Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт хлора и Mg-АТРазная активность в эпителиальных и нервных тканях рыб и лягушки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Транспорт хлора и Mg-АТРазная активность в эпителиальных и нервных тканях рыб и лягушки"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЖЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. IL СЕЧЕНОВА

Ка правах рукописи

ЫЕНЗИКОВ Сергей Арсентьевич

ТРАНСПОРТ ИЮРА И Уг-АТРааная АКГИВЮСТЬ В ЭВИГЕЛИАЛЬШХ И НЕРВНЫХ ТКАНЯХ РНБ И . ЛЯГУШКИ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата Отологических наук

ЛЕНИНГРАД - 1992

Работа выполнена в лаборатории физиологии и водной токсикологии Института бшлогки внутренних вод им. И. Д. Еапанина РАЕ

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Р. а Глебов, кандидат биологических наук Е А. Гдовокий

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор НЕМзслова, • доктор биологических лаук, ст. науч.'сотр. И. А. Мзрахова Веяпчзе учреаденне: . . Московский Государственный Университет

Защита диссертации состоится « » яиЛл^Л 1995 г. в. / 3— часов на заседании специализированного совета. (С 60i.S9.Oi при 'Институте эволюционной физиологии . и биохимии иы. Й.Ц. Сеченова РАН по адресу: 194223, Лэнинград, пр. М. Тореза, д. 44.

С диссертацией мэжно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. и. Сеченова РАН

Автореферат разослан «}4» с^г/гаЕрь 1992. г. Ученый: секретарь специализированного совета,

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последнее время во многих эпителиальных и нервных тканях различного происхождения о5ка-руло н активный транспорт тонов хлора ( Serenóse г, G. А., 1983а; Degnan.RJ. et al » 5.977; Kerstettor T. and Klrschner.L.B. ,1972; Schutz, S. 6., 1979 ; Ando, M, et al,1975;Fiold and Schultz,1979; Веренинов ,1977; Ussi rig aid Zerahn,1951;Leaf,lS65;De Renzis s-id ïfestz,1973;Field and Schultz, 1979). Почти одновременно в этих м других тканях была выявлена анион-чувствительная АТРаза (Durbin and Kasbekar,1955;De Pont and Bonting,1931; Gersncser, 1983; Bornancin et al,1980; Karstetter and Kirschner, 1974; Нага et al,1982;Tanaka et al, 1S85).которая получила название CÍ?HС0з - Lfe-ATPaaa ( Durbin aid Kasbekar,1965; Ивапзэико,1083).

Однако, вопрос о взаимосвязи транспорта хлора через мембраны клеток с анионными ATPasavnt остается открытым до настоящего времени ( Gereneser ana Loe, 1983; Stekhoven and Bonting,1981).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение 'кинетически свойств анкон-чувствительной Mj-AT?-агы в обонятельном эпителии ркЗ и амфибиЛ и з жаберном эпителии рыб, адаптированных к различной солености. 3 связи с зтюл бал;: поставлен« следующее задачи:

-исследовать кинетические свойства анион-чувствительной ?&АТРазы,вьгявляеыой в экстрактах из обонятельной выстилки карпе (Ciprinus carpió) и лягуики (Rana temporaria). - при возможном выявлении CI-активируемой АТРазы, доказать ее участие в АТР - зависимом транспорте хлора через

мембраны везикул.

-изучить Ыг-АТРагнуга активность у ЭБригашшого вида . (Oreochromis mossambicuá) рьяЗ.адаптированных к различной солености.

- сравнить свойства М^-АГРазы обонятельной выстилки карпа

со свойствами Mg-ЛТРазы жабр пштаий. ручная новизна. Проведено сравнительное изучение свойств íij-ATPasb' 20 фракции, обогащенной плазматическими мембранани (СШ) иг обонятельной выстилки icapna(Ciprinus carpió) и травяной лягушки (Нала temporaria).Установлено,что в отличие от травяной лягушки СШ из обонятельной выстилки _ карпа содержит С1-активируемую líg-ATPaay. Показано,что CI-АТРаза преимуцзсг-венно локализована в нейронах обонятельной выстилки карпа и участвует в активном транспорте ионов хлора. Выявлены общие кинетические свойства АТР-зависимого транспорта ионов хлора и СI-авизируемой МгАТРааы из обонятельной выстилки карпа

Показано, что в отличие от тиляпий кз пресной воды в габрах рыб,акклимированных к гиперосмотичной среде, обнаруживается CP активируемая Mg-АТРаза. Исследована динамика появления чувствительности Mg-АГРазы к ионам хлора Обнаружено,что С I-активируемая АТРазная активность не связана с С1/НС0з-АТРазой.

Теоретическая и практическая знауимость. Результаты проведенных исследований расширяют современные представления о роли С1:акгивируеыой- 1£-АТРазы в процессах поддержания ионного го-меостаза у рыб. Полученные бюхюдагеские характеристики CI-акти-вируемой bfe-АТРааы могут быть использованы при изучении процесса электрогенеэа ЭОГ у пресноводных рыб.

Обнаруженный специфический характер изменения чувствительности к анионам lfe-АТРазы в жабрах рыб, адаптированных к

высокой солености.позволяет считать,что появление СI-авизируемой АТРазы в жабрах тиляпий в первые сутки пребывания в повышенной солености является одним из способов "переключения" работы осморегуляторных органов рыбы в режим,позволяющий выжить организму в этих условиях среды,что молег быть использовано при исследовании молекулярных механизмов адаптации водных животных к различной солености.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на •III Всесоюзном совещании по химической коммуникации животных (1ЬскваД988) и X Всесоюзном сове^ии по эволюционной физиологии, посвященной памяти академика Л.А.0рбели (Ленинград, 1990).

Публикации. До материалам диссертации опубликовано 6 статей к 1 тезисы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста Ока вклзчает введение,обзор литературы. описание материала и методов исследования,обсуждение,выводы и список литературы. Работа иллюстрирована Щ рисункауи и 4 таблицами. Список лотературы состоит из 39е отечественных и 1БЗ* зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась на костистых рыбах - карпах (Cyprinus carpió) »тиляпиях ( Oreochromis rnsssarbicus), форели ( Saino trutta).a та^кэ на амфибиях - травяных лягушках (Rana temporaria).

Перед бкохтадгаесгапи опытами гзшотных обезглавливали и вырезали исследуемую ткань обонятельные выстилки и яабры.

Швеску ткаки гомогенизировали в среде, содержаний О,£о Ы сахарозы в 20 мМ трио-глицинового буфера (рЕ-7,6) в соотноданго 1:8,в ступке со стеклянным порошком.

Для получения фракции,обогащенной плазматическими мембранами, гомогенизированную ткань обонг. ;ль«ой выстилка рыб центрифугировали при 1500 е в течение 15 ыивуг.ввтем еудеркагаот разбавляла в соотношении 1:25 и цектрифугировадя вторично при 4500 е 15 минут. Вге процедуры проводили при 4® С. Содзряаше ш-аохо!!дркй и плазматических мембран в полученных фракциям оцз-мшали по активности маркерных: ферментов > сукцинатдегддрогбна-зы и НаК-АТРазы. жабе.пую ткань центрифугировали вторично при . 8000 е 15 минут.

АТРааную активность определяли по приросту неорганичэско-го фосфора в 0,5 мл инкубационной среды при 30е С в течение 30 минут. .

Инкубационная среда для измерения 1с-АТРазкой активности состояла из 20 мМ трис-глицинового .будара (рК~8,0)Дй50^ и* трис- АТР.

Ма^АТРазная активность определялась по разнице реакции £ инкубационной среде,содержащей 20 Ш трио-глицинового буфера (рН -7,Б),1 Ш ЭДТАДОО мМ На21,10 Ш КС1.3 ыИ Ь^О^ ,3 Ш трис-ЛТР, и в этой ке среде с добавление« 1 иИ оубашга.. Для измерения Р1 брали 0,1 ш инкубационной смеси. Фосфор определяла видоизмененным методом Чзна (Спеп,195б).

Удельную активность выражали в мкшдь Р1 на 1 ыг белка в

час.

Сукцинатдегидрогеназнув активность определяла! в инкубационной среде слэдуюцэго состава: 10 Ш трис-глицинового буфера (рН -7,5),0.1 ыМ ЭДТАДО ыМ сукцината натрия.1 мЫ КС1,Б0 мкМ

дшслорфонолиндофенола.О.б ыЫ феназитетазульф?та. ¡^мщия начинали внесением белка и регистрировал! у"эньЕз;гие о::т]г;зской плотности при 600 нм. Удельную активность вьтажалл в мкмоль окисленного сукцината на 1 иг белка за 1 »ли.

Белок определяли по методу Лэури (Кочетов,Г. А. 1980).

Анион-чувствительную АТРазную активность определили в такой последовательности: 15-20 sot белка вносили в 0,5 мл инкубационной среды,содержащей 20 мМ трис-глицинового буфера,трио -ATP,^S0a,0,2 mU оубаина и 20 мУ исследуемого аннона. Активность обцрй У^-АТРазы определяли по приросту неорганического фосфора (Pi),а активность шиш-чувствительной АТРазы рассчитывала по разнице ыехду активностью АТРазы ь присутствии исследуемого аниона и в его отсутствии.

АТР-эазисшзе поглоцгние меченого хлора (ЛамС1) исследовали во Фракции климатических кембран Еезикулярной Форш из обонятельной выстилки карпа. Везикулярную форму препарата контролировали с пояопйо электронного микроскопа.

Аккумуляция меченого хлора ксследуеюй фракцией изучали з следуюдай последовательности: 60 ют белка вносили з 200 нкл jîh-кубациокпой смеси, еодерязярй грис-АТР, IfeSO* и SO мМ HaiSCI (1 икКя) в 20 îîM трпс-глициновой буфере,рН-7,6 и инкубировали а течение 15 кинут при 30'С. Ичкубация проб завервали £яльтрова-шгeu через стекловолокон:!!» фильтры SF/C (Wvatman, Англия) под вакуумом. Затем фильтра триада промывали добавлением 4 мл холодного буфера. Радиоактивность на фильтре измеряли при помощи сцин-тялляционного спектрометра SL-100 ("Intortechnlque",Франция). ОэглоЕряие 56С1 фракцией плазматических мембран рассчитывали по разнице радиоактивности в mot после инкубации в присутствии и в отсутствии АТР и результаты пересчитывали в нмоль Nafci на 1 мг

- в -

белка.

Исследование транспорта хлора и АТРазной активности у эв-ригалннньи рыб выполнялось на тиляпиях.

Рыб акклишровали, постепенно увеличивая концентрацию солей в годе,содержащей NaCI-30, KCI-0,7, CaCIgl.O г/л. Для исследования действия фуросешзда на водно-солевой обмен использовали тиляпий.ачклимированньк к искусственной морской воде. Рыб перед опытом и после него взвешивали. Кровь брали из хвостовой вены в капилляр для определения гематокрита и центрифугировали на ш-кроцентрифуге ЩГ-8. После определения гематокрита плазму взвешивали и разводили в 1000 раз. В полученном растворе определяли концентрацию натрия и калия на пламенном фотометре ШЫ-1, хлора -колориметрическим методом (Allen C. R. .Allen S. ,1S88).

В работе использовали реактивы: фуросемид в виде натриевой соли (4-хлор-н-(2-фурилметил)-5-сульфа.чил-антранильная кислота - препарат лазикс (Кндия),трис(Н-трисСгидрокс!с.юткл)а!лщометан) глицин( NHS CHgCOOH); SITS ( 4-ацетамидо-4-изотиощшостильбен-2,2 дисульфонильная киедота).,МЕЩЬэт1тадэишд),зтакргаювая кислот (2,3 -дихлор-Н 2-метилен-бутиршО -фзноксиуксусной к-ты), ПХМБ (парахлормеркурий бензоат), ДТНЕ( 5,5-дгаиобис(2-нитро Сензойпая кислота) ,КЕРЕ5(М-[2-гидр0Ксиэтил1п1П!эразин-И-С2-этачсульф01П1Л0-вая кислота!-"Slpna"(США),Ма2 АТР-,'1?еапа1"(ВенгргаО,5Цг<4.-эт!1Л-бицислофосфат).остальные реактивы - отечественного производства

Расчет концентраций свободного свободного АГр'и кош-лекса UgATP^" производился на основе констант зязызания для комплекса ЫеАт/, общей концентрации м|*и концентрации АТР*~по следующим формулам:

(bfetl) + (1) (Mg» ATP) . (3)

(ATP«) + (IfeATP)-(ATEX). (2) (LfeX АТР)" смз-

- g -

Находим из уравнения (3) концентрация комплекса ifeATP: (МгАТР)- • (ATP**).

Подставляем вараггзэниэ (4) в уравнение (1). и (2).Решив квадратные уравнения,находим значение концентрации свободного Це?*и АТР*ТПодставив эти значения в уравнение (4),определяем концентрацию комплекса tígATP (Болдырев A.A. и др. ,1983).

Результаты обрабатывались статистически. Дня определения ' достоверности полученных результатов использовал! критерий Стыодентв. '

В работе использовали 370 экз. карпа,15 экз. форели,95 рка, тиляпий, 60 зкз. травяных лягупек. Каждая точка измерения получена при 5-6 повторносгях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кинетические свойства Mg-АТРазной активности в экстрактах из обонятельной выстилки карпа (Cyprinus carpió) и травяной лягузлки( Rana temporaria).

Ранее было установлено, что у земноводных и млэкопктащих жзотных основную роль в генерации ЗОГ выполняет Na каналы, а Ni, К-ЛТРаз а участвует в восстаковленш меьйранного потенциала рецепторных клеток,транспортируя К^знутрь й На"нарулу клетки (Thomas, 1969;Skou,1965;Koch, 1971,1972; 1973;Rossi H. и Koch R.В., 1S81J.B то г® время в обонятельной рецепции рыб роль одновалентных катионов не столь очевидка(Suzuki ,1977)»более того, поддержание рецепторного потенциала осутззствляется в основном sa счет -онов хлора, которые активно ншсапливаюгся в обоня-

- 10- ■ тельной выстилке (Гдовский II А. и др. ,1991).

Если допустить, что транспорт СГв обонятельной выстиа© рыб обеспечивается анионной АТРазой, то активность и свойства этого фэрмента у рыб и амфибий должны существенно различаться. Наш исследования это подтвердили. Было установлено, что во фраздш, оОоганзиной плазматическими меыбраЕШК, го оЗовягельЕсй выстилки карпа в отличие от дагуикн выявляется высокочувствительная к фуросемиду Мг-АТРааная активность. Ео абсолютная активность составила 4,0 + 0,7 моголь Pi / час на 1 иг белка,т.о. зто та часть Mg-АТРазы, которая ингибируется фуросеивдом в концентрации 0,3 Ш (рис. 1).

Рис. 1; Влияние фуросещда на Иг-АТРазнуо шсттность обонятельной выстилки. 1 - карп, 2 - лягушка.

Такой характер действия фуросещда можно объяснить те«', что скорее всего имеется две разных Ыг-АТРазы о различной чувствительностью к атому веществу. Шдтверждениеы этого явилось изучение влияния сульфгидрильвых реагентов, таких как ДТНБ

п IffiS. Оля в ганцшгграции 100 ккU подавлял» »г/естзитслъ::;"» к фуросекид7 Цг-АГРзау, Отношение к аяионаи агкх Уз-ЛТРа^тих сотквностей оказалось такта различным. ташиэ йот;, как гшгиби-руювдй кон-SCtni активярухэдй-ЕСОэ (Иваврнко,1982) .оказаюсь ¡шднфференткыж! в концентрации 20 >.it к выеоко-чувствитслъиой к фуросемзду ¡^-ЛТРазе в отличие от низко-чуветшиелыюй. В то гл время, шггэресувпц?э нас коны хлора в данных уегоигах среды инкубации, т. е. тогда присутствует 3 >.i! MJSO^h 3 мЫ АТР.огкза-дась тшсэ индифферентными.

йзходя из зтого,:.!Ы изшнили как концентрации кофшеторов ч ерзда инкубации и колиество субстрата, тел я шетрггость буФз-ра. Такой подход позволил нам зыявэть хлор-активируем?» AT Разу а обонятзльпоЯ выстилке tcipna (ркс.2).максимальная окткен'ость юторой нЕблвдалаоь в ереде инкубации.оодержедрй 16 ыИ 01,1 мМ ATP и 1 Ш !feSOv

I: 2« ЗР

I'

Ü

=* *

Mj i ф Ц*^ "i

if

т

[ЛТР^иП

Рис. 2.- Влияние АГР{а) и ИгЛТ?(б> па АТВазу обонятельной выстилки ••арпа(1,2) я лягуаки(3,4).1,3 - в присутствии 30 иМ ионов хлора;2.4 - в отсутствии ионов хлора.

- 12 -

Увеличение концентрации ионов хлора в инкубационной среде До 100 мМ ве влияло на скорость реакции (рис.3).

Попытка выявить подобный эффект активации •ионами хлора анионной АТРазы из обонятельной выстилки травяной лягушки не дала положительного результата как в опытах с изменяющимися концентрациями магния и субстрата,так к при различных концентрациях ионов хлора. Ионы бикарбоната вызывали активирующий эффект. Общая Ме-АТРазная активность у лягушки оказалась в два раза ншз (6.5 мгашь Р1/ч на 1 мг белка),чем у рыб (13,5 мкшяь Р1/ч на 1 мг белка).Это позволило нам сделать вывод об отсутствии С1:акгивируешй Ыг-АТРазы в обонятельном эпителии этого вида швотных(рис. 2 и 3).

20 ' М оО ВО 100 {хслмн хлористый],мК

Рис. 3. Ниняние концентрации ионов хлора на 1&-АТРаз-ную активность обонятельной выстилки карпа(1) и лягушки(2).

Детальное исследование кинетических характеристик С1-акти-

вкруемой и фуросемид-чувствктельнсй 1&-АТРози по:сззало их полную идентичность а отнопенкк к SH-реагентом, s (й^эт? • мзду и этакриновой кислоте),к ингибиторам хлорных каналов (SITS и бициклофосфату),а тага© к шлярности буфера В то яс время, изменение концентрации конов водорода в инкубационной среде, а так® солюЗшшзация таким детергентом, как тритон Х-1С0, показало дифференцированность их свойств.

Наш было установлено, что как фуросемид.так и зтакрино-вая кислота,оказывали адекватное влияние па С1гакт1гаируемув и Фуросеьяд-ингибируему» 1&-АТРазные активности. В то гэ зрсья, блокирование их действия дополнительным вяесёнием 0,5 кМ цясге-ина в среду инкубации позволило выявить различие швду юши по механизму действия. Эгякриловая кислота проявляла своз действие как SH-реагент, а фуросемид специфически ингибировал ЛТРазкыэ активности,не затрагивая SH-группы.

Шлученнда нами результаты свидетельствуют о,том,что исследуем» АТРвзы являются слабо чуввтияелыааи к NSi и.скореэ всего, но сзязаны о Н2" и К^АТРазами (Stekhoven and Oonting, 1981). Только в концентрации 0,5 Ш НЕМ незначительно (на 10Х) снижал эффект активации хлором ферментативной активнее?:!, не влияя на фуросешад-чувствительную iij-АТРазу.

D последнее время появились работы,а которых установлено влшшиа SITS на анион-чувствительные АТРши (Kara efc al, 1931; Inagaki at al,lS85). Так а мозге крыс SITS подавлял этакрин -чувствительную l^-АТРазу c.Ki - 8,0 мкмоль(Нгга et al,1981).

Выявленные наш Ыг-АТРааные активности подавлялись SITS,начиная е концентрации 0.1 Ш, а 100% ингибирование наблвдалось при 1 ыИ,

Другой ингибитор хлорных каналов - бкциклофосфат - ока-

а алея более эффективным. В концентрации 10 ыкМ од полностью ингибировал после дуемые АТРвзы, при зтоы лишь незначительно (на 10 X) затрагивая общую Иг-АТРазу.

Исследование влияния полярности буфера на активность апи-оачувствительной АТРазы было продемонстрировано в ряде рабо? (Gassnar • and Кошм ok ,1081; Bomanoin et al,1980; Kaon et al 1381). Авторами отмечена зависимость аффегаа активации анионами АТРавной активности от концентрации буфера. Выявленная нами С1:акпшзруешя lfe-АТРавная активность проявляла аналогичную чувствительность во всех трех исследованных буферах (трис-гдицшовцй, трис-Нг SO*,, трнс-HEPES) - увеличение ¡сэдаггт-рацнн буфера (с Б до 30 иМ). вызывало подавление эффекта активации шпюнон.что согласуется с даппши полученными другиьш авторами (Gassner and Kpirniok ,1S81).Наиболее опткызльпьаг оказался трис-глициновый буфер.

Исследование ионного детергента тритона Х-100 на даяныэ АТГазнш активности показало, что если чувствительная к фуросе-миду Ме-ЛТРазная активность исчезала после обработга 0,1 z де-тергонтои, то в 0,5 X растворе тритона-активность СРактирируе-мой АТРааы возрастала в 2 раза. Анализируя эти дешше.а тага® морфэлогию етого препарата, полученного при 25 ООО. кратное увеличения: па электронном цикроскопе.шшю заключить,что фрагьеип мембран, образовавшиеся при гомогенизации ткани в силу своих размеров и физико-жшнчееюгх свойств замкнулись в везикулы.а при концентрации тритона 0,5 2 произошла полная солкбшшзацшг атих структур, и активные центры исследуемой АТРазы, обращенные внутрь везикул, стали доступны субстрату. . ^

Зная кинетические свойства АТРааных активностей, которые, по нетему предположению, шгут участвовать в транспорте ионо]

- IB -

хлора, '¿и исследовали АТР-вависише накопление ыэчэного хлора ( Mas6CI) фрагедюй, сбогапрнгой плазматическими шмбранают (рис. 4).

Pise. 4. Влияние АТР (а) а МгАТР (б) на поглофпие меченого NaseCl фракцией плазматических иеибраи из обонятельной вдатилки карпа.

Сходство ряда кинетических параметров этих двух процессов,тачях как сродство' к субстрату, зависимость от шгння.а так-л@ ингибирование фуросемидом и SITS,дает основание считать, что транспорт хлора связан с СI-активируемой АТРааой.а тага® с високо- чувств гггелыгай к фуросемиду Ь^-АТРазной активностью. Последпее предполо кепке основано на том факте, что при достаточно высоких концентрациях АТР и IfeSO« в инкубационной среде происходит процесс накопления леченого хлора. Это указывает на участие в этом процессе исследуемого АТРазного комплекса.

- 16 -

Известно,что обонятельный эпителий .животных представляет собой гетерогенную ткань,содержащую как рецепторные.так и эпителиальные клетки(Брокшгейн,1959). Поэтому,естественно.возникает вопрос о месте СI-активируемой и фуросемид-ингибируемой 1&АТРагы в обонятельной выстилке рыб. С помощью метода ретроградной дегенерации(Такаг1,Yaj lira ,1364) нам удалось показать, что после перерезки аксонов происходит как уменьшение общей

АТРазной активности в обонятельном эпителии ^ор^ли, так и исчезновение чувствительной к фуросемиду i^-АТРааы, ч?о косверю моют указывать на принадлежность CI-АТРазы к щНуопам обонятельной выстилки.

2. Кинетические свойства Ыг-АТРазной активности в лабрах тиляпий,акзшамрованных к различной солености.

Ш результатам наших исследований,фуросе^зд при кратковременном воздействии снижает экскреции ионов хлора жабрами тиляпий. При анализе ионного состава плазмы тиляпий из морской

воды, подвергавшихся 6-часовому воздействии фуросемида.установ-

- ■ '

лено, что не только повышается содержание ионов хлора, но к изменяется метаболизм натрия,калия и воды. Известно,что большая часть декретируемого хлора сопряжена с выведением натрия, которое осуществляется Nä.K-ATPaacft. Так как фуросемид з наших опытах не ингибировал Na, К-АГРазу, можно предположить. что этот диуретик, оказывающий столь существенное действие на водно-солевой обмен морской рыбы,влияет на процессы,связанные непосредствен- . но с транспортом хлора (Gassner and Kotnnick ,1981).

Анализ обвдей Mj-АТРазной активности показал, что ферментативная активность у рыб из соленой вода (33 %») снизилась на

- 17 -

30% по сравнения с рыбами из пресиой.

В среда гап^бации.где присутствовало 3 мМ магния и 3 мМ АТР,исследуемые анконы,в том числе и хлор,вызывали только епн-кение Кг-АТРазкой активности жабр обета групп тнляпий. Однако, Мг-АТРазы из аабр тиляпий.аккдимированных к низкой и высокой соленостям,существенно различались по чувствительности к Фуро-семиду и pH среды инкубации. Более того,иигибироаание Мг-АТ?-азы фуросешдсм возрастало в присутствии конов хлсра.Ото? эффект зависел от концентрации хлора в инкубационной среде и наблюдался только у тиляпий га среды с высокая соленяостьа. Суцгствешшм фактом является и то, что тноциаяат не затрагивает »шгибируемую фуросемздом },&-АТРазу жабр тиляпий(рН»7.5).

J-йходя кз этих дaimux модно прздпологяггь.что влияние узэ-лгееши концентрации как протонов,так и ОН-групп из С1гактивн-руемую,фуросешд ингибируему» У^-AT Разу момзт бить обусловлено либо юдификацией белковой молекулы данного фермента этими ионами, либо вовлечением их в ко-траиспортньй cPOHluni С 1-Я* процесс „который наблюдали в юшке у ¿ooocn.Salno gairdne-ri(Aguenaou Hassan et al,1909). Однако, в настояцзо время пет данных о том, что этот процесс, также как и Ná/K?cr кс-транспортный процесс, мойв? совершаться транспортной АТГаэой.

Что ие касается зияния анионов в этих условиях среда инкубации (3 мУ Mg и 3 Uli A'¿?) »то ни один из всего ряда исследуемых ионов не «созывал активирующего действия. Hö„ меняя среду инкубации,т. е. используя низкую ыолярность трис-глицинового буфера с рй-8,5,а тага® различные концентрации субстрата в виде АТР и ifeATP» нам удалось наблюдать стимуляцию ионами хлора Ыг-АТРагпой активности( Km -1.6 мЫ) у рыб из среды с вы-

сокой оолааостых У тнляпий «9 пресной поды Ыг-АТВава проявляла те до свойстве.что и анионная АТРаэадаСр карпа (рис.6).

1 г ■ [М}ДГР],иМ

^ 7

Se

а

» г i

[MJATPIHH

Рис. 5; Зависимость АТРаэной активности от концентрации • UjATP Kaöp Т1шпий,ак1ш1мир0ванпш к соденой(а) и пресной(б) воде.1-в присутствии 30 ».AI ионов хлора в инкубационной среде,2-и отсутствии ионов хлора '

У тидяпий иг соленой воды ферментативная акишиосгь. CI-АТРааы возрастала при увеличении концентрации ионов хлора, достигая максимальной активности - 5 ыкиоль Pi/иг белка час-при 100 Uli холина хлористого. Есе это указывает на. сулрствование Cl-АТРазы в жабрея тиляпий. адаптированных к высокой соленности.

. - 19 -

и ее участие в поддержании гоиеостаэа организма (рис.6).

» '.....

го АО во &о т [СГ],кп

Рис. 6. Езвиеиюсть АТРзвной активности от концентрации конов хлора в кадрах тштпий.егашшированных к соленой (1) и пресной (2) воде.

Луня к кзстсяеззыу времени накопилось значительное (солн-чзстзо работ,в которых исследовалась анион-чувствительная АТР-сза а япберяых экстрактах. у рыб, аккяинироваяных как к пресной водэ.шс и и морской (Kestetter and Klrschner,lS74;Ho and Chan, 1SB0; Nson et al,iSBl j Battram J.C. ,1S87; Реэнкс и др. ,1986; Solomon & J. et al ,1S75) .доказательств того, что она участвует в ссморегудпцш! при солевых нагрузках не имеется. В этих работах пгблэдаяись пеэначагтельныэ различия в активации Щ-АТРаэы юз жзбр.рьй,адаптированных к различной солеяяоети, конами хлора й бикарбоната. НЬ обнаруженные различия (Резник JLE и др., IS8S) устранялись после солябияизации фермента тритоном Х-100,

в отлично от Ма, К-АГРезы, активность которой зависит от солености, когда возрастает • нагрузки на выкачивание из клетки.

В наших опьпгах С1гактизируемая Мг-АТ'Раза появлялась уж через 24 часа после помещения рыб в соленую воду и в даль-нейвец ее активность оставалась стабильной (рис.7).

Рис. 7. Динамика изменения чувствительности 1&-АТРазц в мзбрах тиляпий в период адаптации к соленой воде к ионам хлора (а) и б!карбонага (б). 1 -в присутствии 30 ыЫ ионов.хлора в инкубационной среде ,2-з присутствия 30 ыЫ конов бикарбоната, 3-в отсутствии ионов.

Ориентируясь на гипотезу,предполагающую участие анионных АТРаз в 017НС03 обменном процессе,нами было исследовано влияю® • КСОз на ]>%-АГРазу жабр тиляпий, шшапфовашшх к соленой воде. Как и в случае с ¡¿е-АТРазкой активностью, выявляемой в обонятельной выстилке.' карпа, активирующий аффект хлора не зависел от бикарбоната- - : ■

- 21 -

Все это позволяет нам говорить о существовании в жабрах тиляпий.аккдимированных к высокой солености, С1гактивируе1*зго !,'3-АТРазного комплекса, состоящего как из наблюдаемой Mg-AT Разной, так и анион-активируемой активностей. Он слабо чувствителен к бикарбонату и тиоцяанату. В то ж время этот фермент по ряду кинетических свойств отличался от CI-активируемой АТР-азы из обонятельной выстилки, в частности, в отношении к бициклофосфату, к которому он оказался не чувствителен в исследованных концентрациях.

Таким образом,кинетический и эффегаориый анализ (действие субстрата, анионов, рН и юлярноать буферных систем, SH-pea-гентов,диуретиков, блокаторов CI-каналоз) позволяют выявить а кзмбраниых везикулах обонятельной выетгаки и кгбр рыб сходство трех регистр!груешх параметров : 1)фуросемид-чувствительную Ы> -АТРазу;2)С!гакпшируемую Мг-АТРазу;3)АТР-вависи1Шй захват меченого^! в ш»,йрашша везга^улы. Но.тао полагать, что все три параметра являются элементами единого полифункционалыгаго белка-вого олигомгрксго мембранного комплекса CI-аюттируемой АТРазы, состоящей из каталитической субъедкшцы, гидролизукцзй АТР, и сопряженного С1гканала,при этом энергия гидролиза АТР в боль-сой степени может расходоваться на процесс "открытия" CI-кана-да, чем на сам кокопергносяций процесс (возшгяшм доказательством сопряженности АТРазы и канального, или ионообменного устройства, является чувствительность обоих элементов к фуросеми-ду).Единая система СI-активируемая Мг-ЛТРаза/хяориьй какал или кошюобменкик по-разному регулируется а обонятельной выстилке и кабрах.Описаны условия разобщат СРакгизируемой АТРазы и фу-росемид чувствительной 1й-АТРавы( действие детергентов и выявление оптимума рН).

выводы

. 1. Обонятельный эпителий карпа,в отличие от лягупки, содержит С1:активируеыую Ыг-АТРазу, активность которой в неочищенной фракции плазматических мембран (ШО составила 6,0 + 0,8 мшоль Pi/ч на 1 ыг белка.

2. Субстратом для СРакгивируемой.-^-вависимой Мг-АТРаа-ной реакции,обнаруженной в обонятельном эпителии карла,может быть как АТР, так и Mg-ATP.

3. С1:йктивируамая Mg-АТРазная активность высоко-чувствительна к фуросемиду(К1 -0,16 Ш) и, Сициклофосфату ( 0,03 мУ).

4. Везикулярная Форш фракции плазматических мембран иг обонятельной выстилки карпа способна к АТР-зависиьгаыу трансаорту Na3eCI. ■

5. Ретроградная дегенерация обонятельных рецепторных клетои рыб приводит к снижении сбя,ей ife-АТРаэкой активности и исчезновение высоко-чувствительной к фуросемиду lig-ATPaa

6. В дабрах тиляпий, акквшироваяных к гиперосмотичной среда (33 ,в течение суток появляется CI-активируемая Ife-АГРаза,'

?. Кинетические свойства СРакгивируемых АТРаз в обонятельной выстилка карпа и з жабрах таший га гипероош-тичной среды различны в отношении к NaSCN к бицикло-фосфагу.

8. Высказывается гипотеза о локализации в мембранах! клеток обонятельной выстилки н жабр рыб единой сопряженной по-лифункцноналыюй системы - СI-активируемая Mg-ATPaaa и хлорный канал.

СПИСОК ОПУБШОБАШЫХ РАБОТ Ш TUS ДЙССЕРШШ.

1. Шизиков С. А. .Гдовский а А. Хгораготгаируешя АТРзза га обонятельной выстилки кпрася // Бпогогпя внутренних вод: Информ. бия. Л.-1889. N83.-а 62-6®.

2.Менэиков С.А. .Гдовскяй НА. Впшшш фуросемнда на l^-АТРазу из обонятельной выстилки карпа // Отав- . ШЯ. -1990. -Т. 55, Н4. - С. 754-757.

агдовский П. А.,Шизиков С. А. .Рухянская Е а Тревяжор* шза в обонятельном эпителии пресноводных ностястах pis5 // Тез. докл. X Всесоюзного совеганпя по аволгцгошяа логии.посвяадзнноэ памяти акадеияка Л. А. Орбэла. -&шштр2д, 1SSO.- С. 55-56.

4. Гдовский Е А. .Руззтская ILE .Ызнзгашв С. А. Ионный состав слизи обонятельного эпителия пресноводных костистых рыб // Ж. эвол. биохиц. н физиох - 1991. - Т. 27,1(1. - С. 13-18.

5. Гдовский Е А., Мэпзиков С. Л. Виляние Фуросеьщр. па зяе-крещт хлора и Цг-АТРазу аабр тллзшнй //Еяогогпческпв пауКИ. -1991. ,Н1. - С. 38-45.

6. Шизиков С. А. .Гдовский П. А. .Глебов Р. Е „Ребров И. Г. АТР-зависимый транспорт хлора в обонятельной виствдкг карпа // Биохимия. -1991. -Т. 56, Кб. - С. 995-998.

7. Гдовс!шй П. А., Ыензигеов С. А., Руяинсиая П. Е Роль попов хлора и CI-активируекой fcfe-ATPaau в электрогенеэе сбопя-тельного рецепторного потенциала у пресноводных риб //

' Сенсорные системы. -1992. -т. 6, КЗ. - с. 92-95.

--

Печ.л. I. Тирад 100. 3. IS68. ЛИ.