматривать как шоковую р| акцию клеток на внезапное охлаждение; небольшое последующее уменьшение Э1 зоосмоса отражает перестройку мембран в измененных условиях существовани и наконец, медленное возрастание выхода электролитов в последние 12-24 ч о; лаждения указывает на исчерпание акклимационных возможностей растения и н; чало холодового повреждения.

У растений кукуруз самое сильное и быстрс повышение проницаемое! было при температуре -1°( вызывающей гибель раст ний при экспозициях евьш 4 ч (рис.2). Температура О" оказала сходное действие I экзоосмос электролито выдерживание растений пр этой температуре свыше 1 ч приводило к их гибел! При температуре 1°С гибел растений не наблюдал]

Выход электролитов, % от полного

8 10 12 1« 16 18 20 22 24 Продолжительность охлаждения, ч

Рис.2. Экзоосмос электролитов из высечек листьев кукурузы сорта Днепропет/ювская 247, охлажденных при раттчиых температуре и длительности экспозиции.

первоначальное резкое увеличение выхода электролитов (в первые 2 ч охлажд ния) сменилось линейным участком до 12 ч охлаждения, после чего проница мость вновь возрастала. В ходе охлаждения при 2°С повышение проницаемости первый час сменилось небольшим спадом после 2 ч охлаждения, затем выхе электролитов почти линейно возрастал. В последействии пониженных температ) экзоосмос электролитов постепенно снижался, при этом прослеживалась прям; зависимость изменений проницаемости от длительности холодовои экспозици: Очевидно, необратимых повреждений мембран не происходило, т.к. нормализ; цню функции или тенденцию к этому наблюдали во всех вариантах опыта.

Изменения экзоосмоса электролитов, отражающие нарушения функционир« вания мембран при охлаждении, могут происходить вследствие повышения па' сивпом проницаемости мембран - в результате возникновения пор или разрыве мембран (Simon,1974; Quinn,1988), открывания ионных каналов, вследствие изм! нений мембранного потенциала (Nel!es,Laske,1982; Полевой и др.,1990) или mi

ификации липидиого микроокружения каналов (Simon,1974; Lyons et al.,1979), пи подавления активного транспорта ионов, направленного в клетку (Kasamo, 588; Yosliida et al., 1989; Matsunra-Endo et al., 1992). Вероятно, первоначальное зеличение выхода электролитов связано с деполяризацией мембран, открываю-1ей ионные каналы и усиливающей тем самым пассивную утечку ионов по гради-1ту концентрации, и инактивацией АТФаз. Возрастание экзосмоса электролитов ри дчительном охлаждении может быть отнесено к повреждению мембран.

Активность гзы. Пониженные температуры влияют на актив-

эсть многих ферментов. В растениях проса и огурца активность ТФазы, связанной с плазмалеммой (показано ингибиторным анализом), при :мпературах инкубации 2-10°С практически отсутствовала.

После 3-дневного охлаждения растений проса активность АТФазы у сорта эрьковское 43 была повышена в 6,5 раз, а у сортов Скороспелое 66 и Саратов-сое 2 снижена.относительно контроля. В последействии охлаждения активность ермента в листьях устойчивого сорта постепенно уменьшалась до 10-го дня noie возврата в тепло, но всегда оставалась выше неохлажденного контроля. У рас-:ний чувствительных сортов наблюдали постепенное небольшое возрастание ак-

1вности

Активность фермента во фракции клеточных стенок с плазмалеммой из ли-ъев огурца сразу по окончании трехдневного охлаждения была снижена, более [ачителыю - у теплолюбивого сорта (рис.3). В последействии охлаждения на-нодали быстрое повышение ак-[вности АТФазы у холодо-:тойчивого сорта Алтайский шний 166, и сниженную актив-)сть у растений сорта Нежин-:ий 12.

Таким образом, пониженные мпературы, инактивируя

АТФазу, тем самым ин-бируют активное поступление в клетку; в результате возрас-ет петто-утечка через клеточ-ie мембраны. По окончании лаждения у более устойчивых ртов активность АТФазы резко зрастала, что свидетельствует о пнем начале нормализации со-

Рис. 3

активность

Сразу 'з 7 Ю

после 1

охлажд. Дни после охлаждения . Влияние трехдневного охлаждения на К*.МцГ' -АТФ-азы фракции меточных стенок с тазма1емлюи из листьев контрастных по холодоустойчивости сортов огурца: 1 - Алтайский ранта'! 166; 2 - Нежинский 12.

ржания К+ (и Н+) в клетке и, следовательно, упорядочении ее метаболизма; это впадало со снижением величины КП. В то же время активность фермента у рас-ний чувствительных сортов после окончания охлаждения оставалась поннжен-й, указывая на более сильное повреждение.

Внутриклеточный pli. После трехдневного выдерживания тсплолюбнвь растении в условиях пониженных температур в тканях листьев обнаружено знач тельное снижение внугриклеточного рП. У проса он уменьшался на 0,6 - 1,5 с pH в фазу трех листьев (наибольшее смещение pH-наблюдали в клетках мезофи ла, самое малое - в проводящих пучках), в фазу выметывания снижение pH бы: минимальным, и в фазу цветения величина смещения pH снова возрастала, огурца снижение внутриклеточного pH было максимальным в фазу первого н стоящего листа (на 0,3 - 1,1 ед. pH), и по мере прохождения фаз развития иелич на смещения постепенно уменьшалась, достигая минимума в фазы бутонизации цзетения. Различия между контрастными по холодоустойчивости сортами проса огурца были достоверными во все фазы развития.

После переноса охлажденных растений в тепло происходил постепенный во врат внутриклеточного pH к уровню неохлажденного контроля, однако скорое этого процесса зависела от фазы развития и чувствительности сорта (у более у тойчивых сортов полная нормализация внутриклеточного pH наблюдалась на 10-й дни после охлаждения, тогда как у менее устойчивых она была неполной).

Известно, что даже небольшие изменения внутриклеточного pH влияют i проницаемость клеточных мембран, транспорт ионов, активность ферме!m (Иост,1975), т.е. на функции клетки, нарушающиеся под влиянием пониженш. температур (Генкель,Кушниренко,1966; Christiansen, 1979). Очевидно, больно смещение внутриклеточного pH при охлаждении отражает более значительное п вреждение; оно совпадало с сортовыми и онтогенетическими зависимостями чу ствительности к пониженным температурам.

dH. ел. оН ..и

Рис. 4. Величина внутриклеточного рИ в листьях проса (А) и огурца (Б) а д начике охлаждения. 'Гкани: 1 - эпидермис, 2 - проводящие пучки, 3 - мезо<рилл

В динамике холодового выдерживания растений проса, огурца и кукуруз наблюдали тканеспецифичное, прогрессирующее со Бременем снижение внутр клеточного рН в листьях, наиболее быстрое в мезофилле и эпидермисе и заме ленное - в проводящих пучках (рис.4). 13 последействия охлаждения обнарунач тенденция к восстановлению внутриклеточного рН до уровня неохлажденно] контроля во всех вариантах опыта, однако скорость этого процесса зависела <

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Длительность охлаждения, ч.

0 2 4 6 в 10 12 14 16 18 20 22 24 Длительность оклаждемич, ч

1ПТСЛЫШСТН н температуры экспозиции: удлинение периода охлаждения и более гзкая температура замедляли нормализацию р! 1.

Значительное закислепие цитоплазмы при охлаждении может быть следстви-I как увеличения проницаемости тоноиласта для протонов и кислот (Уо51пс1а е1 ,1979), так и инактивации мембраиосвязанных ЛТФаз, в основном 1Г-помпы :осс1н е( а!.,1983; Кахапю,1988; УобЫЛз е1 а1.,1989; Кияшко,Кияшко,1990; Э51и'с1а, 1991; Вгаиег с( а1.,1991; Уо*1и11а,Ма151шга-Еп1.!о,1991; Ма|51шга-Еп(1о е( ,1992; Ка5ато,1994, Такес1а с( а1.,1995). С закисленнем цитоплазмы тесно со-)яжено возрастание вакуолярного рН (Уо5!нс1а,1995).

Измерения транспорта протонов из высечек листьев огурца во внеклеточную еду (определяемого деятельностью Н+-насосов) показали, что скорость этого юцесса, константная при температуре 24"С, линейно понижалась при 2"С, при-■м это снижение прогрессировало с удлинением холодовой экспозиции. Это яв-ется существенной, хотя и не единственной, основой снижения цитоплазмати-ского рН при охлаждении теплолюбивых растений.

Псрскпснос окисление лнпндов. После 3-дневного охлаждения растений юса и огурца содержание МДА в листьях значительно увеличивалось, причем менения по фазам развития растений совпадали с таковыми, выявленными при учении проницаемости мембран (наиболее сильное повышение - в фазу грех ли-ьев у проса и в фазу первого настоящего листа у огурца). Низкотемпературное иление ПОЛ у чувствительных сортов во все фазы развития было значительно пне, чем у устойчивых. В последействии длительного охлаждения растений со-ржание МДА в листьях снижалось, что указывает на отсутствие необратимых рушений липидного комплекса; скорость процесса была неодинаковой у раз-IX сортов (быстрее у устойчивых) и в разные фазы.

В динамике охлаждения 9-дневных растений проса при температуре 2°С ин-нсивность ПОЛ усиливалась после кратковременного (0,5-1ч) выдерживания,

несколько снижалась спустя 2 ч охлаждения, после чего монотонно увеличивалась до 24 ч охлаждения (рис.5). Сходные изменения содержания МДА отмечены в ходе охлаждения молодых растений огурца и кукурузы. После возврата охлажденных растений в тепло наблюдали тенденцию к снижению интенсивности ПОЛ, при этом скорость нормализации содержания МДА практически не зависела от длительности хо-лодового стресса, но зависела от темпе-

Рис.5. Влияние длительности ох- РатУРь|-ждепия при ГС на интенсивность Очевидно, что холодоустойчивость )Л в листьях проса: 1 - Саршноаское растений связана с их способностью 2 - быстрое противостоять интенсифицирующему

Содержание МДА, мкМ/г сырой массы

2 4 6 8 10 12 14 16 И 20 22 24

Длительность охлаждения, ч

ПОЛ действию охлаждения посредством повышенной АО-активности клеток. ! норме эта активность не проявлялась (поскольку уровень МДА в листьях разны сортов в контроле практически не различался), но при охлаждении увеличение сс держания перекисей у холодоустойчивых сортов сдерживалось. Поскольку МД образуется при перекисном окислении полиненасыщенных жирных кислот, большая часть аиилсодержащих липидов с двойными связями входит в состг мембран, то увеличение продуктов ПОЛ при действии пониженных температу свидетельствует о серьезных повреждениях мембранных структур.

Ростовые параметры клетки п организма. Рост растений при действии п< ниженных температур замедляется, особенно это касается деления и растяженг клеток. У 11-дневных растений кукурузы охлаждение при температурах 0 и 2° вызывало снижение митотического индекса меристематических клеток конуса н; растания (сильнее при 0°С), прогрессирующее с удлинением холодовой экспоз! ции, в результате чего к концу периода охлаждения он был в 3,2 раза ниже, чем растений контрольного варианта. После возврата в оптимальные условия обнар; жена тенденция к усилению роста делением в апикальной меристеме охлаждо ных растений, и в последействии коротких холодовых экспозиций наблюдав нормализацию митотической активности. Сходная зависимость от длительное! холодовой экспозиции обнаружена и для уменьшения размеров клеток в стадг растяжения: после 24-часового охлаждения при 2"С размеры клеток в этой стадг были в 1,9 раза меньше контроля, а после 12-часового выдерживания при 0°С - в 2 раза. В последействии охлаждения происходило постепенное увеличение размеров клеток во всех вариантах опыта, но с различной скоростью. Митотическая активность более чуствительна к охлаждению по сравнению с ростом растяжением.

В качестве интегрального показателя действия пониженных температур на целое растение исследовали

пп и пост за 10 суток после хо полово- """ Расп'с""и аУР'<а "а "["'Ростза 10 су прирос I за ю суток после холодово тт после „срсиоса в таио: 1 - высот,

го выдерживания. Охлаждение рас- растении; 2 - пшщаОь пистьсв. тений проса, огурца и ку курузы приводило к торможению роста, зависящему I длительности холодовой экспозиции; достоверные различия проявлялись начин; с 0,5-4 ч охлаждения (для различных параметров) и усиливались с удлинением п риода охлаждения (рис.6).

2. ПЕРВИЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИНДУКЦИИ ХОЛОДОБОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

Роль эндогенного п экзогенного кальция в повреждении. Согласно гипот зе Р.Мтогеку (1985), реакция растительной клетки на холодовой стресс определ

Длительность охлаждения, ч

Рис.6Ллштие длительности о.хлажОс

:тся нарушениями Са^-гомеостаза (увеличением концентрации цитозольного Са"* [Са2+],„гг ). Для проверки этого положения исследовали влияние охлаждения на наивность Са2*-АТФазы и степень хололового повреждения у растений кукурузы : различным кальциевым статусом.

Активность Си2'-ЛТФты. Активность Са:+-АТФазы из листьев растений ку-гурузы сорта Днепропетровская 247 при температурах инкубации 5-10"С была 1чень низкой. 24-часовое выдерживание растений при температуре ГС приводило ; резкому снижению активности фермента. В последействии охлаждения наблю-[ алось восстановление активности Са"*-АТФазы при рН 6,0 и отсутствие этого у эермента при рН 8,0. Вероятно, эти ферменты принадлежат к различным клеточ-1ы.м компартментам и неодинаково реагируют на пониженные температуры.

Пониженные температуры, резко снижая активность Са"+-АТФазы, приводят : торможению выкачивания ионов Са~+ через плазмалемму в апопласт и/или сек-естирования цитозольного кальция во внутриклеточные депо (митохондрии, эн-юплазматический ретикулум, вакуоль), что повышает [Са2+],0„ и усиливает по-реждение. Сниженная активность Са"+-АТФазы в течение длительного времени юсле возврата охлажденных растении в тепло свидетельствует о том, что даже в тсутствие внешних проявлений холодового повреждения нарушения кальциевого бмена будут резко отрицательно влиять на метаболизм клетки. Таким образом, нактиваиия Са2+-АТФазы играет важную роль в холодовом повреждении тепло-юбивых растений; повышение ее активности, направленное на снижение уровня итозольного кальция, является элементом системы защиты клетки от поврежде-:ия.

Влияние кальциевого статуса растений кукурузы па холодочое повреждение. 1ри вырашиванин проростков кукурузы в водной культуре с варьируемым содер-санием катьиия в среде они имели различный кальциевый статус, т.к. уровень того иона в растениях изменялся пропорционально дозе кальция в питательном астворе. Оптимальной для роста и развития кукурузы была концентрация 6 мМ. [олодовое повреждение этиолированных растений кукурузы после 24-часового ыдерживания при 2°С было самым высоким в вариантах без кальция, с 0,6 мМ и 0 мМ кальция, и минимальным - в варианте с дозой 6 мМ. Таким образом, уве-ичение или уменьшение содержания кальция в растении снижает холодоустой-ивость. Видимо, повышенная концентрация кальция усиливает повреждение, а едостаток Са2+ неблагоприятно влияет на состояние клеточных мембран при ох-аждении, т.к. вызывает нарушение белок-липидных взаимодействий, электрофи-юлогичсских и других свойств мембраны (Poovaiah,Reddy,1987).

Содержание подвижной формы кальция (ионов, локализованных в апопласте цитозоле) в неохлажденных проростках увеличивалась от 0,01 до 0,17 мг/г сухой ассы с повышением кальциевого стату са растений. После охлаждения подвиж-ый пул кальция значительно возрастал, в результате доля подвижного кальция в эшем увеличивалась: в бескалышевом варианте - or 0,14 до 0,55%; при концен-зации кальция в среде 6 мМ - or 0,57 до 2,99%; в варианте с 30 мМ наиболее существенно - с 1,17 до 5,79%. Это указывает на значительное увеличение концеп-

транш« Са2+ в цитозоле при охлаждении. При этом клетка не способна поддержи вать кальциевый гомеостаз, поскольку Са2*-ЛТФазы, отвечающие за активное вы качивание Са2+, инактивированы охлаждением.

Участие окислительного стресса в холодово.ч повреждении. При о.хлажде нии теплолюбивых растений возникает окислительный стресс (усиление образе вания свободных радикалов и перекисей, вызывающих повреждения мембраниы липидов и других клеточных компонентов) (I 1апузс11,Рагкт, 1993;Рга5ас1 е1 а1 1994а; Окапе е( а!., 1996). Низкотемпературное усиление ПОЛ, обнаруженное в лг стьях огурца, проса, кукурузы, указывает на то, что при действии холодовог стресса АО-системы перестают "справляться" с возрастающим уровнем АФК, чт и является начальным звеном повреждении. Если путем повышения АС активности можно будет снизить степень холодового повреждения клеток, то эт явится подтверждением пусковой роли окислительного стресса в реакции на пс ниженные температуры.

Илиянне экзогенных модификаторов ПОЛ на холодовое повреждение. Вь держивание отделенных листьев огурца в течение 4 ч в растворах прооксидант (Ре2*-аскорбат) или антиоксидантов (аскорбат, глутатион, бензоат) с последук щим 16-часовым охлаждением при 3"С приводило к изменениям интенсивност ПОЛ и степени холодового повреждения (рис.7). При этом наибольшее уенлени отмечено в вариантах с обработкой прооксидантом, а минимальное - после обр; ботки антиоксидантами. Такое же действие оказали одновременное действие мс дификаторов ПОЛ и пониженной температуры в течение 4 ч, а также последов: тельная обработка листьев модификаторами ПОЛ и охлаждение в течение 24 1 Между низкотемпературным усилением ПОЛ и величиной КП выявлена высока корреляция (г = 0,929 - 0,997). Полученные результаты подтверждают гипотезу о£

Содержание МДА,

Выход элеггролитзд, % от полного

Г*-аоорС«гт «трОет >л)гт«п>о< 8»ис«г

Г"! г&»с СИ 1*С

»о» I • «сксфблт киорбат глутеш I I 25"С □ 3<С |

I 5

Рис.7. Влияние 16-часового охшж-дения при 3"С отделенных листьев огурщ предовработаниых про- и антиоксидантами, па интенсивность ПОЛ (А), экзош мое электролитов и степень холодового повреждения - КП (Б).

участии окислительного стресса в холодовом повреждении теплолюбивых раст( ний. Путем экзогенной модификации процессов ПОЛ можно существенно изм( нить степень чувствительности клеток к охлаждению.

Поскольку различные аитиоксиданты снижали интенсивность ПОЛ и величн-у КП не в одинаковой степени, предположено, что основное повреждающее дсй-твие при охлаждении оказывают 'О2 и О:", и что подавление их образования бу-ет повышать устойчивость мембран к холодовому стрессу.

'Стационарная концентрация супероксидного ашюн-рчдикта при охла.хеде-ии различных растений и ее связь с ишпеисшшостыа ПОЛ и повреждением. 1заимосвязь образования О2" с Холодовым повреждением растений и усилением ЮЛ исследовали на нескольких видах растений, различающихся по чувствитель-ости к пониженным температурам. После 1-часового охлаждения растений уро-ень супероксидного радикала в листьях теплолюбивых растений возрастал в 2,4,5 раза, но при дальнейшем холодовом выдерживании постепенно понижался, 'пустя сутки после 24-часового охлаждения содержание радикала возвращалось к ровню неохлааденного контроля у проса и этиолированных растений кукурузы и есколько превышало контроль у огурца и зеленых проростков кукурузы. В этио-ированных побегах холодоустойчивого картофеля наблюдали обратную картину шбольшое снижение концентрации 0{ при охлаждении).

Во время холодового выдерживания уровень МДЛ в листьях возрастал с максимумом после 24 ч, более значительно - в листьях наиболее чувствительных рас-гний, и оставался повышенным в последействии охлаждения. В побегах карто-:еля наблюдали лишь тенденцию к повышению интенсивности ПОЛ.

Экзоосмос электролитов из клеток с удлинением холодовой экспозиции воз-астал, при этом величина холодово-э повреждения (КП) была макси-альной в листьях огурца и, что лояльно парадоксально,- в этиолиро-знных побегах картофеля (рис.8), •днако спустя сутки после 24-асового охлаждения уровень КП у роса и картофеля был практически 1ким же, как у неохлажденных про-эстков, что указывает на отсутствие эвреждешш или их быструю репа-зцию. В то же время КП оставался эволыю высоким в листьях кукуру-,1 и огурца, т.е. процессы репарации Г^гах растений в ходе охюждения при

-с- ТС и его последействии: 1 - кукуруза эврежденин у этих растении были (зт1С раста,шу_ 2 . „гурец; 3 ^ прбсо;

1медлены. 4 . кукуруза (этиолированные растения);

Из представленных результатов 5 - картофель (этиолированные побега). тдно, что выдерживание теплолюбивых растений в условиях пониженной темпе-пуры, наряду с увеличением образования супероксидного анион-радикала, пинцировало повышение интенсивности ПОЛ и экзоосмоса электролитов в их тка-IX, однако эти процессы развивались разновременно. Если вспышка образования 2" отмечена после первого часа охлаждения с последующим постепенным зату-

КП. % егт полного выхода электролитов

Длительность охлаждения, ч

Рис.8. Величина КП в листьях и по-

ханием, то увеличение МДЛ н степень холодового повреждения, определенного по состоянию клеточных мембран, были максимальными у всех видов после 24-часового охлаждения. Это можно объяснить различной скоростью формирования и функционирования внутриклеточных механизмов, направленных на элиминацию нарушений и репарацию повреждений (окислительного стресса и вытекающих из него повреждений мембран).

Активность супероксид-дисмутазы (СО/0 охлаждении. Основным клеточным компонентом, элиминирующим О2", является СОД, которая снижает его концентрацию в 104 раз (Мерзляк, 1989; 5саш1аНо5,1993). 1-часовое выдерживание теплолюбивых растений при 2"С снижало активность цитозолыюй СОД относительно контроля, наиболее значительно - в листьях огурца (табл.1). Удлинение хо-лодовой экспозиции привело к увеличению активности СОД; спустя сутки после охлаждения активность фермента была близкой к уровню неохлажденного контроля. У холодоустойчивого картофеля активность СОД в этиолированных побегах в ходе охлаждения изменялась очень слабо. Изменения активности СОД согласуются с чувствительностью видов растений к охлаждению.

Таблица 1

Активность супероксиддисмугазы в листьях теплолюбивых растении после охлаждения при 2°С, ед. активности

Контроль Длительность охлаждения, ч Сутки спус-

Объект (без охлаж- тя 24-час.

дения) 1 4 24 охлаждения

Кукуруза 3,82±0,10 1,36±0,09 1,78+0,06 3,34±0,07 2,83±0,06

(зеленые раст.)

Просо 2,95+0,11 1,00±0,05 2,25+0,09 3,65±0,12 2,67+0,10*

Огурец 3,13±0,12 0,50±0,03 1,55±0,07 2,06±0,08 3,00+0,11*

Кукуруза 4,91+0,09 2,14±0,08 2,47+0,10 3,96±0,12 4,67±0,14*

(этиолир. раст)

Картофель** 2,80+0,07 2,84±0,10* 2,32+0,12 3,41±0,16 3,25±0,23*

* - различия с неохлажденным контролем недостоверны при Р = 0,05

** - у картофеля анализировали активность в этиолированных побегах

Сопоставляя данные по влиянию охлаждения на уровень О2" и активност] СОД, можно наблюдать высокую отрицательную корреляцию между этими пара метрами у теплолюбивых растений (г = -0,794 ч- -0,982) и ее отсутствие в побега картофеля (г = 0,175). Резонно предположить, что холодовое повреждение тепло любивых растений включает в качестве одного из первичных механизмов увели чение продукции О2", а повышенная устойчивость связана с высокоактивной СОД Возрастание активности СОД при удлинении холодовой экспозиции носит адап тивный характер и направлено на снятие окислительного стресса и тем самым холодового повреждения. Виды и сорта, проявляющие малую степень инактива цни СОД при охлаждении и/или быстрое восстановление активности, будут боле( хол о доу сто й ч и в ы м и.

3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

Влияние скорости снижения температуры на развитие повреждении. Ре-

1кция теплолюбивых растений на действие неблагоприятных температур является функцией не только напряженности стрессора, но и скорости понижения темиера-гуры (Minorsky, 1989). IIa 9-дневных растениях кукурузы сорта Пуковипский 2 :равннвали развитие холодового повреждения при двух режимах снижения температуры: внезапном охлаждении (помещении сосудов с растениями в температуру Г'С) и медленном охлаждении со скоростью снижения температуры 5,6"С/ч.

Экзоосмос электролитов в ходе медленного снижения температуры до Г'С вначале понижался, затем возрастай до уровня контроля; выдерживание растений при температуре ГС приводило к повышению выхода электролитов до -J0 мин охлаждения с последующим выходом на плато. В ходе внезапного охлаждения отмечено резкое возрастание выхода электролитов в первые 5-60 минуг действия холода, небольшое снижение спустя 2 ч и дальнейшее увеличение, начиная с 4 ч. Сравнение изменений экзоосмоса в ответ на медленное и внезапное охлаждение показывает, что в первом случае происходят постепенные изменения функции мембран, отражающиеся в медленных кратковременных изменениях выхода электролитов, а во втором - резкий и более сильный подъем утечки ионов.

Изменения интенсивности ПОЛ в динамике медленного и быстрого охлаждения подтвердили закономерности, отмеченные по экзоосмосу электролитов. При постепенном понижении температуры от 24 до Г'С наблюдали преходящее повышение уровня МДА, а выдерживание при температуре Г'С приводило к трехфазным изменениям интенсивности ПОЛ; ее увеличение было выражено значительно слабее относительно быстрого режима охлаждения (рис.9). Видимо, первоначальное возрастание продуктов ПОЛ служит сигналом для запуска синтеза ферментативных и низкомолекулярных АО (Prasad et al.,1994а; 1994b). В результате к моменту снижения температуры до ГС в растениях функционирует система защиты от АФК, вследствие чего последующее выдерживание проростков при пониженной температуре слабее активирует ПОЛ по сравнению с внезапным охлаждением, когда в клетках листьев возникает окислительный стресс.

время снижения I . ,„

I длительность выдерживания при I °С, мин температуры, ч I

Рис.9. Влияние скорости снижения температуры на динамику интенсивности ПОЛ в листьях кукурузы: I - при скорости снижения температуры 5,6"С / мин: 2 - при помещении растений в температуру 1°С; 3 - температура.

По.юс смлыюс действие внезапного охлаждения на нарушение физиологических функции проявлялось и на уровне организма (изменений роста). При медленном понижении температуры ростовые параметры спустя 10 д после кратких холодовых экспозиций зачастую превышали значения неохлажденного контроля, тогда как после внезапного охлаждения всегда наблюдали подавление роста.

Временная динамика хо.тодового повреждения. Суммируя данные, приведенные в главе 1, можно видеть разновременное появление физиологических изменений в динамике охлаждения. У растений проса отмечены быстрые изменения на клеточном уровне и более поздние - па органнзменном (ростовые процессы). Стрессовая реакция на охлаждение начиналась с изменений ПОЛ и рН и замедте-ния роста растений в высоту, что является суммарной реакцией роста клеток. Далее наблюдали увеличение проницаемости мембран, позднее - нарушение водного режима (снижение сырой массы), уменьшение площади листьев, и в конце концов - снижение сухой массы проростков.

У растений кукурузы охлаждение при температуре 0"С вызываю быстрые (уже после 0,5-часовой экспозиции) изменения большинства исследованных ци-тофизиологических параметров. Мягкий режим охлаждения растений кукурузы (2°С) приводил к замедленному проявлению нарушений некоторых физиологических функций относительно температуры 0°С (табл.2).

Таблица 2

Время появления физиологических изменений от начала охлаждения растений кукурузы при температуре 2"С_

Физиологический Длительность охлаждения, ч

параметр 0.5 1 2 4 8 12 16 20 24

Выход электролитов Интенсивность ПОЛ Внутриклеточный рН: •••• •••• •••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • •••

эпидермис •••• •••• • ••• • ••• • •••

проводящие пучки Ростовые параметры: митотический индекс •••• •••• •••• •••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • •••

величина клеток •••• •••• • ••• • ••• • ••• • •••

высота растении •••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • •••

площадь листьев Водный режим: содержание воды транспирация водный потенциал •••• •••• •••• •••• •••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • ••• • •••

Математические закономерности зависимости цнтофпзпологпчеекмх изменений ог длительности и температуры охлаждения. В исследовании взаимосвязей растение-среда большое значение имеет моделирование. Для расчета количественных зависимостей между температурой или длительностью охлаждения, с одной стороны, и цитофизиологическими изменениями в листьях кукурузы, с другой, использовати регрессионный анализ. Установлено, что связь между длительностью охлаждения (1) и проницаемостью клеточных мембран можно выразить

степенной функцией у = а(ь (у - выход электролитов), где коэффициенты а и Ь равны соответственно 12,4 и 0,9<)3 (при -1"С), 11,32 и 0,157 (при 0"С), 9,5 и 0,078 (при Г'С), 6,85 и 0,235 (при 2"С). Зависимость между длительностью охлаждения 0) и КП (у) при фиксированной температуре выражалась гиперболической кривой у = а + Ы + сЛ. Связь между величиной холодового повреждения (у) и температурой (х) при фиксированной длительности охлаждения выражалась функцией у = кш\ где параметры к и т возрастали с удлинением холодовой экспозиции.

Зависимости интенсивностью ПОЛ от длительности холодовой экспозиции выражалась гиперболической функцией у = а + Ы + с/1, где у - содержание МДА, или степенной функцией у = к(га.

Связь между величиной внутриклеточного рН (у) и длительностью охлаждения (I) можно выразить несколькими уравнениями, наиболее подходящее из которых у = а + Ьх1п 1. Величина изменений внутриклеточного рН в последействии охлаждения выражается логарифмической кривой вида у = 1о^х + Ь, где у - величина смещения рН, х - дни после охлаждения. Рассматривая возвращение величин внутриклеточного рН у растений после охлаждения к уровню контрольного варианта, можно отметить, что в этом случае повышение рН представляет экспоненциальную функцию вида у = ахЬ' + с, где у - величина смещения рН, I - длительность охлаждения, ч.

Для выражения зависимостей изменений параметров роста от длительности выдерживания растений на холоде использовали логарифмическую кривую общего вида у = а - Ьх1н I, где у - линейный параметр (размер клетки, высота растения, площадь листьев) или митотический индекс, I - продолжительность охлаждения.

Таким образом, изменения цитофизиологических параметров в динамике охлаждения могут быть описаны несколькими основными регрессионными функциями: степенной, логарифмической, гиперболической, экспоненциальной, причем в зависимости от измеряемого параметра более применима та или ¡тая за-висмость. Расчет коэффициентов» произведенный для каждого процесса, позволяет моделировать поведение функции при изменении параметров эксперимента.

Качественная сторона изменений цитофизиологических параметров при выдерживании теплолюбивых растений в условиях пониженных температур включа-гт в себя взаимную согласованность различных процессов. Обнаружена высокая корреляция между изменениями цитофизиологических показателей (КП, сдвигами внутриклеточного рН, увеличением содержания МДА) у проса и огурца после 3-аневного охлаждения и у кукурузы в динамике холодового выдерживания, что указывает на взаимосвязь этих процессов.

Физиологическая .модель индукнпп и развитии холодового повреждения. Три создании модели холодового повреждения теплолюбивых растений учитыва-тн зависимости между изменениями физиологических процессов, в том числе -эазвитие реакции во времени и пространстве, детерминистические (причинно-следственные) связи, возможные"общие причины. В основе модели лежит снижете температуры как сигнал для запуска изменений в растении. Медленное ее по-шжение, как и охлаждение при относительно высоких для данного ряда темпера-

турах, вызывает изменения физиологических процессов, имеющие адаптивный (акклимациопный) характер. В результате внезапною охлаждения наблюдается преимущественно трехфазная реакция, когда первоначальное резкое изменение параметра сменяется временной нормализацией процесса; длительность этой фазы зависит от физиологических и генетических особенностей растения и от интенсивности действующего фактора. Третья фаза - повторное, уже более выраженное и монотонно усиливающееся изменение параметра, свидетельствующее о повреждении функции. Однако изменения процессов в последействии охлаждения позволяют считать, что в подавляющем большинстве случаев (за исключением действия низких температур, приводящего к быстрой гибели растений, которое не исследовалось в данной работе) повреждения были обратимыми, т.к. после возврата охлажденных растений в тепло у них наблюдали нормализацию нарушенных функций; это восстановление до уровня неохлажденных растений происходило с различной скоростью в зависимости от физиологических особенностей организма, с одной стороны, и интенсивности охлаждения, с другой.

Инициация холодового повреждения имеет в своей основе изменения содержания ДФК и резкое повышение концентрации свободного (ионизированного) ци-тозолыюго кальция ([Са2+]10„). В начальный период внезапного охлаждения происходит блокирование или разобщение систем переноса электронов, что приводит к образованию Ог' и па его основе других АФК (Pow!es,1984; Wise,Naylor, 1987b; Мерзляк, 1989), вызывая окислительный стресс; этому способствует резко выраженная холодовая инактивация СОД. С другой стороны, повышение уровня Ог" будет индуцировать синтез de novo изоферменгов СОД (Tsang et al.,1991; Scandal-ios,1993) и других AO (Jahnke et al., 1991; Fan,Guo,1992; Hariyadi,Parkin,1993; Walker,McKersie,1993). При длительном охлаждении это приведет к снижению содержания АФК и снятию окислительного стресса. Однако АФК повреждают ДНК, белки, липиды, вызывая их перекисное окисление (Bowler et al.,1992); усиление ПОЛ вызывает изменения структуры мембран (Владимиров,Арчаков,1972) и нарушает протекание физиологических процессов в клетке. Говоря другими словами, повышение АО-защиты растительной клетки, направленное на снятие возникающего при охлаждении теплолюбивых растений окислительного стресса, несколько запаздывает по времени и выполняет свою функцию, когда уже включились цепные механизмы ПОЛ и начались нарушения на мембранном уровне. Вероятно, основное отличие холодоустойчивых растений от теплолюбивых заключается в том, что у первых образование АФК при охлаждении не носит взрывной характер и не приводит к возникновению окислительного стресса.

Во время медленного понижения температуры образование 02~ и других АФК, действуя как слабый окислительный стресс, активирует синтез АО-ферментов, в результате которого клетка формирует комплекс дня сопротивления окислительному стрессу. Подтверждением этому служит резкое снижение холодовоГ чувствительности у трансгепных растений - свсрхпродуцентов СОД (Gupta et al. 1993), у растений, обработанных экзогенными AO (Wang,Baker, 1979; Wise,Naylor 1987; Zenu et al.,1991; Jennings, 1994) или II2O2, индуцирующей слабый окисли

тельный сrpecc (Prasad el а!., 1994).

Др\тнм элементом низкотемпературной нндукннп холодового повреждения является увеличение [Са"*]1ОТ, которое приводит к быстрым изменениям многочисленных цитофи зиологических процессов (Minorsky,1985), а также измененному фосфорплированию и функционированию белков, нарушениям работа систем транскрипции и трансляции (Poovaiah,Redely, 1987). Изменения CaJt тесно связаны с окислительным стрессом, который немедленно увеличивает [Са"']1;|гг (Price ct. al.,1991), действуя так же, как и холодовой шок (Knight et al.,1991; 1996). В свою очередь, увеличение [Са"*]1ИГ вызывает усиление окислительного стресса (Lock, Price, 199)) и ннгибирует активность СОД (Price et al.,1994), т.е. происходит каскадное усиление сигнала, индуцирующего холодовое повреждение.

Дальнейшее развитие повреждения может идти по многим направлениям, связанным с усилением свободнорадикального ПОЛ, с одной стороны, и изменением функционирования кальций-кальмодулин-зависимых белков, с другой. Все эти процессы взаимосвязаны и могут усиливать один другой. Так, инактивация Н+-АТФаз будет приводить к снижению внутриклеточного рН, нарушениям ком-партменташш растворимых веществ и ионов, в т.ч. Са2+ (Yoshida et а!.,1989), а понижение цитозольиого рН увеличивает уровень цитозольного Са2+ (Gehring et al., 1990). Снижение рН изменяет кинетику ферментативных реакций, что приведет к низкотемпературному торможению скорости клеточных процессов, таких как клеточное деление (Barlow,Adam, 1989а). Усиление ПОЛ повышает утечку электролитов из клеточных компартментов. Развитие процессов нарушений физиологических функций при низкотемпературном повреждении теплолюбивых растений приведено на рис.10. Совокупность нарушений на клеточном уровне вызывает гущественные изменения физиологических функций растения - фотосинтеза, дыхания, поглощения минеральных веществ и воды, транспорта органических со-гдннений, роста и развития; в конечном итоге могут наблюдаться видимые прояв-тсиия холодового повреждения и гибель растения. Даже в отсутствие внешних товреждений будет происходить снижение продуктивности.

Исходя из представленной модели индукции и развития холодового повреждения, можно выделить этапы, на которых вмешательство позволит резко повысить устойчивость к пониженным температурам. Главным образом, это начальные /частей свободнорадикального запуска окислительного стресса. Повышая уровень тизкомолекулярных или ферментативных АО (обработкой соединениями с АО-нстивностью или в трансгенных растениях - сверхпродуцентах СОД и других АО-{¡ерментов), можно снизить холодочувствнтелыюсть растений или их клеток. По-тобным АО-действием обладают и некоторые аналоги фитогормонов. Кроме того, тредварительная подготовка растения к перенесению стресса позволит снизить шдуцированное охлаждением нарушение физиологических функций. Наконец, три нелегальном охлаждении экзогенные обработки (в том числе аналогами фито--ормонов) помогут ускорить восстановление после стресса.

ХОЛОДОВОЙ СТРЕСС

Пнгибнрование активного транспорта

Утечка К+

Открывание ионных каналов

=г

Увеличение [Са2+]циг

Изменение активности Са-зависимых ферментов и фосфорилирования белков

Увеличение проницаемости мембран (выход ионов, воды, неэлектролитов)

Повышение образования СР и перекисей

Нарушение компартмен-■ тации. Изменение активности фермент он. Дисбаланс метаболизма.

Изменения транскрипции и трансляции. Нарушения действия фитогормонов.

Цшофизиоло! ические изменения (остановка движения цитоплазмы, изменения вязкости, торможение деления и растяжения клеток»

■ Торможение роста. Нарушения дыхания, фотосинтеза, окислительного фосфорилирования (снижение АТФ). . Улыраструктурные нарушення._

Возврат в тепло после суб.петального холодового стресса; Постепенное восстановление нормального метаболизма

Длительное выдержнванпе: Повреждение и гибель клеток и тканей

Рис. 10. Схема инициации и развития холодового повреждения в клетках теплолюбивых растений.

4. ПСПОЛЬЮВАНИЕ ЦИТОФ1ПИО.ЮГИЧГХ KUX ПАРАМЕТРОВ

И МОДЕ ЛЕЙ ХОЛОДОВО! О ПОВРЕЖДЕНИЯ Методы сравнительной опенки холодоустойчивости сортов и гибридов теплолюбивых растений. Для определения возможности применения цитофи-зиологических методов определения сравнительной холодоустойчивости сортов и селекционного материала теплолюбивых растений проведены исследования на коллекции сортов проса (16 сортов из 10 эколото-географических групп и 2 образ-па нз лаборатории селекции проса ВНИИЗБК). По выживаемости проростков после 3 д при температуре ГС образцы разделены на три группы устойчивости: высокой, средней и низкой (Кострубин,1984). Цитофизиологические показатели сравнивали у сортов в фазе кущения (табл.3).

Таблица 3

Относительная холодоустойчивость сортов и селекционного материала проса _после охлаждения при температуре ГС в течение 3 суток_

Г,

орт, ооразен

"/о выживших растений

КП, % выхода ионов

МДА.%

К KOII!

ролю

Сдвиг внутриклеточного pH

эпидермис j мезофилл | провТпучкп

Мироновское 51 Омское 9 Орловское 92 Горьковское 43

к-3359 (Таджикистан) Казанское 2

Дсшшское 86

СескарзгаПское мест.

к-1647 (Иран) Саратовское 2 К-8629 (Киргиши) К-1436 (Утбскястан)

Сорта с высокой холодоустойчивостью

100 83,1 82,5 77,1 76,3 72,1

1,82 0,90 3,29 1,64 2,89 1,53

134,6 141,6 141,3 139,0 149,3 143,8

0,44 0,11 0,45 0,48 0,53 0,67

Сорта со средней холодоустойчивостью

65,5

65.4 63,0

62.5

58.7

49.8

4,00 5,22 4,26 4,59 4,30 5,20

162,6

159.1 169,9 183,6 168,4

180.2

0,55 0,54 0,72 0,79 0,72 0,85

0,68 0,67 0,65 0,6S 0,74 0,75

0,68 0,72 0,87 0,92 0,83 0,91

Сорта и образцы с низкой холодоустойчивостью

Саратовское 853 41,7 5,03 184,8 0,79 0,92

Комовое 1020 40,0 5,59 174,8 0,87 1,09

к-7633 (Kidthihi) 30,4 5,35 197,2 0,92 1,03

к1066д3153 30,0 6,05 181,9 0,94 0,92

Ставропольское 12 15,9 6,58 197,8 0,89 1,05

х-1152 (Узбекистан) 9,5 6,98 194,8 0,90 1,06

0,48 0,33 0,52 0,40 0,53 0,55

0,51 0,54 0,77 0,82 0,76 0,86

0,82 0,76 0,86 0,90 1,07 1,05

Пониженные температуры усиливали экзоосмос электролитов, интенсивность ПОЛ и снижали внутриклеточный рН в листьях проса; при этом сорта с высокой холодоустойчивостью, выявленной прямым методом оценки, имели минимальные величины индуцированных охлаждением изменений, а сорта с низкой устойчивостью, наоборот, отличались наиболее высокими значениями этих показателей. Ос-тхтьные сорта занимали промежуточное положение, которое в основном соответствовало степени их холодоустойчивости. Между выживаемостью на стадии пророст ков и цитофизиологическими изменениями после охлаждения обнаружена высокая отрицательная линейная корреляция, коэффициенты которой равны:

для КГ1 -0,886, возрастания МДА -0,920, сдвигов рН эпидермиса -0,899, мезофилла -0,894, проводящих пучков -0,903. Коэффициент ранговой корреляции Спирмэ-на (по относительной устойчивости сортов) равен 0,925 при определении по экзо-осмосу электролитов, увеличению МДЛ и сдвигу рН в клетках эпидермиса, 0,932 -по сдвигу рН проводящих пучков и 0,966 - в клетках мезофилла.

Высокая корреляционная зависимость между холодоустойчивостью сортов и селекционных образцов проса, определенной методами прямого охлаждения и по изменениям цигофизиологических параметров при действии пониженных температур, позволяет предложить использование цигофизиологических методов в диагностике сравнительной холодоустойчивости сортов теплолюбивых растений.

Обоснование способов подбора соединении, повышающих холодоустойчивость. В качестве соединений, повышающих холодоустойчивость растений, анализировали регуляторы роста рахтнчной природы. На первом этапе определяли прорастание семян при оптимальных и пониженных (12-14"С) температурах, что позволило выявить потенциальную способность препаратов повышать устойчивость и оптимальные их концентрации. В большинстве случаев испытуемые регуляторы усиливали прорастание семян в широком диапазоне концентраций (от 0,01 до 10 мг/л); наиболее эффективными оказались препараты цитокининового типа действия. Экзогенные регуляторы также активировали рост корня и побега в условиях пониженной температуры.

Однако чувствительность к холоду растений и прорастающих семян может сильно различаться (Janowiak,Markovvski,1987; Bertin et al., 1996а), поэтому необходима проверка устойчивости на последующих стадиях развития. На втором этапе работы определяли внешние проявления холодового повреждения молодых растений, обработанных растворами препаратов за сутки до охлаждения, или выращенных из семян, обработанных регуляторами роста. Следует отметить, что эти два варианта приводили к сходным результатам, поэтому в последующем приведены только некоторые из них.

3-дневное охлаждение растений кукурузы при температуре 0-1°С и огурца (2-3"С) приводило к сильному повреждению и гибели растений; обработка различными соедипениеми снижала степень холодового повреждения (рис.11). В вариантах с карто-Рис.11. Влияние обработки рас- ЛШ10М 2 " полистимулином К гибели рас-тепий кукурузы сорта Диепропетров- тений кукурузы не происходило; повыше-ская 247 регуляторами роста nepeô ние выживаемости проростков огурца на- картолин 2; 3 - полиептмулин К; 4 - ^ином и хлорхолинхлоридом. оксикарбам; 5 - квартапш; 6 -ПАП; 7 На третьем этапе проверяли действие -ДФМ. регуляторов роста на холодоустойчивость

% растений

МИш,

I I неповрежденных |i>" ,| поврежденных гютбиия

M ДА Ч * нео«лаж£емиому СОн* рОЛЮ

ril

растений по цитофизиологическим критериям - изменениям проницаемости мембран и интенсивности ПОЛ. Выдерживание растений кукурузы и огурца при пониженных температурах приводило к значительному повышению выхода электролитов, при этом величина КП была существенно ниже у растений в вариантах с обработкой регуляторами роста. В последействии охлаждения происходило неуклонное снижение КП в вариантах с обработкой регуляторами роста, что указывает на снятие неблагоприятного воздействия пониженной температуры. У контрольных растений такое снижение было значительно замедленным. Лучшие результаты для кукурузы отмечены при обработке иолистимулином К, ЬАГ1 и карюлнном 2, огурца - кинетином, квартазином и ССС.

Интенсивность ПОЛ значительно возрастала после длительного охлаждения растений кукурузы. Обработка цитокиииновы-мн препаратами за сутки до охлаждения снижала низкотемпературное увеличение уровня МДА (рис.12). Ауксиновые препараты на куку рузе, как и ГК и гидрел на огурце, слабо влияли на интенсивность ПОЛ, индуцированную охлаждением.

i/J'aoioaiu „

п „ -, Гаким ооразом, ооработка семян и

Рнс.12. Влияние оираоотки г > г

растешш кукурузы сорта Днепре- проростков теплолюбивых растений синте-петровская 247 на интенсивность тическнми регуляторами роста (особенно ПОЛ в листьях после охлаждеты. щ,Токининового типа действия) значитель-Варианты: I - вода; 2 - ИМ К; 3 - -

НУК; 4 - ПУК; 5 - картолин 2; б - 1,0 [,01,ышаст стабильность клеточных мем-полиеппшулин К; 7 - оксикарбач; 8 - бран при охлаждении. квартазин; 9 - ВАП; 10 -ДфМ Физиологическое действие экзоген-

1ых регуляторов роста при повышении холодоустойчивости. Наряду со сниже-шем холодоиндуцированного усиления экзоосмоса электролитов и интенсивности ТОЛ, экзогенные препараты с цитокининовой активностью влияют на различные физиологические параметры в охлажденных растениях. Обработка семян и проро-:тков огурца и кукурузы кинетином (0,1 мг/л) повышала в охлажденных растениях шологическую активность ауксинов и цитокининов, интенсивность дыхания тка-[сй листьев, ростовые параметры (высоту растений, площадь листовой поверхно-ти, сырую и сухую массу растений) относительно водного контроля. В мелкоде-[яночных опытах обработка семян теплолюбивых растений (кукурузы, огурца, ipoca) синтетическими аналогами цитокининов (кинетином, БАП) увеличивала юлевую всхожесть, ускоряла прохождение фенологических фаз и повышала про-уктнвность, особенно при раннем посеве. При этом у кукурузы увеличилось чис-10 растений со зрелыми початками и число зерен в початке, больше у растений аннего посева в сравнении с самым поздним (что является косвенным показате-ем повышенной холодоустойчивости). Значительно возрос урожай: зерна проса а 12-14%, плодов огурца на 17-18%, зеленой массы куку рузы на 16-32%. У проса орта Саратовское 2 и предпосевная обработка, и опрыскивание растений в фазе

трех листьев раствором картолипа увеличивали высоту растений, число продуктивных стеблей и сухую массу растений, а также урожайность (на 14,7-17,7%). Из этих данных видно, что обработка цитокипиновымн препаратами, положительно влияя на устойчивость растений к пониженным температурам, одновременно повышает их продуктивность, и может быть использована в практических целях.

Использование клеточных культур для изучения и повышения холодоустойчивости. Клеточные культуры могут быть удобным модельным объектом при изучении холодового повреждения; однако при этом необходимо модифицировать методы оценки клеточных повреждений, учитывать особенности реакции на охлаждение клеток, полученных от разных эксплантов, и действие ряда внешних факторов (света, уровня цитокининов в среде) на холодоустойчивость.

Самая низкая чувствительность к охлаждению отмечена у катлусных линий, полученных от семядольных листьев огурца и колеоптиля кукурузы, более высокая - у каллусов, полученных при эксплантации гипокотиля и меристемы стебля (огурец), листа и конуса нарастания (кукуруза). Наблюдалась тенденция к снижению холодового повреждения с увеличением возраста исходного растения и к егс повышению с возрастом культуры: максимальная жизнеспособность клеток поел« охлаждения отмечена для пересадочной культуры кукурузы в возрасте 2 недель после чего она прогрессирующе снижалась. Таким образом, эпигенетические i физиологические особенности клеточных культур играют значительную роль в и? холодоустойчивости. Условия культивирования также влияли на степень холодо вого повреждения каллусных линий; оно снижалось при выращивании культуры i темноте и повышении уровня цитокининов в среде.

Выявленные зависимости реакции клеточных линий на охлаждение исполь зованы в экспериментах по повышению холодоустойчивости клеточных линий основанных на сомаклональной изменчивости культивируемых in vitro клеточны: популяций. После 24-часового выдерживания при температуре 1°С каллусных ли ний огурца различного происхождения количество выживших клеток, определен ное по восстановлению ТТХ, составило от 12 до 28%. Пересадка участков каллу сов на свежую питательную среду и их отрастание позволило получить ряд лиши с существенно повышенной холодоустойчивостью. Возможно, что регенераци растений из каллусных культур с последующим клонированием и оценкой устой чивости к пониженным температурам растений и их потомства позволит получит селекционный материал, пригодный для практического повышения устойчивости

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании проведенной работы предлагаются следующие рекомендаци по использованию результатов исследования:

I. Использовать разработанные методы оценки сравнительной чувствител! ности клеток и тканей теплолюбивых растений к действию пониженных темпер; тур, основанные на изменениях цитофизиологичсских параметров - проницаемс сти мембран (выхода электролитов), интенсивности перекисного окисления лит

ив, внутриклеточного pli.

2. Выявление экзогенных препаратов, индуцирующих повышенную холодоустойчивость теплолюбивых растений, проводить по схеме, включающей низкотемпературное проращивание семян, визуальное определение холодового повреж-тения, анализ низкотемпературного повреждения мембран (по выходу электролитов и интенсивности ПОЛ).

3. Для снижения чувствительности теплолюбивых растений к действию по-шженных температур могут использоваться экзогенные аптиоксиданты и регуляторы роста различной природы, наиболее эффективные из которых - синтетиче-:кие аналоги цитокининов и хлорхолпнхлорид (в концентрациях от 0,01 до 1 .1г/л).

4. При предпосевной обработке регуляторами роста наиболее эффективна шитсльность контакта семян с препаратом около 8 ч.

5. Для повышения всхожести семян и продуктивности растений в полевых .словнях предлагается предпосевная обработка кинетином и другими экзогенными препаратами цитокининового типа действия.

6. В целях направленного повышения холодоустойчивости предлагается ис-юльзовать скрининг клеточных культур in vitro после сублеталыюго охлаждения. 1оследующая регенерация растений из клеточных популяций позволит получить 5олее устойчивый к действию пониженных температур селекционный материал.

ВЫВОДЫ

1. В основе первичных механизмов реакции клеток теплолюбивых растений ia холодовое воздействие лежат дисбаланс Са2+-обмена, увеличение уровня сво-юдных радикалов, инактивация ион-транспортирующих систем, приводящие к крушению функций мембранной системы клетки. Это приводит к изменениям физиологических процессов как на клеточном уровне - повышению проницаемо-гти мембран и интенсивности перекисного окисления липидов, снижению внут-шклсточного рН и ростовых параметров клетки, так и на организменном, инте-ральным показателем которых является торможение роста. В динамике охлажде-1ия изменения имеют трехфазный характер, отражающий шоковую реакцию на пресс, акклимационные перестройки и холодовое повреждение.

2. Зависимости изменений цитофизиологических параметров от температуры I длительности охлаждения в общем виде описываются регрессионными функ-шями различных видов (гиперболической, степенной, экспоненциальной, лога-шфмической). В последействии пониженных температур проявляется обрати-юсть холодового повреждения; скорость нормализации нарушенных функций за-1ИСИТ0Т интенсивности холодового воздействия.

3. В защите клетки от холодового стресса участвуют низкомолекулярные и ферментативные аптиоксиданты, ключевую роль среди которых играет суперок-иддисмутаза, а в нормализации клеточного метаболизма после окончания охлаж-1сния - K+,Mî;2+- и Са"+-АТФазы. У теплолюбивых растений, в отличие от холодо-

устойчивых, не обнаружены эффективные механизмы, способные полностью остановить действие холодового стресса.

4. Изменения физиологических процессов при медленном понижении температуры имеют отличный от внезапного охлаждения характер, что проявляется t перестройке реакций в период постепенного понижения температуры и меньшеГ амплитуде изменений во время холодового выдерживания.

5. Величина физиологических изменений при охлаждении коррелирует с чувствительностью растений к пониженным температурам; она более значительна j теплолюбивых сортов и менее выражена у устойчивых. Обнаружены онтогенетические изменения реакции растений на охлаждение: максимальная устойчивост! наблюдалась в фазы выхода в трубку и выметывания (просо) и цветения (огурец) минимальная - в фазы трех листьев (просо) и первого настоящего листа (огурец).

6. IIa основе выявленных регрессионных закономерностей и корреляционны; связей в совокупности с хронологической последовательностью физиологически; нарушений создана модель инициации и развития холодового повреждения теп лолюбивых растений.

7. Выявлена высокая степень гетерогенности каллусных линий огурца и ку курузы по чувствительности к охлаждению, в основе которой лежат эпигенетиче ские и физиологические особенности. Максимальная холодоустойчивость отмече на для линий, полученных из семядольных листьев огурца и колеоптиля кукурузы а также из более зрелых растений и молодых пересадочных культур. Посредство» скрининга выживших клеток после охлаждения возможно направленное повыше ние холодоустойчивости в культуре in vitro.

8. Чувствительность теплолюбивых растений к охлаждению может быть спи жена экзогенными антиоксидантами и регуляторами роста различной природы наиболее эффективные из которых - синтетические аналоги цитокининов и хлор холинхлорид. Обработка регуляторами роста изменяет протекание физиологиче ских реакций при действии пониженных температур: снижает величину индуци рованных охлаждением усиления выхода электролитов, интенсивности перекис ного окисления липидов и подавления дыхания; повышает активность эндогенны фитогормонов и интенсивность ростовых процессов; в полевых опытах обработк кинетином повышает всхожесть семян и продуктивность растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лукаткин A.C. Диагностика холодоустойчивости теплолюбивых растений по и: менению мембранной проницаемости клеток листьев растений// Устойчивость к неблг гоприятиым факторам среды и продуктивность растении: Тез. Всесоюзн. конф,- llf кутск, 1984,- С. 126-127.

2. Лукаткин А.С.,Зауралов O.A. Проницаемость мембран цитоплазмы у теплолк бивых растений в онтогенезе//Бномембраны: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск, 1984 С.143-146.

3. Зауралов O.A..Лукаткин A.C. Кинетика экзоосмоса электролитов у теплолюб! вых растений при действии пониженных темпсратур//Ф|Пнология растений - 1985 Т.32, выи.2,- С.347-354.

4. Зауралов О.А..Лукаткин A.C. Изменение активной кислотности тканей листьев 'астений проса и 01лрца иод влиянием пониженных температур//Доклалм ВАСХ11ИЛ,-986.-N 9 -С.9-10. '

5. Зауралов О.А.Лукагкин A.C. Роль фптогормонов и ферментов в регуляции ус-ойчивостн растений//Регуляция ферментативной активности у растений: Межвуз. сб. :ауч. тр.- Г орький, 1986,- С.69-73.

6. Зауралов О.А.,Лукаткнн А.С.,Кострубин М.М.Лаханов А.П. Цнтофизиологичес-ая диагностика холодоустойчивости сортов проса//С.-х. биология,- 1987,- N 5,- С.70-74.

7. Зауралов O.A., Лукаткин A.C. Цитофизиологические методы оценки устойчиво-ти растений в генетике и селскции//Генстические основы интродукции и селекции рас-ений: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск, 1987,- С.56-64.

8. Лукаткин А.С.,Кострубин М.М.,Лаханов А.П. Перекисное окисление липидов у астений проса при действии пониженных температур//Физиология устойчивости рас-епий и регуляторы роста: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск, 1987,- С.31-36.

9. Зауралов O.A.,Лукаткин A.C. Модель влияния пониженных температур на теп-олюбивые растения (на примере проса)//Физиология устойчивости растений и регуля-оры роста: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск, 1987,- С.61-67.

10. Зауралов O.A., Лукаткин A.C. Цитофизиологические критерии стрессоустойчн-ости//Физнолого-биохимическне основы иммунитета к грибным болезням растений: ез. Всесогазн. конф,- Уфа, 1988,- С.31.

11. Лукаткин A.C., Голованова B.C. Интенсивность псрекисного окисления липи-ов в охлажденных листьях теплолюбивых растений// Физиология растений,- 1988. - Т. 5. вып. 4,- С.773-780.

12. Лукаткин А.С.,Воскова Т.А.,Лаврина М.Н. Активность АТФаз листьев тепло-юбивых растений при охлаждении//Вопросы биологии растений при их интродукции и естественных фитоценозах в условиях Нечерноземной зоны РСФСР: Межвуз. сб. науч. р.-Саранск, 1988,- С.67-77.

13. Зауралов O.A., Лукаткин A.C. Внутриклеточный pH листьев теплолюбивых астений при действии пониженных температур//Физнол. и биохимия культурных рас-:ннй,- 1988,- Т.20, N 6,- С.586-592.

14. Лукаткин A.C.,Жидким В.И. Корреляция фотосинтетической продуктивности и нутриклеточних изменений у теплолюбивых растений после охлаждения//1У конф. мо-эд. уч. Ин-та почвоведения и фотосинтеза: Тез.докл,- Пущино, 1989,- С. 116-117.

15. Лукаткин A.C. Действие неповреждающих пониженных температур на физио-эго-биохимические процессы в клетках листьев теплолюбивых растений//11зучение, крана и рациональное использование природных ресурсов: Тез. науч. конф- Уфа, 389.- Ч. 2,- С.9.

16. Юмаева Л.А.,Лукаткин A.C. Влияние синтетических регуляторов роста на тер-оустойчнвость и продуктивность зерновых культур//Изучение, охрана и рациональное пользование природных ресурсов: Тез. науч. конф - Уфа, 1989.- Ч. 2,- С.49.

17. Зауралов О.А.,Лукаткин A.C. Цитофизиологические методы диагностики теп-элюбивых растеннн//Ученые Мордовского ордена Дружбы народов государственного жверситета имени Н.П.Огарева - научно-техническому прогрессу: Каталог научных пработок,- Саранск, 1989. - С.48-49.

18. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Грунюшкин И.П. Электрическое сопротивление саней листа теплолюбивых растенин//Доклады ВАСХНИЛ.- 1990 - N 3,- С. 19-22.

19. Лукаткин А.С.,Юмаева Л.А. Цитофизиологические основы селекции растений урца на холодоустойчивость//Молодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной >ны: Тез. докл. науч.-практ. конф - Москва, 1990.С. 140-142.

20. Юмаева Л.А.,Лукаткин A.C. Устойчивость и продуктивность растений проса и иеницы при действии регулятора роста картолниа'/Молодые ученые - сельскому хо-йству Нечерноземной зоны: Тез. докл. науч.-практ. конф,- Москва, 1990.- С.191.

21. Лука1кии Л.С .Юмасва Л.Л.,Ласкова Е.Л. Влияние цитокнниповых препарате! на прорасimnie семян кукурузы при оптимальной и пониженной температуре// Устои чивоегь растений и ее регуляция: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск. 1990,- С.22-28.

22. Юмаева Л.Л.,Лукагкин A.C. Влияние длительности обработки регуляторам! роста на прорастание семян огурцов//Устойчивость растений и ее регуляция: Межвуз сб. науч. тр.- Саранск. 1990,- С. 100-104.

23. Юмаева Л.А.Лукаткин A.C.,Ласкова Е.А. Действие экзогенных регуляторо! роста на состояние клеточных мембран при охлаждении растений//1У Всесоюзн. конф мол. ученых по физиологии растит, клетки. - Москва, 1990.- С. 149.

24. Лукагкнн А.С.,Плюшова С.Н. Активность К',\^'*-АТФазы листьев огурца npi действии пониженных тем пера ryp//IV Всесоюз. конф. мол. ученых по физиологии рас тит. клетки - Москва, 1990,-С.150.

25. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Илюшова С.П. Действие пониженной температу ры на активность АТФаз фракции клеточных оболочек, выделенных из листьев огурца/ Регуляция ферментативной активности у растений: Межвуз. сб. науч. тр.- Горький 1990,-С.31-35.

26. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Кострубнн \1.М.,Лаханов А.П. Генетически обу словленные различия цнтофизнологнческих качеств у сельскохозяйственных расте ний//Индуцированная изменчивость в интродукции и селекции: Межвуз. сб. науч. тр. Саранск, 1991,- С.72-81.

27. Зауралов О.А.,Лукаткин A.C. Цитофизиологические аспекты холодоустойчиво сти теплолюбивых растений//Второй съезд Всесоюзн. об-ва физиологов растений: Тез докл.- М., 1992.-2 ч.-С.77.

28. Лукаткнн A.C. Перекисное окисление мембранных лнпидов у теплолюбивы: растений при охлаждении//Второй съезд'Всесоюзн. об-ва физиологов растений: Тез докл.- М., 1992.-2 ч.-С. 121.

29. Лукаткин A.C. Способ оценки холодоустойчивости растений,- Авторское сви детельство СССР N 1732857, кл. A01G 7/00// А 01Н 1/04, 15.05.92 // Б. и. N 18, 1992.

30. Зауралов O.A.,Лукаткин А.С.,Кадеркаева Л.А. Критерии эффективности регу ляторов роста для повышения холодоустойчивости теплолюбивых растений//Трети] съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл.- С.-Пб, 1993.- Вып.6,- С.570.

31. Зауралов O.A.,Лукаткин А.С.,Шаркаева Э.Ш.,Шестакова A.C. Временная дина мика изменения клеточных параметров при развитии холодового поврежденияУ/Трети! съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл.- С.-Пб, 1993,- Вып.6,- С.571.

32. Лукаткин A.C.,Зауралов O.A. Сравнение методов оценки холодового поврежде ния и холодоустойчивости теплолюбивых растений//Третий съезд Всерос. об-ва физис логов растений: Тез. докл.- С.-Пб, 1993,- Вып.6,- С.658.

33. Лукаткин А.С.,Сапуненкова Е.Е. Кальциевый статус и Са-АТФаза в проростка кукурузы при охлаждении//Третий съезд Всерос. об-ва физиологов растений: Тез. докл. С.-Пб, 1993,- Вып.6,- С.659.

34. Лукаткин А.С.,Шаркаева Э.Ш.,Зауралов O.A. Динамика изменения экзоосмос электролитов из листьев кукурузы при различной интенсивности холодового стресса Физиология растений,- 1993,- Т.40, N 5.- С.770-775.

35. Зауралов О.А.,Шаркаева Э.Ш.,Лукаткин А.С.,Шестакова А. Развитие холодовс го повреждения теплолюбивых растений в ходе охлаждения//ХХ1 Огаревские чтенш Матер, науч. конф,-Саранск, 1993,- С.37-38.

36. Лукаткин А.С.,Сапуненкова Е. Экзогенный кальций и Са-АТФаза в листьях те плолюбивых растений при охлаждении//ХХ1 Огаревские чтения: Матер, науч. конф Саранск, 1993,- С.42.

37. Лукаткин A.C., Кадеркаева Л.А. Термопротекторное действие экзогенных ф! тогормонов при обработке теплолюбивых растсний//ХХ11 Огаревские чтения: Тез. нау-конф,- Саранск, 1993,- С. 101 -102.

38. Чауралов О.Л.Лукагкиц Л.С.,Чернова Е.Л. Влияние охлаждения ра шиной литс.тыюсгн па появление повреждений у проростков нроса//Физиоло[ня растений.-т.- Т.41, N -4,- С.603-608.

39. Чауралов О.А..Лукаткин А.С.,Кадсркаева Л.Л. Индукция холодоустойчивости у :плолюбнвых растений экзогенными ре!улягорамн роста//1Гнлуцированная нзменчи-эсть и адаптация растений: Межвуз. сб. науч. тр.-Саранск, 1995,- С.48-51.

40. Чауралов О.А.,Шаркаева Э.Ш..Лукаткин Д.С. Индуцированные охлаждением зменения цигофизнологнческнх параметров в листьях кукурузы//Индуцнрованная из-енчивость и адаптация растений: Межвуз. сб. науч. тр.- Саранск, 1995,- С.52-56.

41. Лукаткин А.С.,Зауралов О.Л. Влияние синтетических аналогов фнтогормонов а цитофизиологнчекие процессы при охлаждении теплолюбивых растений/УТретья 1ежд) народная конференция "Регуляторы роста и развития растений": Тез. докл.- М., ?95,- C.27-2S.

42. Зауралов О.Л..Лукаткин А.С. Повышение холодоустойчивости теплолюбивых тстений при обработке семян цитокининовычи нрепаратами/АГретья Международная знференция "Регуляторы роста и развития растений": Тез. докл.- М.. 1995 - С.97-98.

43. Лукаткин А.С.,Шаркаева Э.Ш..Чауралов О.А. Изменения нерскисного окислена липидов в листьях теплолюбивых растении при различной длительности холодово-) стресса//Фнзиология растений,- 1995,- Т.42, N 4,- С.538-542.

44. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С. Влияние пониженных температур на дыхание зоростков теплолюбивых растений//Международное совещание: Дыхание растений: изиологические и экологические аспекты: Программа и тез.- Сыктывкар, 1995.-С.59-61.

45. Лукаткин А.С.,Тямкина О Н. Генерация супероксидного анионраднкала в клет-1х листьев кукурузы при развитии холодового стрессаУ/XXIV Огаревские чтения: Тез. жл. науч. конф.: В 3 ч,- Ч.2.- Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 1995,- С.26-27.

46. Шаркаева Э.Ш..Лукаткин А.С. Влияние охлаждения различной длительности и ттенсивности на рост мернстематических клеток конуса нарастания кукурузы//ХХ1У гаревскне чтения: Тез. докл. науч. конф.: В 3 ч,- Ч.2.- Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, )95,- С.37-38.

47. Lukatkin A.S. Use of cell cultures chilling-sensitive plants for studying of chilling images//Physical-ChemicaI Basis of Plant Physiology: Annual symposium (5-8 Febr., 1996, :nza): Abstracts.- Pushchino, 1996,- P.103.

48. Lukatkin A.S.,Tyamkina O.N. Lipid peroxidation in the leaves of chilling-sentivite ants as a factor of chilling stress //Physical-Chemical Basis of Plant Physiology: Annual ■mposium (5-8 Febr., 1996, Penza): Abstracts.- Pushchino, 1996,- P.103.

49. Zauralov O.A.,Lukatkin A.S.,Sharkaeva E.Sh. The effect of chilling duration and tensivity on physiological processes in maize plants//Physical-Chemical Basis of Plant lysiology: Annual symposium (5-8 Febr., 1996, Penza): Abstracts.- Pushchino, 1996,- P. 117.

50. Зауратов O.A.,Лукаткин А.С. Влияние экзогенных аналогов фнтогормонов на шодоустойчивость теплолюбивых растений//Афохимия,- 1996,- N 1,- С. 109-119.

51. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Калинина И.В.,Шаркаева Э.Ш. Физиологические гацессы в проростках кукурузы под влиянием продолжительности охлаждения// Док-1ды Росс. Акад. с.-х. наук,- 1996,- N 2 - С. 15-17.

52. Зауралов О.А., Шаркаева Э.Ш., Апарин С В., Лукаткин А.С. Ростовые реакции растений кукурузы на разных уровнях организации материи при пониженной темпера-ре/7Влияиие физических и химических факторов на рост и развитие сельскохозяйст-нных культур: Тез. второй межвуз. конф. - Орехово-Чуево, 1996,- С.29.

53. Зауралов О.А.,Лукаткин А.С. Тканевые и клеточные аспекты холодоустойчиво-и и холодового повреждения теплолюбивых растений //Успехи современной био.то-и,- 1996 -Т. 116. вып.4.-С.418-431.

54. Чауралов О.А.,Лукаткин А.С.,Шаркаева Э.Ш. Внутриклеточный pll тканей лис-кукурузы в динамике охлаждения различной интенсивности//!Ьвестия РАИ. Сер.

биологическая,- 1997,-N 1,- С.96-99.

55. Зауралов О.А.,Колмыкова Т.С.,Лукаткин A.C. Влияние продолжительное! предпосевной обработки семян регуляторами роста на прорастание и содержание в ни фитогормонов//С.-х. биология - 1997,-N 1,-С.80-84.

56. Лукаткин А.С.,Исанкина Е.Е. Кальциевый статус и холодовое повреждав проростков кукурузы//Физиологля растений,- 1997,- Т.44, N 3.C.392-396.

57. Лукаткин A.C.,Левина Т.Е. Влияние экзогенных модификаторов перекисно! окисления липидов на холодовое повреждение листьев огурца//Физиология растений 1997,-Т.44, N 3,- С.397-403.

58. Лукаткин A.C.,Зауралов O.A. Сравнение способов применения регуляторе роста для повышения холодоустойчивости теплолюбивых растений//Четвертая Мсжд; нар. конф. "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г.): Тез. докл.- V 1997,- С.197-198.

59. Лукаткин A.C. Влияние различных классов регуляторов роста на индукцию х лодоустойчивости теплолюбивых растений//Четвертая Междунар. конф. "Регулятор роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г.): Тез. докл.М., 1997.- С.198-199.

60. Лукаткин A.C., Зауралов O.A., Шаркаева Э.Ш., Апарин C.B., Тямкина ОТ Аверкина В.И. Физиология холодового повреждения теплолюбивых растений//Физик химические основы физиологии растений и биотехнология: 3-й ежегодный симпозиу 27-28 июня 1997,- М., 1997.- С. 83.

61. Зауралов О.А.,Колмыкова Т.С.,Лукаткин A.C. Зависимость роста проростков содержания в них фитогормонов от продолжительности обработки семян регуляторах роста//Доклады Росс. акад. с.-х. наук- 1997,- N 3.- С. 6-7.

62. Зауралов O.A.,Лукаткин A.C. Последействие пониженных температур на дых ние теплолюбивых растений//Физиология растений,- 1997.- Т.44, N 5,- С. 736-741.

Подписано в печать 22. 04. 98. Объем 2,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ N 326.

Типография Издательства. Мордовского университета 430000, Саранск, ул. Советская, 24.

Информация о работе

Лукаткин, Александр Степанович
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы