Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм фотопереноса электронов через мембраны липосом, содержащие безмагниевые аналоги хлорофилла

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм фотопереноса электронов через мембраны липосом, содержащие безмагниевые аналоги хлорофилла"

АКАДЕМИЯ НАУК ССОР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А.Н.БАХА

МЕХАНИЗМ ФОТОПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ ЧЕРЕЗ МЕЫБРАШ ЛИПОСОМ, СОДЕШАЩИЕ БЕЗМАГНИЕВЦЕ АНАЛОГИ ХЛОРОФИЛЛА

Ю.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Баранникова Янина Владимировна

УДК 577.3

Москва - 1990

Работа выполнена в лаборатории фотобиохимии Института биохимии имени А.Н.Баха АН СССР

Научный руководитель: академик АН СССР А.А.Красновский Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.С.Крицкий

Ведущая организация: Мемфакультетская проблемная НИЛ им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится " '¿¿¿¿¿/-У^ 199'/г. в № час. на заседании специализированного совета (К.002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (117071, Москва, В-71, Ленинский проспект, 33,корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. I).

доктор химических наук Р.Ф.Хайрутдинов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М.И.МОЛЧАНОВ

\

■■ I

. _| ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТи

Ч ... Актуальность проблемы. Исследование преобразования солнечной энергии, происходящего в~процессе фотосинтеза,- одна из актуальных проблем, стоящих перед современной наукой. Наряду с теоретическим познанием молекулярных основ механизмов реакций, осуществляемых фотосинтезируюцими организмами, существует прикладная задача -создание■ искусствешшх фотокаталитичоских систем, способных эффективно преобразовывать энергию света в энергию химических связей.

В качестве систем, позволяющих моделировать структурные и функциональные особенности мембран хлоропластов и хроматофоров и имеющих перспективу использования для преобразования энергии света, широко применяются дипосомы, в которые включены пигмента-фотосенсибилизаторы (работы лабораторий Кальвина, Толлина, Красновского, Замараевв, Шилова).

Пигмент-содериащио Л1Шосомн представляют собой замкнута:-липидные Оислои, обладающие внутренней водной фазой, липидная Фаза которых содержит фотосинтетические компоненты - сенсибилизаторы. В качестве мембранных фотосенсибилизаторов применяются как природные пигменты (хлорофиллы и их аналоги), так и синтетические красители. Липосомалыше системы стабильны и обладают большой суммарной площадью поверхности, что позволяет получить значительные скорости гетерогенных реакций. Наличие мембранной фазы дает возможность разделить исходные реагенты и осуществить фотошгдуцировагашй трансмембрашшй перенос электронов (ФТПЗ) от низкоэнерготического донора электоронов к высокоэнергетическому акцептору за счет энергии света.

Однако, квантовый выход преобразования световой энергии в липосомалышх системах, достигнутый к моменту начала работы над настоящей диссертацией , не превысз'? ПГ5Ж. Кроме того, несмотря не то, что принципиальная возможность лнлч показана, дотали

механизма этого процесса оставались невыясненными, а круг пигментов, применяемых в качестве мембранных фотосенсибилизатсров, сгр;1~ тчен. Представляло интерес использование в качестве Фотосен-:ибилизаторов, включенных в мембраны липосом, феофитино "в"*, участвующего в процессе первичного разделения зорядол в юакционннх центрах фотосистемы II высаих растений (Клим;:!], ¡расновский,1982), и бэкториофеофитшт "а", игращого ваи'уп }к>л.' | фотосинтезе пурпурных бактерий.

Целью настоящей работы явилась исследование механизма Фотоидцуцированного переноса электронов через мембраны липосом, содержащие фотосинтетические пигменты феофитин "а" (Фф) или Сактериофоофитин "а" (Бф), а также выяснение условий высокой эффективности преобразования энергии света при ФГГО.

В соответствии с этим били поставлены следующие задачи:

I. Методом стационарного фотолиза исследовать ФТПЭ в липосомох, содержащих "а" или Бф "а" , от донора электоронов -аскорбата, заключенного во внутреннее водное пространство, к акцептору электронов - метилвиологену (МВ2+).

2 Методом лазерного импульсного фотолиза исследовать отдельные стадии переноса электронов через мембраны липосом: фотохимические реакции на поверхности мембраны липосом и перенос элоктронов через гидрофобную зону мембраны. .

3. Исследовать действие трансмембранного электрического шля на эффективность ФТПЭ, а также на эффективность отдельных его стадий.

4. Исследовать ФТПЭ при длительном освещении.

5. Сравнить Фф и БФ, встроенные в мембраны липосом, ка: фотосенсибилизаторы ФТПЭ.

Научная новизна. В работе выяснен механизм ФТПЭ в липосомах, содержащих в мембранах Фф"а" или Бф"а", от донора электронов -аскорбата, заключенного во внутреннее водное пространство везикул, к акцептору - МВ2+: на первом этапе происходит восстановление пигмента в триплетном возбужденном состоянии аскорбатом на внутренней поверхности мембраны липосом, затем следует перенос электронов через гидрофобную зону мембраны и восстановление МВ2+ на внешней поверхности мембраны. Установлен "восстановительный" Tira сенсибилизации фотовосстановления МВ2+ от аскорбата бактерио-феофитином, включенным в лшосот. Исследован механизм фогоин-дуцированного переноса ьлектронов через гидрофобную зону мембраны липосом, содержащих Фф или БФ, показано существование двух каналов переноса электронов через мембрану: перенос электронов в результате обмена электронами между молекулами пигментов, находящимися е противоположных монослоях мембраны, и без обмена электронами, при участии одной молекулы пигмента. Установлено влияние трансмем-бршшого электрического поля на ФТПЭ, а также отдельные егс счадг.и. Показано, что трансмомбранное электрическое поле, в зави-сг'.мсли от направления, может как замедлять, так и ускорят! 1»-1К;-л-.ииацию радикалов, образовавшихся на стадии первичного разде-

ления зарядов на мембранах липосом. Получены данные, указывал;;); > на то, что эффективность ФТПЭ снижается при длительном освещении )t результате фотогенерации разностн электрических потенциалов w. мембране, препятствующей переносу электронов.

Научно-практическая значимость. Выяснение механизма транс; -мембранного переноса электронов, фотосенсибилизированного î$"a" или Бф"а" - пигментами, принимающими участие в фотосинтезе высших растения и бактериальных организмов, - существенны для понимания процессов фотосинтеза in vivo. Достижение высокой эффективности ФТПЭ, а также установленная в работе возможность регулирования переноса электронов через мембрану при помощи трансмембрпшюго электрического поля представляет интерес при разработке искусственных фотокаталитических систем, преобразующих энергию света.

Апробация работы. Материалы диссертации били доложоны на Всесоюзной конференции "Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии", Ленинград, 1987, Всезоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ео роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов", Минск, 1988, YI Международной конференции по переносу энергии и электрона, Прага, 1989, Советско-Индийском симпозиуме по регуляции фотосинтеза, Пущино, 1990, научной конференции Института биохижги им. А.Н.Баха АН СССР," I98G.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано а рпбот.

ОБЪЕКТЫ И »Лстода ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основным объектом исследования были липосомы из яичного лецитина, содержащие в мембране Фф"а" или Бф"а". Для получения липосом, содержащих донор электронов во внутреннем водном объемо, концентрированный раствор пигмента и липида в этаноле впрыскивал! в 0,5 М раствор аскорбата натрия в буфере (50 мМ К2з04, ЬОмМ трис-^БО^, рН 7,5) согласно методу (Ва1гг1,Когп,1973). Поело получения липосом для удаления донора электронов из спевшего водного объема липосомальную суспензию пропускали через колонку с сефадексом с-25, уравновешенную буфером.

Для создания трансмембранного градиента концентрации ион^н К* суспензию липосом, содержащих во внутреннем водном оЧгчт определенное количество К^о^, пропускали через • колонку о сефадексом с-25, уравновешенную соответствующем треоу-мому градиенту количеством ^бо^ и добзвлевлым для рцравнивагая н-лшоГ» силы На-БО.. Перед проведением опытов к суспензии ллюссч

добавляли валиномицин. Величину трансмембранного потенциала (Дф) оценивали по формуле Нернста. В отдельных случаях расчет трансмамбранной разности электрических потенциалов проводили по формуле) Корнета с дополнительной коррекцией согласно методу (Kornberg et al,1972), (при соотношении [К+В]/[К+П] = Ю3 Аф=180 МИ, при [К+П]/[К+„]=10~3, Лф=-60 i -IQ0 мВ). При стационарном освещении восстановлэниэ № регистрировали при А..--550 нм (е=8870 М^см"1).

Исследования методом лазерного импульсного фотолиза проводились на установке, сконструированной в Институте химической физики АН СССР (Надточенко, Рубцов, Джабиэв,1983). Феофитин Еозбуждали третьей гармошшой Hd3+:YAG лазера (А. = 354 им) или первой гармошшой рубинового лазера (А, =694 нм), бактериофеофитин второй гармоникой Nd3+:YAG лазера (А. =532 нм). Длительность импульса возбуждения Nd^.-YAG лазера 12 не, анергия импульса в третьей гармонию 4 мДж (диаметр пучка 3 мм), во второй гармонике 25 мДж (диаметр пучка 6 мм). Рубиновый лазер в режиме активной модуляции добротности генерировал импульс с энергией 200 мДж, длительностью 30 не, диаметром 10 мм. Кинетические кривые регистрировали с помощью аналого-цифрового преобразователя с вромошшм разрешошшм 50 не на точку, усреднение проводили по 7-10 образцам, по 100 вспышек на образец. Зондирующий свет ксеноновой лампи или лампи накаливания. Так как спектры Т-Т поглощения <1фт и. Бфт частично перекрываются со спектрам! поглощения радикалов, условия эксперимента выбирались таким образом, чтобы вклад поглощения триплетов пигментов в кинетику гибели радикалов был минимальным. Время жизни Ффт 50 мке, Бфт 45 мке, что существенно меньше характерных времен гиболи радикалов (~I000 micc). Кино тику гибели Ффт и Бфт регистрировали в изобестических точках дифференциального спектра поглощения радикалов Сф~' и Бф~" (соответственно А, =503 нм и А. =480" нм). Кинетику гибели радикалов регистрировали вблизи максимума их полосы поглощения (в случае Ф£Г' А. =465 нм, в случае БФ~" А, =425 нм).

Феофитин "а" и бактериофеофитин "а" получали по стандартным методикам, принятым в лаборатории. В работе использовали лецитин, ипготовлешшй на заводе бакпропаратов (г.Харьков). Аскорбат натрия ":'if7r;i", тлиномищш и метилвиологен дихлорид "Serva".

результаты и обсуждение i. исследование (механизма фотомндувдровашого переноса электронов через мембраны липосом, содержащих феофитин щи

БАКТЕРИОФЕОФИТИН.

Принципиальная возможность фотоиндуцированного перенос:! электронов от донора к акцептору электронов через лшгаддоо мембраны, содержащие фотосенсибилизаторы Сила продемонстрирована в ряде работ. В литоратурэ предлагались различные возмояаше механизмы фтпэ в липосомах, содержащих пигменты, однако, единого мнения о механизме фтпэ прч участии пигментов фотосенсибилизаторов нет. В ппстопвдиЧ рчйото проводилось сравнительное исследование фотосннтстачоеких пигментов - Ф$ и Бф, включенных в мембраш липосом как с0НСй<5ш»«яа?о{Ч?1з фтпо, о тагам изучение механизма фтпэ для этих пигментов.

I. Фотовосстановле1ше МВ2+ при ФТПЭ от аскорзата в Фф- и Бф-содержащих липосомах."

Мы исследовали трансмембрашшй пёрейоо олектронои от аокорбата (АН"), заключенного во внутренней полости липосом, к Следует отметить, что реакция взаимодействия бозмагниегли аналогов хлорофилла (Хл) Фф и Бф с АН" и их способность к сенсибилизации фотохимических реакций в растворах били детально изучены в работах Красновского с соавторами (КрасновскнЯ, Войтовская,1951). При освещении Фф- или Бф-содержащих липосом наблюдается восстановление МВ2+ быстро достигающее стационарного уровня. Начальная скорость фотовосстановления МВ2+, сенсибилизированного ССф, существенно превышает скорость, наблюдаемую при -использовании Бф. Максимальные величины квантовых выходов, равные в случае 1ф-содержащих липосом 20% и в случае Бф-содеркащих липосом 2,8% , достигаются при соотношениях пигмент:липвд, составляющих, соответственно, 1:1500 и 1:250. В этих условиях, таким образом, Фф сенсибилизирует ФТПЭ почти на порядок более эффективно, чем Бф. Фф сенсибилизирует данную реакцию эффективное, тем Бф, при всех исследованных концентрациях пигментов.

При выключении света в суспензиях ФФ- или Бф-содерко'дих штосом наблюдается окисление восстановленного МВ+' вследстшК' тротекания обратной реакции. Последующие освещения внопь щтюлл! с восстановлению МВЬ,+ .

Если аскорбат и МВ находятся во внешнем водном или щутреннем водном отделе липосом совместно, накопление МВ4• ив [аблюдается. Разрушение мембран в ходе фотовосстановления М1Г* при

введении детергента тритона ХЮО (1%), вызывает мгновенное окисление Ш+', что свидетельствует о трансмембранном переносе электронов в ходе фоторэакции.

Начальная скорость фотовосстановлешш МВ2+ аскорбатом линейно зависит от интенсивности света как в случае проведения реакции в суспензии Фф-, так и Бф-содержащих липосом. Этот факт указывает на то, что в обеих системах реакции протекают по одноквантовому механизму.

2. Спектры поглощения и флуоресценции бактериофеофитина "а" в

липосомах!

Из литературных источников известно,что пигменты, встроенные в липидные мембраны, обладают спектральными характеристиками, несколько отличными от характеристик тех же пигментов в органических растворителях. Это потребовало проведения предварительного исследования спектральных параметров пигментов- в липосомах. Детальное исследование спектральных характеристик Хл и 1ф, включенных в липидные везикулы, было проведено ранее. В настоящей работе изучаются спектральные характеристики Бф-содержащих липосом (при 20° С).

Максимумы спектров поглощения Бф, встроенного в мембраны липосом, смещены в длинноволновую область по сравнению с растворами в спирте на 2-4 нм. В липосомах с соотношением гшгмбнт:липид=1:1000 максимумы поглощения расположены при 755,5, 530,5, и 360,5 нм. Увеличение соотношения пигмент:липид от 1:3000 до 1:50 не приводит к изменению положения максимумов поглощения и формы спектра.

Главные максимумы спектров поглощения коллоидного раствора Бф в водном буферо смещаются к 837,5 и 380 нм. Отсутствие полос поглощения при 837,5 и 380 нм в спектрах Бф-содержащих липосом при соотношениях пигмент :лшшд 1:3000 - 1:50 свидетельствует о полном встраивании пигмента в лштасомальные мембраны.

Спектры флуоресценции Бф-содержащих липосом (пигмент:липид= =1:3000) характеризуются максимумом при 762 нм. Увеличение концентрации Бф в мембране от 1:3000 до. 1:60 приводит к постепенному сдвигу максимума к 768 нм, а также к увеличению полуширины пика и росту полосы флуоресценции при 780-825 нм.

При увеличен™ содержания пигмента в липосомах (соотношения пиг№'нт:л;шид от I:3000 до 1:60) относительный квантовый выход ^уорпснснции (ф) падает. Начало падения наблюдается при г. - илютмми ГФглипид »1:600, когда на одну липоссму приходится в

среднем около 5 молекул пигмента. Кривая зависимости ф от соотношения пигмент:лшщц близка аналогичной кривой, полученной для Ффнсодержащих липосом.

Независимость спектров поглощения от концентрации Бф и мембране, а так же отсутствие характерной для агрегатов Еф полос!/ поглощения при X > 825 нм указывает на то, что в липосомах преобладает мономерная форма пигмента. В то же время при соотношениях пигмент:липид>I:600 наблюдается концентрационное тушение возбужденного Бф, приводящее к падению квантового выхода флуоресценции, которое, согласно современным представлениям, происходит вследствие переноса энергии на агрегированные формы пигмента. По-видимому, агрегаты все же присутствуют в незначительном количестве при концентрации Бф

В настоящее время неясны причины сдвига положения максимума спектра флуоресценции с увеличением концентрации Бф. Возможно, такой сдвиг связан с изменением во взаимодействии между молекулами пигмента при увеличении концентрации Бф в мембранах липосом. 3. Механизм трансмембранного фотосенсибилизированного переноса электронов в липосомах, содержащих феофитин или бактериофеофитйнТ Ранее был установлен "окислительный" механизм сенсибилизации

о |

ФТПЭ для реакции фотовосстановления МВ в Хл-содержащих липосомах (на первом этапе происходит окисление Хл в триплетном состоянии метилвиологеном) (Рога,ТоШп, 1932). Затем было показано, что гф сенсибилизирует данную реакцию по "восстановительному" типу (на первом этапе происходит восстановление триплета Фф аскорбатом) в суспензиях липосом (Надточенко и др.,1988). В настоящей работе методом лазерного импульсного фотолиза проведено . исследование механизма сенсибилизации в случае Бф-содержащих липосом и механизма ФТПЭ в случаях Фф- и Бф-содержащих липосом.

С целью выяснения механизма восстановления МВ2+, фотосенсибилизированного Фф или Бф, при трансмембранном переносе электронов от аскорбата, заключенного во внутреннее водное пространстго липосом, были проведены исследования отдельных стадий переноса электронов методом лазерного импульсного фотолиза.

При импульсном фотолизе в суспензиях липосом наблюдаются триплетные возбужденные состояния Фф (Ффт) и Бф (Бфт), спектры которых совпадают со спектрами триплетов ФФ и Бф, известными ил литературных данных. Бремя жизни 4фт и Бфт в липосомах составляет 45^5 мкс и 50-5 мкс, соответственно. В отличие от С>ф в сусп?нг'К^г. Бф-содержащих липосом не наблюдается н.-ллюнтрационного тугч."!'я

возбужденного триплетного состояния пигмента.

В присутствии аскорбата внутри липосом регистрируется тушение <ГФТ и Ьфт и накоплегше радикалов и Бф~". При этом в

да^форшщкалышх спектрах <Хфт и Бфт наблюдаются изменения, вызванные поглощением радикалов. Гибель триплетов коррелирует с накопленном радикалов пигментов. Поело образования радикалов Фф~" и Б}Г" наблюдается их гибель.

Кинетика рекомбинации радикалов внутри липосом существешю отличается от кинетики этой же реакции в мицеллярном и в гомогенном растворах: наблюдается выраженная затяжка кинетической кривой, время полупревращешга анион-радикалов но изменяется с памешошюм энергии фотолнзирующого импульса и, следовательно, с изменением начальной концентрации радикалов пигмента (П~') л аскорбата (А-*). Среднее число радикальных пар в газосох» "'I. Гадикалы образуются внутри липосом и обмен радзхакйш кюаду липосом,"лми за время рекомбинации невозможен. Следователи», их гибель определяется условиями аналогичными условиям геижокой рекомбинации. Анализ показывает, что гибель радкхалмв ко окспоненциальна, но лшюаризуотся в координатах (1/рШ -"и от (гдо р(0=[П~' ] и)/[П~' Ш=о) ), а удубааа пре;,.ги„-лшя реакции по закону Ь1^2 близка к 85Ж. Это указцзает на то, что кинетика рекомбинации радикалов в мембране следует закономерностям кьазиодпомерной диффузии (КоГтап,Вигв1^е:т,1978). Из литературных источников известно, что лшшда способ!Ш претерпевать диффузионные движения в радиальном направлении мембраны в пределах данного монослоя - так называемые "вертикальные флуктуации". Полученные нами данные о том, что рекомбинация радикалов А"' и П-' подчиняется законам диффузионного движения, могут указывать на способность молекул пигмента к вертикальным флуктуациям.

При добавлении МВ'"+ ~;о внешний водный объем липосом, содержащих аскорбат (АН~> не. внутреннем пространстве, наблюдается образование восстановленного Г-ЛВ"1 ■. Этот процесс характеризуется следующими кинетическими проявлениями: в используемых концентрациях (<0,Ш) ИЗ"не тушит триплетные и синглетные возбужденные состояния пигментов, при добавлении МВ2+ ускоряется гибель радикалов ГГ", образование НВ+" происходит симбатно с -гибелью р.'1 д.кзлон пигментов.

Основываясь на данных, полученных е настоящей работе, а так ни; литературных дашшх об окисллтелию-восстановителышх свойствах бата, нагло принять для Фф - и -Бф-содержащих липосом следующую

схему ФТПЭ от АН" к МВ2+:

1)

2)

3)

4)

5)

6)

7)

8) 9) Ю) II)

П — Пв Пт

■ П

п

п1 + п — п + п

+ АН" — П'

П1

АН1 А-'

в

В

АН"

+ АН

— А"' + Н* + А"' + Н*" — АН" + А

П- + АН"

Пд' + А"' -Й Пд + А1Г мв+- + А —МВ2+ + А

+ №

,2+

тпэ —* мв+- +

"в

а+- + д-. мв2+ + ¿д-

где П - либо Фф, либо Бф, в - внутренний, и - наружный,А-дегидро-аскорбат. Кинетические параметры отдельных стадий ФТПЭ, полученные методом импульсного фотолиза, представлены в табл.1.

ТАБЛИЦА I. Кинетические параметры отдельных стадий ФТПЭ от асорбата к матилвиологену, сенсибилизированного Фф или Б®, включенными в мембраны липосом.

N реакции

Фф

БФ

1

2

3

4

5

6

7

8 9а

90/в

9г

10 II

(2,2+0,2) "Ю3 с"1 300 с-1

(1,4+0,4)-105 (Мс)"1 (2,6+0,6)-Ю5 (Мс)"1

6-106(Мс)-1 * (2,3+0,1)Ч0Э (Мс)"1 300+100 с"1

500+100 с (1,2+02)"10'

-I

(МС)"

2-Ю7 (Мс)"1 **

К5 /(к4 +к5 ) 0,6+0,1

2-Ю4 с 1

(5,6+2,5)'Ю4 (Мс)"1

6-Ю6 (Мс)"1 *

150с"1 - БООс"1 <75 с"1 Ю6 (Мс)"1

2 Ю7 (Мс)"1 ** 0,045 .

*-литературные данные (Tafc3.Ehi.i985). получена с

случае, когда АН" и МВ2+ находились по одну сторону мембраны.

- р+

Таким образом, ФТПЭ от АН к МБ протекает согласно "восстановительному" механизму сенсибилизации: на первом этапа переноса электронов происходит восстановление пигмента в триплетном состоянии, находящегося во внутреннем монослое, аскорбатом и образование анион-радикала пигмонта (4,5). Реакции 6 и 7 представляют собой превращения продуктов окисления аскорбата. Возможность протекания реакции 8 показана при исследовании кн., ¡тики гибели 1Г" в двойной системе II - АН". Реакция 9 представляет собой непосредственно перенос электронов через гидрофобный слой мембраны, механизм которого исследуется в разделе 4, и восстановление МВ2+ на внешней поверхности липоссмы. Реакции 10 и II - обратный перенос электронов, механизм которого будет обсуждаться в главе II.

Пред.токошая ранее в работах Толлина схема "окислительнного" типа ФТПЭ для Хл-содержащих липосом также включала несколько этапов: окисление Хлт акцептором, перенос электрона (или "дырки") через мембрану и восстановление катион-радикала Хл+* на противоположной стороне мембраны. Различив механизмов фотосенсибилизации в первую очередь, по-видимому, связано с различием в тормодинамико реакицй взаимодействия триплетных состояний пигментов с Действительно, Бф и Фф в основном и

трипдотном состоянии имеют более положительный окислительный

потенциал, чем Хл ( Е^^». = 1.1 В, Е^Бф/Бф+* = °-97 В "

К;,хп/хл^ - в- = -°-23 В' ^Бфт/Бф+" = -°-03 . В'

^чХлт/Хл'' = В). что Двлаот маловероятным перенос электронов

от <Н'Т и Б1зт на КВ2+, имеющий е9= -0.45 В.

м

Полученные данные объясняют тот факт, что при стационарном освощонаи ФФ- или Бф-содержащих липосом в случае, когда АН- и МВЛ+ находятся гга одну сторону мембраны, не наблюдается накопление Ш;*"*. Причиной этого является быстрая обратная реакция, в которой расходуется МБ*"' и регенерируется АН-.

4. Механизм переноса электронов через углеводородную зону мембраны!

I! данной системе гидрофильные донор и акцептор электронов раздчлони мембраной, содержащей амфифилышй фотосенсибилизатор, следовательно, реакция фотовосстансвлепия МВ~+ должна включать стадию переноса электронов через гидрофобную область липидной м- '/брани СШЭ). В литературе обсуждались 4 возможных механизма

переноса электронов через гидрофобный барьер мембраны: I) обмен электронами между радикалом пигмента и молекулой пигмента в основном состоянии, находящимися в противоположных монослсях мембраш, ("туннельный" перенос) (Ford et а1,1979) или радикалом пигмента и молекулой пигмента в триплетном возбужденном состоянии (двухквантовый "туннельный" перенос) (Дымарь и др., 1932),

2) диффузия через мембрану окисленной (восстановленной) формы пигмента или диффузия дополнительного переносчика электронов,

3) образование в мембране агрегатов молекул пигмента, участвующих в фоторедокспроцессе и способных переносить электроны через мембрану (Хайрутдинов и др.,1985), 4) перенос электронов по сопряженным ненасыщенным двойным связям углеводородных цепочек липидов мембраны (Иванов и др.,1983). Мы изучали механизм ТПЭ в случае Фф- и Бф-содержащих липосом параллельно методами стационарного фотолиза и лазерного импульсного фотолиза.

На первом этапе методом стационарного фотолиза исследовали зависимость квантового выхода фотовосстановления MB'0*' аскорбатом (Ф) от среднего числа молекул пигмента на липосому (ц.) при ФТГПЗ в широких пределах концентраций Фф и Бф в липоссмах. Предположили, что, если реакция 9 протекает по механизму обмена электронами, то для переноса электронов через мембрану требуется участие не монео двух молекул пигмента." В этом случае должно наблюдаться резко»! падение Ф при низких концентрациях пигмента ( ц -»0).

Зависимость Ф от ц в Фф- и Бф-содержащих лшоссмзх, полученная экспериментально, характеризуется наличием максимума. Как указывалось выше, максимальное значение Ф в случао Ф1>-содержаиих л1ш0с0м, равное 20%. достигается при Максимальная величина Ф в случае Бф-содержащих липосом равна 2,8? при Цщ=12. При уменьшении и увеличении р. происходит снижение квантовых выходов ФТПЭ. Падение Ф, наблюдаемое при увеличении ц, отражает . концентрационное тушение возбужденных синглетшх состояний Фф и Бф и триплетных состояний Фф (раздел 2). Падение квантовых выходов ФГПЗ с укеньиением ц связано с уменьшением вероятности нахождения молекул пигмента из противоположных монослоев мембраны на расстоянии, при котором возможен ТПЭ между ними. Однако, если перенос электронов происходил бы только по механизму электронного обмена, то при ц-«0 наблюдалось си Со лов резкое падение ф. Возможно предположить, что, кроме обмена, существует другой путь переноса электронов.

Методом лазерного импульсного фотолиза было показано, что при

р.

[МВ ] =3 мМ наблюдается зависимость характерного времени накопления МВ+" от концентрации Фф или Бф в мембране (ц).

При этом ^1/2 118 зависит от концентрации МВ2+ при [МВ2+]^1 мМ. Это означает, что при высоких концентрациях акцептора электронов в последовательных реакциях- образования МВ+> (9) лимитирующей является стадия ТПЭ.

Полученные при стационарном и импульсном фотолизе факты можно объяснить, если предположить, что при восстановлении МВ2+ ТПЭ происходит по двум параллельным реакциям первого и нулевого порядка по концентрации Зф или Бф (П). Реакция ТПЭ, зависящая от Ц, может быть представлена как обмен электронами между радикалом П~" из внутренного монослоя мембраны с молекулой П в наружном монослое:

9а) П^ + Пц —- Пз + П^' (канал I).

Реакция, независящая от ц , может быть представлена как:

90) П- --- П- или

9в) П"£ + МВ2+ —- Пв + МВ+- (канал 2)

За 9а и 96 следует 9г:

9г) + МВ2+ —> Пд + МВ+-

В случае ФФ-содержащих липосом из наклона прямой зависимости времопи полупревращения реакции образования МВ+* от среднего числа молекул пигмента на липосому (т^/з от ц) было получено значение кда, ровное 300 - 100 с-1. Исходя из величины отрезка, отсекаемого на оси ординат той же зависимости, было определено значение константы скорости реакщш нулевого порядка кд0/в ¿500 с-1. Оценка эффективной величины константы ТПЭ в случае Бф-содержащих липосом показывает, что 150 с-1 - кЭа £ 500 с"1, а к9(?/в ^ 75 с-1.

Предположение о двух каналах переноса электронов подтверждается сравнением зависимости квантового выхода фотовосстановления МВ2+ от ц, рассчитанной с использованием количественных данных, полученных в опытах с импульсным фотолизом, с зависимостью Ф от ц, найденной экспериментально в опытах со стационарным освещением. Случайное распределение молекул пигмента по липосомам учитывалось путем аппроксимирования пуассоновским распределением. Удовлетворительное согласие между расчетным значением Ф и экспериментальным достигается при величинах констант Кг„) - 300-100 с-1, к90/в = 500±Ю0 с-1 в 'случае ФФ содержащих лчлосом п к„ =200с-1, кС(5/ = 50 с-1в случае Бф-содержащих лило-

сом. Из сравнения величин.к9а и к9б/в следует, что при ТПЭ в основном определяется процессом 9а.

На основании данных, полученных в наших экспериментах и литературных источников, можно предложить механизм переноса электронов для каналов I и 2. Из вышеизложенных механизмов следует исключить двухквантовый "туннельный" перенос и перенос с участием агрегатов молекул пигмента, так как наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ФТГО в Фф- или Бф-содержащих липосомах происходит по однокванотовому механизму, а заметного образования агрегатов при ц<10 не происходит. Обмен электронами между радикалом пигмента и молекулой пигмента в основном состоянии за счет "туннелирования" с константой скорости 102 с-1 маловероятен вследствие большой толщины гидрофобной зоны мембраны (35 А). Однако, нами были получены данные, указывающие на возможность вертикальных флуктуаций молекул пигмента. Если предположить, что молекулы П и ГГ' способны к подобным движениям, то можно допустить их сближение на расстояние; при котором между ними возможен обмен электронами.

В настоящее время не представляется возможным однозначно . установить механизм переноса электронов по каналу, независящему от ц (канал 2). Поскольку МВ2+ гидрофилен, реакция прямого переноса электронов от П~' к МВ2+, добавленному снаружи, за счет диффузии МВ2+ маловероятна. Диффузия Л"' или П через мембрану на . противоположную сторону за время 10~3 с, по-видимому, также не может осуществиться. Возможно, что канал 2 определяется диффузией протонированного анион-радикала пигмента, • поскольку незаряженная форма ПН должна легче проникать через гидрофобный барьер мембраны, чем П~". Кроме того, нельзя исключить возможность переноса электронов с участием молекул липидов мембраны.

ГЛАВА II. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ МВ2+ АСКОРБАТОМ ПРИ ФТПЭ В ФФ- И БФ-СОДЕРЖАЩИХ ЛИПОСОМАХ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ СТАЦИОНАРНОМ ОСВЕЩЕНИИ И ПОВТОРНЫХ ОСВЕЩЕНИЯХ СИСТЕМЫ.

На следующем этапе было проведено исследование реакции фотовосстановления МВ2+ в Фф- и Бф-содержащих липосомах аскорбатом при длительном стационарном освещении, а также изучение механизма обратной реакции, протекающей после выключения света, и поведения системы при повторных освещениях, поскольку характер работы липосомальной системы во времени представляет интерес в плвно создания систем, преобразующих энергию света.

При освещении Фф- или Бф-содержацих липсссм нпблюдпптс-я

о .

восстановление МВ . Начальная скорость реакции составляет З.ЗЧО''1' М [МБ4 • ]/с при (.1^=4 и Цщ,=16,5 . Скорость накопления МВ+" падает посла нескольких минут (1-3) овещения, достигая стационарного уровня.

После выключения света наблюдается окисление восстановленного вследствие протекания обратной реакции. Следует отметить,-что принципиально возможна обратная реакция, идущая только при освещении согласно схеме:

МВ2+ А"' + Н+ ,АН~

т V ) - тпэ - К ^

•------„ п • -------

• П^-^-ЧГ;,--— П ------------Ч1В

Однако, поскольку [МВ ' ] ¿10 и М, обратная реакция с участием П но может существенно конкурировать с прямой реакцией. Поэтому можно предположить, что скорость окисления МВ+" при освещении на стационаре равна скорости окисления МВ+•, регистрируемой сразу после выключения света, которая составляет 6,8'10~~а М [МВ2+]/с для йф- и Бф-содержащих липосом в данных условиях. Таким образом, скорость образования МВ+> на стационаре меньше, чем начальная приблизительно в 5 раз. Измерение спектров Фф- и Бф-содержащих липосом до и после реакции свидетельствует об отсутствии значительной деструкции пигментов (выцветание составляет не более ЮЖ за 30 минут освещения). Оценка количеств восстановленного акцептора и окисленного в процессе реакции донора электронов показывает, что падение скорости реакции при освещении не связано с исчерпанием донора или акцептора электронов. Сопоставление спектров поглощения МВ+" и пигментов показывает, что эффект "экранировки" не может объяснить падения скорости. Следует исключить также нарушение разобщения донора и акцептора электронов вследствие их диффузии через мембрану, поскольку оценка выхода восстановленной формы аскорбата во внешнее водное пространство везикул по скорости восстановления феррицианида, добавленного снаружи, показывает, что за 24 часа выходит около 10% аскорбата (вромя эксперимента но превышает 4 часов), окисленный МВ2+ практически не проникает во внутрешее пространство липосом. Из схомы трансмомбрэнного фотовосстановления МВ2+, представленной в главе I, видно, что в реакции 6 в процессе окисления АН" происходит выброс протона, при этом (реакция 9) через 'мембрану переносится 2 электрона. Выброс ^ во внутреннее водное пространство должен привости к локальному увеличению рН, а следовательно, к ухудшению донирующой способности аскорбата. Кроме

того, за счет переноса электронов и накопления протонов может возникать разность электрических потенциалов на мембране, препятствующая дальнейшему переносу электронов. По-видимому, подкисление внутренней среда и электрическое поле являются основными причинами замедления фотовосстановления МВ2+.

После выключения света наблюдается исчезновение восстановленного МВ+" вследствие обратной рекации, которая может протекать согласно уравнениям (10,11) при участии молекул пигмента по схеме, включающей обращенную реакцию 9г, ТПЭ и реакцию П^" с А. Очевидно, что при протекании обратной реакции только с участием пигмента после выключения света должно происходить полное возвращение системы в исходное состояние. Обратная реакция также может быть обусловлена диффузией через мембрану МВ+" во внутреннее водное пространство липосом и/или диффузией окисленной формы аскорбата - дегидроаскорбата во внешнее пространство. Из литературных источников известно, что дегйдроаскорбат и МВ обладают большей способностью проникать через лмшдный бислой, чем

о 1

МВ и аскорбат. Действительно, темновые опыты по ЕосстаноЕлению МВ2*' дитионитом позволили продемонстрировать вхождение во

внутреннее простраство липосом.

В случае выхода дегидроаскорбата во внешнее водное пространство липосом обратная реакция с потреблением протона должна происходить снаружи, т.е. Енутри доллны накапливаться ионы Н+, а снаружи ОН", что приводит к подкислению внутренней среды липосом 1! возникновению трансмембранного электрического поля, которое, по-видимому, сохраняется в пределах времени эксперимента.

При повторных освещениях Фф- и Бф-содержащих липосом вновь наблюдается восстановление МВ2+. При этом в условиях, когда скорость при первом освещении ) достаточно велика (больиие концентрации пигмента), скорость уменьшается с каждым повторным освещением, по сравнению с Ур достигая после нескольких циклоп стационарного значения (т3). При последующих освещениях скорость меняется слабо. В дальнейшем для обозначения липосомальной системы, которая подвергалась освещению, мы будем пользовался термином "засвеченная". "НезасвеченнсЗ" будет называться систсм.ч лптосом, которая оие но подвергалась освеиртю.

При 4 £ £ 15 и 16,5 £ й 22 лаблкипотся иг»илолг>п

сильное падение скорости. В этом случае У3 ~ 1/2 при суммарн'-ч времени освещения 0-8 мин. (независимо от того, кг>к промоипл VI. освещетю - непрерывно или дискретно). При р. ^ <. О, ? и и,,,, <■ !..-'

освещение системы в течение того же времени (6-8 мин.) не вызывает падения скорости. Если при освещение не превышает 15 сек.,

то падения скорости также не происходит. Оказалось, что падение скорости коррелирует с суммарным количеством МВ+', накопленным за все время освещения (дискретного или непрерывного). Действительно, -скорость не падает, пока суммарное количество МВ+" не достигнет величины М. Очевидно, что при малых р., когда скорость

фотовосстановления МВ2+ низка, накопить такое количество МВ+" за 6-8 мин. не удается, поэтому эффекта "засветки" не наблюдается.

На основании полученных результатов можно исключить такие причины падения скорости при "засветке", как исчерпание донора или акцептора электронов, деструкция пигмента или разрушение целостности мембраны липосом. Падение скорости при "засветке" можно объяснить тремя причинами: присутствием МВ2+ во внутреннем пространстве липосом, снижением рН внутри липосом и трасмембранным электрическим полем.

Вероятно, накопление внутри липосом; происходящее в

результете вхождения МВ+; и его взаимодействия с дегидроаскор-батом, снижает скорость фотореакции, на что указывают опыты, в которых МВ2+ вводился внутрь липосом во время их приготовления. В этом случае скорость фотовосстаноаления МВ2+, добавленного снаружи, была занижена уже при первом освещении, причем скорость его восстановления падала с увеличением концентрации МВ2+, введенного внутрь липосом. По-видимому, МВ2+ внутри липосом восстанавливается ГГ- и окисляется дегидроаскорбатом, т.е. восстановление Пт аскорбатом не приводит к трансмембранной реакции.

Очевидно, что локальное уменьшение рН внутри липосом должно снижать скорость реакции. Трансмембранное электрическое поле направлено таким образом, что. должно препятствовать дальнейшему переносу электронов. Из литературных источников известно, что градиент концентрации Н* через мембрану липосом может сохраняться в пределах часа.

Таким образом. липосомы, содержащие фотосинтетическиэ пигменты, дают возможность осуществить ФТПЭ от низкоэнергетического донора электронов к высокоэнергетическому акцептору при циклической работе системы. Полученные данные позволяют предположить, что одной'из причин, вызывающих снижение скорости при фотопереносе электронов является трансмембранное электрическое поле, генерируемое в ходе фотореакции. Для проверки этого

предположения га исследовали влияние ионофоров на ФТГО.

Влияние ионофоров на ФТПЭ.

В работе (Ьаапе,Гогй,1Э81) сообщалось об увеличении эффективности ФТПЭ при введении в липосош, содержащие в мембране фотосенсибилизвторы, ионофоров. Авторы объяснили этот эффект тем, что ионофоры снимают трансмембра1шую разность электрических потенциалов, вызванную фотопереносом электронов, обеспечивая транспорт противоионов. Мы исследовали влияние калий специфичного ионофора валиномицина и протонофора 01сср на ФТПЭ. Предположила, что "засветка" позволяет накопиться во внутренней водной фазе лштосом количеству Н*, достаточному для генерации АцН+, величина которого способна вызвать подавление скорости. Валиномицш должен обеспечивать транспорт ионов К+, что компенсирует разность электрических потенциалов, сюср должен снимать трансмембранную разность концентраций Н+, перенося протоны.

Эффект, вызываемый валиномицином и сюср носил сходный характер. (При [К*] =ГК^] добавление валиномицина не приводит к генерации трансмембранной разности электрических потенциалов, Лф=0).

' ТАБЛИЦА 2. А1стивация скорости ФТПЭ ' при введении в систему валиномицина и создании трансмембранной разности

электрических потенциалов (Дф=180 мВ).

АН~-Бф-МВ2+ АН~-Бф-ЭВС АН^^Гф-МВ2'' "нз" "з" "нз" "з" "нз" "з"

„вал н ' н I 2,3 I . - I Г,6

мах ] 4 6 5,5 - 1,1 1.3

УФ /у и ' н мах [^(ЮЛ)^)] 6 15 6 10 3,5 -9,5 - - ' 2.8

"нз"-"незасвечешше", "з"-"засвечешше" липосомы Введете валиномицина в присутствии ионов К+ или СЮСР б "незасвеченные" Фф- или Бфь-содержащие липосош не приводило к увеличению начальной скорости реакции, однако, вызывало увеличение глубиш реакции, что наиболее ярко проявилось в случае БФ-содержацих липосом (табл.2). В БФ-содоржащих лишсомпх оМ"«т

ионофоров развивался постепенно и достигал максимального значения через время порядка нескольких секунд после начала освещения, что указывает на фотогенерацию электрического поля в процессе реакции. Максимальный эффект ионофора можно определить как

Max[dBajI(t)/d(t) ].

В "засвеченных" Фф- и Бф-содеркащих липосомах введение нонофоров приводило к увеличению как начальной скорости (Ун),так и глубины фот'ореакции (табл.2).

Сопоставление зависимостей падения скорости при "засвотке" и эффекта ионофоров указывает на корреляцию между падением скорости и действием ионофоров: если падения скорости нет, то, ионофоры не увеличивают начальную скорость реации.

Таким образом, действие ионофоров является доказательством предположения о фотогенерации трансмембранного элекрического поля; введение ионофоров позволяет увеличить эффективность ФТПЭ путем устранения этого поля.

ГЛАВА III. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗНОСТИ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ НА МЕМБРАНЕ НА ФТПЭ В ПИГМЕНТ-СОДЕРЖАЩИХ ЛИПОСОМАХ.

Известно, что перенос электронов через фотосинтетические мембаны регулируется трансмембранной разностью электрохимических потенциалов. Одним из подходов в выяснении этих процессов является моделирование. В качестве моделей применяют ЕЛМ и липосомы, содержащие в мембранах фотосенсибилизаторы. Ранее сообщалось о возможности регулирования квантового выхода фотопереноса электоронов при помощи трансмембранной разности электрических потенциалов (Laane,Ford,I98I). Были предприняты попытки исследовать влияние поля на перенос электрнонов через гидрофобную зону липидных монослоев (PolymeropouloB,Möbius,1978 ) и разделение зарядов на границе раздела липид-вода в пигментированных БЛМ (Ьовеу,Ыаивега1,1983). Однако, детали механизма влияния электрического поля на ФТПЭ оставались неясными. Мы исследовали влияние разности электрических потенциалов на ФТПЭ и отдельные его стадии в л;досоздх, содержащих Оф, БФ, или Хл.

I. Влик1!ие трзлсмембранной разности электрических потенциалов на ФТПЭ в 4фн или Вф-.содержащих липосомах при стационарном

освещении.

На первом этапе влияние разности электрических потенциалов на мембране, установленной при помощи вал}шомищша в условиях тронсмомэранного градиента концентраций ионов К+, на скорость

реакции фотовосстановления МВ аскорбатом при ФТПЭ изучалось в "незасвеченных" БФ-содержащих липосомах (ц=6). При увеличении соотношения [К*]/[Кд] (внутренний отдел липосом заряжен более отрицатльно по сравнении с внешним) начальная скорость и глубина фотовосстановления МВ2+ возрастали. Максимальная активация процесса наблюдалась при соотношении [К^ШК^] = Ю3 (Аф=180 мВ). При установлешш на мембране разности потенциалов противоположного знака (Дф<о) начальная скорость и глубина реакции уменьшалась, приближаясь к начальной скорости и глубине в отсутствие валшюмицина. При замене МВ2+ на ЭВС° наблюдалась сходная зависимость скорости ФТПЭ от Аф (данные представлены в таблице 2).

Далее мы исследовали аналогичную зависимость в "засвеченных" Бф- или Фф-содеркащих липосомах. Ход кривых зависимости ео всех этих случаях носил сходный характер; максимальная активация процесса наблюдалась при Дф=180 мВ. однако, как указывалось выше, в отличие от "незасвеченных", в "засвеченных" липосомах валиномицин увеличивал начальную скорость реакции при Дф=0 ([К^] = =[К*], см. табл.2).

XI

2. Исследование механизма действия трансмембранной • разности электрических потенциалов на процесс первичного разделения зарядов и рекомбинацию радикалов методом лазерного фотолиза.

Ранее влияние элетрического поля на разделение зарядов и рекомбинацию радикалов на границе липид-вода изучалось при использовании БЛМ, содержащих Хл"а", Хл"б", Фф"а" в работе .(Ьогеу,Майгега1,1983). В данной работе заметный эффект поля удалось получить только при использовании положительно заряженного производного Хл"б" - хлорофилл-холин-гидразона. В случае его использования авторы продемонстрировали ускорение рекомбинации радикалов при создании на мембране поля соответсвующего направления. Предположили, что эффект поля объясняется его влиянием на движение радикала пигмента в мембране, однако, доказательств этого предположения не приводилось.

Чтобы изучить влияние электрического поля на отдельные стадии ФТПЭ, мы использовали метод лазерного импульсного фотолиза. Исследовалось влияние поля на процессы разделения зарядов и рекомбинацию радикалов на внутренней поверхности лшгасомн в двойной системе пигмент - аскорбот.

Измерение относительного квантового выхода радикалов показало, что поле слабо влияет на выход радикалов. Наряду а этим наблюдается выраженное влигчше поля 'на характерное вр^мя

рекомбинации радикалов ГГ.' и А-'. Отношения средних времен жизни радикалов при Д^ГВО, 0, -60* -ГОО мВ для Фф- и Бф-содоржащих лппосом составляют, соответсвенно:<т+> : <т0> : <т_>=1,41-.1:0,79 и <т+> : <т0> : <т_>=6,7: 1:0,85.

Мы предположили, что поле может влиять на время рекомбинация либо изменяя высоту энергетического барьера переноса электронов между двумя радикалами, либо изменяя скорость дрейфа гидрофобного ион-радикала пигмента в радиальном направлении мембраны липосомы. Имея ввиду наши данные, указывающие на то, что рекомбинации радикалов является диффузионно контролируемым процессом, более вероятно второе.

Можно предложить следующую модель процесса:1) радикалы П-" и А-' образуются в мембране в положении г0 , 2) гидрофильные радикалы А-' быстро выходят в водный объем липосомы, а гидрофобные ГГ* остаются в мембране, 3) скорость рекомбинации П~* и А~" определяется диффузией 1Г' в радиальном направлени мембраны, 4) ■ реакция"мевду радикалами происходит на границе 'липид-вода Е^-. В случае трансмембранной разности потенциалов ГГ' должен дрейфовать в постоянном электрическом поле и ,соответсвенно направлению поля, должно происходить либо ускорение, либо замедление процесса. Для ГГ* должен существовать гидрофобный барьер прохождения мембраны, следовательно, необходимо ввести отражающую границу диффузионного движения -п^ (н1 <и2<н11). Очевидно, что поглощающая граница должна практически совпадать с внутренней границей мембраны -Диффузионное движение ГГ' в радиальном направлении мембраны можно рассматривать как движение точечного заряда в поле сферического конденсатора. Исходя из этих представлений была рассчитана зависимость отношения Т+:Тд:Т_ от расстояния н2 при различных значениях Дф. Сравнение отношения времен. полученных экспериментально при потенциалах 180, 0, -60 мВ, с расчетными позволило оценить положение отражанцей границы для ГГ" в мембране. Оказалось, что для разных радикалов она располагается на разной глубина: в случае Фф на 7 А, а Бф - 15 А относительно внутренней поверхности липосомы, т.е. радиальное диффузионное движение ГГ" в основном ограничено областью йоляршх голов молекул липида, размер которых оценивается в IX .А. Это не. противоречит литературным данным о локализации порфиринового кольца Хл и его аналогов в мембранах. Следовательно, модель удовлетворительно описывает наблюдаемые процессы.

В настоящее время не представляется возможным указать причины

различия в действии электрического ноля на разделение зарядов ь Бф- и Фф-содержацих липосомах. По-видимому, причины заключаются и различном строении молекул пигментов. Бф отличается от 2ф тем, что его II пиррольноо кольцо находится в восстановленной форме, а в кольце I вместо винильной группы, находится карбонильная. Известно, что при восстановлении двойной связи гидрофобность молекулы увеличивается, в то же время карбонильная группа более гидрофильна, чем винильная. Возможно, разлитая объясняются розной локальной гпдрофильностью-гидрофобностью молекул и вызванной этими различиями разнице в движении молекул внутри монослоя мембраны.

Таким образом, трансмембрагаюо электрическое поле в зависимости от направления может повышать или понижать эффективность фоторазделения зарядов в липосомалыгой мембране. Ь основе этого лежит влияние поля на скорость движения гидрофобного радикала в радиальном направлении мембраны.

общее заключение.

На оснований данных, полученных в настоящей- работе, можно считать установленным, что ФТПЭ от аскорбата, заключенного во внутреннее водное пространсвтво липосом, содержащих в мембране Сф или Бф к происходит го восстановительному механизму: на

первом этапе пигмент в триплетном состоянии восстанавливается аскорбатом, затем следует перенос электрона через гидрофобную зону мембраны и восстановление МВ на внешней поверхности липосомы. Перенос электронов через гидрофобную зону мембраны осуществляется по двум каналам:I) перенос электронов при участии двух молекул пигмента путем обмена электронами между анион-радикалом пигмента, образовавшимся во внутреннем монослое мембраны в результате взаимодействия пигмента в триплетном возбужденном состоянии с акцептором электрона , и молекулой пигмента в'основном состоянии, находящейся во внешнем монослое, 2) пернос электронов при участии одной молекулы пигмента. При высоких концентрациях пигментов в мембранах липосом ГПЭ в основном осуществляется за счет

обмена электронами. Наблюдаемые значения констант скорости могут быть объяснены исходя из предположения о радиальной подвижности молекул пигментов в мембране.

Исследование работы липосомальной системы при длительном освещении показало, что одной из причин замедления ФТПЭ при осЕРиении является фотогенерация разности эл-1ктри'юсп,!г потенциалов на мембране. ТраномемЗрашюе электрическое поле мог"!:' снять, если ввести ионофорн, при атом эСф^ктплирст». '17!!.!

увеличивается.

ОТПЭ можно управлять при помощи трансмембранного электрического поля. Ранее в работах, в которых исследовалось вляяше поля на квантовый выход ФТПЭ, эффект поля объяснялся его воздействием на скорость реакции трансмембранного переноса ■электронов за счет изменения высоты энергетического барьера. В настоящей- работе в двойной системе пигмент-донор электрона показано, что 'электрическое поле так же в зависимости от направления уменьшает или увеличивает скорость рекомбинации ион-радикалов пигмента и донора электронов, образовавшихся на стадии разделения зарядов.

Показано, • что квантовый выход фотовосстановления МВ2* аскорбатом при ФТПЭ в Фф- и Бф-содержащих липосомах зависит от среднего числа молекул пигмента на липосому (ц). Максимальные квантовые выходы, равные 20% для Фф и 2,8% для Бф, достигаются при Ндф=3 и Ивф=12 в условиях, когда отсутствует концентрационное тушение возбужденных состояний пигментов.

В результате исследования обнаружены существенные различия в свойствах Фф- и Бф-содержащих липосом. Было показано:1) Фф сенсибилизирует ФТПЭ более эффективно,чем БФ, 2) максимумы зависимости Ф от концетрации пигмента в липосомах для - этих •пигментов расположены при разных р., '3) в случае Бф более выражен эффект поля.

Данные, полученные в опытах с лазерным импульсным фотолизом, позволяют объяснить большую эффективность 2ф по сравнению с Бф как сенсибилизаторов ФТПЭ. Основная причина различия заключается в выходе радикалов пигментов в первичной фотохимической реакции. В случае Фф выход радикалов составляет 60Ж, в то время как в случае Бф 4,5%. Причина сдвига максимума зависимости квантового выхода восстановления МВ2+ от концентрации пигмента в случае Бф-содержащих липосом, по-видимому, связана с отсутствием концентрационного тушения триплетного возбувдешюго состояния Бф, а так же с разлиными величинами констант скорости переноса электронов по каналу 2 (см.табл.1). Различия в действии электрического поля в случаях«Фф и Бф можно объяснить различиями в строении молекул пигментов, обуславливающими разницу их локальной гидрофилыюсти—гидрофобности.

Таким образом, дашше, полученные при исследовании реакции фотсроестановдения МЗ1^ аскорбатом в липосомах, содержащих <Хф или Г'*1, о'сспоьивают возможность использования пигментированных

липосом для моделирования фотосинтетического разделения зарядив, изучения влияния электрического поля на фотопроцессы, протекающие в липидшх мембранах, а также позволяют представить принципы построения фотобиотехнологических систем, преобразующих солнечную энергию.

ВЫВОДЫ.

1. Методами стационарного фотолиза и лазерного импульсного фотолиза исследован механизм фотоиндуцированного переноса электронов через мембраны липосом, содержания Фф"а" или 'Бф"а", изучено влияние разности электрических потенциалов на мембране липосом на эффективность фотоиндуцированного трансмомбрашгаго переноса электронов (ФТПЭ), а также выяснены оптимальные условия ФТПЭ при длительном освещении.

2. Установлен механизм фотосенсибилизированного Фф"а" и Бф"а" восстановления МВ2+ при трансмембранном переносе электронов от аскорбата, заключенного во внутреннее водное пространство липосом: на первом этапе происходит восстановление Фф и БФ в триплетном возбужденном состоянии аскорбатом с образованием анион-радикала пигмента на внутренней поверхности липосомы, затем следует перенос ■ электронов через гидрофобную зону мембраны и ' восстановление МВ*"+ на внешней поверхности липосом.

3. Исследован механизм фотоиндуцированного переноса электронов чероз гидрофобную зону мембраны липосом, содержащих Фф или БФ. Показано существование двух каналов переноса электронов через ля-пидный бислой: I) перенос электрона при участии двух молекул пигмента (обмен электронами между анион-радикалом пигмента, образованным во внутреннем монослое мембраны, и молекулой пигмента в основном состоянии, находящейся во внешнем монослое); 2) перенос электрона при-участии одной молекулы пигмента. При высоких концентрациях пигмента в мембранах липосом (среднее число молекул пигмента в одной липосоме р.^4) трансмембранный перенос электронов в основном осуществляется за счет обмена электронами (канал I). Наблюдаемые значения констант скорости могут быть объяснены исходя из предположения о радиальной подвижности пигментов в мембране.

Ох

4. Показано, что кеэнтовый выход фотовосстановления МВ аскорбатом при ФТПЭ в Фф- и Бф-содержащих липосомах зависит от среднего числа молекул пигмента на липосому (ц). Максимальные квантовые выходы, равные 20Ж для Фф и 2,8% для Бф, достигаются при Цдф=3 и р,щ=12 в усовиях, когда отсутствует концентрационное тушение возбужденных состояний пигментов. Квантовые выходы реакции

ь 1ф-содержащих липосомах превышают квантовые выхода в Бф--содержащих липоссмах при всех исследованных р.. Большая эффективность Фф как фотосенсибилизатора по сравнению с Бф, в основном, связана с различием в выходи радикалов пигментов в реакции взаимодействия Ффт и Бфт с аскорбатом. В случае Ф£ шход радикалов составляет 60%, в то время как в случае Бф 4,5%.

5. Доказано, что разность электрических потенциалов на мембрана, установленная при помощи валияомициш в условиях трансмембранного градиента концентраций ионов К1", оказывает существенное влияние на эффективность восстановления МВ2<" при ФТПЭ от 'аскорбата в липосомах, содержащих Фф> и ВД. Электрическое поле в зависимости от направления может как увеличивать, так и уменьшать квантовый выход фотвосстановления

G. Исследован механизм действия электр1пеского поля на разделение зарядов в реакции взаимодействия пигмента в триплэтном состоянии с аскорбатом в Фф- и Бф-содержащих липосомах. Показано, что электрическое поле оказывает слабое влияние на .выход радикалов, но значительно в соответсвии с направлением замедляет или ускоряет гибель ион-радикалов пигмента и аскорбата. Предложен механизм действия трансмембратюй разности олектрических потенциалов нв ФТПЭ, основанный на влиянии электрического шля на скорость дрейфа ион-радикала пигмента в радиальном направлении мембраны лиггасомы.

7.Получены данные, указывающие на то, что основными фак-

•р.

торами, снижающими эффективность ФГГ1Э от аскорбата к MB являются генерированная в процессе освещешм трансмомбранная разность электрических потенциалов и протекающие в системе обратные реакции.

Полученные данные обосновывают возможность использования ли-посом, содержащих в мембранах пигменты, для моделирования фотосинтетического разделения зарядов и изучения влияния электрического поля на фотопроцессц, протекающие в липидшх мембранах, и выяснения принципов додуроения фотобиотехнологических систем, прообразующих солнечную энергию.

Список работ, оруОликовашшх по материалам диссертации: I. Семенова А.Н., .Баранникову Я.В., Никандров ВТВТ] Красновский A.A. Условия эффективного фотоиндуцированного трансмембранного переноса электронов в'ЛиДОсомах, содержащих хлорофилл и фоофитин. // Биологические мембран!,'--1987.-Т.4, N6.-Сс.648-654.

(Семенова Л.Н., Бараищ$ора Я.В.,• Никандров В.В., Красновский n: .\'i' Условия эффективного фотоиндуцированного переноса электронов

через мембраны липосом, .содержащие фотосинтетическио пигменты. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции Фотокаталитическоо преобразование солнечной энергии. Ленинград, 1987, с.127.

3. Баранникова Я.В., Семенова А.Н., Надточенко В.Д., Никандров В.В., Красновский А.А. Влияние ионофоров и трансмембранной разности электрических потенциалов на фотоиндуцированный перенос электрона через липидную мембрану. Тезисы докладов Всесоюзной конференции Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов, Минск; 1908, с.15.

4. Надточенко В.А., Рубцов И.В., Баранникова Я.В., Никандров. В.В. Влияние трансмембранной разности электрических потенциалов на фотоиндуцированное разделение Зарядов в мембранах липосом // Докл АН СССР.-1989.-Т.306, N5.-cc.I256-I26I.

5. Nadtoohenko V.A., Rubtsov I.У., Nikandrov У.У., Barannikova Уа.У. Transmembrane eleotron transfer across bilayer liposomes between ascorbate and methylviologen photosensitized by pheophytin "a" // Proceedings of the YTth international oonferenoe of energy and eleotron transfer, Prague, Czechoslovakia.-1989.-Y.2.-P.114. Ed. J. Piala, J. Pokorny. •

6. Баранникова Я.В., Надточенко В.А., Никандров В.В., Рубцов И.В., Красновский А.А. Механизм трансмембранного фотосенсибилизи-рованного переноса электрона в липосомах, содержащих феофитин // Докл. АН СССР.-1990.-Т.312, N3.-CC.743-747.

7. Лаврентьев А.И., Надточенко В.А., Рубцов И.В., Денисов И.И., Баранникова Я.В., Никандров В.В. Механизм влияния трансмембранного потенциала на процесс фоторазделения зарядов в липосомах // Биологические мембраны.-1990.-Т.7, N9.-Сс.966-976.

8.Lavrentiev A.i., Nadtoohenko Y.A.Rubteov I.V., Barannikova YA.V., Nikandrov V.Y. Influenoe of transmembrane potential on eleotron transfer and charge separation in liposome membranes containing pheophytin "a" or baoteriopheophytin "a" // Soviet-Indian symposium on regulation of photosynthesis, Pushohino, 1990, P.16.

Подписано. в печать ffS.-fi.9Pr. . Ът.987 Формат 60x90/16_Тираж ¡00_

Москва. Типография ВАСХ1ШЛ