Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цифровое фотоуправление возбудимостью монослоя кардиомиоцитов для экспериментального моделирования автоволновых процессов в сердце

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Цифровое фотоуправление возбудимостью монослоя кардиомиоцитов для экспериментального моделирования автоволновых процессов в сердце"

На правах рукописи

Ерофеев Иван Станиславович

Цифровое фотоуправление возбудимостью монослоя кардиомиоцитов для экспериментального моделирования автоволновых процессов в сердце

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

НАПР 2015

Пущино - 2015

005567304

005567304

Работа выполнена в лаборатории биофизики возбудимых систем ФГАОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет)».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат физико-математических наук Агладзе Константин Игоревич

доктор физико-математических наук, профессор Гурия Георгий Теодорович (зав. лабораторией математического моделирования биологических процессов Гематологического научного центра Минздрава РФ, г. Москва),

кандидат физико-математических наук Морнев Олег Алексеевич

(в.н.с. лаборатории физической биохимии ИТЭБ РАН, г. Пущино)

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, г. Москва

Защита состоится « 20 » мая 2015 г. в 13-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290, Московская область.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290, Московская область, и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.

Автореферат разослан «ЪО » 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Ланина Н.Ф.

к.ф.-м.н.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Исследование автоволновых процессов в возбудимых системах является одним из классических направлений современной биофизики1. Класс возбудимых систем необычайно широк2: реакционно-диффузионная среда Белоусова-Жаботинского, аксоны и дендриты нейронов, морфогенетические системы. Важнейшим примером возбудимой системы, изучаемой в рамках биофизики, является сердечная ткань1. Биофизические исследования сердца имеют фундаментальное значение, стимулируя развитие новых подходов к лечению болезней сердечно-сосудистой системы. Ярким примером влияния биофизических подходов на практическую кардиологию является открытие механизмов возникновения сердечных аритмий в результате образования вращающихся волн или реентри3.

Новые перспективы в биофизике сердца открывает развитие методов не-инвазивного, в том числе оптического, контроля возбудимости клетки4. Помимо стремительно развивающихся методов оптогенетики представляет интерес альтернативный подход, основанный на фотосенсибилизации клеток сердца химическими агентами5. Развитие данного подхода и его сочетание с современной цифровой техникой для прецизионного контроля активности монослоя кардиомиоцитов представляется особенно актуальным, так как позволяет эффективно манипулировать пространственной динамикой возбуждения для экспериментального моделирования автоволновых процессов в сердечной ткани.

1 A.T. Winfree. When Time Breaks Down: The Three-Dimensional Dynamics of Electrochemical Waves and Cardiac Arrhythmias. - Princeton University Press, 1987.

2 Г.Р. Иваницкий, В.И. Кринский, О.А. Морнев. Автоволны", новое на перекрестках наук // Кибернетика живого. Биология и информация. - М.: Наука. - 1984. - С. 24-37.

3 A.S. Dhamoon, J. Jalife. The inward rectifier current (/ki) controls cardiac excitability and is involved in ar-rhythmogenesis // Heart Rhythm. - 2005. - T. 2. -№. 3. - C. 316-324.

4 F. Zhang et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry // Nature. - 2007. - T. 446. - №. 7136. -C. 633-639.

5 Magome N., Agladze K. Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture // Physica D: Nonlinear Phenomena. -2010. -T. 239. -№. 16. -C. 1560-1566.

Цели и задачи исследования

Основной целью работы являлось создание системы цифрового фотоуправления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов и разработка областей его применения. В соответствии с этим ставились следующие задачи:

1. Разработка экспериментальной установки, позволяющей динамически управлять пространственной возбудимостью монослоя кардиомиоцитов при помощи света.

2. Изучение действия стильбен триметиламмония бромида на возбудимость монослоя кардиомиоцитов.

3. Использование экспериментальной модели фотосенсибилизированного монослоя кардиомиоцитов для проверки гипотезы о том, что антиаритмическое действие препаратов, понижающих возбудимость в сердце, заключается в дестабилизации и уничтожении заякоренной спиральной волны.

4. Применение цифрового фотоуправления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов для создания элементов аналоговых вычислительных систем на примере «волнового диода» (системы с односторонней проводимостью волн возбуждения) и задачи о нахождении кратчайшего пути в лабиринте.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые разработана экспериментальная установка для цифрового фотоуправления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов. По результатам экспериментального моделирования дестабилизирующего действия антиартимиче-ского препарата на заякоренные спиральные волны был обнаружен неизвестный ранее механизм гибели спиральной волны: в результате роста ядра спиральной волны образуется локальное сужение в её проводящем пути, блокирующее её проведение и приводящее к её гибели. В работе впервые осуществлена на практике возможность использования монослоя кардиомиоцитов в качестве аналоговой вычислительной системы.

Практическая ценность работы определяется тем, что созданная установка цифрового фотоуправления возбудимостью кардиомиоцитов может быть ис-

пользована для экспериментального моделирования и решения широкого класса задач, посвященных исследованию автоволновых процессов в монослое кар-диомиоцитов. В области перспективных биомедицинских приложений метод фотосенсибилизации кардиомиоцитов может использоваться для системы обратимой фотоаблации и послужить основой для разработки локальных светочувствительных анестетиков.

Положения, выносимые на защиту

1. Стильбен триметиламмония бромид обратимо блокирует возбудимость монослоя кардиомиоцитов без видимого повреждения клеток. Однократное облучение УФ монослоя кардиомиоцитов в растворе стильбен триметиламмония бромида приводит к необратимому блоку возбудимости, сохраняющемуся в течение не менее 24 ч. после смены буфера.

2. В монослое кардиомиоцитов ограниченного размера возможен сценарий гибели заякоренной спиральной волны, заключающийся в её диссипации в локальном сужении, которое образовалось в результате роста ядра спиральной волны.

3. Контакт двух сужающихся проводящих путей с разными углами сужения в монослое кардиомиоцитов может обладать односторонней проводимостью автоволн.

4. Монослой кардиомиоцитов с заданной геометрией проводящих путей позволяет находить кратчайший путь в лабиринте методами аналоговых вычислений.

Апробация работы

Работа докладывалась на семинарах лаборатории «наноконструирования мембранно-белковых комплексов для контроля физиологии клетки» МФТИ. Отдельные главы работы докладывались на семинаре Института теоретической и экспериментальной биофизики, Пущино, и на следующих конференциях:

1. Европейская конференция по искусственной жизни (ECAL, Париж, 2011),

2. Европейская конференция по динамическим системам (Dynamic Days Europe, Ольденбург, 2011),

3. 1-я Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и индустрии» (Долгопрудный, 2011),

4. 1-я и 2-я Международная научная конференция "Нестабильности в возбудимых сетях и возможности управления ими" (Долгопрудный 2012, 2014),

5. Международная конференция по лекарственной разработке и терапии (ICDDT, Дубай, 2012),

6.2-й Российский конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2012),

7. 2-я Международная конференция «Рост и регенерация сердца» (Витербо, 2014). Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, входящих в перечень ВАК, и 7 тезисов докладов конференций.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти разделов основного текста, заключения и списка цитируемой литературы. Работа содержит 113 страниц, 42 рисунка, 2 таблицы. Библиография включает 114 наименований.

Благодарности

Автор считает своим долгом выразить глубокую признательность и благодарность к.ф.-м.н. Агладзе Константину Игоревичу за руководство работой и помощь в её выполнении. Автор благодарит к.б.н. H.H. Агладзе за ценные указания по работе с монослоем кардиомиоцитов и помощь в проведении экспериментов. Автор признателен к.б.н. К.А. Мотовилову за помощь в разработке химического синтеза С-таба и совместную экспериментальную работу. Автор благодарит A.C. Тепленина и О.В. Галайдыча за ценные замечания и активное участие в обсуждениях на семинарах, а также А.К. Гребенко, A.B. Диброва и B.C. Горбунова за содействие в проведении экспериментальной работы по оптическому картированию. Автор выражает признательность к.ф.-м.н. К.Г. Гурии и H.H. Кудряшовой за неоднократное обсуждение результатов работы и замечания по поводу печатного варианта диссертации.

Содержание работы

В разделе 1 проводится анализ литературы, посвященной экспериментальным моделям сердца и сердечной ткани, спиральным волнам. Подробно рассматриваются работы, связанные с воздействием азотаба на монослой кардио-миоцитов. Анализируются эксперименты по созданию аналоговых вычислительных систем с использованием возбудимых сред. Делаются выводы о теоретической применимости фотоуправляемого монослоя кардиомиоцитов для моделирования проводящих путей, в том числе изменяющихся от времени.

В разделе 2 описываются основные методики, использованные в работе, приводятся протоколы приготовления образцов и проведения экспериментов. Подробно описываются методы обработки результатов.

В разделе 3 описывается созданная в процессе работы экспериментальная установка, позволяющая осуществлять цифровой фотоуправление возбудимостью монослоя кардиомиоцитов, приводятся её технические характеристики и изображения волновых структур, полученных с её помощью. Описывается обнаруженное действие стильбен триметиламмония бромида.

Раздел 4 посвящён задаче уничтожения заякоренной спиральной волны на культуре кардиомиоцитов путём её дестабилизации. Приводятся результаты моделирования антиаритмического действия препарата, понижающего возбудимость сердечной ткани, на заякоренную спиральную волну. Приводится подробный анализ процесса дестабилизации волны и её уничтожения. Описывается новый механизм гибели спиральных волн при понижении возбудимости кардиомиоцитов в средах ограниченного размера.

В разделе 5 рассматривается практическая применимость цифрового контроля сердечной ткани для аналоговых вычислительных систем на примере «волнового биологического диода» и задачи о поиске пути в лабиринте. Приводятся результаты распространения автоволн в разных направлениях в «волновом диоде», обсуждается связь подобной геометрии проведения волн возбуждения с причинами возникновения аритмий.

В заключении даётся перечень результатов, выносимых на защиту, и обсуждаются возможные пути их практического применения.

Основные результаты работы

Установка цифрового фотоуправления возбудимостью монослоя кар-диомиоцитов

Метод фотоуправления возбудимостью сердечных клеток в настоящей работе основывается на влиянии фотоизомеров (2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил) диа-зен-1-ил] фенокси} этил) триметиламмония бромида (далее азотаба) на кардио-миоциты. Монослой кардиомиоцитов получался согласно протоколу6 на покровных стёклах, покрытых фибронектином. Культура сердечных клеток подвергалась оптическому картированию на 3-5 день после выделения. Оптическое картирование проводилось на флуоресцентном микроскопе Olympus MVX-10 с полем зрения до 4 см, что позволяло наблюдать весь образец, и регистрировалось при помощи CMOS камеры Andor iXon. Образцы с монослоем кардиомиоцитов окрашивались в течение 35 мин Са2+-зависимым красителем Fluo-4 AM, и при возбуждении на длине волны 490 нм, области, в которых происходил выброс Са2+, флуоресцировали на длине волны 520 нм. Таким образом, визуализировались волны возбуждения, распространяющиеся в монослое кардиомиоцитов.

транс-изомер блокирует ¡(«с-изомер не блокирует

распространение волны распространение волны

Рис. 1. Структурные формулы изомеров азотаба и схема фотоизомеризации. 7ранс-изомер

(слева) блокирует распространение волны возбуждения в монослое кардиомиоцитов и

может быть переведён в г/ис-форму (справа) ближним УФ светом (365 нм), которая не

блокирует распространение волны. Обратная изомеризация происходит либо в отсутствие

освещения (темновая релаксация), либо под действием синего света (450 нм).

6 A. Arutunyan et al. Localized injury in cardiomyocyte network: a new experimental model of ischemia-reperfusion arrhythmias //American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. -2001. -T. 280. -№. 4. -C. HI905-H1915.

Действие азотаба, как фотосенсибилизатора, на монослой кардиомиоцитов было открыто относительно недавно7, вкратце его можно описать следующим образом. Азотаб может находиться в двух формах: цис и транс (рис. 1.). Трансизомер энергетически более выгоден и в темновом состоянии его концентрация составляет около 2/3 от всего азотаба. Перевести транс-азотаб в цис-состояние возможно при помощи ближнего УФ излучения (365 нм), принудительный обратный переход достигается синим светом (450 нм). При этом изомеры азотаба оказывают разное влияние на возбудимость сердечных клеток: транс-изомер блокирует проведение волны возбуждения, а цис-изомер практически не оказывает воздействия на скорость распространения волн.

Если освещать раствор азотаба одновременно УФ и синим светом, то можно получить динамически стабильную смесь двух изомеров, в частности таким образом можно регулировать концентрацию ингибитора распространения волны возбуждения - транс-азотаба. Положим Еъ - интенсивность синего света, £иу - интенсивность ультрафиолетового света, А0 - полная концентрация азотаба, Ас - концентрация транс-изомера, кг — скорость цис—*транс фотоизомеризации, к2 — скорость транс—>цис фотоизомеризации, к3 — скорость термической цис—*транс релаксации. Тогда для концентрации А1 можно записать следующее дифференциальное уравнение: с1А

= к^Ао - АС)ЕЬ - к2АьЕи„ + к3{А0 - Лс).

При постоянной концентрации транс-изомера йАь/(И = 0. Таким образом:

А =А Мь + к3 1 0 кгЕь + к2Ет + к3

Поскольку термическая релаксация по сравнению с фотоизомеризацией при характерных интенсивностях освещения 1 мВт/см2 является медленным процессом (десятки минут против десятков миллисекунд), то скоростью к3 можно пренебречь. Обозначив п — к2Еии/к1Еь, окончательно получим:

1

7 N. Magome, K. Agladze. Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture // Physica D: Nonlinear Phenomena. - 2010. - T. 239.-№. 16.-C. 1560-1566.

Таким образом, концентрацию транс-изомера азотаба можно регулировать соотношением интенсивностей УФ и синего света (параметр и). В настоящих экспериментах по фотоуправлению возбудимостью монослоя кардиомиоцитов синяя компонента освещения присутствует постоянно, так как необходима для возбуждения флюоресценции красителя Р1ио-4 АМ, поэтому концентрация транс-изомера регулируется интенсивностью УФ излучения.

Рис. 2. Принципиальная схема экспериментальной установки цифрового фотоуправления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов. Картина засветки (1) формировалась на управляющем компьютере (2) и выводилась на проектор. Микрозеркальная матрица проектора (3) освещалась УФ диодом (4), изображение с матрицы фокусировалось на образце при помощи линзы (5) и зеркала (6). Образец (7) исследовался методом оптического картирования на флуоресцентном микроскопе Olympus MVX-10 (8). Изображение распространения волн возбуждения (9) регистрировалось камерой Andor iXon (10).

Если монослой кардиомиоцитов в присутствии азотаба освещать УФ светом частично, то волны будут распространяться только в засвеченных областях. В настоящей работе для проведения прецизионного пространственного освещения образца УФ была создана установка на базе микроскопа Olympus MVX-10 и модифицированного проектора Taxan KG-PL105S (рис. 2). Оптическая система установки проецировала УФ изображение на образец, и таким образом,

стало возможным управлять возбудимостью отдельных частей монослоя кар-диомиоцитов.

Длина волны освещения 365 нм

Максимальная мощность освещения 12,5 мВт/см2

Размер освещаемой области 2x2 см

Пространственное разрешение проектора 50 мкм

Динамическая контрастность 1:1200

Статическая контрастность 1:120

Среднее время восстановления возбудимости при концентрации азотаба 100 мкМ 30 сек

Среднее время подавления возбудимости при концентрации азотаба 100 мкМ 10 сек

Таб. 1. Параметры установки цифрового фогоуправления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов.

Рис. 3. Фотография модуля формирования изображения для цифрового фото-управления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов (вид сверху). 1 — проектор, 2 — микрозеркальное устройство проектора на штативе, обеспечивающем прецизионное позиционирование и ориентирование, 3 - УФ диод, 4 - фокусирующая линза, 5 - микроскоп с образцом (за кадром).

Измеренные технические параметры установки приведены в таб. 1. Фотография установки приведена на рис. 3. Можно заметить, что характерные времена восстановления и подавления возбудимости сердечной культуры азотабом

велики по сравнению с характерными временами фотоизомеризации самого азотаба (миллисекунды против секунд). Это означает, что процесс взаимодействия азотаба с кардиомиоцитами медленнее фотоизомеризации самого азотаба.

При помощи установки цифрового фотоконтроля сердечной ткани стало возможным формировать УФ светом картину проводящих путей для автоволн возбуждения на сердечной ткани, ограничивая распространение волн за пределами освещенной УФ области. В качестве экспериментов, показывающие принципиальные возможности установки, были проведены опыты с проводящими путями различной формы (рис. 4).

Рис. 4. (а) Наложение области освещенной УФ (белый) и области, в которой распространяются волны (белый и красный), для У-образного проводящего пути, (б) Последовательность фронтов распространения волны по кольцевому проводящему пути, (в) Распространение волны по извилистому проводящему пути. Высота и цвет соответствуют флюоресцентному сигналу от культуры ткани.

Исследование действия С-таба на возбудимость монослоя кардиомио-цитов

В работе было исследовано действие на возбудимость монослоя кардио-миоцитов другого фотосенсибилизатора: 2-{4-[(Е)-2-(4-этоксифенил) винил] фенокси}-Ы,М,1М-триметилэтанамина бромида (стильбен триметиламмония бромида), далее С-таба. С-таб был синтезирован как стильбеновый аналог азотаба и отличается от азотаба тем, что вместо азобензеновой связи (—1М—1М—) содержит стильбеновую связь (-С=С-) (рис. 5а).

а

Г

в

о

Рис. 5. (а) Структурная формула С-таба. (б-в) Схема действия С-таба на культуру ткани, (б) Если к культуре сердечной ткани, способной проводить волны возбуждения добавить раствор С-таба, то культура становится невозбудимой. При отмытии С-таба возбудимость клеток восстанавливается, (в) Если перед заменой буфера культура сердечной ткани с раствором С-таба была освещена УФ, то возбудимость клеток не восстанавливается.

В работе было показано, что добавление 50-200 мкМ С-таба к монослою кардиомиоцитов полностью ингибирует его возбудимость. При этом после смены буфера возбудимость клеток восстанавливается (рис. 56). Если же культура была освещена УФ (доза облучения 100-500 мДж/см2), то после смены буфера возбудимость клеток не восстанавливается (рис 5 в).

Был поставлен эксперимент, иллюстрирующий обнаруженное действие С-таба на монослой кардиомиоцитов. К возбудимому монослою кардиомиоцитов был добавлен 100 мкМ раствор С-таба, после чего половина образца была подвергнута 30-секундному облучению УФ интенсивности 5 мВт/см2. После замены буфера было показано, что волны возбуждения распространяются только в необлучённой области (рис. 6).

В настоящей работе было показано, что блок активности сердечных клеток сохраняется в течение, по меньшей мере, 24 ч. Для этого образец с клетками подвергался процедуре частичного освещения и последующей отмывки (так же, как описано ранее). Затем, после оптического картирования образец тщательно отмывался от остатков С-таба и помещался в инкубатор на сутки. Через 24 часа образец повторно красился Р1ио-4 АМ, и проводилось его картирование. На рис. 7 показаны области активности образца сразу после проведения экспери-

мента с С-табом и через сутки. В рамках погрешности снятия и обработки данных области активности можно считать идентичными.

б

Рис. 6. (а) Раскадровка распространения волны возбуждения по образцу до добавления 100 мкМ раствора С-таба. Видно, что весь образец возбудим, (б) Распространение волны возбуждения по образцу после добавления раствора С-таба, облучения верхней половины образца УФ и последующего отмытия. Видно, что в облучённой области активность клеток не восстановлена. Сторона изображения 2 см.

Рис. 7. Области активности образца сердечной ткани сразу после эксперимента с С-табом и через 24 часа. Из неизменности в рамках погрешности возбудимой области можно сделать вывод, что действие С-таба сохраняется по меньшей мере на сутки.

Одно из объяснений сохранения блока возбудимости сердечных клеток после отмытия от раствора С-таба заключается в разрушении двойной связи между атомами углеродами в С-табе в результате поглощения молекулой УФ фотона с образованием свободных радикалов. Свободные радикалы могут вступать в реакцию как с двойными связями ненасыщенных липидов мембраны, так и с нуклеофильными группами белков, запуская реакцию радикального присоединения. Образование ковалентных связей между С-табом и компонентами мембраны снижают возможность выхода С-таба во внеклеточное пространство.

Моделирование антиаритмического действия препарата, понижающего возбудимость сердечной ткани, на заякоренную спиральной волну, приводящее к её дестабилизации и уничтожению

Монослой кардиомиоцитов часто используется как экспериментальная модельная система для изучения сложного характера распространения волн возбуждения в сердце, в частности, в монослое кардиомиоцитов могут распро-

страняться спиральные волны (реентри). Существует мнение, что спиральные волны в реальном сердце редко бывают свободными: они совершают вращение вокруг какой-нибудь гетерогенности (неоднородности). Также было показано, что в то время как свободные спиральные волны достаточно легко могут дрейфовать, дестабилизация заякоренных спиральных волн представляется более сложной задачей.

60г с

2 3 4 5

Интенсивность УФ, мВт/см2 Рис. 8. График зависимости скорости распространения волны возбуждения от интенсивности УФ освещения монослоя кардиомиоцитов в 100 мкМ растворе азотаба. При значениях интенсивности УФ менее 2 мВт/см2 клетки либо не возбуждалась вообще, либо фронт волны хаотически рвался, что говорило о пограничном характере возбуждения.

Поскольку транс-изомер азотаба является ингибитором возбудимости сердечных клеток, то его можно использовать для моделирования действия ан-тиартимического препарата, понижающего возбудимость сердечной ткани.

Ранее было показано, что изменением интенсивности УФ излучения можно регулировать концентрацию транс-изомера азотаба. Если интенсивность УФ достаточно низка, то концентрация транс-изомера оказывается высокой и происходит полное ингибирование волн возбуждения в монослое кардиомиоцитов. Однако, при недостаточно низких значениях интенсивности УФ происходит неполное ингибирование возбудимости клеток, и волны возбуждения распространяются по монослою кардиомиоцитов с замедленной скоростью. На рис. 8 представлен график зависимости скорости фронта волны возбуждения от интенсивности УФ освещения монослоя кардиомиоцитов в растворе азотаба.

Схема эксперимента по дестабилизации спиральной волны заключалась в следующем. В монослое кардиомиоцитов с 100-200 мкМ раствором азотаба, находящемуся под УФ излучением интенсивности 6,5-7,5 мВт/см2, вызывалась спиральная волна методом надкритической высоко-частотной стимуляции электродом (рис. 9). Затем интенсивность УФ излучения понижалась на 6070%, и наблюдались изменения в поведении спиральной волны вплоть до её исчезновения. После исчезновения спиральной волны проводилась контрольная стимуляция электродом монослоя кардиомиоцитов при той же интенсивности УФ. Контроль считался положительным, если стимуляция вызывала распространению круговой автоволны: это означало, что возбудимость монослоя кардиомиоцитов подавлена не полностью и в нём могут распространяться волны возбуждения. В дальнейшем рассматриваются эксперименты, в которых удавалось дестабилизировать спиральную волну вплоть до её исчезновения при положительном контроле.

Рис. 9. Спиральная волна, стабилизированная гетерогенностью (прикреплённая). Слева приведена раскадровка вращения волны. Справа - карта времени активации (сторона изображения 2 см). На карте времени активации хорошо видно центральное ядро вращающейся волны.

В работе установлено, что в процессе дестабилизации наблюдается рост ядра спиральной волны - области, не подвергающейся возбуждению, вокруг которой совершает вращение спиральная волна. На рис. 10 показан рост ядра спиральной волны. Этот эффект обусловлен зависимостью скорости волны и длительности потенциала действия от возбудимости, или, иными словами, от соотношения скорости реакции и диффузии в системах реакции-диффузии, к которым относится сердечная ткань. При понижении возбудимости спиральная волна больше не может вращаться вокруг первоначальной неоднородности и включает в своё ядро ближайшие неоднородности.

В результате проведённых экспериментов стало возможным подробно рассмотреть механизм исчезновения спиральной волны. В силу неоднородности монослоя кардиомиоцитов рост ядра спиральной волны происходил несимметрично. Край ядра спиральной волны смещался к периферии, где оказывался поблизости либо от границы клеток, либо от периферийной неоднородности, не пропускающей волны возбуждения. Таким образом, в пути спиральной волны возникало сужение, в котором через некоторое время происходило её исчезновение (рис. 11).

Время, с

5 10 15 20 25

Время, с

Рис. 10. Рост ядра спиральной волны. Слева приведён график движения вершины спиральной волны, справа - увеличение площади ядра спиральной волны от времени.

Рис. 11. Гибель спиральной волны в образованном в результате роста спиральной волны локальном сужении. Чёрным цветом показаны области монослоя кардиомиоцитов, в которые не заходила волна. Красным цветом показаны последовательные фронты спиральной волны. Время между фронтами 60 а о „

мкс. Спиральная волна проходит через локальное сужение на предпоследнем обороте (а) и не проходит на последнем (б). Поскольку монослой кардиомиоцитов можно моделировать как систему реакции-диффузии, то перейдя к понятиям активатор-ингибитор, этот эффект локального сужения может быть объяснён в терминах несовпадения истока и стока {source-sink mismatch) общего для многих систем реакции-диффузии. Выходя из локального сужения, активатору волны необходимо возбудить большую площадь среды, вследствие чего возникает несовпадение истока и стока. Если количество активатора, приходящееся на клетку, оказывается подпорого-

вым, то вместо лавинообразного открытия каналов и роста концентрации активатора, волна затухает и не распространяется дальше.

Исследование «волнового диода»

«Волновой диод» - структура в автоволновой среде, которая позволяет автоволне распространяться в одном направлении и не даёт распространяться в обратном8. Исследование «волновых диодов», с одной стороны, является интересным с точки зрения аналоговых вычислительных систем, так как «диод» представляет простой элемент, на базе которого могут быть реализованы сложные вычислительные схемы. С другой стороны, «волновой диод» как структура нарушающая симметрию, может приводить к разрыву волн и образованию ре-ентри. Классическая модель образования ре-ентри как раз предполагает однонаправленный блок в одном из путей проведения.

6 \ «

в \Щ

V7 V

Рис. 12. (а) «Волновой диод» с геометрией треугольник-квадрат, (б-в) Схемы распространения волн в зоне контакта, (б) Стимуляция снизу. Автоволна из зоны контакта активирует незначительно большую область, (в) Стимуляция сверху. Автоволна из зоны контакта активирует значительно большую область.

Для создания «волнового диода» на поверхность монослоя кардиомиоци-тов в растворе азотаба УФ-проектором высвечивалась асимметричная структура треугольник-квадрат (рис. 12а). При распространении волны в узкой области контакта возникает несовпадение стока и истока, которое оказывается различным для движения волны в одну и другую стороны (рис. 12б-в). Если ширина контакта d оказывается немного меньше удвоенного критического радиуса ав-

8 К. Agladze et al. Chemical diode // The Journal of Physical Chemistry. - 1996. - T. 100. - №. 33. - C. 1389513897.

товолны, то при распространении волны из треугольника в квадрат волна не может выйти из зоны контакта, так как активатор диффундирует быстрее, чем нарабатывается, и волна затухает. При распространении волны в другую сторону диффузия активатора из зоны контакта происходит в меньший угол, что способствует наработке активатора, и волна преодолевает контакт.

Таким образом, подбором ширины контакта и угла при вершине треугольника можно добиться, чтобы «волновой диод» пропускал волну в одну сторону и не пропускал в другую.

г

Рис. 13. (а) «Волновой диод», спроецированный УФ проектором. В верхней части рисунка видна тень от электрода. По оси х бралась пространственно-временная развёртка, (б) Пространственно-временная развёртка оптического картирования. На развёртке видно, что волна, идущая сверху, не проходит через зону контакта, а волна, идущая снизу - проходит. Горизонтальные полосы — тень от электрода.

На рисунке 13 показаны форма спроецированного «волнового диода» и пространственно-временная развёртка оптического картирования. Видно, что волна из верхней части диода блокируется в зоне контакта, а волна из нижней части проходит в верхнюю часть. Ширина зоны контакта составила 960 мкм, угол расхождения - 57°.

Определение кратчайшего пути в лабиринте

Рассмотрим задачу о распространении автоволны в лабиринте. Будем считать, что критический радиус автоволны много меньше характерного пространственного разрешения лабиринта. Другими словами, можно пренебречь замедлением волны при поворотах и движении вдоль непроводящей границы. Если в

начальный момент автоволна инициировалась в точке А, то через время t фронт волны покажет геометрическое место точек, которые можно достичь за время t из точки А, двигаясь со скоростью волны.

Если рассмотреть распространение автоволн сначала из точки А, а потом из точки В, то мы получим два семейства фронтов A(t) и B(t). Рассмотрим какой-либо фронт A(ti) из первого семейства и найдём самый ранний фронт £(/min) из второго семейства, который имеет общую точку с A(t) (например, касается его). Тогда их общая точка С должна лежать на кратчайшем пути, соединяющем А и В. Действительно, если предположить, что существует путь S, который можно пройти быстрее, чем за время ti+tmm, то это бы означало, что из точки В можно достигнуть точки пересечения пути S и фронта A{t\) за время, меньшее чем tmm, что невозможно, так как все фронты В(/), где t < imin не имеют общих точек с A(t,). Окончательно, совокупность всех точек С для разных времён /, и будет являться кратчайшим путём между точками А и В.

Рис. 14. Лабиринт и найденный в нём кратчайший путь между точками А а В. Разными цветами показано распространение волн возбуждения из точек А и В. Точка С - точка касания фронтов из разных семейств.

Эксперимент по нахождению кратчайшего пути в лабиринте проводился следующим образом: на монослое кардиомиоцитов задавались границы лабиринта; выбирались точки А и В, между которыми в дальнейшем определялся минимальный путь; после культура клеток стимулировалась электродом сначала из точки А, а затем из точки В; распространение волн записывалось при помощи оптического картирования. Затем по точкам касаниям фронтов из разного семейства восстанавливался искомый кратчайший путь (рис. 14).

Выводы

1. Создана оригинальная экспериментальная установка цифрового фотоуправления возбудимостью монослоя кардиомиоцитов, позволяющая динамически управлять геометрией проводящих путей в монослое. В экспериментах с использованием этой установки впервые получены следующие результаты.

2. Показано, что стильбен триметиламмония бромид обратимо блокирует возбудимость монослоя кардиомиоцитов, тогда как облучение УФ монослоя кардиомиоцитов в растворе указанного соединения приводит к необратимому блоку возбудимости, сохраняющемуся в течение не менее 24 ч. после смены буфера.

3. Продемонстрировано, что спиральная волна, вращающаяся вокруг неоднородности, гибнет в локальном сужении, образующемся в процессе роста ядра волны. Это является новым сценарием, дополняющим известные ранее механизмы гибели спиральных волн.

4. Экспериментально показано, что в монослое кардиомиоцитов контакт двух сужающихся проводящих путей с разными углами расхождения поддерживает одностороннее проведение автоволн — эффект, аналогичный явлению в полупроводниковых диодах. Найдены условия реализации этого эффекта.

5. Продемонстрировано, что монослой кардиомиоцитов с заданной геометрией проводящих путей может играть роль аналогового вычислительного устройства: в частности, с использованием такой системы нами экспериментально реализован алгоритм поиска кратчайшего пути в лабиринте.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи

1. Erofeev I. S., Magome N., Agladze К. I. Digital photocontrol of the network of live excitable cells HJETP letters. - 2011. - T. 94. - № 6. - C. 477-480.

2. Галайдыч О. В., Ерофеев И. С., Агладзе К. И. Оптическое картирование волн возбуждения в светочувствительной иммортализованной культуре кардиомиоцитов //Труды МФТИ. - 2013. - Т. 5. -№ 1-17. - С. 94-102.

3. Тепленин А. С., Ерошенко JI. В., Ерофеев И. С., Агладзе К. И. Использование полимерных нановолокон для исследования структурной анизотропии культуры иммортализованных сердечных клеток ИТруды МФТИ. - 2013. - Т. 5. — № 1-17. - С. 140-149.

4. Барсков К. В., Ерофеев И. С., Агладзе К. И. Исследование влияния АзоТАБа на фототаксис Planaria torva 11Труды МФТИ. — 2013. - Т. 5. - № 1-17.-С. 84-93.

5. Erofeev I. S., Agladze К. I. Two models of anisotropic propagation of cardiac excitation wave HJETP letters. - 2014. - T. 100. - № 5. - C. 390-393.

Тезисы докладов и материалы конференций

1. Erofeev I., N. Magome, К.Agladze. Digital photo-control of cardiac tissue. // European Conference on Artificial Life. Back to the Origins of Alife, Paris, August 8-12,2011

2. Erofeev I., Magome N., Agladze K. Digital photo-control of cardiac tissue. // XXXI Dynamic Days Europe, Oldenburg, Germany, September 12-16, 2011

3. Erofeev I., Magome N., Agladze K. Digital photo-control of cardiac tissue. // Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и индустрии», Долгопрудный, 12-13 мая, 2011.

4. Ерофеев И. С., JI.B. Ерошенко, Ю.В. Орлова, К.И. Агладзе. Фотоконтроль сконструированной сердечной ткани. // Сборник тезисов II Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы

клинической медицины - возможное и реальное», Санкт-Петербург. — 2012.-С. 178-179.

5. Erofeev I., L. Eroshenko, Yu. Orlova, and К. Agladze. Digital photo-control of the engineered cardiac tissue. // 5th International Conference on Drug Discovery and Therapy, Dubai, February 18-21,2013

6. Erofeev I. S., N. N. Kudryashova, К. I. Agladze, Applications of photo-controlled cardiac tissue. // Book of Abstracts of the International Conference "Instabilities and Control of Excitable Networks. Focus on: Cardiac Biophysics and General Aspects of Excitable Media Self-organization", Dolgoprudny, 2014,-Moscow: DPS,2014,p. 13.

7. Erofeev I. S., N. N. Kudryashova, К. I. Agladze, Applications of photo-controlled cardiac tissue. // Book of Abstracts of the International Conference "Cardiac Growth and Regeneration", Viterbo, June 22-25,2014

rt n

Ерофеев Иван Станиславович

SiOZ dUVSL

ЦИФРОВОЕ ФОТОУПРАВЛЕНИЕ ВОЗБУДИМОСТЬЮ МОНОСЛОЯ КАРДИОМИОЦИТОВ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ АВТОВОЛНОВЫХ ПРОЦЕССОВ В СЕРДЦЕ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 20.03.2015 г. Формат 60 х 84 '/16. Усл. печ. л. 2,2. Тираж 100 экз. Заказ № 105.

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)»

Отдел оперативной полиграфии «Физтех-полиграф» 141707, Моск. обл., г. Долгопрудный Институтский пер., 9 E-mail: polygraph@mipt.ru