Заключительные стадии биосинтеза хлорофилла в листьях растений

Беляева, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Заключительные стадии биосинтеза хлорофилла в листьях растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Заключительные стадии биосинтеза хлорофилла в листьях растений"

россикхая академия наук исгитут почвовццня и фотосинтеза

РГ6 ОД

На правах рукописи удк: 577.152, 577.355, 581.132, 581.174

БЕЛЯЕВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

эаюкншъле стад« вшнтеза хлорофилла в лстьях растеши

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

ПУЩИНО 1994

Работа выполнена на кафедре фазико-хныическои биологии Биологического факультета (Московского Государственного Университета ш. И.В.Лоионосова.

СЦащпальные оппонента:

Доктор биологических наук, академик Б.Н.Кондратьева

Доктор биологических наук, профессор Н.В.Карапэтян

Доктор биологических наук, црофессор В.В.Климов

Ведущая организация:

Институт фотобиологии Белорусской АН.

Защита состоится "Л" июня 1994 г. в часов на заседании Специализированного Совета Д 200. 29. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН (142292, Пущино, Институт почвоведения и фотосинтеза РАН).

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института.

Диссертация в форме Еаучного доклада разослана "_апреля

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических н&ук

Актуальность проблеш. Биосинтез хлорофилла в растениях >бестачивает непрерывную фотосинтетическую активность, лежащую в эснове продуктивности растений и нормального функционирования биосферы.

Началом современного этапа изучения заключительной фотохимической стадии биосинтеза хлорфилла послужили работы Бренча, Смита, Виргина, Красновского и сотрудников.

1озднее благодаря развитию спе--ктроскопических методов удалось 1роследить превращение активной формы предшественника в шороЗиллид непосредственно в листьях растений и установить, что этот процесс включает одну фотохимическую и две последующие гемновые реакции ( Шибата 1956, 1957; Лйтвин, Красновский 1957). Выло установлено, что фотоцревращение осуществляется с участием Зе сантальных форм пигментов ( Вольф и Прайс 1957). Проблема Зиогенеза нативннх форм предшественника хлорофилла, их участия в Бункционировании "центров биосинтеза хлорофилла" и некоторые Сю технические аспекты фотобисинтеза хлорофилла были изучены в работах Годнева, Шлыка, их учеников и сотрудников: Акулович, Звериной, Калера, Раскина, Фрадкина, Чайки.

Темповые стадии биосинтеза хлорофилла завершаются образованием ботоактивного пигмент-белкового комплекса его предшественника - протохлорофиллида. Состав этого комплекса исследован в работах ГриМитса и соавт.(1974-1988), Апеля (1980). Однако, функции юкоторых компонентов комплекса ( в частности, флавинов) и способ ах участия в фотобиосинтезе хлорофилла оставались неясными. В звязи с этим представлялось актуальным исследовать участие кап различных форм протохлорофиллида, так и непигментных компонентов активного комплекса в первичных реакциях фотовосстановления зротохлорофадлвда.

В работах Рубина и соавт. (1962), Гедхира и Верхюльсданка (1970), Сиронваля и Куипера (1972), Раскина (1976), Дюжардин и зоавт. (1977) было показано, что собственно фотохимическая реакция восстановления протохлорофиллида включает стадию образования нефлуоресцирупцего интермедиата, стабилизирующегося 1ри низких температурах. Однако механизм фотовосстановления предшественника оставался неясным, так же как природа ^чествующих в процессе интермедиатов; ряд данных свидетельствовал э более сложной картине процесса. Для выяснения этих вопросов

казалось целесообразным более детально исследовать первичные фотофизические и фотохимические реакции при еще более низких температурах.

Цели я задачи исследования, Основная цель настоящей работы -исследование путей фотобиосинтеза хлорофилла из протохлорофиллида в листьях растений, выяснение последовательности промежуточных реакций» изучение природа образующихся интермедиатов, построение общей схемы процессов заключительной стадии биосинтеза хлорофилла. Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. С использованием современных методов исследовать спектральную картину, отражающую последовательность световых и темновых реакций заключительного этапа биосинтеза хлорофилла непосредственно в листьях растений.

2. В целях изучения механизма промежуточных реакций и природы их интермедиатов провести сравнительное исследование первичных фотофизических и фотохимических процессов фотовостановления протохлорофилла(ида) в листьях растений и в модельных системах с использованием методов ЭПР, абсорбционной и люминесцентной спектроскопии при глубоком охлаждении объектов.

3. Выяснить возможность участия непигментных компонентов активного пигмент-белкового комплекса в первичных реакциях фотовосстановления протохлорофиллида.

4. Проследить динамику накопления спектрально различных нативных форм хлорофилла от начальных стадий до завершения процесса зеленения этиолированных листьев.

Научная новизна. Представлена наиболее полная схема последовательности реакций в процессе образования хлорофилла из протохлорофиллида в этиолированных листьях растений, включащая две последовательных фотохимических реакции и ответвляющийся в точке их сопряжения боковой процесс, завершающийся формированием мономерного, этерифицированного фитолом хлорофилла. Было показано существование темновой реакции превращения продукта второй фотореакции в более длинноволновую форму - реакции, предшествущей "сдвигу Шибата".

При исследовании реакций фотовосстановления протохлорофиллида обнаружено образование первичного интермедиата Н, которое

осуществляется даже при температуре жидкого гелия ( 4,2 К) и проявляется по тушению флуоресценции протохлорофиллида. С помощью ЭПР-спектроскопии было показано, что фотовосстановление протохлорофиллида включает последовательное образование двух парамагнитных интермедиатов ( по-видимому, ион-радикала и нейтрального радикала), которые идентифицируются с промежуточными продуктами И и Х6ЭО.

Первичные стадии фотовосстановления предшественника хлорофилла удалось моделировать в растворах пигмента. Установлено, что в разбавленных растворах протохлорофилла, освещаемых при 77 К, осуществляется первичная реакция его фотовосстановления с образованием парамагнитного интермедиата л, полностью обратимая при повышении температуры. В модельных системах с агрегированным пигментом наблюдается более глубокое превращение с образованием интермедиата Х690, что свидетельствует о важной роли пигмент-пигментного взаимодействия для завершения реакции фотовосстановления протохлорофиллида.

Получены данные об участии НАДФН и фдавинов, присутствующих в активном пигмент-белковом комплексе, в первичных реакциях фотовосстановления протохлорофиллида. Исследована динамика накопления нативных форм хлорофилла и развитие миграции анергии между ними в зеленеющих листьях растений.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований позволяют, как нам представляется, расширить и углубить представления о феноменологии и механизме фотобиосинтеза хлорофилла. Ряд из них получил дальнейшее развитие и был подтвержден в работах других исследователей. Полученные результаты могут иметь значение для выяснения более общих вопросов о механизме поглощения и трансформации световой энергии в фотосинтезе и других фотобиологических процессах, в которых участвуют фотоактивные комплексы пигментов. Решение проблемы механизма первичных реакций фотовосстановления протхлорофиллида до хлорофиллида имеет важное значение для выяснения возможностей управления этим процессом, для поиска путей регуляции продуктивности фотосинтеза, для разработки методов использования фотогербицидов в сельском хозяйстве.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на 1У Международном конгрессе по биофизике ( Москва 1972), на выездной сессии совета "Проблемы биофотоники" (Москва

1974), на XII Международном ботаническом конгрессе (Ленинград

1975), на ХХУ1 Всесоюзном совещании по люминесценции (Самарканд 1979), на Симпозиумах спещбшстов стран - членов СЭВ (Пущино 1981, 1983, Прага 1984), на 1У Международном семинаре по миграции анергии (Прага 1981), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва 1982), на 16 конференции ФЕЕО (Москва 1984), на 1У Всесоюзной конференции по химии и применению порфиринов (Ереван 1984), на Венгерском конгрессе по физиологии растений (Сегед 1988), на 3-м Конгрессе Европейского фотобиологического общества (Будапешт 1989), на Советско-Индийском симпозиуме по фотосинтезу (Пущино 1990), на IX Мевдународном конгрессе по фотосинтезу (Нагойя 1992), на XI Международном биофизическом конгрессе (Будапешт 1993), на Международной конференции по биогенезу пигментного аппарата фотосинтеза (Минск 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе монография: О.Б.Беляева, Ф.Ф.Литвин "Фотобиосинтез хлорофилла", Изд. Московского Университета, 1989 и глава в книге "Биогенез пигментного аппарата фотосинтеза, Минск, 1988.

Методические аспекты работы. Основными методами исследования были спектральные методы: низкотемпературная (77 К) абсорбционная и флуоресцентная спектроскопия ( спектры эмиссии и возбуждения флуоресценции), производная и дифференциальная спектроскопия, ЭПР-спектроскопия. Спектрофотометры усовершенствовались и усложнялись дополнением специальных приспособлений для измерения низкотемпературных спектров целых листьев и других светорассеиваицих объектов. Использовались самостоятельно сконструированные и смонтированные на базе отечественных монохроматоров флуориметры.

Компьютерный анализ использовался для разложения спектральных кривых на составляющие гауссовы полосы.

Црименялся ряд препаративных методов для получения

этиошюстов; выделения, очистки и разделения пигментов; получения модельных систем, в том числе дифференциальное центрифугирование, колоночная и тонкослойная хроматография.

В качестве объекта исследования использовались выращенные в полной темноте (этиолированные) листья растений разных видов;этиопласты, а такке модельные системы: растворы и пленки цротохлорофалла и протохлорофиллида.

результаты н аващщш.

1. о компонентах натионого пигмент-беж овог о

комплекса предаственника хлорофилла.

Современные представления говорят о сложности элементарного Вотоактивного комплекса предшественника хлорофилла в этиолированных листьях, который включает протохлорофиЛлид, донор электрона (НАДФН) и фермент, ответственный за восстановление лтмента, "НАДШ-протохлорофилпид-оксидоредуктазу" (Гриффите и ;оавт. 1974 - 1982) с молекулярной массой 36 кДа ( Аголъ и др. [980). Согласно результатам исследования спектров кругового дахроизма ( Чопфе, Сигельман 1968, Матисс, Зауэр 1972) активная 5орма протохлорофиллида представляет собой агрегат (скорее всего ¡jmep ) пигментных молекул.

Спектрально различные форхы. протхлорофолла(и0а) и их фотохимическая ативноспъ.

Ице в ранних работах было выяснено, что в этиолированных истьях растений под действием света в хлорофилл преимущественно [ревращается форма протохлорофиллида П655/650 (Шибата 1957, йтвин, Красновский 1957). Доминирующая в этиолированных листьях »которых видов растений ( Акулович и др. 197I) и в выделенных игмент-белковых комплексах форма П543/639 также фотохимически ктивна. Самая коротковолновая форма П633/628 считалась не ктивной или слабо активной.

В наших работах [19,39] исследовалась способность указанных центральных форм к фотопревращению при разных температурах.

233 К А \ ^ J \Ч 286 К в цл hV

\ч < 1 V 1 639 \\ 1 628 VJ 639 VW

650 700 660 X НМ

Рис Л. Разностные спектры поглощения этиолированных листьев фасоли и их разложение на составлящие гауссовские полосы: спектр листа, освещенного светом 100 Вт/м^ в течение I минуты при 233 Р (А) и при 286 К (В), минус спектр неосвещенного этиолированного листа.

Анализ разностных спектров поглощений (свет - темнота^ показывает, что при низких температурах (77 К - 263 К) в процесс* фотопревращения принимают участие только две форм протохлорофилла(ида) - 11643/639 и П655/650 (рис.1, рис.5). Сама коротковолновая форма 11633/628 превращается только пр температуре выше 278 К. Эффективность фогоцревращения форм П643/639 зависит температуры ( «возрастает в два раза пр увеличении температуры от 233К до 286К). Кроме тог фотохимическая активность форм П633/628 и 11643/639 увеличиваете в условиях прерывистого освещения. Эти факты свидетельствуют существовании темновой температурнозависимой стадии в процесс превращения в хлорофиллид двух коротковолновых форм П633/628 П643/639, каковой монет быть преобразование этих форм в боле длинновошовую активную форму. Аналогичный механизм обнаружен этиолированных листьях некоторых видов растений, где преобладае

коротковолновая форма с максимумом поглощения при 636 нм (Акулович и соавт. 1971). Форма П643/63Э, по-видимому, может превращаться в хлорофиллид двумя путями: непосредственно , под действием света ( о чем говорит ее активность даже при температуре жидкого азота - рис.5) и опосредованно - через образование активной формы П655/650. Не исключено, что существует два пула этой формы с разным механизмом превращения.

Кроме упомянутых основных форм в этиолированных листьях существует несколько минорных форм со слабыми полосами поглощения и флуоресценции, расположенными в длинноволновой области спектра: П66Э/657, П682/66Э, П697/675, П7/685, П7/697, П730/7Н [5 ], (Литвин, Стадничук 1980). Для выяснения возможного участия длинноволновых форм в биосинтезе хлорофилла были исследованы изменения спектральных характеристик этиолированных листьев, происходящие при избирательном облучении этиолированных Листьев в области собственного поглощения длинноволновых . форм [23,26,27]. Был обнаружен эффект сенсибилизации превращения основной формы П655/650 длинноволновыми формами предшественника. Механизм процесса может быть объяснен антистоксовским переносом энергии электронного возбуждения с длинноволновых форм на основную форму предшественника. Эффективность сенсибилизации фотопревращения П655/650 длинноволновыми формами прото--хлорофилла (5-Ю-^ при 293К) существенно зависела от температуры, уменьшаясь в десять раз при понижении температуры от 293 К до 233 к. Судя по спектрам действия сенсибилизации, можно заключить, что по крайней мере две длинноволновые формы протохлорофилла(ида)( с максимумами поглощения около 688 и 695 нм) энергетически связаны с его основной формой П655/650, и, по крайней мере, косвенным образом (фотосенсибилизация) участвуют в процессе образования хлорофилла на свету. Прямое наблюдение фотореакций собственно длинноволновых форм затрудняется сильным перекрыванием их спектров со спектрами хлорофиллидннх форм, образующихся из основных форм предшественника. Поэтому вопрос о прямом превращении длинноволновых форм в хлорофиллид остается открытым.

О флавинах как компоненте активного пигмент-белкового комплекса этиолированных листьев.

В работе Уолкер и Гриффитса ( 1988 ) получены данные, указывающие на присутствие флавинов в высокоочищенных препаратах, нативного комплекса протохлорофиллида. В наших (совместных с Игнатовым) исследованиях 138,401 обнаружено, что в спектре возбуждения флуоресценции активной формы протохлорофиллида П655/650 присутствуют ПОЛОСЫ при 390, 445-450 И 460-464 НМ, близкие по положению к полосам в спектре возбуждения флуоресценции ФДЦ (рис.2). Обнаруженный аффект миграции энергии указывает на то, что флавины входят в состав активного комплекса, где находятся в тесном контакте с пигментом.

440 448

Рис.2. Низкотемпературный (77 К) спектр возбуздения флуоресценции этиолированного листа кукурузы. Флуоресценция измерялась при 633 нм (I) и при 655 нм (2). Кривая 3 -спектр возбуздения флуоресценции ФАД в препаратах протохлорофиллид-оксвдоредуктазы ( Уолкер и Гриффите 1988).

400

450

\ НМ

Можно предположить, что флавины, пространственно и энергетически тесно сближенные с хромофором предшественника, не только присутствуют в фотоактивном комплексе, но и участвуют в реакции фотовосстановления протохлорофиллида ( см. ниже).

2. Общая пос/едовате/ъность реакций заклочигельного этапа

биосинтеза хлорофилла

Ухе в конце 50-х годов было показано ( Шибата 1956,1957; Литвин и Красновский 1957) , что образование нативного хлорофилла из эго предшественника протохлорофилла(ида) в зеленеющих листьях растений включает несколько промежуточных этапов: одну 5отохимическую реакцию (собственно восстановление предшественника) и две температурнозависимых темновых стадии. На эсновании исследования "спектров флуоресценции (Литвин, Красновский 1957) была предложена следующая схема реакций:

П6335^= П655 -^~Хл690-695--ХЛ675-680 —~ Ы685-686

( цифра указывает положение максимума флуоресценции при 77К, П633 - неактивная, П655 - активная форма предшественника).

В то же время в этих ранних работах были получены указания на золыпую сложность процесса. В частности, в работе Литвина (1958) Зыло отмечено, что при низких интенсивностях действующего света тарвой обнаруживали не Хл690-6Э5, а более коротковолновую форму с максимумом флуоресценции около 675 нм. Этот факт позволил 1редполагать существование более сложной схемы световых и гемновых стадий.

Детальные исследования этой проблемы были осуществлены в наших заботах [1-5 ] методами низкотемпературной абсорбционной и Елуоресцентной спектроскопии (обычной и производной). В зоответствии с результатами этих исследований общую юследовательность фотохимических и темновых реакций образования шорофилла из его предшественника протохлорофилла(ида) можно федставить в виде следующей разветвленной схемы:

I 2 3 4 1655/650 -^^Шхлд684/676 -^^-Шхлд690/680--Хлд695/685 —~Хл683/670

+фитол ХЛ675/670

Здесь и далее цифрами обозначено положение спектральных юксимумов (флуоресценция/поглощение).

0 двух последовательных фотохимических реакциях в процессе биосинтеза хлорофилла.

Существование двух последовательных фотохимических реакций ( реакции I и 2 на схеме) было показано путем исследования дозово! зависимости спектральных изменений этиолированных листьев , разделением спектров продуктов первой и второй фзтореакций с помощью производной спектроскопии, а также путем исследование температурной зависимости спектральной картанфроцессо! биосинтеза хлорофилла. Энергия активации первой фотореакции не превышает 300-400 кал/моль, тогда как для второй фотореакции ош составляет 4-5 Ккал/моль. Благодаря этому удается накопит! продукт первой фотореакции Хлд684/676, освещая листья при 233 К.

В нашей работе с Игнатовым с9,Ю : фотореакции удалой разделить и по спектру их действия, возбуждая сначала первую I спектральной области основной полосы поглощения протахлорофшвд П655/650, а затем вторую - в более длинноволновой области, где расположена полоса поглощения продукта первой фотореакции.

Из анализа экстрактов пигментов из освещенных листьв] следует,что--—-^фотовосстановление хромофора молекул протохорофиллида осуществляется уже в первой фотореакции-Поэтому две ( фотохимические реакции можно объяснит] последовательным' восстановлением молекул в агрегат* протохлорофиллида. Показанное нами ( с помощью производно! спектроскопии) дискретное превращение одной спектральной формы 1

другую' (Щ684/676-Хадб90/б80) возможно при малых размера

агрегата ( две фотореакции в случае димера).

Существование двух последовательных фотореакций в цеп биосинтеза хлорофилла было подтверждено исследованиями Торна 1971), Матисса и Зауэра (1972), Хеннингсена (1974). Результат исследования спектров кругового дихроизма в ходе последовательны реакций (Матисс и зауэр 1972) позволили предположить образовали смешанного димера ( протохлорофиллид-хлорофшишд) в результат первой фотореакции и димера хлорофиллида в результате второ фотореакции.

Разветвление цепи фстохшвмческих реакций биосинтеза хмрофилм, (реакция га на схеле).

При кратковременном (мсек) освещении, инициирующем протекание олъко первой фотореакции и последующем выдерживании освещенного иста в темноте обнаруживается, что в точке сопряжения двух: отореакций ( продукт Хлд684/676) ответвляется боковой путь, едущий к образованию коротковолновой формы хлорофилла Хл675/670. та реакция протекает с заметной скоростью только при емпературе выше 273К. Ее функционирование обнаруживается также при длительном (минуты) облучении листьев светом низкой нтенсивности при положительной температуре. При повышении нтенсивности света вторая фотохимическая реакция начинает спешно конкурировать с боковой реакцией, что приводит к 'орможению последней и переключению процесса на основной путь, [ри отрицательных температурах темновая реакция заторможена, и [роцвсо идет по основному пути как при низкой, так и при высокой нтенсивности света.

Анализ экстрактов с помощью тонкослойной хроматографии юказал, что продуктом боковой темновой реакции является не лорофиллид, а хлорофилл. Таким образом, этерификация молекулы аорофшла осуществляется не только во время "сдвига Шибата", ( сак считалось ранее), но и со значительно большей ( на порядок) жоростью на стадии обсуждаемой темновой реакции образования СЛ675/670 из продукта первой фотореакции. По-видимому, Хл675/670 фвдставляет собой одну из нативных форм хлорофилла. Наличие гаграции энергии с этой формы на Хлд684/676 свидетельствует о ее 5лизком расположении по отношению к центру биосинтеза основной «ассы пигмента.

Матисс и Зауэр (1973), а позже Оливер и Гриффите (1982) юдтвердили не только наш вывод о существовании двух юследовательных фотореакций, но и всю приведенную выше схему зветовых и темновых стадий, включая боковую реакцию.

Судя по коротковолновому спектральному сдвигу, а также по фактам устойчивости продукта Хл675/670 к дезагрегирующим воздействиям и лучшей ( по сравнению с Хлд690/680) экстрагируемостьв этого продукта г 1-3 :, боковая реакция, по всей

вероятности, сопровождается дезагрегацией пигмента. Подтверждением этому служит характер изменения спектров кругового дихроизма гомогенатов из освещенных этиолированных листьев на этом этапе процесса (Матисс, Зауэр 1972). Можно предположить, что так же, как на стадии "сдвига Шибата", дезагрегация способствует ферментативному процессу этерификации молекулы пигмента.

Функциональное значение боковой реакции заключается в раннем формировании небольших количеств мовомерной формы хлорофилла. Известно, что активность фотосистемы II проявляется на самых ранних стадиях зеленения этиолированных листьев ( Хеннингсен, Бордаан 1973). Поэтому можно предположить, что описанная реакция может быть началом формирования РЦ ФСП и их окружения. Недавно полученные Игнатовым и Литвиным данные об образовании этим путем не только хлорофилла а , но и феофитина а, позволяют предполагать, что эта реакция лежит в основе биогенеза реакционных центров фотосистемы 11. Линейная цепь реакций (основной путь) ведет, по-видимому, к образованию основной массы хлорофилла светособирающих комплексов фотосистем.

Телновая реакция Хл£Э0/б80—- Ха695/685 ( реакция 3 на схеме), обнаруженная нами С 1,2 ], как предполагалось, связана с изменениями пигмент-пигментного или пигмент-белкового

взаимодействия. Позднее Эль Хамоури и Сиронваль (1981), а затем Оливер и Гриффите (1982), пришли к заключению, что темновой длинноволновый сдвиг может быть связан с реконструкцией восстановленной формы нуклеотида НАДО после фотореакции. Батохромное смещение спектральных полос может быть связано, как это показали исследования миграции энергии ( Игнатов, Литвин 1981), с уменьшением мекмолекулярных расстояний в агрегате пигмента. По-видимому, структура активного пигмент-белкового комплекса и хромофор-хромофорное взаимодействие зависят от состояния НАДФ ( окисленного или восстановленного). Согласно данным Сиронваля и др. (1984) эта реакция фотообратима.

Следующая темновая реакция - сдвиг Шибата (реакция 4 на схеме), связана с этерификацией хлорофиллида, дезагрегацией пигмента (Батлер 1961) и с конформационной перестройкой хлорофилл-белкового комплекса, обеспечивающей возможность этерификации хлорофьллида (Кирк 1970, Акоюноглу 1971).

3. ПЕРЭЖ£ ПРОЦЕССЫ ФОТОВОССТАНОШЕЖЯ ПРЕДЙЕСТБЕНЖА

ХЛОРОФИЛЛА.

Элементарныые реакции фотовосст ановлвния протохлорофшиида П655/650 в листьях растений.

Для выяснения механизма первичных процессов фотовосстановления протохлорофшвда естественно было перейти к исследованию реакции при очень низких температурах, когда заторможены биохимические температурнозависимые стадии.

Рубин, др.( 1962 ) обнаружили уменьшение длительности флуоресценции протохлорофиллида этиолированных листьев при повышении температуры образца от 77К до 193К. Образование хлорофиллида осуществлялось лишь при последующем повышении температуры ( от 153 К до комнатной) в темноте. Было высказано предположение о переходе под действием света молекулы протохлорофилла при низких температурах в промежуточное состояние, превращение которого в хлорофиллид является результатом следунцей темновой реакции при повышении температуры. Гедхир и Верхюльсданк (1970) и Сиронваль и Куипер (1972) наблюдали падение выхода флуоресценции протохлорофилла после освещения этиолированных листьев при низкой температуре ( 77К 173К) с последующим появлением полосы флуоресценции хлорофиллида после нагревания образца. Раскину (1976, 1977) удалось стабилизировать промежуточный продукт фотохимической реакции, освещая листья при 153 К, и определить положение е го полосы поглощения ( около 690 нм). Образующийся интермедиет, по-видимому, являлся эффективным тушителем флуоресценции как протохлорофиллида П655/650, так и образующегося хлорофиллида. Автор предложил идентифицировать нефлуоресцирующий интермедиат как комплекс с переносом заряда, образованный молекулами пигмента и донора электрона под действием света.

Факт существования нефлуоресцирупцего интермедиата, предшествующего первичным формам хлорофиллида, был подтверяден в ряде работ (Дюжардин и др. 1977-1984, Лосев и Лялькова 1979, наши работы: 111-13,15,16,20,21 ]). Нефлуоресцирующий интермедиат, характеризующийся широкой полосой поглощения в области 680-710

нм, получил название Х6Э0, Этот термин мы будем использовать и в дальнейшем изложении, хотя уже в первых работах высказывалось предположение о возможности существования различных спектральных форм нефлуоресцирующего интермедиата. Применение методов спектроскопии высокого временного разрешения ( 4ранк и др. 1980,1981) позволило наблюдать, по-видимому, ту же реакцию и при физиологических температурах.

Таким образом, считалось, что первым продуктом, образующимся под действием света из протохлорофиллида является интермедиат Х690, появление полосы поглощения которого наблюдали при 143 -153 К. Тушение флуоресценции протохлорофиллида, сопровождавдее появление этого интермедиата, приписывали миграции энергии с протохлорофиллида на Х690. Однако, некоторые данные позволяли предполагать более сложной как картину первичных фотопревращений протохлорофиллида, так и их интерцретацию. В нашей работе с Игнатовым I 15 ] было показано, что реакция образования нефлуоресцирующего интермедиата Х690 фотообратима. На основании исследования кинетики прямой и обратной фотореакций было высказано предположение о существовании еще одного короткоживущего интермедиата (Л), предшествующего Х650.

Для выяснения возможности существования более ранних, чем Х690, проявлений фотохимического акта казалось необходимым при исследовании первичных стадий фотовосстановления протохлорофиллида перейти к еще более низким температурам.

Тушение флуоресценции активной формы протохлорофиллида. Образование первого нефлуоресцирующэго обратного интзрлеоиат в..

Нам удалось зафиксировать фотоиндуцированное тушение флуоресценции активной формы протохлорофиллида в этиолированных листьях при температуре жидкого азота (77 К) и даже при температуре жидкого гелия - 4,2 К ( рис.3) [21]. Это указывает на элементарный фотофизический характер первичной реакции, связанной с тушением флуоресценции протохлорофиллида.

Фотоиндуцированное тушение флуоресценции протохлорофиллида П655/650 при глубоком охлаждении характеризуется очень низким

Рис.3. Изменения низкотемпературных ( 4,2 К - А; 77 К - В) спектров флуоресценции этиолированных листьев фасоли после освещения синим светом: А. I) неосвещенный этиолированный лист;

2) тот же лист после 30 минут облучения аргоновым лазером (458 нм, 103 Вт/м2) при 4,2 К; 3) тот же образец после нагревания до 233 К (Ю минут) в темноте; 4) тот же образец плюс нагревание до 263 К ( 20 минут) в темноте.

В. I) неосвещенный этиолированный лист; 2) тот же лист, освещенный 4 минуты при 77 К синим светом ( 475 нм), Ю4 Вт/м2;

3) тот же лист, после освещения выдержанный 3 минуты в темноте цри повышении температуры до 233 К; 4) тот же лист, дополнительно выдержанный 15 минут в темноте при повышении температуры до 263 К.

квантовым выходом ( на три порядка ниже, чем квантовый выход его фотовосстановления при комнатной температуре), который слабо изменяется при повышении температуры от 4,2 К до 163 К и резко возрастает при температурах вше 173 - 193 К. Последущее повышение температуре листьев, освещенных при глубоком охлаждении, приводит к формированию первичных форм хлорофшшда ( рис.3,4,8). Однако, квантовый выход их образования ( в отличие от квантового выхода тушения флуоресценции} существенно изменяется при повышении температуры освещения от 4,2 К до 153 К: в листьях, освещенных при 4,2 К он в 3-4 раза ниже, чем в листьях, освещенных при 77 К и в 10 раз ниже, чем после освещения при 153 к.

Тушение флуоресценции активной формы протохлорофиллида, наблюдаемое при низких температурах, обратимо при повышении температуры до 233 К. Степень обратимости зависит от температурных условий освещения и составляет (при одинаковой доге облучения) в среднем 75-80% после освещения цри 4,2 К, 30-50% после освещения при 77 К и 5-6% после освещения при I53K.

Приведенные факты свидетельствуют о существовании на пути образования ранее обнаруженного интермедиата Х690 обратных реакций, зависящих от температуры слабее, чем прямой процесс превращения X69Q в хлорофиллид.

В более ранних работах фотоиндуцированное тушение флуоресценции протохлорофиллида П655/650 при низких температурах, объясняли эффективной миграцией энергии с протохлорофиллида на интермедиат Х690. Однако, первичный эффект действия света на этиолированный лист, проявляющийся по тушению флуоресценции протохлорофиллида, наблюдается в тех условиях, когда Х690 практически не заметен то поглощению 129,30,33]. Об этом свидетельствуют результаты сравнительного исследования спектральных изменений ( поглощение и флуоресценция) этиолированных листьев, получивших одинаковую дозу световой энергии при двух температурах (77К и 1БЗК) - рис.4. В этих экспериментах при практически одинаковом тушении флуоресценции (75% при 77К и 80% при I53K) резко различаются спектры поглощения освещенных листьев . В результате освещения при 77 К

Рис.4. Изменения низкотемпературных (77 К) спектров флуоресценции (А) и поглощения (В) этиолированных листьев фасоли, освещенных интенсивным белым светом ( Ю4 Вт/м2) при низких температурах. I - неосвещенный этиолированный лист; 2 -то «8 после 4 мин. освещения при 77 К; 3 - то же, что 2, после повышения температура до 268 К; 4 - этиолированный лист после 4 мин. освещения при 163 К; б - то же, что 4, после повышения температуры до 268 К.

интенсивность полосы поглощения протохлорофиллида П655/650 уменьшается не более, чем на 256 ( или вообще не изменяется), появления новых полос в длинноволновой области спектра обнаружить не удается. В спектрах поглощения листьев, освещенных цри 153 К,наблюдается уменьшение полосы поглощения протохлорафыышда на 10-12» и появление длинноволнового максимума , принадлежащего интермедиату Х690. Сильное (75-80*) тушение флуоресценции листьев, освещенных при 77 К, нельзя объяснить возможным переносом энергии на очень небольшое количество Х6Э0 (не более 2*), которое может присутствовать в объекте. По данным

Игнатова и Литвина (1981) при 3$ превращения предшественника в Х690 при 153 К наблюдается лишь довольно слабая ( швее 20*) миграция анергии с протохлорофилида П655/650 на интермедиат Х690. таким образом, можно заключить, что аффект тушения флуоресценции отделен от реакции образования интермедиата Х690. Об атом свидетельствует также факт фотоиндуцированного при 77 К тушения флуоресценции мономерного протохлорофиллида в разбавленных растворах, где отсутствует миграция анергии ( см. ниже).

Полученные данные позволяют предположить существование еще одной стадии фотохимической реакции, предшествующей образованию 2690, и протекающей с образованием лабильного обратимого интермедиата, который ранее обозначили индексом R (reversible).

Анализ спектральных изменений ( рис.4) позволил предположить, что спекзр поглощения первичного интермедиата R, преимущественно образующегося при 77К, близок ( если не идентичен) к спектру поглощения активной формы протохлорофиллида.

О появлении в цепи превращений протохлорофиллида короткоживущего интермедиата с полосой поглощения, близкой к полосе поглощения активной формы предшественника, свидетельствуют также данные спектроскопии высокого временного разрешения, полученные при физиологической температуре ( Иван и др. 1984).

В нашей недавней работе с Игнатовым существование нефлуоресцирующего интермедиата (предшествующего Х690) со спектром поглощения, близким к спектру поглощения протохлорофилла, было показано с помощью дифференциальной и производной спектроскопии этиолированных листьев, освещенных при 77 К(рис.5) 136,391. На основании анализа структуры дифференциальных спектров можно цредположить, что полуширина полосы поглощения при 650 нм, цринадлежащей интермедиату R несколько больше, чем полуширина аналогичной полосы активной формы протолорофиллида. Таким образом, первичный интермедиат R, образующийся в результате собственно фотореакции,близок по спектру поглощения к исходной форме протохлорофиллида, но отличается от нее очень низким квантовым выходом флуоресценции.

Две формы второго нефлуоресиирухщвго интермедиата Х690 и их превращение в хлорофиллид.

Повышение температуры оовещения до 143 К приводит к увеличению константы скорости прямой реакции превращения интермедиата И в Х690. Игнатовым и нами [36,39 3 с помощью низкотемпературной дифференциональной абсорбционной спектроскопии было показано, что

АВ 650

0,04' Л 697

/ 1 688 1 ||

0 / 1 /3 1 „л 1 л\

\ 650/ у \7jti

0,04

Рис.5 Шзкотемпературные (77К) дифференциальные спектры поглощения этиолированных листьев ячменя: I - спектр образца, освещенного 5 сек. при 77 К, минус спектр того же образца перед освещением; 2 -спектр образца, освещенного I мин. при 77 К, минус спектр того же образца перед освещением; 3 - спектр образца после I мин. освещения при 77 К и последующего его выдерживания при 233 К в темноте в течение 15 мин. минус спектр образца, освещенного в течение I мин. Интенсивность света 102 Вт/м2.

широкая полоса поглощения интермедиата Х690, гетерогенна и состоит из двух полос: 688 и 697 нм, принадлежащих разным формам нефлуоресцирущих интемедаатов (Й697 и 1*683), образующимся в параллельных реакциях, но отличающимся по скорости образования, которая выше для интермедиата 11697 ( рис. 5 ). Последовательное появление двух форм интермедиата Х690 удалось обнаружить при кратковременном освещении этиолированных листьев при 77 К, когда их количество очень мало ( не более 3% превращения активной формы предшественника). Первой формируется более длинноволновая форма Й697. При увеличении времени освещения в дифференциальном спектре обнаруживается вторая полоса при 688 нм ( форма 11688) при

неизменное величине полосы продукта R697. Повышение температур! освещенных листьев в темноте до 233 К приводит к превращению интермедиата Х690 (R697 +R688) как в хлорофиллид, так и обратно в протохлорофшишд. Было установлено, что для образования первичных форм хлорофиллида ( при повышении температуры) необходимо совместное накопление двух нефлуоресцирущих интернедиатов (R697 и R688). Если образовался только интермедиа! R697 ( кратковременное освещение), то при повышении температуры реакция полностью обратима. Этот факт свидетельствует о возможном взаимодействии хромофоров двух молекул в ходе прямой реакции образования хлорофиллида.

Таким образом, можно заключить, что фотовосстановление протохлорофиллида in viva включает, по крайней мере, две элементарных реации, осуществляющиеся при очень низких температурах , при которых стабилизируются продукты этих реакций - нефлуоре сцирупцие интермедиаты:

II655/650-^-R-/650—- X690(R697+R688) — Хлд

О природе пролежуточных продуктов фаювоссшно&ления пропишорофииииОа. Исследование спектров ЭПР.

Обнаружение короткоживущих интермедиатов, стабилизирующихся при низких температурах, естественно позволяло предполагать, что эти интермедиа™ являются промежуточными продуктами в ступенчатой реакции восстановления двойной связи в молекуле протохлорофиллида, которая может включать стадии переноса электронов, протонов и взаимодействия образующихся свободных радикалов. Для подтверждения этого предположения представлялось необходимым выяснить, возникают ли парамагнитные продукты непосредственно в ходе начальных фотофизических и фотохимических стадий процесса, и если это осуществляется в действительности, то установить соответствие между такими продуктами и спектрально идентифицируемыми, описанными выше интермедиатами.

Нами были проведены сравнительные исследования низкотемпературных ( 77 К ) оптических (поглощение и флуоресценция) и ЭПР спектров целых этиолированных листьев на

Рис.6. Низкотемпературные (77 - 86 К) спектры ЭПР этиолированных листьев

фасоли: I - неосвещенный лист; 2,3 - после 4 минут освещения светом Ю4 Вт/м2 при 153 К И 77 К соответственно; 4,5 образец (3) после нагревания до 233 К И 253 К соответственно. Амплитуда ВЧ-модуляции - 0,2 мТл, мощность СВЧ - 0,5 мВт.

разных стадиях фотовосстановления протохлорофиллида ( рис.6) (29,30,34 ]. В спектре ЭПР неосвещенного этиолированного листа при 77 К наблюдался очень слабый темновой сигнал. После освещения листьев интенсивным светом при низких температурах обнаружено возникновение бесструктурного синглетного сигнала ЭПР с д-фактором 2,0021, характерным для свободного электрона. Ширина сигнала зависела от глубины процесса фотовосстановления протохлорофвддида ( при разных температурах). Освещение этиолированных листьев при 77 К, когда преимущественно образуется нефлуоресцируиций интермедиат И, приводило к появлению синглетного сигнала ЭПР с шириной 1,1 мТл. При повышении температуры образца ( непосредственно в радиоспектрометре) наблюдалось уменьшение ширины сигнала до 0,9 мТл при 213 К. Одновременно с накоплением интермедиата Х690 ( в листьях, освещенных при 153 К) в спектрах ЭПР обнаруживался синглетный сигнал с шириной 0,95 мТл. Одновременно с превращением нефлуоресцирующих интемедиатов в первичные формы хлорофиллида ( при повышении температуры образца выше 223-233К) резко уменьшается амплитуда сигнала ЭПР, при 253К она достигает исходной темновой величины.

Таким образом, результаты сравнения оптических и ЭПР спектров пзволяют заключить, что оба нефлуоресцирующих интермедиата К и

Х690 парамагнитны и характеризуются сигналами ЭПР с шириной соответственно 1,1 мТл и 0,95 мТл. Поскольку g-фактор сигнала ЭПР (2,0021) интермедиатов характерен для свободного электрона, то можно сделать вывод о том, что нефлуоресцирущие интермедиа™ R и Х690 представляют собой свободные радикалы пигмента ( см. ниже).

Первичные процессы фотовосстановления протохлорофыда (яда) в модельных системах.

Другим путем выяснения механизма первичных стадий биосинтеза хлорофилла из предшественника и роли биологических структур в этом процессе послужило изучение реакции фотовосстановления цротохлороЗилла в простых системах.

Попытки фотовосстановления протохлорофилла до хлорофилла вне клетки были предприняты в ряде работ. Наиболее ранние и систематические исследования в этом направлении цроводились в лаборатории А. А .красновского с использованием различных модельных систем ( растворы, твердые пленки, мицеллярные растворы пигмента). В результате удалось достигнуть достаточно большого выхода продукта фотореакции ( до 20% ), идентифицированного как хлорофилл (Красновский, Быстрова 1970, 1974; Быстрова и др. 1983). Однако, в этих опытах реакция осложнялась юбочными процессами, в частности фотовосстановлением хромофора по системе сопряженных связей. В работах Лосева и др. (1970,1971) было показано, что хлорины, полученные путем восстановления протохлорофилла и его производных m vitro являются изомерными продуктами хлоринов природного происхождения. Первичные стадии реакции, ее механизм оставались не изученными, хотя в работе Бубличенко и соавт.(1979) при проведении фотовосстановления протохлорофилла в растворах сильными восстановителями при низких температурах (243 К - I83K) был обнаружен синглэтный сигнал ЭПР , который по мнению авторов, принадлежит анион-радикалу пигмента. Однако, характер изменений спектра поглощения свидетельствовал о том, что в этом случае восстановление осуществлялось то системе сопряженных связей (с образованием "1фасного" промежуточного продукта).

Шиш исследования процесса фотовосстановления

протохлорофилла(ида) в модельных системах [25,28-301 быль осуществлены с целью получения информации о механизме самых ранних первичных стадий реакции, исследованных нами ранее в целых листьях. Мы надеялись, что в результате такого сопоставления результатов, полученных tn vitro и in vivo можно идентифицировать спектральные изменения, связанные с преобразованием собственно молекулы хромофора и отделить их от иных процессов, возможно, обусловленных изменениями нативной структуры пигмент-белкового комплекса в многокомпонентной биологической системе.

С этой целью мы исследовали промежуточные стадии реакции фотовосстановления протохлорофилла в модельных системах при низкой температуре (77К), что ранее не было осуществлено, в тех условиях, когда удается проследить протекание первичных стадий фотовосстановления протохлорофиллида в листьях растений. Оказалось, что осуществление первичных стадий фотовосстановления молекулы протохлорофилла в растворах и пленках возможно и без использования восстановителей. По-видимому, донором водорода служит рстворитель (этанол, этиловый эфир, пиридин).

Фотовосстановленив лонолерного протхлорофшиа(иОа).

При исследовании разбавленных растворов протохлорофилла и протохлорофиллида ( 10"%, мономерная форма - рис.7 А) после освещения образцов при 77 К, был обнаружен эффект тушения флуоресценции, который оказался практически полностью обратимым при последующем повышении температуры до 273 К. Однако, после освещения образца не наблюдалось уменьшения полос поглощения протохлорофилла, соизмеримого с изменением флуоресценции, и появления каких-либо новых полос. Другим эффектом, обнаруженным метом ЭПР, было возникновение при освещении образца (77К) синглетного сигнала ЭПР с g-фактором 2,0013 и шириной синглетной полосы 1,2 мТл, который появлялся одновременно с тушением флуоресценции и быстро исчезал при повышении температуры, параллельно с возгоранием флуоресценции. Эффекты воспроизводились в системах с различными растворителями. Добавление восстановителей в несколько раз ускоряло тушение флуоресценции.

Рис.7. А. Фотореакция мономерного протохлорофилла в эфире (10~®М) при 77 К: I- спектр флуоресценции раствора цри 77 к, 2-спекгр того же образца после 7 минут освещения светом I04 Вт/м2, 3- то же после 8 мин. повышения температуры выше 253 К, 4-низкотемпературный (77 К) сигнал ЭПР освещенного образца,

В,С. Фотореакция агрегированного протохлорофилла в концентрированном (Ю-4М) спиртовом растворе при 77 К (В изменения спектра флуоресценции, С - изменение спектра поглощения): I- неосвещенный образец, 2- после 6 минут освещения светом Ю4 Вт/м2, 3- то же после 10 минут повышения температуры выше 253 К; 4,5 - спектры ЭПР освещенного раствора цри 103 К и 153 к соответственно.

Таким образом, можно заключить, что начальная (обратимая) стадия фотовосстановления мономерного протохлорофилла представляет собой образование продукта, близкого по положению красной полосы поглощения исходному хромофору, но отличающегося от него низким выходом флуоресценции и парамагнитностью. Цродукт исчезает при повышении температуры до 253 К, превращаясь обратно в исходное вещество. Полученные по спектрам ЭПР данные позволяют предположить, что механизм этой реакции включает перенос

электрона с образованием свободного радикала пигмента.

Сравнение с опытами на целых этиолированных листьях ( см. выше) показывает, что в этих модельных экспериментах, по-видимому, воспроизводится самая начальная стадия реакции фотовосстановления предшественника хлорофилла, проявляющаяся in vivo в тушении флуоресценции активной формы протохлорофиллида П655/650 с образованием парамагнитного интермедиата R.

Фстовосстановиение протохлорофилла в системах с агрегированным тглетол.

В более концентрированных спиртовых растворах ( Ю-4М) протохлорофилла довольно хорошо имитируются спектры поглощения и флуоресценции трех основных нативных фор« предо стввнника хлорофилла: наблюдаются полосы поглощения при 625, 635 и 645-7 нм и соответствующие полосы флуоресценции при 627, 637 и 651-2 нм ( рис. 7 В, С). Самый коротковолновый максимум, очевидно, принадлежит мономеру пигмента. Более длинноволновые связнвают с сольватированным состоянием протохлорофилла в спирте ( !(расновский, Шувалов 1971). В то ке время измерение спектров кругового дихроизма протохлорофилла в модельных системах (Броуэрс [975, Бедди 1980) свидетельствует в пользу того, что самая длинноволновая спектральная полоса обусловлена образованием дамеров пигмента.

Освещение концентрированного спиртового раствора при 77К гриводит к тушению всех полос флуоресценции. Для двух более ¡оротковолновых полос это тушение оказалось обратимым при ювышении температуры так se, как и в опытах с мономером игмента, тогда как интенсивность флуоресценции для полосы 651 нм «останавливается неполностью. В спектре ЭПР под действием света бнаруаеао появление синглетного сигнала с д-фактором 2,0015 и ириной 1,1 мТл (ети параметры совпадают с параметрами сигнала, оявлявщегося при освещении этиолированных листьев). Одновременно тушением флуоресценции в низкотемпературном спектре поглощения оявляется слабый максимум около 685-690 нм, близкий по оложению к максимуму поглощения нефяуоресцирувдего интермедиата 690, обнаруживаемого в зеленеющих листьях растений.

Сопоставление с опытами in vivo показывает, что в системах с агрегированным хлорофиллом, по-видимому, воспроизводится более глубокое превращение протохлорофилла, включапцее как первую (образование интермедиата R), так и следупцую ( образование интермедиата Х690) отадию фотовооотановлеадя протохлорофилла в листьях растений. Очевидно, что вторая стадия процесса связана с участием агрегированной длинноволновой формы пигмента. Большая по сравнению с мономером пигмента глубина превращения агрегата протохлорофилла может служить объяснением причины высокой активности длинноволновой формы протохлорофаллвда П6ББ/6Б0 m vivo, которую можно связать со взаимодействием в процессе двух хромофоров пигмента.

Для более крупных агрегатов протохлорофилла ( концентрированные растворы в тритоне Х-100, твердые пленки), характеризующихся длинноволновыми полосами флуоресценции в области 660 - 690 нм, также обнаружено частично обратимое падение интенсивности полос флуоресценции и появление синглетного сигнала в спектре ЭПР после освещения образцов цри 77К.

Таким образом, сходство цротекания первичных стадий фотовосстановления протохлорофилла (ида) т vivo с его

простейшими фотореакциями в модельных системах позволяет сделан вывод о том, что наблюдаемые в целых листях первичные фотореакции действительно связаны с изменением собственно молекулы пигмента. Высокая эффективность реакции и общая необратимость процесса, по-видимому, обеспечивается пигмент-пигментным взаимодействием молекул предшественника хлорофилла.

О механизма первичных реакций фотовосстановлешя предавственЕИка хлорофилла.

Если исходить из сопоставления структуры молекул хлорофшшда и его предшественника, фотохимическая стадия биосинтеза хлорофилла представляет собой восстановление полуизолированной двойной связи 7-в в 1У пиррольном кольце.

Полученные вами результаты исследования фотовосстановления протохлорофшшда in vivo и in vitro позволяют предположить, что идентифицированные промежуточные стадии скорее всего

соответствуют элементарным реакциям переноса двух электронов и двух протонов к пигментной молекуле.

Первичная фотореакция проявляется по тушению флуоресценции активной формы предшественника и по появлению сигнала ЗПР после освещения листа при глубоком охлаждении. Спектр поглощения остается практически неизменным. Эта первичная фотореакция осуществляется и в разбавленных растворах протохлорофилла(ида), освещаемых при 77 К. Тушение флуоресценции при неизменном спектре поглощения возможно в случае преобразования под действием света слабого комплекса с переносом заряда в более устойчивый комплекс ( Гуринович и др. 1968). Разделение зарядов между донором электрона и протохлорофиллидом сопровождается образованием анион-радикалов пигмента (Р*). Поскольку продукт первичной реакции -нефлуоресцирувдий интермедаат в характеризуется сигналом ЭПР с д-фактором свободного электрона, можно заключить, что он представляет собой анион-радикал пигмента, стабильный при низкой температуре в жесткой матрице. Близость спектра поглощения интермедиата г* , образующегося в твердой фазе при глубоком охлавдении, к спектру исходного протохлорофиллида свидетельствует о том, что электрон, воспринимаемый молекулой пигмента, изолирован от х-влектронной конъюгированной системы ее хромофора. Дальнейшее превращение (темновое образование хлорофиллида) говорит о локализации электрона по связи 7-8 1У пиррольного кольца. Такая локализация, по-видимому, возможна в результате специального взаиморасположения молекул пигмента и донора водорода в активном пигмент-белковом комплексе, обеспечиваемого ферментом протохлорофилид-оксидоредуктазой.

Следующая реакция (Н—»- Х690) приводит к появлению второго нефлуоресцирупцего парамагнитного продукта . Поскольку эта реакция эффективно протекает при более высоких температурах,чем образование интермедиата И, а соответствующий сигнал ЭПР имеет д-фактор свободного электрона, естественно предположить, что эта реакция представляет собой следующую стадию восстановления молекулы протохлорофиллида - присоединение протона с образованием нейтрального радикала (РН").

Наиболее вероятным механизмом дальнейшего превращения полувосстновленных интернедиатов в хлорофиллид, по нашему мнению, может быть диспропорционирование свободных радикалов ( в условиях высокой локальной концентрации молекул пигмента m vivo). В пользу этого предположения свидетельствует целый ряд фактов, в частности: I) димерное состояние активной формы протохлорофиллида in vivos 2) тот факт, что в исследованных нами модельных системах необратимое фотовосстановление осуществляется только при наличии агрегатов пигмента; 3) описанное выше наблюдение, согласно которому интермедиат Х690 представляет собой смесь двух интермэдаатов R697 и R688, цревращение которых в хлорофиллид осуществляется только при их совместном накоплении. Известно, что атомы водорода по связи 7-8 в молекуле хлоро<£иллида располагаются в транс-положении , поэтому можно предположить, что интермедиат X69CKR69T + R688) представляет собой смесь радикалов -стереоизомеров полувосстановленной формы пигмента.

Предположение о том, что основным механизмом завершения реакции фотовосстановления протохлорофиллида m vivo может быть диспропорционирование свободных радикалов, высказывалось в работе Лосева и Ляльковой (1979). Однако, авторы, не проводившие измерений ЭПР-спектров интермедиатов, могли • лишь предположительно идентифицировать стадии образования свободных радикалов с промежуточными продуктами, обнаруживаемыми с помощью оптической спектроскопии. Так, изложенные вше наши данные по ЭПР-спектроскопии не подтвердили предположение Лосева о том, что первичная флуоресцирупцая форма фотопродукта ( максимум 695 ны) является радикалом.

Поскольку реакция фотовосстановления протохлорофиллида осуществляется в рамках жесткого донорно-акцепторного комплекса, включающего агрегат пигмента, вероятна возможность как даспропорционирования нейтральных радикалов: РН* + FH* = PHg + Р, так и смешанного даспропорционирования между нейтральным радикалом и анион-адикалом: РН"+ РН~+ Р. Не исключено, что описанные ниже параллельные реакции образования двух первичных форм хлорофиллда различаются механизмом даспропорционирования свободных радикалов. Такое различие может определяться разной

природой доноров водорода, их способностью отдавать электрон и протон (или только электрон).

Исходя из данных о димерной форме активного протохлорофиллида, механизм первой фотореакции можно представить следувдим образом:

(Р~- РН")--- (ИГ- Р)-±^-(РНг - Р)

пг> _ _ // (Р - Р)—-(Р*- Р-у

ХЧч(РН--РН') --(И^-Р)

П655/650 Я Х690 ХЛД

Однако, нельзя исключить некоторую вероятность завершения реакции путем последовательного переноса второго электрона и протона.

Механизм второй фотореакции ( см. схему I), по-видимому, отличается от механизма первой фотореакции, о чем свидетельствует 59 на порядок большая энергия активации. Этот вопрос требует дальнейших исследований.

О двух путях образования хлорофялйида из нефлуоресцирувдих иктериедиатов

Как было сказано выше, образование первичных форм хлорофиллида в нефлуоресцирувдего интермедиата Х690 (Е697 + 1*688), [акопившегося в листьях, освещенных при низких температурах, юуществляется в результате темновой реакции при повышении емпературы.

Нами было показано [12,16,21,331, что после освещения тиолированных листьев интегральным "белым " светом при 77К з продуктов первичных фотореакций в темноте ( после повышения емпературы до 233 К) одновременно образуется две формы лорофиллида: ХВД695/684 и Хлд684/676 ( рис.8 А ). При повышении емпературы выше 233К их относительные количества быстро зменяются в пользу более коротковолновой формы Хяд684/676. Эта эрма, по нашему мнению соответствует продукту первой фотореакции,

описанному вше, о чем свидетельствует идентичность спектральных параметров и температурные пределы образования. После дополнительна подсветки в области поглощения этой формы наблюдается протекание второй фотореакции. Было обнаружено, что форма Хад684/676 может формироваться не только из Цд6Э5/684, но и параллельным путем, непосредственно из нефлуоресцирущего интермедиата Х690:

I 2 3 П655/650(Д1) -Х690-- ХЛД6Э5/684----4

П655/650 (Дз) -- Х690-- ХЛД684/676 —-

(2)

Здесь Д[ и Дз - возможные доноры водорода.

Свидетельством существования двух путей образования хлорофиллида служат зависимость результата процесса от спектрального состава света, действупцего на лист при 77К. В результате освещения синим светом (350-540 нм, макс, при 470 нм) и последующего повышения температуры из нефлуоре сцирущих интермедиатов образуется форма хлорофиллида Хлд6Э5/684 с дальнейшим ее превращением в Хлд684/676 (рис.8 В,реакция 4 на схеме 2). Однако, при освещении красным светом (%. >600нм) последующее повышение температуры приводит к преимущественному формированию хлорофиллида Хлд684/676 ( рис.8 С ). По такому се пути идет образование первичного цротохлорофиллида и в выделенных етиопластах (рис.8 о). Спектральные изменения, наблюдаемые при нагревании объекта в темноте, зависят от длительности предварительного освещения. При увеличении времени освещения (до 15 - 30 мин.) после нагревания в спектре флуоресценции регистрируется широкая полоса с максимумом при 686 нм, интенсивность которой меньше, чем при кратковременном освещении. Такое понижение интенсивности флуоресценции образующихся форм хлорофиллида при увеличении дозы освещения мокно объяснить фотодеструкцией их предшественников ( нефлуоресцирующих интермедиатов). Меньшая зависимость предшественников формы

Хлд684/676 от дозы действупцего света также свидетельствует о возможности1, ее образования независимо от Хлд6Э5/684. По-видимому,

нефлуоре сцирунцие интермедиаты, образующиеся в параллельных реакциях, обладают различной чувствительностью к деструктивному действию

интенсивного света.

Коротковолновый спектральный сдвиг, соответствующий реакции 4 на схеме, мохно объяснить ослаблением хромофор-хромофорного взаимодействия при повышении температуры. С другой стороны, как говорилось выше, такие

Рис.8. Низкотемпературные (77 К) спектры флуоресценции этиолированных листьев (А,В,С) и суспензии этгопластов (о) после освещения при 77 К и последующего повышения температуры до 233 к (—) и 283 К (—). Условия освещения: А,б -белый свет, 3 мин.; В - синий свет (475 нм), 3 мин.; С - красный свет, 3 мин.

спектральные изменения могут быть связаны с окислением внутрикомплексного НАДИ ( состояние НДДФН в свою очередь мозет влиять на пигмент-пигментное взаимодействие).

Поскольку в синей области спектра располоЕены полосы поглощения как протохлорофилла, так и непигментных компонентов активного комплекса (преимущественно флавинов), а в красной области спектра поглощают только пигменты, можно предположить, что существование двух параллельных путей (зависящих от спектрального состава действующего света) на ранних стадиях фотовосстановления протохлорофиллида связано с особенностями

участия в sтих реакциях именно непигментных компонентов активного комплекса ( см, ниже).

Если одна из параллельных реакций осуществляется посредством смешанного диспропорционирования радикалов Р~ и РН*,то появление первой формы хлорофиллида Хлдб95/684 должно соответствовать образованию ионной формы пигмента, протонирование которой в результате темновой, зависящей от температуры реакции завершает восстановление молекулы протохлорофиллида образованием формы ХВД684/676.

О возможной участии НАДЮ и флавинов в первичных реакциях фотовосстановления протохлорофилида.

Роль НАДФН как донора электрона в реакции фотовосстановления протохлорофиллида была исследована в опытах с добавлением экзогенного пиридиннуклеотида в препараты мембран этиопластов. ( Гриффите и др. 1974, 1975). В недавней работе Лебедева и Дюжардин (1993) было показано существование миграции анергии с НАДФН на протохлорофиллид в изолированных протохлорофиллид-белковых комплексах. В связи с этими данными казалось важным исследовать спектроскопическими методами изменения состояния внутрикомплексного НАДФН в ходе первичных реакций фотовосстановления протохлорофиллида, протекающих при очень низких температурах непосредственно в целых листьях. Об участии флавинов в фотовосстановлении протохлорофиллида данных в литературе не было. Нами была поставлена задача - исследовать изменения коротковолновой области спектров флуоресценции этиолированного листа, характерной для НАДФН и флавинов, в условиях освещения, соответствующих первичным фотофизическим и фотохимическим стадиям восстановления протохлорофиллида (37,40 ]. Известно, что пиридиннуклеотида флуоресцируют в восстановленном, а флавины - в окисленном состоянии.

В спектре флуоресценции этиолированных листьев при возбуждении в области 300-400 нм ( рис.9) кроме полос флуоресценции протохлорофилида были обнаружены полосы около 470 и 525 нм, которые можно приписать соответственно восстановленному НАДФН и окисленному флавину. В наших опытах освещение листьев при 77К

470 525 580 655

Рис.9. Низкотемпературные ( 77 К) спектры флуоресценции этиолированных листьев кукурузы: I - неосвещенный лист, 2 - тот вэ лист после 40 мин. освещения белым светом ( 103 Вт/м2) при 77К, 3 - тот же образец после нагревания до 273 К. Возбуждение в области 300-400 нм.

приводило к уменьшению интенсивности коротковолновых полос флуоресценции одновременно с протеканием первичной реакции фотовосстановления протохлорофиллида, проявлявдейся по тушению его флуоресцеции. Падение интенсивности флуоресценции сильнее выражено для полосы, принадлежащей НАД®!.

На основании факта тушения флуоресценции НАД5Н и флавинов можно было бы предположить, что в ходе фотореакции при 77К происходит окисление НАД® и восстановление флавинов. Однако, уменьшение интенсивности флуоресценции, по-видимому, отражает два процесса: фотопревращение НАД® и флавинов под действием света и тушение их флуоресценции образовавшимся в етих условиях первичным зефлуоресцирупцим интермедиатом, который, как известно, является эффективным тушителем флуоресценции пигментов. Повышение

температуры освещенного при 77К образца приводит к исчезновению нефлуоре сцирунцего интермедиата в результате его превращения в хлорофиллид. Одновременно наблюается возгорание флуоресценции как НАДОН, так и флавинов. Однако, полоса флуоресценции НАД® при повышении температуры восстанавливается неполностью, что говорит о его конечном окислении в результате фотореакции. Полоса флуоресценции флавинов при повышением температуры образца резко возрастает, достигая значения интенсивности, превосходящего исходную (до освещения) величину, что свидетельствует об увеличении концентрации окисленного флавина. Аналогичные изменения коротковолновой флуоресценции наблюдаются и при использовании красного света (\ > 600 нм), поглощаемого только хромофором пигмента ( но не НАДИ и флавинами). Этот факт свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения коротковолновой флуоресценции принадлежат внутрикомплексным НАДФН и флавинам, и позволяет связать эти изменения с первичными актами фотовосстановления протохлорофиллида, осуществляющимися при низких температурах ( т.е. на стадии образования нэфлуоресцнрущих интермедиатов).

Таким образом, изменения коротковолновой области спектров флуоресценции этиолированных листьев после освещения при 77 К и после дущего повышения температуры свидетельствуют о том, что НАДФН и флавины участвуют в первичных фотореакциях и в конечном итоге (после повышения температуры) находятся в окисленном состоянии. Эти факты позволяют предполагать, что не только НАДФН, но и флавины могут быть донорами водорода (электрона) в реакции фотовосстановления протохлорофиллида. Однако, способ (механизм) участия флавинов в первичных процессах фотовосстановления протохлорофшла пока не ясен . Не исключено, что флавины принимают участие в реакции в сопряжении с НДДВД ( возможно, в качестве кофермента протохлорофкллид-оксвдоредуктазы).

Возможно, что приведенный выше факт сенсибилизации синим светом ( в области поглощения ФАД) одного из параллельных путей образования хлорофиллида (см. схему 2) может быть связан с особой ролью флавинов именно в этой реакции. № исключено, что параллельные реакции осуществляются в разных пигмент-белковых комплексах с различной долей участия в них флавинов.

4. д«ммикл образования нативных ФОРМ хлорофилла.

Вце в ранних работах ( Красновский и др. 1952,Френч 1952, 1955) бнло замечено существование нескольких спектрально различных форм хлорофилла в листьях растений. По данным более поздних исследований в хлоропластах взрослого зеленого листа обнаруживается не менее 10 нативных форм хлорофилла ( Литвин, Синещеков 1967? Литвин, Гуляев 1969; Браун 1972).

формирование системы нативных форм хлорофилла начинается сразу после сдвига Шибата во время лаг-фазы. Последовательность образования форм и развитие миграции энергии между ними было исследовано нами путем сопоставления трех видов спектров (поглощения, флуоресценции и возбундения флуоресценции, а также их вторых произвоных) зеленевших листьев и гомогенатов из них С 4 - 8 ]. Количественно накопление хлорофилла в девяти нативных формах было прослежено с помощью математического разложения спектров с использованием обратной матрицы, рассчитанной на ЭВМ.

Анализ полученных результатов привел к заключению о функциональной разграниченности процесса, который целесообразно разделить на три этапа ( с плавным переходом между ними).

1 этап, (первые 5-6 часов зеленения листьев) - цроисходит образование нескольких переходных форм хлорофилла, спектрально не полностью идентичных формам взрослого зеленого листа ( наблюдаются небольшие отличия в положении максимумов), и характеризующихся полосами поглощения при 648 нм (хлорофилл в), 660,667,672,680,686 нм ( рис. 10). В спектрах флуоресценции наблюдается раннее появление длинноволновой полосы около 712 нм, что согласуется с данными Фрадкина и соавт. (1970).

Согласно результатам многочисленных исследований уже в первые часы зеленения развивается активность ФС1 и ФОН. Бойченко и Литвин (1990) показали,t что в первые часы зеленения образуются свенильные фртосинтетические единицы фотосистем, периферические антенны которых значительно меньше , чем антенны фотосистем взрослого зеленого листа. Из сравнения наших и литературных цанных можно заключить, что на первом этапе формируются реакционные центры фотосистем и их ближайшее окружение, рудой и зоавт. ( 1978) пришли к заключению, что в перше 4-6 часов

зеленения функционирует особый тип центров биосинтеза хлорофилла, отличающийся от формирующихся на более поздних этапах способностью к темновому синтезу аминолевулиновой кислоты.

К концу этого периода образуются практически все нативные пигментные формы, характерные для взрослого зеленого листа: начиная с 5-6 часов зеленения суммарный спектр поглощения математически хорошо представляется в виде суперпозиции гауссовых кривых с теми же параметрами ( положение максимумов и их полуширины), что и для спектральных форм зеленых листьев).

На этом этапе развивается миграция энергии с коротковолновых форм хлорофилла ( ХЛ662, ХлббЭ, Хл672) на образовавшиеся более длинноволновые. К концу первого периода главными акцепторами энергии становятся формы, поглощающие при 676,682,687 нм, принадлежащие к донорно-акцепторной группе форм (в зеленом листе) и характеризующиеся узкими спектральными полосами с полушириной 8-13 нм. Одновременно тушится флуоресценция коротковолновых форм.

2 эдил (6-16 часов зеленения) включает накопление и перераспределение количества пигмента в различных формах ( оцененное по относительной величине площади полос поглощения ). Это свидетельствует о преобразовании ювенильных фотосинтетических единиц в нормальные фотосинтетические единицы взрослого листа. К концу второго периода ( приблизительно к 16-му часу зеленения) устанавливается постоянное соотношение концентраций пигмента в формах, характерное для взрослого зеленого листа. Продолжает развиваться миграция анергии между формами. На этом этапе формы, служившие ранее ( на 1-м этапе) акцепторами энергии, становятся донорно-акцепторными ( с более выраженными донорными свойствами). По данным производной флуоресцентной спектроскопии наблюдается последовательное накопление промежуточных длинноволновых форм ( максимумы флуоресценции при 680,685,693-695,705-710 нм) с узкими полосами поглощения ( АХ 8-13нм) и резкое возрастание главной низкотемпературной полосы. Основными акцепторами энергии становятся самые длинноволновые формы с широкими полосами ( АХ 25-35 нм) флуоресценции в области 710-740 нм (720, 725-730 и 738 нм). Для этих форд также, характерна постепенная смена более коротковолновых форм длинноволновыми, что, возможно, связано с разной степенью агрегации пигмента. К 12-16 часам отношение

интенсивностей полос флуоресценции становится характерным для взрослого зеленого листа. Сопоставление спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции демонстрирует резкое увеличение стока энергии на длинноволновые формы с широкой полосой и приближение картины миграции энергии к той, которая характерна для зеленых листьев. Это свидетельствует о завершении формирования фотосинтетической единицы.

3 этап ( 16-50 часов зеленения) характеризуется равномерным накоплением хлорофилла во всех формах пигмента, что, по-видимому, соответствует увеличению размера пигментной части светособиранцих комплексов фотосинтетнческой единицы.

Рис.10. Образование нативных форм хлорофилла и накопление зигмента. Цифрами обозначены максимумы поглощения пигментных &орм.

ЗАКЛСНЕНЕ

Из приведенных выше результатов исследований и литературных (анных можно сделать вывод, что казавшийся ранее простым процесс »бразования хлорофилла из предшественника представляет собой •ложную, разветвленную цепь реакций. Схема процесса усложнялась и мере выяснения существования все большего числа промежуточных тадий, каждая из которых представляется заслуживающей

самостоятельного исследования. Механизмы этапов биосинтеза хлорофилла различны по своей природе.

Первичные реакции связаны с достройкой химической структуры молекулы протохлорофиллида до хлорофиллвда, которая представляет собой перенос двух электронов и двух протонов. Эти стадии проявляются при низких температурах ( когда заторможены следующие температурнозанисимые реакции), а также обнаруживаются с помощью спектроскопии высокого временного разрешения. Очевидно, что реакция, идущая через короткоживущее синглетное состояние с высоким квантовым выходом, начальные стадии которой могут протекать при глубоком охлаждении ( до температуры жидкого гелия), пракически в твердой матрице, должна осуществляться внутри комплекса, структура которого обеспечивает сближение и оптимальное взаиморасположение протохлорофаллида и доноров ( и переносчиков) электронов и протонов. Это внугрикомплексное сближение партнеров обусловлено структурой фермента протохлорофиллвд-оксидоредуктазы. По-видимому, важную роль в осуществлении фотовосстановления играет пигмент-пигментное взаимодействие. Подтверждением этому служат наши исследования первичных фотореакций в растворах, где необратимый процесс фотовосстановления оказывается возможным лишь в концентрированных растворах с агрегированным пигментом. Наличие агрегатов (димеров) протохлорофилла, по-видимому, необходимо для заверения процесса его фотовосстановления путем диспропорционирования свободных радикалов, образованных в первичных фотореакцсях. Структура активного пигмент-белкового комплекса достаточно сложна. Оказалось, что, кроме пиридиннуклеотидов, в реакции, фотовосстановления принимают участие флавины. Механизм их участия в процессе пока не ясен. Не исключено существование двух параллельных путей фотобиосинтза хлорофилла: с участием флавинов и без их участия. Относительный вклад этих двух путей регулируется светом, о чем свидетельствуют результаты наших экспериментов о зависимости образования двух спектрально различных первичных форм хлорофиллида от спектрального состава действующего света. Возможно, параллельные пути, осуществляются в разных пигмент-белковых комплексах и могут быть связаны со спецификой формирования двух фотосистем.

НАДФН

дн

НАДФ+ Л*

Б95/Б8+

Ход 684/Б7Б

+ фитол Хл 675/670

Биогенез РЦ ФС 2

М>(2)

Ход Б90/680

' / НАДФ

^ НАДФН Ход 695/605

+ фитол

Ход 683/670

Биогенез ССК

со

Рис.11. Общая схема заключительных стадий биосинтеза хлорофилла в листьях растений.

П 655/650 - активная форма протохлорофиллида; И, X 690 0?Б9Г7+1?68Ю - нефяуореесцирущие парамагнитные интермедиа™, цифрами указаны максимумы поглощения; Хл, Ход - хлорофилл, хлорофмллид ( цифры указывают, соответственно: максимум флуоресценции/максимум поглощения).

В результате первичных реакций ( в суше составляющих фотореакцшо I) формируется хлорофиллид Хлд684/676 -"перекрестная форма", на стадии образования которой процесс разветвляется. Разветвление цепи реакций также регулируется светом: цри высокой интенсивности света осуществляется прямой путь - фотореакция 2, при низкой интенсивности света - "боковой" темновой процесс. Таким образом, с помощью механизмов фоторегуляции контролируется не только общая скорость биосинтеза пигментов, но и соотношение биогенеза различных компонентов фотосинтетического аппарата. Ответвление боковой реакции от основной последовательности в точке между двумя фотохимическими реакциями обеспечивает фоторегуляцию отношения скоростей двух процессов: биогенеза комплексов реакционных центров фотосистемы 2 (Игнатов, Литвин 1993) - при низкой интенсивности света, и основного пула пигментов светособиранцих комплексов - при высокой интенсивности света.

Темновые процессы, следующие после фотореакций включают этерификацию пигмента фитолом, ослабление пигмент-пигментного взаимодействия, изменения пигмент-белкового комплекса, завершающееся его дезинтеграцией.

Дальнейшие превращения хлорофилла связаны с образованием нативных структур, включающих около Ю пигментных форм, характерных для антенны "взрослого" листа.

Общая схема процессов представлена на рис.И.

вьвода

1. Установлена последовательность образования промежуточных форм хлорофиллида из протохлорофиллида и пути их превращения в хлорофилл в этиолированных листьях растений. Обнаружено, что биосинтез хлорофилла включает две последовательные фотохимические реакции, в месте сопряжения которых ответвляется "боковой" путь, включающий этерификацию молекулы пигмента ( присоединение фитола) и ослабление пигмент-пигментного взаимодействия в комплексе.

2. Исследованы первичные стадии фотохимического восстановления протохлорофиллида в этиолированных листьях при глубоком охлаждении. Показано, что образованию интермедиата Х690,

считавшегося ранее первоначальным продуктом в ходе фотовосстановления протохлорофиллида, предшествует еше одна ( собственно фотохимическая) обратимая промежуточная стадия, цроявлянцаяся в тушении флуоресценции активной формы протохлорофиллида, - образование интермедиата R. Обнаружено, что следующий интермедиа? Х690 представляет собой совокупность двух спектрально различных продуктов: R697 и R688. Таким образом, фотохимическая реакция восстановления молекулы протохлорофиллида осуществляется,по крайней мере, через две последовательныестадии с образованием трех нефлуоресцирунцих интермедиатов:

П655/650 — R-/650 —Ч ХбЭО (R697+R688) —

3. О пошщыо ЭПР-апектроскопии зеленеющих листьев было показано, что фотовосстановление протохлорофиллида включает последовательное образование двух парамагнитных интермедиатов, характеризующихся синглетным сигналом ЭПР с g-фактором свободного электрона, различающихся по ширине сигнала. Сопоставление эезультатов оптической и ЭПР-спектроскопии позволило заключить, iTo нефлуоресцирующие интермедиа™ R и Я6Э0 представляют собой юследовательно образующиеся свободные радикалы хромофора шгмента ( по-видимому, анион-радикал и нейтральный радикал).

4. Исследованы первичные фотохимические реакции протохлорофилла i модельных системах. Установлено, что в разбавленных (Ю~%) iacTBopax пигмента ( мономэрна^ форма) при низкой температуре 77 К) осуществляется элементарная первичная стадия ютовосстановления молекул пигмента, проявляющаяся по тушению шуоресценции и появлению синглетного сигнала ЭПР. Эта реакция олностыо обратима при повышении температуры. В концентрированных астворах с агрегированным пигментом наблюдается более глубокое ревращение с образованием парамагнитного продукта с полосой оглощения при 690 нм.

СХОДСТВО ПерВИЧНЫХ ПРОДУКТОВ фОТОреаКЦИИ in vivo И in vitro видетельствует о том, что наблюдаемые in vivo элементарные гадии образования интермедиатов R и Х690 связаны с этопревращенибМ собственно молекулы пигмента. При этом для авершения реакции фотовосстановления протохлорофиллида юбходимо наличие агрегатов пигмента, что свидетельствует о

важной роли в этой реакции хромофор-хромофорного взаимодействия, на этом основании высказано предположение, что наиболее вероятным механизмом завершающей стадии фотовосстановления протохлорофиллида в первой фотореакции является диспропорционирование свободных радикалов в структурах с агрегированным пигментом.

5. С помощью флуоресцентного метода показано, что флавины, входящие в состав активного пигмент-белкового комплекса, цретерпевают окислительно-восстановительные цревращения в ходе низкотемпературных реакций фотовосстановления протохлорофиллида. Вместе с тем, обнаружено, что в результате фотовосстановления протохлорофиллида m vivo образуется две формы хлорофшшвда: ХЛД695/684 и Хлд684/676, соотношение которых зависит от спектрального состава действующего света. Высказано предположение о существовании двух параллельных путей фотовосстановления протохлорофиллида П655/650, один из которых связан с превращением флавинов.

6. Показано, что коротковолновая форма протохлорофиллида П643/63Э способна к прямому фотопревращению в хлорофиллид, наблюдаемому и в условиях низкой температуры. Обнаружен антистоксовский перенос энергии электронного возбуждения с минорных длинноволновых форм протохлорофилла(ида) на его активную форму П655/650.

7. Прослежено формирование системы спектрально различных нативных форм хлорофилла в зеленеющих листьях, динамика накопления пигмента в этих формах и развитие миграции энергии мевду ниш в процессе формирования фотосинтетических единиц.

а. Совокупность полученных результатов обобщена в схеме заключительной стадии образования хлорофилла в этиолированных листьях растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литвин Ф.Ф., Беляева О.Б. Характеристика отдельных реакций и общая схема биосинтеза нативных форм хлорофилла в этиолированных листьях растений. Биохимия, I97I.T.36, n3, с.625-632.

2. Litvin F.F., Belyasva O.B.. Sequence of photochemical and dark reactions in the terminal stage of chlorophyll biosynthesis. Photosynthetica,1971,v.5, .N3,pp.200-209.

3. Беляева О.Б., Литвин Ф.Ф. Общая схема и кинетика биосинтеза хлорофилла из предшественника в этиолированных листьях растений. Тезисы доклада на iv Мевдународном биофизическом конгрессе, Москва, 1972, с. 22-23.

4. Литвин Ф.Ф., Беляева О.Б., Гуляев Б.А., Синещеков В.А. Организация пигментной системы фотосинтезирупцих организмов и ее связь с первичными фотопроцессами. В сб. "Проблемы биофотохимии", "Наука", Москва, 1973, с.132-147.

5. Литвин Ф.Ф., Гуляев Б.А., Беляева О.Б., Карнеева H.B., Синещеков В.А., Шубин В.В., Стадничук И.Н. Система нативных форм хлорофилла и ее роль в первичных процессах фотосинтеза и развитие в процессе зеленения листьев растений. В сб. "Хлорофилл", Минск, "Наука и техника1; 1974, с. 215-231.

6. Беляева О.Б., Карнеева Н.В., Стадничук И.Н. Образование и накопление нативных форм хлорофилла в листьях растений и миграция энергии меаду ними. Тезисы докл. на сессии совета "Проблемы биофотоники", 1974, с.6.

7. Беляева О.Б., Карнеева Н.В., Стадничук И.Н., Литвин Ф.Ф. Динамика биосинтеза нативных форм хлорофилла от начальных стадий до завершения процесса зеленения этиолированных листьев. Биохимия, 1975, т. 40, N5, с. 951-961.

8. Беляева О.Б., Карнеева Н.В., Стадничук И.Н. Образование и накопление нативных форм хлорофилла в зеленеющих этиолированных листьях. Тезисы докладов на хп Мевдународном ботаническом конгрессе, 1976, Ленинград, с. 420.

9. Литвин Ф.Ф., Ефимцев Е.И.,Игнатов Н.В., Беляева О.Б. Доказательство существования двух фотохимических реакций в

процессе биосинтеза хлорофилла и исследование переноса энергии между ними. Физиология растений, 1976, т. ЯЗ, Ni, о. 17-24.

10. Litvin F.F., Ignatov N.V., Efimtzev Е.I., Belуаеva О.В. Two successive photoehemical reactions in chlorophyll biosynthesis. Photosynthetica, 1978, v.12,N4,pp.375-3Bl.

11. Беляева О.Б. Изучение процесса фотобиосинтеза хлорофилла в растениях с помощью флуоресцентного метода. Тезисы докладов xxyi Всесоюзного совещания по люминесценции. Самарканд, 1979, с. 138.

12. Беляева О.Б., Литвин Ф.Ф. О новых промежуточных реакциях в цроцессе фотовосстановления протохлорофиллида. Биофизика, 1980, т.26, n4, с. 617-623.

13. Беляева О.Б., Игнатов Н.В., Литвин Ф.Ф. Первичные фотофизические и фотохимические реакции в протохлорофиллид-белковом комплексе. Тезисы докладов на симпозиуме специалистов стран - членов СЭВ, Пущино, 1981, с. 8-9.

14. Вальтер Г..Беляева О.Б., Игнатов Н.В. Способность к фотопревращению различных форм протохлорофилла (ида). Тезисы докл. на симпозиуме специалистов стран - членов СЭВ, Пущино, 1981, с. II.

15. Litvin F.F., Ignatov N.V. , Belyaeva O.B.Photoreversibility of transformation of protochlorophyllide into chlorophyll ids. Photobiochemistry and Photobiophysics, 19B1, N2,pp.233-237.

16. Belyaeva O.B., Litvin F. F- Primary reactions of protochlorophyllide into chlorophyl 1 ide phototransf Dr/nation at 77K. Photosynthetica,1931,v.15, N2,pp.210-215.

17. Ignatov n.v., Belyaeva O.B. , Litvin F.F. Energy nigration in the pigment complexes of etiolated leaves. Relation to the photochemical reactions. Abstracts of Fourth international seminar on energy transfer in condensed media. Prague, 1981, p. 16.

18. Синещеков B.A., Гостимский С.А., Беляева О.Б. Исследование комплекса хлорофилл а - каротин и миграции энергии с каротиноидов в мутантах гороха с пониженным содержанием пигментов. Биологические науки, 1982, n7, с. 29-38.

19. Вальтер Г., Беляева О.Б., Игнатов Н.В., Красновский А.А., мл., Литвин Ф.Ф. Способность к фотопревращению различных форм

протохлорофйлла (ида) в Phaseoius соccineus. Биологические науки, 1982, н9, С. 35-39.

20. Беляева О.Б..Игнатов Н.В. Первичные реакции процесса цревращения протохлорофиллида в хлорофиллид при низких температурах. Материалы I Всесоюзного биофизического съезда. Москва, 1982, Тезисы докл., т.1, с. 312.

21 О.В.Belyaeva, E.R.Personova, F.F.Litvin. Photochemical reaction of chlorophyll biosynthesis at 4,2K. Photosynthesis Research, 1983, v.4,HI,pp.81-85.

22. Ignatov N.V., Krasnoveky A.A.jr., Litvin F.F., Belyaeva O.B., Walter G. Low-temperature (77K) spectra of fluorescence and phosphorescence of native forms of protochlorophy11<ide) in etiolated primary leaves of Phaseoius vulgaris and Phaseoius coccineus. Photosynthetica, 1983, v.17,N3,pp.352-360.

23. Игнатов Н.В., Беляева О.Б., Литвин Ф.Ф. Сенсибилизация фотохимической стадии образования хлорофилла длинноволновыми формами протохлорофйлла (ида) и хлорофиллидом при лазерном Облучении. ДОКЛ. АН СССР, 1983, Т. 273, N 3, С. 737-740.

24. Беляева О.Б., Игнатов Н.В., Литвин Ф.Ф. Взаимоотношение фотофазических и фотохимических реакций биосинтеза хлорофилла в листьях растений. Тезисы докл. на 16 конференции ФЕБО, Москва, 1984, С. 251.

25. Беляева О.Б., Быстрова М.И., Сафронова И.А., Литвин Ф.Ф. ®отопревращение протохлорофйлла в растворах и пленках при 77 К. Тезисы докл. на Всесоюзной конференции по химии и применению аорфиринов. Ереван, 1984, с. 193.

26. Belyaeva О.В., Boddi В., Ignatov N.V., Lang F., Litvin F.F. The role of a long-wavelength pigment forms in the chlorophyll biosynthesis. Photosynthesis Research, 1984, N5, p.263-271.

27. Boddi В., Belyaeva O.B. Some properties of the first steps if the greening procese under 680-700 n® illumination. Т03ИСЫ докладов на Международном симпозиуме специалистов стран - членов }ЭВ, 1984, Прага, стр.7.

28. Беляева О.Б., Бысчрова М.И., Сафронова И.А., Литвин Ф.Ф., Срасновокий А.А. Фотоиндуцироваяные обратимые изменения флуоресценции протохлорофйлла в модельных системах. Биофизика,

1985, т. 30, вып. 6, С. 933-938.

29. Беляева О.Б., Тимофеев К.Н., Литвин Ф.Ф. Исследование природы промежуточных продуктов фотовосстаАления протохлорофилла(ида) in vivo и in vitro методами оптической и ЭПР-ппектроскопии. Биофизика, 1987, т. 32, вып. I, с. 104-109.

30.0.B.Belyaeva, К.N.Timifeev, FiF.Litvin. The primary reaction in the protochlorophyllfide) photoreduction as investigated Ъу optical and ESR-spectroscopy. Photosynthesis Research, 1988, N15,pp.247-256.

31. Игнатов H.B., Беляева О.Б., Тимофеев K.H., Литвин Ф.Ф. Фотохимические реакции протохлорофилла во внутренних оболочках семян тыквы. Биофизика, 1988, т.ЗЗ, вып. 3, с. 500-504.

32. Беляева О.Б. Фотохимическая стадия биосинтеза хлорофилла. Глава в монографии "Биогенез пигментного аппарата фотосинтеза", Минск, "Наука и техника", 1988, с. 35-77.

33. Беляева О.Б., Литвин ф.ф. "Фотобиосинтез хлорофилла" ( монография, 104 стр.), Москва, Издательство Московского университета, 1989.

34. Belyaeva О. В. On the mechanism of protochlorophy11( ide) photoredution in vivo and in vitro.Book of abstracts. Third Congress of the European Society for Photobiology. 1989, Budapest, p.138.

35. Звалинский В.И., Беляева О.Б., Воскобойников Г.М. С причинах изменения опаски талломов ульвовых водорослей в перко; размножения. Биология моря, 1989, n5, с. 49-53.

36. О.В.Belyaeva, N.V.Ignatov, F.F.Litvin. Investigation oi the primary intermediates of chlorophy11ide photobiosynthesis a1 low temperature. In: Researchjin Photosynthesis. Murata Я. (ed), 1992, v.3, p.75-78. Proceeding of IX ICP. Nagoya. Japan.

37. Belyaeva O.B. The role of different components of pigmentprotein complex of etiolated leaves in the realization o: protochlorophyl1ide photoreduction. Abstracts of 11—ti International Biophysics Congress, 1993, Budapest, Hungary p.188.

38. Литвин Ф.Ф., Беляева O.B., Игнатов H.B. Механиз заключительных стадий биосинтеза хлорофилла и феофитина

гробяеш биогенеза РЦ ФСп. Биофизика, 1993, т.38, вып. 6, с. 119-939.

39. Ignatov N.V., Belyaeva О.В., Litvin F.F. Low temperature hototransformat ions of protochlorophyll( ide) in etiolated eaves. Photosynth. Research, 1993, v.38, p.117-124.

40. Ignatov N.V., Belyaeva O.B., Litvin F.F. The possible rolB f the flavin components of protochlorophy1lide-protein complexes n the primary processes of protochlorophy11 photoredution in tiolated plant leaves. Photosynthetica, 1993, v.29, N3.

Со1фащения

протохлорофиллид

я хлорофилл

яд хлорофиллид

2 фотосистема

5 реакционный центр

ЗК светособиравдий комплекс

Щ флавинадениндинуклеотид

ЩФ никотинамидадениндинуклеотидфосфат

5ДФН никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

1а килодальтон

Сл миллитесл