Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое исследование трофобластического бета1-гликопротеина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое исследование трофобластического бета1-гликопротеина"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи УДК 578.233.424.,615.357.37.

СЕВЕРИНА Мария Евгеньевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО р1-ГЛИКОПРОТЕИНА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Р о л

5' г и 0.1

~ ^ /¡¿и

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, Москва и Институте молекулярной биологии РАН, Москва.

Научный руководитель: доктор биологических наук Ю.Ю.Венгеров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.В.Караулов кандидат биологических наук А.В.Глухов

Ведущая организация: Центр биотехнологии РАН.

Защита состоится» 14 декабря 1993 г. в // час мин. на заседании Специализированного совета К 074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: 113 149, Москва, Симферопольский б-р, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦМДЛ.

Автореферат разослан ".Д ¿Г ноября 1993 г.

Ученый секретарь ' специализированного совета кандидат биологических наук

ёЭг-ъ.

В.В.Отраднова

Актуальность проблемы

Весьма актуальным вопросом современной биологии и медицины является вопрос о глубине и характере сходства процессов эмбрио— и канцерогенеза. В связи с этим особый интерес представляет изучение онко—фетальных белков как маркеров опухолей и как нормальных компонентов фетальных тканей человека.

Бурное развитие методов иммунохимической диагностики во многом связано с появлением различных видов иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА значительно потеснил радиоиммунологический и другие методы анализа и начал интенсивно внедряться в практику. Необходимо отметить, что ключевым моментом при любом иммунологическом исследовании является строгая характеристика используемых антител. Недостаточно полно охарактеризованные антитела могут давать артефакты, которые зачастую трудно выявить. Такие явления могут наблюдаться при работе с гипериммунными сыворотками против различных антигенов. Решением этого вопроса послужила разработка гибридомной технологии, позволяющей получать моноклональные антитела, строго индивидуальные по специфичности и физико-химическим свойствам, легко доступные в больших количествах, что весьма важно при решении научных и практических задач.

Одним из онко—фетальных белков явлется трофобластический бета— 1 глккопрогеин (ЭР 1). Обнаружение БР1 в эмбриональных тканях и опухолях, а также в сыворотках крови беременных женщин и онкологических больных позволяет оценивать специфичность и диагностическую ценность этого антигена как маркера беременности и опухолевых заболеваний.

Большой интерес для практической онкологии представляет также поиск новых критериев для мониторинга трофобластической болезни и дифференциальной диагностики между хорионкарциномой и пузырнцк заносой; которые возможно проводить с помощью высокочувствительной тест —системы для определения БР1.

Цель исследования состояла в получении моноклональных антител к 5Р1, проведении иммунохимических исследований этого антигена, создании иммуноферментного теста для количественного определения 5Р1. Также ставилась задача оценки диагностической ценности разработанного теста для ранней диагностики беременности, скрининга и монитрринга беременности и трофобластической болезни на клиническом материале.

Научная новизна

Получены и охарактеризованы « несколько линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к 5Р1. Моноклональные антитела, продуцируемые полученными гибридомами, охарактеризованы по взаимодействию с антигеном БР1 и применимости для создания тест—систем.

На основе моноклональных антител, продуцируемых этими гибридомами разработана диагностическая тест —система для количественного определения БР1.

Показана возможность использования ЗР1 для дифференциальной диагностики между хорионкарциномой и пузырным заносом, а также для прогноза течения хорионкарциномы.

Оценено диагностическое значение соотношения содержания БР1 к бета — субъединице хорионического гонадотропина при мониторинге трофобластической болезни.

Продемонстрирована высокая информативность теста на ЭР1 в диагностике беременности и различных патологий беременности. Обнаружено существенное различие в уровне содержания БР1 в ходе нормальной беременности у женщин Европейской части СНГ и женщин Юго-Восточной Азии.

Внедрение результатов

По результатам работы Фармокопейным комитетом составлены изменения к ВФС 42— 169ВС-88 "Тест — система иммуноферментная для определения трофобластического бета — 1 гликопротеина". ,

Иммуноферментный (ИФ) набор был использован для скрининга и мониторинга беременности и трофобластической болезни в клинических учреждениях г. Москвы, а также в акушерско — гинекологическом госпитале Ты Зу (г. Хошимин, Вьетнам). Получено разрешение Министерства здравоохранения Вьетнама на использование тест — системы в медицинской практике.

Апробапия работы.

Результаты проведенных исследований и отдельные фрагменты доложены и обсуждены на Международном симпозиуме "Маркеры новообразований" (г. Кошице, Чехословакия, 1990 г.), Международном симпозиуме "Будущее онкофетальных белков" (г. Осака, Япония, 1991), Всесоюзной конференции "Актуальные направления и новые методы в молекулярной биологии" (г. Рига, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (г. Самарканд, 1991).

В завершенном виде диссертационная работа апробирована 24 сентября на заседании отдела биохимии Научного Центра молекулярной диагностики и лечения МЗ России.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, трех глав изложения собственных исследований. и их результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа

изложена на _ страницах машинописного текста, содержит

_таблиц и_рисунков.

Библиография включает_литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Метод получения очищенного препарата SP1.

Источником SP1 служила сыворотка ретроплацентарнон крови рожениц. Осажденную 50 % сульфатом аммония сыворотку подвергали аффинной хроматографии на Weat Germ lectin Sepharose

6 MB с последующей гель —фильтрацией на колонке с Sephadex G — 200 (Pharmacia, Швеция).

Фракции, содержащие SP1, подвергали очистке с помощью гидрофобной хроматографии на Phenyl Sepharose CL— 4В (Pharmacia, Швеция), а затем проводили ионообменную хроматографию на DEAE — Sephacel (Pharmacia, Швеция). Полученный препарат SP1 не содержал примесей белков сыворотки человека и его использовали в работе.

Методы иммунизации экспериментальных животных и получение поликлональных и моноклональных антител.

Для получения поликлональных антител проводили иммунизацию беспородных кроликов обоих полов в возрасте от 6 до 12 месяцев. Для получения антисывороток применяли схемы иммунизации, предложенные Ambrosiusom X. (1987) и Vaitukaitis J. (1981).

Для получения гибридных линий, продуцирующих моноклональные антитела против SP1 проводили иммунизацию мышей линии BALB/C по следующей схеме:

1. 10 мкг/мл на мышь внутрибрюшинно в полном адъюванте Фрейнда:

2. через 15 дней 20 мкг/мл па мышь в полном адъюванте фрейнда:

3. через 15 дней после последней инъекции вводили 8 мкг/мл на мышь в неполном адъюванте Фрейнда подкожно.

Для слияния были отобраны мыши с титром специфических антител 5 х 104. Клетки селезенки сливались с клетками миеломы SP2/0. Клетки росли на среде DMEM, содержащей 20% FCS, 2 мМ L —глутамин, 20 мМ Hepes, 0,05 М NaHC03, 136 мг/мл гипоксантина, 0,19 мг/мл аминоптерина, 3.88 мг/мл тимидина и антибиотики. Отбор гибридных клонов, продуцирующих антитела к SP1, проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Отобранные линии клонировали методом предельных разведений, проверяли на контаминацию микоплазмами и частично замораживали, а частично использовали для индукции асцитных опухолей. Асцитные жидкости получали от сенсибилизированных пристаном мышей линии BALB/C по стандартным методикам.

Биохимические методы исследований.

Гамма—глобулиновую фракцию гипериммунных антисывороток и асцитных жидкостей выделяли методом трехкратного осаждения насыщенным раствором (NH<)2S04 по методу Keckwick R.A. IgG — фракцию кроличьих антясывороток получали методами аффинной хроматографии на протеин—А сефарозе CL—4B (Pharmacia, Швеция) или ионообменной хроматографии на DEAE — Sephacel в соответствии с процедурами, описанными в работах Hjelm Н. (1972), Ishikawa Е. (1983), Cotier G. (1984).

IgG — фракцию асцитных жидкостей получали методом ионообменной хроматографии на DEAE — Sephacel или методом осаждения каприловой кислотой и сульфатом аммония по методам Neoh S.H. (1986), Reik L.M. et al (1987).

В качестве ферментов — маркеров применяли пероксидазу хрена (НПО "Биолар", г. Олаине) и неорганическую пирофосфатазу (Labmaster LTD, Финляндия).

Конъюгаты антител с пероксидазой хрена получали методом периодатного окисления по Wilson М.В., Nakane P.K. (1978). Конъюгаты антител с неорганической пирофосфатазой получали методом гель —фильтрации на колонке Sephacryl S—300 (Pharmacia, Швеция) с использованием модификаций, предложенных Байковым и Аваевой (1988).

Аналитический диск — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия проводили в системе Laemmli U.K. (1970).

Иммунохимические методы исслелований.

Аффинный сорбент готовили на основе CNBr—активированной сефарозы (Pharmacia, Швеция) в соответствии с рекомендациями фирмы —изготовителя. В качестве антигена для иммобилизации на сефарозе применяли очищенный препарат SP1.

Различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) : двойной прямой антительный "сэндвич" — ДАС, непрямой тИФА—тест, конкурентные и неконкурентные тесты ставили по методам Guedson J.L., Avrameas S. (1981), Tijssen P. (1985) с модификациями на 96—луночных • планшетах произйодства

"Dynatech" (Швейцария), "Titertek" (Германия), "Nunc" (США) и Московского НИИ Медтехники.

В качестве хромогенов для определения энзиматической активности ферментов использовали : для пероксидазы : о — фенилен—диамин (Merck), а для неорганической пирофосфатазы — молибдат аммония (Sigma).

Результаты тИФА регистрировали на фотометре "Multiscan" при длине волны 492 нм для пероксидазы и 620 нм для неорганической пирофосфатазы.

Клинический материал-

Нормальное течение беременности. Было исследовано 1879 сывороток крови от женщин с нормальным течением беременности на сроках от 4 до 42 недель. Сыворотки были предоставлены кафедрой акушерства и гинекологии I ММА им. Сеченова (703 образца) и акушерско —гинекологическим госпиталем Ты Зу (г. Хошимин, Вьетнам) — 1176 образцов.

Патология беременности. Было исследовано ■ 46 сывороток крови от женщин со следующими патологиями беременности: угрожающий выкидыш — 21 человек, гипотрофия плода — 4 человека, внематочная беременность — 6 человек, переношенная беременность — 6 человек, многоплодная беременность — 5 человек, внутриутробная гибель плода — 6 человек. Во всех случаях диагноз был подтверджден результатами ультразвукового исследования.

Трофобластичесхая болезнь. На базе акушерско — гинекологического госпиталя Ты Зу (г. Хошимин, Вьетнам) было проведено динамическое наблюдение за уровнем SP1 у больных пузырным заносом (209 человек) и больных хорионкарциномой (43 человека). Образцы сывороток забирались до проведения курса химиотерапии и через неделю в течении всего курса. Диагноз устанавливался на основе гистологических данных по критерию Novak и Seah (1954). Химиотерапию проводили метатрексатом (0,3 мг/кг каждый день в течении 6 дней) и актиномицином — D (0,01 мг/кг каждый день в течении 6 дней). Пациентов с хорионкарциномой можно разделить на две группы — те которые

умерли от болезни (19 человек) и те которые получили полную ремиссию (24 человека).

Определение' SP1 на клиническом материале проводили с использованием разработанной иммуноферментной тест —системы. Чувствительность определения 1 нг/мл. Концентрацию бета — субъединицы хорионического гонадотропина определяли радиоиммуноанализом (CIS, Франция). Чувствительность определения составляла 0,2 нг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Исследование свойств моноклональных антител (МКА). взаимолействуюших с SP1.

Предварительный скрининг антител, продуцируемых клонами гибридом, полученных путем слияния клеток мышиной миеломы линии SP2/0 со спленоцитами мышей, иммунизированных очищенным препаратом SP1, вели методом непрямого тИФА. В качестве антигена для сенсибилизации плашек использовали очищенный препарат SP1 и ретроплацентарную сыворотку рожениц (РПС). Наличие специфических антител, взаимодействующих с SP1 выявляли с помощью кроличьих антител против мышиных IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена.

В результате скрининга и последующего клонирования положительных культур было отобрано 5 гибридом, продуцирующих МКА к SP1. В таблице 1 представлены некоторые характеристики этих гибридом.

Таблипа 1. Характеристики гибридом, продуцирующих антитела к SP1

Гкбрндома Гитр культуралыюй жидкости Титр асцктной жидкости Субкласс Конкуренция с HI

HI 1.5 ц 104 1.0 * 10' IgG2a +

Н2 3.0 х 10J 8.8 х 10* IgGl +

НЗ 1.5 х 10* 5.0 х 10" IgG2a -

Н4 8.0 х 101 2.0 х 10" IgGl -

Н6 2.0 х 10* 5.0 х 10" IgG2a +

Из таблицы видно, что титры культуральных жидкостей варьировали от 3,0 х 103 у гибридомы Н2 до 1.5 х 104 у гибридом Н1, НЗ и Н6. Титры асцитных жидкостей также отличались и составляли от 8,8 х 104 (гибридома Н2) до 1,0 х 107 (гибридома Н1). Причем наблюдалась корреляция этих параметров : гибридомы с более высокими титрами культуральной жидкости индуцируют асцитную опухоль с более высокой продукцией антител. Это свидетельствует о сохранении данными гибриднымц линиями антител — продуцирующих свойств при инокуляции в животных.

Представляло интерес выяснить, с одной или несколькими антигенными детерминантами БР1 реагируют МКА пяти полученных гибридных линий. Для этого использовали конкурентный иммуноферментный анализ. Бьхлд изучена конкуренция между немеченными и меченными пероксидазой МКА за связывание с БР1, иммобилизированным на планшете. В эксперименте исследовали кривые титрования конъюгатов МКА разных клонов в присутствии и в отсутствие немеченных антител других клонов в постоянной концентрации 50 нг/мл. При этом совпадение хода кривой титрования кснъюгата в присутствии конкурирующих антител с исходным свидетельствует о направленности сравниваемых МКА к разным детерминантам, а снижение титра конъюгата по сравнению с исходным свидетельствует о взаимодействии с той же детерминантой.

Пример такого эксперимента показан на рис.1. Из рисунка можно сделать вывод, что наблюдается совпадение титра конъюгата Н1 в присутствии немеченных МКА гибридомы Н2 (кривая 2), в то же время титр конъюгата Н1 в присутствии немеченных антител НЗ (кривая 3) снижается по сравнению с исходным. Из этих данных можно сделать вывод, что МКА гибридом Н1 и НЗ направлены к одной антигенной детерминанте, а МКА гибридом Н1 и Н2 направлены к разным антигенным детерминантам.

Исследования конкуренции между МКА всех клонов показало, что их можно разбить на две группы конкуренции. К одной группе относятся гибридные клоны Н1, Н2 и Н6, а к другой группе конкуренции — клоны Н2 и Н4. Данные результаты свидетельствуют о том, что полученные антитела взаимодействуют с независимыми детерминантами на поверхности молекулы БР!.

СШ (492 им)

Разведение конъюгата

Рис. 1 Конкурентное связывание конъюгата МКА Н1 с пероксндазон хрена с вР1 в присутствии немеченных моноклоиальных антител; конъюгат МКА. Н1 в отсутствие МКА (кривая 1), конъюгат МКА Н1 в присутствии МКА Н2 (кривая 2), конъюгат МКА Н1 в присутствия МКА НЗ (кривая 3), конъюгат МКА Н1 в присутствии МКА Н1 (кривая 4)

2. Создание иммуноферментной тест —системы для определения БР!.

Чувствительность иммуноферментной тест —системы при использовании варианта тИФА ДАС определяется, при одинаковой постановке анализа, аффинностью антител и степенью очистки специфических компонентов, связанных с нерастворимой матрицей и аффинностью используемого конъюгата антител с ферментом.

Были проведены исследования возможности использования МКА клонов Н1, Н2, Н4 и Нб для сорбции на полистироловую твердую фазу (96 —луночные планшеты). На рис. 2 изображены кривые титрования БР1 при сорбции гибридных клонов Н1 (кривая 2), НЗ (кривая 3), Н2 (кривая 4). Во всех случаях использовался аффинный конъюгат поликлональных антител с пероксидазой хрена. Данные рис. 2 позволяют сделать вывод, что чувствительность определения БР1 равная 1нг/мл достигается при использовании МКА Н1. Чувствительность определения БР1 при сорбции поликлональных антител (кривая 1) составляет 10 нг/мл.

500 250 125 63,5 31,2 15,5 7,8 3.9 1,9 0,85

Концентрация антигена (нг/мл)

Рис.2 Кривые титрования вР1 при использовании для сенсибилизации пластин поликлональных антител (кривая I), моноклональных антител гибридомы Н1 (кривая 2), моноклональных антител гибридомы НЗ (кривая 3) и моноклональных антител гибридомы Н2 (кривая 4). Во всех случаях использовался конъюгат поликлональных антител с перокскдазой хрена.

Как уже отмечалось выше, для достижения высокой чувствительности важным является также подбор антител, входящих в состав конъюгата с ферментом. Так, даже в оптимальном случае, т.е. при использовании для сенсибилизации пластин МКА Н1, чувствительность иммуноферментного определения 8Р1, равная 1 нг/мл, достигается только в том случае, когда применяется аффинный конъюгат на основе поликлональных антител. Конъюгат на основе МКА Н1 обеспечивает чувствительность определения БР1, равную 3,3 — 7,6 нг/мл а конъюгат на основе МКА Н2 лишь 15,5 нг/мл.

При разработке иммунофэрментных тест —систем с целью достижения высокой чувствительности и специфичности проводят очистку полученных иммуноматериалов различными методами для выделения фракции специфических антител и освобождения от примесей. С позиций технологичности представляло интерес исследоьагь эффективность выделения специфических антител различными методами. Препараты антител получали из асцитных жидкостей методами осаждения каприловой кислотой, осаждекием сульфатом аммония и методами хроматографии : аффинной на

протеин Л—сефарозе и на сефарозном носителе с иммобилизованным 5Р1. Из результатов следовало, что наиболее эффективным оказался метод выделения 1дС — фракции асцитных жидкостей осаждением каприловой кислотой (чувствительность системы 1 нг/мл). Сульфат—аммонийный метод не позволял очистить препарат МКА от белковых примесей, что снижало чувствительность анализа. При использовании препаратов МКА, полученных методами хроматографии, чувствительность, определения составляет 1 нг/мл, однако эти методы многостадийны, трудоемки, а также существует опасность потери активности антител при элюции. Кроме того, указанные методы имеют ограничение при переходе к промышленным масштабам наработки МКА для тест —системы.

Обобщающие результаты подбора оптимальной комбинации антител, применяемых для тест — системы, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Чувствительность иммуноферментного определения 5Р1

Конгюгат с перо-ксждазой хрена ЧКАН1 осажденные сульфатом аммопня мклн1 аффинно очищенные МКА Н1 осаждснпые каприловой кислотой МКЛН6 осажденные каприловой кислотой МКАН2 осаждешше каприловой кислотой Поликлональные антитела (ПКЛ)

Н1 31 3.8-7.6 3.8-7.6 3.8-7.6 15.5 -

Н2 62.5 15.5 15.5 15.5 31 -

ПКА 15.5 1.0 1.0 1.0 7.6 10

Из этой таблицы видно, что максимальная чувствительность равная 1 нг/мл достигается при использовании гетерологической схемы ДАС — метода : сенсибилизации твердой фазы МКА Н1 и Н6, если в состав конъюгата с ферментом входят аффинно очищенные поликлональные антитела. Чувствительность определяли как значение концентрации антигена, при которой оптическая плотность субстрата на конечной стадии не менее чем в два раза превышает значение оптической плотности отрицательного контроля. Чувствительность определения БР1 при использовании МКА Н1 и Нб превышает чувствительность определения ЙР1 при сорбции поликлональных антител (10 нг/мл).

Специфичность антител, используемых при разработке иммуноферментных тест —систем, является характеристикой, которая в свою очередь обуславливает специфичность создаваемого ИФ теста. При изучении специфичности антител определяющими

являются такие параметры как моноспецифичность в отношении иммуногена и его компонентов, наличие или отсутствие перекрестных реакций с близкородственными антигенами и т.д. Применение МКА дает возможность повысить специфичность диагностической тест —системы.

Другим преимуществом использования моноклональных антител является высокая технологичность диагностической тест —системы. Моноклональные антитела можно сравнительно легко производить в промышленных масштабах и обеспечивать стандартность тест-системы.

3. Клиническая апробация метола 3.1 Нормальное течение беременности

С целью выяснения зависимости уровня БР1 в сыворотке крови от срока беременности было изучено 1879 сывороток крови от женщин с нормально протекающей беременностью на сроках от 4 до 42 недель, в возрасте от 16 до 43 лет. Из полученных данных следует, что уровень БР1 нарастает с 4 недели беременности (5000 нг/мл), достигая максимального значения к 38 неделе (220 ООО нг/мл), и уменьшается к 42 (190 000 нг/мл), что является признаком начала родовой деятельности при нормально протекающей беременности.

На рисунке 3 данные представлены в виде диаграмм, которые наглядно отражают динамику нарастания 5Р1. На основании статистических расчетов показана достоверность различий в группе, ошибка среднего значения не превышает 2 5. Можно также сделать вывод, что разработанная тест—система позволяет надежно количественно определять ЭР1 во всем диапазоне встречающихся на практике концентраций.

Впервые в нашем исследовании был проведен систематический анализ содержания вР1 на разных сроках нормально протекающей беременности у женщин Юго—Восточной Азии. Результаты

(xlOOO) SPl конц. (нг/мл) 250000

200000

160000

100000

60000 О

недели беременности

Рис.3 Уровень SPt в сыворотке крови женщин при нормально протекающей беременности.

1 - женщины Юго-Восточной Азии

2 - женщины Европейского региона

показали, что уровень SP1 у женщин региона Юго — Восгочной Азии (1176 образцов) достоверно превышает концентрацию SP1 в сыворотке крови беременных женщин Европейского региона. Этот факт требует дальнейшего детального изучения, вполне возможно что повышенный уровень SP1 тем или иным образом связан с предрасположенностью к развитию трофобласгической болезни, частота встречаемости которой в Юго-Восточной Азии в 15 — 20 раз превышает частоту данного заболевания в Европе.

Представляло интерес выяснить возможности разработанной иммуноферментной тест системы для ранней диагностики беременности. Для этого проводили параллельное исследование сывороток крови женщин на самых ранних сроках беременности на присутствие SP1 и бета —субъединицы хорионичсского гонадотропина (бета —ХГТ).

Используя для SPl "cut off уровень 5 нг/мл, возможно проводить диагностику беременности на 16 — 21 день после оплодотворения. Данный результат свидетельствует о том, что тест на SP1 менее чувствителен по сравнению с тестом на бега—ХГТ, с помощью которого возможна-диагностика беременности на 7—12

—г—1—I—г—I—г—1—г т —г -I' —I—I—I г—

I * 10 12 14 16 18 20 22 24 26 21 30 32 14 36 38 40 42

день после оплодотворения. Причем важным преимуществом теста на ХГТ является возможность его определения в моче. В то же время уровень БР1 не изменяется после проведения гормональной терапии, что дает возможность использовать тест на 8Р1 для ранней диагностики беременности в тех случаях, когда после инъекций ХГТ, результаты определения бета—ХГТ могут быть ложно положительными.

3.2. Патологическое течение беременности

Разработанная тест-система была использована для количественного определения БР1 при различных патологиях беременности, таких как угроза прерывания беременности, гипотрофия плода, внематочная беременность, внутриутробная гибель плода. Было показано, что у женщин с диагнозом внематочная беременность наблюдается снижение уровня вР1 в 3 — 4 раза по сравнению с нормально протекающей беременностью. Уровень БР1 также уменьшается при угрозе выкидыша, внутриутробной гибели плода, гипотрофии плода. В то же время было отмечено возрастание уровня БР1 более чем в 2 раза —до 400.000 нг/мл на сроке 25 — 27 недель у женщин с диагнозом многоплодная беременность.

Большое количество исследований динамики изменений концентрации БР1 при различных патологиях показало высокую ценность данного теста как для выявления патологий так и для определения тактики и адекватности лечения. Ниже приведен типичный пример такого применения теста.

Важным в акушерской практике является вопрос сохранения беременности у женщин с начавшимся выкидышем. Оперативные исследования динамики секреции БР1 в этом случае позволяют определить правильную тактику лечения. На рис. 4 показана динамика изменений концентрации 5Р1 в крови беременной женщины. Концентрация БР1 на 10 неделе составляла 31000 нг/мл, что соответствует содержанию БР1 при нормальном течении беременности. На 12 неделе пациентка обратилась по поводу плохого самочувствия, было проведено иммуноферментное определение концентрации 5Р1, которое показало, что уровень БР1 снизился в 4 раза по сравнению с нормой; Было проведено лечение

туриналом и партусистеном. Положительный клинический эффект проявился в общем улучшении состояния, что также сопровождалось повышением концентрации БР1.

Результаты определения ЭР1 при различных патологиях беременности свидетельствуют о том, что тест на ЭР1 можно использовать для коррекции и мониторинга различных патологических состояний во время беременности. Однако необходимо отметить, что выработка диагностических критериев требует дальнейшего сбора клинического материала и тестирование на БР1 может служить одним из прогностических тестов, после которого следует использовать и другие диагностические методы, например ультразвуковое исследование. ,

Концентрация ЯР1 (вт/мл)

50000 ■ < 46400

«1000

у 7200

0 - N йЗоо

I 19 11 12 13 14 15

срок беременности в педелях

РиС.4 Динамика изменений концентрации 5Р1 (иммунофермеитное определение) в сыворотке крови беременной женщины с диагнозом угроза прерывания беременности.

3 3. Трофобластическая болезнь

Результаты использования иммуноферментного теста для динамического наблюдения за уровнем 5Р1 у больных с трофобластической болезнью (пузырный занос — 209 человек, хорионкарцинома — 43 человека) показали, что по концентрации этого белка можно оценить стадию заболевания, прогнозйровать наличие метастазов, ход и адекватность проводимой

цитостатической терапии. Было установлено, что определение БР1 в течение курса химиотерапии может служить одним из диагностических тестов качества проведенного лечения.

На рисунках 5 и 6 наглядно показана динамика изменения уровня БР1 для двух характерных примеров при лечении трофобластической болезни.

Рисунок 5. Больная К., 21 год, поступила в госпиталь Ты Зу с клинически установленным диагнозом пузырный занос (перерождение клеток трофобласта в доброкачественную опухоль). В ходе лечения было произведено 4 определения содержания 5Р1. Первое измерение было проведено за два дня до операции по удалению пузырного заноса. При этом концентрация БР1 составляла 920 нг/мл. Через неделю после операции уровень БР1 снизился до 114 нг/мл и к моменту выписки из госпиталя составлял 10 нг/мл.

Концентрация (нг/мл) 1600

200

< 820

»у нп

т

Недели лечения

операция

РИС.5 Динамика изменений концентрации 5Р1 (иммуноферментное определение) в сыьоротке крови больной с диагнозом пузырный занос.

В данном случае проведенное лечение оказалось адекватно и снижение уровня $Р1 до 10 нг/мл позволяет предположить отсутствие метастатического процесса и благоприятный прогноз заболевания.

Рисунок 6. Больная М., 20 лет, поступила в госпиталь Ты Зу с клиническим диагнозом хорионкарцинома. За время наблюдения в госпитале Ты Зу было проведено 10 определений уровня SP1, которые делались еженедельно. При поступлении концентрация SP1 составила 400 нг/мл. В ходе лечения, включавшего химиотерапию метатрексатом и операцию по удалению матки, уровень SP1 изменялся следующим образом : перед 3 курсами химиотерапии концентрация SP1 составила 320 нг/мл, затем во время химиотерапии концентрация снизилась до 120 нг/мл, на пятой неделе лечения была проведена экстирпация матки, после операции и последующих курсов химиотерапии уровень SP1 продолжал увеличиваться и через 4 недели посЛе операции составил 580 нг/мл. Данный пример наглядно показывает наличие метастатического процесса, плохо поддающегося лечению, что отражает уровень SP1 в сыворотке крови.

Концентрация SP1 (нг/мл)

1 Недели лечения

операция

РИС.6 Динамика изменений концентрации 5Р1 (иммуиоферментное определение) в сыворотке крови больной с диагнозом хорионкарцинома

2-4 недели - химиотерапия до операции

5 неделя — эхстярпадвя маткн

в—8 недели - химиотерапия после операции

Клетки трофобласта иногда перерождаются, и формируется доброкачественная опухоль — пузырный занос. Пузырный занос

вызывает гибель плода и опухоль подлежит немедленному удалению. Лица, перенесшие пузырный занос, составляют группу риска и специальные наблюдения проводятся систематически с применением тестов на хорионический гонадотропин и БР!. Перерождение трофобласта и формирование злокачественной опухоли — хорионкарциномы —сопровождается возобновлением продукции БР1 и ХГТ. Большое значение .в онкологической практике имеет дифференциальная диагностика между пузырным заносом и хорионкарциномой. В связи с тем, что химиотерапия практически одинаково эффективна для лечения пузырного заноса и хорионкарциномы, ранняя постановка диагноза и подтверждение диагноза хорионкарцинома, * может способствовать выбору правильной тактики лечения и • проведения экстренного оперативного вмешательства.

Нами было проведено параллельное определение содержаний ХГТ и БР1 в сыворотках крови больных трофобластической болезнью, которые на момент исследования не подвергались лечению. Результаты такого определения показаны на рисунке 7. Из рисунка видно, что не наблюдается заветного различия в уровне содержания ХГТ между пациентами с пузырным заносом и хорионкарциномой. В то же время с БР1 идет полнее разделение на 2 группы: все пациенты с пузырным заносом имеют уровень БР1 больше, чем 50 нг/мл, а пациенты с хорионкарциномой меньше этого уровня. Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования теста на БР1 для дифференциальной диагностики между пузырным заносом и хорионкарциномой.

Была продемонстрирована также значительная разница в соотношении содержания 5Р1/бета —ХГТ между пациентами с хорионкарциномой и пузырным заносом. Эти данные представлены на рисунке 8. Из рисунка видно, что у пациентов с хорионкарциномой соотношение 5Р1/бета —ХГТ меньше единицы, а у пациентов пузырным заносом это соотношение всегда больше единицы.

Изменения в соотношении ЗР1/вета —ХГТ было изучено также на пациентах с хорионкарциномой в течение и после курса химиотерапии. Пациентов можно разделить на. две группы : те которые умерли от болезни й те, которые получили полную

Концентрация ХГТ БР1

(нг/мл)

ПЗ ХК ПЗ ХК

Рис 7. Уровень ХГТ и БР1 в сыворотках кровн больных пузырным заносом (ПЗ) и хориоикарциномой 1ХК1. На момент исследования больные не подвергались лечению.

Соотношение 5Р1/бета—ХГТ

10

I

0.1

о

• • •

•

1 • ф • •

•

•

•

• • •

•••

•

•••

•

Хорионкарцинома Пузырный занос

Рис. 8 Соотношение ЭРибета-ХГТ в сыворотках крови больных пузырным заносом и хорионкарциномой. На момент исследования больные не подвергались лечению.

ремиссию. Примеры такого исследования приведены на рисунках 9 и 10.

Среди пациентов, которые умерли от болезни, соотношение ЭР 1/бета — ХГТ было низким и уменьшалось в течение курса химиотерапии. Средние значения соотношения БР1/бета—ХГТ в этом случае составили 0.4 и 0.26, соответственно до и после курсов химиотерапии (Рис.9).

Среди пациентов, которые получили полную ремиссию, наблюдается повышение соотношения 5Р1/бета —ХГТ. Средние значения соотношения БР1/бета—ХГТ в этом случае составили 0.33 и 4.89 соответственно до и после курсов химиотерапии (Рис.10). Известно, что химиотерапевтический агент (метотрексат), который является ингибитором синтеза ДНК, может вызывать дифференциацию трофобластических клеток и изменять их синтез белков. Таким образом можно предположить, что соотношения ЗР1/бета —ХГГ в сыворотке крови пациентов с хорионкарциномой, которые восприимчивы к химиотерапевтическим агентам, может возрасти после химиотерапии. Этот факт подтверждается повышением соотношения ЗР1/бета —ХГТ у пациентов с благопри —

5Р1/6ета-ХГТ соотношение

недели курса химиотерапии

Рис. 9 Изменения в соотношении 5Р1/бета~ХГТ в течении курса химиотерапии у пациентов с хорионкарциномой, которые умерли от болезни

ВР1/бета-ХГТ соотношение

недели курса химиотерапии

Рис. 10 Изменеия в соотношении 5Р1/6ета-ХГГ в течении курса химиотерапии у пациентов, которые получили полную ремиссию

ятным прогнозом заболевания. С другой стороны, соотношение 5Р1/бета —ХГГ остается низким у тех пациетов, которые умерли от болезни и следовательно были не восприимчивы к химиотерапии.

Таким образом, из полученных данных можно сделать вывод, что соотношение 5Р1/бета — ХГТ может служить дополнительным критерием для дифференциальной диагностики пузырного заноса и хорионкарциномы. Кроме того очевидно, что это соотношение коррелирует со степенью дифференциации трофобластической болезни и может являться важным показателем прогноза течения хорионкарциномы.

ВЫВОДЫ

1. Получен и охарактеризован биохимическими методами очищенный препарат БР1, подобраны условия иммунизации для получения специфических поликлональных и моноклональных антител.

2. Получены 4 линии гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, к БР1. Установлено, что моноклональные антитела, продуцируемые полученными клонами, относятся к двум группам

конкуренции и взаимодействуют с двумя независимыми антигенными детерминантами.

3. Подобраны оптимальные по чувствительности и специфичности - комбинации моноклональных и поликлональных антител для

создания диагностической тест—системы для определения БР!.

4. Разработанная ИФ тест —система апробирована на клиническом материале. Показана диагностическая ценность Тест —системы дла скрининга и мониторинга беременности и трофобластических заболеваний, а также для дифференциальной диагностики между пузырным заносом и хорионкарциномой.

5. Оценено диагностическое значение соотношения ЭР 1/бета — ХГТ' для дифференциальной диагностики пузырного заноса и хорионкарциномы и д\я прогнозирования течения хориоякарциномы. Показана корреляция соотношения 5Р1/бета — ХГТ со степенью дифференциации трофобластической болезни.

Список работ, опубликованных по теме лиссертапии:

1. Воробьев С.М., Северина М.Е., Старовойтова Т.А., Гудима С.О., Соколов А.В., Венгеров Ю.Ю.

"Создание иммуноферментной тест —системы для определения трофобластического бета—1 гликопротеина с использованием моноклональных антител". Биотехнология, 1991, N84, стр.82 —85.

2. Воробьев С.М., Северина М.Е., Старовойтова Т.А., Венгеров Ю.Ю. "Получение и характеристика моноклональных антител к трофобластическому бета — 1 гликопротеину". Материалы международного симпозиума "Маркеры новообразований".г. Кошипе, Чехословакия, 1990.

3. Воробьев С.М.,' Северина М.Е., Старовойтова Т.А., Венгеров Ю.Ю.

"Клиническое применение иммуноферментной тест—системы для определения трофобластического бета—1 гликопротеина"

Материалы международного симпозиума "Будущее онкофетальных белков", г. Осака, Япония, 1991.

4. Венгеров Ю.Ю., Платонова Т.К., Старовойтова Т.А., Воронов A.B., Паршина A.B., Воробьев С.М., Северина М.Е., Соколов A.B. Изменение к фармокопейной статье № ВФС 42—169ВС88. "Тест-система иммуноферментная для определения трофобластического бета—1 гликопротеина". Москва, 1990.

5. Мягких И.В., Северина М.Е., Хо Т.К.

"Хорионический гонадотропин кз человеческой плаценты. Быстрый метод очистки и детекция с помощью ИФМ". Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные направления и новые методы в молекулярной биологии". Рига, 1990, стр.71.

6. Воробьев С.М., Северина М.Е., Старовойтова Т.А., Венгеров Ю.Ю. "Моноклональная иммуноферментная тест —система для определения трофобластического бета—1 гликопротеина человека". Материалы Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Самарканд 1991, стр. 43.

7. Vorobiev S.M., Severina М.Е., Starovoitova Т.А., Gudima S.O., Sokolov A.V., Vengerov Y.Y. "Creation of monoclonal antibody enzyme immunoassay for pregnancy specific beta—1 glycoprotein". Biomedical Science. 1990, 1, #6, p.650.