Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ПРИ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ В МОНОМЕРНОМ И АГРЕГИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ПРИ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ В МОНОМЕРНОМ И АГРЕГИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ"

АКАДШИЯ НАУК СССР ОРДЕНА. ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХШИИ виеня А.Н.БАХА

26Я23.

На правах рукописж

нгвлгоико

Наталия Валентжновяа

ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЙ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ПРИ «ЯОХИШВСКЮС РЕАКЦИЯХ ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ В УОвОШЖН И АГРЕГИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ

03.00.04 - бюлог*чевкая

Автореферат дмооертацжж на оовокание ученой отепона кацшшаха бнологнчесысс ваук

Цовква - 1979

ЗВиЛ?

Работа выполнена в лаборатории фотобяохимии Ордена Ленина Института бяохшш имени А.Н.Бага АН СССР

Научные руководителя:

академик А.А.КРАСНОВСКИЙ кандидат Ояол. наук А.В.УМРИХИНА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Э.КАЛМАНСОН доктор биологических наук В.Я.ЩХОВСКИЙ

Ведущее предприятие: Московский Государственный Университет, аналогический факультзг, кафедра физико-химической биологии

Зааюта диссертации состоится 1980 г.

в/#£Рчас. на заседании специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (117071, Москва, В-71, Ленинский проспект, 33, корп. 2) ■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Ленинский проспект, 33, корп. I)

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

И.И.МОЛЧАНОВ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальности ртюбдеяда. Согласно современным представлениям в результате первичного фотохимнческого акта-фотосинтеза, состоящего в переносе электрона от возбужденного светом хлорофилла к первичному, акцептору, появляется катион-радикалы пигмент а и анион-радикала акцептора электрода. Предполагается,.что промежуточным процессом в фоторазделешш зарядов является возникновение наряду с катион-радикальной формой хлорофилла {бактериохлорофилла)'вое-становлекноЗ, анион-радикальной формы феофитина (бактериофеофитн-ва). Свободаые радикалы,. образупцяеея при функционировании хлоро-филдов в реакционных центрах фотосистем, обусловливает появление характерных спектров SHP. В настоящее время идентифишфованы сигналы ЭПР радикалов окисленного хлорофилла а Сакт ериохл орофилла реакцдоааых девтров; природа остальных сигналов, наблилаемцх in т1*о , окончательно не .установлена. Из-за шгагокомпонентноота хизшс снстш интерпретация спектров ЭПР в них затруднена; только с псисшьо модельных исследований иожно о достоверностью .судить о хдсгеесаоЗ природе свободных-радикалов, регистрируемых в фотоскя-теэирувиг организмах.

3 работах советских и зарубехных авторов изучаются радгкаль-ные продукты, обраэухщиеся. при окислительно-восстановительных ггре— ' враседдях изолировании фотосинтетэтеских шп/ентов (Холлогоров. Теренин, I96I-I965; Бобровский, Холмогоров, I97I-X973¡ Евстигнеев * др., 1971-1976; TolUja et га. , 1963-1965; Fajer et «а. , 19701973). В лаборатории (£стобждамии Института биохимии им, А.Н.Баха АН СССР образование свободных радикалов при фотовоостановлен™ s фотоокисдении хлорофилла, бактериохлорофвяда и других пигментов псказано иетодш яницаировааия цепной ползнеризациа (Красновскяй, Умрихгна, 1355,1960} л методом ЭПР (Красновский, Уиршшна и др., I96G-I966, 1972-1979).

К началу налей работа не были изучены катион- я анион-радяка-ли кногт фотосхнгетических пигментов. Кроме того, не были зыясне-на законсмерноот и,. свойства и условия возникновения радикальных фор* пигментов, а гакзе доноров и акцепторов электрона при окисди-телЬЕо-зоссганозЕТельнкх фотопревращениях хлорофшела а его аналогов. В связи с этш продолжается исследования образования свободных радикалов при фотохздичесхих реагщзях питаентов; подобные исследования зеобходвш для сошшаная механизма преобразования эяер-

L'uîpjuwjaalisyîaaabaOjaoïisa Mc-ci^r:^:! с,-д. Jlcr^i Сиаоз. asszt:ca i::t. К, Д. îiarpcirsa

ж&жш.

-г -

от света ь реакционных центрах фотосистем.

Цель it задач?; пссце^овлнкя. Основной целю настояаей работы вило сравнительное изучение .образования свободнцх радикалов при фотохимических реакциях хлорофилла и его аналогов о «ономерном в агрегированном состочнии, исследование зависимости свойств радикальных продуктов от струотуры пигмента и роли, выполняемой ш в процессе фотосинтеза,

^аучцая, новгпн^. Разработан ыетод раздельного обнаружения радикальных форм пигментов, доноров и акцепторов элистрона, осао-sai!Hiiil на различии в длительности жизни в реакционное способности образуются радикалов. С поыокью этого метода при фотооккслекии фотостатетическкх пигментов в мономернсм состоянии измерены катя-ui-радикалыше формы бактерисхлорофидла а, бактериохлорофидла OaKVериовиридша, хлорофилла а, яри фотовосстановлении - анион— радикалы баз:тераохлорофклдов а и fit хлорофилла а, цротохлорофидяа и безиагниевых протгзводных этих пигментов. Показано, что свойства катион-радикалов хлорофилла я его аналогов определятся степенью восст&новленнссти пигмента в ряду б акт ервохдор ин — хлорин - пор-фин. Обнаружено, что характер спектров ЗПР аиюн-радикаяышх фор« шга&втов зависит от природы донора электрона,

Установлено, что при переходе от мовомерного состояния к агрегированному изменяется способность хлорофкллов к образованию ка- ■ тиой- и анион-радикалов. Малоагрегированвые фоцш пигментов способны к быстрым обратимым окислительно-восста-овигельным фотопревращениям., При увеличении степени агрегации снижается фотохимическая активность агрегированных фор«. Агрепфование пкшентсв сопровождает сн появлением темнового сигнала ЭПР. Характер тшновых сигналов ЭИ? позволяет сулить о степени делокалнзации иеспаренного электрона, связанной со степенью упорядоченности агрегированной структуры.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XI Всесоюзном совещании до фотохшии, Сухуми, 1974; симпозиуме "Пиг-мзнт-би^гоше комплексы в фотосинтезе" 7J научно-координационного Ci_тесания СЭВ, Сегед, 1977; Всесоюзно* конференции "Эволюционная и происхождение жизни";' Ереван, I97B; 1У Биохимическом с^саде^А'смашрад,-1979 и были представлены на конкурсе научных : -.Сот'^^птута- ОЕОХЕЛии.'Ш. А*Н.Б«ха ЛН'-ССР , 1275 г.

• Пуб.-да'5?уиа'^По>цагериьла1А диссврт'аоии опубликованrt 13 работ.

t Обь ея "работы.. Диссертационная .работа состоит"из- введения,. обзора литературы-(2 главы)»„экспериментальной части (5 глав), обсуждения результатов ..вывалов и списка лот ературы (370 наименований ) .Дассертация изложена на 156 стр.. (без списка литературы) и. содергиг 37 рисункоа.

. ЭКСЖР11Ш£ГАДЬНАЯ. ЧАСТЬ

1Щ0ДЫ;И ОБЫЗСШ-ИССЛЕДОВАНИЯ

Метопы исследования. Образование свободных радикалов,при окислитедьно-восстановит &льшг< фотопревращениях пигментов' исследовали с помощью метода электронного парамагнитного резонанса. Спектры.ЭПР регистрировали на модифицированном отечественном радиоспектрометре типа РЭ-^1301. Расчет величины, g-фактора проводили -'по говестнш значениям е-факторов 3-ей л 4-ой .линий ЭПР поглощения эталона кристаллического . Ма2* в BgO ..Образцы освещала непосредственно в резонаторе ЭПР спектрометра фокусированным CDe-tou ксеноновой ламш ДССЩ-250 через светофильтры, выделявдие спектральную область поглощения исследуемого пигмента. Термостатиру»-щее устройство позволяло изменять температуру в резонаторе от -180 до +50°С х}. Спектра . поглощения измеряли на регистрирующем спектрофотометре Сф-Ю в спектральной области 400-920 км, При обнаружении радикалов пигментов, доноров и акцепторов электрона исходили яз различий в длительности - кх жизни в хоя& освещения л после выключения саета в зависимости от температуры проведения опыта» ,

Объектам исследования были фотосшггетические пигменты в ыономернсм и агрегированном состоянии.. Еактериохлорофпяя а выделяли из кх .ток бактерий Rhodespirillum - rubrua , бактериохлорофши а - ИЗ культуры Rhodopseudomoaaa viridia , 0акт ериовиридш - из бактериальных клеток Cbloropseudomooas ethyllcum , хлорофилла ^ в £ — из листьев крапивы, протохлорофилл - аз- внутренних оболочек семян тыквы сорта "Столовая" по методикам, принятым в лаборатории

Конструировангв и монгая терсостатирущего и осветительного ' устройств бшш выполнены сотрудником Института бгол&сщ В.Н.Беги-чеввд. •

яс) з работе приняты следуште сокращения: оактериохлорофидлы а и

2 - Вся а в Езсл 2; баетерговвридин - Ева; хлорофилл 3 - Хд я; протохлорофилл - Пхл; бактернофеофитшы & и )i - Б|ф а и Бфф а; -феофятЕн ^ — SO Si сротофеофитин — Пфф,-

фотобиохимии Института с конечной хроматадрафической очисткойна колонках из сахарозы, Бсэкагкиеше аналоги ШЕГментов получала путей обработки эф1фНого раствора соответствующего пютента соляной кислотой, последующего промывания водой дда удал^чкя кислоты и высушивания над прокаленным Ka^so^.

Исследуемые раствори помечали в стеклянные ампулы диаметром 3-4 ым.- Вакуумирование образцов (до 10"^ км рт.ст.) осуществляли при многократном чередованив заморачиванш в жидком азоте и разно--' ракизания до комнатной температуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ ^СЛЕДОВАНИЯ.

I. ОБРАЗОВАНИЕ СВОБОДШ РАДИКАЛОВ ПИГМЕНТОВ ПРИ Ф0Т0-

0К1ЮЛЕШШ '

Первичный акт фотосинтеза связан с фотопереносом электрона, от хлорофилла (бактериохлорофилла) реакционного центра к первичному акцептору; в связи с этим представляет-интерес обнаружение катион-радикальных фор:д пигаента и. аннон-радикалов акцептора электрона , образ ущихся при реакции фотошмяческого окисления хлорофилла и* его аналогов в модельных 'системах,

I.-Бактернохлорофилл а."

Обратилоо фотоокпеление Бхл а хинонаии было обнаружено и исследовано в нашей лаборатории (Красновский, Войковская,-1951; Крас-новскнЗ, Дроздова,, 1963—IS65). Однако образование свободных радикалов в реакциях фотоокислекия Ехла не было тэучено. •

Акцептор электрод - Ц-^£Н2£2ШШга* Мы - исследовали фотореакцию: Бхл а с п~бенэохинонам, на.цршере кс горой - отработали принцип обнаружения свободных радикалов при окислительно-восстановительных фотоьре^раценяях пишёнгов, .основанный..на существовании различий. в длительности низки образунщхся радикальных, продуктов. -

Освещение крагнш светом растворов Бхл а и д-бензохинона в этаноле в вакууме приводило к возникновении снаглетного сигнала-ЗПР с лН=13 гс ц е=2(0025.~ Этот с ¡гнал наблвдался при темпера-турз от -160 до +10° ; в диапазоне температур -160 * -70° он дли-тианое врегля сохранялся, а цри -70 + +10° медленно уменьшался в темноте после светового импульса,. Действие белого возбуждающего езета на растворы одного д-беизохшюна в этаноле при температуре -70° и виге вызывало появление шггикомпоьвнтного сигнала ЭПР семи-хтагана, который, в отличие от синглетного, в темноте с^азу же ио-

чеэад. Раствори одного Ехл á в этаноле или одного а-бензохшюна в этаноле дахе при длительной освещении красным светом не давали измеримых сигналов ЗПР.

Приведенные данные сввдетельствутгг о той, что синглетныЗ сиг-нзл, воэннкапкхЯ в результате фотохимического взаимодействия Ехл § с а-бензохянонсм. принадлежит катиок-рщшкалу пигмента, а не оемкхянону; хатвом-радикальная форма Бхл § довольно стабмьна и при низкой температуре мелет долгое время сохраняться в темноте, тогда как сейросиногошй радикал обладает малой длительностью жизни. Вадо предяолохено, что именно нестабильность семихинона слухи? условием стабилизации катион-радикала Ехл а.

Ппгоода синглетноро сигнала. Исследование зависимости формы к ширины линии ЭПР радикалов пигмента и хзшоаа от температуры доказало, что оба-радикала наблшаотся во все» изученном температурном диапазоне от -160 до +10°. Однако если форма я ширина линии синглетного сигнала практически не изменялась в этом интервале температур (синглет с «№13 гс), спектр семихянока существенно зависел от температуры. Так, при -70 * +10° он представлял собой понтет с хорошо разрешенной сверхтонкой структурой! по мере понижения температуры пихе -70° структура его сглаживалась, и при температуре -100° и ниже он приобретал вид синглетной линии с дН=3 - 10 гс i g=2,0046. Ери этом длительность жизни семихннонного радикала несколько увеличивалась и становилась, измеримой, что давало возможность сравнить скорость исчезновения сигналов ЭПР радикалов пигмента и хинова. СинглетныД сигнал с л11=13 гс, фотоиндуцированный красшы светом в системе Ехл а -д-бензохинон при -110°, после небольшого падения в темноте за первые 2-3 мин практически не изменялся, тогда как синглетный сигнал семихинона ( дН=Э-10 го), воэнихашдЭ при освещении белым светом раса вора д-б енэохзшола » этаноле при -110°, полностью исчезал за 2-3 мин темноты. Из этпх пяттугт следует, что в системе Ехл - хинон на свету мы наблкяаеы суммарный спектр сигналов ЭПР обоих компонентов системы: окисленной -форлы пигмента и восстановленного д-бензохинона» однако из-за близости s-факторов происходит наложение линий-ЭПР. После выключения света в первые 2-3 мин темноты оадгкал хинона исчезает, так как он обладает меньшей длительность!) лизни по сравнено* с радикалом пигмента. Исчезновение семтаинонного радикала происходит, по-видииочу, в результате реакции диспропорционировакпя, идущей в

этих условиях быстрее рекомбинации образушкхся радикалов,.Отсутствие в спектре ЭПР сигнала семихинона при температуре вше -70 * •-SQ0 можно объяснить тем ¿ что в этих условиях, стационарная концентрация семтошона благодаря малой длительности его жизни слишком низка, чтобы внести изменения в форму светового спектра ЭПР системы Ехл - хинон. .

Исследование температурной зависимости показало,.что в диапазоне от -20 до -155° скорость нарастания и интенсивность сигнала. . ЭПР катион-радикала Ехл а увеличивается с понижением температуры. Они минимальны при -20° к максимальны при -150°, причем минимальной скорости увеличения интенсивности симглетного сигнала на свету, соответствует максимальная скорость ее падения в темноте.

Акг'чптор электрона - убихинон. Освещение красным светом растворов Ехл а иубихинона в этаноле при температуре -160 » +20° приводило к возникновения сдаглетного сигнале ЭПР с дН=13 гс и g =2,0025, долгое время- сохранявшегося в темноте. Спиртовые ра~т-воры одного убгосшюна на белом свету при температуре вше -70° давали пят «компонентный спектр сешосинона, исчез алшй сразу же после выключения света.

11э полученных результатов следует,.что при взаимодействии Ехл S с различными акцепторами электрона (тт-бензохкнон, убюслнон) образуется катион-радикальная форма Ехл а с лН=13 гс и g=2,0025, устойчивая в широком диапазоне температур. .

Бхл а с кнелотюдом,воздуха в тптту.ътипе. В нашей лаборатории подробно исследовано фотовосстановление хлорофилла и! его аналогов в пиридине (Красновский, 1060). Фотоокисленве пигментов в пиридине не Наблюдалось, самыми благоприятными для фотоокисления и стабилизации катион-радикальных форм пигментов считались кислые среди (Евстигнеев и др., 1971; Ким и др., 1974,1075). Нами было показано, что фотоокисление Ехл а кислородом наиболее эффективно Едет в пиридине. Освещение красным светом рас воров Ехл § в пиридине в присутствии кислорода воздуха при температуре -40 --50°, близкой к температуре замерзания растворителя, приводило к количественному.перехеду. исходного Ехл а в радикальное состояние: возникал синглетный.сигнал ЭПР с ьН=»12 гс в 6=2,0025. Концентрация образующихся свободных радикалов соответствовала концентрации исходного пигмента. Этот переход сопровождался полным исчезновением полос поглощения в видимой области, причем ноше полосы.

поглощения не появлялись. Реакция была обратима.

Таким образом, Ехл а в пиридине обратимо окисляется кислородом воздуха с образованием радикальной Формы, сходной по параметрам сигнала ЭПР с сигналами, вознгошпцими при фотоокислекии пигмента другими акцепторами электрона.

^&отоокяслрнио в растворе детергента. Фотохимическое образова-1ше свободных радикалов при окислении Ехл а д-бензохиноиам наблюдалось не только в органических растворителях, но и в водных растворах детергента тритона X-IOO, где пигмент находился з мицелле детергента, а хлнон — в водной фазе. Опыты проводились в температурном диапазоне -160 ♦ -50° при рН 5,2 и 6,8, причем интенсивность сигналов ЭПР зависела от рН средн. Ецло показано, что элементарный механизм взаимодействия Ехл а и гг-бензохиюпа в мяцедле детергента такой же, как и в растворе, и специфика среды сказывается лень на скорости процесса.

2. Бактериохлорофилл в Образование свободных радикалов в реакции фотоокисленги мы исследовала ка примере другого бактериального пишента, бактерио-хлорофялла д. Фотохимические свойства Бхл в изучались ранее (Красновский, Бокучава, Дроздова, 1973,1274).

Акцептор электрона - ц-бензохинон. При освещении красны.! светом растворов Ехл £ и д-бензохинона в этаноле возникал синглетный сигнал ЭПР с лК»14 гс и g=2,0Q25* Этот сигнал по своя« характеристикам был сходен с сигналом катион-радикала Ехл а; он также-наблюдался в интервале тешгератур от -160° до +10°. Очевидно, при фотоокислении Бхл как и прп окислении Ехл д, образуется стабиль ная кат ¡¡он-р апикальная форма пигмента.

Несмо ря на общее сходство, радикальные продукты окисления Сактериохлорофиллов различались по длительности жизни. Если сигнал ЭПР.катион-радикала Ехл а часами сохранялся в темноте при температуре ниже -70°, то сигнал катион-радикальной формы Ехл в в этих же условиях исчезал в течение нескольких минут и'дазе при -110° быстро уменьшался по интенсивности после выключения света. Только при температуре ниже -135°, то есть в'замороженной матрице, удалось стабилизировать катион-радикал Ехл в. Эти данные свидетельствуют о большей реакционной способности окисленной радикальной формы Бхл п по сравнению с аналогичной формой Бхл

Зависимость от конпентрацгпт. Синглетный сигнал радикального

продукта окисления' Вхл а вйледствкэ его значитедънсйустойчгвостм можно било наблпдать в довольно широком; интервале концентраций окислителя (I0"2 ♦ ГО"^!), тогда как фотоиндуцироваюшй втемновой спектры ЭПР, принадлеиещие катион-радикалу Ехл е, в наиболее отчетливей форме регистрировали, яра оптимальной концентрации д-бен-зохизюна 5-I0~Sj,

Влияние гляп^ривз.. Известноt что глицерин оказывает замедляющее действие на ход прямой и обратной фотохшической реакции, увеличивая вязкость среды аналогично понижению температуры. Добавляя глицерин к раствору Ехл £ и ц-бенэохинона в этаноле в количестве 20, 40, 50£, мы.смогли повысить предел наблюдения синглетного сигнала ЗПР до +20° п замедлить ход,обратной.реакции - исчезновения синглетного сигнала.

-Акцептор электрона - убихирон.. Использование убихинона в качестве акцептора электрона привело к результатам, аналогичным полученным в опытах с п-бензохиноном.

Фотоокисление в растворе детергента. Фотоокислеше Екл £ д-бедаохинонсм изучалось в водных, растворах детергента тритона Х-100 при различных pH среды,и разных концентрациях хивона в широком интервале температур. Катион-радикальная форма Ехл в оказалась менее стабильной в этих условиях, чем катион-радикал Ехл а, поэтому наблкдаеьый сигнал ЭПР с аН=14 гс"й: g=2,0025 характеризовался небольшой ингенсивностью.

Фотоокисление хлоро^иллоподобного птюдукта. Мы исследовали фотоокисле кие стабильного хлорофилле подобного продукта окисления бактериохлорофвлла а, чтобы показать, как меняются свойства катион-радикальных tfopt* пигментов при переходе от структуры бакте-риохлоркпа к структуре хлорина. ■

Для получения хлорофидлоподобного продукта с максимумом поглощения при 630 !Ш Ехл g. йыл окислен кислородом воздуха на свету. Освещение краеншл светом растворов этого пигмента с ц-бенэохино-ном в этаноле в вакууме не приводило к возникновению устойчивого синглетного сигнала ЭПР, характерного для окисленных' бактериохло— рофиллов. Вместо этого на свету мы наблшалл спектр сешгошона, который исчезал сразу же после выключения света. Полученные ре- • зультаты подтверждает предположение о том, что продукт окисления Ехл з о максимумом при 680 нм представляет собой хлорофидлоподоб-ное соединение и что переход от структуры бактериохлорина к струн-

туре хлорина в результате отвятгя даух атомов водорода в положении 3-4 от. молекулы бактеркохлорофилла существенно изменяет окислительно-восстановительные свойства готлента..

Таким образом, н&чи зарегистрированы катион-радикалыше формы бакгериохдорофкдлов а характера ушке сл устойчиво стьк» п широкого диапазоне температур.

3. Еактерпозиридга(;хлсро^плл а

Свойства радикальных продуктов фотоокисленля пигмента, имеющего - структуру хлорин!*, были.рассмотрены нами на примере пишента. зеленых бактерий бактериовиридша. Обратклое фотоокисление Бон кислородом и хамском изучалось в работах Красновского о соавторш.ш (1959,1967,1963,1964) и Евстигнеева о соавторами (1967,1969), были ¿эмерены электронные спектры поглощения промежуточных продуктов реакции,-Мы сс следовали у слов ля обнаружения и свойства радикальной о^кслешюЯ формы Бвн, воз ник аллей при ^отоокислении пигмента.

Фох^^пслркие фактериопигждгу.а р-^ его ох сто ном. Освеиеике красным светсм растворов Бвн и п-бензохинона в этаноле в вакуум:е при температуре —160 + —90° приводило к возникновении синглетного сигнала ЭПР с л Н=И гс и g=2,002S, который после выключения света приблизительно за 2 мин уменьшался по интенсивности, а осташяйся сигнал долго сохранялся в темноте. Время уменьшении и стабклгзацки этого сигнала соответствовало времени исчезновения сигнала SUP се-шхинова, воэншагщего при освещении белым светом растрора п-бен-эосиюна в этаноле в том же интервале температур. Полученные данные позволяли нам приписать'стабилизированный в темновых условиях сигнал ЭПР катион-радикалу Бвн..

При более высоких температурах сингл*, гный сигнал радикального продукта окисления Евн вследствие его нестабильности не наблвдал-ся. Мы предположили, что в этих условиях катион-радикальная форма пигмента претерпевает дальнейшие фотохимические превращения, приводящие к образованию непарачагнитных продуктов реакции. Для про- ■ верки этого предположения синглетный сигнал катион-радикала Евн генерировали на свету при -110° и выдерживали в темноте в течение времрнк, достаточного для рекомбинации радикалов сеыихдоояа. После этого быстро повыпали температуру и записывали спектры ЭПР. Оказалось, что а темноте в отсутствие других радикальных продуктов реакция (в данном случае семихинонных радикалов) каткон-радш^альная фориа Бвн довольно стабильна и ее можно наблюдать дс температуры

- ю -

-20°. . ' :

Фоурокисление хлорофилла а п-5§Ю52Ш2В£$** С'целью подтвер-вдення результатов, полученных ка примере бактерповиридина,,и для сравнения с данными по бактериохлорофшиам а и £ «и исследовали : ойразовшше свободных радикалов при фотоокислении хлорофилла а-д-дензохиноном, хотя в литературе имелись сведения по атшу;вопросу (Бобровский, Холмогоров, 1971; Евстигнеев и др., 1971),

Катион-радикальцую форму ЗОга удалось зарегистрировать благодаря использованию того же методического приема, который дал воз- - ■ можность стабилизировать катион-радикал Евн,- Освещение красным светом растворов Хл а и хинока в этаноле в вакууме при температуре -110° приводило к возникновению сикглетного сигнала ЭПР с лН=8,5 гс и ."=2,0025,,по-видимому, представляедего сумму двух спектров ЭПР: - катион-радикала Хл а и анион-радикала д-бензохинона, После выдерживания образцов в темноте при -110° в течение 10 м:ш сигнал уменьшался по интенсивности и затем сохранялся а темноте. Так гак 10-минутноготемнового периода достаточно для.рекомбинации семихи-ноннюс радикалов) остающийся в темноте сянглетный сигнал о &IU 8,5 гс и 6=2,0025, можно приписать катион-радикалу Хл а. Он обладает гораздо меньшей стабильностью по сравнению с каткои-радика-лом Бон и уже при -80° исчезает в течение нескольких метут.

Таким.образом» при переходе от структуры бшетериохлерина к структуре хлорина стабильность окисленных радикальных <*орм уменьшается. Катион-радикалы Евн.и Хл & можно зарегистрировать лишь при отсутствии условий, способствутаих их дальнейшим превращениям (свет, другие радикальные продукты).

4, Лротохлорофилл Дкя сравнения о исследованной ранее способностью к фот-, окис-лент штлевтов бактер.иохлоркновой и хлоргеновой структуры изучали фотоокисдение пор^ириноподойного соединения протохлорофилля д-бен-30Х1М01ЮМ. Действие красного света'на растворы протохлороф^лла и п-бензохинона в этаноле в вакууме при температуре -160 * +30° при- ' водило к образованию свободных радикалов. В интервале температур . +30 * -Э0" фотоищуцируемый сигнал ЭПР представим собой пяткком-понентпкй спектр семюсинона; при более низких температурах - сенг-летну» лянип'ЭПР с л Ы=8 гс и g-фактором,.близким к g-факто-ру свободного электрона. Однако кинетики исчезновения сигналов 2ПР, появлягхокся при освеиении красным светом растворов Пхл и хи-

нона и белым — растворов ¡одного хикона в этаноле, били практически одинаковы при —160 +■ —100°. Возможно, катион-радикал Пхл не удается зарегистрировать, так как длительность его жизни меньше,-чем длительность жизни анион-радикала д-бензохиисна, ко более вероятно,:что наблюдаемые спектры ЭПР обусловлены сетшшонкти ра-ддкшшю!, позкскалдага на белом свету в реакцяи кинона с.растворителем: иле на.краснсы свету в -сенсибштэкрованноЯ протохлорофвллом реакилимеаду молекулами хгаюна и^растворителя пли примесей.

Из приведенного материала следует,.что Ехл а и Бхл д характе-ризушся устойчивость г катвон-радккальпшс форд по сравнетш с се-мжатошшми радикалами,, поэтому сигналы ЭПР катион-радикалов этих пигментов можно наблюдать ь широком интервале температур. Переход от структуры бакт ериохлорина к структуре хлорина значительно меняет окдслительпо-восстановительные свс'!стьа молекулы, что в свою очередь сказывается на свойствах продуктов окисления. Действительно, длительность жизни катион-рвдикальких форм Евя я Хл а соизмерима. с длительностью жизни семтсинонннх радикалов, и регистрация спектров.ЭПР катион-радикалов* пигментов,, вдешгос хлориновую структуру, представляет значительную трудность., Катион-рздкг:адьную форму Пхл не удается обнаружить, что согласуется с его известкой устойчивостью к окислению, обусловленной наименьшей степенью восста-новленности полуизолированных даойнах связей по сравнению с Хл и " Ехл.

Результаты работы позволяет заключить, что свойства катяон-радакалов хлорофилла а его аналогов осределнпгсй в первую очередь степенью восстанозлекности пигмента в ряду бактериохлорин - хлорин - сор£кн. По устойчивости катион-радгкалькых форы пкшенты мбжно расположить в последовательность: Бхл ,Еи в> Евн> Хл а> Пхл.

II. ОЕРАЗОаШЗЕ СВОБОДНЫХ РАЕКШОЗ ПШЕНТОЭ. ■ ' ПРИ ФСТОВОССТАНОВЛЙЕШ

Исследованию фотовосстановленвя хлорофилла г его аналогов посвящены многие работы нашей лаборатории, спектральнши методам и истодом потенциометрет подробно изучены свойства восстановленных форм пигментов (КрасновскиЯ, 1960,1974). Так как в настояэее время считается, что первичным актом фотосинтеза является фото-октсление хлорофилла и бактериохлорофилла в реакционном центре, большое вншание в литературе уделяется изучению фотохим^ческог.

окисления пигментов и образовании их кат ион-радикальных форы в первичных фотореакциях in vivo . Однако в последние годы появились данные о том, что анион-радикалы пигментов участвует в первичных процессах фотосинтеза, поэтсму представляло интерес исследовать радикальные продукты, фотово становления хлорофилла и • его аналогов в модельных системах.

I. Еактериохлорофлял;: бактержофеофитин

Донор электрона - аскорбиновая кяслота. Осзепенге' красным-светом растворов бактеряохлорофидлов а ИЙИ бактериофео фитинов § и в .б аскорбиновой кислотой в пиридине при температуре —50 * -50° приводило к возникновению бесструктурнис синглетных сигналов ЭПР с лН=12~13 гс и е-2,003. В контрольных опытах с:аскорбиновой кислотой при этой температуре отсутствовал сигнал мснодепи-роаскорбиновой кислоты'(дублет-с дН=Г,8 гс!который появлялся при более высокой температуре, что свидетельствует о прянаддежнос-■ ти набждаатах спектров ЭПР восстановленным радикальным Горела:* пигментов. По мере повышения температуры проявлялась неустойчивость О1шон-радикальных форм бактераалышх иггаентов, которые можно стабилизировать понижением телтературы почти до температуры: замерзания растворителя. ■ ■ .

Донор злеу^-ро^а - суль^а натрия. Растворы бактериохлорофил-лов а и £ и бактериофеофитинов а и £ я в пиридине освеыали

1фасшм светом при. температуре -10 ■*■ -20°."При этом в случае Ехл £ появлялась синглетная линия со слаборазрезенной сверхтонкой структурой* С Бхл g при всех исследованных условиях удалось зарегистрировать только следовой сигнал ЭПР. В отличие от магниевых комплексов пигментов Оактериофеофиткны давали спектры СП? с хорооа_-|4 разрешенной СГС.

' Исследование температурной зависимости сигнала ЭПР показало, что наибольший-выход радикальных продуктов бил при -10 v -50°, то есть около температуры замерзания растворителя, однако при этом каблвшались* спектры ЭПР с менее разрешенной СГС, 6=2,003 и полушириной около 13 гс. При понижении температуры ниже -50 * -СО0 сигнала ЭПР на свету полностью отсутствовали. Повыаение температуры ВЕие -40° до +20° приводило к постепенному уменьшению интенсивности светоиндуцированного сигнала до его полного исчезновения при температуре больше +25°. 3 наши опытах наблюдался только один тип спектра ЭПР в реакции Ехл и Бфф с ría^S ' . Тек как Гв^г при

окисления не дает радикалов, регистрируемые:сигналы 11017т принадлежать только радикалам ттяента..

Наличие сверхтонкой структуры у; сигналов ЭПР, воэникапокх при «Зотовосстановленжи. Ехл а. Бфф Па^2 • в отличие от опытов : с аскорбиновой кислотой, возможно, указывает на разный характер взаимодействия пигментов с аскорбиновой кислотой;« На^.

2. Хлорофилл

Донср электрона - аскорбиновая кисло^- Исследование Фотовосстановления' Хж а я 4ф а аскорбиновой кислотой в пиридине показало, что освещение этой системы красным светом.ери -4-26° вызывает появление спектра ЭП? монодегидроаскорйшюво Й кислоты. СинглеткыЙ СЕГнил с б =2,003 и лН=10,5 гс и дН=13,5 гс для 1л а ж Фф а соответственно удалось зарегистрировать при температуре -40°, близкой.к температуре замерзания растворителя. Так как спектр ЗПР монодегицроаскорбпновой кислоты в этих: условиях отсутствует, мы приписали наблвдаемый синглетный сигнал. анион-радикальшй форме пкшента.

3.. Цротохлорофюи 1 ' Донор электрона - аскорбиновая кислота. Действие красного света на растворы протохлорофидла и аскорбиновой кислота в пиридине при температуре -30° вызывало возникновение синглетного сигнала ЭП? с е=2,0035 к лН=8 гс. В опытах с аскорбиновой.кислотой без пигмента при этой температуре не ваблхшалось фотоиндуцирован-ного образования радикалов монодегвдроаскорбкновой кислоты. Это позволило сделать вквод о принадлежности еингдетной ленееЭПР анлон-радикальней форме Пхл. Аналогичные результаты были подучены, для гротопоруирина,,соответствующего по уровни посстаноаленности полую олировазтнтг двойное связей-оротохлороф&длу.

Донор,, электт>она — гидрохинон. Взаимодействие Лхл с. друлы донором электрона - гидрохиноном в этаноле на красном свету при температуре -90 + -160° приводило к появлению синглетного елгаала ЭЛР с л!Ы1 гс и 5=2,0035, который, как мы показали, представлял сумму двух скнглетных сигналов: одного, принадлехаиего "семи— хзашну (при температуре ниже —90° он имеет вед сингдетной линии), другого - радикальной форме протохлорофидла. После исчезновения сешгхинонного радикала за первые 2-3 мин темноты в. спектре ЭПР оставалась скнглетная линия, обусловленная пигментным радикалов, который был достаточно стабилен в этих условиях.

г

Данои электрона г тряптоЦ^.. При использовании в качестве донора электрона триптофана также наблшался сигнал. ЭПР восстановленной радикальной форта Пхл о дН=8 гс а е=2,00Э5.- Аналогичные результаты были подучены для . протопорфирина,.

Донор электрона - сульфид рагряч. При фотовосстаяовлении - Пхл Яа^з 8 пиридине в диапазоне температур -70 + +10° появлялась синглетная . линия ЭПР с & Н=1Г гс и е=2,0С35. Более отчетливые сигнала наблюдались в опытах о протофеофитиноы. Так как освещение растворов одного Пхл и Пфф в пиридине, а такхе растворов одного На^з в пиридине не приводило к появлению радикальных Гфодутаов, наОлпдаемые сигналы ЭПР могли бить.обусловлены только возникновением ангон^адикадов сштентов.

Рассмотренные данные свкдетедьствуюг о способности Пхл к вое-' становлении различными донорами электрона. Продукты фотовосстанов-ленжяПхд и П£ф всеми исследованными восстановителями характеризуется оинглетным сигналом ЭПР и:спектром поглоценпя в вшшмоЗ области с максимумом при 470 нм.

Таким образом, фотовосстановление хлорофилла и его енатогов приводит к образованию анион-радикальных фор* пигментов, характер спектров ЭПР которых зависит от природы донора электрона.. При фо-товосетановлении аскорбиновой кислотой, гидрохиноном и триптофаном возникает анион-радикалы пягиентов, г характ еризупглеся синглет-ными сигналами ЭПР'без сверхтонкой структуры. Еслн ае в качестве, донора электрона используется сульфид натрия, то образующиеся восстановленные радикальные формы пигментов дают ли^о спектры ЭПР со слабораэреаешюй .СГС (Ехл а, Ехлц) и с хорошо раэрепенноЙ СГС (Бфф а» Ефф а), либо более широкие сигналы, чем с другими донорами электрона (для Пхл П гс о яа^ н 8 гс с аскорбиновой кислотой, гидрохиноном, триптофаном). Наблюдаемые различия в структуре спектров ЭПР восстановленных радикальных фора хлорофилла н его аналогов, вероятно, обусловлены различием характера взаимодействия пигментов с Яа^З и другими донорами электрона.

Ш. СВОБОДНЫЕ РАЕИКШ ПРИ СЕНСИКШШРОВАННОМ ХЛОРОКШШ П2РЕЕ0СЕ ЭЛЕКТРОНА

Известно, что фотосенсийллизирутаее действие является основной функцией хлорофилла при фотосинтезе, поэтому исследовалось образование свободных радикалов в ходе фотопереноса электрона в

тройной;системе донор.аяектрона;— пигмент - акцептор электрона. Шли:изучена системы; аскорбиновая кислота - хлорофилл в - метил-виологен; аскорбиновая кислота - бактериовиридин - метилви'-логен; НАДН- хлорофилл метилвиологен; фенилгидраанн - бактервохчоро-филл д - метилвиологен; .феиилгвдразив - бактериовиршшн - метилвиологен; Нв^э - бактериохлорофнлл £ - ц-бензохинон^не^в -бакгериофвофнтин а - д-бензохинон. При освещении:исследованных тройка систем наблюдали возникновение спектров ЭПР анион-радика-лов акцептора электрона. - пятикомлонентного сигнала семихивона или * сигнала ЭПР восстановленного' ыетЕлвиологена со сверхтонкой, структурой более чем из 35 линий. Спектров катион- или анион-радикальных форм пигментов при атом обнаружено не было. В контрольных.опы- ' тах с двойными системами1 (питент - донор электрона, пигмент - акцептор электрона) были зарегистрированы сигналы ЭПР окисленных и восстановленных радикальных форы хлорофилла ж его аналогов,, а такие доноров и акцепторов влектрона. Следует отметить, что свойства и кинетическое поведение сигналов анион-радикалов акцепторов электрона в двойныхи тройных системах были.различны. Подученные дан-.ные позволяют предположить» что характер переноса влектрона в тройной системе отличен от переноса электрона при окислении шш восстановлении шоменга. ' '

■ ИГ. ФОТОЩШИРОВАННОЕ ОБРАЗОВАНИЕ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ' В АГРЕГИРОВАННЫХ ФОШАХ ПИГМЕНТОВ

Согласно современным пр едет г тлениям антенна и реакционные центры фотосинт ез ируиадх организмов содерз^г агрегированные формы хлорофилла в. В цикле работ Краснов ского о соавторами (1949-1977) почучены агрегированные формы пигментов в исследованы их спектральные характеристики. Представляло интерес изучить» как ценятся ■ свободнорадшшльние свойства пшиентов при переходе сг мономерного . состояния к агрегированному. С этой цель в мы последовали образование свободных радикалов' хлорофилла и его аналогов в агрегированных формах разной степени агрегации в растворах и твердых пленках.

X. Свойства агрегированных форм пигментов в растворах

БактеряовЕдгугш; в фогоеинтезируших клетках обладает характерной по. ооой поглощепя в области 730-750 нм, тогда как в органических полярных, растворителях он слеет максимум около 660 нм. В неполярных растворителях, таких как толуол и четыреххлористый углерод, Бвн образует агрегированные форш о максимумами 680 и, 720 нм, при-

писываемые соответственна димерам и олнгомерам..

Иы исследовали фотоокислегае Евн кислородом воздуха в толуоле,,серном эфире,,этаноле и пиридине. Было обнаружено, что эта реакция во всех растворителях протекает через стадии возникновения свободного радикала, характеризующегося спектром ЭПР: с л Н=9 гс и 8=2,0039,.однако наибольший выход радикальных продуктов наблюдался в. и толуоле, где:пишент находится в агрегированном состоянии. Для всех: исследованных растворителей выход радикалов был максимальным при температуре,,близкой к температуре замерзания.растворителя. ,

Изучение зависимости образования свободных радикалов'от концентрации бактериовиридина в ссх4 при -20° и +20° показало наличие нескольких одновременно идущих реакций в: про»*ессе фотоокисле-Ешя пишента. Екло установлена,.что при низкой:температуре образуется сд_а,_апри.+20° — две радикальные формы со сходными параметрами спектров ЭПР., Из измерения.электронных спектров поглощения следует, что эти радикалы.соответствуют продуктам последовательно- . го окисления двух разных агрегированных форм бактериовиридина -680 И 720 нм.

Выход, свободных радикалов при окислении бактериовиридина в агрегированном состоянии значительно йолыпе, чем в монсмерном, однако скорость выцветания пигмента в мономерном состоянии превышает скорость его выцветания в агрегированном.-Это означает, что агрегация защищает пигмент от деструктивных превращений и способствует стабилизации первичных фотопродуктов, имеившх радикальную ' природу. .

Такек образом, агрегированная форма бактериовиридина.с низкой степенью агрегацтл "пособна к фотоикдуцированному образованию свободных радикалов в присутствии кислорода воздуха; фотоокисление пигмента в этих условие протекает аналогично его фотоокислению в мономерном состоянии.

ХлордДшщ. Освещение красным светш растворов Хл а в ссх^ приводило к возникновению сиыглетного сигнала ЭПР с & Н=Х0 гс и 6=2,0034, медленно исчезавшего в темноте после выключения света. Максимальный выход радикалов наблюдался при температуре -20°, близкой к температуре замерэангя растворителя, которая, по-ввдшо-му, является оптимальной для образования агрегатов (возиохно, дц-меров) хлорофилла и стабилизации первич: п продуктов фотоокисле—. кия пигмента.

fryjупитуюгюФилл. Исследовалось образование свободнчх радя-кадоз ахрегировадоого бахтернохлотафидла & а метаноле. Бхл а метаноле ори нвзкоа концеитрации {10~т1) находится в моншерном состояния. Увеличение концентрации пгтмента (10^ * .10"* И) вьпзывает его агрегата», возможно, яривключеяиимолекул метанола в агрегированную структуру Вхл(Крлсновсяяй* др., 1972).

Ехл s метаноле образует агрегаты более высокого поряд-

ка so сравнении о агрелрованнши формами Езн К Хя в неполярных растворителях, что приводит к полвленкю новых спектральных и ЭП? свойств. Тах, образцы Бхл в «отаноле дают вцрисутствки воздуха темновой сигнал SDP о лН»12 гс и £«2,0027, который не изменяется в интервале температур -60 * +20°. Разбавление раствора вызывает исчезновение этого-сигнала. При освещении красным светом на--блиаается небольшое обратимое в темноте увеличение его интенсивности, что свидетельствует о снижении фотохимической активности пигментов при переходе от агрегированных фор! в низкой степень» агрегации к более высокоагрегироваюшм структурам.

2. Свойства агрегировании: фор« пигментов в твердых плевках

В твердых пленках пигменты. образуют два типа агрегатов; с малоупорлдоч енной С бакт ервохдорофиля) и высокоуворядоченной Í бак-териофеофитин) структурой, характеризующихся разными ЭПР свойствами.

Баку епиохло-ройалл. Твердые пленки Бхл g, полученные испарением эфирных растворов, в вакууме не обнаруживали спектров ЭПР.После пуска воздуха в темноте появлялась широкая линия ЗПР о дН=12-13 гс и'. 6=2,0039. Темновой сигнал набдгдался таете в вакууме у пленок Ехл, полученных из иетазодовых растворов н из растворов в серном эфире, в присутствии д-бенэохиноня. При освещении красным светом интенсивность теинового сигнала везначжгельно уврвпивалась. Тот факт, что широкий спектр ЭПР.в пленках Ехл наблюдается только в присутствии акцептора электрона - кислорода ш хиаога, показывает, что он возникает в результате взаимодействия шшденза с акцепторами электрона,

£пктетэиобео&итта. Твердые пленки Ефф а, полученные путем зспарения эфирных растворов л содержащие агрегированную форму 860 ai. Давали в темноте в вакууме интенсивный узкий сигнал ЭПР с лЕ=1,8-2,6 гс и 6=2,0027. Примесь Ехл приводила к исчезновению узкого сигнала, что, по-видимому, связано с варупением структуры агреге-рованного пишента. ; . .

Узкий сигнал ЭПР о темновых условиях регистрировали в интервале температур -150 4- +30° бег изменения интенсивности. Освещение пленок Бфф красным светом приводило к заметному возрастания интенсивности спектра ЭПР, ширина которого при атом не изменялась. Све-тоиндуцируемый сигнал пленок Бфф обнаруживал характерную температурную зависимость. С повышением температуры от 150° его интенсивность увеличивалась, достигал максимальной величины при +20°. . После действия гзета оигнал медленно подал до исходного уровня. Однако, когда температуру образца в темноте после осве^екш резко повышала на 10-20°, сигнал мгновенно умекьешгел до темнового уровня. Различное поведение темнового и светового сигналов ЭПР 2|ф в зависимости от температуры может свидетельствовать о разком происхождении обоих видов парамагнетизма. Возможно, что при формировании агрегированной структуры неспаренккеэлектроны возникают за счет перераспределения электронной пдотности между молекулагл: Бфф. Светоиндуцлруefшй сигнал может появляться при переносе электрона мехду двумя соседнши молекулами пигмента; при этом одна молекула играет роль донора, другая - акцептора электрона; следы кислорода могут также играть роль акцептора электрона.

Наблюдаемое различие в.ЭПР свойствах твердых пленок Ехл и Бфф, счевсдао, связано с разными способами мелмолекулярного взаимодействия в агрегированных фортах этих пигментов. Создание высо-коагрзгЕрованноЙ структуры Бфф обусловлено взаимодействием х-эдектроншх систем молекул пигмента.

ррурхлороФилл. Пленки Пхл о максимумом поглощения при 635 1Ы, полученные путем испарения раствора пигмента а серном эфире, в темноте в вакууме не обнаруживали сигналов ЭПР, Освещение образцов белым светом при ксынатноЙ температуре приводило к появлению широкой линии ЭПР поглощения о g»2,0042 и поду: иршгой около 15 гс, возникавшей, вероятно, щ>з переносе электрона между соседними молекулами агрегированного Пхл; акцептором электрона могли также служить следы кислорода.

Такт образом, проведениие нами исследования показали, что раствори пигаевтов с низкой степенью агрегация (Евн и Хл в cci4 и толуоле) не дагг темновых спектров-ЭПР; фотоокисление пигментов з этих условиях протекает аналогично их фотоокисленн» в мономерном состоянии, причем агрегация способствует стабилизации первичных радикальных продуктов. Увеличение степени агрегации {Ехл в метанолетверзще пленки Бал) сопровождается возникновением темно-

вого сигнала ЭПР. При атом снижается фотохимическая активность агрегированных форм пигментов, Твердые пленки.Бфф в темноте в вакууме обнаруживают интенсивный узкий сигнал ЭПР, значительно возрастающий при освещении. Особенности этой радикальной:$ojwa связаны с высокой степень» агрегсшш Ефф и упорядоченностью агрегированной структуры.

3 А К Л » Ч Б Н И Б -о

Сункцискирование хлорофилла и б актериохлорофилла в реакционных центрах фотосистем связано о образованием свободных радикалов. Основным методом регистрации первичных радикальных продуктов реак-переноса электрона является спектроскопия ЭПР. Благодаря применению этого метода к исследованию окислительно-восстановительных фотопревращений пигментов установлено, что в ходе первичного фотопроцесса хлорофилл фотосистемы X и Н и - бакт ериохлорофилд d реакционных. центрах подвергаются обратимому окислению с образованием катион-радикалов: П700+* в П680+* и Ш70+*. В последнее время появились данные об участии анион-радикальных форм бактериофеофкгккг и феофктица в первичной фотохимии ta vivo , обнаружены сигналы £ПР, приписываемые восстановленным первичным акцепторам электрона в фотосинтезе растений.и бактерий и другим компонентам электрон-транспортной цепи. Однако химическая идентификация спектров ЭПР, наблюдаемых в живых организмах,.возможна только при изучении простых модельных систем,, включавших хлорофилл.

В настоящей работе проведено исследование образования свободных радикалов при фотохимических реакциях, глорофилла и его аналогов в мон^мернсм состоянии. Зарегистрированы катион- и анион-радикала ряда фотосинтетических пигментов. Наиболее устойчивой из всех катион-радикальных форм оказалась кат ион-радикальная форма бакте-риохлорофилла; ее можно было наблшать в широком диапазоне температур. Выход радикальных продуктов зависел -от природы акцептора ' электрона, от используемой среды л был максимальным щ>и фотоокис-ленди бактериохлорофидла кислородом воздуха в пиридине. Катион-радикалы бактериовиридкна и хлорофилла менее стабильны, поэт ху их удалось обнаружить только в темновых условиях в отсутствие других радикальных продуктов реакции. Образование окисленной роди- -калькой фюрмы протохлорофилла при фотоокеслении не было показано. По-видимому, свойства катион-радикалов определяются в первую очередь степенью восстановленности.пигмента, и з раду протохлорофклл — хлорофилл — бакт ериохлорофилд наблюдается увеличение склонности

к окислению и устойчивости катион-радикальных фо^м.

Фотовосставсвлеяие хлорофяма:* его аналогов приводило к образованию аалон-роЕпладов пигментов, хярштер спектров ЭПР которых зависел от природы дснйра электрона: спектры ЭПР восстановленных радикальных фор* одного * того хе пхтышла различались жди по ва-рине лиижи, .или по структуре» пряча« - о феофитю/агса была получены более четкие результаты, чв* С; Не -кошлексши шсгмевтов. Hadaa>-даекые различ». в спектрах ЭПР анион-радикальных форм хлорофюиов могут свидетельствовать о различии в характере взатодействия пит- , ментов о раззных донорами «дейтрона.

Исследуя, как иеяявгск свойства хлорофилла и его аналогов при • переходе от моншеряого состояния к агрегированному» мы обнарухи-лж,.что раотворы пигментов, содерхвсив агрегированные форш с нго- ' кой степенью агрегация, споообны к фотоиндуцированному образованию свободных радикалов в приоутствии кислорода воздуха. Фотоокисление пжгментсв в аткг условиях протекало аналогично их фотоокисденоо в мономерном состоянии.- Увеличение степени агрегации приводило к сншению фотохшгеческой активности агрегированных форм пигментов. При этсм наблюдалось появление темпового сигнала ЭПР, Повыпение устойчивости пигментов к быстрьм обратшш окнсдктельно-восстано-внтедьным < превращениям по мере увеличения степени агрегации находится в соответствии о антенной функцией» выполняемой агрегировавших пигментами в процессе фотосинтеза.

Особое место среди агрегированных форм пигментов занимают твердые шеенки бактериофеофитина» которые дают в темноте в вакууме -узкий ссгаал ЭПР с д f 1=2-3 гс и 6=2*0027. Узость линии ЭПР объясняется делокаяизалией неспвреиного электрона по многш молекулам пютсеата в агрегате, обусловленной высокой степенью упорядоченности агрегированной структуры. Расчет, проведенный по методу Кагца (Eata et »1.,1973), показывает» что неспасенный электрон делокализевая по 50 молекулам бавагриофеофюина. По способности к образованию упорядоченных агрегированных структур бактериозе офит ан сходен скорее с хлорофиллом (Хатогоров» Теренин» 1961), чем со своим магниевым комплексом, так как только для хлорофилла и бакте-ргофесфтггжва показано наличие узкого темно во го и сиетояядуцирован-ного сигналов ЭПР в агрегированных формах этих патентов. Тот факт, что у фотоежвтезиругщих организмов не обнарухено стабильнчх темповых и узких фотоншагцируемыг сигналов ттгментов, свидетельствует об отсутствии яхж о иалоЗ концентрации выеокоагрегированшх сос-

тояний б ант ёгошх формах пигментов in vivo . Однако по характеру спектров ЭПР можно судить о степени агрегации и об особенностях структуры агрегированных форм пигментов в модельных системах*.

Исследование образования свободных радикалов при фотохимических реакциях-пягкгнтов показало, что сигналы ЭПР, наблюдаемые при 3-отоокислении мономерного бактериохлорофллла а,, бактериохлорофллла £и хлорофилла а, ..сходны по своим параметрам со спектрами ЭПР,воз-никаищими при освещении реакционных центров фотосистем, и могут быть использованы для интерпретации природы, элементарных процессов фотопереноса электрона.

ВЫВОДЫ

I.Методом ЭПР исследовало фотохимическое взаимодействие бак-териохлорофилла а, бактериохлорофклла.в, бактериовиридина, хлорофилла а» протохлорофалла и их безмагниевых производных с акцепторами электрона (а-бензохинон,. убихивон,, метилвиологен, кислород) и донорами электрона (аскорбиновая кислота,, гидрохинон, сульфид натрия, триптофан,.НАДН). йзучены и охарактеризованы катион- и: анион-радикальные формы пигментов,, доноров и акцепторов электрона.

2.. Экспериментальные условия обнаружения - свободных радикалов в системе пишент- акцептор электрона (донор электрона) определятся длительность» жизни образующихся промежуточных соединений. Накопление радлкалышх форм пигментов можно наблюдать в том случае , когда длительность жизни:пигментного,радикала превышает-(бактериохлорофнлл -хинон) или соизмерила^бактериовиридин - хинон) с длительностью жизни радикала партнера.

3. Катион-радшсальные формы пигментов нсзависшо от природы акцептора электрона характеризуется сходными сигналами ЭПР,.прея-, ставлякишми собой синглетные лшш с g=2,0025 и пгаривой: 8,5 го, II гс, 13 го, 14 гс для хлорофилла а, бактериовиридина,,бавгерио-хлорофидла.а,.бактериохлорофияла £ соответственно.. Длительность жизни катион-радикалов увеличивается, а реакционная способность .уменьшается в ряду протохлорофияд - хлорофилл - бактериохлорофклл. Таким образом, свойства катион-радикальных форм хлорофилла и его аналогов определяются в первув очередь степенью восстановлеяности. полуизолированных доюШих связей молекулы пшмета.

4. Характер спектров ЭПР анион-радикальных фор» пжгаентов зависит от природы донора электрона, Так, , спектры ашюн-радякалов бактериох"орофилла и баятериофеофитина представляют собой скнглет-

ные^ линии (донор электрона - аскорбиновая кислота) : или линии с хорошо разрешенной сверхтонкой: структурой (донор электрона -Па^э );,шгрина лишш ЭПР доходного и того хепишентатакже-доменяетса:в зависимости от используемого донора, электрона (для: , ' : цротох-орофшиа И го "с. ка^в ивгоо аскорбиновой кислотой, гидрохинонаи. триптофаноы). . I

5. Изучены радикальные свойства агрегированных структур фото- : синтетЕчеоклх пы'ментов.ЛТоказано. что степень агрегации пигмента1 определяет '{ютохимяческую активность: и ■ способность к образование катион- и анион-радикальных форм, .Системы;.содержащие агрегированные Форш: пигментов о низкой степенью агрегация: (бактериовиридин;

и хлорофилл в СС14 ж толуоле),,способны к фотоиндуцироваянсму . обра эоваиию свободных радикалов в присутствии.кислорода воздуха. Оотоокисление пишснтов в этих условиях протекает аналогично их фотоокчелению в мономерном состоянии, причем агрегация способству--ет стабилизации первичных - радикальных продуктов.

6. Увеличение степени агрегации приводит к снижению фотохгми-, ческой активности агрегированных форм пигментов, что соответствует антенной функции, выполняемой агрегированными, готгентама в процессе фотосинтеза. Высокоагрегированьне формы пигментов характеризуйся наличием темпового сигнала ЭПР, связанного с переносом электрона меглу молекулами. агрегата.. Ширина темнового сигнала определяется степенью дедокализациз.. не спаренного влектрона, зависящей от . степени упорядоченности агрегированной структуры (12-13 гс для бах-териохлорофншга в метаноле и. твердых пленок бактериохлорофидла; 2-3 го дня твердых пленок бактериофеофигина). Таким образом, по характеру сигналов ЭПР моашо судить о степени упорядоченности агрегированных питентяых структур.- *

7.- Спектры ЭПР, вайлгщаемые при фотоокислении бактерисхлоро-фвяяа а, бактериохдорофидла в и хлорофилла а. сходны по свош параметрам с сигналам* ЭПР, вознжхаадаьш при освещении реакционных центров фотосистем, и используются для их интерпретации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Умрихина A.B., Бубличекко Н.В., Красновский A.A. Светоиндуцяро-ванние сигнала ЭПР при фотовосстановлении в фотоокислении хлорофилла и его аналогов. Биофизика, т.18, вып.З, 565-568, 1973.

2. Умрихина A.B., Бубличенко Н.В. Свойства катион-радикальных форм пигментов фотоскнтезирупцюс бактерий. Тезисы доклада на II Всесоюзном совещании со фотохимии.. Сухуми, 1974.

3. Умрихнна A.B., Зубличенко Н.В.» Бегичев В.Н., Красновский A.A.

- Фотообразование свободных радикалов в системе бактериохлорофвлл - В-бензохннон. ДАН СССР, т.221, вып. 4, 974-977, 1975.

4. КрасновсккЙ A.A., Пушкина Е.М., Дроздова H.H., Бубличенко Н.В., Умрихина A.B. Первичные стадии обратимого фотоокисления óarre-риохлорофалла IAH СССР,.т.221, вып. 6, 1457-1460, 1075.

5. Drosdova H.H., Umrikhina А.7., Pushfcina Е.К., Bublicheaho U.V., Xrasoovsky A.A., Reversible photo osl datlon of bacterlocbloro-phjrll Ъ írom photosynthetic bacteria RbodoPseudomonas viridis, til Intern. Солег. Photobiol. Roma, 1976*

6.. Красвовский A.A., Умрихина A.B., Бубличенко Н.В. Свободные радикалы при фотохимических реакциях хлорофилла. В сб. "Спектроскопия фотопревращений в молекулах", Ленинград, изд. "Наука", 106131, 1977.

7. Бубличенко Н.В., Умрюкна A.B., Краснов ский A.A. Образование катион- л,анион-радикалов* при фотохимических реакциях пигментов фотосгаггеэирутщкх организмов. Тезисы доклада на III Всесоюзном совещании по фотохимии. Ростоа-на-Дону, 1977.

8. A.B.Умрихина, И.И.Быстрова, Н.В.Бубличенко, К.Н.Ыальгошева, А.А.КрасновскиЙ. Образование свободных радикалов при фотоокислении бактериовяршшна в мономерном л агрегированном состоянии.

. Биофизика, т.22, вып.5, 780-767, 1977.

9. Умрихина A.B., Бистрова М.И., Бубличенко Н.В., КрасновскиЙ A.A. Свободные радикалы при фотохимических решениях бактериальных irarweirto» в мономерном и агрегированное* состоянии. Тезисы доклада на ХУ Ыучно-координационном совещании СЭВ. Сегед, 197 7.

10. Бубличенко Н.В., Умрихина A.B. Эволюция фотохимической Зтнщп: порфириновых пиплсцтов. Тезисы доклада на Всесоюзной кон^е|>ек— ции "Эволщиоглая Сиохкшя к происхождение жизни". Ереван, 1973.'

11. БуйлячеяхоН.В., УирихинаА.В,, Краснове кий A.A. Образование, свободных радикалов при фотохимических реакциях прстохлорофил-ла. Биофизика, т.21, вып.4, 58Э-6ЭЗ, 1979.

12. Бубличенко Н.В., Бистрова Ц.Й., Умрихина A.B. Саободкорадикаль-ные формы фотосинтетическкх пигментов в мопомернсм я агрегированием состоянии.. Тезисы доклада на Всесоюзной конференции * по физической и координационной.химтгпорфиркнов. Иваново,,1979.

13. Бубличенко Н.В., Бистрова W.U., Умргаиша A.B. Образование свободных радшеалоз при фотохвияеекгх реакциях моншерннх и агрегированных форы пигментов. Тезисы доклада на ХУ Всесоюзном Биохимическом съезде. Ленинград,.1979.

ЗАК. 1750 TMP. 200 >u. ВЦ ПНШКСя. Т-21346 ОТ ОвЛ7.1»7Рг.