Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трофобластический бета 1-гликопротеин в диагностике и мониторинге беременности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Трофобластический бета 1-гликопротеин в диагностике и мониторинге беременности"

РГ6 од

Российская Академия Наук

') р > ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Тихоокеанский институт биоорганической химии

На правах рукогпг-'

БОГДАНОВИЧ Раиса Нурисламовна

ТРОФОБЛАСТИЧЕСКИЙ (3 ± - ГЛИКО ПРОТЕИН В ДИАГНОСТИКЕ Й МОНИТОРИНГЕ БЕРЕМЕННОСТИ

(П 00.04 "Биохимия"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

Владивосток — 1993

iVtuoid выполнена в поликлинике ДВО РАН и в лаборатории химии, непнфекционного иммунитета им. А.Ф.Павленко Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН

Научные руководители: 1 доктор химических наук

Рл.Ф.Павленко |

кандидат химических наук Мороз C.B.

Научный консультант: академик Оводов ÏO.Q.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Васьковский В.Е.

кандидат химических наук Фролова Г.М

Ведущее предприятие:

Институт Микробиологии и эпидемиологии СО РАМН

Защита состоится ., декабря_^^ г в f^j часов на

заседании специализированного совета Д 003.99.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, т.Владивостох, пр. 100—летая Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН

• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО РАН: г.Владивосток, пр. 100—летня Владивостоку, 159, ДВГИ.

■ . - 1 4 Автореферат разослан "'ó С" /7 _1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Г.И.Прокопенко

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из актуальных задач акушерства и онкологии является изучение биохимических аспектов патогенеза беременности и опухоли. Успешное разрешение этой проблемы создает необходимые условия для разработки методов лечения угрозы выкидыша, бесплодия, опухолей злокачественного характера, а также решения вопросов профилактики и диагностики различных форм болезни.

Наибольшее распространение среди маркеров опухолей получили онкофетальные антигены, одним из представителей которых является трофобласт-специфический 3^-гликопротеин (ТБГ) . Он обнаруживается при беременности и ее патологиях, в том числе и при патологиях злокачественного характера (Татаринов Ю.С., Маскжевич В.Н., 1970) .

В настоящее время практически отсутствуют исследования по изучению влияния метаболической, гормональной, иммунологической терапии на уровень ТБГ яри физиологической беременности, угрозе выкидыша и онкопатологиях.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительное изучение биохимических параметров и теста на ТБГ для поиска объективного доклинического критерия диагностики и мониторинга нормальной и патологической беременности' и опухолей трофобласта.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать микрометод постановки иммуноферментного анализа (ИФА) на ТБГ, определить его чувствительность и воспроизводимость, а также оценить его пригодность по сравнению со стандартной процедурой. _

2. Провести клинические испытания данной тест-системы - определить концентрацию ТБГ в различных биологических жидкостях при

.физиологической и патологической беременности, а также при онкопатологии трофобласта.

3. Изучить динамику гормональных, метаболических, иммунологических реакций при нормально и патологически развивающейся беременности на ранних стадиях.

4. Определить пределы физиологических колебаний биохимических и иммунологических параметров крови и мочи женщин с нормально протекающей беременностью.

5. Установить основные закономерности влияния метаболической, гормональной, иммунологической терапии на продукцию ТБГ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые разработан иммуноферментный микрометод определения ТБГ, максимально

приближенный к клинической практике, по точности и специфичности не уступающий стандартной процедуре. Впервые проведено сравнительное динамическое исследование биохимических, иммунологических параметров у женщин с физиологической и патологической беременностью и показано преимущество теста на ТБГ как наиболее объективного критерия клинической и доклинической оценки эмбрио- и канцерогенеза. Установлены пределы физиологических колебаний биохимических (гормоны, ферменты, ТБГ) и иммунологических (РППЛ) параметров проживающих на Дальнем Востоке женщин с нормально протекающей беременностью и женщин с угрозой вцкидыша.

■ Установлено, что гест на ТБГ быстро реагирует на любые изменения, происходящие в плаценте, является универсальным и достаточно информативным для оценки проводимого лечения.

Впервые показана возможность использования капиллярной крови вместо венозной для определения ТБГ. Разработанный микрометод экономически выгоден и доступен для любых клинических лабораторий.

Применение разработанного микрометода определения ТБГ для диагностики различных нарушений позволило сохранить беременность у 96% женщин с анамнезом выкидыша.

Апробация работы. Результаты работы представлены и доложены на следующих конференциях: на I Всесоюзном • симпозиуме

"Иммунобиотехнология-87" (Таллин, 1987), на I Иммунологическом конгрессе Латвии (Рига, 1991 г. ) , на Научно-практической конференции ТИБОХ ДВО РАН (Владивосток, 1993).

Материалы диссертации опубликованы в 4 работах.

Структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 162 названия. Работа содержит 8 рисунков, 14 таблиц.

Содержание работы

I. Материалы и методы исследования Было обследовано 7 групп женщин (табл.1).

' Таблица 1. Объекты исследования

Группы женщин (подгруппы) Кол-во случаев Возраст Диагноз

Контрольная 190 20-29 Здоровые беременные женщины

(1) Опытная 1 (2) 198 32 24-39 20-32 Привычный выкидыш (гипофункция яичников, смешанная форма, ги-перандрогения) Привычный выкидыш (фетоплацентарная недостаточность)

Опытная 2 (реабилитационная) 18 ■ ' 20-28 Привычный выкидыш (получающая метаболическую терапию до и во время беременности)

Опытная 3 28 19-36 Эктопическая (внематочная) беременность

Опытная 4 12 20-34 Пузырный занос

Опытная 5 5 28-44 Хориокэпителиома матки

Опытная 6 84 19-30 Здоровые небеременные женщины

Аналитические методы. Прегнандиол-и дегидроэпиандростерон (ДЭА) определяли в суточной моче методом, основанным на цветной реакции с концентрированной серной кислотой для прегнандиола и с метадинитробензолом для ДЭА (Чевари С., Чаба И.', 1982, 1983). Гидролиз, выделение и идентификацию ДЭА и прегнандиола проводили по методу, предложенному для определения прегнандиола". Суммарные 17 кортикостероиды (17КС) определяли по унифицированному методу с метадинитробензолом, основанному на использовании цветной реакции Циммермана. Методики отдельных этапов анализа (гидролиз, экстракция, количественное определение) заимствованы из разных работ (Самосудова Н.В., Басс Ж.Х., 1976; Меньшиков В.В., 1987). Суммарные 17 оксикортикостероидьг (170КС) определяли по модифицированному метододу Сильбера и Портерз (в модификации Креховой М.А., 1987). Мочу перед экстракцией обрабатывали (3-глюкуронидазой. 0|тределение содержания суммарных эстрогенов проводили методом Чевари (Чевари С., Чаба И., 1982) , основанном на образовании окрашенных соединений после обработки эстрогенов серной кислотой и гидрохиноном.

Иммунологические методы. Лютропин определяли радиоизотопным методом. Реакцию подавления прилипания лейкоцитов (РППЛ) осуществляли, используя пробирочный метод (Grosser, Tompson, 1983). Хорионический гонадотропин (ХГ) определяли с помощью наборов

"Гравидиагностикум" по методу Котлярской Б.И. (1968). ИФА проводили в сэндвич-варианте на микротитровальных планшетах стандартным методом (Мороз C.B., 1986) и микрометодом, разработанным нами.

Цитохимические и цитологические методы. Дегидрогеназы определяли методом Нахласа с соавт. в модификации Р. п. Нарциссова (1987). Фосфатазы определяли методом азосочетания по Кеплоу в модификации Р. П. Нарциссова' (1987). Кариопикнотический индекс подсчитывали в мазках, взятых из верхнего свода влагалища и окрашенных монохромным методом по Романовскому-Гильзе (Арсеньев М.Г., 1987).

Эмбриональный антиген получали из абортированных плодов человека 8-10 недельного возраста методом высаливания и центрифугирования (Говало В.И., Скуинь Л.М., 1983). Стандартизованный по белку антиген использовали в концентрации 0,5-1 мг/мл. Белок определяли по методу Лоури (Dowry О.H. et al. 1951).

Получение лейковзвеси для проведения иммунотерапии. Выделение аллогенных лимфоцитов осуществляли в асептических условиях по методу В.и.Говало (1992). Для этого использовали кровь мужа беременной женщины или донора.

Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием критериев Стъюдента. Связь между признаками оценивали методом наименьших квадратов. В работе приведены среднеарифметические значения ± стандартная ошибка средней арифметической.

II. Результаты и обсуждение

Разработанный нами микрометод для определения ТБГ в сыворотке капиллярной крови имеет следующие характеристики : Чувствительность определения ТБГ - 5 нг/мл;

Предел определения . - 5-150 нг/мл ;

Объем пробы для анализа - .100 мкл

Концентрация фракции IgG антисыворотки против ТБГ для адсорбции на планшете составляет 10 мкг/мл, а разведение конъюгата 1:400.

Надежность микрометода проверяли тестом - "на открытие" и параллелизм. Определенные количества ТБГ добавляли к нормальной человеческой сыворотке с известив»! содержанием ТБГ (5 нг/мл). Было найдено, что процент открытия находится в пределах 94-104%, а кривые последовательных ' разбавлений стандартного вещества и таких же разведений контрольной плазмы параллельны друг другу; сохраняется также линейность кривых контрольной плазмы. Таким образом, предложенный метод отличается достаточной достоверностью.

- Воспроизводимость разработанного микрометода оценивали по коэффициентам вариации при многократном определении проб с низким (6

мкг/мл), средним (25 мкг/мл) и высоким (100мкг/мл) содержанием ТБГ. Коэффициенты вариации не превышают 10% и, следовательно, микрометод характеризуется надежной воспроизводимостью.

Специфичность тест-системы устанавливали добавлением в стандартные калибровочные пробы ТБГ лютропина, фоллитропина, пролактина, ХГ и др. При этом было найдено, что добавка указанных препаратов не влияет на определение ТБГ.

Результаты стандартного и микрометода ИФА хорошо согласуются и статистически достоверны (р<0,05). Однако разработанный микрометод экономически более выгоден и пригоден для любых клинических лабораторий. Он позволяет эффективно оценивать уровень ТБГ при беременности, в 3 раза уменьшить время проведения анализа, вдвое сократить расход реагентов и используемого материала.

С помощью микрометода мы обнаруживали ТБГ в сыворотке капиллярной крови, начиная с 15-2 0 дня после оплодотворения яйцеклетки. Уровень антигена варьировал от 20 до 500 нг/мл, увеличиваясь в 3-4 раза каждую неделю беременности. >

В самый ранний период беременности (с 3 до 5 недель) уровень ТБГ невелик- и варьирует от 0,5 мкг/мл до 4,5 мкг/мл. По мере увеличения срока беременности содержание ТБГ в сыворотке капиллярной крови (рис.1,а) резко возрастает (от 4,4 до 49,5 мкг/мл) , что позволяет судить не только о наличии беременности, но и косвенно о ее сроках. В опытных группах (рис.1) также отмечается увеличение уровня ТБГ: для подгруппы 1 от 3,6±0,4 до 32,6+3,8 мкг/мл р<0,05 (рис.1,6), для подгруппы 2 от 2,9+0,6 до 24,2 + 3,9 мкг/мл р<0,05 (рис.1,в). В опытных группах уровни ТБГ снижены на 20-50% для- всех сроков беременности по сравнению с контрольной группой. В подгруппе 2 с неблагоприятным прогнозом не наблюдается заметного роста концентрации ТБГ, уровень ТБГ значительно понижается (на 70-80%) по сравнению с контрольной группой. В этой подгруппе беременность прерывалась в 54% случаев в сроки до 20 недель (рис.1,в*), и в более поздние сроки:25-30 недель (рис.1,в»*).

При вирусной инфекции в ранние сроки беременности уровень ТБГ снижается в 4-8 раз и составляет от 1,5±0,9 до 13,4±2,2 мкг/мл. Кроме того, по сравнению с контрольной группой отмечаются более низкие показатели ТБГ (в 1,5-1,8 раза) у группы женщин, при обследовании которых были обнаружены хламидии (18 чел) , герпес (5 чел), микоплазмы (6 чел), уреаплазмы (4 чел).

ТВг МКГ/ХА

с -

Рис. 1.Определение ТБГ с помощью микрометода ИФ.\ в сыворотке капиллярной крови.

а) контрольная группа

б) опытная группа 1 (подгруппа 1)

в} опытная группа 1 (подгруппа 2)

в*, в** - с неблагоприятным исходом беременности. ,

о

4

6 8 Ю 12 14 16

Недели беременности

Такое снижение уровня ТБГ в сыворотке крови мы связываем с частичной гибелью трофобласта. По-видимому, ткань трофобласта, являясь сильно пролифериругащей и обладая фагоцитарной активностью, служит мишенью для репликации вируса. Размножение вируса приводит к гибели клеток трофобласта, а, следовательно, и к снижению их гормональной и метаболической функций, связанных с биосинтезом белка.

При исследовании мочи беременных женщин на содержание ТБГ мы нашли, что антиген обнаруживается в ней на 40-45 день беременности, но его уровень не так показателен, как уровень ТБГ в сыворотке в ранние сроки.

Сравнивая количество ТБГ в сыворотке и моче .беременных женщин, мы пришли к выводу, что определение ТБГ в моче не имеет прогностической ценности для ранней диагностики.

Проведенный нами сравнительный анализ диагностических тестов на ТБГ и ХГ показывает, что тест на ТБГ имеет ряд несомненных преимуществ перед определением уровня ХГ:

- во-первых, ХГ не влияет на определение уровня ТБГ при добавлении ХГ в стандартные растворы ТБГ и сыворотку. Следовательно, при использовании ХГ как лечебного препарата тест на ТБГ может являться единственным объективным критерием;

ео-вторь»! процессы, вызывающие снижение и увеличение уровня ХГ в кровотоке не влияют на динамический рост ТБГ, т.е. тест на ТБГ можно использовать независимо от колебаний ХГ в крови пациентов; .

- в-третьих, ХГ имеет в организме аналог - лвэтеинизирующий гормон, обладающий сходными гормональными и иммунологическими ,

что приводит к сомнительным результатам;

в-четвертых, тест на ТБГ при угрозе прерывания беременности (особенно после 10 недель) имеет более высокую клиническую ценность, чем тест на ХГ, т.к. уровень ТБГ с ростом беременности постоянно увеличивается, в то время как уровень ХГ после 10 неделе беременности падает.

Большую опасность для женщин представляет эктопическая беременность. Прогрессирующую внематочную беременность в ранние сроки диагностировать Трудно, т.к. при этом в организме женщины возникают изменения, свойственные нормальной беременности.

Определение уровня ТБГ дает возможность диагностировать эктопическую беременность. К 5-6 неделям прогрессирующей внематочной беременности (группа 3) уровень ТБГ составляет 0,3±0,2 мкг/мл, в то время как при нормально развивающейся беременности его концентрация достигает к тому же сроку 4,4+0,4 мкг/мл. С увеличением срока эктопической беременности уровень ТБГ повышается, но все же он существенно ниже соответствующих значений для нормально развивающейся беременности. ХГ в этих случаях дает положительную реакцию на наличие беременности только в 30% наблюдений.

Пузырный занос в клинической практике весьма сложно отличить от протекающей беременности, особенно в ранние сроки. Результаты, полученные нами разноречивы (группа 4), т.к. для данного срока беременности уровень ТБГ может быть как относительно низкий,. так и высокий. Так, например, для пузырного заноса концентрация ТБГ в сыворотке крови при беременности 5-6 недель в одном случае составляла 1,5 мкг/мл, в другом 10 мкг/мл, что не соответствует уровню ТБГ, характерному для данного срока беременности. В данном случае, наибольшую ценность тест на ТБГ представляет для контроля за эффективностью лечения пузырного заноса после прерывания беременности: Использование этого теста дало 100%-ный положительный эффект для всей группы. При хорионэпителиоме (группа 5) уровень ТБГ в 3-х случаях достигал 1,8+0,8 мкг/мл.-В двух случаях он составил 12 мкг/мл и 60 мкг/мл, соответственно, и коррелировал с размерами трофобластической опухоли и степенью ее инвазирования. После оперативного вмешательства и проведения химиотерапии наблюдалось снижение уровня ТБГ до 0,02-0,2 мкг/мл. -После повторной терапии

уровень ТБГ не отличался от контрольной группы. Присутствие ТБГ в сыворотке больных, как правило, говорит о неблагоприятном прогнозе болезни.

Таким образом, тест на ТБГ при онкопатологических изменениях трофоОласта также является информативным. Он дает достаточно полную информацию об опухолевом процессе и может быть использован для диагностики опухолей. Наибольшую ценность тест на ТБГ представляет для контроля за эффективностью лечения, а после выздоровления - для выявления рецидивов.

Для выявления причин выкидыша мы провели комплексное обследование женщин с угрожающим выкидышем различного генеза и здоровых беременных женщин на содержание ТБГ, гормонов, метаболитов, ферментов, и иммунорегуляторов, обеспечивающих развитие зародыша. Сравнительный анализ биохимических показателей опытной и контрольной групп свидетельствует о том, что при угрозе выкидыша просматривается тенденция к достоверному снижению уровня ТБГ (до 50%), стероидных гормонов - эстрогенов (до 20%), прегнандиола (до 23%) , ХГ и лимфоцитарных ферментов (до 19%) .

В контрольной группе экскреция гормонов и продукция ТБГ значительно растет с увеличением срока беременности (рис.2). У женщин опытной группы уровень гормонов и ТБГ также возрастает в процессе протекания беременности (рис.2), но этого уровня, видимо, недостаточно для нормального развития беременности.

Прегнавдиод

Эстрогены

ХГ

ТБГ

мкм/сут

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

мкм/сут 2.5.

1.5

1

МЕ/л 60000

50000

20000

10000

мкг/мл 50,

8

16

5.

16

5 8 16 5 О 16

Рис.2. Уровень экскреции гормонов и секреции ТБГ в контрольной и опытной группах при 5, 8 и 16 неделях беременности

I_I - показатели в контрольных группах;

ЕЙ - показатели в опытных группах.

0.5

.. .¡:1:зля изученные биохимические параметры, мы пришли к ; чаоду, '¡то для диагностики выкидыша при гормональных нарушениях тест на ТЕГ является специфичным и наиболее показательным.

Исследование корреляционной зависимости между достоверным увеличением количества ТБГ и уровнем гормонов и их метаболитов в процессе роста беременности показало прямую связь между ними {табл.2) . Наиболее сильная корреляционная связь отмечается со стероидными гормонами (пр'егнандиолом, эстрогенами) . Такая связь между ними говорит о том, что ТБГ может являться либо рецептором стероидных гормонов, либо их переносчиком. Возможно, взаимодействие ТБГ с гормонами свидетельствует о Наличии нескольких связывающих мест на данном антигене к каждому гормону и позволяет предположить его регуляторную функцию в отношении транспорта гормонов.

Таблица 2

Корреляционная зависимость между изменением уровня ТБГ и гормонов у беременных женщин в динамике от 3 до 16 недель

Биохимические показатели ТБГ

контрольная группа г основная группа г

17 КС + 0,20 + 0,66

ДЭА + 0,40 + 0,48

ХГ -0,12 -0,04

17 ОКС +0,54 + 0,55

Прег«андиол +0,69 + 0,79

Эстрогены +0, 67 +1,00

Кариопикнотический индекс (КПИ) +0,45 + 0.41

во всех случаях р<0,05.

В основной группе отмечается усиление корреляционной связи между 17КС (ДЭА) и ТБГ по сравнению с контрольной, что подтверждает важность определения 17КС и его фракции ДЭА при угрозе выкидыша.

Обратная корреляционная зависимость между ТБГ и ХГ объясняется резким падением уровня ХГ у беременных женщин со сроком 9-10 недель. Следует отметить, Что до 8 недель отмечается значительная прямая корреляционная связь между ними, переходящая, к 10-12 неделе в "обратную. Это еще раз подтверждает правильность нашего вывода о диагностической значимости уровня ХГ' только до 10 недель беременности.

В таблице 3 приведены показатели ошибочного прогноза благоприятного исхода беременности у женщин опытной группы при использовании разных тестов. Как видно из та^ 'пцы, иммунохимический

тест на ТБГ по сравнение с гормональными методами исследования обладает несомненным преимуществом при диагностике угрозы выкидыша и имеет наименьший из всех ошибочный прогноз (0,9%).

Таблица 3.

Показатели ошибочного прогноза благоприятного исхода беременности у _женщин опытной группы при использовании разных тестов_

Диагностический тест Число наблюдений % женщин, не имеющих отклонений от нормы Показатели ошибочного прогноза (% от числа патологий)

ТБГ 120 20 0,9

Сум.эстроген 50 25 2,5

ХГ 120 18 4.0

170КС 80 92 5.0

Прегнандиол 120 38 6.0

17КС 120 66 ко СО 1_

Кольпоцитология 90 ■ 59 12 .0

Сравнение тестов на ТБГ с другими диагностическими характеристиками показало, что:

во-первых, тест на ТБГ - универсален для определения сроков беременности. Путем динамического исследования уровня ТБГ можно диагностировать угрозу выкидыша даже при отсутствии клинических симптомов, начиная с ранних сроков беременности;

- во-вторых, тест на ТБГ имеет более высокую точность прогноза;

- в-третьих, тест на ТБГ позволяет объективно оценивать функцию трофобласта, что крайне важно для ранней диагностики формирующейся плацентарной недостаточности.

Нами выявлена прямая корреляционная связь между уровнем ТБГ и активностью ферментов лимфоцитов и нейтрофилов крови. СДГ (г=+0,69; р<0,05), обГФДГ (г=+0,71; р<0,05), ЩФ (г=+0,73; р<0,05). Мы полагаем, что уменьшение количества ТБГ в сыворотке крови, в среднем, на 50% (р<0,02) в опытной группе может быть обусловлено снижением концентрации СДГ, ГФ, ЩФ, о чем свидетельствует прямая корреляционная связь между этими показателями.

На рис.3 приведены результаты изучения динамики уровня ТБГ у женщин контрольной группы, а также опытной группы 1 до и после метаболической терапии. Как видно из рисунка 3, применение метаболической терапии препаратами, которые нормализуют

окислительно-восстановительные процессы в тканях материнского организма, приводит к повышению секреции ТБГ, что подтверждает данные полученные ранее другими исследователями (Мамедалиева Т.Н. ,

Калафати Т.И., 1991} . По-видимому, препараты, применяемые при метаболической терапии, нормализуют метаболизм самой плаценты и оптимизируют белок-синтезируюжувэ функцию плаценты. Этим и объясняется увеличение концентрации ТБГ в сыворотке крови (рис.3,в-г) .

ТБГ мкг/мл

60

Рис. 3.Содержание ТБГ в сыворотке капиллярной крови до" и после метаболической терапии

а) опытная группа 2

б) контрольная группа

в) опытная группа 1 (подгруппа 1) после лечения

г) опытная группа 1 (подгруппа 1) до лечения

д) опытная группа 1 (подгруппа 2) после лечения

е) опытная группа 1 (подгруппа 2) до лечения

4 б 8 10 12 14 16

недели беременности

В тех же случаях, когда имеются выраженные и подтвержденные УЗИ морфологические нарушения трофобласта (низкая плацентация, отслойка хориона), откорректировать нарушение функции плаценты очень сложно. Многое зависит от степени метаболических нарушений в плаценте. Как мы уже отмечали, морфофункциональные изменения в трофобласте оказывают большое влияние на синтез ТБГ, т.к. при данных нарушениях плацента не способна поддерживать адекватный обмен в системе мать-плод. Нарушаются транспортная, эндокринная, трофическая и метаболическая функции и, как следствие этого, наблюдаются низкие показатели концентрации ТБГ. Чем более глубоко выражены эти процессы, тем меньше синтезируется антигена в трофобласте. Можно заметить (рис.3,д-е), что в таких случаях после метаболической терапии концентрация ТБГ увеличивается незначительно по сравнению с исходным уровнем: от 24,2 до 32,6 мкг/мл. Но и этого недостаточно

ДШ1 ' "ин^рон.чо й деятельности органоидов синцитиотрофобласта. Недостаточная концентрация ферментов лимфоцитов и нейтрофилов крови ¡переменных женщин не обеспечивает нормальной функциональной активности трофобласта, вследствие чего снижается его способность к синтезу антигена, продукции гормонов (прогестерона, эстрогенов, ХГ) и ферментов- (СДГ, ГФ, ЩФ) .

Для того, чтобы планировать беременность с благоприятным прогнозом для женщин с риском привычного выкидыша, мы проводили реабилитационные мероприятия еще до наступления беременности, контролируя их цитохимическими данными, что давало хорошие результаты. у 18 беременных женщин, регулярно получавших метаболическую терапию до и во время беременности, уровень ТБГ составил 5,0+0,4 мкг/мл; 17,6+2,3 мкг/мл и 52,8±2,8 мкг/мл в 5,8 и 16 недель, соответственно (рис.3,а), что даже несколько выше показателей контрольной группы.

Таким образом, проведение реабилитационных мероприятий еще до наступления беременности, а также регулярное применение метаболической терапии, начиная с ранних сроков беременности, нормализует окислительно-восстановительные процессы в организме матери и отпгимизирует белок-синтезирующую функцию плаценты. Это проявляется з повышении уровня ТБГ, который в данном случае является тестом для прогнозирования плацентарной недостаточности. Ее коррекции способствует раннее и регулярное применение метаболической терапии, приводящее к благополучному исходу беременности.

Иммунологическую реактивность мы изучали с помощью РППЛ. в качестве антигена использовали водно-солевой экстракт из ткани абортированного эмбриона. Оценивали специфическую клеточную реакцию сенсибилизации беременной антигенами эмбриона и наличие или отсутствие блокирующего действия сыворотки, аутологичной исследуемым клеткам.

Подавляющее большинство женщин (89,3%) в контрольной группе было сенсибилизировано эмбриональным антигеном (Табл.4). Сыворотки 93% женщин контрольной группы содержали блокирующие факторы. Женщины в основной группе реже оказывались сенсибилизированными (75%) и в крови у 47% женщин этой группы выявлялись блокирующие субстанции. Для данной группы женщин с ослабленным клеточным иммунитетом были характерны низкие показатели ТБГ (от 3,3+0,8 до 25,8+2,5 мкг/мл), прегнандиола (от 10,1+1,8 мкл/сут до 26,2+2,4 мкл/сут) в сроках от 5 до 16 недель соответственно. У 68% женщин отмечено снижение , активности СДГ до 17,2+1,3 гр/лф и Г4> до 11,2±0,4 гр/лф.

Таблица 4.

Влияние иммунизации на РППЛ у женщин

Группы обследованных Число наблюдений % женщин с положит, клет. реакцией % женщин с блокирующим действ.сыв-ки

Контрольная 60 89 93

Опытная группа 1 до иммунотерапии 60 75 47

Опытная группа 1 после иммунотерапии 45 92 86

Полученные данные указывают на то, что физиологическое развитие беременности сопровождается закономерной сенсибилизацией женщин к антигенам эмбриона и блокированием этой иммунологической активности сывороткой крови. При угрозе прерывания беременности сенсибилизация беременной к 'антигенам плода ослабляется, а блокирующая активность сыворотки нередко отсутствует. Нами установлено, что блокирующие 1дС-антитела, как и ГБГ, обнаруживаются в сыворотке крови женщин контрольной группы на самых ранних стадиях беременности. "Между ними существует двухсторонняя взаимосвязь, т.к. при отсутствии блокирующих факторов, уровень ТБГ всегда снижен. В организме начинается формирование нейро-гормонального и метаболического фона, обеспечивающего оптимальное протекание иммунных реакций, направленных на элиминацию трофобластических клеток из организма. Антигены, способные приостановить данный процесс и вызвать образование блокирующих антител, были обнаружены ранее в лейкоцитах (Говало В.И., 1987). Поэтому иммунотерапия проводилась нами лимфоцитами мужа или донора, которые вводились женщинам основной группы в случае отсутствия блокирующего фактора или при резком снижении блокирующего действия сыворотки крови. Количество введенных клеток варьировало от 60 до 140 млн.

Мы нашли, что при внутрикожной иммунизации (табл.4) у обследованных женщин повышаются значения РППЛ с эмбриональным антигеном на 17% и стимулируется появление отсутствующих блокирующих факторов в сыворотке крови на 39%. Возможно,(что лимфоциты мужа или донора у беременных женщин играют роль дополнительного антигенного стимулятора, который усиливает распознавание матерью отцовских антигенов плода и способствует протективным механизмам беременности.

После проведения терапии у большинства женщин отмечено улучшение самочувствия, снижение симптомов токсикоза; через 1-2 недели стабилизируются показатели ТБГ (рис.4) и гормонов.

Иммунокоррегирующий эффект внутрикожной иммунизации продолжается на протяжении 1-1,5 месяца.

ТБГ мкг/мл 15

5-

5 6 7 8 недели беременности

Рис. 4. Динамика уровня

ТБГ после проведения иммунотерапии женщинам с угрожающим выкидышем в 5 недель беременности

1 - контрольная группа

2 - результат иммунотерапии взвесью лейкоцитов от нескольких доноров

3 - результат эффективной иммунотерапии лейкоцитами мужа

4 - результат неэффективной иммунотерапии лейкоцитами мужа

Снижение концентрации ТБГ или отсутствие роста его уровня в процессе иммунотерапии свидетельствует о неэффективности лечения угрожающего выкидыша (рис.4). В этом случае повторная иммунотерапия беременных женщин проводилась лимфоцитами донора. Более эффективное действие оказывает взвесь лейкоцитов от нескольких доноров. Уровень ТБГ при этом даже превышает контрольный и в дальнейшем стабилизируется.

Иммунотерапия группы женщин из б человек с цитомегаловирусной инфекцией в ранние периоды беременности привела к повышению уровня ТБГ, что является благоприятным прогностическим признаком. Это, видимо, связано с активацией иммунной системы, приостановлением размножения вируса, который приводит к частичной гибели трофобласта и, соответственно, к снижению продукции ТБГ. Однако, несмотря на увеличение уровня ТБГ (от 3,6±0,3 до 34,8+4,2 мкг/мл), средние его значения остаются достоверно сниженными по сравнению с контрольными.

На рис.5 показаны результаты проведения метаболической, иммунологической и комплексной терапии. Об эффективности той или иной терапии мы судили по положительной или отрицательной динамике ТБГ, характеризующей косвенно состояние фетоплацентарной системы.

ТЪГ мкг/мл 60 ■

50 40 ■ 30 20 10

0

16

Недели беременности

•¿'ис. 5 Влияние метаболической, иммунологической и комплексной терапии на уровень ТБГ

Уровень ТБГ: I I - в контрольной группе

„ а) до и б) после метаболической терапии - а) до и б) после иммунологической терапии _а) до и б) после комплексной терапии.

Положительный эффект наблюдается при всех видах терапии. После проведения иммунотерапии и метаболической терапии наблюдается повышение уровня ТБГ (от 12,9±0,9 до 47,8+3,7 мкг/мл и от 12,6±0,8 до 46,б±4,2 мкг/мл в период от 8 до 16 недель), но несмотря на то, что уровень ТБГ увеличился, средние его значения достоверно снижены по сравнению с контрольной группой (от 13,6+4,2 до 49,5 мкг/мл' в период от 8 до 16 недель). Однако проведение комплексной терапии является наиболее эффективным методом профилактики выкидыша, т.к. при этом отмечается существенное возрастание уровня ТБГ (от 15,4+0;5 до 52,2±5',5 мкг/мл в сроки от 8 до 16 недель) .

Таким образом, полученные данные показывают, что тест на ТБГ является уникальным и достаточно информативным для оценки эффективности проводимого лечения при угрозе выкидыша. Уровень ТБГ быстро реагирует на любые нарушения или изменения, происходящие в организме матери.

Проведенные нами исследования показали наличие связи между уровнем стероидных гормонов И ТБГ. Особенно это относится к половым

стероидным гормонам. Поскольку женские половые стероидные гормоны играют важную роль в процессах оплодотворения яйцеклетки, имплантации ее, вынашивания беременности, то такая тесная корреляционная связь между ними может говорить о возможности регуляторной функции ТБГ в отношении транспорта гормонов. Нами отмечена зависимость между блокирующими факторами и синтезом гликопротеина на фоне различного гормонального и метаболического фона. Присутствие ТБГ и блокирующих факторов в сыворотке крови при физиологическом и патологическом течении беременности указывает на значимость этих биологических компонентов на всех этапах развития беременности, в то время как. их недостаток приводит к выкидышу. ТБГ, по-видимому, выступает в .роли интегрирующих молекул-эффекторов, связывающих гормонально-зависимые процессы гестации с иммунной системой.

Метаболические процессы, происходящие в организме матери, в том числе в плаценте, оказывают влияние на трофобласт, вследствие чего снижается способность последнего к синтезу белка (рис.3,5), которая восстанавливается за счет препаратов цикла Кребса, что, видимо, стимулирует пролиферацию клеток трофобласта.

Снижение .синтеза ТБГ "связано не только с метаболическими, иммунологическими и гормональными процессами, но и с нарушениями целостности трофобласта {нарушения клеточных мембран и паренхиматозной активности синцитиотрофобласта и т.д.).

Анализ литературы и полученные нами данные свидетельствуют о том, что основная биологическая роль ТБГ при беременности, по-видимому , з аключается в регуляции роста клеток трофобласта и йлаценты, а также в обеспечении необходимого иммунологического, гормонального, метаболического фона для нормального ее протекания. Можно предполагать аналогичные функции этого антигена при формировании онкопатологий.

ВЫВОДЫ

1. Разработан микрометод иммуноферментного анализа для определения трофобластического -гликопротеина в сыворотке капиллярной крови. Предложенный микрометод не уступает стандартному макрометоду по точности определения, * специфичности и чувствительности, позволяет сократить расход реагентов, время проведения анализа и заменить венозную кровь на капиллярную.

2. Проведены испытания разработанного микрометода для определения ТБГ в биологических жидкостях при физиологической и

патологической беременности, а также при онкологических заболеваниях .

трофобласта. Показано, что по уровню ТБГ в сыворотке капиллярной крози можно определить нормальное протекание беременности и диагностировать ее патологические нарушения до появления клинических симптомов.

3. Найдено, что определение содержания ТБГ в моче не имеет прогностической ценности для ранней диагностики беременности из-за низкой специфичности теста.

4. Установлено, что ТБГ является наиболее информативным маркером опухолей трофобласта и тест на него может быть успешно использован для их ранней и дифференциальной диагностики/ а также для мониторинга их лечения.

5. При сравнении разработанного микрометода определения ТБГ с другими методами^ диагностики, найдено, что предложенный микрометод имеет несомненное преимущество для контроля за нормально протекающей беременностью, для ранней диагностики патологий беременности и лечением ее нарушений, так как он наиболее точно отражает состояние плацентарной системы, быстро реагирует на метаболические, гормональные и иммунологические нарушения, происходящие в организме.

6. Обнаружена значительная корреляционная зависимость между уровнем ТБГ и стероидными гормонами. Это позволяет предположить, что ТБГ может выполнять регуляторную функцию в отношении транспорта гормонов.

Практическое внедрение Результаты работы внедрены и используются в течение б-ти лет в клинической практике больницы с поликлиникой ДЮ РАН и Приморского краевого диагностического центра.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Богданович Р.Н., Мороз C.B., Павленко А.Ф. Использование иммуноферментного теста определения трофобласт-специфического Pj-гликопротеина в клинической практике /} Тезисы научно-практической конференции*. -Владивосток. -1989. -С. 6-7

2. Берестовая Т.А., Богданович-Р.Н. Комплексное обследование женщин, страдающих невынашиванием беременности // Тезисы научно-практической конференции. -Владивосток. -1989. -С.20-21.

3. Богданович Р.Н., Берестовая Т.А. Клиническое значение иммуноферментного определения трофобластического Д^-гликопротеина // Лабораторное дело. -1990. -ПЭ. -С.43-45.

4. Bikova Е. , Gerula N. , Bogdanovich R. , Berestovaya T. , Moroz S. The indexes of the humoral immunity in case of cytomegalovirus