Молекулярные механизмы регуляции продукции оксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки

Николаева, Светлана Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции продукции оксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции продукции оксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки"

На правах рукописи

НИКОЛАЕВА Светлана Дмитриевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЛЯГУШКИ

03.01.04 - Биохимия

4855103

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 СЕН 2011

Санкт-Петербург 2011

4855103

Работа выполнена в лаборатории физиологии почки и водно-солевого обмена Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Парнова Римма Германовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Крутецкая Зоя Иринарховна

доктор биологических наук Шпаков Александр Олегович

Ведущее научное учреждение: Учреждение Российской академии

Защита диссертации состоится «11» октября 2011 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44).

Автореферат разослан « Об » сентября 2011 г.

медицинских наук

исследовательский

Научно-институт

экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оксид азота (NO) является важнейшим ауто/паракринным регулятором огромного спектра физиологических реакций. Низкомолекулярное неполярное соединение N0 способно быстро диффундировать и свободно проникать через плотные клеточные слои и межклеточное пространство, не требуя специальных переносчиков. Внутриклеточные эффекты N0 включают в себя (А) его связывание с гем-содержащими белками, из которых наиболее важное значение во внутриклеточной сигнализации имеет цитозольная гуанилатциклаза, (Б) нитрозилирование различных белков, что приводит к изменению их функциональной активности, (В) образование активных форм кислорода и азота [см. обзоры Stamler, 1994; MacMicking, 1997; Liu & Huang, 2008] и др. Эндогенный NO образуется в организме при ферментативном окислении аминокислоты ¿-аргинина. Эта реакция катализируется ферментом NO-синтазой (NOS), для которой известны три изоформы: нейрональная (nNOS, NOS1), первоначально обнаруженная в нейронах центральной и периферической нервной системы; эндотелиальная (eNOS, NOS3), впервые идентифицированная в клетках эндотелия кровеносных сосудов; и индуцибельная (iNOS, NOS2), которая, в отличие от nNOS и eNOS, как правило, не экспрессируется постоянно, а индуцируется в клетках различных типов в ответ на действие патологических стимулов. Изоформы NOS различаются аминокислотной последовательностью, молекулярной массой, локализацией в органах и тканях и механизмами, регулирующими их экспрессию и активность.

Образующийся при участии NOS оксид азота обладает крайне разнообразным биологическим действием, играя важную роль в различных физиологических процессах, таких как поддержание тонуса сосудов, воспалительный и иммунный ответ, нейротрансмиссия, модуляция ионных каналов, агрегация тромбоцитов, секреция ренина, ангиогенез и др. [см. обзоры Bredt, 1994; Reid, 1995; MacMicking, 1997; Ziehe 2000; Garthwaite, 2008; Kolluru, 2010]. Конститутивные NOS обеспечивают участие NO в процессах внутриклеточной сигнализации, опосредованных, главным образом, активацией цитозольной гуанилатциклазы и увеличением уровня цГМФ. Функция iNOS преимущественно связана с участием образовавшегося NO в воспалительных реакциях и обеспечении неспецифической иммунной защиты [Dai et al., 1995; Calza et al., 1997]. Токсическое действие NO на бактериальные патогены основано на его взаимодействии с активными формами кислорода, нитрозилировании различных реакционно-способных групп и других механизмах, что приводит к повреждениям белков, ДНК и липидов бактериальной клетки [Fang, 1997]. Наиболее эффективными индукторами iNOS, стимулирующими транскрипцию гена, являются цитокины (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей, у-интерферон), а также бактериальные липополисахариды (ЛПС) - компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий [Ziesche et al., 1996; Galea, Feinstein, 1999; Kleinert et al., 2003].

Большой объем существующей информации свидетельствует о наличии огромного разнообразия механизмов регуляции образования NO. К ним

относится регуляция уровня экспрессии NO-синтезирующих ферментов, их различные постгрансляционные модификации, Са2+/кальмодулин-зависимое изменение активности NOS, наличие кофакторов, доступность субстрата, регулируемая как на уровне поступления аргинина в клетку, так и изменением активности ферментов, конкурирующей с NOS за общий субстрат [Копе, 2000; Closs et al, 2000; Mori, Gotoh, 2000; Li, Poulos, 2005]. Наиболее полно регуляция образования NO и механизмы его физиологического действия исследованы в клетках нейронов и глии [Espluques, 2002; Saha, Pahan, 2006], эндотелии сосудов [Fleming, Busse, 1999; Sessa, 2005] и в различных типах макрофагов [Mori, Gotoh, 2004; Kobayashi, 2010]. Эпителиальная ткань представляет большой интерес в отношении регуляции продукции NO и его физиологической роли, так как эпителии являются первым барьером на пути проникновения бактериальных патогенов и помимо этого выполняют присущие каждому типу данной ткани специализированные функции. Тем не менее, данные по эпителиальной ткани в отношении способов регуляции образования NO и разнообразию экспрессируемых изоформ NOS немногочисленны.

Данная работа посвящена исследованию регуляции продукции NO в клетках осморегулирующего эпителия, специализированного на поддержании водно-электролитного баланса. В качестве экспериментальной модели были выбраны изолированные эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки -классического объекта, используемого в изучении механизмов гормональной регуляции транспорта воды. В основе интереса к этому объекту лежит функциональное сходство и общность молекулярных механизмов, обеспечивающих действие антидиуретического гормона (АДГ) на реабсорбцию воды в эпителии мочевого пузыря бесхвостых амфибий и собирательных трубок почки млекопитающих [Наточин, 1983; Hasegawa et al., 2005; Uchiyama, Konno, 2005]. Имеющиеся данные свидетельствуют о несомненной роли NO в механизмах регуляции водного транспорта. Так, на перфузируемых фрагментах собирательных трубок почки крысы и изолированном мочевом пузыре лягушки было показано, что доноры NO вызывают снижение действия АДГ на увеличение осмотической проницаемости [Garcia et al., 1996; Fock et al., 2004; Klokkers et al., 2009]. Есть данные, что ингибирующее действие простагландина Ег на АДГ-стимулированную осмотическую проницаемость обусловлено ЕР1-рецептор-опосредованной мобилизацией Са2+, которая приводит к увеличению продукции NO [Bachteeva et al., 2007].

Важной предпосылкой проведения данной работы является тот факт, что мочевой пузырь амфибий может быть колонизирован грамотрицательной бактериальной флорой, главным образом, представителями семейства Enterobacteriaceae [Hutchinson, Porter, 1972], эндогенное присутствие которых рассматривается как одна из причин низкого эффекта АДГ на увеличение осмотической проницаемости [Лаврова и др., 2011]. Совокупность этих данных позволяет предполагать наличие в эпителии мочевого, пузыря лягушки как конститутивных NOS, участвующих в осморегуляции, так и iNOS, обеспечивающей неспецифическую иммунную защиту.

Целью исследования было изучение молекулярных механизмов, участвующих в регуляции продукции NO в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки Rana temporaria. В данном исследовании рассматривались два аспекта регуляции синтеза N0 изучаемыми клетками: (1) регуляция экспрессии фермента и (2) регуляция NO-синтазной активности за счет доступности субстрата. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать изоформы NOS, экспрессируемые эпителиальными клетками мочевого пузыря лягушки.

2. Оценить влияние ЛПС Е. coli на экспрессию iNOS и продукцию N0 изучаемыми клетками. Исследовать возможность экспрессии TLR4, рецепторов ЛПС, в эпителиальных клетках.

3. Исследовать роль циклооксигеназы и продуктов ее каталитической активности в регуляции экспрессии NOS и продукции NO.

4. Охарактеризовать кинетические параметры транспорта L-аргинина и изучить влияние ЛПС на активность транспортера.

5. Оценить активность аргиназы, использующей аргинин в качестве субстрата катализируемых ею реакций, и выявить экспрессию отдельных изоформ фермента в изучаемых клетках. Исследовать участие аргиназы в регуляции активности NO-синтазы.

Научная новизна. Впервые была выявлена NO-синтазная активность в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки и показана экспрессия нейрональной и индуцибельной NOS в изучаемых клетках. Впервые определена и проанализирована нуклеотидная и аминокислотная последовательности участка iNOS у данного вида. Впервые была показана способность клеток эпителия мочевого пузыря лягушки экспрессировать TLR4, рецептор бактериального ЛПС, и отвечать на ЛПС рецептор-опосредованным усилением экспрессии мРНК, белка iNOS и увеличением продукции N0. Доказано, что экспрессия iNOS в данных клетках критично зависит от активности циклооксигеназы.

Впервые на клетках осморегулирующего эпителия охарактеризованы особенности входа ¿-аргинина, его кинетические характеристики, установлена зависимость входа аргинина от натрия, что позволило отнести его к транспортерам катионных аминокислот системы у+. Для данного типа клеток было впервые показано, что вход аргинина в клетку стимулируется ЛПС и зависит от уровня активности индуцибельной NOS.

Впервые показано, что клетки осморегулирующего эпителия обладают относительно высокой аргиназной активностью, которая обеспечивается экспрессией аргиназы II. Для данного типа ткани были впервые продемонстрированы конкурентные отношения двух ферментов — NOS и аргиназы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки экспрессируют нейрональную и индуцибельную NOS.

2. Эпителиальные клетки отвечают на бактериальный ЛПС TLR4-опосредованным усилением экспрессии iNOS и продукции NO. Экспрессия iNOS критично зависит от активности циклооксигеназы и продукции ПГЕ2.

3. Дополнительная регуляция синтеза N0 в эпителиальных клетках осуществляется на уровне модуляции доступности субстрата NOS - L-аргинина, а именно посредством изменения активности транспорта аргинина в клетку и конкуренции аргиназы и NOS за общий субстрат.

Теоретическая и практическая значимость. Исследование имеет фундаментальное значение для понимания механизмов регуляции биосинтеза NO в эпителиальных тканях, механизмов развития неспецифического иммунного ответа и роли N0 в поддержании водно-солевого баланса, что имеет большое значение для разработки новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний выделительной, сердечно-сосудистой и других систем организма человека и животных, а также для разработки методических подходов в диагностике этих заболеваний. Работа представляет также большой интерес для эволюционной и сравнительной физиологии. Полученные результаты могут быть включены в курсы лекций по физиологии и биохимии для студентов биолого-почвенного и медицинского факультетов Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербургского медицинского университета и других вузов.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов (Санкт-Петербург, 2005), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на XIII Международном совещании и VI Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008), на XX и XXI съездах Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 05-04-48899, 08-04-00837), Министерства науки и образования (грант 14.740.11.0918).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 6 из которых-статьи в рецензируемых журналах, 7 — тезисы докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 10 отечественных и 202 зарубежных источников. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 46 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили на самцах травяной лягушки Rana temporaria L. в период с октября по май. Лягушек отлавливали в естественных условиях зимовки (на дне незамерзающих проточных водоемов) и содержали в лаборатории при температуре +5°С в емкостях, на 1-1.5 см заполненных водой.

Выделение и культивирование эпителиальных клеток мочевого пузыря. Внутреннюю полость мочевых пузырей у обездвиженной разрушением спинного мозга и вскрытой лягушки заполняли раствором, содержащим (в мМ): NaCl 85, KCI 4, NaHC03 17.5, КН2Р04 0.8, глюкоза 2, ЭДТА 2 (рН 7.6) (раствор «А»), Пузыри перевязывали, извлекали и помещали в раствор того же состава на 45 мин в условиях интенсивной аэрации. Мукозные растворы, содержащие клетки, центрифугировали 10 мин при 100 g. Клетки промывали в растворе «Б» (в мМ: NaCl 85, КС1 4, NaHC03 17.5, КН2Р04 0.8, MgCl2 0.8, глюкоза 2, СаС12 1.5), содержащем 40 мкг/мл гентамицина. Изолированные клетки культивировали в модифицированной по осмоляльности среде L-15 с добавлением гентамицина при +23°С. Клетки эпителия сохраняли жизнеспособность в таких условиях до нескольких суток.

Определение содержания нитритов в культуральной среде. Концентрацию нитритов в культуральной среде определяли по методу Грисса с использованием растворов 1%-ного сульфаниламида и 0.1%-ного К[-(1-нафтил)-этилендиамина, приготовленных в 2.5%-ной ортофосфорной кислоте [Green, 1982]. Оптическую плотность измеряли на планшетном ридере при длине волны 540-570 нм. В качестве стандартов использовали растворы нитрита натрия, приготовленных на модифицированной среде L-15.

Исследование активности NO-синтазы в гомогенате эпителиальных клеток. Клетки гомогенизировали в буфере, содержащем (в мМ) Tris-HCl 50, ЭДТА 1, ДТТ 1, глюкоза 5, PMSF 1 с добавлением 10 мг/мл пепстатина А и 20 мг/мл леупептина (рН 7.5). Гомогенаты клеток центрифугировали 15 мин при 12000 g. К 10 мкл супернатанта (60-100 мкг белка) добавляли 40 мкл реакционного буфера, содержащего 50 мМ HEPES, 1мМ ДТТ, 1.25 мМ СаС12, рН 7.5, а также кофакторы (1 мМ НАДФН, 10 мкМ ВН4, 1.25 мкг/мл кальмодулина, 10 мкМ ФАД) и 0.5 мкл [3Н]-£-аргинина (исходный раствор: 1 мКи/мл, специфическая активность 68 Ки/ммоль, Amersham). Полученную смесь инкубировали 1 час при 30°С. Реакцию останавливали добавлением 250 мкл холодного (+4°С) буфера, содержащего 100 мМ HEPES, 25 мМ ЭДТА (рН 5.5), и помещали на лед. Активность NOS определяли по количеству [3Н]-£-цитруллина в реакционной смеси. Для разделения цитруллина и аргинина к пробам добавляли 125 мг ионообменной смолы DOWEX® 50WX-8, через 10 мин пробы центрифугировали и отбирали супернатант. Радиоактивность в супернатанте измеряли на р-счетчике (LKB 1209/1215 Rack-Beta).

Определение активности NO-синтазы и аргиназы в суспензии изолированных эпителиальных клеток. Эксперименты проводились на клетках, инкубированных в течение 21 часа, а также на свежевыделенных клетках. Каждая проба содержала около 2*106 клеток. Клетки смывали с лунок культурального планшета, переносили в пробирки, дважды отмывали от среды раствором «Б» и ресуспендировали осадок в этом же растворе. Исследуемые ингибиторы добавляли за 20 мин до внесения аргинина. К суспензии добавляли смесь радиоактивного аргинина и «холодного» аргинина из расчета достижения концентрации аминокислоты в пробах 200-250 мкМ. Пробы инкубировали в течение 45 мин при 25°С, реакцию останавливали добавлением холодного 2 мМ

аргинина на растворе «Б». Клетки осаждали центрифугированием, промывали 1 мМ аргинина, лизировали в 30 мкл лизирующего буфера (50 мМ Трис-НС1, 4 мМ ЭДТА, рН 7.5) и центрифугировали. Аликвоту супернатанта наносили на силикагельные пластинки с алюминиевой подложкой (Merck, Германия) и подвергали хроматографическому разделению в системе этанол : аммиак (10:15, по объему). Зоны, соответствующие L-цитруллину и £-орнитину, вырезали, аминокислоты элюировали водой и определяли уровень радиоактивности. Оценка активности NOS производилась по накоплению [3Н]-£-питруллина, а аргиназы - по [3Н]-£-орнитина.

Определение параметров транспорта ¿-аргинина. Для измерения входа ¿-аргинина в клетки суспензию подготавливали так же, как и для определения NO-синтазной активности. Концентрация «холодного» L-аргинина составляла от 0 до 250 мкМ. После инкубации клеток в течение 5 мин при 25°С включение радиоактивного аргинина в клетки останавливали добавлением двух объемов холодного (+4°С) раствора «Б», содержащего 2 мМ нерадиоактивного аргинина, затем клетки центрифугировали (10 мин, 100 g), осадок промывали раствором «Б», содержащим 1 мМ аргинина, клетки лизировали и определяли уровень радиоактивности в супернатанте.

Измерение активности аргиназы в гомогенатах тканей и клеток. Активность аргиназы определяли по модифицированному методу, приведенному в работе [Corraliza et al., 1994]. Фермент активировали, выдерживая аликвоту гомогената с содержанием белка около 100 мкг в течение 10 мин при 55°С в присутствии 1 мМ МпС12. Реакцию инициировали внесением аргинина в конечной концентрации 250 мМ, проводили при 37 °С в течение 1 часа и останавливали добавлением 4х-кратного объема смеси H2SO4 : Н3РО4 : НгО (1:3:7. по объему). После остановки реакции к пробам добавляли 25 мкл 9%-ного спиртового раствора а-изонитрозопропиофенона, выдерживали 45 мин при 100 С и после охлаждения измеряли в них оптическую плотность на планшетном ридере при длине волны 570 нм. В качестве стандартов использовали растворы мочевины. Данные выражали в нмоль/мг белка/мин.

Иммуноблоттинг. Экспрессию исследуемых белков в пробах, содержащих лизат клеток или гомогенат тканей, оценивали методом иммуноблотганга. Белки, выделенные из лизатов разгоняли на SDS-PAGE, затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали антитела anti-uNOS (1:500, Affinity Bioreagents), anti-nNOS (1:500, Affinity Bioreagents), anti-arginase-II (1:300, Abcam), anti-TLR-4 (1:750, Abbiotech). Для визуализации результатов использовали систему ECL (Amersham Biosciences). Уровень экспрессии специфических белков был скорректирован по сигналу а/р-тубулина. Измерение концентрации белка в лизатах проводили по методу Брэдфорд.

Обратная транскрипция — полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

Эпителиальные клетки или ткань мочевых пузырей гомогенизировали в Trizol'e и выделяли РНК согласно протоколу производителя (Sigma). Чистоту полученных препаратов РНК определяли разделением на 1%-ном агарозном геле. ОТ-ПЦР с праймерами, специфическими к ¡NOS и GAPDH, проводили,

используя набор реактивов Titan One Tube RT-PCR system (Roche), согласно протоколу производителя. Продукты ПЦР анализировали в 2%-ном агарозном геле. Специфические праймеры были сконструированы с использованием программы Primer3. Принадлежность ПЦР-продуктов к ¡NOS и GAPDH подтверждали секвенированием.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывались статистически по парному и непарному t-критерию Стьюдента. Данные представлены в виде среднего арифметического ± полуширина доверительного интервала для среднего значения. Достоверными считались отличия при уровне значимости р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Идентификация изоформ NOS, присутствующих в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки. Оценивая накопление нитритов в культуральной среде и продукцию [3Н]-Х-цитруллина изучаемыми клетками при добавлении радиоактивно-меченного субстрата, мы показали, что эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки обладают NO-синтазной активностью. Наиболее интересным представлялся вопрос, какие изоформы NOS присутствуют в изучаемых клетках. Известно, что в собирательных трубках почки млекопитающих экспрессируются все три изоформы NO-синтаз (эндотелиальная, нейрональная и индуцибельная) [Копе, 1997; Wang et al., 1998; Chen et al., 2002; Martin et al., 2002]. Мочевой пузырь бесхвостых амфибий функционально сходен с собирательными трубками почки млекопитающих, поэтому можно было ожидать, что в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки также экспрессируются несколько изоформ фермента. Для определения изоформ NOS мы использовали различные подходы: исследование кальциевой зависимости активности фермента, применение селективных ингибиторов конститутивных и индуцибельной изоформ, иммуноблоттинг с использованием специфических и универсальных антител, ОТ-ПЦР.

7-нитроивда'ЮД

150 кДа 135 кДа

1<Г

[ингибитор], M

Рис. 1. Влияние ингибиторов NOS на накопление нитритов в культуральной среде за 21 час инкубации (А); иммуноблоттинг лизата клеток с универсальными антителами uNOS (Б). * - р<0.05, ** - р<0.01, # - р<0.001 по сравнению с контролем, п=5.

Исследование зависимости активности фермента в гомогенатах свежевыделейных клеток от присутствия Са2+ показало, что в бескальциевой среде активность NO-синтазы, определяемая по продукции [3Н]-£-цитруллина, угнеталась лишь частично: контроль - 1271 ±115, бескальциевая среда+ЭДТА - 1 405 ± 197, Z-NAME (1 мМ) - 228 ±174 cpm/мг белка/мин. На основе этих данных можно предположить присутствие как Са2+-зависимых (конститутивных), так и Са2+ -независимой (индуцибельной) изоформ NO-синтазы. I

Наше предположение подтвердилось в экспериментах с исследованием i действия селективных ингибиторов конститутивных и индуцибельной NOS на накопление нитритов в культуральной среде за 21 час инкубации клеток. Накопление N02~ тормозилось в присутствии 7-нитроиндазола (ингибитор nNOS и eNOS) и 1400W (7У-[3-(аминометил)бензил]ацетамид, ингибитор iNOS) в концентрационном диапазоне 10-200 мкМ и 5-50 мкМ, соответственно (рис. 1, 1 А). Методом иммуноблоттинга с антителами anti-uNOS мы показали присутствие нейрональной и индуцибельной изоформ (рис. 1, Б). I

лягушка курица человек свинья

морская свинка мышь крыса акула

золотая рыбка рыбка данно рсрио форель

лягушка курица человек свинья

морская свинка мышь крыса акула

золотая рыбка рыбка длнно рерно форель

Рис. 2. Выравнивание аминокислотной последовательности участка iNOS лягушки и iNOS различных животных с использованием программы Clustal W. Последовательности белков были взяты из базы данных GenBanL Accession 1 numbers: человек, Р35228, курица, Q90703, мышь, Р29477, крыса, САВ46089, I свинья, NPJ001137162, морская свинка, 054705; форель Oncorhynchus mykiss, I AJ295230; кошачья акула, ААХ85385; золотая рыбка Carassius auratus I ААХ85387; рыба Danio rerio, ABY51620.

Экспрессия мРНК iNOS была подтверждена методом ОТ-ПЦР. Праймеры i подбирали к консервативным участкам гена после сравнения известных , нуклеотидных последовательностей генов iNOS различных животных. Анализ последовательностей показал, что наиболее консервативным участком гена iNOS, при этом отличающимся от последовательностей конститутивных 1 изоформ, является участок, содержащий часть оксигеназного домена, | полноразмерный кальмодулин-связывающий домен и часть редуктазного

10 I

YQIDAWKTHVWHDESRKPKKKEFKLSVIAKAVFFASLLVRKSMAARIKATILYATETGKS YQVDAWKTHIWHDETRR PKKREIKLSILAKAVLLASLLLQKTMAARPKVTVIYATETG KS YQVEAWKTHVWQDEKRRPKRREIPLKVLVKAVLFACMLMRKTMASRVRVTILFATETGKS YQVEAWKTHVWQDEKRRPRRKEIRFKVLVKAVLFAAVLMHKTMAARVRATILFATETGRS YQVEAWCTHVWQDETRRPKRREIPFRVLAKA.TLFASLLMRKMMASRVRATILF ATETTGKS YQIEPÎKTHIWQNEKLRPRRREIRFRVLVKWFFASMLMRKVMASRVRATVLFATETTGKS YQIEPWKTHIWQDEKLRPRRREIRFTVLVKAVFFASVLMRKVMASRVRATVLFATCTGKS YQVDAWKTHVWHDE SKRPKKNEITFKHLALAALFS SVLMRKTMAKRTKATILYATETGKS YQPDPWLTHKWKDKKRMERRHAISFKGLIRWLFSQTLIKSALAKRVRCTVLYATETGKS YQPEAWJTHF^ÎKDKKRKASRCTISFKGLIRVVLFSQALIKLAMAKRVRCTVLYATETTGKS YQHDPWMTHVWRNGEMCLKKHQISFKAVARA7\LFSSTLMSRVLAKRVRCTVLYATETGKS

ETLARKLHTLFS FAFKTKVICMQDYNIS NLDKETLLL WTSTFGNGDCP GNG E SF 116

ETLANSLCSLFSCAFNTKILCMDEYNISDLEKETLLLWTSTFGHGDSPNNGKTL 605

EALAWDLGALFSCAFNPKVVCMDKYRLSCLEEERLLLWTSTFGNGDCPGNGEKL 599

ETLARDLGALFSCAFNPKVLCMDEYRLSRLEEEQLLLWTSTFGNGGSPGNGEKL 602

EALAQDLGALFSCAFNPKVLCMDQYQLSSLEEEKLLLWTSTFGNGDCPGNGETL 604

EALARDLATLFSYAFNTKWCMDQYKASTLEEEQLLLWTSTFGNGDCP SNGQTL 512

EALARDLAALFSY7\FNTKVVCMEQYKANTLEEEQLLLWTSTFGHGDCP SHGQTL 602

ETLAKKLRTLFNGAFDAKVVCMDDYDLNNLSKESLVLWTSTFGHGDSPGWGEVF 593

QTFAKKLNTMMNCAFSSRVICMEDYNFSELEKESLLIWTSTFGHGDCPGNGESF 602

QTFAKKLNGIMNCCFSSRWCMEDYNVSELEKESLLIWTSTFGNGDCPGNGESF 552

QTLAQRLNSMLNGAFNSRLLCMEDYNFSDMEQESLLVWTSTFGNGDSPGNGESF 548

домена. Исходя из этого, были сконструированы праймеры (прямой -AGCATCACCCCTGTGTTCCACCC, обратный - TGGGGCAGTCTCCATTGCCA; размер ПЦР-продукта - 388 п.н.). Секвенирование полученного ПЦР-продукта подтвердило его принадлежность к iNOS. Трансляция нуклеотидной последовательности в аминокислотную позволила нам сравнить участок белка iNOS лягушки и других животных. Выравнивание аминокислотных последовательностей показало, что идентифицированный участок на 70% идентичен последовательности iNOS курицы, на 61-66% - последовательностям iNOS различных млекопитающих и на 51-53% совпадает с аминокислотной последовательностью iNOS различных рыб (рис. 2). Идентифицированная последовательность была размещена в базе данных GenBank (accession number GU086402).

2. Влияние бактериального эндотоксина ЛПС Е. coli на продукцию нитритов изолированными эпителиальными клетками. Несмотря на то, что

мы выявили присутствие двух изоформ NO-синтазы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки, дальнейшая работа, в основном, была сфокусирована на исследовании регуляции продукции N0, обеспечиваемой индуцибельной изоформой NOS.

В ходе работы с клетками эпителия мочевого пузыря лягушки было обнаружено, что мочевой пузырь лягушки может быть колонизован бактериями. Анализ состава бактериальной микрофлоры показал наличие грамотрицательных бактерий, в том числе лактозонегативной Е. coli. В связи с этим исследовали действие ЛПС Е. coli (компонента клеточной стенки грамотрицательных бактерий), классического активатора экспрессии iNOS, на NO-синтазную активность в изучаемых клетках. Эксперименты проводили на изолированных эпителиальных клетках при их 21-часовой инкубации в присутствии ЛПС. Исследование временной и концентрационной зависимостей эффекта ЛПС показало, что ЛПС стимулировал накопление нитритов, проявляя эффект в концентрациях свыше 1 мкг/мл (рис. 3, А, Б). Стимулирующий эффект ЛПС на накопление нитритов полностью снимался в присутствии 20 мкМ 1400W. Аналогичные результаты были получены при исследовании действия ЛПС на активность NOS, определяемую по продукции [3Н]-£-цитруллина (рис. 3, В).

Анализ экспрессии мРНК iNOS в изолированных эпителиальных клетках проводили через 6, 22 и 46 часов инкубации с ЛПС или без него. Оказалось, что уже через 6 часов инкубации увеличивается экспрессия мРНК iNOS, которая резко стимулируется в присутствии ЛПС. На более длинных сроках инкубации наблюдается постепенное снижение уровня экспрессии как в контрольных, так и в ЛПС-стимулированных клетках (рис.3, Г). В качестве внутреннего стандарта для количественной оценки уровня экспрессии iNOS использовали ген «домашнего хозяйства» gapdh. Праймеры для него конструировали, используя известную последовательность этого гена у хоккайдской лягушки Rana pírica (GenBank: FS290153.1). Последовательности праймеров: 5'-AAGGCTTCTGCTCACTTGAAGG-3 ', 3 '-TATGAGATCCACCACACGGTT-5 '. Исследование уровня экспрессии белка iNOS методом иммуноблоттинга

показало, что эффект ЛПС на уровень экспрессии максимально выражен через 21 час инкубации (рис. 3, Д).

0,1 1 ю

[ЛПС], мкг/мл

6000

I 5000 S

^ 4000

| 3000

s 2000

8- юоо о

время инкубации, ч

контроль | ЛПС 0 б 22 46 б 22 -К время, ч

■ -it lllll t ; --gapdh

, I -«-W OS

SmgiA

ЛПС

контроль ЛПС nnC+1400W

wmprut, 6 'mm чмт: Ti mtm 45 >ш:т<

Рис. 3. Влияние ЛПС и 1400W на NO-синтазную активность. А. Действие различных доз ЛПС на продукцию нитритов в первичной культуре эпителиальных клеток за 21 час инкубации. ** - р<0.01, *** - р<0.001 по сравнению с контролем, п=4. Б. Динамика накопления нитритов в культуральной среде в течение 0-28 часов культивирования клеток. * - р<0.01, п=5. В. Продукция [3Н] -L-цитруллина эпителиальными клетками, прединкубированными в течение 21 часа с ЛПС или без него. * - р<0.01 по сравнению с контролем, ** - р<0.01 по сравнению с ЛПС, п=4. Г. Изменение экспрессии мРНК iNOS под действием ЛПС. Д. Изменение экспрессии белка iNOS под действием ЛПС. Используемые концентрации (рис. Б - Д): ЛПС - 25 мкг/мл, 1400W- 20 мкМ. *

Интересно, что некоторое усиление экспрессии мРНК и белка iNOS наблюдается в инкубируемых клетках и в отсутствие ЛПС. Об этом свидетельствует эффект 1400W на накопление нитритов в культуральной среде (рис.1, А) и активация экспрессии мРНК iNOS (рис.3, Г) в контроле. Возможным объяснением ЛПС-независимого увеличения экспрессии iNOS и продукции NO в изучаемых клетках может быть тот факт, что извлечение и инкубация in vitro мочевых пузырей, а также последующая дезинтеграция эпителия могут приводить к высвобождению эндогенных стимулов, известных как DAMPs

(damage-associated molecular patterns), таких как белки теплового шока, гиалуроновая кислота, клеточная ДНК и другие молекулы, которые могут активировать TLR-сигналинг и приводить к развитию неспецифического иммунного ответа [Ben Mkaddem et al., 2010].

3. Оценка вклада фагоцитирующих клеток в эффект ЛПС на продукцию нитритов. Хорошо известно, что эффекты ЛПС могут быть активированы в «профессиональных» иммунокомпетентных клетках, таких как резидентные макрофаги. Необходимо было выяснить, является ли наблюдаемая нами реакция клеток на ЛПС характерной именно для эпителиальных клеток, а 1 не для макрофагов, которые могут присутствовать в суспензии клеток.

Действительно, в нашей суспензии присутствовало небольшое количество клеток, отличающихся высокой способностью к адгезии и фагоцитозу. Прикрепившиеся клетки эффективно фагоцитировали флуоресцентные | биочастицы Е. coli (рис. 4, А). Однако эффект ЛПС проявлялся в одинаковой степени как в общей суспензии клеток, так и в суспензии, очищенной от прикрепившихся фагоцитирующих клеток, о чем свидетельствует степень увеличения активности NOS, оцениваемая по накоплению [3Н]-Х-цитруллина I (рис. 4, Б). Аналогичные результаты были получены при оценке продукции нитритов в обеих суспензиях (данные не показаны).

А Б

Рис. 4. Фагоцитоз биочастиц (флуоресцентно-меченных Е. coli, линия К-12) клетками, выделенными из мочевого пузыря лягушки. Фотография предоставлена Е.М.Фок (А). Сравнение активности NOS в общей (светлые столбики) и очищенной от фагоцитирующих клеток (темные столбики) суспензиях эпителиальных клеток (Б). * - р<0.01 по сравнению с соответствующим контролем, п=4.

Таким образом, присутствие макрофагоподобных клеток не вносит вклад в продукцию N0, и эффект ЛПС локализуется в самих эпителиальных клетках.

4. Обнаружение рецептора TLR4. Известно, что в основе узнавания ЛПС и инициации врожденного иммунного ответа у млекопитающих лежит чрезвычайно сложная сигнальная цепь, начинающаяся со связывания ЛПС со

специфическими рецепторами ТЫ14 и образования комплекса, включающего в себя ЛПС с ЛПС-связывающим белком, собственно ТЬЯ4 и белки тСО 14 и МЕ>-2. Стимуляция ТЬЯ4 под действием ЛПС приводит к высвобождению транскрипционных факторов таких, как например, №-кВ, которые активируют иммунный ответ, запуская экспрессию различных генов. Представляло интерес выяснить возможность экспрессии Т1Л4 в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки и выявить его участие в эффекте ЛПС на стимуляцию продукции N0.

Методом иммуноблоттинга с использованием антител против ТГ.К4 мы обнаружили экспрессию белка с молекулярной массой около 100 кДа в эпителиальных клетках мочевого пузыря и лейкоцитах лягушки, что совпадает с размером ТЫ14. В качестве позитивного контроля были использованы лейкоциты крысы (рис. 5, А). Чтобы показать, что действие ЛПС на изучаемые клетки опосредуется его связыванием со специфическим рецептором, был использован полимиксин В, блокирующий связывание ЛПС с рецептором ТЫН. Полимиксин В (50 мкг/мл) полностью снимал стимулирующий эффект ЛПС на продукцию N0 (рис. 5, Б). I

Рис. 5. Обнаружение рецептора ТЬЯ4. А. Иммуноблоттинг с использованием антител против ТЬЯ-4: лизат лейкоцитов крысы

(1), лизат лейкоцитов лягушки \

(2), лизаты эпителиальных клеток (3-5). Б. Действие полимиксина В на ЛПС- \ стимулированное накопление \ нитритов в кулътуралъной среде. ЛПС - 25 мкг/мл, полимиксин В -50 мкг/мл. * - р<0.01 по сравнению с контролем, ** - р<0.01 по сравнению с ЛПС, п=4.

Таким образом, проведенное нами исследование свидетельствует о наличии в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки молекулярного механизма распознавания бактериальных стимулов, активация которого I приводит к индукции iNOS.

Хорошо известно, что увеличение продукции NO при действии бактериальных патогенов является важной частью неспецифического иммунного ответа. N0 может вызывать повреждения ДНК, белков и липидов бактериальной клетки, основанные на взаимодействиях NO с активными формами кислорода, прямых взаимодействиях NO с различными реакционно-способными группами в белковых молекулах [Fang, 1997; Chakravortty, Hensel, 2003]. В нашей лаборатории было показано, что изоляты бактерий, выделенные из эпителия мочевого пузыря лягушки, чувствительны к действию доноров N0.

Совокупность этих данных позволяет предположить, что основной функцией iNOS в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки является ее участие в неспецифической иммунной защите клеток эпителия.

5. Участие циклооксигеназы и простагландина Е2 в регуляции экспрессии iNOS. На различных экспериментальных моделях было показано, что индукция iNOS при действии воспалительных стимулов сопровождается изменением активности циклооксигеназы (СОХ), обеспечивающей образование эйкозаноидов из арахидоновой кислоты. Известно, что N0 может влиять на экспрессию СОХ и на синтез простагландинов [Yang, 2006]. Другие исследования свидетельствуют об эффекте продуктов СОХ на экспрессию iNOS и синтез NO [Aeberhard et al 1995; Westet al, 2008]. Особое значение в этом процессе имеет индуцибельная форма фермента (СОХ-2). Представляло интерес выяснить, участвует ли СОХ и продукты ее каталитической активности в регуляции продукции NO в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки.

■■■—■ NS-398 -■*--SC-560 —*— диклофенак

120

% 100

f р 80

о 60

'я 40

о а 20

200 300 400

[ингибитор], мкМ 12 3 4

Рис. 6. А. Продукция нитритов в первичной культуре эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки под действием ингибиторов СОХ. Контроль — 0.5% ПМБО. Для всех ингибиторов снижение содержания нитритов в культуральной среде было достоверно при концентрации ингибитора 50 мкМ и выше (р<0.01), п=4. Б. Эффект простагландинов на продукцию нитритов: 1. 0.05% спирт; 2. 0.05% спирт + 0.25 мМдиклофенак; 3. 0.25 мМдиклофенак + 0.1 мкМПГЕ2; 4. 0.25 мМ диклофенак + 0.1 мкМПГР2а. * — р<0.01 по сравнению с контролем, ** — р<0.05 по сравнению с серией 2, п=3.

Мы исследовали влияние селективных ингибиторов СОХ-1 и СОХ-2 (ЭС-560 и N8-398, соответственно), а также диклофенака, неспецифического ингибитора обеих изоформ, на накопление нитритов в культуральной среде за 21 час инкубации клеток. Все используемые ингибиторы резко снижали накопление нитритов: величина 1С50 составляла 90, 220 и 470 мкМ для N8-398, БС-560 и диклофенака, соответственно (рис. 6, А). Наблюдаемое снижение продукции N0 при действии диклофенака частично восстанавливалось при добавлении ПГЕ2, основного продукта каталитической активности СОХ. П1~Т2а был не эффективен (рис. 6, Б).

Чтобы выяснить, связано ли действие ингибиторов СОХ на продукцию N0 с изменением уровня экспрессии ¿N08, мы оценивали экспрессию мРНК ¡N08 в

клетках, обработанных ЛПС в присутствии NS-398 и SC-560. Методом ОТ-ПЦР показано, что добавление селективных ингибиторов приводит к резкому снижению ЛПС-стимулированной экспрессии мРНК iNOS (рис. 7).

Рис. 7. Влияние ингибиторов циклооксигеназ на ЛПС-стимулированную экспрессию iNOS. ОТ-ПЦР со специфическими праймерами на iNOS (количественная оценка уровня

экспрессии мРНК iNOS выражена в виде отношения оптических плотностей

ЛПС - + + +

ns-398 + inos/gapdh). ЛПС - 25 мкг/мл, NS-398 и SC-

sc-560 + 560 - 50 мкМ. * - р<0.01 по сравнению с

контролем, ** - р<0.01 по сравнению с ЛПС.

Таким образом, мы показали, что экспрессия iNOS в изучаемых клетках критично зависит от продуктов каталитической активности СОХ, в первую очередь, ПГЕ2. Исходя из полученных нами данных следует, что в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки активность циклооксигеназы и, как следствие, увеличение продукции простагландина Е2 предшествует и является необходимым звеном в цепи активации iNOS.

В нашей лаборатории было показано, что наблюдаемое снижение продукции N0 при действии диклофенака частично восстанавливалось при добавлении бутапроста (агониста цАМФ-мобилизующих ЕР2-рецепторов) и форсколина [Бахтеева и др., 2011]. Таким образом, можно предположить, что эффект СОХ на активность iNOS, по всей вероятности, обеспечивается усилением продукции ПГЕ2 и ЕР2-рецептор-опосредованным увеличением цАМФ. Опираясь на данные литературы [Galea et al., 1999], можно предположить, что цАМФ-зависимая сигнальная система активирует транскрипционные факторы семейства CREB, которые повышают транскрипцию гена, кодирующего iNOS, результатом чего является увеличение iNOS-зависимой продукции NO.

6. Механизмы регуляции продукции NO на уровне доступности субстрата. Дальнейшая часть исследований была посвящена изучению механизмов регуляции продукции NO на уровне доступности субстрата NOS - L-аргинина. Известно, что хотя внутриклеточная концентрация аргинина во много раз превышает величину Км для NOS, активность фермента значительно зависит от поступления субстрата из внеклеточной среды (так называемый «парадокс аргинина») и от «биодоступности» субстрата для NOS внутри клетки.

Описано четыре системы транспорта аргинина в клетку: у+, y+L, b0,+ и В°'+, отличающиеся по кинетическим характеристикам, способности транспортировать другие катионные и нейтральные аминокислоты, зависимости транспорта от натрия.

Для определения величины Км и Vmax транспортера аргинина эпителиальные клетки инкубировали 5 мин в присутствии аргинина в диапазоне концентраций от 0 до 250 мкМ (рис. 8, А). Об активности транспортера судили по накоплению радиоактивно-меченного L-аргинина в клетках. Для определения

величины Км мы привели эти данные к координатам Лайнуивера-Бэрка (рис. 8, Б), что дало величину Км для аргинина 43 мкМ, а максимальную скорость реакции - 2.3 пмоль/106клеток/мин. Такая величина Км характерна для переносчиков катионных аминокислот у+ типа [Ра1аст е[ а1., 1998; БаЛага й а!., 2001].

В последующих экспериментах исследовали зависимость входа аргинина в клетки от присутствия в среде ионов натрия. Для создания безнатриевой среды №С1 в растворе заменяли эквивалентным количеством хлорида холина. Натриевую зависимость исследовали при двух концентрациях арлгаина 100 мкМ и 300 мкМ. Данные эксперимента показали, что вход аргинина в клетки не зависит от натрия (рис. 8, В), что также указывает на активность системы транспорта у+ или у+Ь типа в изучаемых клетках.

в ё в в 2,5 "

к 2 -

•л ¡е

и « к о & Ч 1.5 -

X "о 1 -

о. я Л ч 0,5 -

Ч о

о и в В 0 <

100 200 [аргинин], мкМ

1,6 1,2 0,8 0,4.

300

-0.04 -0,02 0 0,02 0.(4 0,06 0,08 1/3 , мкМ -1

800

600

Г | 400

а, «ъ

я С

■г- в 200

300 мкМ L -арппщня

и контроль □ ХОЛ1Ш-С1

г4н

100 мкМ Ь -аргинина

5000

еэ 4000

Г-

ё 3000

$ 2000

1000

котроль /.-лтин £-оршт1н 1мМ 1мМ

Рис. 8. Характеристика входа Ь-аргинина в эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки. А. Кривая субстратного насыщения транспортера. Б. То же в координатах Лайнуивера-Бэрка. В. Зависимость входа Ь-аргинина от внеклеточного натрия. Темные столбики - контроль, [Ыа]=85 мМ; белые столбики - без натрия, концентрация хлорида холина 85 мМ. Г. Влияние Ь-лизина и Ь-орнитина на вход аргинина. * — р<0.01, п=4.

Известно, что транспорт аргинина, опосредованный переносчиками у+ и y+L типов, угнетается в присутствии других катионных аминокислот - лизина и орнитина. Мы измеряли накопление [3Н]-Х-аргинина в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки при добавлении ¿-орнитина и ¿-лизина.

Оказалось, что ¿-орнитин в концентрации 1мМ ингибировал транспорт аргинина в клетки на 54.8%, а в присутствии 1 мМ ¿-лизина вход аргинина снижался на 39.2% по сравнению с контролем (рис. 8, Г).

Таким образом, мы показали, что в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки функционирует система транспорта аргинина, которая не зависит от присутствия ионов натрия, угнетается в присутствии ¿-орнитина и ¿-лизина, что позволяет отнести ее к транспортерам аминокислот у+ или y+L типа. Полученная величина Km (43 мкМ) свидетельствует о том, что транспорт ¿-аргинина в данном типе клеток осуществляется посредством транспортера у типа. Наличие и функционирование данной системы транспорта характерно для большинства клеток, реагирующих на бактериальные стимулы и участвующих в обеспечении неспецифической иммунной защиты [Pan et al., 2002; Meng et al., 2005; Rothenberg et al., 2006; Yeramian et al., 2006; Niese et al., 2010].

Известно, что iNOS и транспортер катионных аминокислот могут быть ко-индуцированы в клетках млекопитающих различных типов при развитии воспалительных реакций, активируемых различными цитокинами, образующимися в клетке при повреждениях и при действии бактериальных стимулов. В рамках данной работы представляло интерес выяснить, участвует ли система транспорта аргинина в обеспечении эффекта ЛПС на активность NOS в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки. Инкубация клеток с ЛПС в течение 21 часа приводила к увеличению транспорта аргинина на 28% (рис. 9).

Рис. 9. Вход L-аргинина в эпителиальные клетки,

преинкубированные в течение 21 ч с ЛПС или без него:

1. контроль;

2. 25 мкг/мл ЛПС;

3. 25 мкг/мл ЛПС, 2*l(fs M 1400W. ** - р<0.01 по сравнению с контролем, п=4.

Чрезвычайно интересно, что 1400W, ингибитор активности iNOS, угнетал ЛПС-стимулированный вход аргинина (рис. 9). Этот факт свидетельствует о том, что усиление экспрессии iNOS и продукции NO приводит к активации системы транспорта аргинина. Механизм влияния самого NO на транспорт предшественника в эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки остается неизвестным. Возможным объяснением действия NO на транспорт аргинина может являться тот факт, что транспортеры системы у+ чувствительны к изменению мембранного потенциала - гиперполяризация мембраны приводит к сильной стимуляции транспортера [Closs et al., 2004]. Было показано, что NO-опосредованная гиперполяризация плазматической мембраны увеличивает вход

¿-аргинина в клетку [Queen et al., 2006]. Можно предположить, что такая регуляция транспорта ¿-аргинина и его зависимость от активности NO-синтазы является необходимой для предотвращения повреждения клеток побочными продуктами синтеза N0, такими как супероксид (02 ) и перекись водорода, которые синтезируются NOS в условиях недостатка субстрата. Известно, что вход ¿-аргинина в клетку из внеклеточной среды играет важную роль в поддержании жизнеспособности клеток при окислительном стрессе [Suschek et al., 2003].

Еще одним молекулярным механизмом регуляции продукции NO в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки может быть регуляция активности или экспрессии аргиназы, превращающей ¿-аргинин в ¿-орнитин и конкурирующей таким образом с NOS за общий субстрат.

Исследование активности аргиназы в разных органах и тканях лягушки показало, что, как и следовало ожидать, наибольший уровень активности фермента был обнаружен в гомогенатах печени и почки (рис.10, А). Активность аргиназы в других исследованных органах распределяется следующим образом: мозг > мочевой пузырь (эпителий) > сердце > семенники. В изолированных эпителиальных клетках мочевого пузыря активность фермента почти в 3 раза выше, чем в стенке интактного мочевого пузыря (таблица 1). Таким образом, эпителиальные клетки мочевого пузыря обладают относительно высокой аргиназной активностью.

Известны две изоформы аргиназы - аргиназа I и аргиназа И, каждая из которых кодируется отдельным геном. Аргиназа I экспрессируется преимущественно в печени и участвует в «цикле мочевины», тогда как аргиназа II обнаруживается в почке и других тканях [Morris et al., 1997]. Экспрессия аргиназы в лизате эпителиальных клеток оценивалась с помощью метода иммуноблоттинга с использованием специфических антител против аргиназы I и II. В качестве положительного контроля связывания антител мы использовали лизаты печени и почки крысы и лягушки. В результате иммуноблоттинга с антителами против аргиназы II в зоне интереса была обнаружена полоса размером 37 кДа, что соответствует молекулярному весу аргиназы

Ткань mU/мг белка/мин

Печень 131.5 ± 2.5

Почки 99.5 ±5.5

Мозг 13.2 ± 1.7

Семенники 0.9 ±0.1

Сердце 1.8 ±0.5

Мочевой 3.3 ±0.7

пузырь(стенка)

Эпителиальные

клетки мочевого 9.2 ± 0.3

пузыря

Таблица I. Активность аргиназы в некоторых органах и тканях лягушки Rana temporaria.

эпителиальные почка печень клетки

крысы крысы кДа мочевого пузыря лягушки

Рис. 10. Результаты иммуноблоттинга с использованием антител против аргиназы II.

Иммуноблоттинг с использованием антител против аргиназы I не выявил экспрессии этой изоформы фермента в изучаемых клетках, хотя антитела связывались с аргиназой I печени лягушки (данные не представлены).

Представляло интерес исследовать влияние ЛПС на активность и уровень экспрессии аргиназы в изучаемых нами клетках. Оказалось, что бактериальный эндотоксин достоверно не менял ни активность, ни уровень экспрессии фермента (данные не приведены). Тем не менее, эксперименты с применением неселективного ингибитора обеих изоформ аргиназы (8)-(2-бороноэтил)-1,-цистеина (ВЕС), позволили выявить наличие конкурентных отношений между аргиназой и NOS как в контрольных, так и в ЛПС-стимулированных клетках. Предварительно необходимо было выяснить, действительно ли данный ингибитор угнетает активность аргиназы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки. Применение ВЕС в наших экспериментах показало, что он в диапазоне концентраций от 10"6 до 10"4 M чрезвычайно эффективно тормозил активность фермента (рис. 11, А). Использование наибольшей дозы подавляло активность аргиназы на 93%.

[ Н]-£-цитруллин

Контроль щ«м 1СГ5 M 10'* M

контроль

Рис. 11. А. Влияние ВЕС на активность аргиназы в гомогенате эпителиальны

1 - р< 0.01 по сравнению Б. Влияние ВЕС на накопление [3Н]-L-цитруллина и [3H]-L~

р < 0.05,

клеток мочевого пузыря лягушки, контролем, п=5.

орнитина изолированными эпителиальными клетками. Светлые столбики контроль, темные — 10'4М ВЕС. Концентрация ЛПС составляла 25 мкг/мл. * р<0.05 по сравнению с контролем, п=4.

Убедившись в том, что ВЕС способен ингибировать аргиназу лягушки, мы попытались выяснить, участвует ли аргиназа эпителия мочевого пузыря в регуляции продукции N0. Был использован метод, позволяющий проводить одновременную оценку активности обоих ферментов в интактных эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки. Эксперименты проводили на клетках, инкубированных в течение 21 часа с ЛПС или без него, нагружали [3Н]-Ь-аргинином, после чего оценивали продукцию [3Н]-£-орнитина и [3Н]-£-цитруллина, разделяя радиоактивные продукты методом тонкослойной хроматографии. Оказалось, что в интактных клетках ВЕС (100 мкМ)

действительно снижал активность аргиназы, о

чем свидетельствует снижение

Зт

синтеза [3Н]-Х-орнитина, при этом увеличивался уровень ['1Н]-Х-цитруллина как в контрольных, так и в ЛПС-стимулированных клетках (рис. 11, Б).

Аналогичный эффект ВЕС на активность NOS был обнаружен при анализе уровня нитритов в культуральной среде (данные не приведены). Таким образом, с помощью этих подходов мы показали наличие тесной связи между активностью аргиназы и уровнем продукции N0, в основе которой лежит конкуренция ферментов за общий субстрат.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование показало, что в эпителии мочевого пузыря лягушки экспрессируются, по крайней мере, две изоформы NOS - нейрональная и индуцибельная. Продуцируемый ими N0 может играть как регуляторную роль, участвуя в модуляции действия АДГ на транспорт воды, так и защитную роль, обеспечивая неспецифический иммунный ответ. Полученные данные продемонстрировали, что эпителиальные клетки имеют систему распознавания бактериальных патогенов и отвечают на их присутствие индукцией iNOS, опосредованной продуктами каталитической активности циклооксигеназы. Регуляция синтеза N0 в изучаемых клетках осуществляется посредством дополнительных молекулярных механизмов, включающих iNOS-зависимое увеличение транспорта L-аргинина в клетку и вовлечение аргиназы как ферментной системы, конкурирующей с NOS за общий субстрат.

ВЫВОДЫ

1. Продукция N0 в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки Rana temporaria обеспечивается экспрессией двух изоформ NOS: nNOS и iNOS.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента кДНК iNOS, соответствующая участку белка, содержащему часть оксигеназного домена,

* полноразмерный кальмодулин-связывающий домен и часть редуктазного домена (GenBank: GU086402).

3. Экспрессия мРНК и белка iNOS и продукция NO в эпителиальных клетках стимулируется ЛПС Е. coli. Этот эффект обусловлен связыванием ЛПС с рецептором TLR4, экспрессия которого была выявлена в данных клетках. В исследуемой суспензии обнаружены макрофагоподобные клетки, способные к фагоцитозу, однако эффект ЛПС на экспрессию iNOS реализуется в эпителиальных клетках.

4. Продукция NO эпителиальными клетками тормозится в присутствии ингибиторов СОХ-1 и СОХ-2, которые полностью предотвращали стимулирующее действие ЛПС Е. coli на экспрессию мРНК iNOS. ПГЕ2 обладал способностью частично восстанавливать ингибирующий эффект диклофенака на продукцию N0. Таким образом, в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки экспрессия iNOS критично зависит от уровня активности СОХ.

5. Охарактеризованы параметры входа i-аргинина в эпителиальные клетки, которые позволяют предположить активность системы транспорта катионных аминокислот у+ типа. Транспорт ¿-аргинина в клетку усиливается при действии ЛПС и тормозится ингибитором iNOS, что свидетельствует о

наличии сопряжения между уровнем активности iNOS и системой доставки субстрата в клетку.

6. В исследуемых клетках обнаруживается относительно высокая аргиназная активность, обеспечиваемая экспрессией аргиназы II. ЛПС не влияет на активность и уровень ее экспрессии, однако, ингибирование аргиназы приводит к увеличению продукции NO эпителиальными клетками, по-видимому, за счет изменения доступности ¿-аргинина для NOS.

СПИСОК 1'ЛБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Бахтеева В.Т., Фок Е.М., Лаврова Е.А., Горбушин A.M., Романова И.В., Николаева С.Д., Парнова Р.Г. Обнаружение NO-синтазной активности в клетках мукозного эпителия мочевого пузыря лягушки. // Росс, физиол. журн. им. И. М.Сеченова. 2006. Т. 92. N 8. С. 1022-1028.

2. Bachteeva V., Fock Е., Lavrova Е., Nikolaeva S., Gambaryan S., Parnova R. Prostaglandin E2 inhibits vasotocin-induced osmotic water permeability in the frog urinary bladder by EP1-receptor-mediated activation of NO/cGMP pathway. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2007. V. 293. P. R528-R537.

3. Николаева С.Д., Бахтеева B.T., Фок E.M., Лаврова Е.А., Парнова Р.Г. Активность аргиназы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки и ее участие в регуляции продукции оксида азота. // Журн. эвол. биохим. физиол. 2008. Т. 44. N 3. С. 234-240.

4. Фок Е.М., Бахтеева В.Т., Лаврова Е.А., Николаева С.Д., Парнова Р.Г. Исследование NO-синтазной активности и обнаружение NO-зависимого антибактериального эффекта в первичной культуре клеток эпителия мочевого пузыря лягушки. // Цитология. 2008. Т. 50. N 10. С. 895-900.

5. Е.А.Лаврова, С.Д.Николаева, Е.М.Фок, В.Т.Бахтеева, Р.Г.Парнова. Липополисахарид Е. coli ингибирует увеличение осмотической проницаемости мочевого пузыря лягушки, стимулированное аргинин-вазотоцином. // Росс, физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2009. Т. 95. N 3. С. 215 - 224.

6. Бахтеева В.Т., Федотов Т.М., Николаева С.Д., Лаврова Е.А., Фок Е.М., Парнова Р.Г. Регуляторные взаимоотношения циклооксигеназы и индуцибельной NO-синтазы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки при действии бактериальных стимулов. // Журн. эвол. биохим. физиол. 2011. Т.47. N. 1.С. 27-33.

Тезисы докладов

1. Парнова Р.Г., Бахтеева В.Т., Лаврова Е.А., Николаева С.Д., Фок Е.М., Черниговская Е.В. Типы NO-синтаз и исследование NO-синтазной активности в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки. // 1 Съезд физиологов СНГ "Физиология и здоровье человека". Сочи, Дагомыс. 2005. Сборник тезисов. Т. 2. С. 13.

2. Николаева С.Д., Парнова Р.Г. Обнаружение NO-синтазной активности в первичной культуре эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки. // Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов. Санкт-Петербург. 2005. Тезисы докладов. С. 28-29.

3. Бахтеева В.Т., Фок Е.М., Николаева С.Д., Парнова Р.Г. Обнаружение NO-синтазы нейронального типа в клетках мукозного эпителия мочевого пузыря лягушки. // XIII Международное совещание и VI Школа по эволюционной физиологии. Санкт-Петербург. 2006. Тезисы докладов и лекций. С. 26-27.

4. Парнова Р.Г., Бахтеева В.Т., Фок Е.М., Лаврова Е.А., Николаева С.Д. Обнаружение нового молекулярного механизма действия простагландина Е2 в регуляции транспорта воды в осморегулирующем эпителии амфибий: роль NO-синтазы нейронального типа. // XX Съезд физиол. общества им. И.П.Павлова. Москва. 2007. Тезисы докладов. С. 72.

5. Николаева С.Д., Фок Е.М., Лаврова Е.А., Бахтеева В.Т., Парнова Р.Г. (2008) Экспрессия и функциональная роль индуцибельной NO-синтазы в клетках осморегулирующего эпителия мочевого пузыря лягушки. // VI Сибирский физиологический съезд. Барнаул. 2008. Тезисы докладов. Т.2. С. 16.

6. Парнова Р.Г., Николаева С.Д., Бахтеева В.Т., Фок Е.М., Лаврова Е.А.. Молекулярные механизмы регуляции iNOS-зависимой продукции NO в обеспечении иммунной защиты эпителиальных клеток мочевого пузыря амфибий. // Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы». Москва. 2008. журн. Аллергология и иммунология. 2008. Т.9. N. 3. С. 268.

7. Николаева С.Д., Фок Е.М., Бахтеева В.Т., Лаврова Е.А., Парнова Р.Г. Экспрессия индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и ее регуляция в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки при действии липополисахарида Е. coli. Н XXI съезд Физиол. общества им. И.П.Павлова. Калуга. 2010. Тезисы докладов. С. 441.

Подписано в печать 31.08.2011г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ №2210.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николаева, Светлана Дмитриевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиологическая роль оксида азота.

1.2. Биосинтез оксида азота.

1.3. Функциональная роль N0 в регуляции транспорта воды в собирательных трубках почки млекопитающих и мочевом пузыре амфибий.

1.4. Участие N0 в неспецифическом иммунном ответе в уроэпителии и почке млекопитающих.

1.5. Регуляция активности разных изоформ NOS.

1.5.1. Регуляция конститутивных NOS.

Кальций/калъмодулин

Эндогенные ингибиторы NOS.

Фосфорилирование.

Миристоилироеание и палъмитоилирование.

Регуляция экспрессии eNOS и nNOS

1.5.2. Механизмы регуляции iNOS.

1.5.2.1. Механизм действия ЛПС'на экспрессию iNOS.

1.5.2.2. Роль циклооксигеназы и простагландинов в индукции экспрессии iNOS

1.5.3. Регуляция продукции NO за счет изменения доступности субстрата.

1.5.3 Л. Транспорт аргинина.

1.5.3.2. Аргиназа.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2.Получение суспензии клеток мукозного эпителия мочевого пузыря лягушки.

2.3. Получение первичной культуры клеток мукозного эпителия мочевого пузыря лягушки.

2.4. Определение концентрации нитритов в культуральной среде.

2.5. Исследование активности NO-синтазы в гомогенате эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки.

2.6. Определение активности NOS и аргиназы в суспензии изолированных эпителиальных клеток.

2.7. Определение параметров транспортаZ-аргинина.

2.8. Измерение активности аргиназы в гомогенатах тканей и клеток.

2.9. Измерение концентрации белка в лизате эпителиальных клеток.

2.10. Выделение РНК из эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки.

2.11. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

2.12. Электрофорез РНК и ДНК в агарозном геле.

2.13. Иммуноблоттинг.

2.13.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения.

2.13.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.13.3. Иммуноблоттинг со специфичными антителами.

2.14. Выделение лейкоцитов из крови лягушки и крысы.

2.15. Получение перитонеальных макрофагов крысы.

2.16. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. NO-синтазы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки.

3.1.1. Обнаружение NO-синтазной активности в изолированных клетках.

3.1.2. Идентификация изоформ NOS.

3.1.2.1 .Исследование кальциевой зависимости NOS в клеточных гомогенатах

3.1.2.2. Влияние селективных ингибиторов конститутивных и индуцибельной NOS на NO-синтазную активность в эпителиальных клетках.

3.1.2.3. Идентификация изоформ NOS в эпителии мочевого пузыря лягушки методом иммуноблоттинга.

3.1.2.4. Идентификация iNOS методами ОТ-ПЦР и сиквенирования. Частичная характеристика первичной структуры iNOS.

3.2 Регуляция продукции NO изменением экспрессии iNOS в эпителиальных клетках.

3.2.1. Влияние бактериального эндотоксина ЛПС Е. coli на продукцию нитритов изолированными эпителиальными клетками.

3.2.2.0бнаружение рецептора TLR4 в эпителиальных клетках мочевого пузыря.

3.2.3. Оценка вклада фагоцитирующих клеток в эффект ЛПС на продукцию нитритов.

3.2.4. Изменение экспрессии мРНК и белка iNOS под действием ЛПС Е. coli.

3.3. Роль циклооксигеназы и простагландинов в регуляции экспрессии iNOS.

3.4. Механизмы регуляции продукции NO на уровне доступности субстрата.

3.4.1. Транспорт аргинина в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки.

3.4.1.1. Характеристика транспортера катионных аминокислот в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки.

3.4.1.2. Влияние ЛПС Е. coli на вход аргинина в клетки.

3.4.2. Участие аргиназы в регуляции продукции NO.

3.4.2.1. Активность аргиназы в эпителиальных клетках и ее кинетические характеристики.

3.4.2.2. Идентификация изоформы аргиназы, присутствующей в эпителиальных клетках.

3.4.2.3. Активность NOS в условиях ингибирования аргиназы.

3.4.2.4. Конкурентные отношения NOS и аргиназы в присутствии ЛПС.

3.4.2.5. Влияние ЛПС на активность и экспрессию аргиназы.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Список используемой литературы.

Список сокращений

АВТ - аргинин-вазотоцин

АДГ - антидиуретический гормон

БСА — бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотриитол

ЛПС - липополисахарид

НАДФН — никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПГЕ2 — простагландин Е nTF2a - простагландин F2a

ПГ12- простагландин

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ФМН - флавинаденинмононуклеотид

ФСБ - фосфатно-солевой буфер цАМФ — циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВЕС - (8)-(2-бороноэтил)-Х-цистеин

ВН4 - тетрагидробиоптерин

СаМ - кальмодулин

CAT - транспортер катионных аминокислот (cationic amino acid transporter)

СОХ - циклооксигеназа (cyclooxygenase)

L-NAME — NG-nitro-Z,-arginine methyl ester

NFkB - нуклеарный фактор кВ (nuclear factor кВ)

PMSF - фенилметансульфонилфторид (phenylmethanesulfonylfluoride)

SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)

TNFa - фактор некроза опухоли a (tumor necrosis factor a)

TLR - Toll-like receptor

NOS - NO-синтаза (nitric oxide synthase) eNOS, NOS3 - эндотелиальная NO-синтаза nNOS, NOS1 - нейрональная NO-синтаза iNOS, NOS2 - индуцибельная NO-синтаза Arg — аргинин

Asp — аспарагиновая кислота

Glu - глутаминовая кислота

Leu — лейцин

Lys — лизин

Met — метионин

Phe - фенилаланин

Ser - серин

Туг — тирозин

Val - валин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы регуляции продукции оксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки"

Актуальность проблемы

Оксид азота (NO) является важнейшим ауто/паракринным регулятором огромного спектра физиологических реакций. Низкомолекулярное и не несущее заряда соединение NO способно быстро диффундировать и свободно проникать через плотные клеточные слои и межклеточное пространство, не требуя специальных переносчиков. Внутриклеточные эффекты NO включают в себя его связывание с гем-содержащими белками, из которых наиболее важное значение во внутриклеточной сигнализации имеет цитозольная гуанилатциклаза, нитрозилирование различных белков, что приводит к изменению их функциональной активности, образование активных форм кислорода и азота [см. обзоры Stamler, 1994; MacMicking, 1997; Liu & Huang, 2008] и др. Эндогенный NO образуется в организме при ферментативном окислении аминокислоты L-аргинина. Эта реакция катализируется ферментом NO-синтазой (NOS), для которой известны 3 изоформы: нейрональная (nNOS, NOS1), первоначально обнаруженная в нейронах центральной и периферической нервной системы; эндотелиальная (eNOS, NOS3), впервые идентифицированная в клетках эндотелия кровеносных сосудов; и индуцибельная (iNOS, NOS2), которая, в отличие от nNOS и eNOS, как правило, не экспрессируется постоянно, а индуцируется в клетках различных типов в ответ на действие патологических стимулов. Изоформы NOS различаются аминокислотной последовательностью, молекулярной массой, локализацией в органах и тканях и механизмами, регулирующими их экспрессию и активность.

Образующийся при участии NOS оксид азота обладает крайне разнообразным биологическим действием, играя важную роль в различных физиологических процессах, таких как поддержание тонуса сосудов, воспалительный и иммунный ответ, нейротрансмиссия, модуляция ионных каналов, агрегация тромбоцитов, секреция ренина, ангиогенез и другие [см. обзоры Bredt, 1994; Reid, 1995; MacMicking, 1997; Ванин, 2000; Ziehe, 2000; Garthwaite, 2008; Kolluru, 2010]. Конститутивные NOS обеспечивают участие NO в процессах внутриклеточной сигнализации, опосредованных, главным образом, активацией цитозольной гуанилатциклазы и увеличением уровня цГМФ. Функция ÎNOS преимущественно связана с участием образовавшегося NO в воспалительных реакциях и обеспечении неспецифической иммунной защиты [Dai et al., 1995; Calza et al., 1997; Виноградов, 1998]. Токсическое действие NO на бактериальные патогены основано на его взаимодействии с активными формами кислорода, нитрозилировании различных реакционно-способных групп и на других механизмах, что приводит к повреждениям! белков, ДНК и липидов бактериальной клетки [Fang, 1997]. Наиболее эффективными индукторами iNOS, стимулирующими транскрипцию гена, являются цитокины (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей, у-интерферон), а также бактериальные липополисахариды - компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий [Ziesche et al., 1996; Galea, Feinstein, 1999; Kleinert et al., 2003].

Большой объем существующей информации свидетельствует о наличии огромного разнообразия механизмов регуляции образования NO. К ним относится регуляция уровня экспрессии NO-синтезирующих ферментов, их различные посттрансляционные модификации, Са2+/кальмодулин-зависимое изменение активности NOS, наличие кофакторов, доступность субстрата, регулируемая как на уровне поступления аргинина в клетку, так и изменением активности ферментов, конкурирующей с NOS за общий субстрат [Копе, 2000; Closs et al, 2000; Mori, Gotoh, 2000; Li, Poulos, 2005]. Наиболее полно регуляция образования NO и механизмы его физиологического действия исследованы в клетках нейронов и глии [Espluques, 2002; Saha, Pahan, 2006], эндотелии сосудов [Fleming, Busse, 1999;

Sessa, 2005] и в различных типах макрофагов [Mori, Gotoh, 2004; Kobayashi, 2010]. Эпителиальная ткань представляет большой интерес для изучения регуляции продукции и действия NO, так как эпителии являются первым барьером на пути проникновения бактериальных патогенов и помимо этого выполняют присущие каждому типу данной ткани специализированные функции. Тем не менее, данные по эпителиальной ткани в отношении способов регуляции образования NO и разнообразию экспрессируемых изоформ NOS немногочисленны.

Данная работа посвящена исследованию регуляции продукции NO в клетках осморегулирующего эпителия, специализированного на поддержании водно-электролитного баланса. В качестве экспериментальной модели были выбраны изолированные эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки- — классического объекта, используемого в изучении механизмов гормональной регуляции транспорта воды. В основе интереса к этому объекту лежит функциональное сходство и общность молекулярных механизмов, обеспечивающих действие антидиуретического гормона (АДГ) на реабсорбцию воды, в эпителии мочевого пузыря бесхвостых амфибий и собирательных трубок почки млекопитающих [Наточин, 1983; Hasegawa et al., 2005; Uchiyama, Konno, 2005]. Имеющиеся данные свидетельствуют о несомненной роли NO в механизмах регуляции водного транспорта. Так, на перфузируемых фрагментах собирательных трубок почки крысы и изолированном мочевом пузыре лягушки было показано, что доноры NO вызывают снижение действия АДГ на увеличение осмотической проницаемости [Garcia et al., 1996; Fock et al., 2004; Klokkers et al., 2009]. Есть данные, что ингибирующее действие простагландина Е2 на АДГ-стимул ированную осмотическую проницаемость обусловлено ЕР 1-рецептор-опосредованной мобилизацией Са2+, которая приводит к увеличению продукции NO [Bachteeva et al.,2007].

Важной предпосылкой проведения данной работы является тот факт, что мочевой пузырь амфибий может быть колонизирован грамотрицательной бактериальной флорой, главным образом, представителями семейства Enterobacteriaceae [Hutchinson, Porter, 1972], эндогенное присутствие которых рассматривается как одна из причин низкого эффекта АДГ на увеличение осмотической проницаемости. Совокупность этих данных позволяет предполагать наличие в эпителии мочевого пузыря лягушки как конститутивных NOS, участвующих в осморегуляции, так и индуцибельной NOS, обеспечивающей неспецифическую иммунную защиту.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение молекулярных механизмов, участвующих в регуляции продукции N0 в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки Rana temporaria. В данном исследовании рассматривались два аспекта регуляции синтеза NO изучаемыми клетками: (1) регуляция экспрессии фермента и (2) регуляция NO-синтазной активности за счет доступности субстрата. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать изоформы NOS, экспрессируемые эпителиальными клетками мочевого пузыря лягушки.

2. Оценить влияние ЛПС Е. coli на экспрессию NOS и продукцию NO изучаемыми клетками. Исследовать возможность экспрессии TLR4, рецепторов ЛПС, в эпителиальных клетках.

Научная новизна работы

Впервые была выявлена NO-синтазная активность в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки и показана экспрессия nNOS и iNOS в изучаемых клетках. Впервые определена и проанализирована последовательность участка кДНК iNOS у лягушки Rana temporaria. Впервые была показана способность клеток эпителия мочевого пузыря лягушки экспрессировать TLR4, рецептор бактериального ЛПС, и отвечать на ЛПС рецептор-опосредованным усилением экспрессии мРНК и белка iNOS и увеличением продукции NO. Доказано, что экспрессия iNOS в этих клетках критично зависит от активности циклооксигеназы.

Впервые на клетках осморегулирующего эпителия охарактеризованы особенности входа /--аргинина, его кинетические характеристики, установлена зависимость входа аргинина от присутствия ионов натрия, что позволило отнести транспортер к транспортерам катионных аминокислот системы у+. Для данного типа клеток было впервые показано, что вход аргинина в клетку стимулируется ЛПС и зависит от уровня активности iNOS.

Теоретическая и практическая значимость

Исследование имеет фундаментальное значение для понимания механизмов регуляции биосинтеза N0 в эпителиальных тканях, механизмов развития неспецефического иммунного ответа и N0 в поддержании водно-солевого баланса, что имеет большое значение для разработки новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний выделительной, сердечно-сосудистой и других систем организма человека и животных, а также для разработки методических подходов в диагностике этих заболеваний. Полученные результаты могут быть включены в курсы лекций по физиологии и биохимии для студентов биолого-почвенного и медицинского факультетов Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербургского медицинского университета и других вузов.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и' аспирантов (Санкт-Петербург, 2005), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на XIII Международном совещании и VI Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008), на XX и XXI съездах Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007; Калуга 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, 6 из которых — статьи в рецензируемых журналах, 7 - тезисы докладов.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 10 отечественных и 202 зарубежных источников. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 46 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Николаева, Светлана Дмитриевна

ВЫВОДЫ

1. Продукция NO в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки Rana temporaria обеспечивается экспрессией двух изоформ NOS: nNOS и iNOS.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента кДНК iNOS, соответствующая участку белка, содержащему часть оксигеназного домена, полноразмерный СаМ-связывающий домен и часть редуктазного домена (GenBank: GU086402).

3. Экспрессия мРНК и белка iNOS и продукция NO в эпителиальных клетках стимулируется ЛПС Е. coli. Этот эффект обусловлен связыванием ЛПС с рецептором TLR4, экспрессия которого была выявлена в данных клетках. В исследуемой суспензии обнаружены макрофагоподобные клетки, способные к фагоцитозу, однако эффект ЛПС реализуется в эпителиальных клетках.

4. Продукция NO изолированными эпителиальными клетками тормозится в присутствии ингибиторов СОХ1 и СОХ2, которые полностью предотвращали стимулирующее действие ЛПС Е. coli на экспрессию мРНК iNOS. ПГЕ2 обладал способностью частично восстанавливать ингибирующий эффект диклофенака на продукцию NO. Таким образом, в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки экспрессия iNOS критично зависит от уровня активности СОХ.

5. Охарактеризованы параметры входа Z-аргинина в эпителиальные клетки, которые позволяют предположить активность системы транспорта катионных аминокислот у+ типа. Транспорт Х-аргинина в клетку усиливается при действии ЛПС и тормозится ингибитором iNOS, что свидетельствует о наличии сопряжения между уровнем активности iNOS и системой доставки субстрата в клетку.

6. В исследуемых клетках обнаруживается относительно высокая аргиназная активность, обеспечиваемая экспрессией аргиназы И. ЛПС не влияет на активность и уровень ее экспрессии, однако, угнетение активности аргиназы ее специфическим ингибитором приводит к увеличению продукции NO эпителиальными клетками, по-видимому, за счет изменения доступности L-аргинина для NOS.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование показало, что в эпителии мочевого пузыря лягушки экспрессируются, по крайней мере, две изоформы NOS - нейрональная и индуцибельная. Продуцируемый ими NO может играть как регуляторную роль, участвуя в модуляции действия АДГ на транспорт воды, так и защитную роль, обеспечивая неспецифический иммунный ответ. Полученные данные демонстрируют, что эпителиальные клетки имеют систему распознавания бактериальных патогенов и отвечают на их присутствие индукцией iNOS, опосредованной продуктами каталитической активности СОХ. Регуляция синтеза NO в изучаемых клетках осуществляется посредством дополнительных молекулярных механизмов, включающих iNOS-зависимое увеличение транспорта ¿-аргинина в клетку и вовлечение аргиназы как ферментной системы, конкурирующей с NOS за общий субстрат.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николаева, Светлана Дмитриевна, Санкт-Петербург

1. Бахтеева В.Т., Федотов Т.М., Николаева С.Д., Лаврова Е.А., Фок Е.М.,

2. Парнова Р.Г. Регуляторные взаимоотношения циклооксигеназы и индуцибельной NO-синтазы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки при действии бактериальных стимулов. // Журн. эеол. биохим. физиол. 2011. Т. 92. N8. С. 1022-1028.

3. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях. // Вестн. Росс. АМН. 2000. N4. С. 3-5.

4. Виноградов H.A. Антимикробные свойства окиси азота и регуляция еебиосинтеза в макроорганизме. // Антибиотики и химиотерапия. 1998. Т. 43. N2. С. 24-29.

5. Гервазиев Ю.В., Соколов H.H. Механизмы регуляции кальмодулиномактивности синтазы окиси азота. // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45. N3. С. 187-199.

6. Лаврова Е.А., Николаева С.Д., Фок Е.М., Бахтеева В.Т., Парнова Р.Г.

7. Липополисахарид Е. coli ингибирует увеличение осмотической проницаемости мочевого пузыря лягушки-, стимулированное аргинин-вазотоцином. // Росс, физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2009. Т. 95. N 3. С. 215-224.

8. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы ворганизме млекопитающих при различных функциональных состояниях. // Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 4. С. 485-503.

9. Наточин Ю.В. Эволюция водно-солевого обмена • и почки. // В кн.

10. Эволюционная физиология» под ред. Е.М. Крепса. 1983. Ленинград, Наука. Ч. 2. С. 371-426.

11. Проскуряков С .Я., Бикетов С.И., Иванников А.И., Скворцов В.Г. Оксидазота в механизмах патогенеза внутриклеточных инфекций. // Иммунология. 2000. N 4. С. 9-20.

12. Сомова Л.М., Плехова Н.Г. Оксид азота как медиатор воспаления. // Вестник ДВО РАН. 2006. №2. С. 77 80.

13. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник. // Соросовский образовательный журнал. 2000. N 12. С. 27-34.

14. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. II Biochem. J. 2001. V. 357. P. 593-615.

15. Andre M., Latado H., Felley-Bosco E. Inducible nitric oxide synthase-dependent stimulation of PKGI and phosphorylation of YASP in human embryonic kidney cells. // Biochem. Pharmacol. — 2005, v. 69, p. 595-602.

16. Armant M.A., Fenton M.J. Toll-like receptors a family of pattern-recognition receptors in mammals. // Genome Biol. 2002. V.3. N. 8. P. R3011-R3021.

17. Ash D. E. Structure and Function of Arginases II J. Nutr. 2004. V. 134. P. 2760S-2764S.

18. Ben Mkaddem S., Chassin C., Vandewalle A. Contribution of renal tubule epithelial cells in the innate immune response during renal bacterial infections and ischemia-reperfusion injury. // Chang. Gung. Med. J. 2010. V. 33. N 3. P. 225-240.

19. Bôger R.H., Vallance P., Cooke J.P. Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a key regulator of nitric oxide synthase. // Atheroscler. Suppl. 2003. V. 4. N4. P. 13.

20. Bôger R.H., Bode-Bôger S.M., Matsuoka H., Miyazaki H., Usui M., Ueda S., Okuda S., Imaizumi T., Cooke J.P. Is asymmetric dimethylarginine a novel marker of atherosclerosis? // Circulation. 2000. V. 101. N 14. P. 160-161.

21. Boo Y.C., Jo H. Flow-dependent regulation of endothelial nitric oxide synthase: role of protein kinases. II Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2003. V. 285. N 3. P. 499508.

22. Boucher J.L., Moali C., Tenu J.P. Nitric oxide biosynthesis, nitric oxide synthase inhibitors and arginase competition for Z-arginine utilization // Cell. Mol. Life Sci. 1999. V. 55. P. 1015-1028.

23. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification microgram quantités of protein utilizing the principle of protein dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

24. Breder C.D., Smith W.L., Raz A., Masferrer J., Seibert K., Needleman R, Saper C.B. Distribution and characterization of cyclooxygenase immunoreactivity in the ovine brain. II J. Comp. Neurol. 1992. V. 322. N 3. R 409-438.

25. Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule. // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. R 175-195.

26. Buga G.M., Wei L.H., Bauer P.M., Fukuto J.M., Ignarro L.J. NG-hydroxi-L-arginine and nitric oxide inhibit Caco-2 tumor cell proliferation by distinct mechanisms II Am. J. Physiol. 1998. V. 275. R 1256-1264.

27. Carraway M.S., Piantadosi C.A., Jenkinson C.P., Huang Y.G. Differential expression of arginase and iNOS in the lung in sepsis. // Exp. Lung. Res. 1998. V. 24. N 3 P. 253-68.

28. Castrop H., Schweda R, Schumacher K., Wolf K., Kurtz A. Role of renocortical cyclooxygenase-2 for renal vascular resistance and macula densa control of renin secretion. // J. Am. Soc. Nephrol. 2001. V. 12. N 5. P. 867-874.

29. Ceccatelli S., Grandison L., Scott R.E., Pfaff D.W., Kow L.M. Estradiol regulation of nitric oxide synthase mRNAs in rat hypothalamus. // Neuroendocrinology. 1996. V. 64. P. 357-363.

30. Chakravortty D, Hensel M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. // Microbes Infect. 2003. V. 5. N 7. P. 621-627.

31. Chen C.-C., Chiu K.-T., Sun Y.-T., Chen W.-C. Role of the cyclic AMP-protein kinase A pathway in lipopolysaccharide-induced nitric oxide synthase expression in RAW 264.7 macrophages. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 31559-31564.

32. Chowdhury P., Sacks S.H., Sheerin N.S. Minireview: functions of the renal tract epithelium in coordinating the innate immune response to infection. // Kidney Int. 2004. V. 66. N 4. P. 1334-1344.

33. Closs E.I., Boissel J.P., Habermeier A., Rotmann A. Structure and function, of cationic amino acid transporters (CATs). // J. Membr. Biol. 2006. V. 213. N 2. P. 67-77.

34. Closs E.I., Scheld J.S., Sharafi M:, Forstermann U. Substrate supply for nitric-oxide synthase in macrophages and endothelial cells: role of cationic amino acid transporters. // Mol. Pharmacol. 2000. V. 57. N 1. P. 68-74.

35. Closs E.I., Simon A., Vekony N., Rotmann A. Plasma membrane transporters for arginine: // J.) Nutr. 2004. V. 134; R 2752Sr2759S; 2765S-2767S;

36. Coleman J.W. Nitric oxide in: immunity and inflammation.: // Int. Immunopharmacol. 2001. V. 8. P. 1397-406.

37. Corraliza I.M., Campo M.L., Soler G., Modolell M. Determination of arginase activity in macrophages: a micromethod // J. Immunol. Methods. 1994. V. 174. P. 231-235.

38. Dai A., Zhang Z., Niu R. The effects of hypoxia on nitric oxide synthase activity and mRNA expression of pulmonary artery endothelial cells in pigs. // Chung Hua Chieh Ho Ho Hu Hsi Tsa Chih. 1995. V. 18. P. 164-166

39. Dala E., Szajani B. Immobilization, characterization, and laboratory-scale application of bovine liver arginase // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 49. P. 203-215.

40. Dauphinee S.M., Karsan A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. // Lab. Invest. 2006. V. 86. N 1. P. 9-22.

41. Dedio J., König P., Wohlfart P., Schroeder C., Kummer W., Müller-Esterl W. NOSTP, a novel modulator of endothelial nitric oxide synthase activity. // FASEB J. 2001. V. 15. N 1. P. 79-89.

42. Dhakal B.K., Kulesus R.R., Mulvey M.A. Mechanisms and consequences of bladder cell invasion by uropathogenic Escherichia coli. // Eur. J. Clin. Invest. 2008. V. 38. Suppl. 2. P. 2-11.

43. Doyle S.L., O'Neill L.A. Toll-like receptors: from the discovery of NFkappaB to new insights into transcriptional regulations in innate immunity. // Biochem. Pharmacol. 2006. V. 72. N 9. P. 1102-1113.

44. Dreyer J., Hirlinger D., Müller-Esterl W., Oess S., Kuner R. Spinal upregulation of the nitric oxide synthase-interacting protein NOSIP in a rat model of inflammatory pain. // Neurosci. Lett. 2003. V. 350. N 1. P. 13-16.

45. Fan J.S., Zhang Q., Li M., Tochio H., Yamazaki T., Shimizu M., Zhang M. Protein inhibitor of neuronal nitric-oxide synthase, PIN, binds to a 17-amino acid residue fragment of the enzyme. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N 50. P. 33472-33481

46. Fang F.C. Perspectives series: host/pathogen interactions. Mechanisms of nitric oxide-related antimicrobial activity. II J. Clin. Invest. 1997. V. 99. N 12. P. 28182825.

47. Fleming I., Busse R. Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2003. V. 284. P. R1 -R12.

48. Fleming I., Busse R. Signal transduction of eNOS activation. // Cardiovasc. Res. 1999. V. 43. N3. P. 532-541.

49. Fock E.M., Lavrova E.A., Bachteeva V.T., Chernigovskaya E.V., Parnova R.G. Nitric oxide inhibits arginine-vasotocin-induced increase of water osmotic permeability in frog urinary bladder. // Pflugers Arch. 2004. V. 448. N 2. P. 197203.

50. Forstermann U., Boissel J.-P., Kleinert H. Expressional control of the 'constitutive' isoforms of nitric oxide synthase (NOS I and NOS III). // FASEB Journal. 1998. V. 12. N 10. P. 773-790.

51. Freedman J.E., Sauter R., Battinelli E.M., Ault K., Knowles C., Huang P.L., Loscalzo J. Deficient platelet-derived nitric oxide and enhanced hemostasis in mice lacking the NOSIII gene. // Circ. Res. 1999. V. 84. N 12. P. 1416-1421.

52. Fulton D., Church J. E., Rúan L., Li C., Sood S. G., Kemp B. E., Jennings 1. G., Venema R. C. Src kinase activates endothelial nitric-oxide synthase by phosphorylating Tyr-83. II J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 35943-35952.

53. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. // Nature. 1980. V. 288. N 5789. P. 373-376.

54. Galea E., Feinstein D.L. Regulation of the expression of the inflammatory nitric oxide synthase-(NOS2) by cyclic AMP// FASEB Journal. 1999. V. 13. P. 21252137.

55. Garcia N.H., Stoos BA., Carretero O.A., Garvin J.L. Mechanism of the nitric oxide-induced blockade of collecting duct water permeability. // Hypertension. 1996. V.27. N 3. Pt 2. P. 679-683.

56. Garg U.C., Hassid A. Nitric oxide-generating vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells. II J. Clin. Invest. 1989. V. 83. N 5. P. 1774-1777.

57. Garthwaite J. Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission. // Eur. J. Neurosci. 2008. V. 27. N 11. P. 2783-2802.

58. Garthwaite J., Balázs R. Supersensitivity to the cyclic GMP response to glutamate during cerebellar maturation. II Nature. 1978. V. 275. N 5678. P. 328329.

59. Gatti G., Rivero V., Motrich R.D., Maccioni M. Prostate epithelial cells can act as early sensors of infection by up-regulating TLR4 expression and proinflammatory mediators upon LPS stimulation. // J. Leukoc. Biol. 2006. V. 79. N5. P. 989-998.

60. Goetz R.M., Morano I., Calovini T., Studer R., Holtz J. Increased expression of endothelial constitutive nitric oxide synthase in rat aorta during pregnancy. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 205. P. 905-910.

61. Gotoh T., Mori M. Arginase II downregulates nitric oxide (NO) production and prevents NO-mediated apoptosis in murine macrophage-derived RAW 264.7 cells. II J. Cell. Biol. 1999. V. 144. N 3. P. 427-434.

62. Green L., Wagner D., Glogowski J., Skipper P., Wishnok J.S., Tannenbaum S.R. Analysis of nitrate, nitrite, and 15N.nitrate in biological fluids. I I Anal. Biochem. 1982. V. 126. P. 131-134.

63. Gu Z:, Kaul M:, Yan B:, Kridel S.J., Cui J., Strongin A, Smith J.W., Liddington R.C., Lipton S.A. S-nitrosylation of matrix metalloproteinases: signaling pathway to neuronal cell death. // Science. 2002. V. 297. N 5584. P. 1186-1190.

64. Guzik T.J., Korbut R., Adamek-Guzik T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. // J. Physiol. Pharmacol. 2003. V. 54. N 4. P. 469-487.

65. Hammermann R., Stichnote C., Closs E.I., Nawarth H., Racke K. Inhibition of nitric oxide synthase abrogates lipopolysaccharides-induced up-regulation of L-arginine uptake in rat alveolar macrophages. // Br. J. Pharmacol. 2001. V. 133. N 3. P. 379-386.

66. Hao C.M., Komhoff M., Guan Y., Redha R., Breyer M.D. Selective targeting of cyclooxigenase-2 reveals its role in renal medullary interstitial cell survival. // Am. J. Physiol. 1999. V. 277. N 3. Pt. 2. P. F352-F359.

67. Harris R.C., McKanna J.A., Akai Y., Jacobson H.R., Dubois R.N., Breyer M.D. Cyclooxigenase-2 is associated with the macula densa of rat kidney and increases with salt restriction. II J. Clin. Invest. 1994. V. 94. N 6. R 2504-2510.

68. Hattori Y., Kasai K., Gross S. S. Cationic amino acid transporter gene expression in cultured vascular smooth muscle cells and in rats. // Am. J. Physiol. 1999. V. 276. N 6. Pt. 2. P. 2020-2028.

69. Hiraku Y., Kawanishi S., Ichinose T., Murata M. The role of iNOS-mediated DNA damage in infection- and asbestos-induced carcinogenesis. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010. V. 1203. P. 15-22.

70. Icking A., Matt S., Opitz N., Wiesenthal A., Miiller-Esterl W., Schilling K. NOSTRIN functions as a homotrimeric adaptor protein facilitating internalization of eNOS. // J. Cell Sci. 2005. V. 118. Pt 21. P. 5059-5069.

71. Jenkinson C.P., Grody W.W., Cederbaun S.D., Comparative properties of arginases // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 1996. V. 114. P. 107-132.

72. Joerink M., Savelkoul H.F., Wiegertjes G.F. Evolutionary concervation of alternative activation of macrophages: structural and functional characterization of arginase 1 and 2 in carp (Cyprinus carpio L.) // Mol. Immunol. 2006. V. 43. P. 1116-1128.

73. Johann A.M., Barra V., Kuhn A.M., Weigert A., von Knethen A., Brüne B. Apoptotic cells induce arginase II in macrophages, thereby attenuating NO production. // FASEB J. 2007. V. 21. N 11. P. 2704-2712.

74. Kavanaugh M.P., Wang H., Zhang Z., Zhang W., Wu Y.N., Dechant E., North R.A., Kabat D. Control of cationic amino acid transport and retroviral receptor functions in a membrane protein family. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. N 22. P. 15445-15450.

75. Kim S.F., Huri D.A., Snyder S.H. Inducible nitric oxide synthase binds, S-nitrosylates, and activates cyclooxygenase-2. // Science. 2005. V. 310. N 5756. P. 1966-1970.

76. Kleinert H., Pautz A., Linker K., Schwarz P.M. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase. // Eur. J. Pharmacol. 2004. V. 500. N 1-3. P. 255266.

77. Kleinert H., Schwarz P.M., Förstermann U. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase. II Biol Chem. 2003. V. 384. N 10-11. P. 13431364.

78. Kobayashi O., Miwa H., Watanabe S., Tsujii M., Dubois R.N., Sato N. Cyclooxygenase-2 downregulates inducible nitric oxide synthase in rat intestinalepithelial cells. II Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol 2001. V. 281. P. G688-G696.

79. Kobayashi Y. The regulatory role of nitric oxide in proinflammatory cytokine expression during the induction and resolution of inflammation. // J. Leukoc. Biol. 2010. V. 88. N6. P. 1157-1162.

80. Kolluru G.K., Siamwala J.H., Chatterjee S. ENOS phoshorylation in helth and disease. H Biochimie. 2010. V. 92. N 9. P. 1186-1198.

81. Kone B.C., Baylis C. Biosynthesis and homeostatic roles of nitric oxide in normal kidney. II Am. J. Physiol. Renal Physiol. 1997. V. 272. P. F561-F578.

82. Kone B.C. Protein-protein interactions controlling nitric oxide synthases. // Acta Physiol. Scand. 2000. V. 168. N 1. P. 27-31.

83. König P., Dedio J., Müller-Esterl W., Kummer W. Distribution of the novel eNOS-interacting protein NOSIP in the liver, pancreas, and gastrointestinal tract of the rat. // Gastroenterology. 2002. V. 123. N 1. P. 314-324.

84. Kubes P., Suzuki M., Grander D.N., Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88, N 11. P. 46514655.i

85. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. II Nature. 1970. V. 227. N 5259. P. 680-685.

86. Lahera V., Salom M. G., Miranda-Guardiola F., Moncada S., Romero J. C. Effects of NG-nitro-L-arginine methyl ester on renal function and blood pressure. II Am. J. Physiol. 1991. V. 261. N 6. Pt. 2. P. F1033-1037.

87. Lam H.H., Hanley D.F., Trapp B.D., Saito S., Raja S., Dawson T.M., Yamaguchi H. Induction of spinal cord neuronal nitric oxide synthase (NOS) after formalin injection in the rat hind paw. // Neurosci. Lett. 1996. V. 210. P. 201-204

88. Lee S.J., Beckingham K., Stull J.T. Mutations at lysine 525 of induciblenitric-oxide synthase affect its Ca2+-independent activity. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N 46. P. 36067-36072.

89. Leiper J., Vallance P. Biological significance of endogenous methylarginines that inhibit nitric oxide synthases. // Cardiovasc. Res. 1999. V. 43. N3. P. 542-548.

90. Li H., Poulos T.L. Structure-function studies on nitric oxide synthases. // J. Inorg. Biochem. 2005. V. 99. N 1. P. 293-305.

91. Liao J.K., Zulueta J.J., Yu F.S., Peng H.B., Cote C.G., Hassoun P.M. Regulation of bovine endothelial constitutive nitric oxide synthase by oxygen. // J. Clin. Invest. 1995. V. 96 P. 2661-2666

92. Liu V.W., Huang P.L. Cardiovascular roles of nitric oxide: a review of insights from nitric oxide synthase gene disrupted mice. // Cardiovasc. Res. 2008. V. 77. N 1. P. 19-29.

93. Louis C.A., Reichner J.S., Henry W.L., Mastrofrancesco B., Gotoh Y., Mori M., Albina J.E. Distinct arginase isoforms expressed in primary and transformed macrophages: regulation by oxygen tension // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. R775-R782.

94. Lu Y.C., Yeh W.C., Ohashi P.S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. // Cytokine. 2008. V. 42. N 2. P. 145-151.

95. Lumme A., Vanhatalo S., Sadeniemi M., Soinila S. Expression-of nitric oxide synthase in hypothalamic nuclei following axonal injury or colchicine treatment. II Exp. Neurol. 1997. V. 144. P. 248-257

96. MacAllister R.J., Rambausek M.H., Vallance P., Williams D., Hoffmann K.H., Ritz E. Concentration of dimethyl-L-arginine in the plasma of patients with end-stage renal failure. // Nephrol. Dial. Transplant. 1996. V. 11. N 12. P. 2449-2452.

97. MacMicking J., Xie Q.W., Nathan C. Nitric oxide and macrophage function. // Annu. Rev. Immunol. 1997. V. 15. P. 323-350.

98. Majid D.S., Williams A., Kadowitz P.J., Navar L.G. Renal responses to intraarterial administration of nitric oxide donor in dogs. // Hypertension. 1993. V. 22. N4. P. 535-541.

99. Mann G.E., Yudilevich D.L., Sobrevia L. Regulation of amino acid and glucose transporters in endothelial and smooth muscle cells. // Physiol. Rev.2003. V. 83. N 1. P. 183-252.

100. Manner C.K., Nicholson B., MacLeod C.L. CAT2 arginine transporter deficiency significantly reduces iNOS-mediated NO production in astrocytes. // J. Neurochem. 2003. V. 85. N 2. P. 476-482.

101. Martin P.Y., Bianchi M., Roger F., Niksic L., Féraille E. Arginine vasopressin modulates expression of neuronal NOS in rat renal medulla. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2002. V. 283. P. F559-F568.

102. Massion P.B., Feron O., Dessy C., Balligand J.L. Nitric oxide and cardiac function: ten years after, and continuing. // Circ. Res. 2003. V. 93. N 5. P. 388398.

103. Meulemans A. Diffusion coefficients and half-lives of nitric oxide and N-nitroso-L-arginine in rat cortex. // Neurosci. Lett. 1994. V. 171. N 1-2. P. 89-93.

104. Michel T., Vanhoutte P.M. Cellular signaling and NO production. // Pflugers Arch. 2010. V. 459. N 6. P. 807-816.

105. Mohamed S.A., Fahmy A.S., Mohamed T.M., Hamdy S.M. Urea cycle of Fasciola gigantica: purification and characterization of arginase // Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 2005. V. 142. P. 308-316.

106. Mori M., Gotoh T. Arginine metabolic enzymes, nitric oxide and infection. // JNutr. 2004. V. 134. N 10. P. 2820S-2825S

107. Mori M., Gotoh T. Regulation of nitric oxide production by arginine metabolic enzymes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 275. N 3. P. 715-719.

108. Mori T., Dickhout J.G., Cowley A.W.Jr. Vasopressin increses intracellular NO concentration via Ca(2+) signaling in inner medullary collecting duct. // Hypertension. 2002. V. 39. N 2. Pt. 2. P. 465-469.

109. Morris S.M., Bhamidipati D., Kepka-Lenhart D. Human type II arginase: sequence analysis and tissue-specific expression // Gene. 1997. V. 193. P. 157161.

110. Morris S.M Jr., Kepka-Lenhart D., Chen L.C. Differential regulation of arginases and inducible nitric oxide synthase in murine macrophage cells. // Am. J. Physiol. 1998. V. 275. N 5. Pt. 1. P. E740-E747.

111. Morrissey J.J., McCracken R., Kaneto H., Vehaskari M., MontanLD., Klahr S. Location of an inducible nitric oxide synthase mRNA in the normal kidney. // Kidney Int. 1994. V. 45. N 4. P. 998-1005.

112. Musicki B., Ross A. E., Champion H. C., Burnett A. L., Bivalacqua T. J. Posttranslational modification of constitutive nitric oxide synthase in the penis. // J. Androl. 2009. V. 30. N 4. P. 352-362.

113. Nicholson B., Manner C.K., Kleeman J., MacLeod C.L. Sustained nitric oxide production in macrophages requires the arginine transporter CAT2. // J. Biol Chem. 2001. V. 276. N 19. P. 15881-15885.

114. Nicholson B., Sawamura T., Masaki T., MacLeod C. L. Increased Cat3-mediated cationic amino acid transport functionally compensates in Catl knockout cell lines. II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N 24. P. 14663-14666.

115. Niese K.A., Chiaramonte M.G., Ellies L.G., Rothenberg M.E., Zimmermann N. The cationic amino acid transporter 2 is induced in inflammatory lung models and and regulates lung fibrosis. // Respir. Res. 2010. V. 11. P. 87-96.

116. Nowicki B., Singhal J., Fang L., Nowicki S., Yallampalli C. Inverse relationship between severity of experimental pyelonephritis and nitric oxide production in C3H/HeJ mice. I I Infect. Immun. 1999. V. 67.N 5. P. 2421-2427.

117. Palacin M., Estevez R., Bertran J., Zorzano A. Molecular biology of mammalian plasma membrane amino acid transporters. // Physiol. Rev. 1998. V. 78. N4. P. 969-1054.

118. Palmer R.M., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. //Nature. 1987. V. 327. N6122. P. 524-526.

119. Palsson-McDermott E.M., O'Neill L.A. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. // Immunology. 2004. V. 113. N 2. P. 153-162.

120. Pan M., Souba W.W., Karinch A.M., Lin C.M., Stevens B.R. Specific reversible stimulation of system y(+) L-arginine transport activity in human intestinal cells. II J. Gastrointest. Surg. 2002. V. 6. N 3. P. 379-386.

121. Poljakovic M., Karpman D., Svanborg C., Persson K. Human renal epithelial cells express iNOS in response to cytokines but not bacteria. // Kidney Int. 2002. V. 61. N 2. P. 444-455.

122. Poljakovic M., Persson K. Urinary tract infection in iNOS-deficient mice with focus on bacterial sensitivity to nitric oxide. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2003. V. 284. N 1. P. F22-F31.

123. Poljakovic M., Svensson M.L., Svanborg C., Johansson K., Larsson B., Persson K. Escherichia coli-induced inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase expression in the mouse bladder and kidney. // Kidney Int. 2001. V. 59.N3.P. 893-904.

124. Prestes-Carneiro L.E., Shio M.T., Fernandes P.D., Jancar S. Cross-regulation of iNOS and COX2 by its products in murine macrophages under stress conditions. // Cell Physiol.Biochem. 2007. V.20. P. 283-292.

125. Raetz C.R., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 635-700.

126. Ratovitski E.A., Bao C., Quick R.A., McMillan A., Kozlovsky C., Lowenstein CJ. An inducible nitric oxide synthase (NOS)-associated protein inhibits NOS dimerization and actyivity. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. R 30250-30257.

127. Rebl A., Goldammer T., Seyfert H.M. Toll-like receptor signaling in bony fish. // Vet. Immunol. Immunopathol. 2010 V. 134. N 3-4. P. 139-150.

128. Reid I.A., Chiu YJ. Nitric oxide and the control of renin secretion. // Fundam. Clin. Pharmacol. 1995. V. 9. N 4. P. 309-323.

129. Reiser P.J., Kline W.O., Vaghy P.L. Induction of neuronal type nitric oxide synthase in skeletal muscle by chronic electrical stimulation in vivo. // J. Appl. Physiol. 1997. V. 82. P. 1250-1255

130. Rodriguez S., Schleiffer R., Raul F., Richert L., Berthelot A. How could aortic arginase activity enhancement be involved in DOCA-salt hypertension? // Clin. Exp. Hypertens. 2004. V. 26. P. 1-12.

131. Roman L.J., Masters B.S. Electron transfer by neuronal nitric-oxide synthase is regulated by concerted interaction of calmodulin and two intrinsic regulatory elements. // J. Biol. Chem: 2006 V. 281. P. 23111 -23118.

132. Ronald A. The etiology of urinary tract infection: traditional, and emerging pathogens. II Am. J. Med. 2002. V. 113. P. 14S-19S.

133. Saibara T., Ono M., Iwasaki S., Maeda T., Onishi S., Hayashi Y., Enzan H. Effects of ethanol on L-arginine transport in rat Ito cells in relation to nitric oxide production. II Alcohol Clin. Exp. Res. 2001. V. 25 (6 Suppl). P. 39S-45S.

134. Schilling J.D., Mulvey M.A., Vincent C.D., Lorenz R.G., Hultgren S.J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. II J. Immunol. 2001. V. 166. P. 1148-1155.

135. Scolnick L.R., Kanyo Z.F., Cavalli R.C., Ash D.E., Christianson D.W. Altering the binuclear manganese cluster of arginase diminishes termostability and catalic function II Biochemistry. 1997. V. 36 N 34. P. 10558-10565.

136. Sessa W.C. eNOS at a glance. // J. Cell Sei. 2004. V. 117. P. 2427-2429

137. Sessa W.C. Regulation of endothelial derived nitric oxide in health and disease. II Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005. V. 100 (Suppl 1). P. 15-18.

138. Singh R., Pervin S., Karimi A., Cederbaum- S., Chaudhuri G. Arginase activity in human breast cancer cell lines: NG-hydroxi-L-arginine inhibits cell proliferation and induces apoptosis in MDA-MB-468 cells // Cancer Res. 2000. V.60. P. 3305-3312.

139. Sivick K.E., Mobley H.L. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. // Infect. Immun. 2010. V.78. N 2. P. 568585.

140. Smith W.L., Langenbach R. Why there are two cyclooxygenase isozymes. II J. Clin. Invest. 2001. V. 107. N 12. P. 1491-1495.

141. Stamler J.S., Jia L., Eu J.P., McMahon T.J., Demchenko I.T., Bonaventura J., Gernert K., Piantadosi C.A. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient. // Science. 1997. V.276. N 5321. P. 20342037.

142. Stamler J.S. Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide. // Cell. 1994. V. 78. N 6. P. 931-936.

143. Steppan J., Ryoo S., Schuleri K.H., Gregg C., Hasan R.K., White A.R.,i

144. Bugaj L.J., Khan M., Santhanam L., Nyhan D., Shoukas A.A., Hare J.M., Berkowitz D.E. Arginase modulates myocardial contractility by a nitric oxide synthase 1-dependent mechanism // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 2006. V. 103. P. 4759-4764.

145. Swain P., Nayak S.K., Nanda P.K., Dash S. Biological effects of bacteriali lipopolysaccharide (endotoxin) in fish: a review. // Fish Shellfish Immunol. 2008.1. V. 25.N3.P. 191-201.

146. Takeda K, Akira S. TLR signaling pathways. // Semin. Immunol. 2004. V.16. N l.P. 3-9.

147. Terasaki K., Spector E.B., Hendrickson R., Cederbaum S.D. Properties of arginase from liver of Macaca fascicularis; comparison of normals with redblood cell arginase deficient monkeys // Biochem. Genet. 1980. V. 18. P. 829841.

148. Tan C., Mui A., Dedhar S. Integrin-linked kinase regulates inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression in an NF-kappa B-dependent manner. II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. N 5. P. 3109-3116.

149. Torok N.J., Higuchi H., Bronk S., Gores G.J. Nitric Oxide Inhibits Apoptosis Downstream of Cytochrome c Release by Nitrosylating Caspase 9. // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 1648-1653.

150. Uchiyama M., Konno N. Hormonal regulation of ion and water transport in anuran amphibians. // Gen. Comp. Endocrinol. 2006. V. 147. N 1. P. 54-61.

151. Vallance P., Collier J. Biology and clinical relevance of nitric oxide. // BMJ. 1994. Y. 309. N 6952. P. 453-457.

152. Verrey F., Closs E.I., Wagner C.A., Palacin M., Endou H., Kanai Y. FCATs and HATs: the SLC7 family of of amino acid transporters. // Pfliigers Arch. Europ. J. Physiol 2003. V. 447. N 5. P. 532-542.

153. Wang X., Lu M., Gao Y., Papapetropoulos A., Sessa W.C., Wang W. Neuronal nitric oxide synthase is expressed in principal cell of collecting duct. // Am. J. Physiol 1998. V. 275. N 3. Pt 2. P. F395-399.

154. Weber C.M., Eke B.C., Maines M.D. Corticosterone regulates heme oxygenase-2 and NO synthase transcription and protein expression in rat brain. // J. Neurochem. 1994. V. 63. P. 953-962.

155. Weiner C.P., Knowles R.G., Stegink L.D., Dawson J., Moncada S. Myometrial arginase activity increases with advancing pregnancy in the guinea pig II Am. J. Obstet. Gynecol 1996. V. 174. P. 779-782.

156. Weiner C.P., Lizasoain I., Baylis S.A., Knowles R.G., Charles I.G., Moncada S. Induction of calcium-dependent nitric oxide synthases by sex hormones. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 5212-5216.

157. West S.D., Suliburk J.W., Helmer K.S., Mercer D.W. Cyclooxygenase-1 suppresses lipopolysaccharide-induced changes in rat gastric inducible nitric oxide synthase. // Crit. Care Med. 2008. V. 36. N 2. P. 572-579.

158. White A.R., Ryoo S., Li D., Champion H.C., Steppan J., Wang D., Nyhan D., Shoukas A.A., Hare J.M., Berkowitz D.E. Knockdown of arginase I restores

159. NO signaling in the vasculature of old rats // Hypertension. 2006. V. 47. P. 245251.

160. Xia C., Misra I., Iyanagi T., Kim J-J. P. Regulation of Interdomain Interactions by Calmodulin in Inducible Nitric Oxide Synthase. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. N 44. P. 30708-30717.

161. Xia Y., Zweier J.L. Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric oxide synthase in macrophages. // Proc. Natl. Acad. Set USA. 1997. V. 94. N 13. P. 6954-6958.

162. Xu L., Eu J.P., Meissner G., Stamler J.S. Activation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) by poly-S-nitrosylation. // Science. 1998. V. 279. N 5348. P. 234-237.

163. Yang T., Singh I., Pham H., Sun D., Smart A., Schnermann J.B., Briggs J.P. Regulation of cyclooxygenase expression in the kidney by dietary salt intake. // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. N 3. Pt. 2. P. F481-489.

164. Yang T., Sun D., Huang Y.G., Smart A., Briggs J.P., Schnermann J.B. Differential regulation of COX2 expression in the kidney by lipopolysaccharide: role of CD14. II Am. J. Physiol. 1999. V. 277. N 1. Pt. 2. P. F10-16.

165. Yilmaz A., Shen S., Adelson D.L., Xavier S., Zhu J.J. Identification and sequence analysis of chicken Toll-like receptors. H Immunogenetics. 2005. V. 56. N 10. P. 743-753.

166. Yip M.C.M., Knox W.E. Function of arginase in lactating mammary gland. II Biochem. J. 1972. V. 127. P. 893-899.

167. Zhang C., Hein T.W., Wang W., Miller M.W., Fossum T.W., McDonald M.M., Humphrey J.D., Kuo L. Upregulation of vascular arginase in hypertension decreases nitric oxide-meditated dilation of coronary arterioles. // Hypertension. 2004. V. 44. P. 935-943.

168. Zhou J., Kim D.D., Peluffo R.D. Nitric oxide can acutely modulate its biosynthesis through a negative feedback mechanism on L-arginine transport in cardiac myocytes. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2010. V. 299. N 2. P. C230-239.

169. Zhou L., Zhu D.Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. // Nitric Oxide. 2009. V. 20. N 4. P. 223-230.

170. Ziche M., Morbidelli L. Nitric oxide and angiogenesis. // J. Neurooncol. 2000. V. 50. N 1-2. P. 139-148.

Информация о работе

Николаева, Светлана Дмитриевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Молекулярные механизмы регуляции продукции оксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы