Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная локализация и регуляция биосинтеза предшественников хлорофилла

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурная локализация и регуляция биосинтеза предшественников хлорофилла"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРШШГГАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им. В. Ф. ИГОРЕВИЧА

На правах рукописи

РАССАДИНА Валентина Вацлав овна

СТРУКТУРНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И РЕГУЛ/ЩИ БИОСИНТЕЗА ПРЕДШТЮТЗЕННИКОВ ХЛОРОШЛА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой отепени кандидата биологических наук

Минск - 1992

Работа выполнена в лаборатории биофизики и биохимии фото-оинтетического аппарата Инотитута фотобиологии АН Беларуси

Научные руководители:

член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук профессор [А.А.Шлык .

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологичеоких наук Н.Г.Аверина

доктор биологичеоких наук В.Л.Калер

кандидат биологических наук Г.Е.Савченко

Кафедра физико-химической биологии Биологического факультета Московского государственного университета

Защита состоится "22" О-мрчия, 1992 г. в 1( 1 часов на заседании специализированного совета К 006.04.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологичеоких наук при Ордена Трудового Красного Знамени Институте экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купревича АН Беларуои (220733, г.Минск, ул. '¿.Скорины, 27)

С диссертацией мсжно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Л. Колоса АН Беларуои,

Автореферат разоолан "2.0" ила рТс. 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологичеоких наук ¿V А^сс^7 _ и.В.Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальной проблемой современной биологии является исследование биогенеза пигментного аппарата фотосинтеза. В этой связи большой интерес представляет выяснение структурно-функциональной организации аппарата биосинтеза хлорофилла, путей образования молекул этого пигмента и его предшественников, их локализации в структуре хлоропласта и связи с другими компонентами фотосинтетического аппарата.

К настоящему времени практически полностью установлена последовательность реакций, в результате которых из 5-углеродного скелета глутаминовой киолоты образуется молекула хлорофилла (Зеа1е, ','/е1па1;о1п,1990). Показано, что хлоропласта растительных клеток содержат все ферменты, необходимые для превращения глутаминовой кислоты в хлорофилл. Предполагается, что ферменты ран -них этапов хлорофилл ообразованкя - от образования молекулы 5-ами-нолевулиновой кислоты до синтеза протопорфириногена IX, докали -зованы в строме, а ферменты, катализирующие все последующие ота-дии процесса - в мембранах хлоропластов (Савгв1Гглпоо, Вва1в, 1983).

Систематическое исследование локализации аппарата биосинтеза хлорофилла в структуре хлороплаотов зеленых растений было инициировано и активно проводилось А.А.Шпыкш и сотрудниками. Данные о том, что наиболее легкие и лабильные субмембранные частица, получаемые при дезинтеграции хлоропластов, обогащены ове-жеобразованными молекулами ^-хлорофилла, его предшественника™ - хлорофиллидом а, протохлорофиллидом, монометиловым эфиром М§-протопорфирииа IX, а также свежеобразованными молекулами кароти-нсидов,. хлорофиллазой и ферментом, превращавши хлорофилл а в хлорофилл в, послужили основой для формирования представлений о метаболической гетерогенности фотосинтетических мембран и наличии в них особых структурных элементов - центров биосинтеза хлорофилла, которые содержат высокоорганизованные полиферментные комплексы хлорофилл-синтетазы. Вио показано, что в, центрах биосинтеза хлорофилла осуществляется широкий круг реакций, начиная, по крайней мере, с этапов образования и метилирования М^-прото-порфирина IX и завершая процесс синтезом самого хлорофилла (Итак и оотр., 1967, 1969, 1975, 198С).

Параллельно о этими работами представления о полиферментной сиотеме - олигомере о интегрировании активным центром, осуществляющим полностью формирование молекулы хлорофилла, начиная от образования молекулы 5-аминолевулиновой кислоты, развивались Ка-лероь: и сотр. fcaler et el., 1969; Калер, 1ЭТ6; Калер, Фридлявд, 1978; Фридлянд, Калер, 1980) на основании математического моде -лировачия процесса биосинтеза хлорофилла.

Однако и на сегодняшний день еще мало известно о внутренней организации полиферментных комплексов, входящих в состав центров биосинтез хлорофилла, о локализации центров в структуре хлоро-пластов. Неясно, насколько широк круг реакций, осуществляемых хлорофилл-синтетазой, какова природа рада механизмов, контролирующих активность отдельных ферментов биосинтеза хлорофилла. До-полнгтельную информацию о<5 этом могло дать изучение биосинтеза, нативного состояния, локализации в мембранах хлороаластов и вза-имооргаииэации ранних предшественников хлорофилла - протопорфи-рина IX, М^-протопорфирина IX, его монометилового эфира и прото-хлорофиллида.

Развитие представлений о структурно-функциональном устройстве системы биосинтеза хлорофилла органически включает в себя вопросы, касаюаиеся природа механизмов контроля процесса хлорофил-лообразования. Важным достижением последних лет явилось открытие существования в растениях нескольких путей биосинтеза хлорофилла, образующих химически различающиеся вида молекул этого пигмента, которые, по-видимому, связаны с разными пигмент-белковыми комплексами фотооинтетичеокого аппарата и выполняют, таким образом, различные функции в фотосинтезе { Rebela et ni., 1982). Представляло значительный интерес изучить метаболические особенности поведения промежуточных и конечных продуктов темнового биосинтеза хлорофилла в различных биосинтетических путях. С этой целью изучали образование моно- и дивинильных производных предшеотвенни -ков хлорофилла - протохлорофиллида и монометилового эфира Mg-npo-топорфирина IX в однодольных и двудольных растениях.

Сокращения. AJIK - &-аминолевулиновая кислота; ПП - протопор-фирин IX; Ш - Mg-протопорфирин IX; МПЭ - монометиловый вфир МП; МП(Э) - суша МП и МПЭ; Цц - протохлорофиллид; Хл - хлорофилл; ЦБХ - центр биосинтеза хлорофилла; СФ и СВФ - спектры флуорео -ценции и возбуждения флуоресценции; Ж - 2,2-дипиридил; МВ - пиг-

менты, содержащие во 2-ом положении порфиринового макроцикла ви-нильную группу; ДВ- - пигменты, содержание во 2-ом и 4-ом положениях порфиринового макроцикла винилыше группы; Ос и С - ооадки и супернатанты, полученные при центрифугировании фрагментов хло-ропластных мембран.

Цель и задача работы. Основная цель работы заключалась в получении новых данных о структурной организации, функционировании и регуляции активности аппарата биосинтеза Хл через изучение образования, нативного состояния и взаимоорганизации темновых предшественников Хл - ПП, Ю(Э) и Пд. Вали поотавлены следующие задачи:

1. Изучить нативное оостошие, локализацию в мембранах хло-ропластов и пространственную взаимоорганизацив ранних даембрано -связанных предиесгвенников Хл - ПП, Ш(Э) и Пд m vivo.

2. Исследовать возможное энергетическое оопрянение ПП и' Ш(Э) с каротиноидами.

3. Изучить активность одного из ферментов Mg-участка пути биосинтеза Хл - S -аденозил-I -глетионингМ^-протопорфирин IX ме-тилтрансферазы в листьях лшеншда, снабжаемых экзогенной АЛН.

4. Изучить химическую гетерогенность молекул Цд и МПЭ в ряде этиолированных, поотэтиолированшх и зеленых однодольных и двудольных растений в норме и при обработке их экзогенной АЖ и хелаторами металлов. -

Научная новизна работы. Обнаружено сцепленное сооредоточе -низ ПП, МП(Э) и Цд в участках хлоропластных мембран, характеризующихся повышенным содержанием ЦБХ. Сделан вывод, что все мемб-раносвязанкые стадии формирования молекула Хл, начиная,.по меньшей мера, с образования ПП, осуществляются в ЦБХ и катализируются единым поляферментным комплекссм.

Описаны in vivo низкотемпературные СФ и GB5 ПП и МП(Э) в этиолированных листьях ячменя и пшвпкца и з клетках мутанта Chla-mydoraonas г. H-I9. Показано, что образованные из экзогенной АЛК молекулы ПП и Ш(Э) накапливаются в растениях в монемзрном состоянии. Установлено, что in vivo существует миграция энергии от ПП и Ш(Э) к Пд, тогда как ПП и Ш(Э) энергетически разобщены о каротиноидами.

По мере накопления в этиолировали« и зеленых листьях лшени-щ МПЭ и Цд из экзогенной АЛК активность S-аденозил- ь-мэтиошш:

ьу-протопорфирин II штилтрансферазы заметно снижается.

Обнаружен различный характер накопления подфондов ЫВ— и ДВ-Пд в ходо темпов ого развития этиолированных семядолей огурцов, в ходе ресинтеза Цц после светового воздействия «'доследующего затемнения семядолей, а также при накоплении пигментов из экзогенной МК. В двудолышх растениях существуют два типа ЦБХ, одни из которых синтезируют Ш-, а другие - ДВ-Пд. ЦБХ ИЗ- и ДЗ-типов в двудольных растениях функционируют независимо друг от. друга. У однодольных растений ДВ-Пд является интермедиатом в цепи хлорофиллообрезования - предшественником МВ-Цд. ЛД индуцирует накопление МВ- и ДВ-производных Пд и ШЭ, активируя, таким образом, МВ- и ДВ-типы ЦЕХ.

Практическое значение, Исследование нативного состояния, внутримембранной локализации и взшшоорганизации молекул предшественников Хл, а также их химической гетерогенности способствует лучшему понимания принципов структурной организации и функционирования аппарата биосинтеза Хл. Сведения о сопряженной вну-трихлоропластной локализации и энергетическом взаимодействии Ш, !'П(Э) и Пд язляютоя вшшш свидетельством их пространственной близости, что экспериментально подтверждает существование ЦБХ и полиферментного комплекса, катализирующего мембраносвязанные реакция процесса биосинтеза Хл.

Разработанный нами спектр офлуориштрический метод количественного определения ГШ в экстрактах этиолировгшшх и зеленых листьев, содержащих пилимо ПП такке ЬШ(Э), Дц и хлорофиллид, нашел широкое использование в работах лаборатории по изучению метаболизма ранних интермздиатов цепи хлорофиллообразования.'

Полученные в работе фундаментальные данные имеют практическое значение при создании гербицидов, обладаювдпе фотодинашчес-ким типом действия.

' Апробация работа. Материалы работа докладывались и сбсоздались на ГУ Всесоюзной конференции по яиши и приисканию порфири-нов, Иваново, 1984; 1У Всесоюзной конференции до "Биологии клетки'", Тбилиси, 1985; Региональной конференции "Молекулярные механизма регуляции метаболических процзосов", Минск, 1987; Всесоюзном совещании по пзотицидш, Черноголовка, 1288; У Всесоюзной конференции по координационной и физической химии порфиринов, , Иваново, 1988; Всесоюзно;.»] оовзщании по молекулярной лвминесцон-

о

ции, Караганда, 1939; Г/ Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, Минск, 1990; 2-ом Воеооюзном съезде физиологов растений, Минск, 1990; Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология", Пущино, 1991.

Публикации. Результаты опубликованы в работах.

Структура диссертации. Диссертация содержит; введение, обзор литературы, 2 главы, обсуждение результатов, выводы, приложение и список цитируемой литературы из ^^наименований. Материал содержит страниц машинописного текста, таблиц и рисунков.

Объекта и методы исследования. Работу проводили о этиолированными, постэтиолированными и зелеными листьями ряда однодоль -них и двудольных растений, а также пигментным мутантом СЫатуДо-топаз г. Культуру мутанта любезно предоставил А.С.Чунаез. Зеленые растения выращивали под люминесцентными лампами ЛБ-40 (освещенность 3,2 Вт/м2), а этиолированные - в темноте, при 24°С в обоих случаях. Клетки мутанта культивировали в темноте при 24°С на плотной среде Я2 с ацетатом в течение нескольких суток (Квитко, Борщевская, Чунаев, .1983).

Измерения флуоресценции экстрактов листьв проводили о помощью спектрофлуориметра, изготовленного ЦКБ АМН СССР, регистрируя некоррелированные спектры (Аверина, Шалыго, Фрадкин, 1980).- Некоррелированные и СВФ листьев и клеток водоросли при ~196°С регистрировали на спектрофлуориметре, описанном в работе (Домая-ский, Самойленко, Лис, 1986), при спектральной ширине щели воз -бузздащего и регистрирующего монохроматоров 2 нм оо светофильт -ром 0С-13 перед регистрирующим монохроматором.

Для выделения хлоропластов листья растирали в 0,2 М Трио -Ш1 буфере с добавлением сахарозы, после чего гомогенат пропускали через 2 слоя капроновой ткани и осаждали пластиды в течение 15 мин при I ООО Для выделения фрагментов мембран использовали либо механическую дезинтеграцию листьев, либо добавление к хлоропластам 0,5$ раствора дигитонина. Фракционирование мембран проводили с помощью выоокоскоростнсго дифференциального центрифугирования фрагментов хлоропластов в режиме: 10 мин - 2 ООО р, 30 мин - 10 ООО 2, 50 мин - 50 ООО а. 60 мин - 144 ООО д. Лепте частица, содержащиеся в конечном оупернатанте (С^), высаливали о помощью 30-, 60- и 100$ сульфата аммония и осаждали центрифуги-

рованием 60 мин при 144 ООО

Количества ПП, №(Э) к Пд определяли по СФ отмытых гексаном водно-ацетоновых экстрактов листьев (Аверина и др., 1980, 1984). Содержание Хл а и в в гексане рассчитывали из спектров поглощения ( Kooki, 1950).

Хроматографическое разделение ПП, МП, МПЭ и Пд осуществляли в тонком слое силикагеля ЛС 5/40 ммк в системе растворителей: бензол-этилацетат-этанол (4:1:1,У/УД) ( Belan^er, Bebeiz, IS80). Разделение пулов Пд и МПЭ на MB- и ДВ-компоненты осуществляли с ' помощью хроматографии в тонком слое полиэтиленового порошка марки ПНД 20508040, выпускаемого Гурьевским химкомбинатом (СССР), модифицировав известную методику ( Belonger, Rebeia, 1980).

Активность s-аденозил- Ь-метионин:М£-протопорфир;ш IX метил-трансферазы определяли по количеству МПЭ, образованному гомогена-таш листьев пшеница из S-аденозил- Ь-ыетионина и МП ( Ellsworth, Dullagh-.ni, Pierre, 1974).

НАТШНОЕ СОСТйШИЕ, ВЗАИМНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В

МЕМБРАНАХ ПЛАСТИД ПР010П0РФИРИНА IX, Мз-ПРОТОПОРФИРИНА IX,

МОНОЫЕТКЛОВОГО ЭФИРА М£-1РОТОПО№1РйН,Г IX И ПРОГОМОРОФШШЩ.

Спектоосвлуориметричеокое исследование нативного состояния ПП и Ш(Э) в растениях. В результате исследований спектральных свойств этиолированных и зеленых листьев получена значительная информация о нативном состоянии Хл и его ближайшего тешового предшественника - Пд (Красновский, 1974; Virgin, 1981). Сведения о опзктральных характеристиках других болео ранних интермедиа?ов цепи хлорофиллообразования - ПП и Ш(Э), весьма ограничены. Спектра поглощения мутантов водорослей к- высших растений с повышен -ним содержанием зтих пигментов осложнены полосами поглощения других продуктов цепи биосинтеза Хл и каротиноидов. Известная нам информация о лшинеоцентнах свойствах ПП и Ш(Э) in vivo к началу данного исследования сводилась к данным о положении полосы Соре ПП в' ¡тетках рорфирановах ыугсштов (Яйаиуйоаопаа г, (Чунаев ' и др., 1981) и основной полосы свечения МП(Э) в зеленеющих листьях ячменя (Аверина, Шалыго, Фрадкин, 1980).

Исследование нативного состояния ПП проводили о использованием малопигментированной этиолированной ткани (2-дневные проростки или нижняя часть 12-дневнах лиотьев ячменя), обработанной она-

чала растворами хелаторов металлов - ДП или 1,10-фенантролина,. блокирующими превращение МПЭ в Пд (Duggan, Gaeemum, 1974), а за -тем экзогенной АЛК в сочетании о хелатором. Подвергнутые такой процедуре листья содержали практически только ПЛ.

СФ (-196°С) этиолированного лиота, накопившего Ш (рио.1), имеет сложную структуру о основной полосой при 632-633 нм и тремя менее интенсивными полосами при 664. 682 и 701 нм. В зарегистрированном при 701 нм СВФ такого листа наблюдаются полосы при 631, 605-607 , 577 о плечом при 585, 542, 512 и 418 (Соре) нм. СФ и СВФ m viro показывают независящее от температуры регистрации батохромное смещение по оравнению оо спектрами ПП в растворе 0,05 MNajHPo^ (для полосы Соре смещение составляет 14 нм). Различным оказалось и соотношение интеноивностей полос в СВФ. Щ in viro и In vi tro. Нами, так. же как и другими авторш,ra (bañóla et al.,1981), показано, что добавление сывороточного альбумина к раствору ПП в 0,05 М ИагНР04 приводит к батохромному смещению полосы Соре на 13 нм и основного максимума в СФ на 10 нм, так что в присутствии белка СФ и СВФ приближаются к спектрам порфирина в листе. Вероятно, связь ПП о мембранами определяется в основном гидрофобным взаимодействием пигмента о белковыми компонентами мембраны. Однако, поскольку связывание о альбумином не влияет на соотношение между интеноивноотями полос в СВФ ПП, можно говорить о дополнительных специфических особенностях микроокружения порфи-рина в клетке.

Поскольку в ассимилировавших экзогенную АЯК этиолированных листьях ПП накапливается в количествах, сопоставимых с уровнем эндогенного Пд (Аверина и др.,1988), спектральные свойства длинноволновой форма которого определяются агрегацией пигментных молекул (Фрадкин, Шшк, 1978), можно было ожидать, что ПП накапливается также в агрегированной форме. Однако никаких спектральных проявлений агрегации, характерных для ПП in vitro, таких как гип-сохромный сдвиг полосы Соре, "размывание" и батохромный сдвиг Q-полосы, появление новых полоо в СФ, в спектрах изученных расти -тельных объектов не наблюдается. Использование воздействий, ведущих к разрушению агрегатов Цд и Хл в листьях, таких как инфильтрация в них дигитонина, пиридина, многократное замораживание-оттаивание образцов, не влияет на спектры ПП в растениях. Сделан вывод, что in vivo ПП находится в монемзрном оостотшг.

Ряс. I. Спектры флуоресценции (-196°) при возбуждения 410 ем (I) я возбуждения флуоресценция при TOI нм (2), 580 им (3), 550 н?л (4) и 530 нм (5) 2-дневного этиолированного листа ячменя,инкубированного 3 ч на раствора 10 ыМ ДП,а затем 18 ч на растворе 10 мМ AÄK в сочетании с Ш. Приведен такке спектр возбуждения флуоресцан -ции водного раствора рибофлавина при 585 нм (6)

Рве. 2. Спектры флуоресценции (-196°) при возбуждении 420 т (I) я возбуждения флуоресценция при 593 (2,3). 560 (4), 550 (5) и 530 нм (6) 7-дневного этиолированного листа ячменя,инкубированного 3 ч на растворе 10 мМ ДП, а затем 18 ч на растворе 10 tí»! АЛК. Приведен также спектр возбуждения флуоресценции водного раствора рибофлавина при 585 нм (7).Масштаб спектров 3-6 увеличен в 10 раз.

В СФ (-196°С) 7-дневных этиолированных листьев, обработанных в те г,йоте растворами хелаторов, а затем подкормленных экзогенной АЛК, присутствует узкая полоса МП(Э) о максимумом при 593 нм (рис.2). Наблюдение второй полосы флуоресценции МЩЭ) ln vivo затруднено из-за наличия полос Цд в области 630-660 нм. В СВФ нативного МП(Э) присутствуют полосы с максимумами при 42S (Соре), 555 и 592 нм. Вид спектров МП(Э) in vivo практически не зависит от температуры регистрации. Полоса Соре эндогенного МЩЭ) смещена в красную облаоть на 8 »л по сравнению с полосой Соре МП в 0,5 M п«2®04 Отношение интенсивноотей полос Copo и полос при 555 нм у нативного пигмента меньше (1,6), чем у раство -ренного (6,0). При добавлении к раствору Ж в фосфатном буфера сывороточного альбумина, как и в случае ПП, наблюдаотся'батохром-ное смещение полосы Сорз (до 10 нм), возрастание лнтенсявности свечения, сужение основной полосы флуоресценции и гилсохромный сдвиг второй полосы свечения.

Низкотемпературные спектры МП в Трис-ЮГ буфере с добавлением Д?,Й0 и Тритона 2-100 паилутаим образом воспроизводят спектры нативного пигмзнга и по положении глкомгумов, и по соотношению • интенсивностей полос в СФ и СВ§. Полосы Ш1 в модельной системе уже, чей in vivo, что может объясняться более жесткой фиксацией и ориентацией молекул пигмента з замороженном растворе.

Ни на одной из стадий накопления Ш(Э) в листьях, как и в случае ПП, не наблюдалось признаков агрегации этого пигмента, характерных для агрегатов МП in vitro (Гуриношге, Севчеико, Соловьев, 1968).

Таким образом, особенности нативного состояния ПП и МЩЭ), накапливаемых из экзогенной АЛК з этиолированных листьях, обусловленные их взаимодействием с мембранами, опредслявтся в основном гидрофобным взаимодействием пигментов с белками мембран, а также другими оообенпоотлга ыикроокружоя:гя аорфяринов в клетке, in vivo и МЩЗ), и ПП находятся в моноиерноа состоянии.

Отсутствие переноса энергия от каротинодлов к ПП и Ш(.Э) в растениях. Эффективность переноса энергии от каротиноидсп к Хл в светособирающих комплексах хлоропласгов достигает 10С$ (Фрадкин и др., 1975; 1886; Siefermann-Iíarraa,IS35), тогда Как миграция энергии от каротинокдов к Яц как в этиолирезаншх (Batier, 1961; Pradlcin et ni., 1969), так и в зеленых растениях (1!1лык и

др., 1967) либо отсутствует, либо имеет место о очень низкой эффективностью - 2-5/? (Стадничук, Литвин, 1989). Миграция энергии от каротиноидов к Пд и Пхл в модельных системах (Зенькевич и др., 1975; Фрадкин и др., 1985) показывает принципиальную возможность переноса анергии между этими пигментами и свидетельствует о сте-рической разобщенности желтых пигментов и Пд в мембранах пластид (Фрадкин, 1Шшк, 1967). Данные об энергетической сопряженности ка-ротиниидов и более ранних интермедиатов цепи хлорофиллообразова-ния в высших растениях к началу данного исследования отсутотво -вали.

Анализ СФ и СВФ (-196°С) этиолированных и зеленых листьев ячменя, накопивших Ш(Э), показал, что в зарегистрированном при наблюдении в максимуме свечения МЩЭ) - 593 нм - СВФ помимо по -лос МЦЭ) - 426 и 555 нм, отмечается слабая полоса о максимумом при 477-480 нм (рио.2). При регистрации флуоресценции в более коротковолновой области спектра - 580 , 550 , 530 нм, где Ш(Э) не флуоресцирует, полоса о макимумом при 477-480 нм становится более интенсивной и наряду о ней появляется полоса с максимумом при 453 нм. Это означает, что на флуоресценцию МП(Э) при 593 нм налагается длинноволновый спад свечения, максимум которого находится в более коротковолновой области. Одним из источников коротковолновой люминесценции в листьях могут быть вещества флавино-воЙ природы, излучающие в области 450-650 нм (Kataki., Vagi, IS70). Так, водный раствор рибофлавина обладает широкой полосой флуоресценции в области 500-700 нм и двумя полосами в СВФ о максимумами при 449 и 480 нм, напоминающими полосы СВФ нативного этиолированного листа.

В СВФ этиолированного лиота, накопившего практически только ПП (рио.1), так же присутствует малое плечо в области 480 нм, которое, по-видимому, обусловлено поглощением оамого ПП, поскольку оно отчетливо проявляется в СВФ этого порфирина в растворах. Регистрация СВФ содержащих Ш1 лиотьев при наблюдении в более корот-волноввй области спектра, где ПП не флуоресцирует, свидетельствует об усилении полосы при 478 и появлении новой - при 454 нм, что, вероятно, тал же следует связать оо свечением веществ флавиновой природа.

Спектрофлуориметрическое исследование клеток мутанта СЫшау-domonaB и, содержащего только ПП, показало отсутствие в СВФ ПП

полос переноса энергии от каротиноидов. В зеленых листьях ячменя и пшеницу, обогащенных Ш и МП(Э), миграция энергии от каротиноидов н этим пигментам также отсутствует.

Таким образом, отсутствие переноса энергии от каротиноидов к Щ и МП(Э) в этиолированных и зеленых растениях указывает на то, что эти порфириш, как и Пд, разобщены с каротиноидами, скорее всего, в силу пространственной удаленности пигментов друг от друга.

Перенос энергии мекду ПЛ. Ш(Э) и Пд в растениях. Поскольку П11 и Ш1(Э), как и Пд, изолированы от желтых пигментов, логично предположить, что все эти предшественники Хл находятся в одних и тех же локусах мембраны и между ними возможен обмен энергией. Анализ СФ и СВФ (~196°С) этиолированных листьев ячменя и пшеница, ассимилировавших экзогенную АЛК и накопивших как Пд, так и ПП, ■ показал, что в зарегистрированных при 656 пм СВФ таких листьев наряду с полосами Цд присутствуют и полосы ПП. Поскольку собст -венное свечение ПП в области 656 им незначительно (рис.3), наличие полос ПП в СВФ при" 656 нм монет объясняться миграцией энергии от ПП к Пд. Сопоставление интенсивности полос ПП и Пд в СВФ и СФ нативных листьев г в спектрах, соответствующих вкладам собственного свечения и поглощения этих порфиринов, показывает, что перекос энергии отвечает более чем за 9Q% интенсивности полос ПП в СВФ ( к наблюдения 656 н.м) и более чем за 7С$ интенсивности флуоресценции Дд при S56 им, что указывает на интенсивный перенос энергии мезду этими пигментами. Дополнительное подтверждение наличия миграции энергии от ПИ к Пд получено в экспериментах, з которых наблюдалось возгорание собственной флуоресценции ПП и ослабление его полос в СВФ Пд656 при инфильтрации дигитокина в содержащие порфирины листья, а также при их многократном замо-ражизашш-оттаизании.

Сложность спектров нативных листьев затрудняет количественный расчет эффективности миграции энергии от ПП к Пд. Относительным количественным показателем, характеризующим эффективность переноса, кожет быть изменение интенсивности полосы при 512 нм в СВФ ПП яри переходе от длиш волны наблюдения 633 к 656 нм. Наибольшее значение этой величины наблюдалось для листьев, обработанных АЛК и г.инетином (0,53+0,14). Наименьшее - ггргт обработке листьев сначала ЛД, а затем ДП и АЖ (0,06^0,03), в результате

Рис. 3. Спектры флуоресценции (-196°С) при возбуждении 410 нм (А) и возбуждения флуоресценции при 656 нм (Б): I, 1'- спектры 7-дневнго этиолированного листа пшеница, инкубированного 16 ч на растворе 10 мМ АЛК; 2, 2'и 3, 3'- вклады в спектры I и обусловленные собственной флуоресценцией ПП (2, 2') и Пд (3, З"); 4 -сумма спектров 2 и 3.

coropoií практически не накапливалась промежуточная форма Цц, ?луоресцирупщая в области 637-643 им. Высказано предположение, ito перенос энергии от Ш к Пд656 осуществляется через более коротковолновые промежуточные формы Пд. Отсутствие или слабое знер-?етич80К0е сопряжение мезду Ш1 и Пд656 в обработанных хелаторами иготьях метет быть вызвано нарушением нативного состояния мем-Зран зтиопдастоз, о которыми связаны цорфириш, в результате хеширования ионов геталлов, присутствующих в мембранах. Рибарг и зоавт. показали, что обработка этиолированной пшеницу 8-гидрок-зшшнолином приводит к уменьшению виутритилакоидного пространот-за этяопластов (Ryborg,1983).

При инкубации этиолированных лкотьез в течение I ч на раот-зоре ДП, а затем в течение 16 ч на растворе АЛК в них образуется 1д637-643 и МП(Э). Показано, что CBÍ> таге ого листа, зарегиотриро-эашмй при 700 ш, где Ш(Э) практически не флуоресцирует, наряду з полосами Пд содержит также и полосы Ш(Э), что может слидвтоль-зтвовать о миграции энергии от !Ш(Э) к Пд. В листьях, получивших гесткую обработку хелаторами, хорошо видны полосы собственной лю-линесценции Ш(Э), что говорит о низкой эффективности стока энергии от !Ш(Э) на другие пигменты в таких объектах. Как и в олучае з ПП, это может быть связано с отсутствием накопления промзлуточ-шх форм Пд и/или о нарушением натизного состояния-мембран под действием хелатороз.

С учетом мембранной локализации ферментов биосинтеза Хл: зротопорфириноген-оксидази (Jacobo, Jscobe¡,rf84), Mg-хелатазы (HsbeiH et alI978), Б-аденозил-ь ч.;зтиопин:Ш мзтилтрапсфзразы ^Rebaia et al.,I97Q), Mg-цкклазы (Caatelfrorteo, 3cala, 1983) и ЩФН-Пд-оксидоредуктазн (bütz ei al.,I98I) обнаруженная нами зространственная близость in. vivo рада интермедиатов биосинтеза 1Сл в значительной степени укрепляет прздогавленке о су^зствова -;ши мзмбранноовязанного феркзптного коглиокоа биосинтеза Хл.

Структурная организация аппарата биоогатзза Хл, при которой осуществляется сток поглощенной порфиринаии энергии та агрегированные, неактивные з фотодинамичеокпх пропеосах длапнезолновуо |орш Дч (Вютрава, Назарова. ISS8) кмевг водное фкзиогагичеокое значение: с одной стороны, повышается вероятность фототраисфор -«ации Пд656 в хлорофиллид, с другой - осуиеотвлоттся оффзктгоная защита растительного организма от фотодзотрукционят-. про^'осол,

сенсибилизируемых порфкринами.

Локализация Ш в мембранах хл opon ластов зеленых листьев ячменя. ассимилировавших экзогенную AJIK. Полиферментный комплеко Хл-синтетазы, обеспечивающий работу ЦЕХ, осуществляет широкий круг биооинтетических реакций, начиная юс, по крайней мере, о 'этапов, связанных о мембранами - включения в ПП, этерифика-ций последнего до метилового эфира и завершая процесс синтезом молекул Хл ¿ и в (Шлык и др., 1970, 1975, IS8I). Образование . предшественника Ш - Ш, происходит в аосоциацйи о мембранами хлороплаотов (Jacobs, Jacobs, 1984). Чтобы выяснить, связано ли образование ПП о ЦБХ,изучали внутрихлоропластную локализацию и распределение во фракциях мембран хлероплаотов ПП, образованного in vivo в отрезках зеленых листьев ячменя, ассимилировавших экзогенную АЛК. Дезинтеграцию мембран хлороплаотов осуществляли с помощью механического разрушения листьев, либо путем пропускания выделенных хлороплаотов через Френч-пресс, либо обрабатывая хло-роплаота 0,5$ дигитонином. Фракционирование частиц хлорояластов осуществляла о помощью высокоскоростного дифференциального центрифугирования. Легкие частица, содержащиеся в конечном суперна-танте - высаливали о помощью 31$2, 6С$ и IOO^Ó (WH^so. и осаждали центрифугированием в течение 60 мин при ускорении 144 тыс. пооле чего осадки 0o3!j^, Оо6С^ и Ос100'" промывали соответствующим по концентрации раствором ((Ш4)2зо4 для удаления водорастворимых порфиринов - уропорфирина и копропорфирина, оо~ осаждающихоя с частицами.

Опыты о проотш растиранием зелешх листьев ячменя, ассимилировавших экзогенную АЛК, последующим дифференциальным центрифугированием полученного гомогеката и высаливанием частиц С^ о- помощью 30£ (hh4.)2S04 показали, что основные количества ПП (до 95,2?), такш как и остальных шгшнтов - Хл а,+в, Пд и Ш(Э), обнаруживаются в составе крушгях частиц. На долю легких фрагментов мембран Оо^ и Оо ^ прнходнтоя соответственно лишь около 3-4$ ПП-, Ш(Э), Пд в 0,2& Хл ци*. В оупернатанте, оотающемоя пооле высаливания чаотпц С^^, бшш обнаруяана лишь водораотворише предшественники Хл - МК, порфобилиноген, уропорфирин и копропор-фирин. Оценка соотношения количеств Хл а и Хл в во фракциях показала саше высокие значения'у легких чаотиц 0с50, Ос14д и Оо30^. (соответственно 5,3; 4,5 и 4,3) к 3,5 для тяжелых чаотиц.В любом типе

выделенных частиц количества Цд оказалиоь в ореднем в 39 раз выше, чем количества Ш(Э) и в 12 раз выше, чем количества ПЛ. Пигментные фонда оамых легких частиц - Ос^-^ и Оо30^, оказалиоь обогащены как ПП, так и Ш1(Э) и Пд в раочете на единицу Хл £+в.

При использовании резкого дерепада давления в качестве опо-ооба фрагментирования мембран хлороплаотов основные количества всех пигментов также концентрировались в осадках тяжелых частиц. Относительное содержание ПП оказалось самым высоким в наиболее легких частицах мембран хлороплаотов, содержащихся в Оо - в 9,4 раза выше, чем в исходной суспензии хлороплаотов и в 8,1 раза выше, чем а Оо-^. Такую же картину наблюдали и в отношении распределения относительных количеотв Пд и Ш(Э), Соотношения количеств Пд, Щ(Э) и ПП в различных фракциях оказалиоь практически одинаковыми и равнялись 38,0 для Пд/МП(Э) и 12,3 для Пд/ПП.

При обработке хлороплаотов 0,5% дигитонином значительно увеличился выход легких фрагментов мембран, не ооаздающихся при, уокорении 144 тыо. §. Однако соотношение количеотв Пд, Ш(Э) и ПП в конечных оупернатантах пооле высаливания 60$■и ЮС$-ым (мн4)2304 оставалось практически таким аз как и в походном материале и в осадках. Это свидетельствует о том, что в С и С' сосредоточены очень мелкие фрагменты мембран, а не свободные пигменты. Наиболее высоким относительным оодеряанием ПП, Цд и Ш(Э) к Хл а+в обладала фракция оамых легких чаотиц, не осавда-ющихоя при высаливании чао тип Ссульфатом аммония. Так, относительное содержание Ш в С и С* ^ превысило его относительное оодерхсание в ближайших к пим осада-сох - 0о6С^ и Ос100^, соответственно в 2,6 и в 2,0 раза, а в Оо^ - ооответотвенно в 11,5 и 22,0 раза.

Таким образом, исследование показало, что независимо от способов разборки хлороплаотов наиболее легкие и лабильные фрагменты фотосинтетичеоких мембран оказалиоь обогащены не только магниевыми предшественниками Хл, но и безметальным кптермедиатом цепи биооинтеза Хл - ПП. Обнаружение оцепленного оооредоточения • ПП, Ш(Э) и Пд в определенных участках мембран и обогащение ими одних и тех же оубмембраншх чаотиц, характеризующихся повышенным содержанием ЦБХ (Шлык, 1975), означает, что образование ПД так же происходит в центрах и, следовательно, все стадии формирования молекулы Хл, начиная, по .меньшей море, от ПП, осуществляв "

ютоя единым полифзрыенгшш комплексом.

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ТШЮШХ ПРЕДЩЮТВЕШШОВ ХЛОРОФИЛЛА.

Поскольку биосинтез Хл является сложным физиологическим процессом, осуществляемым интегрированной ферментативной системой, невозможно понять механизмы регуляции образования пигмента только на ооновании изучения отдельных стадий процесса или его элементарных звеньев. Создание концепции ЦВХ открыло возможности для анализа регуляторных явлений в процессе хлорофиллообразоза-нкя на урозне функционирования целостных надмолекулярных структур, осуществляющих весь процесс биосинтеза молекулы Хл, начиная от образования молекулы АПК. В этой связи какется ванным получение информации о механизмах, контролирующих накопление пигментов в оптимальных условиях функционирования ЦБХ, когда растения не иопытцваю!1 дефицита основного субстрата - АЛК. С этой целью наш осуществлено изучение активности одного из ферментов Ыо-участка пути биосинтеза Хл - З-едонозил- 1нй8тиошт:Мд-протопорфирин IX ыетклтраноферазы в листьях» какашишшощах кз экзогенной АЛК избыточные количества Пд и его предшественников.

В настоящее время развивается представление о существовании в растениях нескольких путей биосинтеза хлорофилловых пигментов, синтезирующих хшичзски гетерогекше молекула Хл, которые, по-видиыоыу, связали! с разными ппгкент-белкоБкж комплексами фото-оинтетичвекого аппарата а выполняют, таким образом, разные функции в фотосинтезе ( ЕеЬэ1а, 1982; Фрадкин и др., 1988). Предложенная Ребейзом и соазг. модель образования Хл, включающая в себя род функционально гетерогенных путей формирования этого пигмента, достаточно олеина к для ее обоснования, несомненно, потребуются значительные экспериментальные усилия. Работы по выяснению функциональной значимости химичэски различающихся видоз Хл в про-, цеосо фотосинтеза только начинаются к в этой связи особенно ванны исследования хидшческой'гетерогенности предшественников Хл.

Изучение активности 5-аленпз.ил- ^метионингМ.^продощг^вин. ТХ мстилтрансФерази в листьяэс шекиш. аоокшлиповавщих экзогенную АЛК. Изучение кинетики накопления предшественников Хл из экзогенной АЛК в этиолированных и зеленых листьях ячменя и пшеилда показало постепенную остановку в синтезе и накопление предельных уровней не только Пд (Шлык, Костгок, 1972), но и его предаествен-

жа - молекул МП(3) (Аверина, Шалыго, Шлык, 1985). Это указыва-■ на существование в растениях механизма, контролирующего оинтез пыточных количеств предшественников Хл, действие которого лока-:зовано на ступени более поздней чем синтез АЛК (Шлык, Коотюк, 172; Oarl s son., Sundqvlst, 1979). Природа этого механизма не ясна, вестно лишь, что в мутанте Chlanyflomonae г. Пд при определенных ловиях угнетает включение в ПЛ. ("/апд et al., 1977), высту-я, до-видимому, в роли ретроингибитора этого процесса (Caetel-'anco, Beale,1983). Чтобы понять причину остановки оинтеза пиг-нтов, изучали активность мембранносвязанного фермента S-адено-л-ь -метионин^д-протопорфирин IX метилтрансферазы, катализиру-ей образование МПЭ из МП и S-зденозид-Ъ -метионина в гомогена-х из этиолированных и затемненных зеленых листьев пшеницы, инку-руешх разное время в темноте на растворе 10 мМ АЛК и/или киш-на (50 мг/л). В специальном опыте было показано, что экзогенная К, добавленная в гомогенат, не ингибирует активность фермента в де инкубации препаратов с Ш1 и s-аденозил-Ь -метионином.

Шло обнаружено, что в процессе образования Пд и МПЭ из эк-генной АЛК активность метилтрансферазы снижается, так что ко змени завершения накопления пигментов активность фермента сос-зила лишь 15$ от активности метилтрансферазы в.контрольных листе этиолированных и 34% - зеленых растений. По-видимому, в ус-зиях избыточного накопления в листе МП(Э) и Пд из экзогенной { ограниченность мест овязывания порфиринов на структурном но-геле может приводить к инактивации ферментов, оинтезирующих даественншш Хл, например, в результате прекращения транопор-продуктов реакций от своих ферментов и, следовательно, прекра-шя дисооциации комплексов фермент-продукт, Ингибирование чао-шо очищенных препаратов метилтрансферазы оо стороны Пд, Хд и ) ранее было продемонстрировано Элсворсом (Ellsworth, Pierre, '6). При этом максимальное ингибирование наблюдалооь продуктом ггельности фермента - МПЭ.

Регуляция биосинтеза моно- и дивинильных предшественников в высших растениях. Обнаружение химической гетерогенности пу-г i молекул Хл и его предшественников в растениях (Belm^er, Re-La, 1980; Rebela, IS32; Rebeiz et ni. ,1984, 11-35) поставило рад рооов, касающихся регуляции их образования, структурно-функцио-.ьной связи разных биосинтетическнх путей и пигментных систем '

фотосинтетического аппарата и др. № остановились на изучении оебенностей образования MB- и ДВ-форм Пд и МПЭ у ряда однодольных и двудольных растений в норме и при обработке их AJIK, ДИ и светом - агентами, которые индуцируют в растениях накопление предшественников 2л de novo.

Количественная оценка химически гетерогенных подфондов Пд в этиолированных сеыдцолях огурцов показала разный характер накопле ния MB- и ДВ-Дц в ходе темнового развития растений, при инкубации семядолей на растворе экзогенной АЛК (рис.4), а также в ходе ре-синтеза Пд после кратковременного освещения и последующего затемнения семядолей (рис.5). Эти данные свидетельствуют о том, что об' разование МЗ- и ДВ-Дд в этиолированных семядолях огурцов осуществляется в разных типах ЦБХ, одни из которых синтезируют MB-, а другие - IB-производные молекул Пд.

Кинетические кривые накопления MB- и ДВ-Пд в ходе темнового развития этиолированных семядолей огурцов показывают ьрэкращение накопления ДВ-Пд к 5-6 дню развития, в то время как МВ-Пд активно синтезируется вплоть до 9-II дней. Снабжение семядолей разного возраста экзогенной АЛК приводит к дополнительному накоплении обоих типов Пд, однако с преобладанием пигмента ДВ-гипа. Причем при переходе от 3-х к 6-ти дневным семядолям содержание как эндогенного Пд, так и Пд, образованного из экзогенной АЛК, увеличи -лооь в одно-и то ае число раз - 3,6 раза для ДВ-Пд и в 1,8 раза для МВ-Пд. Это означает, что накопление Пд в растущей ткани связано о формированием новых ЦБХ.

Начальная скорость и предельный уровень накопления ДВ-Пд из экзогенной АЛК в этиолированных оемдцолях огурцов оказались выае, чем эти т характеристики для МВ-Пд (рис.4), тогда-как соотношения между начальными скоростями и предельными уровняли накопления для обоих типов молекул Пд, характеризующие форму кинетической кривой, оказалиоь практически-одинаковыми - соответственно 0,022 и 0,024 ч"1. Это означает, что наблюдаемые кинетические различия определяются разным количеством функционирующих, перерабатывающих экзогенную ЛЖ в Пд ЦБХ MB- и ДВ-типов. Максимальная ае активность единичных центров обоих типов в оптимальных условиях функционирования, когда нет ограничений в их онабжении АЛК, а тпкжо предельная емкость',' предназначенная для депонирования максимального количества образованных из экзогенной АЛК молекул Дц,

50 ч

Рис. 4. Изменение количеств МВ-Пд (3), ДВ-Пд (2), их суммы (I) и величины соотношений МВ-Пд и ДВ-Пд (4) в 5-дневных этиолированных семядолях огурцов, инкубированных на раот-воре 10 мМ АЛК.

о

одинакова в обоих типах центров.

Кинетические кривые накопления МВ- и ДВ-Пд в ходе их ресин-теза после освещения (рио.5) свидетельствуют о том, что после снятия светом ограничений с синтеза эндогенной АЛК, начальная ■ скорость образования ДВ-Пд, определяемая большим количеством функционирующих центров этого типа, намного превысила начальную окорооть ресинтеза МВ-Пд. Уровни ке, доотигаемые к 24 ч затемнения семядолей, оказались практически одинаковы для обеих форм Пд и близки к имевшимоя в семядолях до их освещения. Это означает, что за время освещения произошла преимущественная, как и в случае о экзогенной АЛК (рис.4), активация ЦЕХ ДВ-типа. Разная форма кинетических кривых ресинтеза МВ- и ДВ-Пд свидетельствует о том, что как образование АЛК, так и регуляция активности этого участка цепи биосинтеза Хл в ЦБХ т~ и ДВ-типов осуществляются независимо. Можно также предположить, что в раотениях существуют и независимые каналы поступления АЛК в разные типы ЦБХ.

В результате обработки этиолированных семядолей огурцов ДП, активирующим синтез молекул АЛК путем увеличения числа активных ЦБХ (Аверина, Яронская, Дудкина,1Э91), возрооло количество как МВ-, так и ДВ-Пд. МПЭ так же накапливался в виде МВ- и ДВ-произ-водных. Эти данные могут означать,что под действием хелатора произошла активация обоих типов ЦБХ, и свидетельствовать об одинаковых механизмах контроля ферментной активности системы синтеза АЛК в них со'стороны гема.

Исследование пигментного состава других однодольных этиолированных растений - фасоли, люпина, хлопчатника, бобоа, кабачков,

Рис.5.Изменение количеств МВ-11д (4), ДВ-Пд (3) и их суммы (2) в ходе ресинтеза пигментов после 2 мин освещения и последующего затемнения 5-дневных этиолированных семядолей огурцов. Кривая I имевшемуся до ос-

гороха показало, что в отличие от оешздолей огурцов, в таких объектах МВ-Пд преобладал не только в норме, но и после их инкубации на экзогенной МК. В некоторых зеленых растениях - лебеда, фаооль, обработанных экзогенной АПК, так ze образовывался преимущественно МВ-Цц. По-видамому, это означает, что в таких растениях соотношение мевду числом центров обоих типов другое, чем в случае семядолей огурдоз. Однако во возх изученных двудольных растениях, как и в случае с оошдоляак огурцов, относительный прирост образованного из экзогенной МК ДВ-Дц иоегда превышал относительный прирост АЛК-МВ-Пд при расчете величины прибили на исходный уровень каждого из них, кмеЕвшйся до помещения растений на раствор МК.

Отмеченным ваша особзкноотяы накопления MB- и ДВ-Пд из экзогенной МК, а также в ходе их ресинтеза наиболее полно соответс-вует модель, предполагающая изначальную разнокачественность ЦБХ MB- и ДЗ-типов, обусловленную меньшим количеством эндогенного Цц в единичном центре ДВ-типа.

У изученных нами однодольных этиолированных, либо затемненных зеленеющих или зеленых растений, в отличие от двудольных организмов, на всех стадиях онтогенеза обнаруживался только МВ-Дд и лишь при снабжении отрезков экзогенной АЛК в них накапливался в незначительных количествах и ДВ-Пд. Метаболические особенности поведения ДВ-Пд в этиолированных листьях злаков позволяют прзпо- .

10 14 • hi теьшота, ч

соответствует исходному уровню суммарного Пд, вещения семядолей..

ложить, что у злаков ДВ-Пд являетоя интермедиатом биооинтетичео-кого пути, в данном случае предшественником МВ-Пд. Последний, по-видимому, является единственным конечным продуктом темпового синтеза Хл в этих видах растений. Выделение из этиолированных- . лиотьев пшеница и частичная очистка 4-винил-редуктазы ( Richards, Vxmg, Kessler, 1987), которая характеризовалась высокой специфичностью к ДВ-МПЭ и ДВ-Пд, превращая их в MB-аналоги, поддерживает нашу точку зрения о том, что в однодольных этиолированных растениях, в отличие от двудольных организмов, реакция восстановления ДВ-Пд до МВ-Пд действительно имеет место. Таким образом, данные Ребейза и соавт. ( Hebels, Tripathy, 1986) о существовании в листьях ячменя биосинтетичеокого взаимодействия между ДВ- и MB-путями на стадии синтеза ПП и ШЭ дополняютоя данными о существовании подобной связи и на стадии образования Пд.

Свет, активируя в злаках звено синтеза АЛК, включает в работу все ЦБХ и образование ДВ-Пд как интермадиата в оложном потоке предшественников Хл становится отчетливо регистрируемым.

Таким образом, основным результатом проведенного исследования является обнаружение в двудольных организмах двух типов ЦБХ, синтезирующих химически-различающиеся MB- и ДВ-молекулы ШЭ и Пд. Образование АЛК и регуляция атого процесса в обоих типах ЦБХ происходит независимо. В изученных однодольных и двудольных растениях продемонстрирован различный характер метаболизма предшественников Хл.

. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Я ВЫВОДИ

1. Изучены низкотемпературные СФ и СВФ предшественников Хл -ПП и Ш(Э) в растениях. Эти спектры но зависят от температуры, проявляют батохромшй сдвиг и изменение соотношения интенсивное-тей полос в СВФ по сравнению со спектрами порфиринов в растворах. Дезагрегирующие воздействия но влияет на спектры Ш! и Ш(Э) в растениях. При добавлении сывороточного альбумина к раствора»,! ПП к МП(Э) их СФ и СВФ приблиааютоя к матпзшм. Сделан вывод, что молекулы ПП и 'Ж(Э) in vivo находятся в мономзрнш состоят» и особенности их спектров определяется взаимодействием пигментов

о белковыми и другими компонентами хлоропластных мембран.

2. В этиолированных и'зеленых листьях, накопивших'ПП и Ш(3), a Tarase в клетках пигментного мутанта Chlnnyilomonas г., содержащего ПП, отсутствует перенос энергии от каротиноядов к порфири- ,

нам, что, вероятно, обусловлено проотранотвенной разобщенностью этих пигментов. Отсутствие каротиноидов в непосредственной близости от порфиринов объясняет активное учаотиэ последних в сенсибилизации фотодеотрукционных процессов у раотений.

3. В этиолированных листьях, обработанных экзогенной АЖ и накопивших ПП, Ш(Э) и Цц, имеет место перенос энергии от Ш и МП(Э) к Цц. Обнаруженная миграция энергии свидетельствует о проотранотвенной близооти ПП, МП(Э) и Цц в мембране.

4. Предшественники Хл - ПП, МЩЭ) и Цд, образованные в за- . темненных зеленых листьях ячменя из экзогенной АЖ, связаны с фотооинтетическими мембранами и не о стабилизируются 0,5$ дигито-нином. При разных способах разборки хлороплаатов наиболее легкие и лабильные фрагменты мембран, содержащие преимущественно ЦЕХ, оказались обогащены и ПП, и Ш(Э), и Цц. Это означает, что образование молекулы Хл, начиная, по крайней мере, от Ш, осуществляется в ЦБХ единым полиферментным комплексом.

5. Активность фермента. М§-участка цепи хлорофиллообразова -шш - э-аденозил-х -метионишМд-протопорфирин IX метилтрансферазы в этиолированных и зеленых лиотьях пиеницы сникаетоя по мере накопления в них МПЭ и Цд из экзогенной АЖ. Предполагается, что в условиях избыточного накопления предшественников Хл, ограниченность меот связывания порфиринов на структурном нооигеле начинает определять скорооть процесса, приводя к инактивации образующих порфирит ферментов в результате прекращения диссоциации комплекса фермент-продукт.

6. Изучение химической гетерогенности предшественников Хл в двудольных растениях позволило обнаружить различный характер накопления подфондов МВ- и ДВ-Пд в ходе темнового развития этиолированных семядолей отурцов, в процеооэ реоинтеза Цц в поотэтиоли-рованных семядолях, а также при накоплении МВ- и ДВ-Пд из экзогенной АЛК или в присутствии ДП. Сделан вывод, что в изученных двудольных раотениях существуют, по крайней мере, два типа ЦБХ, • одни из которых синтезируют МВ-, а другие - ДВ-МПЭ и Цц. Как образование АЛК, так и регуляция активности этого участка цепи биосинтеза Хл в ЦБХ МВ- и ДВ-типов осуществляются независимо. Предложена модель, согласно которой ЦБХ ДВ-типа содержат меньшее количество эндогенного Пд,' чем центры РЛВ-тина, тогда как максимальная активность ЦБХ обоих типов в условиях избытка АЛК, предельная

емкость центров, предназначенная для депонирования максимального количества образованных из экзогенной АЛК молекул Пд, а также механизмы контроля ферментной активности оистеш синтеза АЛК со стороны гема в цвнтрах разного типа одинаковы.

У изученных однодольных организмов, в частности, у злаков, в условиях этиоляции или при затемнении зеленеющих и зеленых растений обнаруживается только МВ-Пд. В условиях затемнения ДВ-Пд появляется лишь при снабжении растений экзогенной АЛК. Поведение ДВ-Пд соответствует поведению интермедиата - естественного предшественника МВ-Пд в биосинтезе. Свет, активируя звено синтеза эндогенной АЛК, включает в работу все ЦЕХ и образование ДВ-Бд также начинает отчетливо регистрироваться.

' СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Г. Аверина Н.Г., Рассадина В.В., Шалыго Н.В. Спектрофлуори-метрический метод определения протолорфирина IX в лиотьях, обработанных 5-ашнолевулиновой кислотой.// Весц1 АН БССР, сер.б1ял.' навук.-1984.-й 4.-С.102 -105.

2. Аверина Н.Г., Рассадина В.В., Шалыго Н.В., Шлак А.А. Определение протопорфиряна IX в листьях методом дифференциальной спектрофлуориметрии.// 1У Всесоюзн. конференция по химии и применению лорфиринов; - Иваново, 1984,-С.97.

3. Рассадина В.В., Шалиго Н.В., Яронская Е.Б., Аверина Н.Г. Порфиринм цепи биосинтеза хлорофилла: локализация, метабо.изм, фотогербицидное действие.// 1У Всесоюзн. конференция "Биология клетки"- Тбилиси, 1985.-С.616-618.

4. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В., Яронская Е.Б., Рассадина В.В. Изучение активности s-аденозкд-ь -метионишмагний-протопорфирин IX метилтрансферазы в зеленых и этиолированных листьях пшеницу. // "Молекулярные механизма регуляции метаболических процессов" Сб. кратких научных сообщений биохимиков Белоруссии, Литвы, Эстонии,- Минск, 1987.-С.256.

5. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В., Яронская Е.Б., Рассадина В,В. и др. Исследование гербицидов фотодинамического действия.// Тез. Всесоюзн.'совещания по пестицидам. ДСП.-Черноголовка, 1388.-

С.134-135. '

6. Аверина Н.Г., Рассадина В.В. Спектрофлуориметричеокоа исследование протопорфирина IX и ГЛд-протопорфирина Щмонометяло-

вого эфира) в растениях.// У Всесоюзн. конференция по координационной и физической химии порфиринов.- Иваново, 1988.-С. Ц7.

7. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В., Яронская Е.Б., Рассадина В.В. Фотодинамические гербицида - индукторы накопления порфиринов, сенсибилизирующих фотоповреждение растительных клеток.// У Всесоюзн. конференция по координационной и физической химии порфиринов.- Иваново, 1988.-С. 118.

8. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В., Яронская Е.Б., Рассадина В.В. Фотодинамический эффект и накопление порфиринов в растениях, обработанных 5-аминоловулиновой кислотой и 2,2-дипиридалом.// Физиология растений.-1988.-Т.35, вып.4.-С.679-686.

9. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В'., Яронская Е.Б., Рассадина В.В. Особенности накопления порфиринов в однодольных и двудольных растениях, обработанных 5-ашнолевулиновой киолотой и 2,2-диш-ридилом.//Веоц1 АН БССР, сер. <51ял. HaByK,-I989.-JS I.--C. 100-102.

10. Рассадина В.В., Аверина Н.Г., Фрадкин Л.И. Перенос энергии в растениях между порфиринаш - предшественниками хлорофилла. // Всесоюзн. совещание по молекулярной люминесценции.- Караганда, 1989.-С.66.

11. Аверина Н.Г., Рассадина В.В., Шлык А.А. Локализация про-топорфирина IX в мембранах хлоропластоз зеленых листьев ячменя, ассимилировавших экзогенную 5-ашнолевулиновую кислоту.// Известия АН СССР, биологическая серия.-1990.-i¿ 2.-С.282-287.

12. Раосадина В.В., Аверина Н.Г., Фрадкин Л.Я. Отсутствие переноса энергии от каротиноидов к порфиринам в растениях.// Докл. ЛИ БССР,-1990.-Т.34, № 6.-С.567-569.

13. Рассадина В.В., Аверина Н.Г., Фрадкин Л.Я. Спектрофлусрк-метрическое исследование состояния протопорфирина IX, катний-про-топорфирина IX и его монометилового эфира в растениях. // S. прикладной опектроскопии.-1990.-Т. 53, й I.-С.62-67.

14. Расоадина.В.В., Сенкевич Г.С. Регуляция синтеза моно- и дивинильных производных протохлорофиллида в высших растениях на свету и в темноте.// 1У Всесоюзн.' конференция молодых ученых по физийлогии растительной клетки.-М., 1990.-С.42.

15. Рассадина В.В. Накопление моно- и дивинилышх производных протохлорофиллида в этиолированных семядолях огурцов из экзогенной 5-ашнолевулинрйой кислоты.// 1У городская конференция мол одах ученых.-Минск, 1990.-С.26.

16. Аверина Н.Г., Рассадина В.В. Химическая неоднородность протохлорофиллида в эткг лрсванных семядолях огурцов.// I международная конференция "Фотосинтез и фотобиотехнология"- Пущино,' I99I.-C.95.

17. Аверина Н.Г., Яронокая Е.Б., Шалыго Н.В., Рассадина В.В. Изменение активности s-аденозил- Ь-метионишмагний-протопорфи-рин IX метилтрансферазы в листьях пшенииц, ассимилировавших экзогенную 5-аминолевулиновую кислоту.// Докл. АН HJCP.-I99I.-

Т.35, .№ 10.-С.S39-941.

18. Рассадина В.В., Фрадкин Л.И., Аверина Н.Г. Перенос энергии от протолорфирина IX к прогохлорофиллиду в растениях.// Докл. АН ECCP.-I992.-T.36, й I.-С.76-80.

19. Аверина К.Г., Рассадина В.В., Сенкевич Г.С. Регуляция биосинтеза моно- и дивинильных предшественников хлорофилла в двудольных растениях.// Физиология1растений.-1992,-в печати.

20. Расоадина В.В., Аверина Н.Г., Сенкевич Г.С. Образова- . ние моно- и дивинильных производных монометилового эфира магний-протопорфирина IX и протохлорофиллида в однодольных растениях.// Физиология растений,-1992,- в печати.