Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Триплетные состояния фотосинтетических пигментов in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Триплетные состояния фотосинтетических пигментов in vitro и in vivo"

* ,1 V

,14),

о з ФВ №

На правах рукописи УДК 577.3

ПРОСКУРЯКОВ Иван Игоревич

ТРИПЛЕТНЫЕ СОСТОЯНИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ

т уИго и т у1уо

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степенй доктора физико-математических наук

ПУЩИНО 1997

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

Научный консультант: чл.-корр. РАН В.А. Шувалов

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Л. А. Блюменфельд доктор физико-математических наук, профессор Ю.А.Лазарев доктор физико-математических наук В. А. Караваев

Ведущая организация: Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится "1*? " (^-с&^а./ 1997 г. ;

в а часов на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН,т. Пущин

Автореферат разослан " ^ ц/ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических н; '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы, ее актуальность. Фотосинтез шляется одним из важнейших биосферных процессов на Земле. В результате его протекания энергия солнечного :вета используется для синтеза органических веществ. 1осле поглощения света молекулами пигментов, входящих в состав фотосинтезирующих организмов, происходит быстрый процесс межмолекулярного переноса энергии. При попадании возбуждения на пигменты специализированных пигмент-пипопротеиновых структур (реакционных центров, РЦ1), запускается цепочка реакций переноса электрона между его компонентами. Конечные стадии функциональных процессов в РЦ имеют высокий квантовый выход (~ 100%) и энергетический к.п.д. (0,5 - 0,6).

Исследования общих принципов структурной организации и механизма первичных стадий фотосинтеза имеют большое значение как для понимания самого процесса фотосинтеза, так и для создания работающих на сходных принципах высокоэффективных фотопреобразователей. Кроме этого, они являются важным звеном изучения общих закономерностей фотохимических и фотофизических процессов.

Еще в 1936 г. Гаффрон и Воль высказали предположение, что основной пигмент фотосинтеза, хлорофилл, в метастабильном состоянии может играть роль сенсибилизатора фотохимических реакций. Это предсказание в полной мере оправдалось в случае фотохимических реакций хлорофилла in vitro. В работах ряда авторов (Франк 1953, 1957,1964, Робинсон 1963,1967, Фонг 1974,197 6,1977) триплетному состоянию хлорофилла отводилась ключевая роль и в процессе фотосинтеза. Такие свойства триплетов, как большое время жизни возбужденного состояния и высокая реакционноспособность были сочтены подходящими для осуществления фотореакций in vivo.

Представления о роли триплетных состояний коренным образом изменились после того, как стали возможны оп-

1Сокращения: АДМР-абсорбционно-детектируемый магнитный резонанс; МОДС-магнитооптическая дифференциальная спектроскопия; НФС-магнитофотоселекция; ОДМР-оптически детектируемый магнитный резонанс; РИДМР-Reaction Yield-Detected Magnetic Resonance; РНП-расщепление в нулевом поле; РП-радикальная пара; РЦ-реакционный центр; СВЧ-сверхвысокая частота; ЭПР-электронный парамагнитный резонанс; MIA-Microwave-Induced Absorbance changes.

тические измерения с пикосекундным временным разрешением. Было показано (Кауфманн 1975, Рокли 1975), чт< первая приводящая к относительно стабильным продукта» стадия фотопереноса электрона в бактериальных РЦ завершается за время ~ 10~11 с. Поскольку при поглощени! кванта света пигменты фотосинтеза переходят в синглет-ное возбужденное состояние, и на переход молекул i триплетное состояние обычно необходимо время ~ 10'8 с, гипотеза об участии триплетов в фотосинтезе была отвергнута .

Современный взгляд на механизм первичных стадий фотосинтеза отводит триплетным состояниям пигментов ролг побочных, эффективно заселяемых лишь при нарушении нормального электронного транспорта. Тем не менее, триплетное состояние пигмента представляет собой почта идеальную спиновую метку, которую можно использовать для исследования структуры и функции фотосинтетическогс аппарата. При создании такой метки сохраняется нативное окружение, она чувствительна ко взаимодействиям с окружающими молекулами. Очень важно, что в триплетныс состояния переходят те же молекулы, которые участвуют i функциональном переносе энергии и электрона. Далее, триплетное состояние чувствительно к магнитным взаимодействиям, которые невозможно исследовать методам* оптической спектроскопии и которые играют важнейшук роль в процессе переноса электрона. Магнитное диполь -дипольное взаимодействие между неспаренными электронам!-триплетного состояния зависит от расстояния между спинами приблизительно как г~3. Поэтому даже небольшие вариации расстояния могут отражаться на спектроскопических параметрах триплетов. Это позволяет надеяться на возможность обнаружения распределения свойств триплет-несущих молекул. К недостаткам, скорее не собственно триплетных меток, а методов их исследования, существовавших к моменту начала данной работы, следует отнести то, что регистрация триплета магниторезонансны-ми методами требовала охлаждения образцов до низки* температур (—10 К).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в исследовании свойств триплетных состояний фотосинтетических пигментов in vitro и in vivo, а также и> предшественников, и получение на этой основе новой информации о механизмах переноса энергии и электрона е бактериальном фотосинтезе и в фотосистеме II высшиг растений.

В связи с этим в работе были сформулированы следую-;ие экспериментальные задачи:

1) разработка методов исследования триплетных со-тояний и их предшественников в возможно более широком иапазоне температур и с достаточно высоким Бременным азрешением;

2) изучение механизмов заселения триплетных состоя-ий in vitro и in vivo;

3) поиск проявлений распределения свойств (неодно-одности) исследуемых фотосинтетических препаратов;

4) поиск подходов к изучению магнитных взаимодейст-ий предшественника триплетных состояний в фотосинте-ических РЦ;

5} изучение механизма триплет-триплетного (Т-Т) пе-еноса энергии в бактериальных РЦ;

6) исследование причин существенных различий войств триплетных состояний в бактериальных РЦ и реак-ионных центрах фотосистемы II.

Научная новизна и практическое значение работы, ольшинство научных и методических результатов, пред-тавленных в данной работе, носит приоритетный арактер. Предложенный метод регистрации влияния маг-итного поля на выход флуоресценции способствовал тановлению представлений о первичной радикальной паре, Р+1~] (см. рис. 2), как предшественнике триплетного со-тояния первичного донора РЦ, и о существовании флуо-есцентного канала рекомбинации этой радикальной пары, существленное впервые прямое детектирование первичной адикальной пары в бактериальных РЦ методом ЭПР позво-ило однозначно определить величину и знаки магнитных заимодействий между ее компонентами. Это в свою чередь дало дополнительные свидетельства в пользу по-ледовательного механизма переноса электрона в РЦ.

Впервые сконструированный в нашей стране (и один из учших в мире на момент создания) автоматизированный пектрометр флеш-ЭПР позволил расширить температурный иапазон измерений спектров ЭПР триплетных состояний отосинтетических пигментов до комнатной температуры, лагодаря этому удалось наблюдать ранее неизвестные из-енения в триплетном спектре Rb.sphaeroides, которые ыли интерпретированы как проявление первой стадии Т-Т ереноса энергии на каротиноид РЦ. Полный процесс пере-оса был затем также изучен методом флеш-ЭПР; родемонстрировано выполнение в процессе Т-Т переноса нергии правила сохранения проекции спина на внешнее

магнитное поле. Температурная зависимость триплетногс спектра ЭПР Eps.viridis позволила высказать предположение о релаксации спиновой поляризации триплете первичного донора РЦ, индуцированной магнитным взаимодействием с комплексом первичного акцептора электрона. Методом АДМР впервые продемонстрировано распределение свойств триплета первичного донора в РЦ ЯЪ. sphaeroidei R26. Неоднородность обусловлена вариацией расстояни; между половинами димера и соответствующими изменениям* в величине экситонного взаимодействия между ними.

Флеш-ЭПР исследования триплетов хлорофиллов in vitro показали, что их параметры РНП изменяются i зависимости от свойств растворителя и могут достигав значений, характерных для триплетного состояния первичного донора фотосистемы II (3Р680). Проведенные впервые измерения спин-решеточной релаксации 3Р680 позволши дать объяснение отмеченному ранее исчезновению сигнале ЭПР этого триплета при температурах Т > 30 К. Методов флеш-ЭПР удалось исследовать спектры ЭПР 3Р680 в широко* температурном интервале, вплоть до Т = 230 К. Предложенная модификация метода магнитофотоселекции (МФС) дала возможность регистрировать сигналы при низких ин-тенсивностях возбуждающего света. Полученные этим методом данные позволили определить знаки параметров PHI 3Рб80. Сопоставив свойства Р680, обнаруженные в экспериментах по МФС, и температурную зависимость релаксации, мы предложили первую детальную модель структурной организации первичного донора фотосистемы II.

Разработанные экспериментальные методики, подходы, установки продолжают использоваться в ИПФС РАН (Пущино) и Лейденском университете (Нидерланды). Многие из полученных результатов имеют принципиальное значение дл> понимания механизмов переноса энергии и электрона в фотосинтезе .

Основные научные результаты работы.

1. Показано, что флеш-ЭПР спектроскопия триплетныз состояний фотосинтетических пигментов и их предшественников служит эффективным методом исследования первичны: процессов фотосинтеза. Применяемая в этом методе быстрая регистрация фотоиндуцированных сигналов позволяем судить об их начальной спиновой поляризации и во многи: случаях дает возможность резко расширить допустимы! температурный диапазон измерений по сравнению со стандартным стационарным методом ЭПР. С помощью параметра РНП триплетного состояния можно проводить его идентифи-

ацию. Изучение формы спектра и релаксационных свойств риплетных состояний дает информацию о магнитных взаи-юдействиях и динамических характеристиках триплетов.

2. Характер начальной спиновой поляризации спектра ПР триплетного состояния несет информацию о механизме го заселения. По виду поляризации легко различать три-летные состояния, образовавшиеся в результате екомбинации триплетных радикальных пар, прямого интер-омбинационного перехода, синглет-триплетного деления озбуждения или Т-Т переноса энергии.

3. Установлено, что димерная организация первичного ;онора электрона в реакционных центрах фотосинтеза яв-яется универсальной, характерной для всех известных ипов реакционных центров. Такая организация позволяет согласовать требуемые оптические и окислительно-осстановительные свойства первичного донора.

4. На примере триплетного состояния первичного до-ора бактериальных РЦ продемонстрировано наличие аспределения свойств этих фотосинтетических объектов, днное наблюдение скорее всего носит общий характер, и озможность распределения кофакторов РЦ по расстояниям

взаимным ориентациям необходимо учитывать при разра-отке моделей, описывающих их свойства.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всесоюзном сове-ании по люминесценции (1979 г., Самарканд), V сесоюзной конференции • "Использование вычислительных ашин в спектроскопии молекул и химических исследо-аниях" (сентябрь 1980 г., Новосибирск), III Всесоюзной онференции "Поляризация электронов и ядер и магнитные ффекты в химических реакциях" (август 1981 г., овосибирск), Симпозиуме специалистов стран-членов СЭВ Исследование биогенеза, структуры и функции отосинтетического аппарата в связи с преобразованием олнечной энергии" (1981 г., Пущино), Всесоюзном овещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии его аппаратурное обеспечение" (декабрь 1981 г., ига), Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в сследовании химических элементарных актов" (сентябрь 984 г., Новосибирск), Всесоюзной конференции "Кинетика механизм электронного переноса в белковых системах и х моделях" (апрель 1985 г., Вильнюс), Всесоюзной онференции "Физико-химическая биология и биотехнология ототрофных микроорганизмов" (июнь 1987 г., Москва), IX етней Амперовской школе (сентябрь 1987 г.,

Новосибирск), Всесоюзной конференции "Преобразовани световой энергии в фотосинтезирующих системах и и моделях" (июнь 1989 г., Пущино), VIII Всесоюзно конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине (май 1990 г., Звенигород), Российско-Американско семинаре по фотосинтезу (май 1992 г., Пущино), семинар Голландского общества "Biospec" (февраль 1994 г. Лейден), семинаре Европейского научного фонда (апрел

1995 г., Вай, Англия), Международной конференци "Биоэнергетика фотосинтеза" (июнь 1996 г., Пущино), XI Международном биофизическом конгрессе (август 1996 г. Амстердам), IV Международном симпозиуме "Магнитные спиновые эффекты в химии и родственные явления" (авгус

1996 г., Новосибирск), а также на иных конференциях семинарах.

Структура и обгьем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов. Она содержит '{>^ страниц, включая рисунков и таблиц. Список литературы включает J ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Глава 1. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О ТРИПЛЕТНЫХ СОСТОЯНИЯХ МОЛЕКУЛ.

Раздел 1.1 играет роль вводного; в нем обсуждаетс возникновение современных взглядов на триплетны> состояния, впервые экспериментально наблюдавшиес Терениным, а также Льюисом и Каша в 1943-44 гг. Боль шинство молекул (в том числе пигменты фотосинтеза) невозбужденном состоянии имеет нулевой суммарный элек тронный спин (синглетное состояние, S). В процессе пог лощения кванта света спиновое состояние молекул н< изменяется. Для заселения триплетного состояния Т изо лированной молекулы (спиновое квантовое число 1, муль типлетность 3) необходимо, чтобы за время жизни возбуж денного состояния успел пройти интеркомбинационный пе реход с изменением спина молекулы (S-T конверсия). Об менное взаимодействие электронов, участвующих в S-' конверсии, в молекулах фотосинтетических пигменто: (как, впрочем, и для большинства органических молекул имеет ферромагнитный характер (обменное взаимодействи! J > 0), т.е. триплетный уровень расположен ниж( синглетного по энергии. Следовательно, S-T конверси;

энергетически возможна; в изолированных молекулах она шределяется взаимодействием спинового и орбитального шгнитного моментов.

Развитие знаний о триплетных состояниях в значительной степени определялось созданием экспериментальных методик для их исследования. Раздел 1.2 посвящен шисанию этих методик в той степени, насколько это не->бходимо для понимания дальнейшего изложения. Регист->ация фосфоресценции, применявшаяся при первых наблюде-1иях триплетных состояний, малополезна при исследовании 'риплетов фотосинтетических пигментов из-за низкого ~1СГ3) квантового выхода фосфоресценции последних. Ис-:ледования триплетных состояний изолированных молекул [игментов возможны с использованием быстрой и замедлен-юй флуоресценции. При высоком квантовом выходе (0,3 -6) и большом (~1СГ3 с) времени жизни триплетов их ста-.ионарная концентрация при непрерывном освещении может 1ыть достаточно высокой, чтобы за счет обеднения основ-;ого состояния влиять на выход быстрой флуоресценции, '■амедленная термоактивируемая флуоресценция возникает 'лагодаря обратному заселению синглетного возбужденного юстояния из триплетного, Из чисто оптических методов аиболее широко используется метод флеш-фотолиза. Он 'азируется на том, что спектры поглощения (в том числе отосинтетических пигментов) заметно отличаются для мо-екул, находящихся в основном и триплетном состояниях, спользуя короткие вспышки возбуждающего света можно ыстро создавать высокие концентрации триплетных со-тояний и затем исследовать их спектральные и инетические свойства. Этот метод нашел широкое приме-ение в исследованиях как изолированных молекул, так и игментов, включенных в структуру фотосинтетического ппарата.

Одним из основных методических подходов данной ра-оты является спектроскопия электронного парамагнитного езонанса (ЭПР). Впервые методом ЭПР триплетные молеку-ы исследовали Хатчисон и Мангум в 1958 г. Теоре-ическое описание наблюдаемых спектров ЭПР триплетных остояний разработано усилиями Ван-дер-Ваальса и де рота, Хатчисона и Мангума в 1959-1961 гг. В большинст-е случаев спектры ЭПР органических молекул хорошо писываются в рамках чисто спинового магнетизма, без чета спин-орбитального взаимодействия. Соответствующий пин-Гамильтониан имеет вид:

1 Л2

Нз = рВдгЭ + иге; - - Б') + Е(Б< + вр)

(I)

где 5 - оператор полного спина молекулы (5 = + В2) и ¿д - его проекции, р - магнетон Бора, д - д-тензор молекулы, В- магнитная индукция, Б и Е - т.н. параметры расщепления в нулевом поле (РНП). Параметр й можно рассматривать как меру интенсивности взаимодействия

электронов, а параметр Е отражает симметрию делокализации неспаренных электронов (обращаясь в ноль в пределе аксиальной симметрии). Спин-спиновое взаимодействие (1) вызывает расщепление триплетного уровня •молекулы на три спиновых подуровня, которые при условии 0,Е * 0 являются невырожденными . л Гамильтониан Я5 при В = 0 диагонализиру-ется в системе координат, связанной с молекулярными осями (магнитные оси), и три спиновые подуров-

В. иТл

280

300

320

340

360

380

эпр

Рис. 1. Общий триплетного

вид спектров состояния.

а)равновесная заселенность спино- и'я обозначаются х у вых подуровней, б)ЕЕЕААА спин- порфиринов и

поляризация ( Хл а в растворе), ^

в)АЕЕААЕ спин - поляризация хлорофиллов магнитная С3Р680), г) спектр (в) в диффе- ось г близка к нор-ренциальной форме. А - поглоще- мали к плоскости ние, Е - излучение мощности СВЧ. тетрапиррольного

кольца, а оси х и у лежат в этой плоскости. При В Ф 0 (в приближении сильного магнитного поля) ось квантования совпадает с направлением внешнего магнитного поля, и энергетические подуровни триплета получают обозначения^ Т0, IV, Г- в зависимости от величины проекции вектора 5 на направление магнитного поля. Разрешенными являются переходы с изменением спинового числа ¿М5 = ±1, и таким образом в общем случае триплетная молекула характеризуется парой линий

ЭПР, расположенных симметрично по отношению к точке В = 1™/др (йу - энергия кванта СВЧ). Сигналы, соответствующие переходам ДМЭ = ±2, также возможно наблюдать; эти сигналы в настоящей работе не рассматриваются.

Спин-спиновое дипольное взаимодействие анизотропно. Поэтому энергия спиновых подуровней зависит от ориентации молекулы в магнитном поле. Это приводит к значительному анизотропному уширению спектров ЭПР три-плетных состояний (для фотосинтетических пигментов полный размах спектра составляет 40-60 мТл) и к их специфической форме. В характерных точках спектра, обозначенных на рисунке 1 числами 1-6, в резонансе оказываются в основном молекулы, ориентированные одной из магнитных осей параллельно В (т.н. канонические ориентации и канонические линии ЭПР триплетного состояния).

Знаки параметров Б и Е из спектра ЭПР триплетного состояния как правило не определяются. Для этого необходимо провести измерения магнитофотоселекции (МФС). Метод МФС разработан Коттисом и Лефевром, а также Эль-Саидом в 1963-64 гг. При измерении МФС образец возбуждается линейно-поляризованным светом, и исследуется зависимость амплитуд канонических компонент спектра ЭПР от угла между направлением магнитного поля и плоскостью поляризации. Такие измерения позволяют вычислять значения углов между вектором оптического дипольного момента перехода и магнитными осями молекулы и тем самым соотносить канонические компоненты с определенными ориентациями триплетных молекул. Следует подчеркнуть, что знаки Б и Е, в отличие от абсолютных значений параметров РНП, имеют условный характер. В данной работе принято естественное, на наш взгляд, положение, что обозначение у получает та магнитная ось, которая лежит вдоль вектора £>у-перехода пигментной молекулы, ось х лежит вдоль вектора дх, а ось г перпендикулярна плоскости тетрапиррольного кольца. При таком выборе магнитных осей знаки параметров РНП автоматически задаются порядком следования канонических компонент в спектре ЭПР. Усилиями лабораторий Норриса и Сауэра (Тернауэр 1976,1977, Боксер 1979, Франк 1979, Троспер 1982) были определены знаки О и Е в фотосинтетических объектах: 0 > 0, Е < 0 для изолированных хлорофиллов и бактериохло-рофилла а, И > 0, Е > 0 для триплетного состояния первичного донора электрона бактериальных РЦ. Данные о знаках О и Е отсутствуют для фотосистем I и II растений .

Важным свойством спектра ЭПР триплетного состояния является также его спиновая поляризация, связанная с отклонением заселенностей спиновых подуровней от термодинамически равновесных значений. На рис. 1а приведеь обобщенный вид равновесного спектра ЭПР, а на рис.. 16-1 - спин-поляризованные спектры в интегральном и (пока более распространенном) дифференциальном виде. Картинг спиновой поляризации спектра ЭПР определяется механизмом его заселения и свойствами триплетной молекулы.

Спиновая поляризация с большой скоростью релаксиру-ет к равновесной, поэтому для ее изучения надо иметь возможность быстрой регистрации фотоиндуцированных спектров ЭПР. Для этого используют короткие вспышки света и (в простейшем варианте) постоянная времени спектрометра ЭПР выключается; сигналы записываются цифровым регистратором быстропротекающих процессов. Другая возможность - модуляция интенсивности возбуждающего света и двойная демодуляция полученного сигнала на частотах модуляции магнитного поля спектрометра и интенсивности света. Оба эти подхода не обеспечивают необходимого временного разрешения, которое ограничивается частотами модуляции. Радикальным решением является отказ от модуляции магнитного поля и применение прямого детектирования сигналов, формирующихся на выходе смесителя СВЧ спектрометра ЭПР (метод флеш-ЭПР). При этом, используя низкодобротный резонатор, удается достичь временного разрешения ~100 не.

Еще более высоким временным разрешением (~10 не в 3-см спектрометрах ЭПР) обладает метод спин-эхо. Образец возбуждается короткой (< 10 не) вспышкой света, а обычная последовательность импульсов возбуждения эхо подается на образец после регулируемой прецизионной задержки. Для'формирования сигнала спин-эхо от триплетных состояний фотосинтетических пигментов обычно требуется время ~ 600 не, считая от первого СВЧ импульса. Существенным преимуществом спин-эхо является отсутствие воздействия на образец мощности СВЧ в промежутке между вспышкой света и СВЧ импульсами, что устраняет процесс индуцированной релаксации. Метод спин-эхо позволяет исследовать собственную релаксацию парамагнитных частиц и их кинетические свойства.

Мощным инструментом исследования триплетных состояний является разработанный в лабораториях Ван-дер-Ваальса и Квйрама (1971 г.) метод оптического детектирования магнитного резонанса в нулевом поле " (ОДМР).

1онижением температуры образца (обычно до Т < 10 К) доживаются того, что релаксация между спиновыми юдуровнями становится много медленнее, чем процессы их заселения-дезактивации. Таким образом триплетные подуровни и (и = к, у, z) оказываются кинетически полированными, при этом стационарная концентрация три-шетного состояния под светом интенсивности I вписывается формулой

[T]/[So] = сГ£ Pu / К> (2)

и

?де с ■ - константа, ри - вероятность заселения и ки -сонстанта скорости дезактивации спинового подуровня и, [So] - концентрация исследуемых молекул в основном со-:тоянии. Воздействуя на образец электромагнитной волной ; энергией кванта, равной энергетическому зазору между чарой подуровней (|D|+|E|, |D|-|E| или 2|Е|), добивают-:я насыщения соответствующего перехода, так что два /•ровня оказываются связанными. Если, к примеру, насыщается переход между х- и у-подуровнями, то

[T]/[S03 = cIHpz/k: + (рх + ру)/(кх + Jry)] (3)

I общем случае величины (2) и (3) отличаются. Поэтому )ДМР регистрируется по СВЧ-индуцированному изменению оптических характеристик образца. При регистрации по юглощению метод получил название АДМР (абсорбционно-зетектируемый МР) . Метод АДМР обладает высокой чувст-зительностью и селективностью. Последнее свойство позволяет применять его к исследованиям распределения свойств (неоднородного уширения) триплетных состояний.

Близким по физическому механизму является метод регистрации эффекта внешнего магнитного поля. Изолированные при В - 0 спиновые подуровни триплета в ^нулевом магнитном поле перемешиваются, что, как и в методе ОДМР, приводит к изменению стационарной концентрации триплетного состояния. Процесс описывается /равнениями типа (2) и (3). В отличие от ОДМР магнитное юле действует на все триплетные состояния в образце. Тоэтому метод регистрации магнитных эффектов не обладает селективностью.

Магнитное поле может влиять на концентрацию триплетов и по совершенно другому механизму, если процесс заселения триплетного состояния проходит через стадию эадикальной пары (РП). В зависимости от взаимной ориентации спинов неспаренных электронов двух парамагнитных

молекул, образующих РП, она может находиться в синглет-ном или триплетном состоянии. Магнитное поле влияет н< частоту S-T переходов в РП, изменяя вероятность развития реакции по синглетному и триплетному каналам. Tej самым изменяются квантовые выходы триплетного состоянш и (в фотосинтетических РЦ) флуоресценции, возникающе! при рекомбинации синглетных радикальных пар. При несложной технической реализации метод регистрацю магнитных эффектов позволяет детектировать рекомбинаци-онную люминесценцию на фоне значительной быстро* компоненты и исследовать свойства радикальных пар.

Триплетные состояния в фотосинтетических препаратаэ исследуются также методом РИДМР (детектирование магнитного резонанса по изменению выхода продуктов реакции). Он близок к методу ОДМР, но колебания СВЧ воздействую'] не на само триплетное состояние, а на предшествующук ему триплетную радикальную пару. Это также вызывает изменение квантового выхода триплета. Обычно метод РИДМ1 реализуется в варианте с разрешением по времени путеь воздействия на образец мощным СВЧ импульсом и быстро* регистрацией вызванных этим оптических изменений.

Раздел 1.3 посвящен краткому обсуждению литературных данных по ЭПР-исследованиям триплетных состояний изолированных фотосинтетических пигментов в растворах, которые впервые были проведены Грибовой и Каюшиным е 1963-64 гг. на переходе AMS = ±2. Как в этих, так и £ последующих измерениях применяли замороженные растворь пигментов. Для многих пигментов, включая хлорофилл а у бактериохлорофилл а, картина спиновой поляризации спектра имела вид ЕЕЕААА (Е - излучение, А - усиленное поглощение мощности СВЧ канонических компонент в порядке их следования, см. рис. 16) .

В разделе 1.4 обсуждается современный уровень представлений о роли и свойствах триплетных состояний пигментов в фотосинтезе. In vivo сигналы ЭПР триплетон впервые обнаружены Даттоном, Ли и Сайбертом в 1972 г. на препаратах фотосинтезирующих бактерий. Ими оказались триплетные состояния первичного донора электрона реакционных центров. Как уже упоминалось, фотохимическая реакция в РЦ протекает с участием синглетных уровней, а триплеты образуются только в случае нарушения нормального физиологического транспорта электронов (который представлен на рис. 2, левее пунктирной линии). Условия эффективного заселения триплетных состояний РЦ оказалось легко создать искусственно, прерывая перенос

'РВ10А

Рис. 2. Упрощенная схема первичных реакций в бактериальных РЦ. Р-первичный донор электрона, димер бак-?ериохлорофилла; I-промежуточный акцептор, бактериофе->фитин; Од.-первичный акцептор, хинон? Кар-каротиноид; 3-мономерный бактериохлорофилл {если это не оговорено отдельно, В в обозначениях текста опускается и его золь не рассматривается).

электрона на первичный акцептор. Этого можно добиться 'даляя молекулы первичного акцептора или восстанавливая IX химически (при этом активизируются процессы, изобра-сенные на рис. 2, правее пунктира). Спиновая юляризация спектра ЭПР 3Р имеет необычный вид АЕЕААЕ [рис. 1в) . Триплетное состояние, помимо собственной вы-:окой реакционной способности, может при взаимодействии : молекулой кислорода привести к образованию возбужден-юго синглетного кислорода. Последним способен реагировать с компонентами фотосинтетического аппарата, зызывая их разрушение. Для устранения вредного эффекта зо многих организмах триплетное состояние переносится 1а молекулы каротиноидов, которые быстро растрачивают энергию в тепло. Т-Т перенос энергии на каротиноиды не 1дет при температуре жидкого гелия и резко ускоряется три повышении температуры. Установлено, что триллетные ;остояния пигментов образуются также в светособирающих антеннах фотосинтетиков.

В разделе 1.5 суммируются сведения об известных механизмах заселения триплетных состояний in vitro и ii vivo. Это интеркомбинационный переход из синглетног« состояния, образование триплета при рекомбинации триплетных радикальных пар, Т-Т перенос энергии t триплетной молекулы, деление синглетного возбуждения < образованием триплетного состояния и, наконец, процесс прямого перехода из синглетного основного состояния i триплет, который, хотя и имеет низкую вероятность, может реализоваться при высоких плотностях возбуждения.

ГЛАВА 2. МЕТОДИКИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОБРАЗЦОВ И МЕТОДЬ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследование триплетных состояний и их предшественников потребовало разработки новых экспериментальны* методик, часть которых была создана при участии автора. В разделе 2.1 описана автоматизированная установка для измерения влияния постоянных магнитных полей на Bbixoi флуоресценции. Установка позволяет регистрировать изменения флуоресценции в диапазоне магнитных полей 0 - 6С мТл и проводить синхронное накопление сигналов в памяти калькулятора ДЗ-28 с последующим выводом результата на графопостроитель. Она характеризуется чувствительностьк измерений относительного изменения флуоресценции не хуже 2-Ю"4.

В разделе 2.2 обсуждаются теоретические предпосылки и техническая реализация метода МОДС. Соответствующая установка была создана в Лаборатории молекулярной спектроскопии ИПФС РАН.Она имеет чувствительность около 10~6 при небольшом (3-5 минут) времени регистрации дифференциального спектра. В разделе 2.3 описана установка АДМР университета Штуттгарта, использованная в работе. Она позволяет регистрировать как спектры изменений оптического поглощения под действием резонансных СВЧ колебаний (т.н. спектры MIA), так и собственно спектры АДМР при фиксированной длине волны оптической регистрации. Установка работает в диапазоне частот СВЧ 1 МГц -1,9 ГГц (при мощностях накачки от 200 до 25 Вт) и длин волн регистрации 400 - 1000 нм. Чувствительность установки лучше 10~6 единиц оптической плотности при разумном времени накопления сигнала 1 час. Раздел 2.4 описывает условия измерения оптических спектров поглощения образцов.

Раздел 2.5 посвящен основному для данной работы методу - электронному парамагнитному резонансу. Наиболее адекватной для исследований триплетных состояний явля-этся спектроскопия ЭПР с разрешением по времени, а именно флеш-ЭПР и спин-эхо. При непосредственном участии автора были созданы 2 спектрометра флеш-ЭПР. Спектрометр ИПФС РАН сконструирован на основе серийно выпускавшегося супергетеродинного спектрометра 3-см диапазона РЭ 1302. Помимо модернизации самого спектрометра (в основные задачи которой входило улучшение стабилизации клистронных генераторов СВЧ, создание прецизионной развертки магнитного поля и разработка системы криостатирования образцов) была изготовлена система быстрой цифровой регистрации сигналов. Цифровой осциллограф собран на базе микро-ЭВМ "Электроника-60", Элоков в стандарте КАМАК и специально разработанного программного обеспечения и имеет минимальную длитель-кость выборки сигнала 70 не. Спектрометр работает в режиме прямого детектирования, с отключенной модуляцией магнитного поля. Широкополосность системы регистрации (300 Гц - 15 МГц) предопределяет низкое значение отно-пения сигнал/шум и необходимость синхронного накопления полезных сигналов. Триплетные состояния в образце генерируются вспышками лазера ИЗ-25-1 (Хген=540 нм, энергия б мДж, длительность 20 не) или лазера на красителях ПЖИ-4 02 (Хген=595 нм, энергия 2 мДж, длительность 150 кс). Были приняты специальные меры для устранения артефакта вспышки, вызванного разрядом емкостных накопителей лазера. Созданный пакет*программ позволяет осуществлять запись и обработку как кинетических кривых фотоиндуцированных сигналов, так и "мгновенных" спектров ЭПР. Спектрометр обеспечивает временное разрешение около 300 не и погрешность определения д-фактора кО,00005.

Спектрометр Лейденского университета (Нидерланды) представляет собой универсальную компьютеризованную установку. Реализованы три режима работы: стандартного гомодинного 3-см спектрометра ЭПР, спектрометра флеш-. ЭПР и спектрометра спин-эхо. Возбуждение образцов производится вспышкой лазера на оптическом параметрическом преобразователе (Хген плавно перестраивается в пределах 400 - 2500 нм, энергия вспышки 7-20 мДж,- длительность 4 не). Временное разрешение спектрометра в режиме флеш-ЭПР -100 не, в режиме спин-эхо - лучше 10 не.

В разделе 2.6 описана модификация метода МФС, разработанная автором для измерений на препаратах фотосистемы II. Спектр ЭПР триплетного состояния первичного донора второй фотосистемы имеет резкую температурную зависимость. Для уменьшения нагрева образца измерения проводили при низких интенсивностях света, что повлекло за собой необходимость длительного накопления слабых сигналов для повышения отношения сигнал/шум. Как уже упоминалось, явление МФС проявляется в зависимости амплитуды сигналов от угла между направлением магнитного поля и плоскостью поляризации возбуждающего света. Если вращать плоскость поляризации, то в сигнале ЭПР появятся компоненты, модулированные на частоте этого вращения. Это свойство использовано в новой методике. Детектирование сигнала ЭПР производится сначала на частоте модуляции магнитного поля, а затем на частоте вращения плоскости поляризации. Результатом двойной демодуляции является сигнал МФС, который легко накапливать в автоматическом режиме при многократных развертках магнитного поля.

В разделе 2.7 кратко описываются методики приготовления препаратов. В работе использовали целые клетки, хроматофоры и реакционные центры различных фотосинтези-рующих бактерий, Dl-D2-cyt Ь559 комплексы фотосистемы II и изолированные фотосинтетические пигменты.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРВИЧНОЙ РАДИКАЛЬНОЙ ПАРЫ И ТРИПЛЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ ЭФФЕКТА МАГНИТНОГО ПОЛЯ.

В главах 3 и 4 приводятся результаты исследования предшественника триплетного состояния первичного донора

бактериальных РЦ - первичной радикальной пары. Развитие представлений о радикальной паре как промежуточном звене реакции фотопереноса электрона в фотосинтетических реакционных центрах обсуждается в

Рис.3. Кривые магнитного эффекта, а,в)с восстановленным Од., б) комплексы каро-тиноид-содержащего штамма; а,б)293К, в)5К

разделе 3.1. Кроме пикосекундных оптических измерений (Рокли 1975, Кауфманн 1975) и характера спиновой поляризации спектра ЭПР 3Р (Тернауэр 1975), на существование первичной РП указывали также данные об уменьшении выхода триплетного состояния Р при наложении магнитного поля на препараты РЦ с восстановленным первичным акцептором (Бланкеншип .1977, Хофф 1977). Элементом, завершившим создание целостностной картины первичных процессов в РЦ и места, которое занимает в ней первичная РП, явились результаты измерений эффекта магнитного поля на выход флуоресценции препаратов фото-синтезирующих бактерий. В разделе 3.2 приведены такие впервые полученные результаты. При Т > 120 К внешнее магнитное поле усиливает флуоресценцию РЦ-содержащих препаратов с прерванным электронным переносом на QA (рис. За) по механизму, описанному в Гл. 1. Величина магнитного эффекта падает с понижением температуры и при Т < 100 К обращается в ноль. Свойства эффекта магнитного поля хорошо объясняются в рамках схемы реакций переноса электрона в РЦ (рис. 2), если принять существование канала рекомбинации РП в синглетное возбужденное состояние (обозначенное на рис. 2 пунктирной стрелкой) . Магнитное поле, уменьшая выход S-T конверсии РП, тем самым увеличивает вероятность ее рекомбинации с испусканием флуоресценции. Такая рекомбинация является термоактивируемой, что объясняет уменьшение эффекта с понижением Т. Анализ формы кривых зависимости выхода флуоресценции от магнитного поля позволяет сделать следующие выводы: 1) в РЦ Bb.sphaeroides и R.rubrum обменное взаимодействие в РП не превышает 1 мТл; 2) время жизни РП составляет ~1 не, что заметно короче величины, получаемой из оптических измерений. Это противоречие обсуждается в Гл. 4.

На препаратах каротиноид-содержащего штамма Rb. sphaeroides влияние магнитного поля наблюдается и без восстановления первичного акцептора, причем форма кривых заметно отличается от таковой для образцов с прерванным электронным транспортом (рис. 36) . В разделе 3.3 делается вывод о наличии магниточувствительной стадии переноса энергии возбуждения в светособирающей антенне - деления синглетного возбуждения на два триплетных, протекающего с участием молекул каротиноидов. Стадия переноса энергии с каротиноидов на бактериохлорофилл -это, вероятно, единственная стадия нормально функционирующего фотосинтеза, на которой происходит эффективное

заселение триплетных состояний пигментов, сопровождаемое значительными потерями энергии.

При понижении температуры образца ниже 100 К влияние магнитного поля на флуоресценцию образцов с восстановленным Од начинает проявляться снова, но уя;е за счет изменения стационарной концентрации триплетных состояний первичного донора. Этот эффект оказался удобные для проверки выполнимости соотношения Вреденберга-Дайзенса (т.е. зависимости выхода флуоресценции от долк РЦ, находящихся в закрытом состоянии) при низких температурах {5 К) . В разделе 3.4 'сообщается о результатах таких экспериментов. Магнитное поле в этих условиям уменьшает выход флуоресценции (рис. Зв), снижая долк РЦ, находящихся в закрытом состоянии вследствие образования 3Р. Изучение зависимости величины эффекта от интенсивности возбуждающего света подтвердило соблюдение соотношения Вреденберга-Дайзенса для РЦ, закрытых образованием триплета первичного донора.

ГЛАВА 4. ЭПР - СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРВИЧНОЙ РАДИКАЛЬНОЙ ПАРЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА.

Первичная радикальная пара [Р+1~] - это первый относительно стабильный продукт реакции фотопереноса электрона в РЦ. Оптические измерения однозначно демонстрируют образование состояния с электроном, перенесенным с первичного донора на промежуточный акцептор, однако они не дают информации о взаимодействиях между двумя парамагнитными молекулами в этом состоянии. Измерения магнитных эффектов - это лишь косвенный метод исследования РП1, не обеспечивающий получения надежных сведений о таких взаимодействиях. Следует отметить, чтс взаимодействия между участниками реакции переноса электрона, особенно дипольное магнитное Б и обменное Л -определяют механизм этой фотореакции и ее свойства. Поэтому неудивительно, что в течение ряда лет многими лабораториями мира предпринимались усилия для прямой регистрации РП1 с использованием магнитного резонанса. Относительным успехом увенчались измерения лабораторий Дж. Норриса (Норрис 1982) и А. Хоффа (Хантер 1987, Лерш 1989) с применением метода РИДМР. Однако и в этом случае для извлечения из экспериментальных данных полезной информации необходимо применять достаточно сложную модель, к тому же нечувствительную к знаку обменного взаимодействия. Кроме того, применяемые в РИДМР

высокие уровни мощности СВЧ приводят к уширению регистрируемых сигналов и потере части информации. Все попытки обнаружения

сигналов РП1 методами ЭПР с разрешением по времени к успеху не привели.

В Гл. 4 описываются первые результативные измерения РП1 методом флеш-ЭПР. Измерения проводили на препаратах реакционных центров ЯЬ.эрЬаегох с?еэ К26 и ЯрБ. уЛт^сИэ . При нормально функционирующем фотосинтезе Рис.4.Центральные 25 мТл спек-время жизни РП1 слишком тра эпр зр> измеренные с раз-коротко (-200 пс) для ными задержками после вспышки протекания Э-Т конвер- света, Т=70К. РЦ ЛЬ.врЬаег.И26. сии и ЭПР-регистрации.

Поэтому электронный перенос в препаратах прерывали либо восстановлением, либо удалением 0А. При регистрации парамагнитных продуктов, индуцированных короткой вспышкой света, с небольшими (30 - 200 не) задержками после вспышки в области д=2 обнаружены новые спин-поляризованные сигналы ЭПР. Эти сигналы исчезают параллельно нарастанию известных линий, принадлежащих 3Р (рис. 4) . Подобные кинетические свойства указывают на то, что обнаруженные сигналы принадлежат предшественнику триплетного состояния, т.е. РП1.

Наибольший интерес представляет информация о магнитных взаимодействиях между партнерами РП1. Для ее получения было предпринято математическое моделирование обнаруженных сигналов в рамках теории спин-коррелированных радикальных пар. В процессе моделирования выяснилось, что хорошего соответствия между экспериментом и расчетом можно достичь только при ширинах линий ЭПР отдельных радикалов, намного превышающих известные стационарные значения указанных параметров. Этот результат обусловлен коротким временем жизни изучаемых сигналов (временное уширение). Результаты мо-

-1-1-1-1-г^

320 325 330 335 340 345

делирования линии при д=2 для РЦ из Rb.sphaeroides R26 приведены на рис. 5. Экспериментальный спектр был получен вычитанием из суммарного (3Р+РП1) сигнала вклада триплетного состояния, измеренного при больших задержках, когда линия д=2 отсутствует. Хорошее соответствие экспериментального и расчетного спектров - еще одно подтверждение принадлежности нового короткоживущего сигнала

Рис.5.РП1 в РЦ Rb.sphaer.c первичной радикальной паре, восстановленным qa, Т=70К. в Табл. 1 приведены параметры моделирования ЭПР сигналов РП1. Как и в случае магнитных эффектов, обращает на себя внимание тот факт, что время рекомбинации т

Таблица 1

J, мТл D, мТл ДВ (D+) , мТл AB(I"), мТл T, HC

Rb.sphaer. R26 -0,9±0,1 -3,0+1,5 3,6±0,2 3,8±0,2 1,5

Rps.vir. -1,7±0,1 -3,0±0,5 2,2±0,2 2,4±0,2 2,4

имеет существенно меньшую величину, чем дают оптические измерения (Парсон 1975). Это объясняется тем, что оптика нечувствительна к спиновому состоянию РП, в то время как метод ЭПР регистрирует только триплетные РП. Время жизни РП, определяемое из спектров ЭПР и влияющее на форму кривых магнитного эффекта в основном зависит от кт, а оптическое время жизни определяется также величинами ks и и (см. рис. 2) . Расхождение оптических и ЭПР данных можно объяснить лишь при условии kT » ks, ш. Эти условия действительно выполняются (Фольк 1995).

Основываясь на теории неадиабатического переноса электрона (Биксон и Йортнер 1991,1993,1995) из полученных значений магнитных взаимодействий можно сделать вывод, что состояние Р+В" расположено ниже по энергии чем *Р* (В - мономерный бактериохлорофилл РЦ) и в РЦ Rb.sphaeroides и Rps.viridis, следовательно, реализуется последовательный перенос электрона Р—>В-»1.

ГЛАВА 5. ТРИПЛЕТНЫЕ СОСТОЯНИЯ ПИГМЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА.

Спиновая поляризация сигналов ЭПР триплетных состояний существенно увеличивает их интенсивность, особенно в случае триплета первичного донора (спектр ЭПР первичного донора бактериальных РЦ выглядит качественно так же, как спектр на рис. 1в). Поэтому методом флеш-ЭПР, регистрируя парамагнитные состояния еще до прохождения спин-решеточной релаксации, можно записывать спектры триплетов с высоким отношением сигнал/шум без значительных затрат времени на синхронное накопление. Это преимущество было использовано нами для исследования триплетных состояний в препаратах фо-тосинтезирующих бактерий.

В разделе 5.1 описываются результаты измерений ЭПР на хроматофорах и РЦ Rb.sphaeroides, мутанта R26 и ка-ротиноид-содержащего штамма. К моменту начала этой работы Шуваловым и Парсоном (Шувалов 1981) на основе данных оптических измерений было высказано предположение, что 3Р смешан с состоянием 3[Р+В~], которое выше триплета по энергии всего на 0,03 эВ. Это означает, что при комнатной температуре должна наблюдаться значительная примесь состояния 3[Р+В~] . Поскольку неспаренные электроны в таком состоянии с переносом заряда находятся на разных молекулах, то в среднем они будут слабее взаимодействовать друг с другом. Это Рис. б. D(T) в РЦ Bb.sphaer. должно проявляться в умень- R26 с Удаленным Од. шении параметров РНП при

повышении температуры. Измеренная нами на РЦ с восстановленным Qa температурная зависимость оказалась иной. Параметр D возрастает (рис. 6), а параметр Е почти не изменяется при повышении температуры. Аналогичные температурные зависимости были получены на мембранных РЦ-содержащих препаратах - хроматофорах. Следовательно, температурные зависимости РНП не являются артефактом

выделения РЦ. Нами высказано предположение, что они обусловлены процессом термоактивированного Т-Т переноса энергии с Р на мономерный бактериохлорофилл В. В каро-тиноид-содержащих штаммах такой процесс может служить промежуточной стадией переноса энергии 3Р на каротиноид с последующей ее быстрой диссипацией. Последующие рент-геноструктурные работы Фехера с сотр. (Иейтс 1988) показали, что молекула каротиноида действительно лежит в непосредственной близости от мономерного бактериохло-рофилла неактивной цепи пигментных кофакторов РЦ. Франком с сотр. (Франк 1993) обнаружено, что Т-Т перенос на каротиноид прекращается в модифицированных РЦ, где В замещен на пигмент с более высоким энергетическим положением триплетного уровня. В функциональном отношении описываемый Т-Т перенос служит целям фотопротекции РЦ, уменьшая вероятность образования синглетного кислорода в результате Т-Т переноса с 3Р на молекулу Ог.

Метод ЭПР не позволяет получать информацию о распределении свойста исследуемых триплетных состояний. Метод ДЦМР, напротив, характеризуется высокой селективностью в силу чрезвычайно узкой полосы СВЧ возбуждения, а также вследствие избирательности оптической регистрации сигналов. Результатам АДМР-измерений РЦ Rb.sphaeroides R26 при 7 К посвящен раздел 5.2. На рис. 7 представлены спектры MIA триплетного состояния первичного донора реакционных центров при возбуждении в пределах СВЧ перехода ID|+|Е|. Гетерогенность популяции 3Р проявляется в том, что, как видно из рисунка , при изменении частоты СВЧ возбуждения в сторону меньших значений пик выцветания ИК полосы первичного донора сдвигается в длинноволновую область. Для выявления связи между оптическими свойствами субпопуляций Р и их РНП нами были изучены

Рис.7. Спектр MIA РЦ Rb.sphaer. R26 с восстановленным QA. Т=7К.

спектры двойного АДМР (при одновременном возбуждении резонанса в |D|+|E| и |D|-IЕ | переходах) в зависимости от длины волны регистрации. Результаты измерений приведены на рис. 8. Эти данные можно объяснить в рамках модели распределения димеров первичного донора по величине экситонного взаимодействия. Увеличение экситонного взаимодействия приводит к сдвигу Q(y~' полосы поглощения Р в длинноволновую Рис.8. D(Т),Е(Т) Rb.sphaer. область и одновременно к с восстановленным QÄ, Т=7К. более равномерному распределению спиновой плотности по димеру с возрастанием примеси состояния с переносом заряда (Pmpl ) • вызывающих уменьшение параметров РНП. В приближении точечных диполей можно оценить разброс межмолекулярных расстояний в димере, описывающий наблюдаемое распределение свойств Р, в ±0,2 А. Возможность распределения свойств реакционных центров необходимо учитывать при интерпретации экспериментальных данных и построении теоретических моделей.

Раздел 5.3 посвящен ЭПР-исследованию температурной зависимости спектра 3Р в реакционных центрах Rps. viridis. Ранее с использованием традиционного метода ЭПР с модуляцией интенсивности света (Схаафсма 1986) было обнаружено, что при Т > 20 К обычная картина спиновой поляризации 3Р (АЕЕААЕ) изменяется на АЕАЕАЕ. Для объяснения этого феномена была создана теория спиновой эволюции в трехспиновой системе (Хор 1988) . Было известно (Окамура 1979), что магнитные взаимодействия между первичным и промежуточным акцепторами в РЦ Rps.viridis гораздо сильнее, чем у Rb. sphaeroides. Теория П. Хора описывает коррелированное поведение спинов двух неспаренных электронов РП1 и эффективного спина 1/2 0АЕе2+-акцептора с очень резко возрастающей при Т > 10 К скоростью спин-решеточной релаксации. Наблюдаемая температурная зависимость связана с редркс-состоянием первичного акцептора. Если QA перевести в непарамагнитное дважды восстановленное состояние, то

/320

330

340

350

Рис.9. Температурная зависимость спектра 2Р в РЦ Rpa.viridis с восстановленным Од.

температурная зависимость спектра 3Р становится подобна той, которая наблюдается для ЛЬ. sphaeroides.

Известно, что измерения с модуляцией света могут приводить к искажениям формы спектра, зависящим от частоты модуляции и интенсивности света. Нами были проведены исследования 3Р Rps.viridis методом

флеш-ЭПР. Удалось показать , что в использованиих экспериментальных условиях при т • = 25 К исчезают центральные Х-пики, а при 60 К - Z-пики спектра ЭПР (рис. 9). Изменение знака спиновой поляризации не обнаружено. Было сделано предположение, что такая температурная зависимость объясняется влиянием релаксатора - Q^Fe2+ -имеющим анизотропный характер вследствие фиксированной взаимной ориентации 3Р и первичного акцептора. Действительно, прямые измерения продемонстрировали значительно более резкую температурную зависимость релаксации Z- и Х-пиков триплета Rps.viridis, чем Rb.sphaeroides R26. Релаксация происходит, по-видимому, также и в РП1 -предшественнике 3Р.

В разделе 5.4 сообщается о применении ЭПР спектроскопии триплетного состояния к исследованию РЦ Rb.sphaeroides R26 с химически модифицированным пигментным составом. В данном случае бактериофеофитин а был замещен на растительный пигмент феофитин а, что заметно изменило кинетические свойства РП1. Такие замещения используются для изучения структурно-функциональных свойств реакционных центров. Процедура замещения пигментов включает стадию достаточно жесткого воздействия на РЦ (1,5-часовая инкубация при 42°С) . Необходимо было убедиться, что РЦ, помимо замещения пигментов, не претерпевает значительных изменений. Поскольку параметры РНП чувствительны к взаимодействию неспаренных электронов и, следовательно, к изменению

структуры Р, то ЭПР три-плетного состояния может применяться для решения подобных задач. Измерения флеш-ЭПР показали, что параметры D и Е и картина спиновой поляризации спектра 3Р не изменяются при модификации. Это означает, что структура первичного донора,* а также взаимодействия в РП1 в результате модификации существенно не изменяются. Прямая регистрация РП1 в модифицированных РЦ (Кленина 1996), а Рис.10. Спектры ЭПР кароти-также недавние (Мейер 1996) ноид-содержащего штамма Rb. данные лаборатории X. Шира sphaeroides. (которым был предложен метод химической модификации РЦ) подтвердили эти выводы.

Раздал 5.5 касается процессов с участием триплетных состояний вспомогательных фотосинтетических пигментов -каротиноидов. Приводятся результаты измерений флеш-ЭПР 3Кар, образующихся в результате Т-Т переноса энергии в РЦ каротиноид-содержащего штамма Rb.sphaeroides и процесса деления синглетного' возбуждения в светособирающей антенне. В первом случае установлено, что при переносе энергии в условиях ЭПР-эксперимента сохраняется проекция спина на внешнее магнитное поле. Таким образом •избирательно заселяется Т0-подуровень 3Кар, и его спектр (рис. 10) демонстрирует спин-поляризацию типа ЕААЕЕА (вследствие D < 0 картина поляризации 3Кар по сравнению с 3Р инвертирована). Перенос энергии имеет резкую температурную зависимость и практически прекращается при Т < 40 К. Подобная температурная зависимость подтверждает существование в РЦ промежуточной стадии Т-Т переноса энергии на каротиноид - заселение триплета мономерного бактериохлорофилла, лежащего выше 3Р по энергии.

Деление синглетного возбуждения каротиноида на два триплетных впервые отмечено при наблюдении эффекта магнитного поля (Радемакер 1980, Елфимов 1982). Регистрация спектра ЭПР спин-поляризованного состояния, возникающего при возбуждении в полосу поглощения каротиноида - это первое прямое наблюдение такого рода. Измерения проводились на препаратах Rps .palustris, содержащих

светособирающую антенну. Параметры РНП указывают на то, что наблюдаются триплеты молекул каротиноидов. Спиновую поляризацию (ЕАЕАЕА) можно считать характерной для триплетного состояния, заселяемого в процессе S Т + Т.

ГЛАВА 6. ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС ТРИ-ПЛЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ ХЛОРОФИЛЛА IN VITRO И В РЦ-КОМПЛЕКСЕ ФОТОСИСТЕМЫ II ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ.

Первичный донор фотосистемы II Р680 демонстрирует необычные спектроскопические и окислительно-восстановительные свойства. Некоторые оптические свойства Р680 указывают на его димерную структуру .(ван Кан 1990, Браун 1990). С другой стороны, редокс и ЭПР-свойства Р680+ напоминают свойства хлорофилла а в растворе . Триплетное состояние первичного донора при регистрации ЭПР имеет очень резкую температурную зависимость . Согласно литературным данным, его наблюдение возможно лишь при Т < 30 К (Франк 1989, Сеарль 1DD0). В то же время при оптической регистрации отмечено, что квантовый выход 3Р680 в интервале температур 4 - 290 К падает лишь от 0,8 до 0,3 (Хроот 94). При изучении ориентации магнитных осей 3Р680 относительно плоскости фотосинтетической мембраны (ван Михем 1991) был сделан вывод, что z-ось составляет с этой плоскостью угол 60°, в то время как соответствующий угол в бактериальных РЦ близок к 0е. Для объяснения результата было сделано предположение, что сразу после заселения 3Р680 происходит быстрый перенос триплета на молекулу мономерного хлорофилла, хотя никаких иных подтверждений такого про-' цесса не существовало. Эти и другие противоречия вызвали необходимость более тщательного исследования свойств P68t) и сравнения их с мономерным Хл в растворе.

Раздел 6.1 посвящен изучению 3Хл а в твердых растворах методом флеш-ЭПР. Из литературы известно (Тернауэр 1977), что параметры РНП хлорофилла зависят от растворителя, однако систематических исследований такой зависимости не проводилось. Нами изучены свойства Хл, растворенного в некоторых алифатических спиртах. Оказалось, что D увеличивается при росте диэлектрической постоянной окружения, и при е, изменяющемся от 2,5 до 33, варьирует от 0,0279 до 0,0290 см"1. Таким образом, РНП мономерного хлорофилла в некоторых растворителях может принимать значения, характерные для 3Р680 (0,0288 см"1). Это указывает на возможность локализации

триплетного состояния первичного донора фотосистемы II на одной молекуле хлорофилла, в отличие от соответствующего триплета в бактериальных РЦ.

В разделе 6.2 описываются результаты изучения температурной зависимости релаксационных свойств 3Хл а и 3Р680 методом спин-эхо. Эксперименты проводили на РЦ-содержащих Dl-D2-cyt Ь559 комплексах фотосистемы II. Поскольку в У- рис.11.Температурные зависимо-и Х-канонических пиках сти констант скоростей рел.а-спектра ЭПР триплетов ксации (точки) и дезактивации имеется существенное пе- 3Р680 (линия). рекрывание за счет

различных молекулярных ориентаций, все измерения проведены в 1г-пиках. На рис. 11 приведены результаты измерений, построенные в Аррениусовских координатах. При низких температурах исчезновение сигнала Р680 определяется его физической дезактивацией (кинетики ЭПР совпадают с оптическими). Однако в области Т > 15 К, т.е. в том температурном диапазоне, где ранее было отмечено исчезновение сигнала ЭПР, происходит резкое нарастание скорости спин-решеточной релаксации. При Т > 25 К зависимость константы скорости релаксации от температуры приобретает экспоненциальный характер (см. врезку в рис. 11), что указывает на термоактивируемый (Орбаховский) механизм процесса. Интересно отметить, что соответствующие температурные зависимости, измеренные для Хл а в растворе и 3Р реакционных центров ЯЬ. зрИаего1с!ез И26 имеют степенной характер, указывающий на механизм прямой релаксации с эффектом узкого фононного горла. Данные по спин-решеточной релаксации свидетельствуют в пользу пентакоординированного состояния центрального иона Мд2+ в хлорофилле Р680. На основе полученных результатов делается вывод, что неудачи предыдущих попыток регистрации спектров ЭПР Р680 при Т > 30 К связаны с ускорением релаксации спин-поляризован-ного состояния.

Даже при столь резкой температурной зависимости регистрация спектров 3Р680 в широком диапазоне температур возможна при условии использования ЭПР с временным разрешением. При получении спектральной информации метод спин-эхо обладает рядом недостатков. Он чувствителен к спин-спиновой релаксации, приводящей к существенному падению сигналов при повышении температуры. Другой серьезный недостаток искажение спектров вследствие различия модуляции огибающей спин-эхо для отдельных канонических пиков триплетного сигнала ЭПР. По этим причинам измерения температурных зависимостей спектров ЭПР 3Р680, описанные в разделе 6.3, проведены методом флеш-ЭПР. При регистрации сигналов в течение 1 мке сразу после вспышки света спектры ЭПР удалось наблюдать вплоть до 230 К (температура плавления образца, содержащего 60% глицерина). Температурная зависимость формы спектра (рис. 12) качественно напоминает таковую у бактериальных препаратов Rps.viridis. Однако, поскольку Dl-D2-cyt Ь559 комплексы не содержат первичный акцептор, механизм такой зависимости должен быть иным. В настоящее время надежная модель, объясняющая трансформацию спектра 3Р680 при изменении температуры, отсутствует. Параметры РНП при повышении температуры немного падают: |D| от 0,0290 до 0,0284 см"1 и |Е| от 0,0043 до 0,0038 см"1 в интервале температур 6 - 190 К.

В разделе 6.4 приводятся результаты исследования 3Р680 методом магнитофотоселекции. Целью этой работы являлось определение знаков параметров РНП. Измерения МФС на Dl-D2-cyt Ь559 комплексах осложнены сильным перекрыванием полос поглощения входящих в их состав пигментов, в то время как необходимо исключить перенос энергии на Р680 (т.е. обеспечить его прямое возбужде-

Рис.12.Температурная зависимость спектра ЭПР 3Р680.

ние). Мы применили подход, в котором МФС последовательно измеряется при узкополосном возбуждении на нескольких длинах волн в пределах длинноволновой полосы поглощения. Вспомогательные хлорофиллы Dl-D2-cyt Ь559 поглощают свет более коротких длин волн, чем Р680. Поэтому предполагалось, что при сдвиге в длинноволновую область условия прямого возбуждения будут выполняться все точнее, и определяемые из данных по МФС углы будут асимптотически приближаться к величинам, характеризующим Р680. Действительно, бьшо обнаружено, что МФС сильно зависит от длины волны возбуждения. Однако такой подход не устранял возможности переноса энергии с молекул феофитина а, входящих в состав РЦ фотосистемы II и очень сильно перекрывающихся по спектру поглощения с Р680. Когда исследование находилось на этой стадии, появились и стали накапливаться данные о том, что при Т ~ 4 К перенос энергии с феофитинов на Р680 прекращается (Ква 1994, Фолькер 1995). Наши измерения МФС проведены при б К, т.е. при достаточно низких для эффективного торможения переноса энергии температурах. Таким образом, были получены значения углов между магнитными осями 3Р680 и его оптической осью дипольного момента перехода 0у. В обозначениях рис. 1, <р 1,6 = 90°; ф2,5 ^ 30°; фз,4 £ 55°. Это означает, что магнитная ось, соответствующая каноническим компонентам (2,5), лежит ближе (или вдоль) 0у, а (3,4) - ближе к 0Х. В соответствии с принятым в данной работе условием, линии (2,5) можно обозначить как У-канонические, а линии (3,4) - как X-канонические. Компоненты (1,6) можно было сразу отнести к г-канонической ориентации молекул, и из картины спин-поляризации этих компонент определить Б > 0. Таким образом, порядок следования канонических компонент в спектре ЭПР 3Р680 имеет вид г-У-Х-Х-У-г, что (при положительном Э) означает, что Е также положительно. Уместно отметить, что те же знаки Б и Е и порядок следования канонических компонент были установлены в случае бактериальных реакционных центров [Франк 1979, Троспер 1982] . Отметим также, что принятый до настоящего времени порядок следования канонических компонент для 3Р680, г-Х-У-У-Х-г, соответствует знакам Р>0, Е<0.

В разделе 6.5 обсуждается, какие выводы о структурной организации Р680 можно сделать на основе полученных данных. Результаты МФС показывают, что по сравнению с 3Хл а магнитные у- и х-оси 3Р680 повернуты

Плоскость мембраны

Рис.13. Структурная модель Р680.

на 10-20° вокруг оси 5. Рассматриваются четыре модели структурной организации Р680, которые могли бы объяснить наблюдаемый поворот осей: 1) Р680 это мономер Хл а, все отличия свойств которого от хлорофилла в растворе объясняются влиянием белкового окружения; 2) Р680 это димер Хл а, и триплетное состояние делокализовано по обеим молекулам; 3) после первоначального заселения триплета димера происходит быстрый Т-Т перенос энергии на мономер хлорофилла и 4) Р680 поглощает свет как димер со слабым экситонным взаимодействием, а при заселении триплетного состояния взаимодействие между мономерными половинами разрушается, и триплетное состояние локализуется на одной из молекул Хл а, входящих в его состав. Делается вывод, что наиболее вероятна гипотеза (4) . В ее рамках предпринята попытка построения структурной модели первичного донора фотосистемы II. При этом сделано предположение что, как и в случае бактериальных РЦ, имеется Сг-симметрия с осью симметрии, перпендикулярной плоскости мембраны. На рис. 13 представлена модель Р680, которая согласуется со всеми имеющимися на настоящее время спектроскопическими данными. В этой модели плоскости тетрапирролов составляют угол в 60°, а межцентровое расстояние, оцененное в при-, ближении точечных диполей, равно 11 А.

Данные по температурной зависимости скорости спин-решеточной релаксации также хорошо объясняются в рамках предложенной структуры Р680, если предположить, что при Т < 15 К триплет локализуется на одной из половин димера, а при повышении температуры возникают перескоки возбуждения между половинами димера. Такие перескоки вызывают изменение ориентации магнитных осей и по сути эквивалентны процессу вращательной релаксации триплетного состояния. Термоактивируемый Т-Т перенос энергии между половинами димера объясняет и Орбаховский характер температурной зависимости релаксации. Слабое падение параметров РНП с повышением температуры находит объяснение, если принять модель медленных (£ь0р < 10-100 МГц) перескоков триплета. Энергетический зазор между

триплетными уровнями двух половин димера (по порядку составляющий 100 см"1) отнесен к различному взаимодействию половин димера с полипептидным окружением.

Итак, полученные результаты и литературные данные с достаточной степенью достоверности указывают на ди-мерную организацию Р680, так же как и первичных доноров бактериальных РЦ и фотосистемы I. Можно сделать вывод, что димерная структура первичного донора является универсальной особенностью РЦ. Диссертационная работа завершается обсуждением функционального значения димер-ности первичного донора. По-видимому, такая структура позволяет добиваться компромисса между его оптическими и окислительно-восстановительными свойствами. В применении к фотосистеме II это означает, что экситонное расщепление спектра поглощения Р680 обеспечивает длинноволновый сдвиг, необходимый для осуществления переноса энергии со вспомогательных пигментов на первичный донор. С другой стороны, разрушение экситонного взаимодействия при заселении триплетного состояния или окислении Р680 определяет возможность достижения высокого окислительного потенциала, необходимого для отрыва электрона от воды и характерного для мономерных форм хлорофилла.

В заключении обсуждаются основные научные результаты работы.

ВЫВОДЫ

1.Разработаны экспериментальные методики для исследования триплетных состояний фотосинтетических пигментов: метод модуляции выхода флуоресценции магнитным полем, метод флеш-ЭПР прямого детектирования сигнала, модуляционный метод измерения магнитофотоселекции. 2.Обнаружен эффект магнитного поля на выход флуоресценции РЦ-содержащих препаратов с восстановленным первичным акцептором. Эффект приписан влиянию магнитного поля на синглет-триплетную конверсию первичных радикальных пар РЦ. Сделан вывод о существовании флуоресцентного канала рекомбинации радикальных пар. Оценена величина обменного взаимодействия между их компонентами.

3.Проведена прямая регистрация первичных радикальных пар методом флеш-ЭПР. Математическое моделирование формы спектра позволило определить величины и знаки обменного и дипольного взаимодействий м^жду двумя радикалами пары. Значения этих параметров указывают на

реализацию в бактериальных РЦ последовательного фотопереноса электрона между пигментными кофакторами.

4.Методом флеш-ЭПР исследованы спектры триплетных состояний первичного донора электрона в бактериальных РЦ в широком температурном диапазоне, от температуры жидкого гелия до комнатной. Температурные зависимости, обнаруженные в случае Rb.sphaeroides R26, интерпретированы как результат Т-Т переноса энергии на мономерный бактериохлорофилл РЦ - первой стадии переноса энергии на молекулу каротиноида. Температурная зависимость, зарегистрированная для Rps.viridis, объяснена эффектом релаксатора - комплекса первичного акцептора электрона РЦ.

5.Методом АДМР было обнаружено распределение свойств триплетного состояния первичного донора РЦ Rb. sphaeroides R26, проявляющееся в вариации значений параметров РНП и положения максимума длинноволновой полосы поглощения. Сделан вывод о наличии в образцах набора конфигураций димера первичного донора, различающихся величиной экситонного взаимодействия.

6.Химическая модификация РЦ Rb.sphaeroides R26, заключающаяся в замещении обеих молекул мономерного бактериофеофитина на феофитин а, не приводит к существенному искажению структуры первичного донора или к резкому изменению свойств первичной радикальной пары. Таким образом, подобные модификации представляют собой контролируемое воздействие на РЦ и могут применяться в исследованиях соотношения между структурой и свойствами РЦ.

7.Параметры РНП триплетного состояния хлорофилла a in vitro зависят от свойств растворителя и изменяются в широких пределах, принимая значения, характерные для 3Р680 в РЦ фотосистемы II.

8.Спин-решеточная релаксация 3Р680 резко ускоряется в интервале температур 15 - 30 К. Такая температурная зависимость определяет невозможность регистрации триплета Р680 стандартным методом ЭПР при Т > 30 К.

9.Впервые проведенные измерения магнитофотоселекции 3Р680 позволили определить его знаки РНП: D > 0, Е > 0. Знак параметра Е отличается от знака этого параметра у мономерного хлорофилла a in vitro, что связано с поворотом магнитных осей х и у относительно оси z на 10 - 20°.

10.Предложена структурная модель первичного донора фотосистемы II, в которой Р680 представляет из себя Сг~

симметричный димер молекул хлорофилла со слабым экси-тонным взаимодействием. Межцентровое расстояние в димере оценено в 11 А. При поглощении света Р680 проявляет свойства димера, но при заселении триплетного состояния экситонное взаимодействие разрушается, и триплетное возбуждение при низкой температуре локализуется на одной из половин димера. При повышении температуры происходит Т-Т перенос между компонентами димера. Предложенная модель согласуется с известными и вновь открытыми свойствами Р680:

литературными данными по линейному дихроизму Р680;

- литературными данными по ориентации магнитных осей 3Р680 по отношению к плоскости фотосинтетической мембраны;

- данными по температурной зависимости скорости спиновой релаксации, полученными в настоящей работе;

- результатам^ измерений магнитофотоселекции 3Р680;

- высоким значением редокс-потенциала Р680.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1.Возняк В.М., Елфимов Е.И., Проскуряков И.И. Влияние магнитного поля на рекомбинационную флуоресценцию ряда фотосинтезирующих бактерий // Доклады АН СССР, 1978, Т.242, №5, С.1200-1203

2.Возняк В.М., Елфимов Е.И., Проскуряков И.И. Влияние магнитного поля на флуоресценцию ряда фотосинтезирующих бактерий // Тезисы XXVI Всес. совещания по люминесценции. Самарканд, 1979, С.27

3.Елфимов Е.И., Казанцев А.П., Проскуряков И. И. Автоматизированная система регистрации изменений выхода флуоресценции, вызываемых наложением магнитного поля II Журн. прикл. спектроскопии, 1980,Т.33,№3,С.439-443

4.Возняк В.М., Елфимов Е.И., Проскуряков И.И. Влияние магнитного поля на флуоресценцию ряда фотосинтезирующих бактерий // Журн. прикл. спектроскопии, 1980, Т.32, №5, С.865-868

5.Казанцев A.n., Проскуряков И.И. Автоматизированное рабочее место исследователя в экспериментах по регистрации быстропротекающих процессов на флеш-ЭПР-спектрометре // Использование вычислительных машин в спектроскопии молекул и химических исследованиях / Тез. докл. V Всес. конф. Новосибирск, 1980, С.224

6.Proskuryakov 1.1., Elfimov E.I., Voznyak V.M. Magnetic field-induced changes of fluorescence yield of Rhodopseudomonas sphaeroides at 5 K. Does the Vreden-berg-Duysens relationship hold for reaction centers closed by the formation of a triplet state? // Studia biophys., 1981, V.84, №2, P.125-132

7.Возняк B.M., Елфимов Е.И., Проскуряков И. И. Влияние магнитного поля на первичные процессы фотосинтеза // Поляризация электронов и ядер и магнитные эффекты в химических реакциях / Тез. III Всес. конф. Новосибирск, 1981, С.94-95

8.Возняк В.М., Елфимов Е.И., Проскуряков И.И. Применение метода магнитной модуляции флуоресценции для изучения первичных процессов фотосинтеза // Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение / Тез. докл. Всес. совещания 4.2. Рига, 1981, С.111-112

9.Возняк В.М., Елфимов Е.И., Проскуряков И. И. Влияние магнитного поля на первичные процессы фотосинтеза // Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии / Тез. докл. симп. специалистов стран-членов СЭВ. Пущино, 1981, С.14

Ю.Казанцев А.П., Проскуряков И.И., Пронин Л.А., Возняк В.М. Импульсный спектрометр парамагнитного резонанса для исследования явления электронной спиновой поляризации // Журн. физ. химии, 1984, Т.58, №4, С.1028-1030

11.Hoff A.J., Proskuryakov I.I. Triplet EPR spectra of the primary electron donor in bacterial photosynthesis at temperatures between 15 and 296 К ,// Chem. Phys. Lett., 1985, V.115, №3, P.303-310

12.Prpskuryakov I.I., Manikowski H. Zaleznost tempera-turowa stanu trypletowego bacteriochlorofilu mierzona metoda EPR w chromatoforach purpurowych bakterii // Abstr. VI Zjazd Polskiego Towarz. Biofizycznego. Szczecin, 1986, P.105-106

13.Проскуряков И.И., Маниковски X. Температурная зависимость спектра ЭПР триплетного состояния бактериохлорофилла реакционных центров фототрофной бактерии Rhodobacter sphaeroides R26 I ! Доклады АН СССР, 1987, Т.297, №5, С.1250-1252

14.Borisov A.Yu., Proskuryakov I.I. The efficiency of energy migration and trapping in bacterial photosynthesis // Laser picosecond spectroscopy and

photochemistry of biomolecules / V.S. Letokhov, ed., Bristol: Adam Hilger, 1987, 307 p.

15.Борисов А.Ю., Проскуряков И.И. Эффективность миграции энергии и ее захвата при бактериальном фотосинтезе // Лазерная пикосекундная спектроскопия и фотохимия биомолекул /под ред. В.С.Летохова,. М.:Наука, 1987,252с.

16.Proskuryakov I.I. ESR spectroscopy of pigment spin-polarized triplet states in photosynthesis // Abstr. IX AMPERE summer school. Novosibirsk, 1987, P.45

17.Проскуряков И.И., Шкуропатов А.Я., Возняк В.М., Шувалов В.А. О свойствах триплетного состояния реакционных центров Rhodopseudomonas viridis II Биофизика, 1988, Т.33, »5, С.877-879

18.0рлинский Д.В., Проскуряков И. И. К вопросу об аномальной температурной зависимости спектра ЭПР реакционных центров R.viridis в триплетном состоянии // Биофизика, 1989, Т.34, №2, С.324-325

19.Проскуряков И.И. Свойства триплетных состояний пигментов фотосинтетических организмов по данным электронного парамагнитного резонанса // Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и моделях / Тез. Всес. конф. Пущино, 1989, С.101-102

20.Proskuryakov I.I. Triplet state ESR spectroscopy of photosynthetic pigments // Abstr. Russian-USA workshop on photosynthesis. Pushchino, 1992, P.27-28

21.Manikowski H., Proskuryakov I.I. Triplet state of bacteriochlorophyll in reaction centers of photosynthetic bacteria // Curr. Topics in Biophys., 1993, V.16, №2, P.68-71

22.Шкуропатов А.Я., Проскуряков И.И., Шкуропатова В.А., Зверева М.Г., Шувалов В.А. Перенос электрона в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R-26 с химически модифицированным пигментным составом // Доклады АН, 1993, Т.331, »6, С.769-772

23.Shkuropatov A.Ya., Proskuryakov 1.1., Shkuropatova V.A., Zvereva M.G., Shuvalov V.A. Formation of charge separated state P+QA" and triplet state 3P at low temperature in Rhodobacter sphaeroides (R-26) reaction centers in which bacteriopheophytin a is replaced by plant pheophytin a//FEBS Lett.,1994,V.351,№2,P.249-252

24.Bosch M.K., Proskuryakov I.I., Gast P., Hoff A.J. Relative orientation of the optical transition dipole and the triplet axes of the photosystem II primary donor. A magnetophotoselection study // J. Phys. Chem., 1995, V.99, »41, P.15310-15316

25.Bosch M.K., Proskuryakov 1.1., Hoff A.J. Magnetopho-toselection and triplet EPR spectroscopy of the Dl/D2/Cyt b559 complex of photosystem II // Abstr. ESi workshop on Dl/D2/Cytb559 complex, Wye, UK, 1995, P.22

26.Bosch M.K., Proskuryakov I.I., Gast P., Hoff A.J. Time-resolved EPR study of the primary donor triplet in Dl-D2-cyt b559 complexes of photosystem II: temperature dependence of spin-lattice relaxation //. J. Phys. Chem., 1996, V.100, »6, P.2384-2390

27.Кленина И.В., Проскуряков И.И., Шкуропатов А.Я., Хофф А.Я., Шувалов В.А. Сигнал ЭПР первичной радикальной пары [Р+1"] в необработанных и феофитинзамещенньк реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R26 с восстановленным первичным акцептором // Доклады АН, 1996, Т.347, »2, С.259-263

28.Proskuryakov I.I., Klenina I.В., Ноге P.J., Bosch М.К., Gast P., Hoff A.J. Electron paramagnetic resonance of the primary radical pair [D+<J>a"] in reaction centers of photosynthetic bacteria // Chem. Phys. Lett., 1996, V.257, №3, P.333-339

29.Проскуряков И.И. Исследование первичного донора фотосистемы 2 высших растений методом ЭПР // Биоэнергетика фотосинтеза / Тез. Межд. конф. Пущино, 1996, С.13

30.Кленина И.Б., Проскуряков И. И. Спин-поляризованный сигнал ЭПР первичной радикальной пары в бактериальных фотосинтетических реакционных центрах: наблюдение и моделирование // Биоэнергетика фотосинтеза / Тез. Межд. конф. Пущино, 1996, С.33

31.Proskuryakov I.I. Magnetic resonance of transient intermediates in reaction center photochemistry // Progress in Biophys.S Mol.Biol.,1996,V.65 suppl.l,P.13

32.Hore P.J., Till U., Proskuryakov I.I., Klenina I.В., Bosch M.K., Gast P., Hoff A.J. EPR of the spin-polarized primary radical pair in photosynthetic bacteria // Magnetic field and spin effects in chemistry and related phenomena / Abstr. IV Internatl. Symp. Novosibirsk, 1996, P.70-71.

33.Proskuryakov I.I., Klenina I.В., Bosch M.K., Gast P., Hoff A.J. Detection of spin-polarized EPR signals belonging to the primary radical pair in bacterial reaction centers // Magnetic field and spin effects in chemistry and related phenomena / Abstr. IV Internatl. Symp. Novosibirsk, 1996, P.72-73.