Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт и метаболизм монокарбоновых кислот у экстремально галофильных архебактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Транспорт и метаболизм монокарбоновых кислот у экстремально галофильных архебактерий"

*1 '0 ^ ^

1 к •

?схийс;сая ашшя нлуіі

■ ..ІНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.841.5

Кевйркна Марина Влакяюфовяа

Транспорт к метаболизм монскарбсноЕгх :гясгот у экстремально галофильянл гфхебахтери»

Специслы:сг:ть 03.00.07. - к.’:кго<ї;:алсгия

Автореферат їкссертзайя на соасхангэ уч*ноа степени с.: .-í ли лата <Зколсгп,!<’сг.г.2: чаук

Москві - 19:’,?

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты : доктор биологических наук Ивановский Р.Н.

заседании специализированного совета Д.002.64.01. в Инстит микробиологии РАН по адресу : ІІ73І2, г. Москва, Проспект 60-лет Октября, д'. 7, корпус

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт микробиологии РАН. ^

Плакунов Б. К.

доктор биологических наук Никитин Д. И.

Ведущая организация : кафедра биологии почв факультета почвоведения МГУ, Москва.

Автореферат разослан

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, к. б. н. С/‘

Л.Е.Никитин

тч>* f i'* ,'р v; ■ (

л л ' ч',: . '

jjHüiiiiu i'iíKA

' I.

Актуальность темы. Экстремально галофильные архебактерии 1редставляют собой уникальную группу микроорганизмов, обитавшую в ,'слсвиях высокой солености среды. Эти микроорганизмы обладает рядом

гсобеностей.отличашшх их от других микроорганизмов. Приспособленность Зелков функционировать только в високосолевых условиях, протекание 1роцессов транспорта органических веществ в клетки галобактерий в основном за счет градиента ионов Na+ и электрического потенциала эбу сдавливают особенности биохимических и транспортных процессов в «летках галобактерий.

Наличие е клетках экстремальных галофилов пурпурных мебран. основным белковым компонентом которых являетег. бактериородопсин, тозволяет этим микроорганизмам осуцествлять энергизацию многих про-1ессов за счет использования энергии света. Этот уникальный механизм запасания энергии существует в клетк&х галобактерий наряду с другими известными для эубактерий энергетическими механизмами. Изучение Лгоэнергетики экстремальных галофилов и их транспортных процессов тризело: к- углубление хемиосмстической теории и представлений о ■шханизках.поддержания ионного гомеостаза клетки. .

Однако... несмотря на изучение отдельных проблем, связанных с Зиологкей экстремальных галофитоь, многие особенности их физиологии * Зиохинии остались вне поля зрения исследователе;!.

Все экстремальные • галофилы хорошо растут ка средах, богатых мшкжйслоташ. Только некоторые ¡¡¡тамга! способны утилизировать сахара :ак основной источпак углерода и энергии. О потреблен»??: otkwc 'отсрсэрг&вкзц&’я ертлпс органических Ев”эстг, таюгх хгк ¿г.:;арбокогы? тнслоти. стало ягзестно лг::ь в последнее- эромв. . А дакг.ие зг, зотрэблзяию »»нокарбоксэых кислот яо экхедклп за раж:! отаялартяж 5;{ох:яс?ческих тостог.. 7рзчспортные' а 1.'ета<5сл;1’!г>с’:из процесс:! тая re 5-улг! изучены i>. эс::ээясн только длл акяяскгслст. ' углето.гог. аккарбоновго; кислот. Транспорт к мэтаболгэм конокарбозозга ¿’»ело? у этой группы ¡.'иксос'гглг.г^моз чг- отучался. Отсутствие »тих сгелэгл:.! ::е зозгол-'этг пра?иль'ю сцгяи'Ь» •*гк?н6.тогйч,сск«с;" осоЗэнноетя, трэР-теск/* :зяэя и эхояопгозечоэ гпаченке к&тзого гида. ' . .

Цель работы. В свягг. с актузлънсстто тега приставляло ««лесообразчьм изучать гот|/.о:-;чссть утилизации гококербеновых :."':слот рагшгтжк видан;! сс-и. Halobacteriacoca. , : ••

Пр'5 ксследова:«.:! грзпепорта кэнокарбсяовкх кислот приставляют

следуй гсг.рссы • спзшфшсмь' транспортных систем, гг

кинетические ' параметры, способы сопряжения с энергией, возможны! спосообы регулции биосинтеза транспортных систем.

Актуальной проблемой физиологии и биохимии изучаемы: микроорганизмов является выяснение возможности нсдользоваии; гонокарбоновых кислот в качестве основного источника углерода и изучение начальных этапов метаболизма этих субстратов.

Изучение этих аспектов позволяет глубже понять физиологию экстремально галофильных бактерий и их место в трофических связя внутри галофильного сообщества микроорганизмов.

Научная новизна. В клетках экстремальных галофилов обнаружен активны транспорт ряда монокарбоновых кислот, исследованы его основни характеристики : субстратная специфичность, кинетические параметры способ сопряжения с энергией. .

Показано физиологическое значение такой ионокарбоновой кислоты, как ацетат. Клетки галоалкалофильного штаммма На1гопососсиз оссиПи ЗА способны расти на средах с ацетатом, используя его как основно источник углероода и энергии. При этом ацетат вызывает иидукци транспортных механизмов и ферментов собственного метаболизма. Пр росте на среде с ацетатом культура Иа1гопососсив оссиПиз ЗА ыатаболизирует его через цикл, трикарбоновых кислот и глиоксилатны цикл, накапливая в клетках поли-/Э-оксимасляную кислоту.

Полученные данные даст основание считать, что ацетат являете естественным пищевым субстратом и возможность использования его в качестве основного источника углерода и энергии определяет мест экстремально галофильных бактерий в обеспечении и функционировав» одного из звеньев аэробного галофильного сообщества.

' Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют нал представления о разнообразии и экологическом значеш архебактериальной микрофлоры в природе. Галоалкалофильный ста! Иа1готюсоссиз оссиИиз ЗА может быть использован для разработ» микробиологических основ получения ряда биологически активнь веществ, например, поли-/3-оксимасляной кислоты.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ВсесоюзI конференции "Регуляция микробного метаболизма"СПуилно,1989),Всесоюз! симпозиуме "Биодинамика почв"СТаллин,1988), Всесоюзном совещании ”Э! логия популяций" (Новосибирск, 1988), 5-м Европейском конгрессе биотехнологии (Копенгаген, 1990). '

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в. 4 тезна одна статья сдана в печать,

Збъем и структура диссертации. Диссертация изложена ка 105 страницах машинописного текста и состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Заключение", "Экспериментальная часть"(вклвчарщего главы "03-ьекты и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение результатов"), "Выводы" и "Список литературы'Ч 185 наименований ). Диссертация проиллюстрирована 19 рисунками и содержит 6 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Збьекты и методы исследования. Культуры Halcbactenvn satinarme шт. [231.995,337,Haloarcula val lisiartis 1393,Haloferax mediterrani 1533. ■'aloferax volcanii IS39, Halococcvs rwrhuae 1235,Halobacterina saccha-rovonm 1537 получены из В KM ИБ4М РАН, Halobactsrim. salinariim Rj no-пучэла из коллекции кафедры микробиологии ІКГУ.НаїоЬссІегіїт dislribu-tus m.Halobacterim disrtibutus 13.Halobactorium distributus 4П.Halo-bacterim. distributus 32,Halococcvs tvurkmsnicus AK.Nalronococcus oc-zultus 3t\,Nalronobacleriun pharaonis 12, г: да лены к описаны Звягинцевой с соавторами [Звягинцева,Тарасов, 1987].

Культуры неатро^-ильши итт-.;ов галсфілов зыргцивали на среде R І. ;одертацеЯ С г/л): КаСІ - 250; КС! - 2; íígSO^'THgO - 20; Ка-лимоннокисла? трзхззмецеиный - 3: пептон - 10; дро^евой экстракте ДЭЗ-1; pH 7,2;на •! 2.модифицированной среде ІЯ без пептона,содержащей 5 г/л каза-'¿іиовнх кислот(КА). Лл{сало$ильныэ штаммы выращивали на среде fá 3, со-аяргакей Сг/л): líaCl - 250;КС1 - 2;MgS04'7H20 - І; На2С03. - 10; КаНС03

- 10; Ка-лимогаюкпслуйІ трехзгг'еиенный - 3; ДЭ - 2,5; КА - 5; pH 9,5. Культуру Hatrcnococci'S occulius ЗА вурымвали также на среде IS 4. ':од:;$ицированксй среде И 3. содержащей вкосто КА 5 r/л ацетат NaC0,5- 2 г/л), илч пропионат Na (I г/л),- бутират Na CI г/л), ацетанид С2 г/л); :одерсан;;о ДЭ варькропали от 0.05 до 2.5 г/л к добавляли СІ СО.З г/л): на среде В 5,гюдиф'.щфоганпей среде й З.содергаиеД илзсто ДЭ раст-гор зата.спюз по Волшу [Wolín et а1,ІЄЗЗ];ка среде » 3, модк|«цирован-;»оа среде ¡i З.содзрхацей вместо ICA п ,53 I г/л ацетата На и яжроэле-Ü3HTK в «Г/Л - СаС12'2К20 - 0,7; CuSO^E^O - 0,05; PeS04' íf^O - 2,3-а!2Р04 - 150; iinS04'H20'- 0,3; ZnS04‘7Н20 - 0, 44; pH 9,5.

Культивирование проводили в колбах ка 250 ил с 50 мл среды качалке при температуре 37-40°С з течение трех суток.

Для исследования транспортных процессов клетки галобактерий овали два раза центрифугированием при 5000 ц и суспендировали в О, Трис-HCl СрН 7,2),в который предварительно энссили минеральньл' среды Я I,- для нейтро^ильных штаммов, или в содовом буфере (pH

t.V.: о-р'д-ацс.г: (у. л) : !(аСЗ - й’.ч), КС! - Г', 1/.yS.'J *'7':iyj -■ i, iu.(C0„ -IС. "ahCO-j '■ 10,- дл„ ;_,^лочо/[¿юл^п, м;лло... Cyan Л1ЛПЛ : «iO'

¡.изьод.ьчч /.о елтичссксг. '.л^л.с.’-л 1,0 , что солгаи.гсч 100 - i и.,1 Б^^орлалалув с-'о:иьз’.ы ос г;-оч 0,20 - О. ?'5 шт ncc-ic

• .и-тглтг с :.;=.-40iia:.i с„'¿отглто!.' Ф»ль'?ровг.;г.! с а г- л'о:л.!.;:Л 1 <ш,т{

"Си.шир" :< 6 С ЧССР, .г. а:. лат 0,4 vjcvJ ¡: ирс. .игал: ла? vt: - >.г Ъ,Ъ ; JtaO'l. Ло^i_er;-i:о ¿ильтрп г:с:.л.-i: лолл:: ллелллл^ (._..а;сс:ш; аллльалп b ;.ui сцнктллллл-'^ллаЯ :,.лл ос-г,; /.,0-Юо л л.:паца,,.К;;

; ¡'оагплвнссть клатол ^¡ллсллло.., ллллплллллочлоь! сллтчш-..

’ ;\o:kD?ta 12J9" CTir.i..a ;-лллал': pap аь.ллгя с/Зстр

ллссчитиаалк ка;: ovbct: лш:е алутрлллагс-алл; ..¿¡¡иситрлцш' ;

/алаеатращл! I- среде, праншлл СЙ1'С:.. i ayTpiuca^ .iyvo-l ид-г у ла:; Л .•:\ч/1л1 булхл irUcDoor.ld, / I, 197лР.

Ллл млул¡.‘¡и'.!! ьллилл'лч. ллслгл л процессе л'лаолал;

:'‘:г::ш>г;с>за;.л ■‘лтрлгла.- ол.,-: гллл^лл! ллслот л - 'Л:ла.пл\-!1/‘л ] D-rpa :ли:Л ¡!лл;л.'гл'. лай'пт -л , aaccs'an: :: ,л<лу: лллалл;,;. о:, к’’ ^О-к.,слагал. i;r>i ллуч.лли гллллглл лроллалл'Д лслллл^<г

''С-ацетат-. лсаплалат ¡.лалллл л лльисчтр. лил:,; с. I да J0

Лог.’о^ори' : а.лпа; ацил. ‘о: :-нслл. ара;слюаарл:..; pa;/аллталл л^Г ларолннлллан;л;-:,1-:;ллул лш;лги,;,:>.:лсл: - аиссллл л уопи;эш;у:; ot,v.v; л ло.чцелтраллш I' I0~’°U.

йншгкпегк:.!.' парапатрп .'.Дрс-Аллялл iijicv. л^.л-р^лнл а~ Л .л; г.лоролтл у^шюпоота -с. u-тата It- ь диапаэо;:? концентрymt. II,i;

- 200 мкН пр--1 37°.оиалла'.л К . л V,,.л их cc&'Jky расчлшаалл aiaiaia

t лШКч*

¿¿аллгалкол рлгреслл:-. па лпа.аау Hu>iCH& с корр-,сц::с-8 ЕОлх-рт, Ог.ерат. 1а531.реаллзсаанаоЛ на ¡г.*!л! Ы! PC/AT Глигслгйг- В. н.\ .:з>!ла Q-jjci Bail с и по латоду Ллйну:глс.,.л-Блрка ,[ Леникллер, 1386]. Дпя олрлг.ело,лл‘ К1!Нотичас:а’х паракетроь г.оглси.гзник i I-'1‘‘С] -ацэтата ¡{а в прлеутоть, пглпислат;- лослл^лчП доозблслл а 2и-кргл1кс..* '.олярпс;.! нлОлп-:^ стлло! ■¡ильно ацетата.

. 0 1'.ОЛ;!ЧЛСТЬ;‘ Л^рГаоБаННОГО |.ЙЧО}:ОГС СОк оудПЛЛ ПО роЗЛ'КТЯ соле; '-:анлл метл!! ь клеточной суспьнаиы э мл;-.лих лл-^акня с среду,не core; ллую Hf>«**j40Horo .-.цетата, ^'С-ли^тата и послэ U, чассл кульп^ированш Слра'делэал« салка прюгч^дилл ло о,л>лс/л с Кугаси сиии;.! I Нател;

'йи>Д бактериологии, 1984 ].

ОПРОДСЛС'НПЛ ЛОЛЛ-Э-О^СМУЛСЛЯНСН КИСЛОТЫ ПГО'гОДЛЛЛ ]

году, предложенное Ераукагом с л:,л:,т. [Бгамгепт tl al,JS72]

лонцтатраща лц-ататл л ¡сультур-^льной ;:кд;<остч л г слолл

cwouvax питате.;;ьнол среды елрелалллл лотсдси газоллдлаат;'

• ограф'И па лроматегра^о Chroa - 4 С Ч0С? j . Последовал ■■! сораьа

полученные отгонкой с водлнчм паром из подкисленной до pH 1,0 культуральной жидкости с последующим упариванием в селсчшг/. условия:: ССролоз-Багр^ев, Агабальяна.19513 и 0.5%-1:ых подкисЛ“н:;чх водных растворах ДЭ, КА и пептона.

Для анализа продуктов нэтаболизма С-ацетата ' клетки поело контакта с мечены?! ацс-татсм отделяли на мембранных фильтрах л понепалк б ккслкЯ этанол, дзлеэ наличие ко'.*лонетов никла трикарйопо-?>гл кислот определяли методом восходящей йумажксП- хроматографии зта-нольны; ткстрактсв клеток в систем“ растпоритежА : н-бутанол-мурав^--ппая киолота-ьодаС Ю: 2: 5). Хрсчатограмму проявляли 0,05/;-ннм спиртовчн раствором г.'ро;,ф?нолог,01'о синего СХаПс, Kai’pr:, 19523. Налкчпг аминокислот определяли îttcscm рссхсдязей dynasHOi- хроматографии зтгяольных экстрактов клеток на анисксЛмен::оЛ бумаге"Эктеола"в 0,2%-ном водном растворе уксусной кислоты. Хрматограм;лу проявляли 0,57»-нки спиртовым раствором нчнгидрчча [Плакучсв.Волкова. I9QI3.0 нг.лччии хлслот судили по ссападетш пиков ралиоактивкостп с iA-.5criî*4 расположения числот -свидетелей на хроматограмме.

Определение ¿шизиостн веег £эрмоитов проводили при 37 0 С в :слй-70Ч.ЧСМ пкстр. г:тг,получ’нкон после обработки ультразвуком и далькеКк-?-го цечтри.^угпровалия. Активность кооцчтр-'тличз!.: \гР ‘. 1.3.1)определял!' по методу. описанному "ак-Фад.'еном Хоуэсом [KcFadden,Ho\-.?s,IP313 з *лодя|икаш:и КрасильникорсЯ С Красильпичокз, ГЯ703. Античность ацетпл-Коч-сиктетаси С НФ G.2.I.2 ') апреле : -лк по методу, описачнс’7 Дгокесом и Лчпмчном [ Jones ,:,1стлпп, 191353 . Агтиэност.з ?чггаткиназч С И* 2.7. 2Л ) (.лределпли по методу, описанному Fooe I ~os&, 19553. Лктпгчость фосфат-ац.этилтранс^’гагы ( Hî> 2.3.1.S )определяли по методу,списание^' '^тад-ïierc** fSUdlnan.ISSSJ и методу,еппоачночу г'лотчьм i ,УЗ otzscii, I339j.

? качестве 6y.i-jpa использовал:: 0,2 V Сил ч ПО Гркс-HCi С pH 3,7 или ?,25;, сг^рги^йй ■? ?! KCi. .

Зтамк галотолерантней бактерии зыдетял:? п" солевой корки СО - 0,5 гг О сухого содового солончака Араратской "е.тлтч! вблизи Зрчонаунг. Вк-\3.~w? проводили на ..реде 3, содержав-ï Jfv. f.'.-.Cl. Л;.ч ¡'¿октн^п.соцни культур!' проссдит»! изучение ее мер-ологии. потребности ч iJaCl, температуру роста, кислотность осе.:;;, спэсойясст;. расти z !'У.-'.;.сгэрс^/л^ньл усколиях. обр^оочаниг лигмг-кта, рссста:;чзл":ч:е н;:трз.с:: ? кн-сиг:» пдролкэ крахмала, казеина и rx-латлнз, кал.пие тироз«кг<ггой и ла:ч1;; Чг.гноП ''чгизнсотн. использование глскози, саилрозч, челлоз:.!, цитр-*?, пропионата и фгнила.танииа [Beroeys чапиа!, I9L'l ; г'зтодг по”вепно*... I35Q; ''етсди с;^.5': ¿а.^терислогии, I9Î1.

ß.

Результаты и их обсувдениз.

Транспорт монокасбоновых кислот у. экстремальных галофклов.

Среди изученных монскарбновьы кислот (таких как ацетат, иропионат, бутират, гликолевая кислота, пируват. лактат, формиат) практически все С кроме формиата) позлащались всеми изучаемыми штаммами галобактерий, обнаруживая условную степень концентрирования в клетках в 15 - 126 раз Стабл.1). Концентрирование радиоактивной метки в клетках галобактерий означает либо наличие активного транспорта, в чистом виде, либо параллельное протекание метаболических превращений поглощенной кислоты. В дальнейшем бшю показано.что последнее действительно имеет место.Эти результаты свидетельствует о возможности использования этих веществ как пищевых субстратов. .

Пируват поглощался с наименьшей з ффектиаиостьс по сравнении с другими органическими кислотами (табл.1). Наивысшаа степень концентрирования этого субстрата была 15-кратной у tib.mediterra.ni 1Ь38. Значительное концентрорование гликолевой кислоты обнаружено .у Hb.saccharovorm. 1537, Hb.volcanii 1539 и штаммов вида Hb.distribulus С до 62 раз). Лактат поглощался всеми штаммами галобактерий. обнаруживая концентрирование у разных штаммов от 15 до 61 раз. Ацетат, пропионат и бутират поглощались практически всеми штаммами галобактерий. При этом выявилась явная корреляция между поглощением этих кислот : те штаммы, которые активно поглощали ацетат, также хорошо поглодала пропионат и бутират. .

При изучении. действия всего подбора кислот на поглощение каждой конкретной кислоты было обнаоугено, что ацетат, пропионат и бутират оказывает ьзашгное ингибиторное влияние в процессе поглощения, являясь либо конкурентами, либо ингибиторами .Это дает возможность предположить наличие общих систем транспорта для этих кислот. У остальных кислот <. пируват, лактат, гликолевая кислота) такого эффекта обнаружено не было, что -свидетальствует о существовании независимых узкоспецифичных транспортных систем этих кислот.Предпояо-ение о наличии общих транспортных систем ацетата,пропионата.бутирата ажется вполне оправданным,тем более,что в литературе встречаются ¡едения об общих механизмах транспорта жирных кислот. Так, например, E.coli, Corynebacterium glutamicum. Salmonella typhimirivm., '.ocapsa roseopersicina ацетат и пропионат проникают в клетку по ей транспортной системе [Kay, 1972; Ebbighausen et al. 1990; ghausen et al. I9SI; Fernandez-Briera, Garrido-Pertierra, 1988;

Тг,<5л:їцй Î. Лккугтулгшіл дочзпкх г»кокар<Зоноаік кислот D клотга» галобактэрлй.

Вил Ствпзкь кягсцеитргромяия &»чзшк хг.слсг

Ааэтат Проппопат Буткрат Г.таю*лт Пярутт Дмстат

ialcbc.c 1er ііга lialobim Rj 'ib. halobim 933 Hb.cutiruùrm S37 fíb. salinnriun I23I Hb. sàccharovorvm 1537 ¡ft.distributus Itî Hb.distribuios ІЗ Hb. distributes ífl Kb.distribuios 22 Halo forex ■

*i?di ter rani 1529 Hf.valccnii 1533 Halocrcula •

vat 11sr*ortis I3S3 Halococс us rarrhuaa 1235 He. turkeenicus 4fC Ha tronococcus occultus ЗА Hartoncbcc teriun pharaonis 12

5.7 В.Э <31 ,0

1.2 3.1 17.0

5.3 10.5 31.0

13.0 10.9 47.7

25.G S.O 31.0

33,7 13.5 23.0

5-5.5 27.3 109.3

30.5 II.Í G5.0

ZZA 25.7 123,0

1.7 r.o I0.G

2S.0 15.0 23.0

10.8 H. 8 33.0

4.0 4.0 14.0

33.3 30.8 47.0

22.8 Î6.2 16.4

14.5 І 6.7 8.2

2.0 I.O 30,0

3.2 1.0 15.5

1.5 1.0 K,G

1.9 1.0 10,0

62,2 13.0 53,5

54.3 II.0 31,0

23.0 12.0 55,0

23.3 . 6.4 ê?A

IS.4 6.5 48.0

7,G ' 15.2 17,7

39.7 11,2 45,0

3.7 1.0 24.0

2.0 «.5 15,0

8,5 10,4 35.4

23.а 9.4 40,0

4,5 3.« 19.0

1Цюаноь и ср.. Í9S2 ]. Плачеи явление ««о^-гстэсгмоста транспортешз систем не является свойством только эубактерня, у эхстреиальнш галофилоп показано существование нескольких сбаях тракспортнш; спот ей для некоторых аминокислот, сахароз г. дикарбоно-вых кислот IMicDonald et al, 1977, Пиьаиоэ « др., I98S6; Звягинцева -и др.. 1934).

При ьичснениа энергетических характеристик транспорта ацетата, пропионата, бутирата использовали протонофорньгл разобантель 1ХТ, ио1:оф.'ры валиношиин и конеиони . Иогаю предполагать. что поглощение этих кислот не зависит от электрического -гх^ракнага потенциала Ду, так как валиноашии не влиял не. поглощение ли одной 4л Tpt)Л изучаемых кислот. Элиминирование ДрН. путей добавления в инкубационную спесь К*Г, и ДрЛа. путем добавления ыоненснна. ингибировало поглощение кислот. Причем у иейтрофильных штаымов зависимость от ДрН сильнее, чем от ApNa (ингибирование КФГ на 60-93'/., а ыоненскнои - на 42-83%). У щелочелсбивого штамма Не. осcuUilS ЗА обнаруаена обратная картина - зависимость от ДрМа сильнее, чем от ДрН (ингибирование КФГ на 20-44%, а ыоненсином - на 87-92%). Полученные результаты вполне, закономерны,т.к. в условиях роста неатрофильных итакиов (pH 7.2) теоретически для энергизации транспортных процессов .«овет использоваться как ДрН, так и ДрМа, причем первичная роль ДрН.вполне вероятна, так как ДрМа монет возникать вторично за счет аитипорта Н*-'Нат.Б щелочных условиях (pH 9.5) при обратном градиенте протоков кеиду клеткой л средой микроорганизм вынуядеи искать другие способу энерг-изаиии транспортных процессов, например, прямое формирование Apila. Как показано ранее.транспорт дикарбенових кислот такае не зависит от Ьу в зависит от ¿pNa,(Звягинцева и др. ,19861. Одна) о, болоо вдрагенная завнсихгост-ь от ДрН и отсутствие эавиониог'.ти от Д^ отличает транспорт шнокарбоно-süií ккслот от транспорта г. лнокислот и сахаров, кото.рыа зависит от Äw и ДрНа, по не зависит от ДрН [RicDonald <ot al. 1377; Паиэ!.г.а ц

др., IS88al. Зависимость транспорта с&инскисдот. сахароз, да-' <л ьшокарбоиопих кислот от ¿pila -.вполне здкоисдернг> , та;: не.::

экстремальные гало^или обятаот в сродо с 25% ЛаС1, а различив

отношения транспортных с::стеи а*гаиэ;:асАог ". сахарог. - с e.íiiCj

стороаы, я карбоновых (ííoho- •« au-З ;с:сдст - с другое сторожа, х L.;. ссадетельствуот о различиях -и '^уккаиоисфовгиии траьсооргиии с детей разниа классов оргаиическггг ix-цссть. 2 рдда случаи Д--шголнзть пэ - иорготичеснуя, * часто pcry¿rrcvi:¡yr. ро;;ь.

f.¡ih юучзиис narao?.cKí;í¡ «аиэтьтв иг^золъакй rinepcc ир^йотрз.«;ст

codc.l селочелс0иг«1 этап f'c.ozcullvc ЗА. Эта куль-ура nptrjyrx'";г тлппгзчгс что сч5:гггот («»ломтя: условия.;: С р!I 9.5)„ '’v:î содгрг::

25". ::ороа:о растет п~ среде с ацетатом. Пр;* 9.5 уксуснз."

ггзсдотя почти полностью л!гос-оияирует о образована?!» ааетат-аипсяог (то.тйчо 0.001% ?юл.*кул находятся з неаиссоциирсзаннон состоит«). Эго ксзголпэт предполагать, что з к?:к5рчн? Hc.cccultus ЗА .поляк*. сут’.естсо,'атъ тракстртпг-л снстэгл для протг.'.йовэнкя анпоноп

пцотата. так г.г.х заряген!г.:э частица к? иогут с закгтноГ: скоростм язссгзио гш^-Ьч’Диромть через яппядкмЗ слой мембраны. Это стлмчаст изучаемую культуру Кс. cccuiius ЗД от культура E.coh. у которой, по литературно данн1гл. тргнслорг.'.ая сютемэ ацетата к проппопзпг представляет собой р.гркг;гг облегченчоя диффузии, а з услозида. когда молекула :г:р:;оП ::;;слоты (до С^) находится а среде а недиссоциирозаннои г.лде. î^r.rr !;дат1> место и пассивная диффузия tKay. !9?2; Saianitro. Нэдепег, 197П.

У ft.ccctiliî 15 Э.А при росте на среде со следовыми количествам ацетата (кстори*а вкосится з сроду з составе дрожзевого экстракта) функционирует две тракспортнкэ системы со значениям К^( равные 32 ♦ 10 кхИ и К~ рзйнитл 16? t 50 :-c'i (табл.2).

Дополнительное доказательство того, что систем транспорта лес, а ка одна, дают результаты янгибирсааалл поглощения * С-аиетата раэнюй! кокцентраингул пропарната С ряс. I. • ). Сильное ингнбирозанияэ поглощения ацетата (на 75% ) происходит сразу при яизхях

концентрациях пропг.снато (до 0.1 ;<•*). Ляльнойи'эа по^шэнкз

концентрации пропиончта; на снигает г.оглозош:я ацетата. Эго сгллете.’п-стгу.т о яхжт'’ трздспортпт: сястеч, где одпа сист-тт с "чгтбр/'Гй:' nrm^cnrrov, - .у^.та;-; ч; ?а*;м::.г-:т о? этого

. /‘‘T'J '■ ^ V'ÜTN. .'НГ-СГ'С: С/.

Кот ‘.;:ироиий 12-С-пропионла, мМ.

Рмс. 1.Поглощение 14-С-аиотата культурой йоТгопососси оссиНис ЗА о эсэнсимости от <;омисхт,раиия пропионата.

1 — культура оьфашвна на среде |Цо.З,

2 — культура вирашена на среде ¡N0.4.

Таблица 2. Кинетические характеристики поглощения сцстата у ilalrcnoccccus occullus ЗА а гависикости от состава срэгн культивирования а прясутстсил ангабаторов э инкубационной скэси.

Срода Ингибитор Значения K,¡

гультиварованая --------------------------

- І 2

КА у 32+10 167±50

КА цсченсин (ІМКІ1) 167+50

И.А пропионат 300+50

С соотн. ацет: пропион.=1:20 )

ЛЭ <• А 32*10

К Л - срэда 2 З.содерзаащая дроагэгоЗ экстракт и казс’тизозкэ k:íc.*:oti: À3 + А - с рола Л 4,содерзааал дроззэвой экстракт я ацетат.

п пропионата) аналогична транспортнсЗ система ацетата у эубактэрзЗ.

У Е.cotí 0-12 и Corynobaclenua. ¡jlutcmcun обнаружено по одноЗ тр^з-гпортной сь'стецэ ацетата со анзченияня '^.разным "0 .icíü у E.coli ¿3-12 •л К. разным 50 tscli у Corynsbactenua fflutcaicici [¡-Cay, 1972, Ehbighau-£>гп ot al, IP9I3. Транспортная система у этих ьшхрорргаизэкоэ является так 29 :гак а а иашеа случае коиститутилноа -а обава для .ацетата я пропионата. Но она отличается от транспортной слстекы .;*£.сесиШш Í& до способу зпгргззацки : у СогутхеЬас leriisn gLuíanicm этот процесс ¡яэ .ез-2пснт от присутствия ионов Нд, а осуществляется за счет грздяокта про-тс’лоэ, а транспорт ацетата у E.coli В-12 драхояат по типу облопгскзоЗ :;::&5уэш1.

Вторая систеиа транспорта ацетата у fic.cccultia ЗА с ¡IC^ ipasacâ Ï57

i 50 titcLl является индуцибельноз системой преимущественного транспорта ацетата а и присутствии пропионата лишь незначительно .цзиекяет срод-стпо к субстрату, что пыра^ется £ повышенна значения :К^ ;£3 сгсйстеэ подогителыюа кооператнвнссти. При вырашнзашщ '.'с. cccv.ltиз ЗА па срэ-

де с ьизоккю! концентрациями ацетата эта система репрессируется. Бэз-иоілзю, чго ?та транспортная система ацетата Функционирует по типу оЛг.ьгченной диффузии. '

Налкчлэ двух транспортных систем ацетата не является уникальный сгейстЕоч экстрегальныя галэфилор. и ранее било показано у оубйктерии Е. coli V С с К., равны;® 6 ыхМ л 700 ікМ) и такого

эукариотического организм, как nsurospora crassa Сс К.- равшлла 25 wdi и 140 нкШ ifiao. Da Busk, 1977; Wagner- et al, І972І. Причем y Neurospora crassa вторая систеиа (Ky = 140 uxM) является

пняуцибельной и синтезируется только при росте на среде с ацетатов. Езроятно, как к s случае Nalronococcus occullus ЗА, такая регуляция синтеза систем транспорта ацетата носит адаптивний характер и

позволяет культуре ьыгсквать б различных условиях обитания.

Гост Hatronococciis occultus ЗА на средах с ацетаток.

Рост Hc.cccultus ЗА на среде с високим содержанием ацетата

представляет интерес с точки зрения изучения физиологии культуры.

Данные, представ;; энные на рис. 2, показывает, что при г.ираьивании культуры Nc.occultus ЗА на среде . содержащей яроегевза зкетракт п казамиповые кислоты, продолжительность лаг-фазы составляет лвоа сугоп (рис. 2. і), после чего наступает фаза ускоренного роста,

дляздяся дво* суток.- lia четвертые сутки роста культура переходит в стационараув фазу. При следусеем пересева культури на среди, оодерааоис? только Дроздовой экстракт ■ или дрохк-соР: экстракт с раэкькз; концентрациям: ацетата СО.5 - 5.0 глл. среда S' 4.) наЗ.тодаэтсг длительная лаг-.¿аза. : лл^апся 7 - ГО суток С?:<а. ?.. г,*.«}. НаяЗолг-р .. лит^ /Г’Г-фтсл нпбллдаете." среде с С г;*?.

I:. Гі*-? п.и-: л;::: .о:,.!..;- г

;,j: ¡¡а"./•: : ■. '.v .. ï : і : •

'¡'і)" ■ vu.’- '.v^y с n/.rV - . і

-■ ¡.c; 'Н'-.:іі:!0 . ~ч z.-'і

IS. '

«его. невелики. i!0 стимулируслее действие ацгтата очевидно. При Э?СС! '•летки. сирааенные д п',^'сутствии ацетата, обнаруживали споссЗдсеть псглоаать ¡.¡с^гт;» ацетат и пропчсиат. почти а 7 раз больауо, чэм лрч г-ьфамваняи па среде без ацетата . Поглощение меченого бутирдта по зависело от среды культивирования и было незначительным. Эти результат:« также соответствует представлениям о включении ацетата в !<етабо.'Ш21!.

При культивирована;! Не. occul tus ЗА ¡¡а средах с дрсетэкд! экстрактом в присутствии I r/л пропионата или I г/л Оутнрата :зэ соблюдалось заиетнего увеличения биомассы и способности кдэтод л?глса.атз> печение ацетат, пропионат и бутират по сравнения с ростом ;:а среде с дрожжевыи экстрактом.

Для выяснения способности культуры Не. cccultus ЗА к использоваипэ дцетата в качестве одного из источников углерода и энергии была поставлена серия опытов. результаты которых приведены и таблице 3.Показало. что при высоких концентрациях дрожжевого экстракта (2,5 г/л, ср:эдд й -1) концентрация ацетата в культуральной жидкости но оказывает сильного влияния на рост культуры.Вероятно,клетки используют для роста D остоанон компоненту дрожжевого экстракта. Теы не пенсе, ацетат активно потребляется «з среда, о чем свидетельствует шгекао остаточные концентрации ацетата на -!-s сутки роста.

Пр.ч использовании более -низких концентрация дрожжевого экстракта (.1.5 и 0.5 r/л) влияние ацетата на рост л развитие культур: I проявляется сильнее. Следует отг.этить. что культура, раступдл на среде, содержащей 0,5 г/л дрожжевого экстракта н 5 г/л ацетата, переходят з стационарную фазу развития несколько поэдо по сравнения с другими вар'лантзш! - к 8-а - 9-м суткам, потребляя ацотат :с 7-а суткам- .хульт'лаирования до остаточной концентрации 0,65 r/л, В D?o:t каркайте опыта концентрация ацетата превышает содерадяха л;о":егого экстракта з 10 раз, гтезте'у логично предположить, что . прирост биомасса происходит псшу^аестсенно за счет ацетата, прячем :.м.'ап"!.руп’"ли Эктором ятззяетсл ацетат, а дреглэзоа. экстракт. Пои росте ."я лтол среде у:*е д охспо?:цдлыюЛ роста обгаруднглотся s клодах '.yjMcuce гет?стю - г.оп-р-окежпаг.тяя идслотд --'.ccrrn'jT':!<••?■« к '!.?тг:рт:'л сутк.'/д реет», содер гущ я 0,.; глг v.l I !-Т ' :д опс.-асс*!. ¡-ы- с 0,5 г/л гг-ого г’четрддтд 1т, с?, "а

:;?сЯ ! ср-:пч, у,о б^о гдттд) гзтет полиггр vdnппу-сн. Пс:йсз-

".•:то ”а сп.:;:'; с '..ч.у;ъ:.'л.. -;сrc.vv;ric?i И м С Г” г.; ^оугст^":; гдтп:.-;:-

л.сг:.п 3) рос-’’ -'у'•-'•"рч чдблздйдсл.Культура

: Л г;:;-:'VCV"1' ..Т/,:0ГУ"! ''Т'ГГЖСЯ .'Т^'ГТ.'ОЛ

О 5 10 15 20

0р«.’мк,сут. ‘

Рис.2.Кривые роста Ыо^опососсиз оссиИив ЗА но средах различного состава,

1 - на 2,5 г/л дрожжевого окстрахта и ксгассминовмх

кислотах,

2 - на 2,5 г/л дрожжевого зкстракта и 1 г/л аивтата,

3 - на 2,5 г/л дрожжевого экстракта и 0,5 г/л аиетата,

4 - на 2,5 г/л дрожжевого экстракта.

Ib.

Таблица 3. Е.пшше концентрация ацетата и фоюсевсго :>:tc*p'^í'c на рост Halranccoccus осаЛ tus ЗА.

Содержание в среде Биокасса Са ед. опт. пл.), С г/л ) за время культивирована.*! С сутки 3 Солерггнге щетатг Ка Сг/лЭ, за ¿рема куяъ-таЕкрсвання СсутгаЗ

Лрсххеаой экстракт Ацэтат 2 3 4 7 8 9 4 7

о. к 0.0 0,52 С. 42 0.42 0.39 _* - - -

0.5 0.5 0.53 0.46 0.45 0.45 - - 0,15 -

0.5 1.0 0,59 0.6С 0.55 0,50 - - 0.15 -

0.5 2,0 0.62 0.80 0.77 0.70 - - 0.15 -

0,5 5.0 0.55 0.70 0.81 1.00 I.C3 1.12 1,30 0,66

1.5 0.0 0.40 0.57 0.61 0.61 - - • _ - -

1.5 0.5 0,80 0.92 0.83 0,66 - - 0.Г5 -

1.5 1.0 0,31 Г.07 0.S7 0,70 - - 0,15 -

1.5 . 2.0 0.S5 1,13 Г. 17 0.81 - - 0.15 -

1.5 5,0 1.00 1.24 I.3I 1.27 - - 1.30 -

2.5 0.0 0.80 1.25 1.00 1.00 - - - -

7 К £•( W 0.5 0.85 1.25 1.03 1,01 - - 0.15 -

2.5 1.0 0,94 1.25 1,30 1.05 - - 0,15 -

2.5 2.0 0.95 1.25 1.30 1.25 - - ОАО -

2.5 5.0 0.9S 1.25 1.30 1.25 - - 1.60 -

- определение не проводилось.

экстракт ил;: каза:,'лног»;э кислоты. При г ток iporzecoü экстракт

талге яэллетсл ксгочллком витаі.’лліон. Kai: известно из литературу, только некоторые прегстаглтелк гадоЗактеркА (кгпру.;/.зр, Kalo fere:: volcaniï) растут es елнтетичрокол ергле Сз ітрлоутствля зитакиког и мдг.реэлзхзат оі.0 , rje едхветьенггг. источником утл-грода является

осгаклчеакис- кислоты. i:;to-i::.t::ov. аз oí a NH¿Ci. При зіиг рост значительно кик, чем на ергле с хрэггзвых гкстрактс«. С Kauri et ai, 19303. Большейегье т.з гггойд.-стеркг г;? удзетсл в:»рагквать ка cpszax

0 ы'.нэралыгл'. кстс'Шеком 'азота, з еозтгЕ зоег. синтетических сред осязательно ВГС5ЛТ &ыц&сп.кслоты [Gnisni et al. ISc5; Grey, Fill, 1976; Javor, 1324].

7 г;,: KS игнее. в средь- д,"я Hc.o:ct.líus сА удалтсл значительно ссг.зить сохерзгшгг ярэгхэвэто экстракта. кот источника органического •4ЭОТП н г.лтйі.лгксз С до 0,05 r/.ij, лоЗгмз в среду !.д:нэ?алькиг источник азота - ItH/Cl л ьстечккк утл ó рог г - aserai. Прг этой рост культур;:

за счз? ї.с;їздьзсд:-.гкг с.дехатз ¡:а : еслоьлстс келлчнлкз

углуреха i.. »cskc.vhc, зке-рпа. Еот-'дгаое ;<й&чёкчч ллетата :сак истзч-:-.с.гс. ьг.аргкл олло уточнено ь oüjtsx по ллмллгллг о'ргзоьалсил ¡-;?Ч';-;эго О'.'у Г-р і: лулътлллрлеллли о мзч-скик а^гтатс;.' гд? !•-. г.-г он с., чго ь цл;.о:-' î3âxî игЗсльгал чгтт:. адегсга прл’лс л;ллльлустоя ь ::.-гстру::тлг-

глг 5...таСолКз;.'.і. Оолллал часть с лллляэтс“ де СС-,.

¡'л.тгргс::ым i,-5irrv:,’ Ç-rc-sr.’.C'i-KJ: /.с. cccvî tu? і/, ягпдсісч способное» ото*', культурі ;:;;.o-o ласт;: ;:а сгрсдє с гдіта;-~до--д, яьляедйу.ся

ірлхлгчалкл е еднетплл.лл,: гсто-лідло:.' У к N. лл :: v лс Тлкдала к Триггера íTirrSail, Truper. 193"?. ухлхрэиж: одзіног.-'-д^огс і:::: лчнлка углерода

1 г.рлоутстллк :: эс-ргадгчс-скогг. азота згтг;тд«5К£< ііз-з? галего

хслгг-лоть:: їлі4 г-ри ї-ііссглг: лнлчллл<:х л.-Iî ерллл Ьсшс:?; прлсу.ствил в среде лллЛлллролаллзго готочкіггсг. угліузда >: глотл ■Г'ллтспрялтао для

роста кулілург. Ь ¡.ало.' сдучі': тап.л 'Л.'Слллрола iiua< лсточл.л:ол

углерода у азсіг лглдэтсе глл-:та:лд. .

Бкргдзи-глг?. культурі .,;с o~c.¿ltvs Ь.\ на средал л рззлччкідл.

ксточ.-іі ría:"Д С к К псидтж /зу-;'т_ оозЛел^лллл к.ліайллллі.т. алетрта у

данлоЛ культур«. У.гі: л-лх-аедла -«? та;сратурь: у эу<а>:терлп Скалркх'Эр. у Е. cri L її ТіоЬ’2:і'.Іч~ ? аттреЗлоиллі- ацетат 'через

a^jTK“pc: ¿лг мгерл^.игруез к досгу;іа?т l 21 ti. при ,::то:: через

?-оллс7лутс.рллус ,с;.слогу он ьлглл- лр;лр=1.атлля в ллутаїлінсЕус- кислоту V яг*.-; к;: 5/оокктетл л-г'лгл д?лл Лст^ллк, 1Лл2, ^І'лли; 61 al,

і У 33; У гад'>Ла-“~рлЛ лллл ?..л-''¥лллл UTK г гллолсі ла іНсло пикла Сдло лл; с.эано рал-íü {Аіі-.іл, л о..п, ??;.?. I i.-.sor. Pt ol. I9S5Í.

iiiî4:;o f.Jiitw r;.> '

.''ч - • .лл:. : .:л : ■, ллы ■ ~'1 .с. 'лУл.1' л ллсл.л > лл л

• ■ -■т- -. л - л ■> , :л л' • л л ■ ■. л . лз1,' ■ л Ул *).

ту л.л . ■ у. сс лулг : л ■ лт л г./ ■■ .. : л . лл /! у/ \

- у' . л ■ : ■ 'г с:1 ;1 л .^л-1 '-л>:. л1 л л > ч л лт' г-;.., ю

.. - л V ь'!! V 1 гсг ) Л.л.л.л .л ■ ' г: Л.’-.'.

' :1'¡гс? I :. ' с■;. :л "с р>. г. .■ .-т <;

. . . ; • л 1 :т:; ’■/" ' л л лл ¡сл л.

" . с-:.-. • ■ . • л . : лл 1 ". г л) ’ л. лог^ рллл- '"■л

> ::’У. • " . лллл ‘ ■"ллгл ' • л.'л;л

.■ ■ л. л . .Г". л.л . л;: :л л.'о, -тл ' ’ : о

, , . ( ■ ,-т , ,,;0, . ... ^ -

' _ -г*. У .'А.: лч.лл: ЛЛ Ъл :: Л лу ■' г" .ОТС’.

. о..У! ¡юге илл- . : 'лллтл'л I г'Л : лг;л ,;;л лл';,,'У’*л

\' :■ . . слл_ . , п.л:.о лл -л ’’ : 1..члл.. ;

"■ . ' л лл.. V;'- ;'л ллллл.: ' ' л: ■: ■ ~ гл. л.лл',1 ■!■■■■" ■ 'С :

г~'^^¡'Т., ■' лл’л’. > ч.ч' ; .■ у ' л .> Л.У ; , ... ■.ч'О

■ к.!. ;л .' г-г. л г лл." ЛЛЛЛ''.' :"---л ’”1 У. л::!|' 1(!л>., У’лллл

■’•Л5; Л-’О, I -УУ-; лл?]. ■ ,^л2 тлгулалл ллл.--:

^ лл:: ст. л ;::я:'С''о.лл лте:л: V ¡'с.осс'11’’:.:' У Л ,;ллг

.лл ^'л;;!л-:л:.:л ь ■ '-^млл>-'’скг чг нспсссо.-.'- ¡¡г с г у.'.’ь турл :• у'Л''.',: :.л ::ус^трлг ; I :‘'Л'Л' л;:л:л -/-"тгм :"'1:л:!ог::,:ч'1л.!П г л тел,

/л:л.;л;у '"лл;, ':::л:л роль’ >'! лсл::пллг м,

. -!.л:л-л”л' ю гл л ■’ПТ'льлгь гсстол'.'чо з

1-::ру:г.'’-'1Л ч Л'''"'?.

:р» "г;г/у- с: с ' 1:/:-;.':тл.' у;..э ч Л'.’! \.'Л л?', ус^ол'Т’лю реег.ч

• ■ л..етлл' л:л>1*'~ '. Л'"!ч”-' г 1'*':лпли’:атт)0>; ■1олч-0-л':л",'лг:п::'';;:

:л ; лт.,. ’к' п -тег ■ ""’т ;: л;,"л

: 'л’лл ;м’ 1“.: л<л/:л^.ч !с<. .1 ■ , '['. г !гг г: ), ’л л, ”

ЛЛЛ : Л'лл" У'-ЛЛ Л Л ■ ,Г;. .р,

- , С “л " "гпу-'л::; • :: л' •: ■ т:': I -Л' "'Л71'’ л; .':[ЛЛ‘

.".тате-: и . ';гог<'~ 'рс/гГ'Л'-:!;;' ’-''лрс.уело:'':!:,:: •'ллллл'Ь''?;: ’Лсгь

•.1ЛГ'М~> -Л'ТУ ’• Л .Л> 'Ю 1Х!'С Л:(!Н5Т .Л'’Г :л Л<П'ПЛ

т:-;3-о::о;;!"‘с ¡Л1С-.: ;"с."гц. ч ’ : ;лл ^:л.:-глта ст:сис;ко'гс;(

: ЦТ;" г.':,1С‘ЛиЛ.< гг.гл; ,:.л ЛЛ'Л'ЩЛ' :лс;т?ггсй•}Т?ля,

лчул ,у.Т) ) ГУС^ЛР ГС Л“!1-”'УС:ГЛ(;г::,нсУ: УУУУСТУ [ПЬЗСО

. 18. Таблица 4. Определение активностей ферментов в клеточных экстрактах ■ Natronococcvs occullus ЗА. выращенной на разных средах.

Среде Активность ферментов С ед/кг белка клеточного

культ;;шфования экстракта )м

Ацетил-КоА-синтетаза Ацетаткиназа Изоцитратлиаза

КА *!! 0,013 0,014 0,050

ДЭ + А 0,014 0,014 0

К 0 . 0 0

?< За ед. активности ацетил-КоА-синтетазы и ацетатккнаэа принимали количество форманта,образующего I мкмоль ацетогндроксамозой кислоты в I мин на I мг белка,за ед.активности изоцитратлиаза приникал!: количество фермента,образующего I ьпсколь глиоксиловоя кислоты за I час на I от белка. . '

** КА - среда И 3.содержащая дрозжевой экстракт и кэзатговыэ кислоты ДЭ + А - среда И 4,содержащая дрожжевой экстракт к ацетат.

К - среда й 5,сдержа1дая казампнвые кислоты и раствор витаминов.

el al, 1989; Стейние-р к др. ,19793. У других микроорганизмов с Pseudomonas sp, Azotobacter sp, BacilliLS sp к до.) синтез поли-/3-оксишсллноЛ кислоти происходит из ацетил-КоА на более поздних стадиях роста культуры при недостатке источника азота и избытке источника углерода и энергии [Готвдлк. 1982. Ст°5*!:::ср « др., 19793. Е случае образования целя ■(3-оксамасляііоя ккслотк у Nc.occu.ltm, ЗА uu не мохом исключать . ни первого, ни второго вариантов пути синтеза поли-/3-оксимасляной кислоты. Однако, второй вариант кажется более вероятным, так как синтез этого полимера происходит на среде с избытком источника углерода (ацетата) г. лимите источника азота и витаминов СдроЕхевого экстракта), хотя к на начальных стадиях роста культуры. ‘

Таким образом, ш ыот.ем предложить следующую наиболее вероятную схему первин, аталое нэтабслиэма ацетать у М.. occuUus ЗА Срао. 3).

поли—р—оксимасляная

кислота

Л

ацетат.

сц«таткииаэа

сиотилфосфат

. си«ткл-КоА-смит*то*а

аиетилЧ<оА

оксалоацвтсгг

А

цитрат

* глиоксилат

кэоцитратлиа»а

изоцитрат

малат•

■фумарат»" 11 сукцинат ♦—2-оксоглутарат

аминокислоты

Рис.З.Схема первых этапов метаболизма ацетата у Ыа<гопососсиз оссиИиз ЗА.

Л. — Цикл трикарбоновых кислот.

Б. — Глиоксияатный цикл, при высоких концентрациях ацетата происходит репрессия синтеза иэоцитратлиаз». ’

Способность культуры Nc.occultus ЗА хорошо расти на средах с ацетатом вызвала интерес к изучение среды' обитания данного микроорганизма и его места в трофической цепи микробного сообщества.

Сезонные-.колебания влахности содовых солончаков и их солености приводят л смене, доминирувютх микроорганизмов в этих почвах. Культура Nationscoccvs occultus ЗА выделена из почвенных образцов при содержании в среде 25% NaCl. Эта культура развивается при диапозоне солености 15 - 25% и не растет при более низкой концентрации . соли. При содержании 0 - 20% NaCl из тех же образцов почв была выделена культура Bacillvs circulons var.halophilus, оптимальный рост которой наблюдался при 10% NaCl. При повышении концентрации соли в среде до 25% рост почти полностью прекращался. Культура Вас.circulons var.halophi lus способна в аэробных условиях секретировать в среду ацетат (концентрация которого в культуральной яидкости составляла на 7-ыо сутки 3,9 г/л).

Полученные данные показывает, что умеренные и экстремально галофильные бактерии, выделенные из одного и того же образца содового солончака, физиологически взаимосвязаны, и обеспечивает функционирование одного из звеньев аэробного гало$ильного ссобаествг. при изменении условий внешней среды.

• ВЫВОДЫ.'

1. Представители основных таксонов экстремально гало$ильнкх

аряебактерий СгалобактериЮ обнаруживает способность поглоаать Си утилизировать) широкий набор С-1 - С-4 конокарбоновых кислот, из

которых наиболее эффективно поглощается ацетат, пропионат, бутират. лактат, пируват и гликолат. Первое три аниона, по-видимому, транспортируется с пемошьв нескольких общих транспортных систем, различавшихся по сродству к суостратам.

2. У Hcitronococcus occulLus il. при росте на среде со следовыга

количествами ацетата функционирует двэ транспортные системы со ' значениями K¡> С для ацетата) равными = 32-10 мкМ и Kjjj - 167 - 50 мкМ. .Первая транспортная система (с высоким сродством) является общей для ацетата и пропионата и энергкзуется оа счет

трансмембранного градиента ионов На+ (ÄpKa). Вторая транспортная система (с и;зкии сродством) более специфична для ацетата, и ее синтез подавляется при поьизеи.м: концентрации ацетата в среде.

5. Культур- ¡i:..cccultv3 ЗА растет на среде с лимитеров акным

количеством лрог&евого экстракта (до 0,05 г/л) с а счет использования

ацетата в качестве основного источника углерода, a NH^Cl в качестве основного источника азота или за счет ацетамида в качестве основного источника углерода и азота.Однако она не способна использовать NH^Cl в качестве единственного источника азота и нуждается в присутствии аминокислот.

4. При росте на средах с высоким содержанием ацетата в клетках Nc.occultus ЗА накапливается (в качестве запасного вещества) поли-/Э-оксимасляная кислота в количестве до 0,5 мг/мг клеточного белка.

5. При росте Nc.occultus ЗА на средах с ацетатом в клетках обнаружена

ферменты метаболизма ацетата : ацетил-КоА-синтетаза, ацетаткиназа и

изоцитратлиаза. Синтез этих ферментов носит индуцибельныП характер. По-видимому, при росте на средах с высоким уровнем ацетата в клетках Nc. occullus ЗА функционирует только ЦТК, тогда как на средах со следовыми концентрациями ацетата функционируют одновременно ЦТК и глиоксилатный цикл.

6. Из того же экотопа, откуда ранее была выделена культура Nc.occultus

ЗА, выделена галотолерантная культура Bacillus circulans var.halophilus, способная в аэробных условиях накапливать в средо ацетат и, возможно, находящаяся в трофических взаимоотношениях с галобактериями, утилизирующими ацетат. '

Список работ, опубликованных по теме диссертации. '

1.Кевбрина М.В..Звягинцева И.С..Плакунов В.К.Рост Natronococcus occul-tus ЗА на средах с ацетатом.Микробиология,1989,т.58,вып.З,с.377-381.

2.Кевбрина М.В..Звягинцева И.С..Плакунов В.К.Поглощение моно- и три-карбоновых кислот экстремально галофильными архебактериями.Микробиология ,I989.т.58,вып.5,с.703-708.

3.Кевбрина М.В. .Звягинцева И.С. .Плакунов В.К.Изучение поглощения ^С-ацетата у Natronococcus occultus ЗА.Микробиология,1989,т.58,вып.6.с. 892-896.

4.Плакунов В.К., Звягинцева И.С., Кевбрина М.В..Тарасов А.Л. Регуляция транспорта органических кислот у галофильных и галоалкалофильных архе-бактерий.Биологические науки,I99I.J& 6,с. 123-130.

5.Zvyagintseva I. .Kevbrina М. ,Kulichevska.,a I. .Kostrikina N. .Skvortsova I. .Tarasov L. Metabiosis of Kaloalkalophilic Bacteria. 5^ Europ. Congr.on Biotechnology.Proceeding,Copenhagen,1990,v. I,p. 604-607.

6.Zvyagintseva I. .Kevbrina M.,Kravchenko I. .Skvortsova I. Metabiosis of Haloalkalophilic Bacteria. 5*^ Europ.Congr.on Biotechnology.Abst.

Book,Copenhagen,IS30,p. 79.

7.Зьягинцова И. С. .Кевбрина М. Ь. ,Тарасов А.Л.Сравноние популяции yix-тр«:сг.льио гало$.1льных архебактарий из различных мест обитания. Тез. док;; Есес.совеа. "Экологш; популлциЛ".Новосибирск,1988,с. 178-179. Ь.Звягшщога К. С. .Кевбрина М. В. .Ксстрпкина К. А. .Тарюов А.Л.Сукцессия бактерий ь содойых солончаках. Тез. докл. 3Г0Вссс. Сшэт. "Биог.ина1и;:а почв" Таллин,IS38.C.73. - - ,

9.Згягшшева И.С. .Тарасов А. Л.,Кэвбркна М.В. Регуляция транспорта органических кислот у экстремально галэйильных г. галоалкалофильных ерхе-бактерий.Тез.докл.Всес.конф. "Регуляция микробного изтаболпзиа".Пунино, 1539. с. 8-4-85. .

10.Ковбркна М.В..Плакунов Е.К.Метаболизм ацетата у- Natronococcus occul tus За.Микробиология, 1992.Св печати). YvJittjA--

КЕЯБРК11А МАРИНА ШДЩ'МРОША

ТРАНСПОРТ И МЕГЛБШШа.1 ЮН0КАРБ0Н0ШХ КИСЛОТ У ЭКСТК3.1АЛКЮ ГАЛОЗЖШШХ АРХЕДАКТЕРКЛ

/Автореферат/

Подлизано г. початп 24.06.92 Сармат 60x90 I/16 п.л. 1,5 Уч.изд.л. 1,3 Тирая-Т.00 Заказ 88 ;.Н "Гарант"

Готапршт МАСИ /BTÍS-ЭДД/, 103280, Москва, Автозаводская, IG