Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экологические аспекты применения экзотоксинсодержащих биопрепаратов на сосне обыкновенной

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Экологические аспекты применения экзотоксинсодержащих биопрепаратов на сосне обыкновенной"

игр. од

ин московский

^(^ДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЛЕСА

—- —;; ;и-М*' ?-

На правах рукописи

ЕФИМЦЕВ ЕВГЕНИЙ ИВАНОВИЧ

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩИХ БИОПРЕПАРАТОВ НА СОСНЕ ОБЫКНОВЕННОЙ

Специальность 03.00.16 — Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ч

Москва —

1994

Работа выполнена на кафедре селекции, дендрологии и ботаники лесного факультета Московского государственного университета леса.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор В. В. Кузнецов;

доктор биологических наук, профессор А. Я. Потапенко;

доктор биологических наук А. И- Сметник

Ведущая организация — Всероссийский научно-исследовательский институт охраны природы

Защита диссертации состоится ^^» Л^/гагг/* 1994 г.

в . часов .^^.минут на заседании специализированно-

го ученого совета Д 053.31.05 по экологии при Московском государственном университете леса по адресу: 141001, г. Мытищи-1, Московской области, Московский государственный университет леса, ауд. 313.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета леса.

Автореферат разослан . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированною совета, кандидат биологических наук, доцент Е. Г. КУЛИКОВА.

Подп. к печ. 3.03.94 г. Объем 2 п. л.

Зак. 104 Тир. 100

Типография Московского государственного университета леса

• ВВЕДЕНИЕ

Защита растений от насекомых-вредителей с помощью пестицидов является одним из важнейших направлений научных и • практических изысканий, обеспечивающих повышение выхода продукция фотосинтеза. Использование химических средств в борьбе против насекомых помогло уяснить, что кроме направленного действия инсектицидов возникают побочные эффекты, влиявдие на изменение состояния среды. Негативные последствия применения химических энтомоцидных препаратов вынудили искать новые подходы для защиты растений от насекомых-вредителей.

В последние десятилетия были созданы новые технологии по выпуску инсектицидов на основе биологического синтеза с помощью микроорганизмов. Среди них наибольшее распространение получили бактериальные препараты, энтомоцидные свойства продуцентов кот^ых обнаружил Л.Пастер (1870 г.). Разработка технологии и применение, первого бактериального препарата связаны с именем И.Мечникова (1879 г.).

Выпуск бактериальных препаратов в стране'достиг 12 тыс. т/год, а обрабатываемые ими площади 7-8 млн.га (1989 г.). Объем биоинсектицидов может достичь к 2000 г. 50 % от мирового производства пестицидов. •

Особую группу биопрепаратов представляют бета-экзоток-син-содеряащие инсектициды. Одним из основных энтомопатоген-ных компонентов ряда бактериальных препаратов является токсин .нуклеотидной природы. ' •

Значительные'объёмы производства, широкое применение, рекламируемая безвредность и обнаруженное воздействие на растения требовали' более углублённых исследований в области биотехнологии производства и применения бактериальных препаратов.

Актуальность проблем«. Увеличению эффективности ведения лесного и сельского хозяйства во многом способствует использование энтомопатогеиных биопрепаратов. С их помощью обрабатывается,' примерно, 40 % площадей, пораженных основными хвое-лхстогрызуиими вредителями, однако оставшаяся часть по-прежнему подвергается воздействию химических инсектицидов,.отрицательное влияние которых на биоценозы, чистоту сельскохо-

зяйственной продукции, лекарственных трав хорошо известны. Привлекательность использования "экологически-безвредных" энтомоцидных биопрепаратов, изготовляемых на основе микробиологического синтеза, стимулируется и экономической целесообразностью.

Эффект от применения препаратов, изготовляемых на основе биосинтеза бактериями Bacillus thuringiensis в сосновых насаждениях составил в ценах 1989 года 0,56-0,64 тыс.руб./га, дубравах - 0,10-0,27 тыс.руб./га. Среди широкого ассортименте 'биологических энтомоцидных препаратов (Африкян, 1970; Канды-бин, ,1984, 1989; Кондратьева, 1984; Штерншис 1988) особое месщ занимают ß -экзотоксинсодержащие црепараты (Глушкова и соавт., 1985) битоксибащшшн, турянгин, гомелин и их зарубежные аналоги, продуцируемые бактериями ряда подвидов. Являясь, наряду с кристаллическим дельта-эндотоксином, основным энтомопатогеном ряда биопрепаратов, ß -экзотоксин (БЭТ), в отличии рт белковой природы первого токсина, является аде-ниннуклеотядом. Он был открыт. Макконнешщ.я Ричардсом в 1959 году, его структуру установили позднее (Фаркаш и соавт., 1969). Изучены свойства БЭТ, одно из, которых ингибирование ..ДНК - зависимой РНК полимеразы (Шебеога и. соавт., 1970), по-видимому, лежит в основе его энтомоцидного эффекта. Нукле-отидная природа,- указанное свойство и отмеченный терратоген-ный эффект у насекомых зародили некоторые сомнения в безопасности использования бета-экзотоксинсодержащих биопрепаратов. Однако изучение (Кантвелл и соавт., 1983) характера действия ■БЭТ с помощью теста Эймса, показало отсутствие мутагенного эффекта у салмонелл. В то же время появлящиеся публикации (Шарма и соавт., 1976; Алексеенок, 1986) с противоречивыми результатами по характеру воздействия БЭТ на растения оставляли сомнения в безопасности применения бета-экзотоксинсо-держаидос биологических препаратов. Неоднозначен и сложен состав внеклеточных метаболитов Вас. thuringiensis (Банкова, 1978). ' . , ;. ';•,.'

Несмотря на имеющиеся факты, вопрос о воздействии биопрепаратов на биологические ■ системы и, в том числе, на растения оставался малоизученным. Этому способствовало отсутствие;

февде всего, надеиных способов количественного контроля БЭТ ) биопрепаратах, вследствие чего, например, доза при их применении значительно (1,5-2 раза) варьирует. По-видимому, ювершенствование биотехнологического процесса производства Зактеряальных средств защиты растений также определялось развитием количественного подхода. Существование перечисленных 1роблем,на фоне начавшегося широкого использования экзоток-сянсодераащих энтомопатогенных биопрепаратов в лесном и сельском хозяйствах, а такие при защите посевов кормовых и лекарственных трав, настоятельно требует изучения их воздействия т растения.

Цель и задачи исследований. Основная цель исследований заключалась в разработке и обосновании концепции, направлен- . той на доказательство 'необходимости введения контролируемого применения бета-экзотоксинсодержащих препаратов, служащей эдним из основных путей обеспечения экологической безопасности лесных фитод^нозов при обработке.

Исследования били посвящены решению взаимосвязанных проблем промышленной биотехнологии производства и экологической безопасности применения энтомопатогенных биопрепаратов для растений.

Задачи исследований включали:

1. Разработку способов контроля жизнеспособности микроорганизмов' на различных этапах биотехнологического процесса производства бактериальных препаратов.

2. Создание методов количественного контроля энтомоцпд-1шх бактериальных экзотоксинов в жидалх л твердых препаратах.

3. Исследование процессов биосинтеза экзотоксинов для оптимизации параметров прошилэнной биотехнологии.

-4. Изучение физико-химических и биологических свойств нового экзотоксина нуглсотпдной природа с частичной расшифровкой структуры его молекулы.

5. Попек, отбор методов я выявление критериев дая оценил изменения биологического состояния растений под воздеНси::!-зм ойзотолспноз С1:опрепар,а.тоз. „

6. Сценку алпяняя эн-гоьхздзнше аденшшукяоотидоз на се-.:-о:шоз потомство соси;« с учого:: окологичеекях особенностей

произр&стандя маточников,

7. Изучение характера изменения биометрических показателей растений, а также спектральных параметров пиментов и процесса фотосинтеза в целостной системе растительной клетка под воздействием антропогенных факторов, включая биопрепарата.

8. Выяснение механизма биосинтеза пигментов у растений и егр нарушения, при воздействии на них экзотоксинов биопрепаратов, а такке изменения экологических условий произрастания .сосны обыкновенной.

I 9. Изучение влияния обработок бактериальным препаратом | насаздений сосиы обыкновенной разного возраста в естественных условиях.

10. Генетическая оценка характера влияния экзотоксинов биопрепаратов на сосну обыкновенную, передачу и сохранение вновь приобретенных под их воздействием признаков в потомстве у одноклеточных водорослей.

IIРазработка экологически-оправданной концепции применения бактериальных препаратов на основе полученных доказательств их воздействия на растения.

Научная новизна. Предложен количественный метод аначяза бета-экзотоксина и близкого ему по природе экзогенного энтомо-цидного метаболита, названного бета-2 экзотоксином (БЭТ-2), в биопрепаратах. Получены два авторских свидетельства на способы их контроля. Обнаружен, впервые, новый энтомоцидный экзотоксин адениновой природы в биопрепарате битоксибациллине, а также лепидоциде и дендробациллине. Изучены природа и свойства БЭТ-2, оказавшиеся близкими БЭТ, но имеющие и существенное отличие. Созданный метод внедрен в научно-исслёдовательс-кую и производственную сферу деятельности.

Показана инициация изменений в пигментном аппарате и процессе фотосинтеза одноклеточной водоросли хлореллы, проростках сосны, а также биометрических показателях последней, вызываемых экзотоксинами.

Результаты работы позволяют сделать вывод о прямом воздействии БЭТ и БЭТ-2 Вас , Ш1г1па1ейЕ1а - на пигментный -аппарат и фотосистемы высших, растений и водорослей.

Кариологаческий анализ показал, 'что экзотоксин вызывает

изменения в меристеме анафазных клеток корешков проростков сосны обыкновенной, увеличивая число хромосомных аберраций на один - два порядка.

Получены экспериментальные доказательства предложенной ранее схемы заключительного этапа фотообразования нативных форм хлорофилла из его предшественника у растений. Использование разработанных в этой области подходов явилось плодотворным при изучении нарушений пигментного аппарата растений возникавших под воздействием экзотоксинов в ходе темнрвого и светового этапов биосинтеза и превращения протохлорофилла из предшественника у сосны обыкновенной.

Фотосинтетдческое выделение кислорода одноклеточной водорослью хлореллой и проростками сосны, выращенными в присутствии экзотоксинов, обнаружило общее снижение у них скорости фотосинтеза.; 1 '

Обнаруженное изменение световых кривых и спектров действия-фотосинтеза проростков сосны и хлореллы, частично, связано с изменением пигментного аппарата, обнаруживаемого по результатам изучения спектров поглощения, флуоресценции и ее возбуждения. Возрастание эффективности фотосинтеза водорослей, в области более 680 нм обусловлено, возможно, возросшим накоплением длинноволновых форм хлорофилла, поглощающих-в области за 700 ил. Наблюдаемые изменения в пигментном аппарате подтверждаются спектральным смещением границы фотосинтеза в длинноволновую область. Увеличение поглощения в видимой области трудно объяснить только возросшим светорассеянием клеток, что подтверждается результатами изучения спектров действия. На хламидомонаде показана передача-па наследству вновь приобретенных, под действием экзотоксинов, свойств на протяжении развития нескольких поколений.Близость получен-' них результатов у высших растений и водорослей указывает, что механизм действия экзотоксинов у них, примерно, одинаков..

Обнаруженное воздействие энтомопатогенных экзотоксинов адениновой природы отрекается на всех показателях, связанных с ростом,- развитием растения. Воздействие экзотоксинов,.-оцениваемое по спектральным а генетическим изменениям, близко эффекту воздействия промкишенных выбросов в атмосферу на маточники и семенное потомство сосны обыкновенной. Обнаружен-

ное явление носит характер синергизма при одновременном действии двух указанных факторов.

В ходе исследования процесса производства битоксибациллина было установлено, что протекание биологических процессов в ферментере, по-видимому, регулируется взаимодействием БЭТ с БЭТ-2. Последний смещает я регулирует рН среды взаимодействием собственных молекул, а также изменяет ее с помощью реакции с БЭТ, что вызывает изменение метаболизма у продуцентов биопрепаратов. Получены доказательства универсальности обнаруженного механизма регуляции распространяющегося на близкородственные бактерии вас. гьиг1пз1'епв1в по обнаружению у них БЭТ-2. Последнее свидетельствует о том, что выпускаемые препараты на основе этих бактерий синтезируют или оба экзотоксина (битоксибациллин), или только бета-2 экзотоксин (леоидоцид и дендробациллин). Доказана, с помощью методов ЯМР, Ж- и УФ- спектроскопии, близость природы моле-, кул ,двух экзотоксинов. Оптимизированы параметры процесса ферментации при производстве препарата битоксибациллина. Созданный новый способ оценки содержания экзотоксинов в препаратах позволяет контролировать их содержание, и впервые охарактеризовать количественно биопрепараты, а также осуществлять слежение за протеканием процесса синтеза этих токсинов, проводить направленный отбор ряда ' продуцентов бактерий, перейти к точной дозировке "биопрепаратов и, на этой основе, свести к минимуму воздействие экзотоксинов на окружающую среду. _ '

Практическая значимость работы. Оптимизация параметров биотехнологического процесса, осуществленная с помощью количественного определения основных энтомоцидных компонентов, позволила сократить сроки основного процесса получения биопрепарата битоксибациллина - ферментацию, примерно, в 2 раза.

Показано, что 'ориентация научных учреждений и промышленных предприятий,на общепринятый критерий вирулентности биопрепарата, определяемого по числу спор, не верен а требует пересмотра. '"'".".."'■"

Экономический эффект от внедрения количественного метода определения токсинов в практику- научно-исследовательских

учреждений л промышленных предприятий может составить десяти миллионов рублей (в ценах 1988 года).

Особую роль может сыграть введение метода количественного определения экзотоксинов при аттестации промышленных -препаратов и оценке используемых концентраций. На это нацелена разработанная экологически-оправданная концепция применения энтомоцидных биопрепаратов, без учета которой невозможно создание законченной экологически-безопасной биотехнологии производства и применения бактериальных энтомоцидных биопрепаратов.

Научная постановка проблемы, программа я методы исследований, их проведение и теоретическое обобщение полученных результатов выполнены автором самостоятельно. Изучение ряда вопросов осуществлялось при участии аспирантов и сотрудников: |Гольтяева С.в|, Бойченко В.А., Игнатова В.Н., Бурова Г.П., Новикова М.Н., ^алентировой О.Б., Кузнецова М.И., которым автор выражает глубокую благодарность.

Результаты работ внедрены в практику научно-исследовательского учреждения и Бердского химического завода. Они включают создание метода количественного определения бета-экзотоксина (А.С. № 1359744 от 12 августа 1985 г.), а-также бета- и бета-2 экзотоксинов (А.С. № 1745172 от 8 марта 1992 г.) в биологических препаратах, выпускаемых промышленностью.

Апробация работы. Основные результаты были доложены и обсу,вдены на II Всесоюзном симпозиуме по колебательным процессам в биологических я химических системах (Дущшга, 1971), на 1У Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972), на Всесоюзном симпозиуме "Биофизические аспекты загрязнения биосферы (Москва, 1973), на сессии ыенуакультетского координационного совета. ¡ЯУ по биоготоняке (Пущлно, 1974), на XII Международном Ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), на семинаре в Австралийском национальном университете (Канберра, 1976), на IX Всесоюзной конференции по итогам исследования '.о;:аниз,.,.а фотосинтеза (Пятно, 1976), па итоговой научно-нрак-.мчсскол конференция ьИУ - Глазглкробиопрома (Лосква, 1286), аа всесоюзной конференция по пробловам физиологии и биохпжа ;.ревеск.чх растении (Петрозаводск, 1969), на Всесоюзной донфс-

ренции создания и применения микробиологических средств защиты'растений (Белигож , 1989), на II Симпозиуме стран-членов СЭВ по микробным пестицидам (Протвино, 1990), Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 46 рабрт в советских и международных изданиях, получено 4 авторские свидетельства,

. Структура диссертации. Работа включает введение, изложение! полученных результатов и их обсуждение, отраженное в 8 главах, заключение, выводы и список цитируемой литературы.

ОБЪЕКТЫ И METO® ИССЛЕДОВАНИЯ

• ' Изучение метаболизма и жизнеспособности бактерий проводилось на Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis , штаммы 98HI и ИШ 1140 . Бета- и Бета-2 экзотоксины выделяли« из.серийных заводских биопрепаратов битоксибациллада,' продуцент Вас.thuringiensis subsp. thuring. , HIalB ИЛИ 98HI ПО каталогу Бердского химического завода, и только бетг2 экзотоксин из промышленных препаратов дендробащшшна (B.thur.sut?¡?v dendrolimuä;H4a4B) И лепидоцида (B.-fc.subsp.kurstaki ; НЗаЗв' Биологическая активность указанных 'дрёпаратов и выделенных из них токсинов оценивалась на гдухе комнатной (Musca dornest.).

Объектом,при изучении мутагенной активности,служили Salmonella ty.phimurium, ТАЭ8 и TAI00 и анафазные клетки меристемы корешков проростков.Pinus sylvestrisoöujero сбора Московской области. Действие экзотоксинов изучалось на проростках семян сосны обыкновенной из Куровского мехлесхоза Московской области и популяции сосны обыкновенной Дзержинского -лесхоза Нижегородской области, подвергавшейся длительному воздействию промышленных выбросов в атмосферу. Кроме высших растений влияние.токсинов исследовалось на одноклеточных зелёных (OhlainydOMonas reinhardi ,Chlorella vulgaris ) всдорос-лнк куньишируемых в колбах на агаре юш в среде Тамия.

Одно-, трех- и даадцатилетние культуры сосны обыкновенной служили объектом при обработках битоксибациллином в естесз венных условиях Подмосковья и Херсонской области Украины.

Способ количественного определения БЭТ и БЭТ-2 включаек растворение биопрепарата в воде с рН4 освобождение среды от остатков питальной среды центрифугированием; отделения БЭТ-2 от БЭТ смещением рН до 7,2 и извлечения БЭТ из его бариевой соли с помощью Нд^О^. Выделенные экзотоксины растворяют в воде с рНд д, фбтометрируют при длине волны 259 нм,с учётом светорассеяния. Анализ чистоты токсинов осуществляется с помощью тонкослойной хроматографии и использования метчика (эталон БЭТ из института Л.Пастера, Пария).

Способ количественного определения жизнеспособных бактерий в суспензий основан на взаимосвязи их состояния со"временем затухания кинетической кривбй хемшгкминесценция микроорганизмов, возникающей при их окислении КМпО^.

Способ определения числа живых клеток бактерий в суспен-зиа-с помощью я^/кции флуоресценции НАДЕГ^ дашна волны регистрации 440 нм, возбуждение 340 нм) анаэробиозом, развивающимся вследствии дахания клеток.

Способ контроля состояния популяции бактерий в процессе культивирования,по изменению их цитохромной системы, основан на измерении дифференциальных спектров поглощения (окисленные минус восстановленные) микроорганизмов.

Способ внутри- и внеклеточного определения скорости изменения концентрации кяслорода-полярографическим методом у растений а бактерий.

Метода спектральных исследований пиментов и процесса фотосинтеза в нативных клетках■растений представлены в таблице I. '

I. ИЗУЧЕНИЕ ЭНТШОЦИЩШХ ВНШ2Т0ЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ АДЕНШЮВОй ПР1ГР0ЛЫ БАКТЕРИИ ЗАС.кгошхижк.

Установление состава, природы, характера биологической .-.ктовноста и спектра действия на кавые организмы биопрепаратов ядяястся первоочередно;! задаче;: при создании экологически ■•истой биотехнологии. Отечественный и зарубежный опыт создания с.-исхериалышх онтоыоцядних препаратов показал, что решение этих вопросов является одной из сло;шейсйх научных задач.

Таблица I

СПЕКТРАЛЬНЫЙ УСТАНОВКИ ПРИЖИЗНЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ РАСТЕНИЙ

Наименование 1 Технические а спектральные характе- : Решаемые задачи

способа : ристики метода , :

I. Спектрофоюметрия:

а. обычная '

б.повышенной чувств.

в. производная

г. низкотемперат.

д. скоростная

II. . Флуорометрия:

а. Спектры флуоресценции

Автоматический дифференциальный спектро- Приязненное изучение спектров гоглоще-фотометр, СФ-18, Д=Х/шк, 400-750нм, скорость 10-60 нм/мин.,

СФ-18, Л=10"2/шк.

Первая, вторая и четвертая

производная спектра поглощения.

Охлаждение регулируемое <$0-120°С) я низкотемпературное 177°К пли -196°С). I спектр за 10~^сек, б00-700нм. Импульсное освещение объекта.

няя листьев, гомогенатов, хлоропластов, клеток.

Цитохромы (растений и бактерий), этиолированные растения.

Определение параметров полос поглощения в его спектре, лучшее разрешение структуры, цитохромы.

Исследование состояния хлорофилла в клетке.

м N

Изучение фотобиосинтеза хлорофилла в растениях.

Автоматическая установка, область Изучение пигментов в целых листьях и их

регистрации УФ-ИК (260-900 ид) при низ- изменение при экзогенном воздействии.

ких температурах (77 К).

Спектры НАД-Н:

б. Спектры возбуждения Автоматич. установка, УФ-ИК ,1260-900нм) Поглощение и миграция энергии в биологи-флуоресценции низкие температуры 177°К). ческих системах, изменения.

ИГ.а. Кинетика обмена 0g Измерение по,,точкам или в автоматичес- Кинетика, световые кривые и спектры дей-у растений и оакте- ком реииме, 400-800 юл, способ п'олярогра- ствия фотосинтеза по обмену у фяческин. растений.

б. Спектры деиствия.

Количественное .определение бета-экзотоксина в биопрепаратах битоксибациллина и биологическая активность его энтомо-цидкых компонентов. Поиски количественного способа определения БЭТ ведутся более 30 лет. Последнее десятилетие характеризуется широким использованием для этой цели различных физико-химических и иммунных способов анализа. Разработан и прошел проверку, с помощью метода ядерного магнитного резонанса, способ количественного определения БЭТ в биопрепаратах(табл.2). Совместное использование двух методов позволило уточнить коэффициент поглощения БЭТ, необходимый для проведения количественных расчетов при определении его содержания в препаратах. Полученные результаты подтверждены биотестом, который иллюстрирует невысокую надежность биологического метода. Согласно техническим условиям (ТУ) на битоксибациллин, оценка летальной концентрация используется в качестве крите-

рия для установления его качества. Одной из основных характеристик активности биопрепарата, согласно ТУ, является количество находящихся в нем ;кязнеспособных спор. Установлено, что число спор не коррелирует ни с содержанием БЭТ, ни с антибиотической активностью растворов кристаллов'эндотоксина и, следовательно, не мо:;;ет служить критерием биологической активности биопрепарата. •

Исследование кинетики накопления бета-экзотоксина при производстве бптокслбациллдна и обнаружение нового экзотоксина адеклновой пплроды. Изучен процесс накошгеняя БЭТ в куль-турлльпо;; жидкости во время ферментации (табл.3) и установлено, что кинетическая кривая проходит iepe3.. максимум и затем гклязгтся. 2е форма -xwwstcf : .чал. :эдействяем двух экзоток-сввол •:> ферментере.

Изучешв upotí культурально* кадкостп (табл.3) на содер-:: лле ГЭТ показывает, '¡то з. ких шбладкэгея спонтанные отклонил я . Do лее;; азучеянгх (*»ер.\!ектациях кас&идалось c&iegcuze рН ••.педн от 1л:сл!х: ышоппП л 1 глоч;л::л. Оценка биологической '.ли.ч.х'лч: п.; .ях-чагкол :-;гло чоказолл отсутствие существенных

. чллллЛ upocto: л/ллчучлльной лидкостл с максимальном

: ччснь:л;ччлчся (уас'л.3),к кошу фгркеьтецал, содержанием

— ' - • . _ Таблица 2

Количественное, определение бета-экзотокслна в "бактериальных препаратах различными методами и. оценка их активности _

Название препарата-

Суммарное содержание экзогенных метаболитов и бета-экзотоксина, мг/г

Содержание бета-экзотоксина,.мг/г

ГЛетальная -г концен-

СпектроФотометряческое опреде-: йпектро- : трация(ЛКсп)

ление элюата пятен с хроматог-; скрпия ¡препарата, '

_-грамм •_ : т :мг/г корма,

1-е пятно: 2-е пятно! ' X ¡ Ш Н [муха, комнат-

ная

. Турингин-1

Битоксябациллин, I

14,9+0,0 6,6+0,1

Бятоксябациллин, партия 2 '

Битоксибациллин, партия 3

Стандарт

битоксибациллина

Очищенный бета-экзотоксш из битоксибациллина

360

7,2+0,1 7,2+0,1 7,2+0,1 7,1+0,4 0,037 ~~ "" ~ }

4/9+0,1 . 4,9+0,1" 4,9+0,1 5,0+0,6 0,055

3,0 3,3 3,2+0,2 3,5+0,2

-1,9 1,8 1,8+0,1

330 330 330+30 360+30

0,043 0,082 0,058

Примечание:

Суммарное содержание экзогенных метаболитов рассчитывали, исходя аз предпосылки, что их коэффициент поглощения равен коэффициенту для бета-экзотоксина.

Повторное изучение проб (табл.4) культуральной жидкости, выдержанных 6 суток при пониженной (+3°С) температуре, показало, что содержание БЭТ в них изменилось, по сравнении с первоначальным', достигнув, примерно, одного (0,64 г/л) уровня. При этом произошло смещение рН культуральной жидкости. На основании полученных результатов и последующих экспериментов было установлено, что падение содержания БЭТ свяаано с образованием комплекса БЭТ и неизвестного метаболита, способного изменять рН среды. Исследование взаимосвязи между рН проб и изменением светорассеяния культуральной жидкостя позволили установить, что его появление обратимо регулируется изменением рН среды. Выделенное из культуральной жидкости энтомоцид-ное (табл.З) вещество, образующее светорассеивавдие структуры, как было установлено позже, оказалось вторым компонентом, образующим коглплекс с БЭТ. Очевидно, что этот процесс и приводил . к наблюдаемому к~"ебанию содержания БЭТ в пробах, что отражалось на кинетической, кривой (табл.З) накопления БЭТ. '

Изучение свойств нового эктомоцядного экзогенного метаболита." Метаболит выделен и очшцен, растворяется в воде сдвигая ее рН, в зависимости от концентрации, до 9,3. Модель-, ные опыты подтвердили обнаруженное ранее взаимодействие двух экзотоксинов. йиофильно высуженный метаболит был гранулирован и сыпуч. Сопоставление спектров поглощения водных растворов БЭТ и метаболита, а. также .высших производных спек-

тров поглощения показало их идентичность.. Результаты .спектрального'анализа Показали, что хромофором неизвестного экзотоксина является, как и у БЭТ, адениновое основание, имеющее в УФ-области спектра главный максимум 259 к\ги"плечо" 264 нм, а в ИК- области 1650 см-1. .

-Существенные различия между молекулами'двух экзотоксинов наблюдались в области, связанной с колебаниями ОН- группы, где поглощение (1420 см-^) у обнаруженного экзотоксина, по сравне-' нию с БЭТ, уменьшилось на 60-80 %,. Обнаруженные полосы поглощения с максимумами 1100 и 570 см~* относятся, соответственно, к продольным и поперечным колебаниям иона Р0~. Спектроскопия ЯМР^Н и 3% обнарушли сходство молекул экзотоксинов, подтвердив результаты ТФ- и ИК- спектроскопия, а такае их отличия,

Таблица 3

Характеристика проб культуральной жидкости и динамика накопления в них экзотоксинов адениновой природы при производстве биопрепарата битоксибацшшша

Период времени

от начала фермента- . ции.час.

;Содер- ; :аание : ; бета- экзо-:токси- : :на (БЭТ),: : г/л :

Содер- : :жание : -бега-2 : :экзоток-: Хина :

•(БЭТ-2),;

: г/л

Суммар-: ное со-: держа- : рН

ние эк-.'среды:

;м5о :дяя ком-:натной

зоток-сшов, г/л

.мухи, :мл/г .'корма, : БЭТ

:ж50 доя

:комнатной ••мухи, :мл/г : корма,

:БЭТ-2

12 0,049 0,228 0,277 5,8 - -

14 0,100 0,312 0,412 5,6 - -

16 0,120 0,436 0,556 5,2 - -

18 0,217. 0,647 0,864 ' 5,5 ' 0,5

20 . 0,186 0,735 0,931 5,9 -

22 . 0,316 0,547 0,863 6,3 - -

24 0,298 0,485. 0,783 6,7 -

26 0,198 0,700, 0,898 6,7 - -

28 0,167 0,681. 0,848' 6,7 1,15 0,48

Таблица 4

Изменение содержания ^-экзотоксина в пробах культуральной жидкости до (А) и после (Б) их хранения при пониненной температуре

Период времени от начала ферментации, часы

А. Концентрация ^в-эизо-токсина в пробе-,г/л, и её рН

Б. Концентрация ^В -экзотоксина в пробе, г/л, я её рК

24 0,828; 7.1 0,566; 6,5

26 - 0,75.0;. . 7,4".■ 0,674,- 7,0

28 0,688; 7,4 0,679; 7,1

32 0,543; /:.--' 7,6 0,632; 7,2

34 ■ 0,433; : 7,6. . 0,618; 7,9

касающиеся способности молекул нового токсина к смещению рН, отсутствия взаимодействия с Ва+2. Полученные результаты позволили отнести обнаруженное соединение к нуклеозидщшгофос- ' фатам и назвать его бета-2 экзотоксином (БЭТ-2).

Показано, что БЭТ-2 ингибирует ДНК-зависимую РНК поли-меразу и обладает энтомопатогенностыо близкой БЭТ. Мутагенную активность по тесту Эймса у двух экзотоксинов обнаружить не удалось. На основании полученных результатов можно заключить, что обнаруженный экзогенный энтомоцидный метаболит близок по природе БЭТ.

Развитие новых представлений по количественному определению двух экзотоксинов в биопрепаратах и возможной роли БЭТ-2 в регулярии метаболизма у бактерий. Обнаружение БЭТ-2 и установление его свойств привело к разработке нового способа количественного определения каждого из двух экзотоксинов в битоксибащшг'ше. Его применение при определении двух экзотоксинов в процессе ферментации (табл.3) позволило установить, что изменение содержания БЭТ в пробах определяется его взаимодействием с БЭТ-2, что подтверждается определённой стабильностью их суммы. Комплексообразование и диссоциация двух экзотоксинов показана на моделях. Они, очевидно, обеспечивают поддержание и регуляцию рН культуральной жидкости при ферментации. Показано, что изменение рН и его стабилизация может достигаться также с помощью образования агрегатов, состоящих только из молекул БЭТ-2. Изучена (табл.3)'кинетическая кривая накопления БЭТ-2 и установлено, что количество синтезируемого экзотоксина превышает количество БЭТ в .культуральной жидкости.

Из полученных новых результатов следует, что наиболее сложная часть биотехнологического процесса получения битокси-бащшшна - ферментация, может быть сокращена во времени на -30-40 процентов без ущерба в накоплении (табл.3) экзотоксинов я нарушения энтомоцлдной активности кристаллов эндотоксина. Последнее подтверждено специальным исследованием, фундаментальные труда И.Л.Работновой, тлеющиеся данные (Ыантейфель, 1949", Арзуыанов,.1979) свидетельствуют о значительной роли изменения рН среда в жизнедеятельности микроорганизмов. Исходя из этих представлений и обнаруженных свойств БЭТ-2, характера поведе-

ния двух экзотоксинов при ферментации, было .предположено, что БЭТ-2 может содержаться и в других биологических препаратах, получаемых на основе синтеза бактерий Bacillus thu-ringiensis ряда подвидов, используемых в промышленности.

Действительно оказалось, что серийные заводские биопрепараты лепидоцид и дендробацшшш, не синтезирующие БЭТ, содержат в своем составе энтомоцидный метаболит по спектральным ^ физико-химическим характеристикам близкий БЭТ-2, причем в количествах более0,^ от их сухого веса.

, Полученные результаты, по-видимому, подтвердились обнаружением БЭТ-2, как утвервдают, урациловой природы у Вас. thu-ringiensis subsp.morrisoni (Левшсон а соавт., 1990). Таким образом, все выпускаемые бактериальные биологические препараты на основе Вас. ttmri'ngiensic имеют в своем составе экзотоксины нуклеотвдной природы. Методические трудности количественного определения БЭТ в препаратах, по-видимому, . были связаны с наличием БЭТ-2,' его особенностями и взаимодействуем между экзотоксинами. В основе разработанного новогб метода определения экзотоксинов (A.C. & I745I72 от 8 марта 1992 г.) лежит концепция регуляции метаболизма у Bacillus

thuringiens.c помощью экзогенных метаболитов БЭТ я БЭТ-2 (Рис.1 ). .

. 2,- ВОЗДЕЙСТВИЕ ШШЛЖЕННЫХ ВЫБРОСОВ В АТМОСФЕРУ НА

СОСНУ ОБЫКНОВЕННУЮ И.ЕЁ СШЕННОЕ ПОТОМСТВО •

Изучение последствий воздействия на лесные фитоценозы 'промышленных выбросов выявило их мутагенный характер. Происходящие изменения приводят к ослаблению древостоев, которые более активно заселяются насекомыми вредителями (Воронцов А..И,, Мозолевекая Е,Г., 1987). При уходе за такими насаждениями .предпочтение отдаётся обработкам насекомых , с использованием биопрепаратов. Изучениюих воздействия nà растения цред-шествоавл^ исследование, характеризующее уровень состояния сосни обыкновенной, обусловленный изменением экологических урловяй произрастания. -, :г

: Влияние промышленных-эмиссий на насаждения сосны обыкновенной издалась в. Дзержинском лесхозе Нижегородской об-

'ПУЛ i органических i кислот.__|

л рн I I; +д pH

Культуральная j жидкость

-д pH

рн> 4,7 С» 0,4 г/л

Г"

- л pH ] 11 2 +дрН

— —i-L----L_j------1

— —1 Комплекс 1 (ЭМ+ЭМ)

эм

1 1 2 Диссоциация "r"j

I__комплекса J__|

Рис. I. » .

Предполагаемый механизм участия бактериальных экзоген-■ них метаболитов аденшовой природа в регуляции внутриклеточных процессов у Bacillus thuringiensis с помощью смещения pH среда.

А+Б ~ бактерии синтезирующие ß -экзотоксин (БЭТ) и экзогенный энгомоцядный метаболит (ЭМ), у

Bacillus thuringionüis sabsp. thurinfjiennis.

Б - только у некоторых бактерийНпс. thurinsiensis subsp, kurstnki, dondrolimus,например, ласти, входящие в Центральный лесосеменной .район. Присутствие токсичных веществ в воздухе (сернистого ангидрида, окислов азота, хлора) установлено в 20 км от хяшческох заводов. Изучение ' проводилось в одаойозрастних насаждениях и культурах. Степень воздействия на сосну оценивалась по содержанию серы и хвое. Дифференциация пробных площадей и отдельных деревьев, из степени накопления серы, мояет слушть косзеннш критерием '

содержания в воздушной среде сернистого ангидрида. Контрольные площади взяты на расстоянии 45 км от источников выбросов.

С увеличением содержания серы в хвое снижается средняя высота и средний диаметр деревьев в насаждении, уменьшается доля здоровых деревьев в популяции_при возрастании доли ослабленных. 'Критический уровень содержания серы в хвое 0,120,14 %. Увеличение его приводит к угнетению роста хвои. Показано, что воздействие промышленных эмиссий приводит к снижению содержания хлорофилла в хвое, которое зависит от величины экзогенного воздействия и определяется возрастом и периодом вегетации.

Действие промышленных выбросов в атмосферу на семенное потомство и проростки сосны. Исследования показали, что в . изучаемом районе сосны шлет, по сравнению с контрольными условиями, меньшую длину (8 %) и мас.су сырой шишки (на 18 %). В них содержится в 2 раза меньшее количество семян, с бблышш процентом пустых (до 10 %). Семена из этих условий имеют по-ниженную'всхожесть (до 12 %) и энергию прорастания падающую 1 до 57 % .

Воздействие на наследственны^ аппарат растений было оценено с помощью кариологического анализа в мерист,еме корешков проростков семян с деревьев произрастающих в различных по уровню загрязнения атмосферы условиях. В аберрантных ана-фазных клетках и их хромосомном аппарате наблюдались одиночные, двойные' и тройные мосты, фрагменты , отставания или , опережения. '

. Как показали расчеты (табл.5), антропогенное воздействие приводит к увеличёнию,более чем на порядок, числа хромосомных аберраций. . • .

Проведено сравнительное изучение содержания Сахаров в прорастающих семенах с деревьев, произрастающих в условиях различного экологического стресса, шкрокалометрическим методом. Результаты свидетельствуют о достоверном различии в скорости накопления сахароз.у семян сосны, выросших в различных экологических условищ;-. и обусловленных воздействием на их генетический аппарат промышленных выбросов в атмосферу.

Протекание .процесса фотосинтеза'у растений зависит от

Таблица 5

Последствия воздействия промышленных выбросов в атмосферу на генетический аппарат семенного потомства сосны обыкновенной

Контроль, пробная площадь Я 18 Опыт, пробная площадь № I 1. - ХГХ2

число хромосомных аберраций/ $ ,

х1± хх : б V ; Р :х2- х2 : | V ;Р

0,6+0,12 0,2 33,3 20,0 14,5+0,27 0,46 3,2 1,9 39,26

сопряженного функционирования большого числа ферментативных и световых реакций.

Как было установлено, проростки из семян с деревьев, подвергающихся воздействию поллютантов, имеют более низкий уровень фотосинтеза. При этом наименьшая скорость обмена кислорода наблюдается у проростков с деревьев, имеющих пониженное содержание хлорофилла в хвое. ■• . '

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что вещества,промышленные эксгалаты,вызывают глубокие нарушения в организме находящие отражение в работе фотосинтетического аппарата. Очевидным подтверждением этому служат данные по ферментативному и генетическому анализу состояния семян., .

' Отбор сосны обыкновенной по устойчивости к действию промышленных эмиссий осуществлён на основе фенотипического и генотипического анализа популяции. Проведено изучение стенотипической изменчивости сосны обыкновенной по , устойчивости к воздействию промышленных эмиссий в районе исследований. С помощью метода • однофакторного диверсионного анализа оценено воздействие изменения чистоты атмосферы, по содержанию' серы в однолетней хвое, на изменчивость ряда биометрических параметров сосны обыкновенной. Анализ показал, что промышленные выбросы оказызаат наибольшее влияние на высоту деревьев (82,1 %). Учитывая, что наследуемость роста

в высоту низкая (Н2= 0,2), а у оставшихся показателей ещё ниже, можно заключить, что эффективность отбора деревьев при использовании биометрических параметров будет невысокой и они не могут быть использованы в качестве критерия селекции.

Содержание хлорофилла в хвое сосны обыкновенной являете^ генетически обусловленным признаком. В связи с этим было проведено определение коэффициента наследуемости (Н2) по содержанию хлорофилла в хвое сосны обыкновенной, который составил 0,714 при эффективности отбора фенотипов 8,6 %.

I Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможном использовании показателя содержания хлорофилла в хвое сосны обыкновенной в качестве критерия отбора деревьев, характеризующихся различной степенью устойчивости к антропогенному фактору. Проведенная работа была необходима для эффективного отбора отдельных фенотипов сосны, необходимых в Дальнейшем в качестве аттестованных объектов для проведения ищ опытов по действию на них бета-экзотоксинсодержащих био--препаратов. ,

3. ВЛИЯНИЕ БЕГА.- И БЕТА-2- ЭКЗОТОКСИНОВ НА ' ПРОРОСТКИ ИЗ СЕМЯН СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

Влияние экзотоксинов битоксибациллина на морфологические показатели развития проростков сосны обыкновенной. Известно воздействие на проростки растений ряда, микробных инсектицидов, проявляющееся в виде стимулирующего, индифферентного и ингибирувдего, а.также летального действия, в зависимости от концентрации и времени экспозиции. Отмеченные эффекты наблюдались при воздействии битоксибациллина и баве-рина на .семена пшеницы, БЭТ - на' семена гороха, капусты, ячменя и ряда других сельскохозяйственных культур.

Как показали эксперименты БЭТ и БЭТ-2 экзотоксины вызывают снижение' всхожести а энергии прорастгшая семян сосны обыкновенной.' а также угнетают, скорость роста и развитие проростков. Возрастание концентрации БЭТ.и БЭТ-2 токсинов увеличивает общий, ингибирущий эффект их воздействия на проростки. При этом концентрация.; экзотоксинов 10""*мг/мл вызывает полную'гибель раст'ений.

Под влиянием БЭТ происходит снижение содержания хлорофилла (табл.6 ) у проростков сосны. С увеличением концентрации токсинов эти.изменения усиливаются. У семян сосны, собранных с деревьев, произрастающих в условиях со значительными. промышленными выбросами в атмосферу (г.Дзержинск, Нижегородская обл.), показатели энергии прорастания и всхожести под действием экзотоксинов снижаются в значительно большей степени, чем у семян из экологически более благоприятных. .

■ Изучение спектральных-свойств нативннх пигментов, процесса Фотосинтеза и их изменение при воздействии экзотоксинов проведено на проростках сосны обыкновенной. Анализ спектральных данных натявных проростков сосны обыкновенной позволил обнарзЫмь различия в поглощения (табл.7 ) а флуоресценции пигментов у нативннх проростков из семян сосны, которые определится уровнем воздействия на маточники промышленных эмиссий з атмосферу.

Спектральные.кривые -поглощения и возбуждения флуоресценции нативных проростков сосны, выросших в присутствии БЭТ и БЭТ-2 токсинов изменяются за счёт общего увеличения амплитуд спектров в широкой области. Воздействие выбросов химического производства в атмосферу отразилось на маточниках и их потомстве, что сказалось в изменениях спектральных кривых, близких по характеру к тому, что наблюдалось при воздействии БЭТ' и БЭТ-2 токсинов (табл.7 ). Наблюдаемые изменения спектров поглощения проростков трудно объяснять только увеличением светорассеяния клеток из-за их изменения под влиянием антропогенных факторов. '

Изучение процесса выделения О2 семядолями проростков сосны показало, что воздействие БЭТ приводит к значительным изменениям всех параметров кинетической, а также световой ::р:шой фотосинтеза. Воздействие промышленных эмиссий на маточники сказалось на семенном потомстве сосны, что нашло от-;ччсеивз в дзмеяешш форда световых кривых, снижении уровня '.»тосяктзза и азмзнения есэх таз кинетических кривых обмена

Одкша :;з интересных противоречий в полученных результатах явдлосъ возрастание оптической плотности у кавкх объектов

^ Таблица 6

Влияние бета-экзотоксина на содержание хлорофилла в семядолях проростков сосны обыкновенной

Концентр.! Количество хлорофилла, мг/г ,в ацетоге 5 Критерий *±МХ | X в % к контролю ¡Стьюдента

О контроль . 0,168 + 0,0048 100

3 х 10"2 0,139 + 0,0045 82,7 3,74

3 х 10"1 0,109 ¿ 0,0021 64,9 93,30

1,5 {с Ю-1 0,111 + 0,0031 66,1 8,31

"Ь ,табл = 3; Р = 0,98; °'99; °'999) = 2,35 ; 4,54; 10'21'

Таблица 7

Изменение спектра поглощения нативных проростков из семян сосны, выращенных в присутствии экзотоксинов битоксибацил-лина

Происхождение 1 Ток-¡Значение амплитуд, мм, спектров при им

■ семян___-1-Г-—!-!-Г~-ГТ--

^логические НГ^Чбоо }550 { 580 ¡ 625 ¡650 [б78 \ ^ условия.. |дер. | мл.1 | ! ! I | . | А678

Благоприятные. 74 в Московская область

Воздействие промышленных эмиссий, Горьковская область

при уменьшении содержания хлорофилла.в ацетоновых экстрактах ■ из семядолей проростков сосны. Обнаруженные изменения в спектрах флуоресценции проростков сосны свидетельствуют о происходящих отклонениях от нормы в фотосистемах растений под влиянием атмосферного загрязнения окружающей среда и вносимых эн-томопатогенных биопрепаратов Лри этом наблюдается возростание ёмшштуд яизкотешературной флуоресценции фотосистемы II проростков семян сосны с увеличением дозы БЭТ.

74 вода 90 35 . 41 . 52 . 71 100 0,41

БЭТ-2 82 51 58 . 71 84 . 100 0,58

4/2 вода 84 • 39 '49 ■ 66 82 100 0,49-

БЭТ-2 89 41 .49 ■69 79 100 0,49

БЭТ 93 47. 54 70 80 100 0,54

4/3 вода ■ 94 39 44' ■ 60' 73 100 0,55

.БЭТ-2 95 42 49 65 77 100 0,49

БЭТ - 96 ■ 49 57 72 83 100 0,57

4. Ф0Т0ЕИ0СИНТЕЗ ПИГМЕНТОВ И ЕГО ИЗМЕНЕНИЕ У СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ПОДВЕРГАЮЩЕЙСЯ, ВОЗДЕЙСТВИЮ ПРОМЫШЛЕННЫХ'ВЫБРОСОВ В АТМОСФЕРУ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭНТОМОЦИДШХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕСТИЦИДОВ

Исследование генетически обусловленного механизма фотобиосинтеза хлорофилла в растении является одним из важнейших подходов при изучении пигментного аппарата и, по-видимому, его изменения в процессе антропогенного воздействия. Интерес к изучению механизма биосинтеза хлорофилла появился уже давно и был отражен.в работах Тимирязева, Любименко, Монтеверде, Годнева, Шлыка. Процесс биосинтеза хлорофилла' в этиолированных растениях йредставляет многостадийный процесс, включаодиЗ темновые стадия и световое фдтопревращение ряда форм его предшественника. Освещение предшественника хлорофилла в этиолированных листьях (пЦр ) приводит к образованию фотопродукта с поглощением в области 678 нм и флуоресцирующего око-' ло 684 нм (Хл|®| ). Дальнейшее освещение этого фотопродукта вызывает его превращение в форму Хл|дд , претерпевали ую затем превращение в ХлЩ. Эта фотореакция зависит от температуры. При 18-20°С в темноте происходит сдвиг спектра в коротковолновую область Хл|®д —, сопровождающийся фи-толизацией пигмента. Литвин и Беляева предложили гипотетическую схему процесса фотобио'синтеза хлорофилла, которую нужно было.доказать,

,В связи .с имеющимися данными о влиянии на пигментный аппарат растений промышленных выбросов_в атмосферу и экзотоксинов биопрепаратов, вшшо было Получить доказательства их воздействия на ранних стадиях формирования хлорофилла. Однако, для этого необходимо было сначала'изучить промежуточные стадия с£отореакц0Й, ведущих к образованию хлорофил-лкда из его предшественника у растений, не синтезирующих его з темноте. .'

Спектральный состав, длительность и интенсивность облучения могли варьировать благодаря использованию непрерыв-' них л импульсных источников освещения. Измерение интенсивно-с.'ей света осуществлялось термоэлементом, фотодиодом и ката-

брованным фотоэлементом..Регистрация поглощения.флуоресценции и спектров ее возбуждения проводилась на разработанных установках (Табл.1).

Разложение спектров объектов на Гауссовы и Лоренцевы полосы проводилось на анализаторе кривых (СК-2, СКВ БП АН СССР). В качестве объекта исследования взяты листья 7-9 дневных проростков фасоли сорта 1024 и сосны обыкновенной общего сбора из лесхозов Московской и Нижегородской областей. Растения 'выращивались в полной темноте и, в качестве контроля, на свету при температуре +26°С.

Изучение механизма и доказательство существования двух фотохимических реакций в процессе биосинтеза хлорофилла у растений. Для доказательства существования двух фотореакций' образования хлорофилла из предшественника их было необходимо разделить возбуждая сначала реакцию I (пЦц ), а затем реакцию II. Было известно, что второе фотопревращение. 684—»-690 нм сильнее зависит от температуры / чем первое. Поэтому, для торможения фотореакции I освещение листьев проводили при низкой температуре (-40°С).

Из спектров возбуждения флуоресценции продукта I фотореакции было видно что спектр его поглощения незначительно (0,5 %) перекрывав ; с поглощением предшественника при длинах волн 465 И'640-нм. Индуцируя реакцию'I светом 640 или 465 нм удалось добиться почти полностью, фотопревращения ^650 и появление только одной полосы в низкотемпературном спектре флуоресценции с максимумом - 684 нм. После фотореакции I провели изолированную фотореакцию II, возбувдая ее светом 680 нм, который поглощает, практически, только форма ^678* ~^0°С потребовалось 60 мин дая полного и изолированного проведения фотореакции II, что связано с ее температурным торможением. ""'....■ •

Полученные результаты впервые подтвердили существование двух последовательных фотореакций (ФР), протеканцих при фотобиосинтезе хлорофилла в этиолированных листьях растений,

согласно схеме: . ~ ' -

„655 свету 684 свет, '„ 690 .'

"650-тТьТбте ТПГп 680 —теышше прев-А 676 ; ращение,

(-196°С). 670 (-40°2)

где: числитель - максимум флуоресценции, знаменатель-максимум поглощения.

Торможение фотореакции I на ее конечных стадиях вслед- ' ствие оттока энергии электронного возбуждения с предшественника на фотопродукты гложет служить новым, физическим механизмом регулирования скорости биосинтеза пигмента. "Ингябиро-вание" этой реакции продуктом сопровождается накоплением предшественника, уровень которого, как известно, влияет на скорость начальных стадий биохимического синтеза пигмента.

Исследование быстрых стадий процесса фотобяосянтеаа хлорофилла в этиолированных листьях методом скоростной спектрбфотометрии. За последнее время получено значительное количество экспериментальных данных, позволяющих представить превращение протохлорофилла в хлорофилл не как фотореакцию, а как последовательность целого ряда световых и темновых стадий.. Однако, применяемые метода не позволяли исследовать быстрые темновые превращения, которые могли завершиться после фотореакций за время; пока осуществлялось глубокое охлаждение объекта. Созданная Сна базе спектровизора) установка позволяла производить спектральные измерения в области 360800 ям, со спектральной полушириной щели 0,8 нм и шумами не более 2 %, при оптической плотности объекта 0,1-0,2 ед./шкалу. Наибольшая скорость сканирования до 500 спектров в I сек.

Наиболее' интересным результатом является вывод о существовании быстрых СЮ-2 - сек) темповых превращений промежуточных продуктов фотореакций - нативных форм прото-хлорофиллида при низких (до -30°С) температурах. Поскольку известные в настоящее время темновые превращенняХ678—■- 670 яХб80—- 685 протекают при положительных температурах momia полагать, что обнаруженные изменения не идентичны им и представляют собой быстрые темновые этапы, включенные в реакции, которые до сих пор рассматривали, кал часто фотохимические (световые).

Следовательно, нативным формам хлорофиллида, фиксируемым охлаждением после освещения листьев, предшествута более короткоживущие, чем наблюдаемые ранее, истинные продукты фотореакций, характеризующиеся более коротковолновым положением

спектров. К сожалению, различия спектров поглощения известных нативных форм, образующихся в фотореакциях и хЦд), так малы, что пока трудно определить, к которой из двух фотореакций относятся обнаруженные темновые стадии. Интерпретация затрудняется и тем, что положение полос, измеряемых на спектровизоре при температуре -30°С| может несколько отличаться от положения при -196°С. Судя по обычным спектрам, наблюдаемые темновые сдвиги полос очень невелики - 2-3 нм. Однако, они могут отражать важные■изменения структуры комплексов или их мшфоокруяения (например, смещение полос, как следствие электрохромного эффекта). С другой'стороны, результаты по разностным скоростным спектрам поглощения наводят на мысль о том, "что"'они обусловлены не сдвигом полосы, а взаимопревращением двух форм, уменьшением полосы 670 нм и ' возрастанием полосы около 690 нм. "В этом случае следует , предположить/ что цродуктом первичной фотореакции.является образование более коротковолновой,- чем предполагалось ранее, формы пигмента с максимумом поглощения около 670 нм, которая затем, путем быстрого темнового процесса превращается в более длинноволновые формы.

',. Действие бета-экзотоксина' на процесс биосинтеза хлоро-. филла из предшественника в проростках из семян соснч обыкновенной, произрастающей в различающихся экологических"условиях. Как следует из предыдущего, фотохимические и темновые этапы ■• синтеза хлорофилла уже достаточно,хорошо изучены, в связи с чем могут служить надежным критерием дая оценки нарушений, возникающих в растения под воздействием некоторых экзогенных факторов, ....... \

_ В семядолях хвойных в полной темноте накапливаются формы хлорофилла,' присущие зеленому растению, а также в зна-1 чительных количествах - протохлорофялляд п|дд. Последний • может быть феврацен в хлорофнлляд, как световым, т,;к д темповым путем. . '

Изучение спектроз поглощения я флуоресценция показало,, что' у ее;,генного' потомства сосна, ойорглирозавлегося в условиях промышленных выбросов в атмосферу я затем проросшего в -темноте, наблюдается существенное различие с контролем.

В целях определения воздействия выбросов промышленых отходов в атмосферу на сосну обыкновенную было использовано определение характера протекания процесса фотобиосинтеза хлорофил- : ла из предшественника,рассчитываемого по отношений амплитуд максимумов флуоресценции хлорофилла Хл 730 к его предшественнику 1165$.. Полученные результаты свидетельствуют, что действие промышленных эмиссий отразилось на семенном потомстве сосны и выразилось в ингибировании накопления длинноволновых форм хлорофилла. Обнаружены "нарушения произошедшие в, I и II фотоситемах и изменения уже заложенные ^^астении, нашедшие отражение в различном накоплении формы П^ предшественника хлорофйлла и его фотопревращении на свету.

Обработка семян соснн бета-экзотоксином при проращива- ' нии вызывала изменения в темновом биосинтезе протохлоро-филлида Й25ц> придав стимулирующий характер^ этому воздействию. Освещение выросших в црисутствии БЭТ проростков из семян с деревьев произрастающих в различных.условиях показало, что фотопревращение; протохлорофиллида П6с;д.,с одновременным накоплением длинноволновых форм хлорофилла, протекает более интенсивно у проростков, маточники которых не подвергались' антропогенному воздействию. Необходимо отметить, что в отличие от контроля,растения . выросшие в присутствии БЭТ накапливали в большем количестве длинноволновые формы хлорофилла.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИНШ ОБРАБОТОК БИОИНСЕКГИЦИДОМ БИТОКСИБАЦИЛЛИНОМ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В ПРИРОДНЫХ УСЛОВИЯХ

Развитие сеянцев и саженцев сосны обыкновенной изучено достаточно полно и явилось методической основой при оценке отклонений в биологическом развитии растений под воздействием битокисбациллина. Результаты наблюдений за развитием контрольных растений в лесопитомнике не обнаружили отклонений,на основе сравнений с имеющимися данными. Проведенные исследования по действию биопрепарата были направлены на диагностику протекающих морфологических изменений в растениях. '

Измерения, проведенные в течение вегетационного периода показали, что битоксибациллин при одноразовой-обработке в начале июня вызывал у всходов сосны морфологические изменения, характер которых зависал от дозы (3; 4,5 и 6 кг/га-500 л ^0) препарата. Однако, независимо от неё можно отметить общее ингибирование накопления сухой биомассы за счёт снижения веса корешков, гипокотиля и настоящего побега. Воздействие биопрепарата также сказалось на динамике суточных изменений морфологических показателей, вызвавшего смещение ритма линейного прироста, накопления биомассы и её распределения в органах. Результирующие показатели проявились к концу вегетационного периода у сеянцев в виде угнетения развития корешков и настоящего побега.

Проведенная одноразовая обработка трёхлетних саженцев• в указанных выше дозах и в тот не день (рис.2 ) привела к снижению измеренных показателей. Изменения проявились в падении скорости роста;тангентальных побегов в длину. При этом не наблюдалось пропорциональности эффекта от дозы. Результаты по развитию хвои показали резкое снижение её роста в дагину, биомассы, содержания хлорофилла в.течение первых трех декад после обработка, затем эти показатели в значительной степени нивелировались. Наблюдаемое уменьшение . показателей развития боковых побегов у обработанных бктокси-бацяллином растений свидетельствует о снижении общего прироста сосны, и предполагает (Листов,'IS69) сохранение индуцл-. рованного процесса в следующем году.

Исследование изменений в содержания-хлорофилла и состоянии пигментного аппарата ".в хвое техлеткпх и.однолетних растений под действием однократной обработки бйтоксибацштлн-ном показало, что этот'процесс протекает кеодипако но '.и течение сезона. Изучение влияния бдтоксиба^'клдка на динамику, накопления хлорофилла в хвое позволило установить, <0. характер протекала» этого процесса неоднозначен и згаксят от.дозы препарата, длительности периода после обработки и возраста сосны.' ■ ■ . .

Изучение характера процесса накэпленея хлоро§злла показало , ч?с прл епаллитсльно!' стабильности ;з оотнелеглл его

21

19

17

15

13

11

см

В

1ПШ

_____I ..: » 1У.ЙШШ

5 6 7 8 9 декады

Рис. 2 Воздействие битоксибацнллина на некоторые биометрические и другие параметры трехлетних саненцев соснн в процессе их роста, ^-прирост боковых побегов, Б- изменение 'длины хвоя,.В- сухой массы ишшт.) хвои, Г- содержания в хвое хлорофилла. /

Варианты опыта (расход препарата, кг/га;:К- О, 1-3,0, П- 4,5,

Лит.) хвои, Г- содержания в хвое хяо' ™ ^ п -гЯпЩа (расход препарата, кг/га ш- ь,0. Обработка - 5 июня, московская обл.

•» - уровни значимости различий средних величин опнта и контроля соответственно: 0,05; 0,01; 0,001. Примечание: масса хвои и сод-е хлорофилла в усредненном образце.

Ук1+Ю 0,Ь41/!0,2ЬиЬх' %Х= ±1,454 /СМ/ А.ЛЯрокскмация

Уг

11+Ю

19,5

1+10

1+10-

0,5387 -0,2478х 17^0____

0,9410-0,3750х

20.5 О,7517-0,3104х

« т чпг / / фактических-дан-

Vх ' них на, ЭВМ.

¡Лух=+0,834 /см/ . ^•=+1,960 /ом/

П

длинноволновых и коротковолновых форм в контрольных растениях разного возраста, использование биопрепарата приводило к индукции их колебания. Суммарное содержание хлорофилла изменялось в вегетационный период, при этом фазы колебания, независимо от дозы, совпадали в его середине (июль). После обработки следовала короткая лаг-фаза и даже наблюдалось резкое .различие в накоплении хлорофилла в зависимости от дозы. Одна из причин этого явления, по-видимоэду, заключалась в изменении состояния фотосистем растения, оцениваемого по соотношению амплитуд флуоресценции длинноволновых (730 нм, I фотосистема) и коротковолновых (695 нм, фотосистема II) форм в нативной хвое сосны. Последнее свидетельствует о протекании глубоких изменений в пигмент-белковом комплексе фотосистем растения в вегетационный период под действием экзоток- • сияов биопрепаратов. По-видимому, -следствиемэтого являются наблюдаемые морфологические изменения, выразившиеся в снижении биометрических.параметров растений. . '

Оценка последствий авиаобработок двадцатилетних насаждений сосны битоксибацшшжом основывалась на изучении изменения содержания хлорофилла в хвое. Как показали ' исследования, этот показатель наиболее точно характеризует изменение состояния растений при антропогенном воздействии.'

Необходимость проведения независимой оценки влияния . битоксибациллдна на насаждения в условиях высокой инсоляции (Херсонская область) побудили нас осуществить контроль их состояния 'после плановой .авиаобработкц очагов энтомовредп-■телей. Результаты"количественного анализа по содержанию хлорофилла позволили установить ,что средний уровень.у обработанных.растений,' даже спустя 3,5 месяца после её проведения (1,5 кг/га*500 л Н20),обнаружил его.достоверное снижение при сравнении с контролем. ; • ; \ ?'' '

6. ' ОБОСНОВАНИЕ СЛЗСТЕОВАШЯ' ЭКЭМШЕСКОЛГ^ЕЙШ ' ИЗ-ЕКЕЕГ/Л РАОТЗНЙ ПРИ ОБРАБОТКАХ БЛЛ^И^ТХаЖ'

'.'...• з1:то:.юцидна.к щтшююш \

Предсяазшпше результата' по воздействию на растения, Епзчптгльнуе объе?ш производства, ппрэкое яспольгозаяяс,

экономическая выгода, рекламируемая безвредность биопрепаратов указывают на появление новой и сложной экологической проблемы. С открытием БЭТ-2 во всех основных промышленных биопрепаратах, доказанной близостью его молекулярной структуры и характера воздействия на растения бета-экзотоксину, становится очевидной необходимость разработки условий реализации экологически-оправданной концепции применения бактериальных препаратов.

Исследования, проведенные только на сосне и её семенном потомстве,не давали полного ответа на ряд принципиальных вопросов, связанных с влиянием экзотоксинов на растения других систематических групп, а также возможных последствий применения препаратов на популяционном, физиологическом и молекулярном уровнях. Для_достижения этой цели были использованы культуры зелёных водорослей хйореллн и хламидомонада.

Воздействие экзотоксинов биопрепаратов на популяцию одноклеточных водорослей, их пигментный аппарат и процесс фотосинтеза. БЭТ и БЭТ-2 стимулировали, на начальном этапе, развитие популяции (10 поколений) хлореллы., одновременно снижая в ней содержание хлорофилла. Измерение флуоресценции показало наличие деградации фотосистемы II у хлореллы в результате воздействия БЭТ а БЗТ-2 в ходе развития популяции (12 поколений). Спектры поглощения претерпевали изменения под действием экзотоксинов, форма которых была аналогична наблюдаемой у проростков сосны. Спектральные изменения поглощения, вызванные экзотоксинами, сохранялись в клетках при их пересеве на чистые среда без экзотоксинов, Следовательно, наблюдаемые спектральные изменения в клетках хлореллы и хла? мидомонады'свидетельствуют о передаче в поколениях приобретённых новых свойств. Однако, характер спектральных кривых свидетельствует о протекании в популяции водорослей сложных переходных процессов, по-видимому, связанных с изменением метаболизма клеток, состава популяции и нарушениями в биосинтезе пигментов, вызванных последействием экзотоксинов. Обнаруженное увеличение поглощения у меток хлореллы и семядолей сосны, под действием токсинов, как показало изучение

34 Таблица 8

Воздействие бета-экзотоксина из битоксибацнллина на генетический аппарат проростков из семян сосны обыкновенной, произраставшей в разных экологических условиях

Концентрация бета-экзотоксина, мг/ыт

3 х 1СГ1 ' 3 х 1СГ2 3 х I(Г3

контроль '

и£о)

: Хромосомные аберрации в корешках проростков,' %

¡Маточное ¡-Ы _т ¡Маточное ¡4- г - ¡Семена общ. ; ¡дерево : ' п¡дерево ; Л1 "п:сбора, ; л1~ : 4/з # : : 4/5 : ¡моск.обл. :

43,5+0,02 128 47,5+0,02 183 37,0+0,01 117 ' 34,5+0,02 125 25 ¿0+0,03 36 25,7+0,01 ИЗ

13,()+0,01

8,5+0,01 -

II + 0,04 218

7,5 +0,01 53

4,7 +0,007 66

0,12+0,0003 -

"^табл.^ ^ 120; Р1=0,|5)=1,96

Таблица 9

Влияние экзотоксинов биопрепаратов на индукцию хромосомных аберраций в анафазных клетках меристемы корешков проросткоэ сосны обыкновенной

Препарат,

чТОКСИН

' Кон-ц«ят-рация ■ от/мл

Хромосомные аберрации в корешках проростков {%)

¡Битоксиба-7 ¡БитоксиСа+Ь; - ¡Лешщоцвд; ¡1 ^ :цшшш; : АТ■пшиллинг- : лп ¡бега-2 ^ I "г: '. : бета-2 :. " '

;<5ета-экзо токсин

:экзоток-: син

¡экзотоксин".

1,5 х Ю-1 47,4+0,2. 136 49,5+0,25

3 х 10~2 21,5+0,12 50 ; 27,5+0,Г

контроль' 10,7+0^18 - 12,5+0,18 --

Ui.fi) ~

120 73

39,6+ 0,3 77 17,8+0,09 28 11,7+0,2

табл.0 > 120; Р-9,999) =3,29;

Для таблиц й8 ,д

Семена с деревьев, подвергавшихся воздействию промышленных выбросов в атмосферу (.г.Дзерг-инск, Нижегородская область). Лроросткц 14-дневю/е, выращены при 26°0 и освещении 2С0С люкс.

на одноклеточных водорослях, проведенное с помощью производной сдектрофогометрии, не определялось увеличением вклада коротковолновых форм хлорофилла. • 1

Это окончательно подтвердили результаты исследования спектра действия фотосинтеза по обмену у хлореллы. При этом было обнаружено, что действие экзотоксинов повлияло ¿1а ■ возрастание роли длинноволновых форм хлорофилла в процессе фотосинтеза хлореллы» Последнее подтверждается также данными по стимуляции биосинтеза длинноволновых форм хлорофилла в проростках семян сосны, выращенных в темноте в присутствии экзотоксинов. В отличие от.контроля, клетки хлореллы, выращенные с БЭТ, снизили эффективность фотосинтеза в главном максимуме поглощения хлорофилла (678 им), однако показали его • существенное возрастание в области большей 700 нм, где он практически отсутствует у. высших растений 'и зеленых водорослей. • . -

Доказагельством руществования экологической проблемы изменения окружающей средн под действием бактериальных препаратов явились результаты, 'полученные на высших растениях и зеленых водорослях. Обнаруженный синергизм в действии на сосну обыкновенную продуктов химического производства, выбрасываемых в атмосферу и сохраняющих свое воздействие в генетическом аппарате семенного потомства, а также экзотоксинов (табл.8) указывают на появление новой экологической опасности. Как было выяснено, основной причинойшблюдаемых изменений является воздействие энтомоцидных экзотоксинов основных промышленных препаратов (табл.9) на генетический аппарат клетки. Характер наблюдаемых изменений у высших растений, водорослей и микроорганизмов свидетельствует о трудности прогнозирования последствий неконтролируемого применения бактериальных препаратов для функционирования фитоценозов. Снижение степени опасности применения экзотоксинсодержащих биопрепаратов в условиях глобального, атмосферного загрязнения ведется,на данном этапе,в реализации мер, представленных на рис.3. Все вышеизложенное является основанием для утверждения о существбвашш новой эко--логической проблемы обусловленной производством и применение!* бактериальных энтомопатогенных биопестицидов.

Рис. 3

Рекомендуемая система мер по снижению воздействия бактериальных энтомоцидных препаратов на фитоценозы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ :-

Проведено комплексное исследование промышленной биотехнологии получения и использования энтомоцидных бактериальных пестицидов, направленное на установление степени их экологической безопасности для растений.

На'основе исследований в области микробиологии, 'а также фотосинтеза, селекции и генетики растений, обнаружена индукция изменчивости растений под воздействием биопрепаратов и установлено, что причиной ее являются экзотоксины нуклеотидной природа продуцируемые бактериями и входящие в состав 'биопестицидов.

Обнаружено, что-не/только в бета-экзотоксинсодержащих био-.препаратах, но и во свех других бактериальных промышленных препаратах имеется дополнительный инсектицидный экзогенный метаболит. С помощью абсорбционной спектрофотометрии в УФ- и ИН облас-

•1 31

тях, Ни- Р ЯМР спектроскопии установлена адениновая природа этого метаболита, оказавшаяся близкой,бета-экзотоксину. Обнаруженный экзотоксин выполняет вместе с бета-экзотоксином особую регуляторную функцию у бактерий Вас.Шиг1пн1епз1з, с помощью изменения рН среды, в процессе развития популяции микроорганизмов. Обнаруженные впервые во всех промышленных бактериальных препаратах новые экзотоксины оказались не только по природе, но и характеру воздействия на растеши близки бета-экзотоксину '^БЭИ/ - известному адениновому нуклеотиду и названы бэта-2 экзотокнами /БЭТ-2/.

Установлено, что БЭТ-2 токсины биопрепаратов, как и БЭТ, обладают свойством ингибировать активностьь ДНК-зависимой РНК полимеразы, вызывают нарушения в'генетическом аппарате клеток меристемы корешков проростков сосны обыкновенной. Использование теста Эймса на мутагенность в классическом виде-; по-видимому, оказалось малопригодным для оценки характера генетического в6з$0й-

• 38

ствия экзотоксинов на растения.

Обнаружено, что развитие семян и проростков сосны в присутствии экзотоксинов, оцененное с помощью биометрического.анализа, приводит к ингибированию большинства биологических процессов связанных с их прорастанием и, последующим морфогенезом, степень подавления которых определяется концентрацией вносимых экзо-ток-синов.

С помощью абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии показано воздействие экзотоксинов на пигментный аппарат растений, выражающееся в изменении фотосистем. Показана идентичность наблюдаемых нарушений у высших растений и водрослей.

Доказано, с помощьью измерения световых кривых и спектров . действия обмена кислорода у растений, что наблюдаемые изменения в фотосистеме I и II сопровождаются-изменениями процессов фотосинтеза. При этом граница спектральной эффективности скорости выделения сместилась в красную область />700 нм/.

Уникальность обнаруженного явлешя свидетельствует о глубоких изменениях произошедших в растениях под действием экзотоксинбв адениновой природы, протекающих по одному и тому же механизму у высших растений и водрослей. : :

Доказан механизм фотообразования хлорофилла из предшественника и роль миграции анергии в регуляции этого процесса. Обнаружено, что нарушение процесса биосинтеза хлорофилла экзотоксинами происходит уже на уровне темновых стадий, что указывает на его генетическую природу. • .

Установлено, что однократная обработка сеянцев и сагонцев сосны в культурах /Подмосковье/ биопрепаратом Ситоксибацшшном, содержащим оба экзотоксина, приводит к снижению их биометрических параметров и уменьшению содержания хлорофилла в хвое.

Обнаружено, что однократная профилактическая авиаобработка

двадцатилетних насаждений сосш обыкновенной битоксибащшшном против хвоегрызущих вредителей в Херсонской области привела к снижению биосинтеза хлорофилла, обнаруживаемому спустя 3,5 месяца после ее проведения.

Установлено, что воздействие экзотоксинов адениновой природа приводит к нарушениям генетического аппарата клеток высших растений, вызывая многократное увеличение числа хромосомных аберраций, достигающее 40% и более у проростков из семян сосны обыкновенной произрастающей в условиях значительного антропогенного загрязнения.

Прослежено устойчивое изменение пигментного аппарата у растений, находящее■отражение в фотосинтезе,которое сохраняется в ряде поколений одноклеточных- водрослей и возникает под действием экзотоксинов. Оно свидетельствует о наследуемости вновь приобретенных признаков и показывает, что они носят генетический характер.

Обобщение полученных результатов дает основаниее считать, что экзотоксины адениновой природы биологических бактериальных препаратов воздействуют на генетический аппарат и через него на процесс биосинтеза хлорофилла и механизм фотосинтеза у растений.

Проведенные исследования показали, что в условиях существующего неконтролируемого применения биопрепаратов, загрязнения биосферы и обнаруженного эффекта синергизма в действии двух факторов на растения, выход заключается в аттестации препар^ов, установлении норм расхода и контроля за их использованием.

Разработанный и предложенный количественный метод определения экзотоксинов в биопрепаратах, в сочетании с обоснованной концепцией их воздействия на растения, дают ключ к решению этих вопросов и создают предпосылки для снижения уровня экологической опасности.

- ВЫВОДЫ.

I. Впервые, на основе комплексной эколого-биологической оценки биотехнологии производства и применения энтомощщшх бактериальных биопрепаратов,показана недопустимость неконтролируемого их использования при обработке лесных насаждений сосны обыкновенной.

.2. Разработаны способы количественного контроля жизнеспособности бактерий в среде и слежения за их состоянием в процессе ферментации на основе измерения сверхслабой хешлюминесценщш, флуорометрии НАД-Н* и абсорбционной спектрофотометрш цитохромов. разработаны способы поляр<^ического определения фотоводорода у водорослей, обмена 03 и изменений окислителыюгвосстановительно-го потенциала внутри одиночной растительной клетки защищенные авторскими свидетельствами. -

Развит комплексный подход в изучении пигментов растений и л роли в биологических процессах, усовершенствованы способы исследования кинетики и спектров действия обмена 02 при фотосинтезе, а также проведено изучение состояния пигментов и его изменение с помощью абсорбционной производной, дифференциальной и скоростной спектрофотометрии, спектров излучения и возбуждения флуоресценции при 293-77°К.-

Разработаны и созданы количественные методы определения экз токсинов адениновой природы в бактериальных биопрепаратах и полу чэны авторские свидетельства.

3. Впервые открыт в промышленных бактериальных препаратах экзотоксин и,-частично, охарактеризована его молекула,оказавшаяс близкой по структуре и механизму действия на растения ^ета-экзо токсину. Установлен фант взаимодействия двух экзотоксинов и выяс ненаег°роль, как одного из основных факторов определяющих прсце развития популяции с помощью экзогенной регуляции рЦ среди, очег

но, у ряда бактерий Вас.Шиг1щ1епз1з.

Впервые расшифрован механизм регуляции содержания бета-зкзо-токсина при его накоплении в процессе промышленной ферментации, на его основе разработан метод определения двух экзотоксинов и оптимизирована заводская биотехнология получения битоксибациллина, . позволяющая увеличить его производство более чем на за счет сокращения сроков ферментации.

4. Установлено воздействие бета- и бета-2 экзотоксинов на пигментный аппарат растений, приводящее к изменению фотосистем I

и и, возрастанию содержания длиноволновых,минорных,форм пигментов 1 клетке. Исследованиями световых кривых и спектров действия скорости обмена кислорода показаны участие и роль форм хлорофилла В процессе фотосинтеза и доказана возросшая роль"его длинноволновых форм в этом процессе у растений, выросших в присутствии экзотоксинов адениновой природа. Спектральная граница процесса фотосинтеза оказалась смещенной в красную область более чем на 20 нм, по сравнению с аналогичным процессом у обычных" растений,не подвергавшихся действию токсинов.

Совокупность полученных данных доказывает наличие единого механизма воздействия экзотоксинов адениновой природы и содержащих их бактериальных препаратов у высших растений и водорослей.

5. Впервые доказано, что фотообразование форм хлорофиллида из предшественника включает две последовательные фотохимическою реакции. Их протекание сопровождается параллельно идущими с высокой скоростью ферментативным процессом, наблюдаемым при комнатной температуре только с помощью скоростной (10 °сек/спектр) спектро-фотометрии,' Установлено, что фотопревращение протохлорофиллида оказывает влияние на скорость его биосинтеза и может служить в качестве механизма его регуляции. Впервые обнаружено, что экзотоксины адениновой природы воздействуют на биосинтез хлорофилла у

растений на темповых /ферментативных/ стадиях процесса при образовании его предшественника. Последнее свидетельствует о том, что основа нарушений в пигментном аппарате сосш закладывается уже на уровне начала биосинтеза молекулы протохлорофиллида.

• 6. Установлено, что экзотоксины адениновой природа воздействуют на процесс всхожести, энергию прорастания и биометрические показатели проростков из семян сосны обыкновенной, ингиби-рующе влияя на протекание биологических процессов, в пределах рекомендуемых концентраций используемых при обработке растений. Обнаружен^, что применение биопрепарата битоксибациллина в полв-

I С - '

вых условиях приводит к снижению содержания хлорофилла и вызывает в однолетней хвое у саженцев и сеянцев сосш обыкновенной изменения близкие тем, что обнаружены на тех же растениях при использовании выделенных из препарата и очищенных бета- и бета-г экзотоксинов.

Показано, что в результате профилактической одноразовой авиаобработки энтомовредителей в 20-летних насаждениях сосш битоксибациллином наблюдается существенное снижение содержания хлорофилла в однолетней хвое.

7. Впервые показано, что Сета-2 экзотоксин энтомоциден и ингибирует, как и бета-экзотоксин, активность ДНК-зависимой РНК полимэразы. Доказано, что экзотоксины адениновой природы биологических препаратов вызывают у растений увеличение числа хромосомных абарраций в анафазных клетках меристемы корешков проростков сосны обыкновенной.' Установлено, что уровень нарушений генетического аппарата растительной клетки под действием экзотоксинов усугубляется в результате воздействия на семенное потомство .антропогенных факторов, и в частности, выбросов в атмосферу продуктов химического производства.

Наследование вновь приобретенных под действием экзотоксино]

свойств растительной клетки, прослеженное на ряде поколений в ■ нескольких различных популяциях одноклеточных водорослей, доказывает генетический характер обнаруженных изменений. Устойчивость и особеннойсть вновь преобретенных свойств, достаточная жизнеспособность новых растительных клеток, позволяет утверждать,, что применение бактериальных биопрепаратов, содержащих экзотоксины адениновой природы ,может привести к непредсказуемым изменениям в фитоценозах.

8. Осуществлена разработка и внедрение метода контроля на этапах биотехнологического процесса производства бактериального препарата,на основе количественного подхода определения-в нем ■ бета- и бета-2- экзотоксинов, могущая найти применение при их ис-.пользовании. Способ контроля вместе предложенной концепцией воздействия биопрепаратов на растения, может составить основу безопасного применения бактериальных препаратов.

Разработаны тест-методы контроля й оценки степени возДействия бета- и бета-2- экзотоксинов, биопрепаратов на интактные растения, основанные на биологических, морфологических показателях, изменениях генетического и пигментного аппарата клетки, возрастании уровня фотосинтеза в дальней /более 700 нм/ красной области спектра.

9.Рекомендуемые дозы, используемых биопрепаратов, согласно полученных данных биологического тестирования растений по воздействию на них бета- и бета-2- экзотоксинов, должны быть снижены до 5* -4

10 г/лилй 0,5 кг БТБ на 600 л воды для опрыскивания I га угодий при одноразовой обработке.

Основные материалы диссертации опубликовали в следующих

работах:

1. Литвин Ф.Ф., Хэ-и-тань, Ефимцев Е.И. Полярографический метод исследования кинетики и спектров действия фотосинтеза Физиология растений.-, 1965, Т.12, вып.2,-с.364-370

2. Литвин Ф.Ф., Ефимцев Е.И. Исследование спектров действия фотосинтеза на одиночной клетке нителлы внутриклеточным методом., Труды МОИП, отдел биологический, 1966, 16 4,-<5.

3. Ефимцев Е.И., Литвин Ф.Ф. Способ изготовления металлических микроэлектродов в кварцевой изоляции. Авторское свидетельство 1966, К 190524

4. Литвин Ф.Ф., Ефимцев Е.И. Внутриклеточное исследование шкроэлектродаым методом фотосинтеза и сопряженных с ним процессов. Труда МОИП по физико-химическим основам авторегуляции в клетках, 1968, т.ХХУШ, с.196-199

5. Ефимцев Е.И. Колебательные процессы в одиночной растительной клетке. Труды П -Всесоюзного симп. "Колебательные процессы в биол. и хим. системах", Пущино-на-Оке, 1971, Т.1, с.ИО-ПЗ •

6. Ефимцев Е.И. Микроэлектродные исследования спектров действия фотосинтеза и сопряженных с ним процессов. Тез. IУ Международного биофизического контр., Москва, 1972, секц. 1У, с.302

7. Ефимсев Е.И. функциональная связь пигментной системы -отделыгой растительной.клетки. jM-eSta.fi с фотошщуцированними изменениями окислительно-восстановительного потенциала и потенциала покоя. Труда ШИП, Проблемы'биофотохимии, 1973, Наука, М., Т.Х П, с. 155-159

. 8. Ефимцев Е.И.,-БоЙчепко В.А., Ефнмцева Э.Н. Влияние факторов внешней среда на скорость фотосинтеза.'Тез. Всосоюзн. симп. "Биофизические аспекты загрязнения биосферы", 1973, Наука, М., с.о1.

9. Есппмцев Е.И., Дубровский В.Т. Внутриклеточный метод комплексного исследования метаболизма растктолышх клеток. Тоз. Всосоюзн. симп. "Биофизические аспекты пагряоиенпя биосферы'.*,' 1973, Г..ука, М. - С.62.

10. ЕЗканев 33.И., Бойчегасо В.Л. йссягдованао жделелгк -кислорода и водорода фотоелнтезиртишкш! оргезккгсе'Я нрн мсколзо-¡т.тас.чй 20зб;п:гдек1и" Тез. докл. сессп" нсз^гулкггтекот-о коор-

совет?. МГУ по бло'Тотонзко. Проблем ггло.'ото:аг-;д, Г;г;с1.гс, 197'!. - С.1Т.

11. Ефимцев E.II., Игнатов H.B. Флуометрические исследования промежуточных стадий фотопревращения•пигментов этиолированных растений под действием импульсного освещения. Докл. МОИП, общая биология, 1974, Изд. МГУ, М., с.35-36

12. Ефищев Е.И., Ефимцева ЭЛ., Бойченко В.А., Влияние внешних факторов на кинетику и спектры действия фотосинтеза. Докл. МОИП, общая биология, 1974, Изд.МГУ, М., с.37.

13. Литвин Ф.Ф., Красновский A.A.Ефимцев Е.И.., Лебедев Н.И., Игнатов Н.В. Молекулярная организация пигментов, ее роль в фотосинтезе и друтих фотопроцессах в растительной клетке. Тез. ХП Международного Ботанического конгресс'а, Ленинград, 1975, с.429.

14. Ефимцев Е.И., Бойченко В.А., Ефимцева З.Н. Газообмен кислорода и водорода у фотосинтезирующих организмов при монохроматическом освещении. Тез. ХП Международного Ботанического конг-гресса. Ленинград, 1975i с.424

15. Ефимцев'Е.И., Бойченко В.А., Литвин Ф.Ф.. Фотоиндуцирован-кое выделение водорода бактериями и высшими"растениями, Докл. АН СССР, 1975, Т.248, К 4, с.986-989

16. Ефимцев Е.И., Бойченко В.А., Литвин Ф.Ф. Спектры действия фотосинтеза и выделения водорода у бактерий, водорослей и высших растений. Докл. АН СССР, 1975, Т.220, 5, с.1238-1240

17. Litvia P.?.,' Efimtsev E.I., Ignatov N.V., Belyaeva O.B. 1978. Two successive photochemical reactions ia chlorophyll biosyathesis. Photosynthetica, v.12, N p.375-381,-

18. Литвин Ф.Ф., Ефимцев Е.И., Игнатов H.B., Беляева О.Б. Доказательство существования даух фотохимических реакций в процессе биосинтеза хлорофилла и исследование переноса энергии между ними. Физиология растений, 1976, Т.23, вып. I, с.17-23

19. Ефищев Е.И., Байченко В.А., Затолокин Н.Е., Литвин Ф.Ф. Исследование первичных процессов фотоиндуцированного выделения водорода хлореллой при импульсном освещении. Докл. АН СССР,' 1976. т.227, I 3, с.731-734

20. Литвин Ф.Ф., Ефимцев Е.И., Игнатов Н.В. Кинетика фотохимических реакций биосинтеза хлорофилла и миграция энергии между пигментами в этиолированных листьях. Физиология растений, Т.23, выл.4, с.653-659

21. Ефимцев Е.И., Литвин Ф.Ф. Исследование быстрых фотоинду-цированных процессов выделения водорода. Тез. IX Всесоюзной конференции по итогам исследования механизма фотосинтеза. Пунино-на-Оке, 1976, с .36.

22. Литвин Ф.Ф., Ефимцев Е.И., Игнатов Н.В. Миграция энергии в фотоактивных комплексах предшественника хлорофилла в этиолированных листьях и спектроскопические характеристики пигментных форм. Биофизика, 1976, Т.ХХ1, с.307-312

23. Ефимцев Е.й., Архипов В.Н., Лелеткин В.А., Литвин Ф.Ф. Исследование биосинтеза хлорофилла в этиолированных листьях методом скоростной спектрофотометрии. Научные докл. высшей школы. Биол. науки, 1977, №5, с.45-48

24. Ефимцев Е.И., Бойченко В.А., Гусев М.В., Никитина К.А., Литвин Ф,Ф'. Исследование изменений фотосшгтетических характерней! сине-зеленых водорослей в зависимости от длительности темповой инкубации. Физиология растений, 1977, Т.24, № I, с.23-29

25. Бойченко В.А., Ефимцев Е.И. Способ определения фотообра-зоЬания водорода биологическими системами. Авторское свидетельств

1978, № 687637

26. Ефимцев.1.И., Бойченко В.А., Литвин Ф.Ф. Полярографический метод исследования спектров действия и кинетики газообмена

02 при фотобиологических\процессах.'Физиология растений. 1978,' Т.25, вып. 4, с.860-868 .

27. Бойченко В.А., Ефимцев Е.И. Ингибиравзние активности фотосистемы П у хлореллы при высоких концентрациях кислорода. • Физиология растений, 1979, Т.26, вып,4, с.815-823

28., Ефимцев Е.И., Бикетова Д.'Х. Изучение состояния цитбхро-мов целых клеток в процессе культивиро-

вания. Депонирована во ВНИИСЭНТИ, 1985, 15 299МБ-Д85 . ' .

ЕгороЕ Н.С., Лория Я.К,, Юдина Т.Г., Ефимцев Е.И., •Чигалейчик А.Г.,'Уваров И.П. Определение интенсивности токсико- . логического действия кристаллов -&О.С, тез, итоговой

научно-практической конференции МГУ' - Главмикробиопрома, Москва, 1986, с.21 ■'.';'■" ; . -..'.".

ЗР. Ефимцев Е.И., Новиков М.Н. Исследование влияния экзогенных факторов на репродуктивный аппарат растений. Научн. ¿руда Моск. лесотехн. инст,., 1987, вып.187, с.61-63

31. Ефимцев Е.И., Чигалейчик А.Г. Способ определения бета-экзотоксина в инсектицидных биопрепаратах. Авторское свидетельств 1937, Л 1359744

32. Ефимцев Е.И., Новиков М.Н., Кузнецов M.II., Новикова О.Б. Изучение результатов антропогенного воздействия на семенное потомство и фотосинтетический аппарат сосны обыкновенной. Тез. Все-союзн. конф. по проблемам физиологии и биохимии древесных растений, Петрозаводск, 1989, с.210

33. Ефимцев Е.И., Буров Г.П., Соломин A.A., Юдина Т.Г., Егоров Н.С. Определение роли компонентов битоксибациллина в проявлении его биологической активности. Антибиотики и химиотерапия., 1989, Т.34, № II, с.841-846

34. Ефимцев Е.И., Новиков М.Н., Кузнецов М.й. Изменчивость фотосинтеза проростков семян сосны обыкновенной из района воздействия промышленных эмиссий. Научн. труда Моск. лесотехн. инст., 1989, вып.211, с.68-72

35. Ефимцев Е.И., Воронина O.E. Проведение исследований фото-индуцированного обмена кислорода у проростков древесных растений

и водорослей полярографическим методом. Метод, указания для студентов, Моск. лесотехн. инст., Москва, 1989", с.1-19

36". Ефимцев Е.И., Штанникова Е.В. Флуоресценция "töittbikß, индуцируемая анаэробиозом и ее связь с. функциональным состоянием . клетки. Биол. науки,'1989, $ 5, с.85-89

37. Ефимцев Е.И., Буров Т.П., Кузнецов М.И., Новикова О.Б. Экзогенные метаболиты А&с. ifusünjfiüisis адениновой природа и воздействие бета-экзотоксина на фотосинтезирующие организмы. Научн. труда Моск. ..лесотехн. инст., Москва, 1989, вып.2П, с.19-38

38. Ефимцев Е.И., Буров Г.П. Применение количественного контроля бета-экзотоксина на этапах биотехнологического процесса производства битоксибациллина. Тез. Всесоюзн. конф. создания и применения микробиологических средств защиты растений, Велигож, 1989,

г.48 /."

39. Ефимцев Е.И., Буров Г.П., Соломин A.A. Количестве^ое эпределение бета-экзотоксина J3<i,c. -thwubg ■ в инсектицидных биопрепаратах. Биол., науки, 1990, № 2, с.119-126 ,

40. Ефимцев Е.И., Буров Г.П., Ефимцева Э.П. Особенности количественного анализа экзотоксинов ■ адениновой трирода в биопрепаратах. Тез. П Симпозиума стран - членов СЭВ по дикробным пестицидам, Протвино, М., 1990, с.171

41. Ефимцев Е.И., Новикова O.E., Кузнецов М.И. Воздействие экзотоксинов битоксибациллина на фотосинтез растений и сопряжение с ним процессы. Тез. П.Симпозиума стран-членов СЭВ по микроб-.

ным пестицидам, Протвино, М., 1990, с.109

4-2. Егоров Н.С., Юдина Т.Г., Буров Г.П., Ефимцев Е.И. Экзогеннге метаболиты нескольких подвидов З^сЛ^х^^ч '1^ Тез. П Симпозиума стран-членов СЭВ по микробным песттш, Протвино, М., 1990, с.38

4 3. ЕфимцевЕ.И., Буров Г.П. Способ количественного определения бета-экзотоксина и дополнительного инсектицидного компоненте в биопрепаратах. Авторское свидетельство, 1991, В 1745172.

44. Ефшцев Е.И. Хемишдуцкрованное окисление бактерий порманганатом калия как способ оценки их жизнеспособности Тез. докл. Всесоюзной конференции Достижения баотехноногил - 'агропромышленному комплексу, Черновцы, 1991, с. 152.

45. Ефищев Е.И., Буров Г.П. Обнаружение и некоторые свойств; бета-2-экзотоксина, синтезируемого ¿ЬаЫМи?

Тез. дом. Всесоюзной конференции Достижения биотехнологии -агропрогдшшеняому комплексу, Черновцы, 19Э1, .с. 151.

46. Ефиицев Е.И. Механизм эндогенной изменчивости растений индуцируемой бета- я бёта-2-экзотаксинаьта £а.сс££и£

Тез. докл. Всесоюзной -конферошиш Достижоцкя биотехнологии -агронрошшдещгому комплексу, Черновцы, 1291, с. ОС.

Л?<¿/4 4