Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансплантация эмбриональной ткани мозга при экспериментальной эпилепсии

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Трансплантация эмбриональной ткани мозга при экспериментальной эпилепсии"

0^9*1

рте*

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.С. БЕРИТАШВИЛИ

На правах рукописи

КОКАЯ МЕРАБ ГЕДЕЗАНОВИЧ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТКАНИ МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

ЭПИЛЕПСИИ

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТБИЛИСИ - 1991

^ >> - / ^ ' < ^ ' о .

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.С.Бериташвили АН РГ (директор - член корреспондент АН Грузии, профессор В.М.Мосидзе) и Институте Клеточной Медицины Лундского университета, Швеция (руководитель лаборатории проф. А.Берклунд).

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик АМН СССР, профессор О.С.Адрианов

доктор биологических наук, акдемик АН Грузии, профессор Т.Н.Ониани

доктор биологических наук, профессор И.К.Сванидзе

Ведущее учреждение - Институт теоретической и экспериментальной биофизики АН СССР

Зашита состоится .ир 1991 г. в часов на

заседании Специализированного^ совета Д-007.0Э.01 при Институте физиологии им. И.С.Бериташвили АН Гузии. Адрес: 380060, Тбилиси, ул. Готуа, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.С.Бериташвили АН Грузии.

Автореферат разослан « В « ; <1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Н.Г.Букиа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трансплантация нервной ткани является одной из важнейших фундаментальных проблем' современной нейробиоло-гической науки, которая приобретает особенно большой практический интерес в связи с исследованием таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Паркинсона, Хантингтона, Альцгеймерз и др. Метод пересадки мозговой ткани дает возможность, с одной стороны, изучить основы развитая, дифференциации, специализации и регенерации, а также биохимические, иммунологические и анатомо-морфологические особенности нервной ткани, а с другой - разработать и в последующем внедрить в медицинскую практику эффективные терапевтические методы лечения тех заболеваний ВДС, в основе которых лежит селективное и постоянно прогрессирующее перерождение нейронных груш определенных типов.

В настоящее время накоплен богатый экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что эмбриональные нейроны, пересаженные в разные структуры мозга взрослых млекопитающих, могут восстанавливать поврежденные нервные связи мозга реципиента путем замены погибших, или перерожденных его элементов. Эти исследования, в противоположность традиционным взглядам, привели к осознанию того факта, что,, зрелая ткань ВДС млекопитающих распологает потенциальной возможностью интегрирования в свои сформировавшиеся нервные цепи новых нейро-нальных элементов и, что эти имплантированные элементы в состоянии модифицировать функции и поведение самих реципиентов. Несмотря на неоспоримость полученных экспериментальных данных, до сих пор не существует единого мнения о возможных механизмах действия трансплантатов нервной ткани на различные функции мозга реципиента.

Исследование проблемы эпилепсии дает возможность выявить не только те интимные механизмы, которые лежат в основе происхождения, течения и завершения этого патологического состояния, но и открывает широкие перспективы для получения фундаментальных знаний в области нормального Функционирования отдельных клеточных систем ВДС. Одним из наиболее широко используемых методов экспериментальной эпилепсии животных является т.н. «раскачка», впервые описанная Годдардои и соавт. в 1969 году (соаавга в1 в!.. 19вэ). Несмотря на то, что данная модель эпилепсии весьма интенсивно изучается многими исследователями

и что удалось продемонстрировать важную тормозящую роль норадренергической системы синего пятна б процессе раскачки, вызываемой из амигдалы и гклпокампа, до сих пор не полностью ясны тонкие клеточные и фармакологические механизмы развития данной патологии.

В настоящее время, наряду с многочисленными экспериментальными исследованиями по изучению пересадки мозговой ткани в некоторых моделях вышеописанных нейродегенеративных заболеваний, также предпринимаются отдельные попытки изучения возможного влияния трансплантации различных типов эмбриональных нейронов на судорожную эпилептическую активность, вызванную в экспериментальных животных. Несмотря на то, что, в некоторых случаях, было продемонстрировано подавление генерализации судорожной активности трансплантатами определенных типов нервной ткани (Barry «t ai.. 1987 Carou, Privat., 1988), всеже не удалось окончательно установить те возможные механизмы, которые могут определять этот эффект.

Исходя из всего вышеизложенного, исследование влияния пересадки эмбриональной нервной ткани на развитие экспериментальной эпилепсии, может выявить некоторые закономерности как нормальной так и патологической активности нейронных систем головного мозга во время судорожнеой активности, а также определить те интимные механизмы и которые лежат в основе восстановления потерянных функций, модуляции возбудимости и регенерации нервной ткани. Все это имеет несомненное теоретическое и практическое значение и является весьма актуальной проблемой современной нейробиологической науки.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования было определение тех специфических нейрофизиологических и иейрофармакологических механизмов, которые лежат в. основе подавления судорожной активности мозга при пересадке эмбриональной нервной ткани.

Для достижения данной цели в работе были решены следувдие конкретные задачи:

- изучена возможность применения метода микродиализа мозга в определении синаптической активности норадренергических окончаний в гиппокакпе крыс:

- проведен анализ динамики высвобождения НА и серотонина во время фокальных и генерализованных судорог при развитии раскачки в

гиппокампе:

- исследована динамика высвобождения НА в гиппокампе и изучены фармакологические особенности возможного его тормозящего влияния на процесс генерализации судорог во время развития т.н. быстрой раскачки;

- исследовано тормозящее влияния пересадки клеточной суспензии эмбриональной ткани синего пятна унилатералъно в пшпокамп и билатерально в отдаленные от стимулирующих электродов участки мозга, в частности в амигдала-пириформную кору, на скорость развития генерализованных судорог при раскачке в гиппокампе крыс с повышенной предрасположенностью к эпилептизашш, вызванной разрушением внутренней норадренергической системы;

- изучено тормозящее влияния пересадки клеточной суспензии аллогенной эмбриональной ткани синего пятна на процесс генерализации судорог при быстрой раскачке в гиппокампе крыс с повышенной возбудимостью, вызванной разрушением внутренней норадренергической системы;

- определена специфичность эффектов трансплантатов эмбрионального синего пятна на процесс раскачки по отношению к норадренергическим нейронам;

- исследована динамика регулируемого синаптического высвобож-' дения НА из трансплантированных норадренергических нейронов эмбрионального синего пятна в ответ на генерализованные судороги.

Научная новизна результатов исследования. Использование оригинального метода микродиализа мозга в свободном поведении животных, с применением последующего усовершенствованного нами радиоферментативного теста для анализа внеклеточного уровня НА в гиппокампе, позволило впервые показать значительное увеличение высвобождения НА во время развития фокальных и генерализованных судорог, вызванных раскачкой в гиппокампе. Впервые показано, что это увеличение высвобождения НА носит специфический характер, поскольку таковое не наблюдается, например, в случае серотонина и его метаболитов. Впервые показано также , что во время быстрой раскачки происходит сильное увеличение внеклеточного уровня НА поело первых же стимуляций гигатокампа, которое с последующими стимуляциями постепенно снижается и приходит к первоначальному уровню. Одновременно с этим протекает усиление генерализации судорожной активности.

Впервые показано, что устойчивый фоновый уровень внеклеточного НА в гиппокампе после завершения раскачки значительно ниже по сравнению с таковым в интгктных животных. На основаниии анализа высвобождения НА в гиппокампе с использованием мияродизлизного метода до и после перерезки восходяица норадревергических путей у животных с завершенной раскачкой нами впервые показано, что наблюдаемое увеличение выброса НА при развитии генерализованных судорог резко снижается после операции.

Все вышеизложенное свидетельствует о мощной активации норадре-нергической системы синего пятна и о длительном сохранении изменений в нейромедагторной тормозящей передаче этой системы в процессе эпилептизации и после его завершения.

Впервые показана нормализация скорости генерализации судорог при раскачке в гиппокампе у животных с, повышенной предрасположенностью к эпилептизации, вызванной предварительным разрушением внутренней норадренергкческой системы трансплантатами клеточных суспензий эмбриональной ткани синего пятна, пересаженными в область амиг-дала-пириформной коры.

Впервые показано, что билатеральная аллотрзнсплантация эмбрионального синего пятна в гиппокамп нормализует развитие судорог при быстрой раскачке в животных с предварительно разрушенными катехо-ламинергическими системами. Впервые продемонстрировано, что сингенная унилатеральная внутригиппокампальная трансплантация данной области в таких животных не влияет на процесс генерализации судорог при традиционной раскачке.

Также впервые показано,' что аналогично внутренней норадренер-гической системе, во время развития генерализованных судорог, из гиппокампальных трансплантатов синего пятна происходит регулируемое увеличение сикаптического" высвобождения, а' также, восстановление фонового уровня внеклеточного содержания НА в гиппокампе животных с предварительно разрушенной норадренергической системой.

Впервые было продемонстрировано устранение торможения процесса генерализации судорог гигаюкампальными трансплантатами эмбрионального синего пятна при блокировании альфа-2 адренергических постсинапти-ческих рецепторов,

Все вышеуказанное свидетельствует о том, что трансплантаты

эмбрионального синего пятна оказывает свое тормозящее влияние на процесс генерализации судорог при раскачке в гиппокампе путем активации специфического механизма норадренергических нейронов и, что несмотря на свое эктопическое расположение, они, по-видимому хорошо интегрируются в нейронные цепи гкппокампзльной формации реципиента.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование тонких нейрсбиологлческих. механизмов процесса эпилеп-тизации нервной системы и подавления судорожной активности, с использованием методов микродиализа мозга и пересадки мозговой ткани, а таете иммуногистохимических, гистофлуоресценткых, биохимических и фармакологических подходов, имеет большое теоретическое и практическое значение. Представляется возможность по новому взглянуть на роль норадренергической системы ШС, в частности системы синего пятна, в осуществлении защиты от чрезмерной активации отдельных, особенно лимбических, структур головного мозга, что, в случав периодического повторения может привести к возникновению эпилептического очага с его последующей генерализацией и развитием моторных судорог.

Показанное в работе увеличение выброса НА из нервных окончаний аксонов норадренергических нейронов в результате активации их тел на уровне продолговатого мозга в синем пятне во время возникновения Фокальных и"генерализованных судорог, играет важную роль в расширении наших знаний о тех синаптических тормозящих механизмах, нарушение которых может лежать в основе происхождения различных эпилептических состояний в ЦНС и дает определенные предпосылки для разработки фармакологических подходов в лечении эпилептических заболеваний.

Изученная в работе роль трансплантации эмбриональной нервной ткани синего пятна в регулировании предрасположенности к эпилеп-тизации мозга взрослых реципиентов, углубляет' наше понимание функционального интегрирования таких трансплантатов в уже сформировавшиеся нервные цепи, с одновременным изменением их функцинального состояния. Подавление генерализации судорожной активности пересадкой определенного типа эмбриональной нервной ткани в различные критические для эпилептизации структуры головного мозга может иметь неоценимое практическое значение длч разработки методов нейрохирургического лечения эпилептических заболеваний с использованием метода внутримозговой трансплантации. Практическое

значение этого метода уже подтверждается многочисленными успешными клиническими попытками использования такого подхода в лечении Паркинсонизма.

Результаты работы могут быть использованы при чтении учебных курсов нейрофизиологии, неврологии и .невропатологии в ВУЗах биологического и медицинского профилей, а также могут быть в дальнейшем внедрены в невролдогических и нейрохирургических клиниках. Основные положения выносимые на защиту,

1. Изменения содержания НА в микродиализных перфузатах гиппокампа отражает изменения в сикаптической активности норадренергической системы синего пятна крыс:

- стимуляция синаптических окончаний повышением концентрации КС1 в перфузирувщем растворе, а также блокироание поглощения НА сияаптическишг окончаниями добавлением дезипрамина, приводит к значительному увеличению концентрации НА в перфузатах;

- блокирование потенциалов действия аксонов путем добавления в пер$уз1фую15ий раствор блокатора натриевых каналов тетродотоксина на фоне действия дезипрамина приводит к резкому падению содержания НА в перфузате:,

- галотановый наркоз значительно уменьшает концентрацию НА в префузате; •

- нейронное происхождение НА доказывает понижение его содержания в перфузате ниже уроня детекции после разрушения норадренергической системы внутрижелудочковымм введением катехоламинергического нейротоксина, 6-гидроксидофамина (6-ГДА)

2. Нейротоксическое разрушение норадренергической системы мозга частично компенсируется с течением времени:

- низкое содержание НА в перфузате гиппокампа, не поддающееся определению на второй неделе после внутрижелудочкового введения 6-ГДА, постепенно восстанавливается до уровня детекции, на 4-8 неделе, не достигая контрольного значения,-

-при этом увеличение высвобождения НА в ответ на повышение концентрации КС1 в перфуэирующем растворе и генерализованную судорогу сильно подавлено;

3. Фоновый устойчивый уровень внеклеточного НА значительно уменьшается после завершения процесса раскачки, однако норадренергическая система синего пятна сохраняет способность

реагировать на развитие судорог увеличения высвобождения НА:

- гиппокампалыже перфузаты интактных животных содержат значительно высокие концентрации НА по сравнению с животными подвергшихся процессу польной раскачки;

- развитие как Фокальных (интактные животные), так и генерализованных судорог (животные подвергшиеся полной раскачке) приводит к одинаковому повышению высвобождения НА в гиппокампа льшх перфузатах;

4. Увеличение высвобождения НА во время развития генерализованных судорог происходит за счет активации тел нейронов синего пятна:

- увеличение высвобождения НА в ответ на генерализованные судороги в ггашокампе устраняется перерезкой восходящих путей синего пятна;

5. Процесс генерализации судорог тесно связан с нарушением нормальной норадренергической нейропередачи в гиппокампе во время быстрой раскачки:

- увеличенный выброс НА в ответ на первоначальные стимуляции быстрой раскачки постепенно уменьшается с последующими раздражениями;

- процесс генерализации судорог во время быстрой раскачки усиливается с уменьшением высвобождения НА;

6. Унилатеральная норадренергическая реиннервация гиппокампа но влияет на процесс генерализации судорог, вызванных раскачкой гиппокампа:

- пересадка норадренергической ткани эмбрионального синего пятна илсилатерально по отношению к раздражающему электроду в гиппокамп не способна повлиять на развитие раскачки;

7. Реиннервация норадренергическими волокнами амигдала-пириформной коры достаточна для подавления генерализации 'судорог, вне зависимости от места их первоначального возникновения:

- пересадка норадренергической эмбриональной ткани в область амигдала-пириформной коры в животных с повышенным предрасположением к судорогам связанным с предварительным разрушением норадренергичесмкой системы, подавляет развитие генерализации судорог, вызываемых раскачкой гиппокампа;

8. Аллогенная эмбриональная норадренергическая ткань способна подавить генерализацию судорог при внутригиппокаыпальной трансплэн-

тации:

- внутригиппокампальнзя пересадка норадренергической эмбриональной ткани между индивидами лабораторной линии беспородных крыс с повышенным предрасположением к судорогам связанным с предварительным разрукением норадрекергичесмкой системы, подавляет развитие генерализации судорог, вызываемых раскачкой гсппокампа ¡

9. Пересаженная эмбриональная ткань оказывает свое подавляющее влияние на развитие генерализации судорог посредством активации эктопически расположенных норадренергических нейронов, которые хорошо интегрированы в мозг реципиента:

- генерализованные судороги вызывают аналогичное нормальному увеличение высвобождения' НА из транспадотированных норадренергических нейронов эмбрионального синего пятна:

- эффект подавления генерализации судорог у крыс с предварительным разрушением норадренергической системы транспалнтатами эмбриональной нервной ткани устраняется при блокировании альфа-2 адарекергических рецепторов взедением идазоксана:

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Ежегодной Международной встрече Общества Нейронаук (ХУ1П - Торонто, 1988); Ежегодной Международной встрече Европейского Общества Нейронаук (XI -Цюрих, ФРГ, 1983; XII - Турин, Италия, I989; XIII - Стокгольм, Швеция, 1990); Четвертой международной встрече «Электрохимическая детекция, ХХ8Д и in vivo наблюдения в бионэуках.» (Ноттингем, Великобритания, 1939); Международной встрече Американского Общества Эпилепсии (Бостон, США, Í939)-, Осенней школе Европейской Образовательной Программы (Кастельвеччио, Лука, Италия, 1990); заседании Физиологического общества Грузии; заседании ученого совета Института физиологии АН Грузии.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 17 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация излсжена на 271 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав и выводов. Работа илюстрирована 22 рисунками и 2 таблицами. Библиография содержит 471 источников, из которых 28 отечественных и 443 иностранных.

- II -

МАТЕРИАЛ И КЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В 01ШТЭХ ИСП0ЛЬ30ВЭЛ1!СЬ крысы ЛИНИИ Зргаеия Dawlcy И

беспородные белые лабораторные крысы обоего, пола весом перед началом экспериментов 180-200 г.

Операции производились на анестезированных животных, которые фиксировались в стереотаксическсы аппарате. Координаты для вживления регистрирующих и разждрэжзющих электродов, а также для микродиализной трубки определялись по атласу Пзксиноса и Ватсока (1982).

После фиксации животных в стереотаксическом аппарате, в черепной кости делались отверстия и вживлялись хронические раздражающиие и регистрирующие биполярные электроды с наружным диаметром 0.25 мм. в следующие структуры мозга: билатерально в дорсальный гиппокамп, в эмигдалу и унилатерэльно в префронтальную кору. В дорсальный гиппокамп рядом с электродом вживлялась и трубка для микродиализа. Индифферентным электродом служила проволока из нержавеющей стали с диаметром 0.1 мм, которая помещалась между мышцами и черепной костью.

Эксперименты на животных обычно производились через 1-2 недели после операции, а в случае применения микродиализной трубки - на следующий день.

Для регистрации электрической активности различных структур мозга применялся многоканальный электроэнцефаллограф (iirass efg and Poiygraph System, модель 79 d). Стимуляция гиппокампа производилась стимулятором ПОСТОЯННОГО тока (Grass s-88).

Обычно раскачка производилась в левом гиппокампе, однако в некоторых случаях, в зависимости от целей эксперимента, производилась стимуляция и правого гиппокампа. Параметры раздражения были: прямоугольные импульсы постоянного тока длительностью I мс, частотой 100 Гц, в течении I с 1-2 раза в день в случае традиционной раскачки и частотой 10 Гц в течении 10 с каждые 5 мин в случае т.н. быстрой раскачки. Сила раздражения подбиралась соответственно порогу для возникновения послеразряда (ПР) в гиппокампе и колебалась в отдельных случаях от 20-40 мкА до 200 мкА в случае традиционной раскачки и 400-600 мкА в случае быстрой раскачки.

Степень генерализации судорог прч раскачке определялась соответственно поведенческому проявлению моторных судорог по

модифицированной степенной шкале Расина (1972): 0-вая степень -нормальное поведение, отряхивание, замирание; I-вая степень - клонус лицевых мышц-, 2-ая степень - жевательные движения, ритмическое кивание головой; 3-я степень - клонус передних конечностей; 4-ая степень - клонус при поднятых передних, конечностьях, падение на передние конечности, клонус задних конечностей; 5-ая степень -падение на бок, или на спину (полная потеря равновесия при судорогах), переворачивание на спину. Раскачка считалась завершенной, когда животные' демонстрировали, по крайней мере, 3 генерализованные судорога 5-ой степени.

Для разрушения центральной норадренергической системы производили внутрижелудочковое введение 250 мкг б-ГДА (sigma) растворенного в 20 мкл физиологического раствора с добавлением 0.2 мг/мл аскорбиновой кислоты.

Блокатор альфа-2 норадренергических рецепторов, идазоксан (Песк i 11 end Colтип i Ни11 у Великобритания) и блокатор бета-адренергических рецепторов, пропранолол (inderal, ici), вводились внутриперитонеально (2 мг/кг) за 20 мин до начала быстрой раскачки и, повторно, через 40 мин после начала быстрой раскачки.

Для перфузии диализной трубки применялся раствор Рингера. При повышении концентрации калия путем увеличения содержания kci é растворе Рингера до 100 мМ, концентрация Nací понижалась до 51 Ш для сохранения физиологической осмолярности раствора. В перфузионную сроду в различных экспериментах также добавлялись блокатор поглощения норадреналина (НА), дезипрамкн (5 мкМ) и блокатор натриевых каналов, тетродотокснн (I мкМ). Микродиализные трубки приготовлялись из гибкой целюлозной трубки (cd Medical International, БрЮССвЛЬ, БеЛЬГИЯ) С наружным диаметром 0.30 мм и молекулярным весом около - 10 ООО. Для микродизлизных трубок, применяемых в этих экспериментах, in vitro концентрация НА в перфузате составляла 18.4-1.5 % от концентрации НА во внешней среде, а для серотонина и его метаболита, 5-гидрокси-индолацетиленовой кислоты (5-ГИАК), 18.8±1.2 -'22.0±0.6655 и 18.8±0.40 - 21.0-0.66* соответственно. Во время эксперимента животные помешались в пластиковую клетку с едой и водой и электроды с помощью разъема зафиксироанного' на черепе крыс, соединялись со стимулирующим и регистрирующим комплексом. Одновременно микродиализная входящая КЭНЮЛЯ подсоединялась с микроинфузионной системой (Carnegie Medicine

ab, Стокгольм, Швеция) посредством жидкостного шарнира, прикрепленного к балансирующему рукаву. 40 сантиметровая пластиковая трубка С внутренним объемом В 12 МКЛ/М (Carnegie Medicino) соединялась с выходящей канюлей и микродиализная трубка перфузировалась с постоянной скоростью 2 мкл/мин раствором Рингера.

Гиппокампальные перфузаты собирались 2 или 15 минутными фракциями в Эппендорфных микропробирках. Первая 120 мин фракция перфузата выбрасывалась, так как содержала излишнее количество нейромедиаторов (Kaien et ai., 198й). Для определения фонового уровня нейромедиаторов в ткани мозга, до каких либо манипуляций, собирались, по крайней мере, три фракции перфузата. Перфузаты с НА немедленно замарзживались в жидком азоте и хранились при температуре -85° С от 2 дней до I месяца прежде чем предпринимался их анализ. Хранение перфузатов до I месяца при таких условиях не влияло на концентрацию НА в образцах. Перфузаты с серотониноы и его метаболитом хранились на льду в течении 24 часов до анализа в Эппендорфных микропробирках, содержащих 825 пМ L-цистеина для предохранения от окисления и 1.5 пМ альфа-метил-серотонина в 5 мкл дистилированной воды, в качестве внутреннего стандарта.

Для определения концентрации НА в перфузате применялся основанный на катехол-0-метил-трансферазе (КОМТ) радиоферментативный, метод, который состоял из комбинации последовательных ступеней инкубации и экстракции, модифицированных от метода Пеулера и Джонсона (1977), и очистки по методу Шмидта и соав. (1982). Этот метод имел чувствительность 3 фМ для НА.

Перфузаты с серотонином и 5-ГИАК анализировались на жидкостном хроматографе высокого давления с флуорометрической детекцией (Kaien

et al. ,1988 ) .

Локализация раздражающих и регистрирующих электродов, а также микродиализной трубки в каждом мозге определялась при помощи окраски срезов мозга керзил виолетовым красителем. Для специфического окрашивания норадренергических нейронов и их волокон применялся метод иммуногистохимического окрашивания дофашн-бета-декарбоксилазы (ДБГ -фермент синтезирующий НА) и тирозин гадроксилазы (ТГ - фермент синтезируший дофамин). Инкубация срезов ио~са, зафиксированного в 4%-ном растворе параформальдегида, с ионоклсяальныы антителом против ДБГ и ТГ (ни, ene Tech Int Inc»i Аллендейл, США) производилась в

течении 36-48 ч. Антитела против ДБГ и ТГ маркировались пероксидаза-знтилероксидазным комплексом, с последующей визуализацией хромогеном, З.З-диаминобензидином. Интенсификацию окраски производили раствором oso^.

Для гистофлуоресцентного окрашивания катехоламинов применялся метод т.н. alfa (злюминий-Формальдегидный) по Лорену и соаз. (1980)

Для определения общего количества катехоламивергических нейронов в трансплантате как при иммуногистохимическом, так и при гистофлуоресцентном методах применяли коэфициент коррекции по формуле Аберкомби (1946).

Для пересадки использовалась область мозговой ткани развивавшегося синего пятна крысиных эмбрионов в возрасте около 13-14 дней после зачатая (кулевым днем считался день- совокупления), что соответствовало длине эмбриона 9-IÏ мм (см. Bjorkiund et ai., iэаь). Область синего пятна и объеме приблизительно I ш3 вырезалась под микроскопическим контролем при помощи специальных микрохирургических ножниц. Вырезанная ткань от 9-15 эмбрионов, переносилась в 50-75 мкл стерильного физиологического раствора, содержащего 0.6% d-глюкозу и путем пипетизации приготовлялась клеточная суспензия для пересадки. При использовании ткани стриатума, суспензия приготовлялась от 15 дневных эмбрионов. В этом случае перед пипетизацией производили, инкубацию вырезанных кусков нервной ткани с 0.15 трипсином (sigma Тура II) при температуре 37° С в течении 15-20 мин с последующей промывкой в физиологическом растворе с 0.6%-noil глюкозой , Пересадка в мозг реципиента осуществлялась при помощи шприца Гамильтона. В каждую инъекционную точку пересаживали 1.5 мкл клеточной суспензии. Координаты для пересадки, в амигдала-пирифсрмной коре были: (I) 4.3 мм каудальнее брегмы, 5.5 ш латеральнее средней линии и 7.5 мм вентргльнее dura mater; (II) 1.3 мы каудальнее брегмы, 4.5 мм латеральнее средней линии и 7.5 ш ввнтральнее iWa muter; (III) 1.2 мм ростральнее брегш, 4.0 мм латеральнее средней линии и 6.5 мм нейтральнее dum .nater. Для гиппокаыпа координаты были: (I) 3.8 ш каудальнее брегш, 3.5 мм латеральнее средней линии и 3.0 мм вентральнео dura mater: (II) 5.3 мм каудальнее брегш, 0.75 мм латеральнее средней линии и инъекция производилась вдоль осевой линии ггатокампа под углом 40° от вертикали в корональном разрезе, с точками для пересадки 7.9, 5.4 и 2.5 ш вевтрэльнее дуры. Для

контрольных животных производилась инъекция физиологического раствора с 0.6 %-ной глюкозой в тех же точках. Эксперименты на этих животных проводились спустя 2-3 месяца и более после пересадки.

Для статистической обработки данных использовались различные методы. В частности, результаты микродиализа обрабатывались при помощи сопряженного (двухстороннего) t-теста Стюдента. Простая линейная регрессия, сопровождаемая (двухсторонним) t-тестом применялась для определения корреляции между длительностью ПР и количеством высвобождаемого медиатора. Для анализа параметров раскачки применялся вариационный анализ с последующими тестами Нюман-Кеулса, Даннета и Шеффе. Статистически достоверным считалась разница при Р<0.05. Все цифровые данные выражены .в средних арифметических - стандартная ошибка средней.

I. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ НОРАДРЕНАМНА ВО ВРЕМЯ СУДОРОГ

Многие вопросы функциональной характеристики норадренергической системы могут быть решены лишь прямым изучением высвобождения НА в мозге, интактных животных. Это относится к влиянию различных афферентов на синаптическую активность норадренергической системы, а также к пониманию функциональной причастности норадренергической системы к неврологическим нарушениям, таким как возрастные и эпилепсия. Наблюдение за синаптической активностью норадренергической системы представляет особый интерес в связи с трансплантацией мозговой ткани, содержащей норадренергические нейроны, для анализа взаимоотношений между трансплантатом и реципиентом.

I.I. Основные характеристики высвобождение НА в гиппокампе.

Для определения внеклеточного уровня большого количества нейромедиаторных веществ ¡„ vivo успешно применяется метод внутримозгового микродиализа (Un«erst«н. 1эш). Однако, непосредственному исследованию вопроса о том, действительно ли уровень НА, измеряемый в микродиализном перфузате, является нейронного происхождения и может ли применяться как показатель высвобождения НА из синаптических окончаний норадренергических

нейронов, посвящены ТОЛЬКО ЛИШЬ две работы (L'Heureux et al., 1986,

Eoutledge, Mersdon. 1907).

Исходя из вышеизложенного, были проведены серии . экспериментов, основными задачами которых были: дальнейшая оценка пригодности метода микродиализа мозга и высокочувствительной радиоферментативной детекции НА в перфузате для определения высвобождения НА.в мозге из нейронных элементов и описание основных характеристик высвобождения НА в гигагокампе бодрствующих и наркотизированных животных.

В бодрствующих, свободно передвигающихся животных, усточивый уровень внеклеточного НА в течении I ч перфузии составлял 6Э±21 фМ/30 мкл (п=6), что примерно в 50 раз выше разрешающей способности теста (см. методику). Содержание животных на руках' экспериментатора в течении 15 мин вызывало увеличение уровня НА на .35 % по сравнению с фоновым значением (Р<0.05). Во время последующих 45 мин уровень НА постепенно уменьшался до нового устойчивого уровня, который был на 26 % ниже первоначального (Р=0.05). Уровень НА в гиппокампе на следующий день эксперимента, который проходил полностью под галотанккм наркозом, составлял 19.3-3.0 фМ/30 мкл, т.е. на 63% ниже, по сравнению с наименьшим уровнем бодрствующего состояния (Р=0.06). Добавление kci (100 мМ) в перфузирующий раствор вызывало 27 кратное увеличение высвобождения НА (Р<0.01).

В животных с предварительным введением б-ГДА за 10-16 дней до эксперимента (п=4), уровень НА во всех фракциях перфузата' был ниже уровня детекции, т.е. меньше 3 фМ. После введения kci в перфузиругацую среду, уровень НА достигал всего лишь 3.4-I.I фМ/30 мкл, что составляло меньше 1-го % от уровня НА в интактных животных. Что же касается группы, подвергшейся введению 6-ГДА за 1-2 месяца до эксперимента, уровень НА во время бодрствования составлял 10.1±2.6 ФМ/30 мкл (п=6). В отличии'от интактных, содержание этих животных на руках не вызывало увеличения высвобождения НА (8.0-2.8 фМ/ЗОмкл). Эффект введения калия на высвобождение НА в 3-х животных, в которых норэдренергическая система была разрушена за 1-2 месяца до начала эксперимента, был слабо выраженным и уровень внеклеточного НА достигал всего лишь 13.3*7.7 фМ/30 мкл.

В интактных животных введение в перфузирующий раствор блокатора поглощения НА - дезипрамина (5 мкМ), увеличивало уровень НА в гиппокэмпэльных перфузатах в течении 45 иин до нового устойчивого

уровня, который приблизительно в 8 раз превышал первоначальный (р<0.01)., При добавлении в перфузирующий раствор блокатора натриевых каналов - тетродотоксина (I мкМ), в присутствии дезипрамина, уровень НА уменьшался на 85 % в течении 45 мин (Р<0.01). Когда тетродотоксин удалялся из перфузирующего раствора, концентрация НА постепенно возвращалась к исходному уровню. В животных с предварительным введением 6-ГДА (за 10-16 дней перед экспериментом), дезипрамин на увеличивал концентрацию НА вше уровня детекции.

1.2. Высвобождение НА в гиппокампе во время фокальных и генерализованных судорог.

Многочисленные экспериментальные данные указывают на то, что норадренергическая система синего пятна оказывает мощное тормозящее влияние на развитие раскачки и что инактивация норадренергической передачи на пре-, или постсинаптическом уровне, может играть определенную роль в формировании судорожного состояния (см. chauvei,

Trottier, 1986; Concoran, Mason, 1980: Mclntyre et al., 1979, Mclntire, Edson, 1Э81; Bortolotto, Cavalhero, 1986; Carre, Harley, 1986; Jimeres-Rivero et nl, 1987; Jimeres-Rivera. Weiss, 1989). /-

Целью данной серии экспериментов было изучение изменения высвобождения НА из нервных окончаний в гиппокампе во время развития генерализованных и фокальных эпилептических судорог.

Стимуляция раскачки, вызывающая развитие генерализованной судороги 4-5 степени (длительность ПР в ипсилатеральном гиппокампе 152-21 с) приводила к немедленному повышению высвобождения НА на 271% в ипсилатеральном гиппокампе по сравнению с предыдущим фоновый уровнем (р<0.001). В последующей 15 мин фракции'перфузата этот эффект уже не обнаруживался. Процентное увеличение высвобождения НА в отдельных животных не коррелировало с длительностью ПР (г=0.31; р>0.05). В животных, подвергшихся воздействию 6-ГДА, ни содержание на руках, ни генерализованная судорога не вызывали каких либо существенных изменений высвобождения НА (Р>0.05). Уровень НА во время судорог в этих животных (длительность ПР II3-9 с, достоверно не отличающаяся от длительности в интактных животных) составлял только лишь 20% от такового в интактных животных. По прошествии 60 мин после первой стимуляции раскачки в интактных животных, в перфузирукдай

раствор добавляли дезипрамин. До осуществления второй стимуляции раскачки, предварительно брали три 15 мин и одну 2-х мин фракции перфузата. При развит™ генерализованной судороги (длительность ПР 122*12 с) высвобождение НА увеличивалось приблизительно в 9 раз (Р<0.05). Пиковое значение достигалось на 8-ой мин после раздражения во всех животных. Так как объемная задержка системы микродиализной трубки, измеренная в различных экспериментах, составляла 6-8 мин, эти данные свидетельствуют о том, что пикового значения высвобождение НА достигает на первых же минутах после начала судорог, и что уровень НА постепенно возвращается к первоначальному уровныо в течении последующих 6-8 мин.

В следующей части исследования животные' не подвергались раскачке до начала микродиализного эксперимента. • Первый ПР вызывал увеличение высвобождения НА на 278$ в стимулированном гиппокампе, по сравнению с его предыдущим фоновым уровнем (Р=0.06). Аналогичный ответ наблюдался после повторной стимуляции гиппокампа с той же интенсивностью раздражающего тока спустя 61 мин (205% увеличение по сравнению с Фоном, Р<0.05). Пороговое значение силы раздражающего тока для вызова ПР которое колебалось в отдельных животных между 50 и 130 мкА, и сила тока, при которой происходило увеличение высвобождения НА, совпадала в 5 животных из 6. Какой либо статистически достоверной корреляции между длительностью первого ПР и последующего ему увеличения выброса НА не наблюдалось (г=0.27, Р>0.05). Что же касается второго (повторного) ПР, то здесь эти два параметра коррелировали между собой (г=0.81, Р<0.05).

Значительные изменения в высвобождении НА наблюдались также при расположении микродиализной трубки в контралатеральном, по отношению к раздражающему электроду, пшпокампе. Первый и второй ПР, соответственно, вызывали 74 и 249%-ное увеличение выброса НА (з=0.06 для пика после первого ПР и Р<0.05 для пика после второго ПР). Увеличение внеклеточной концентрации НА как после первого, так и после второго ПР коррелировало с длительностью ПР (г=0.96, Р <0.01 и г=0.90, Р<0.02, соответственно). Аналогично, если данные первой и второй стимуляции объединялись Еместе, то эти параметр« также коррелировали между собой с высокой достоверностью.

1.3. Высвобождение серотонина и 5-ГИАК в гиппокампе во время генерализованных судорог

Серотонинергические нейроны предположительно также могут быть задействованы в механизмах развития раскачки, хотя их роль в этом процессе менее исследована по сравнению с НА Uraki et ai.. i98ii

Lerner-Natol i et al., 1986; Munkenbeck, Scwark, 1982; St'ach et al., 1981).

Целью данной серии экспериментов было определить изменения синаптического высвобождения серотонина из гиппокампальных афферентов в ответ на генерализованную судорожную активность во время раскачки.

Содержание животных на руках приводило к увеличению высвобождения серотонина в гиппокампе на 39 % по сравнению с фоновым его значением (Р<0.05), тогда как содержание 5-ГИАК в перфузате не менялось. Напротив, стимуляция гиппокампа вызывающая развитие генерализованных судорог (длительность ПР 130*11 с) не вызывала каких либо достоверных изменений в высвобождении серотонина и 5-ГИАК (р>0.05). Изменения высвобождения серотонина в отдельных животных составляло: -13, +15, -12, -34, -I, +78 и +64%, соответственно.

Внеклеточный уровень серотонина и 5-ГИАК также были определены, в двух животных, которые подверглись предварительному введению в-ГДА в латеральный желудочек за 5 недель до проведения микродиализного эксперимента. В этих животных, с разрушенной норадренергической системой, содержание на руках также приводило к увеличению высвобождения серотонина. Каких либо данных, указывающих на то, что удаление норадренергического афферентного входа гиппокампа ведет к увеличению высвобождения серотонина в ответ на судорожную активность не было получено.

1.4. Высвобождение НА в гиппокампе во время быстрой раскачки

Эпилептизавдя животных раскачкой обычно производится тетанической стимуляцией с частотой 60-100 Гц дителълностью I с один раз В день (CM. Racine, Burnham, 1984 ) ИСПОЛЬЗУЯ Д8НВЫЭ ПарВЫвТрЫ

стимуляции, раскачка в амигдале обычно требует две, а в гиппокампе -четыре недели. Возможность применения микродиализной трубки для мозга ограничивается максимум 4 днями после имплантации (Dennis et ai., 1987). Это лимитирует использование этого метода для анализа динамики высвобождения нейромедиаторов на различных,особенно более поздних, стадиях развития генерализации судорог во время раскачки. Несмотря на то, что уменьшение межстимульного интервала в раскачке исследовалось и ранее (Racino et ai.. 197з), значительное сокращение времени между отдельными стимуляциями (до 5 мин) было описано сравнительно недавно (Цщерьфт уе Фдюб 1985). В данной модели 10 с залпы тетанического супрапорогового электрического тока с низкой внутризалповой частотой прилагаются к гиппокампу каждые 5-7 мин. Это ведет к развитию сильных лимбических судорог в течении нескольких часов. Используя «быструю раскачку«, можно за короткое ' время получить мощную модель эпилептогенеза со многими сходствами с традиционной раскачкой (Lothman et «i., i98s). Следовательно, данный метод раскачки дает возможность использовать метод микродиализа мозга для изучения динамики высвобождения НА в процессе раскачки на отдельных стадиях ее развития. Как уже неоднократно описывалось выше, норадренергическая переднемозговая афферентация из системы синего пятна оказывает мощное тормозящее влияние • на развитие традиционной раскачки. В частности,, селективное разрушение норадренергической системы, или фармакологическое блокирование альфа-2 адренергических рецепторов оказывает облегчающее воздействие на скорость развития раскачки, а стимуляция синего пятна (chauvei. Trottier. 1986), или же введение агонистов НА (Geiiman et ai., 1987), замедляет процесс раскачки.

Исходя из вышеизложенного и из наших конкретных задач, целью следующей серии экспериментов было: (I) исследовать возможное тормозящее влияние норадренергической системы мозга на развитие быстрой гиппокамяальной раскачк и (II) проанализировать высвобождение НА в гиппокампе in vivo в процессе динамики развития эпилептогенеза при быстрой раскзчке, используя метод микродиализа мозга.

В контрольной группе животных первая генерализованная судорога 4-5 степени наблюдалась в среднем на 19-ой стимуляции и возникала 3 раза в течении 40 стимуляций. Первая генерализованная судорога 4-5 степени в течении 40 стимуляций в груше с введением 6-ГДА возникала в среднем 9 раз, начиная со 2-ого раздражения (р<0.05 по сравненеию с

контрольной группой). Флуоресцентный гистохимический анализ мозговых срезов , этих животных выявил почти полное отсутствие норадренергической иннервации переднего мозга, также как и некоторое уменьшение плотности волокон в мезостриатной дофаминергической системе. Развитие судорог быстрой раскачки после введения идазоксана, блокатора альфа-2 адренергических рецепторов, было схожим с наблюдаемым развитием этого процесса в группе с разрушенной катехоламинергической переднеыозговой системой после введения б-ГДА. В частности, во время 40 стимуляций раскачки развивалось 10 генерализованных судорог 4-5 степени, начиная со 2-ой стимуляции. Напротив, в группе с введением пропранолола, блокатора бета адренергических рецепторов, первая генерализованная, судорога возникала после большего числа стимуляций, по сравнению с контрольной группой (р<0,05), а по количеству этих судорог, данные группы животных не отличались друг от друга.

Фоновый уровень НА (в присутсвш дезипрамина) в ипсилатеральном и контралатеральном по отношению к раздражающему электроду гиппокампах сотавлял 81*19 фМ/10 мкл и 69*16. фМ/10 мкл, соответственно. После начала стимуляции наблюдалось быстрое и значительное увеличение высвобождения НА в обоих, в стимулированном (33055) и нестимулированном (320%) гиппокампах. Пиковое значение выброса НА наблюдалось во Фракции, взятой после второй стимуляции. Затем внеклеточный уровень'НА постепенно снижался и достигал фонового уровня после 14-ой стимуляции. При этом, моторные судороги 0-вой, или 1-ой степени совпадали с наибольшими значениям внеклеточного уровня НА. Когда появлялись первые генерализованные лимбические судороги 4-5 степени, высвобождение НА было значительно понижено. Эти животные отвечали генерализованными судорогами 4-5 степени уже на второе раздражение гиппокампа и в течнии 10 стимуляций судороги 4-5 степени возникали 6 и 7 раз, соответственно. При этом, наблюдалось быстрое увеличение высвобождения НА с пиковым значении (180% и 320% выше фонового значения, соответственно) во фракции, взятой после второго раздражения.

- 22 -

1.5. Влияние перерезки восходящих норздрвнерпгчвских путей на высвобождение НА в гиппокампе во время судорог.

В предыдущих сериях экспериментов "нами было показано, что во время развития судорог в'ответ на раздражение гиппокампа, как в интактных, так и в эпилептизированкых животных с завершенной раскачкой, происходит значительное увеличение синаптического выброса НА. В данной серии экспериментов нами была предпринята попытка, путем перерезки восходящих норадренергаческих волокон синего пятна, выяснить, связяно ли" данное увеличение высвобождения НА с локалными регуляторными механизмами на уровне синаптич^ских окончаний в гиппокампе (Nelson ot si., 1980), или же с активащей нейронов синего пятна В стволе мозга (jimeres-Rivera ct al . . 1989: Yamaguchi, Rogavski. 1987).

После перерезки восходящих путей синего пятна, хотя и наблюдалось статистически достоверное увеличение высвобождения НА в птпокэмпе в ответ на повторное раздражение и последующую судорогу (24±7 фМ/30 мкл выше фонового уровня, ¿<0.05), оно составляло только лишь 26 % от увеличеного выброса НА после первой судороги (до перерезки) (92-32 фМ/30 мкл выше фонового уровня, Р<0.05). Напротив, в ложно оперированных животных, обе генерализованные судороги (до и после ложной перерезки) вызывали одинаковое увеличение высвобождения НА (68-12 и 61±фМ/30 мкл, соответственно). Фоновое значение внеклеточного уровня НА в этих двух грушах (21±3 и 16-2 ФМ/30 мкл, соответственно), также как и уровень НА до и после перерезки, статистически достоверно не отличались друг от друга (р>0.05). Также не отличался выброс НА в ответ на первое раздражение в' этих группах. В обоих группах длительность ПР была одинаковой до и после перерезки.

ВЛИЯНИЕ ПЕРЕСАДКИ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТКАНИ QMHETO ПЯТНА НА РАЗВИТИЕ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ СУДОРОГ РАСКАЧКИ

Тормозящее влияние Трансплантатов эмбриональной норадренергической ткани синего пятна на развитие и генерализацию судорог при раскачке в гиппокампе гиперчувтвствительных к судорогам (из-за

предварительного разрушения внутренней норадренергической системы мозга введением 6-ГДА) крыс, было впервые продемонстрировано в 1987 году (Barry et ai.. 19йт). Хорошо известно, что НА оказывает тормозящее влияние на скорость развития генерализованных судорог при раскачке (подробнее см. в гл. 2). Разрушение внутренней норадренергической системы мозга приводит к значительному ускорению процесса

раскачки (Mcintiro et al.. 1979; Mclntire, Eíson, 198l). ПрвДПО-

логают, что тормозящее влияние трансплантанта на генерализацию судорог в таких, животных определяется активацией норадренергических нейронов, содержащихся в пересаженной ткани эмбрионального синего

пятна (Barry et al.. 1987; Buszakl et al., 1988).

2.1. Влияние пересадки нейронов эмбрионального синего пятна в область амигдала-пириформной коры на развитие генерализации судорог раскачки.

Ранее было показано (Barry et ai., 1987 ), что даже при весьма интенсивном и широком разрушении норадренергической и дофаминергической нейронной системы ВДС, весьма существенно облегчающем развитие раскачки (Mclntire et al., 1979 ; Mclntire, Edson, 1981 ), реиннервация'трансплантантом только лишь ограниченного участка мозга, в частности гиппокампа, может восстанавливать нормальную скорость процесса генерализации судорог. Исходя из этого, целью данной серии экспериментов было (I) исследовать возможность подавления судорог реинервашей только лишь стимулируемого участка мозга, т.е. при исключительно ипсилатеральной трансплантации в гиппокамп и (II) исследовать возможность влияния на развитие раскачки при пересадке эмбриональных нейронов синего пятна в отдаленные от раздражающего электрода участки мозга, в частности в область амигдала-пириформной коры, которая, по некоторым данным (Mclntire,

Raciiio. 1986; Racin«, Burr,ham, 1984 ), ЯВЛЯвТСЯ КрИТИЧвСКОЙ ОбаЛСТЫО

для распространения и развития судорог при раскачке.

Унилатеральная _ пересадка эмбриональной ткани стриатума в стимулируемый гиппокамп значительно не влияла на развитие раскачки в животных с разрушенной норадренергической системой. В животных с

односторонним трансплантантом эмбрионального синего пятна количество стимуляций для достижения генерализованных судорог 5-ой степени было больше по сравнению с животными с контрольными трансплантантами, однако разница не достигала статистически достоверного значения. Что же касается животных с предварительным введением 6-ГДА и последующей билатеральной трансплантацией синего пятна в амигдала-пириформную кору, они показали значительное замедление скорости раскачки по сравнению с такими же ложно оперированными животными (без трансплантанта). Судороги 1-ой степени наблюдались в среднем через 9 стимуляций, а 5-ой степени - через 19. Развитие раскачки от судорог 1-ой степени до генерализованных судорог.5-ой степени происходило за 10 стимуляций (статистически недостоверно отличающееся от ложно оперированных животных, Р>0.05). В этой группе трансплантированных животных как скорость раскачки, Так и ее развитие не отличалось от этих значений для контрольных животных.

Флуоресцентный гистохимический анализ выявил сильное разрушение переднемозговой норадренергическсй системы в животных с введением 6-ГДА. В ггатокампальной Формации этих животных были отмечены только лишь отдельные редкие флуоресцентные (т.е. катехоламин-содержащие) волокна. В области амигдала-гсфиформной коры, наоборот, наблюдались многочисленные Флуоресцентные нервные окончания, большинство которых, вероятно, составляли дсфамин-содержаише волокна. Степень сохранения норадренергических волокон не удавалось определить, ' так как гистохимический метод не дает возможности дифференцирования между дофашнергическими и норздренергаческими нейронами (Lindvaii et ai..

1987 ).

Флуоресцентное микроскопическое исследование было проведено на 9 крысах с унилатеральной трансплантацией синего пятна в гиппокамп. Во всех этих животных 'наблюдались прижившиеся трансплантанты. Количество нейронов в трансплантантах колебалось от 114 до 785.

Во всех животных с пересадкой ткани синего пятна а область амигдала-пириформной коры, наблюдались билатеральные трансплантанты. В большинстве животных можно было наблюдать по два трансплантанта на каждой стороне мозга. Среднее число катехоламин-содержащих нейронов в каждой точке пересадки было 125 (от 9 до 468).

2.2. Влияние пересадки нейронов эмбрионального синего пятна в гиппокамп на развитие генерализации судорог при быстрой раскачке

Наши данные (см. раздел 1.4), а также данные других авторов (Lothman et ai.. 19В5), покзали, что механизмы генерализации судорог во время развития быстрой раскачки весьма схожи с таковыми с традиционной раскачкой. Разрушение норадренергической системы мозга, а также введение блокатора альфэ-2 норадренергических рецепторов, аналогично традиционной раскачке (Concoran. Mason. 1980; Gulmnn et ai.. 1987), способствует развитию генерализованных судорог при быстрой раскачке.

Множество литературных.данных указывает на- то, что переживание сингенных трансплантантов мозговой ткани значительно лучше, по сравнению с алло- и особенно с ксенотрансплантантами (см. viidner. Brundin. 1988). Также нами показано, что сингенные транспалнтанты эмбрионального синего пятна нормализуют повышение предрасположенности к эпилептизации крыс с разрушенной норадренергической системой введением 6-ГДА (см. раздел 2.1,- Вап-у et ai.. 1987).

Исходя из вышеизложенного, данная серия экспериментов имела две цели: (I) исследовать возможность подавления генерализации судорог во время быстрой гиппокампальной раскачки пересадкой клеточной суспензии эмбрионалдьного синего пятна и, тем самым, сходство с традиционной раскачкой и, одновременно, (II) изучить потенциальную способность" аллотрансплантантов эмбрионального синего пятна в торможении развития генерализованных судорог во время быстрой раскачки.

В животных с введением 6-ГДА наблюдалось в среднем 1.9*1.0 генерализованных судорог 4-5 степени в течении 40 стимуляций, что, несмотря на большее значение, статистически достоверно не отличалось от такового для контрольных животных (i>>0.05). Длительность ПР (53.6-4.3 с) была также большей по сравнению с контрольной группой животных (46.4*8.0 с), но статистически достоверной разницы не обнаружно (р>0.05). Статистически достоверно в данной группе животных по сравнению с контрольными животными (1.3*0.8) увеличилось количество вторичных ПР на каждое гиппокаштзльное раздражение, что увеличило общее количество ПР в течение 40 стимуляций до 9.6*2.2

(р<0.05).

Внутригиппокампальные трансплантанты синего пятна в животных с разрушенной норадренергической системой введением 6-ГДА достоверно уменьшали длительность ПР (32.5±3.5 с) по сравнению с контрольной группой (46.4-8.0, с) и группой с введением 6-ГДА (53.6±4.3 с, р<0.05). Общее число ПР в этой группе также достоверно уменьшалось и не отличалось от контрольной группы (I.7-I.2, Р<0.05). Каких либо различий в пороге возникновения ПР между отдельными группами не наблюдалось.

Кммуногистохимический анализ срезов мозга животных с введением 6-ГДА с использованием моноклональных антител -против ДБГ показал полное отсутствие норадренергаческих волокон в. гиппокампе и новой коре.

В группе животных с пересадкой клеточной суспензии эмбрионального синего пктна были обнаружены трансплантанты среднего и малого размеров, расположенных билатерально в хороидальной борозде гиппокампа, или же в зубчатой фасции и поля CAI. Один трансплантант среднего размера расрпологался на желудочковой поверхности гиппокампа. Все трансплантанты содержали жизнеспособные и нормальныенорадренергические нейроны, которые посылали свои отростки, за пределы самих трансплантантов. Во многих случаях границы между трансплантантом и тканью реципиента не было видно и трансплантанты выглядели хорошо интегрированными в мозг хозяина. Несколько отдельных нейронов было обнаружено вне трансплантанта. Большинство трансплантантов были окружены инфильтратами кровяных клеток, что свидетельствовует о протекающем процессе отторжения (см. widner, Brundin. i паи). Подсчет клеток показал, что в среднем на каждое животное приходится Ш±2Э пересаженных норадренергаческих нейронов эмбрионального синего пятна. Плотность норадренергаческих волокон была выше вблизи трансплантантов и постепенно уменьшалась с расстоянием от него.

2.3. Высвобождение НА из трансплантированных нейронов при развитии судорог.

Как было показано в предыдущих разделах, при развитии судорог

во время раскачки происходит повышение высвобождения НА в гиппокампе. Этсг феномен может играть важную роль в подавлении генерализации судорожной активности в процессе раскачки норадренергической системой синего пятна. Как показала серия экспериментов с перерезкой восходящих норадренергических путей (см. раздел 1.5), повышение высвобождения НА в гиппокампе, в основном, зависит от распрастранения импульсной активности по аксонам нейронов синего пятна и в меньшей степени регулируется локальными гиппокампалъкыми механизмами. Эти результаты подтверждаются данными о повышении частоты импульсной активности нейронов синего пятна во время развития судорог

(.Нтеге5-£иуега, Х »¡зз, 1989 ).

Нами также было показано, что пересадка нейронов эмбрионального синего пятна в мозг крыс с предварительно поврежденной норадренергической системой, может нормализовать их повышеную предрасположенность к развитию генерализованных судорог (см. раздел 2.1). Оставалось еыяснить насколько специфическим является этот эффект по отношению к норадренергическим нейронам трансплантанта. Одним из важных доводов в пользу специфичности эффекта восстановления может служить сопоставление данных о высвобождении НА из нормальных и пересаженных норадренергических нейронов и динамика этого процесса во время развития генерализованных судорог. Попытка анализа этого процесса била предпринята в следующей серки экспериментов.

В животных с трансплантантом эмбрионального синего пятна развитие раскачки было значительно замедлено (16*3 стимуляций для достижения судороги 5-ой степени) по сравнении с животными с поврежденной норадренергической системой (6*1, Р<0.01) и было сходным с таковым для нормальных крыс (21*3). Это означало, что трансплантанты синего пятна были эффективными и функционально активными, что выражалось в их способности подавлять развитие судорожной активности.

Крысы с содержанием трансплантантов синего пятна показывали восстановление не только фонового высвобождения НА в гиппокампе, но и повышение его высвобождения в ответ на развитое генерализованных судорог. Устойчивый фоновый уровень высвобождения НА в гиппокампе трансплантированных животных (58*29 и 41*17 фМ/30 мкл на стимулированной и нестиыулированной стороне, соответсвенно) был сходным с фоновым значением для нормальных животных (40*12 ФМ/30 мкл

в , станулиррованнош гиппокампе). Генерализованная судорога с длительностью ПР 81*9 с в трансплантированной группе и 79*17 с в нормальной группе, приводила к трехкратному увеличению высвобождения НА в гиппокампо как трансплантированных <244*121 фМ/30 мкл), так и нормальных (189*58 фМ/30 мкл) животных в 15 мин фракциях перфузата. Величина этого эффекта была одинаковой на обоих сторонах мозга в трансплантированных животных. В последующей фракции уровень НА возвращался к фоновому значению. В группе животных с введением 6-ГДА устойчивый фоновый уровень высвобождения НА составлял 6*2 фМ/30 мкл и 1*1 фМ/30 мкл соответсвенно в стимулированном и нестимулированном гиппокампе, т.е. всего 12 % на стимулированной и 3 % иа нестимулированной стороне в обоих гиппокампах от уровня НА в трансплантированных животных. Эти значения в группах достоверно отличались (Р<0.05 и Р<0.01 на .стимулированной и нестимулированной стороне, соответственно). Высвобождение НА в этой группе в ответ на генерализованную судорогу (длительностью 94 * II с) составляло всего лишь 7 X (16*4 $М/30 мкл) на стимулированной стороне (Р<0.01) и 2 % (3*2 ФМ/30 мкл) на нестимулированной стороне (р<0.001). Это свидетельствует о том, что- высокий уровнь НА во время судорог, определяется его высвобождением из норадренергических нейронов трансплантанта эмбрионального синего пятна. Значительной разницы в пороге возникновения ПР и его длительностью между группами не наблюдалось.

Для более детального исследования временного течения высвобождения НА из трансплантантов синего пятна в ответ на генерализованную судорогу, было предпринято введение в перфузируюций раствор дезипрамина, блокатора поглощения НА, что позволило сократить время для отдельных фракций перфузата до 2-х мин. Устойчивый фоновый уровень высвобождения НА в присутствии дезипрамина составлял 87*12 и 71*7 фМ/30 мкл в трансплантированных и нормальных животных, соответственно. Во время развития генерализованной судороги (внеклеточный уровень НА ва стимулированной стороне увеличился в 14 раз в трансплантированных животных и в II раз - в нормальных. Пиковое значение НА отмечалось во фракции на 2-4-ой мин после начала стимуляции. Затеи уровень НА постепенно возвращался к исходному уроеныо в течении 6-8 мин.

Морфологический анализ срезов мозга животных ■ с пересаженной

тканью эмбрионального синего пятна выявил наличие в среднем 252-76 окрашенных, ТГ-положительных, предположительно норадренергических) ныронов в каждом гиппокампе. В основном, наблюдались трансплантанты, средних и больших размеров, содержащих от 114 до 374 ТГ-положительных нейронов билатерально.

2.4. Роль альфа-2 норадренергических рецепторов в подавлении генерализации судорог трансплантантами синего пятна.

Многочисленные экспериментальные данные показывают важную тормозящую роль норадренергической системы синего пятна в генерализации судорожной активности во время раскачки (см. chauvei.

Trottier, 1986; Concoren. Macon. 1980: Molntyro et nl., 1979; Mclntire. Edson. 1981; Bortolotto. Cavalhero, 1986; Carre, Harley, 1986: Jimeres-Rivera et al., 1987; Jimereп-Rivera. Weiss, 1989).

Недавние исследования показали, что этот тормозящий эффект опосредуется через постсинаптические альфа-2 норадренергические рецепторы (ceiman et ai.. 1987; см. раздел 1.4). Исходя из, вышеизложенного, в следующей серии экспериментов, нами была' предпринята попытка получения дополнительных данных в пользу предположения о специфичности по отношению к трансплантированным норадренергическим нейронам эффекта подавления развития генерализованных судорог во время раскачки, в предварительно денервированном от. НА гиппокампе крыс, с повышенной предрасположенностью к эпилептогенезу.

Количество стимуляций, необходимых для достижения различных степеней генерализации судорог, было достоверно меньше в нормальных и трансплантированных животных, подвергшихся воздействий идазоксана, по сравнению с трансплантированными животными, получившими, в качестве контроля, инъекцию растворителя. Например, первая генерализованная судорога 5-ой степени в среднем развивалась после 11*2 стимуляций в трансплантированной груше с введением идазоксана и после 8*1 стимуляций в груше нормальных животных с введением идазоксана, тогда как в груше трансплантированных животных без применения идазоксана для этого было необходимо 25*6 стимуляций. Также, развитие раскачки от 1-ой до 5-ой степени генерализации судорог происходило достоверно

быстрее в группе трансплантированных (10*2 стимуляций) и чория::ьшх (7*3 стимуляций) животных с применением идазоксана, чем в груше трансплантированных животных без применения идазоксана (22*6 стимуляций). Каких либо достоверных различий в пороге или длительности ПР между отдельными группами животных не наблюдалось. Значения порогов и длительности ПР в среднем составляли: 65*14, 39*7 и 36*3 мкА и 124*16, 94*10 и 90*4 с для группы трансплантированных животных без применения идазоксана, трансплантированных и нормальных животных с применением идазоксана, соответсвенно.

Микроскопический гистофлуоресцентный анализ величины и расположения трансплантантов, содержания в них катехоламинергических нейронов и степень реиннервации гиппокампальной формации норадренергическими волокнами, берущими начало от трансплантантов был предпринят в 5 произвольно отобранных крысах из каждой трансплантированной группы животных. Отдельный статистический анализ данных из этих отобранных животных продемонстрировал аналогичное облегчение развития судорог после действия идазоксана, как и в полных трансплантированных группах. Во всех животных были обнаружены билатеральные трансплантанты средних и больших размеров, которые, в большинстве случаев, распологались либо на вентрикулярной поверхности гиппокампа, либо в хороидальной борозде. В некоторых гиппокампах трансплантант распологался в зубчатой фасции, или в поле CAI. Катехоламин-содержащие нейроны (гистофлуоресцентная визуализация) были обнаружены во всех трансплантантах, среднее число которых составляло 223 и 353 на стимулированной и нестимулированной стороне, соответсвенно в группе трансплантированных животных с применением идазоксана и 295 и 304, соответственно - в группе трансплантированных животных без его применения. Какого либо статистически достоверного различия в содержании норадренергических нейронов в трансплантантах между отдельными грушами животных на обоих сторонах мозга не наблюдалось.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Устойчивый уровень высвобождения НА в гиппокампе в 15 мин перфузатах в наших экспериментах приблизительно находится в пределах

тех же величин, которые были определены ранее для коры больших полушарий (Dennis et al., 1987; L'Heureux et al., 1986 - 40 фМ), ДЛЯ nucleus accumbens Hernandes et al., 1986 - 15 ФМ), ДЛЯ ГИПОТЗЛЗМУса (Hernandes et al., 1986; Kapoor. Chalmers. 1987; Routledge, Marsden,

1987 - 70-120 ФМ), супраоптического ядра (Kendrick, Leng ,1988 - 30 ФМ) И обонятельной луковице (Kendrick. Leng. 1988 - 30 фМ).

Сенсорная стимуляция во время нахождения животных на руках экспериментатора вызывает значительное увеличение высвобождения НА, тогда как галотановый наркоз уменьшает концентрацию НА в перфузате. Эти наблюдения сопоставимы с данными о том, что нейроны синего пятна, которые являются основными источниками норадренергической иннервации гиппокампа (Loy et ai., i98o), активируются невредными (non-noxious) внешними стимулами окружающей среды (Aston-Jones. 1935), и что частота разрядов нейронов синего пятна значительно выше во время активного бодрствования и настороженности по сравнению с состоянием дремотности и сна (см. Footo et ai.. 198з). Таким образом, наши данные свидетельствуют, что увеличение высвобождения НА, определяемое методом микродиализа, может отражать происходящие активные физиологические процессы в системе синего пятна.

Отсутствие измеряемого НА в перфузатах животных с предварительным (10-16 дней) внутрюселудочковым введением 6-ГДА дает основание говорить о специфичности процедуры радооферментативного анализа, а также является сильным аргументом для нейронального

происхождения ЭТОГО НА (L'Heureux et al.. 1986; Routledge, Marsden,

1987). Увеличение уровня НА в животных с 1-2 месячным предварительным разрушением норадренергической системы выше уровня детекции может свидетельствовать об увеличении синтеза и метаболизма НА в денервированном участке мозга (Acheson. Zigmond. 1981; Gage et al.. 1983) за счет сохранившихся после воздействия 6-ГДА малочисленных норадренергаческих аксонов, что может постепенно компенсировать потерью норадренергической иннервации. Однако, реактивность норадренергической системы при этом остается сильно поврежденной, так как ни сенсорное воздействие (содержание на руках), ни ксг-ная стимуляция, не вызывают каких либо значительных изменений высвобождения НА.

Дальнейшим свидетельством нейронального происхождения НА в гиппокампальных перфузатах могут служить наши данные, показыващие,

что с добавлением kci в перфузирукщий раствор происходит значительное увеличение внеклеточной концентрации НА. Этот эф$ект, скорее всего, является результатом деполяризации нервных окончаний и последующего выброса нейромедиатора, так как kci увеличивает высвобождение НА только в присутствии ионов кальция (Phiiippu et ai.. 1979). Возможность объяснения эффекта kci изменением проницаемости гематоэнцефалического барьера к системному НА крови исключается, так как этот эффект отсутсвует в животных с предварительно разрушенной центральной норадренергической системой введением 6-ГДА.

Когда в перфузирукщий раствор вводили блокатор поглощения НА (дезипрамин), наблюдалось 8-кратное увеличение устойчивого уровня высвобождения НА в перфузатах. Эти результаты хорошо согласуются с предыдущими результатами, полученными при использовании push pull канюлы (Martin et ai.. 1976). Аналогичные результаты с использованием

МИКрОДИаЛИЗа МОЗГа бЫЛИ ПОЛучеНЫ ДЛЯ СерОТОНИНЭ (Kalen et al., 1988; Pilowsky et al., 19Вб) И ДОфЭМИНа (Westerink et al.. 1987). Как ДЛЯ

серотонина, так и для дофамина было показано, что тесная взаимосвязь между внеклеточным уровнем нейромедиатора и синаптической активностью системы сохраняется и при добавлении блокаторов поглощения в перфузирующий раствор (Kai en et al., 1988; Pilowsky et al., 1986; Westerink et al., 1987 a. b). ЭТО, ПО ВИДИМОМУ, СПраВвДЛИВО И В

отношении высвобождения НА, так как, по нашим данным, подавление электрической активности в перфузкруемом участке мозга добавлением в перфузирующий раствор, содержащий дезипрамин, тет^адотоксина (Narahashi. 197л), вызывало уменьшение высвобождения НА на 85 Таким образом, эти данные указывают на то, что блокаторы поглощения нейромедиаторов могут быть использованы для улучшения временной характеристики метода микродиализа.

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что (I) микродиализ мозговой ткани является весьма удобным методом для исследования внеклеточной концентрации НА в гиппокампальной формации крыс-, (2) что НА в перфузате является нейронального происхождения; (3) что изменения внеклеточного уровня НА тесно связано с изменениями синаптической активности, и могут отражать изменения физиологической активности системы синего пятна; (4) что блокатор поглощения НА, добавляемый в перфузирующий раствор может сократить временные параметры перфузатных фракций с одновременным сохранением тесной

взаимосвязи между изменениями внеклеточной концентрации НА и синаптической активностью системы; и (5) что высвобождение НА, в подвергшихся воздействию 6-ГДА животных, псдавляемое на второй неделе после его введения, частично восстанавливается с течением времени.

Некоторые экспериментальные данные показывают, что система синего пятна оказыввает значительное подавляющее влияние не только на процесс раскачки, но и на некоторые другие виды экспериментальной эпилепсии. Например, разрушение восходящего пучка синего пятна вызывает усиление пентилентетразольных, злектороиоковых и кобальтовых

судорог (Ма son. Concoren, 1979; Trottier et al.. 1988)» С ДРУГОЙ

стороны, стимуляция области синего пятна подавляет эпилептиформную активность, вызванную системным введением пентилентетразола (übet et

al., 1977), ИЛИ фОКЭЛЬНКМ ВВеДеКИбМ кобальта {Fischer е t al., 1983),

или пенициллина (Neuman, 1986). Существуют некоторые биохимические данные, показывающие увеличение нейромедиаторного метаболизма в центральных норадренергиче'ских нейронах как при фокальных (Nelson et

al.. 1980), так И при ГеНераЛИЗОВЗННЫХ (Calderini et al., 1978)

судорогах. Нами показано, что как фокгльные> так и генерализованные судороги, вызванные стимуляцией при раскачке S гиппокампе. вызывают значительное увеличение внеклеточного уровня НА. Например, в i животных, подвергшихся полной раскачке, выброс НА в ответ на генерализованные судороги увеличивался в трехкратном размере. Нейрональное происхождение высоких уровней внеклеточного НА при развитии судорог, описанных в данной работе, подтверждается тем фактом, что этот эффект не наблюдается при генерализованных судорогах в животных, с предварительным введением б-ГДА. Таким образом, значительные изменения внеклеточного содержания НА, наблюдаемые в наших условиях эксперимента, не могут быть сколько нибудь в значительной степени связаны с влиянием.судорог (johanson, Niisson,

1977; Leo. Olszevski, 1961; Zucker et al., 1383), ИЛИ ИМПЛЭНТаЦИИ

микродиализной трубки на проницаемость гематоэнцефалического барьера для системного НА, циркулирующего в крови.

Синее пятно является единственным источником норадренергаческих афферентов гиппокампа (Lindvaii, Bjorkiund. 1983) и, следовательно, высокий уровень НА в гиппокампе во время судорог, в основном, определяется увеличением высвобождения НА из синаптических окончаний нейронов синего пятна.

Полученные данные исключают возможности объяснения увеличения выброса НА в гиппокампе после стимуляции при раскачке из-за непосредственного влияния раздражающего тока на аксоны норадренергиЧч.ских нейронов и свидетельствуют о том, что это увеличение должно быть непосредственно связано с развитием эпилептического ПР. так как, во первых, существует определенная селективность в ответе, что выражается в увеличении выброса только НА, но не серотонина-. во вторых, стимуляция во время раскачки вызывала увеличение уровня НА и в контралатеральнои по отношению к раздражающему электроду гиппокампе, приблизительно на растоянии 10 мм от него, и вероятность распространения электрического тока на такое растояние весьма мала (напек, 1975); в третьих, порог для достоверного увеличения высвобождения НА совпадал с порогом для возникновения ПР почти во всех животных и не зависел от интенсивности раздражающего тока; в четвертых, в интактных животных, не подвергавшихся раскачке, наблюдалась высокая степень корреляции между длительностью ПР и увеличением высвобождения НА; в пятых, перерезка восходящих норадренергических путей приводила к резкому понижению высвобождения НА во время .генерализованных судорог, возникатоих в ответ на раздражение гиппокампа.

Все животные, подвергшиеся полной раскачке, демонстрировали значительное увеличение высвобождения НА в ответ на стимуляцию гиппокампа, вызывающего развитие генерализованных судорог. Пиковые значения уровня НА в это время были идентичными с таковыми во время фокальных судорог в интактных животных. Таким образом, наши данные показывают, что норадранергическая система сохраняет свою способность отвечать на эпилептические судороги увеличением высвобождения нейромедиатора в гиппокампе и после того, как процесс раскачки полностью завершен. Напротив, устойчивый фоновый уровень НА в животных с завершенной раскачкой <23±2 фМ/30 мкл) существенно ниже такового по сравнению с интактными животными (60*15 фМ/30 мкл). Более того, внеклеточный уровень НА во время применения блокатора его поглощения в интактных животных составлял 225-230 фМ/30 мкл, тогда как в животных с завершенной раскачкой - всего 80 фМ/30 мкл. Эти данные дают возможность предположить, что фоновое высвобождение НА несколько уменьшено во время состояния завершенной раскачки и поддерживают гипотезу о том, что ослабление норадренергической

передачи способствует развитию раскачки. Этот эффект не был связан с самой процедурой раскачки, так как контрольные эксперименты с соединением животных с применяемой во время раскачки аппаратурой не дали каких либо различий в высвобождении НА. Другие данные (ibnhous,

McNamara. 1987; Kant et al.. 1980: Lewis et al.. 19Я7; Okazaki et al., 1986; Wilkinson. Halporn. 1979) В ОСНОВНОМ He ПОДТВерЖДЭЮТ

наличие каких либо длительных изменений в активности норадренергической системы, связанных с спроцессом раскачки.

Таким образом, результаты этих экспериментов дают основание заключить, что (I) внутримозговой микродиализ представляет собой весьма удобный метод наблюдения за изменением высвобождения НА в гиппокампе во время фокальных и генерализованных судорог: что (II) при развитии фокальных судорог во время начала раскачки, в гиппокампе происходит билатеральное увеличение высвобождения НА: что (III) генерализованные судороги в животных с завершенной раскачкой также приводит к значительному увеличению выброса НА в гиппокампе; что (1У) способность норадренергической системы отвечать на эпилептические судороги увеличением высвобождения НА также сохраняется после достижения состояния полной раскачки; и что (У) развитие раскачки может быть связано с уменьшением интериктального высвобождения НА в гиппокампе.

Центральные норадренергические нейроны замедляют развитие судорог при быстрой раскачке аналогично тому, что было описано для традиционной раскачки (с oncoran, Mason, 1980). ЖИВОТНЫб С предварительным введением 6-ГДА достигали первой генерализованной^ судороги после значительно меньшего количества раздражений, чем интактные животные. Во время последующих стимуляций частота развития таких судорог была также значительно выше в группе животных с введением 6-ГДА. Важность норадренергической системы для быстрой раскачки была также подтверждена результатами, полученными с введением блокаторов адренергических рецепторов. Первые сильные лкмбкческив судороги возникали значительно быстрее после блокирования идазоксаном альфа-2 адренергических рецепторов, а также частота таких судорог была значительно выше. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными при традиционной раскачке (Geiman et ai., 1987). Эффекты введения идазоксана и разрушения катехоламинов 6-ГДА-ом были весьма схожими. Напротив, пропранолол задерживал

.^звитив судорог при быстрой гиппокампальной раскачке, что подтверждает предыдущие данные, указывающие на проконвульсивный эффект НА опосредованный через бета-адренергические рецептора (см.

Louis et el.. 1982; Mueller, Dunwiddie, 1983) При ТрЭДИЦИОННОЙ

раскачке.

Измерение НА с помощью метода микродиализа при традиционной раскачке показало, что как первая стимуляция, вызывающая фокальный ПР, так и стимуляция, вызывающая генерализованную судорогу в животных с завершенной раскачкой, приводит к значительному увеличению высвобождения НА в гиппокампе. Аналогично этим данным, первые же стимуляции гиппокампа при быстрой раскачке приводят к резкому увеличению выброса НА. Такое же увеличение наблюдалось и в противоположном к раздражающему электроду гиппокаше, на растоянии 10 мм от раздражающего электрода, что дает основание предположить, что увеличение высвобождения НА является результатом судорожной активности, а не распространения электрического тока (Ranck. 1975).

Типичной динамикой высвобождения НА при быстрой раскачке было постепенное понижение увеличенного высвобождения НА после первых стимуляций. После 14 стимуляций, проведенных в первые 70 мин, НА возвращался к фоновому уровню и сохранялся неизменным оставшееся время стимуляции. Причина этого ослабления высвобождения НА не известна и остается только лишь спекулировать по этому поводу. Можно предположить, что повторяющаяся стимуляция через каждые 5 мин приводит к истощению способного к высвобождению, ограниченного пула

НА (СМ. L'Heureux et al.,1986; Scatton, 1982). ВЫСОКИЙ УрОВвНЬ

внеклеточного НА после первых стимуляций может также вызывать возвратное торможение через пресинаптические авторецепторы, тем самым ограничивая выброс. Этот эффект может также отображать временную функциональную инактивацию норадренергических нейронов во время развития раскачки. Если последнее действительно имеет место, то подтверждается выдвинутое нами предположение о том, что ослабление норадренергической передачи является одним из важнейших факторов в механизме развития раскачки. Однако, остается открытым вопрос о том, является ли наблюдаемое нами ослабление увеличения высвобождения НА в поздней части развития быстрой раскачки справедливым и для традиционной раскачки с Солее длительными интервалами между раздражениями.

Эти результаты показывают, что (I) центральные норадренер-гические нейроны оказывают сильное тормозящее влияние, вероятно, Ч'-реэ альфа-2 адренергические рецепторы, на процесс генерализации судорог при развитии быстрой гиппокампальной раскачки и что (II) в ответ на судороги, вызванные первыми раздражениями, происходит значительное увеличение высвобюождения НА, которое затем постепенно снижается, возвращаясь к исходному уровнью в течении остальной одной трети 40 стимуляций. Является ли наблюдаемое ослабление высвобождения НА во время судорог основной причиной достижения згшлептизации животных при раскачке, пока не полностью ясно.

Трансплантация эмбриональной ткани синего пятна билатерально в область амигдала-пириформной коры замедляет развитие гиппокампальной раскачки в сверхвозбудимых крысах с предварительным разрушением внутренней переднемозговой катехоламинергической системы. Выраженность эффекта была сопостовимой с таковой,описанной в ранней работе (Barry et ai.. 1987), в которой трансплантация производилась в гиппокамп. Таким образом, не только трансплантация непосредственно в гиппокамп, но и в область отдаленную от стимулирующего электрода, может влиять на скорость гиппокампальной раскачки. Следует отметить, что область амигдала-пириформной коры предположительно является важной областью для развития и распространения судорог в

НеЗаВИСИМОСТИ ОТ Места СТИМУЛЯЦИИ При раскачке (Meint ire. Racine, 1986; Racine, Burnham, 1984). Например, бИЛЭТераЛЬНОе, ИЛИ

унилатеральное разрушение амигдалы приводит к облегчению развития судорог при гиппокампальной раскачке (Araki et al.. 1983: Me Intire et ai., 197з). Разрушение пириформной корт также вызывает изменения в скорости развития раскачки в амигдэле, или в септуме (Racine et ai., 1988 ). Более того, микроинъекши гамма-винил ГАМК билатерально в амигдалу вызывают регрессию судорог от 5-ой степени до уровня 1-ой степени при СТИМУЛЯЦИИ в гиппокаше (Le Gal La Sale, Feldrum, 1983 ). Внутримозговая инъекция гамма-винил ГАМК приводит к длительному увеличению уровня ГАМК в области ее введения (Gaie, ladaroia, 1982). Следовательно, эффект введения гамма-винил ГАМК в амигдалу можно объяснить i скорее всего, увеличением ГАМК- ергического торможения в данной области.

Наши эксперименты подтверждают важную роль области амигдала-пириформной коры в развитии судорог при гиппокампальной раскачке.

Точные механизмы, по которым трансплантация эмбриональной ткани синего пятна вызывает замедление скорости раскачки, пока остаются неясными. Эффект, по видимому, не является результатом самой операции и сопутсвувщего незначительного повреждения мозга реципиента, так как в животных, которые получили инъекцию физиологического раствора с глюкозой вместо нервной ткани (ложно оперированные крысы), процесс раскачки завершался значительно быстрее.. Также маловероятно, что рост объема трансплантанта, что может влиять на окружающую паренхиму, может быть причиной задержки раскачки. Разрушение области амигдалы фактически вызывает облегчение гиппокампальной раскачки (лгам е1

а 1 , , 1983: Нс1пИге е! «1.. 1982 ).

На наш взгляд, наиболее вероятным объяснением подавления судорожной активности трансплантантами может быть высвобождение НА нейронами синего пятна в катехолэмин-денервированной амигдале и пириформной коре. Как уже неоднократно отмечалось, облегчение процесса раскачки после внутрижелудочкового введения 6-ГДА является результатом разрушения норадренергической системы мозга (Mc.int.ire а1, 1979; ис1пИгв. Ияоч, 1981). Все ЖИВОТНЫ6, КОТОрые ПОЛУЧИЛИ

трансплантанты эмбриональной ткани синего пятна, билатерально имели жизнеспособные трансплантанты с содержанием значительного числа норадренергических нейронов. Степень реинервации не поддавлась определению из-за сохранения определенного числа катехоламин-ергических (в основном, дофаминергических) волокон в этой области. Однако, было отчетливо видно, что пересаженные норадренергическив нейроны посылают свои отростки в окружающую паренхиму амигдала-пириформной коры реципиента. Реинервация, происходящая от трансплантанта ограничивалась областью амигдала-пириформной кары и микроскопический анализ свидетельствует, что функциональный эффект не свзан с реинервакией гитпокампа. Хотя до последнего времени не существует никаких морфологических данных, касающихся пересаженных эмбриональных нейронов синего пятна в область амигдала-пириформной коры, из других экспериментов известно, что пересаженные нейроны синего пятна могут реинервировать гиппокамп реципиента, формировать синаптические контакты и восстанавливать функциональное синаптическое высвобождение нейромедиаторов (в^гиш.и «1.. 1979. 1энб; э^^поу» е1 а1 , 1987). Степень подавления судорог находится в хорошей корреляции со степенью реинервации трансплантантом гиппокампа

- 39 -

реципиента (Barry et ai., 1407).

Наши эксперименты показывают, что норадренергическая реинер-вз'.ля контралатерального по отношению к раздражающему электроду гиппокампа также принимает участие в подавлении судорожной активности при развитии раскачки. В некоторых крысах, подвергшихся пересадке ткани синего пятна унилатерально, были обнаружены трансплантанты больших размеров со значительным количеством норадренергаческих нейронов, дающих начало интенсивной реинервации гиппокампа. Несмотря на это, в данной группе животных не было обнаружено какого либо достоверного эффекта на скорость развития раскачки. Таким образом, в отлте от предположения, высказанного авторами в ранней работе

(Barry et al.. 1987 ), МОЖНО ЗаКЛЮЧИТЬ, ЧТО ДЛЯ ПОЛНОГО Эффекта

подавления судорожной активности необходима реинервация обоих гиппо-кампов трансплантантами эмбрионального синего пятна. Это особенно интересно в связи с тем Фактом, что комиссурэктомия мозга, в отличие ОТ раскачки В амигдале (McCnughran nt al.. 1 978: Racine et al . . 1ЭБ8), не облегчает развитие раскачки в гиппокампе (Mcintire.

Stuckey. 1985).

Можно заключить, (I) что данная серия экспериментов полностью подтверждает возможность подавления трансплантантом эмбрионального синего пятна, содержащего норадренергические нейроны, процесса гене-рализащм судорог в крысах с повышенной возбудимостью, вызванной разрушением внутренних норадренергаческих проекционных систем; (II) что этот эффект, который ранее был продемонстрирован при пересадке в пшпокамп (Barry et ai.. i эв7), может также вызываться трансплантатами, расположенным! в области амигдала-пириформной коры: (III) что эффект трансплантанта вызван норадренергической реинервацией предварительно денервированной амигдала-пириформной коры и (1У) что восстановление норадренергической нейропередачи в данной, отдаленной от места стимуляции области, является достаточным условием для нормализации предрасположения к судорогам, вызываемым стимуляцией гиппокампа, в животных с разрушенной внутренней норадренергической системой.

В работе показана эффективность внутригиппокампальной алло-трансплантации эмбриональной ткани синего пятна в подавлении повышенной предрасположенности к судорогам во время быстрой раскачки, в крысах с предварительно разрушенной норадренергической системой.

Трансплантация богатой норадренергическими нейронами сингенной эмбриональной ткани синего пятна билатерально в гиппокамп, или область амигдала-пириформной коры, замёдляет скорость традиционной раскачки (ваг,.. et ai.. i987, см. раздел 2.1) в гипервозбудимых крысах с предварительно разрушенной катехоламинергической системой. При этом, минимальное количество норадренергических нейронов на каждой трансплантированной стороне было около 100 (Barry et ai., 1987).

Пересадка мозговой ткани между разными видами животных по сравнению с сингенньаш трансплантантами обычно имеет меньшую степень приживаемости в мозге реципиента (widner. Brundin. 1988). Это подтверждается и в нашем случае, так как была использована аллотрансплантация с аналогичной процедурой, как в предыдущих сериях с сингенной пересадкой, но степень приживаемости была сравнительно ниже (111*29 нейронов в каждом животном). Однако, следует учитывать, что в клеточной суспензии, приготовленной для пересадки ве определялось количества жизнеспособных клеток. Мы также наблюдали отдельные пересаженные норадренергические нейроны, расположенные вне границ трансплантанта, что весьма характерно для иммунологически несовместимой пересадки и предположительно связано с процесс«! миграции эмбриональных клеток (*eiis et »l., 1987). Основной причиной низкой степени приживаемости не гомогенных трансплантантов считается отторжение пересаженной ткани (см. »idner. Brundin, 19ва). В нашем случае наличие инфильтратов кровяных клеток вокруг трансплантантов указывает на активацию процесса их отторжения.

Несмотря на сравнительно низкий уровень приживаемости трансплантантов, все таки наблюдалась некоторая нормализация предрасположенности к судорогам в животных с введением 6-ГДА этими трансплантантами. Таким образом, нам удалось показать, что аллотрансплантанты также способны влиять на развитие судорог при пшпокампальной раскачке.

Между традиционной и быстрой раскачкой существует много общего (Lothman et ai., 1985). Как было показано (см.разд.1.4), аналогично традиционной раскачке, центральные норадренергические нейроны оказывают сильное тормозящее влияние, по-видимому, через активацию ал1>фа-2 адренергических постсинаптических рецепторов на развитие генерализованных судорог во время быстрой раскачки. В разделе 1.4

было показано, что внутрижелудочковое введение 6-ГДА, сильного катехоламинергического нейротоксина, увеличивает число генерализованных судорог 4-5 степени в течение 40 стимуляций, одновременно уменьшая количество стимуляций необходимых для достижения первой генерализованой судороги 4-5 степени, что связывают с разрушением исключительно норадренергической системы мозга

(МЫпМге. а 1 . , 1979; Мс1ги1ге, Ейвоп. 1901). ВраЗДвЛв 2.2 ТЭКЖв

было показано увеличение числа генерализованных судорог после введения 6-ГДА, однако это увеличение не достигало статистически достоверного уровня. Причиной тому может служить малое число переживших контрольных животных (п=3), а также тот факт, что эксперименты проводилиь на беспородных белых лабораторных крысах, что может увеличивать разброс данных.

Увеличенное количество ПР в ответ на каждое гиппокампальное раздражение в животных с введением 6-ГДА, нормализовалось трансплантантами эмбриональной ткани синего пятна. Уменьшалось также длительность ПР. Все эти данные, указывающие на аналогичное традиционной раскачке, влияние трансплантантов эмбрионального синего пятна на предрасположенность к судорогам во время быстрой раскачки, свидетельствуют о сходстве между этими двумя процессами. ;

Используя метод микродиализа мозга, нами было показано, что во время первых стимуляций быстрой раскачки происходит увеличение выброса НА в гиппокампе. Этот выброс не наблюдается в животных с введением 6-ГДА. Исходя из этого, можно предположить, что восстановление нормального процесса генерализации судорог при быстрой раскачке может быть результатом восстановления высвобождения НА трансплантантами эмбриональной ткани синего пятна в гиппокампе (см. раздел 2.3).

Можно заключить, (I) что эти эксперименты еще раз подтверждают факт тормозящего влияния внутригигатокампзльных пересаженных эмбриональных норадренергических нейронов на развитие генерализованных судорог в крысах с повышенной возбудимостью из-за предварительного разрушения внутренней норадренергической системы; (II) что этот эффект, показанный для сингенных трансплантантов синего пятна при традиционной раскачке, может также быть оказан аллогенными трансплантантами синего пятна при быстрой раскачке.

Наш показано, что генерализованная эпилептическая судорога,

влияя на мозг реципиента, ведет к значительному временному увеличению высвобождения нейромедиатора из трансплантированных норадренер-гических неГгоонов синего пятна, реинервируюиих предварительно денервированную от НА гиппокэмпальную формацию. Как временное течение, так и величина ответа были схожими с таковыми в интактных животных с неповрежденной внутренней системой синего пятна. Механизмы, лежащие в основе увеличения выброса НА из пересаженных нейронов синего пятна пока не до конца известны, однако мало вероятно, что причиной тому может быть общее активирующее влияние судорог на различные нейромедааторные системы, иннервирующие пшпокамп, так как внеклеточный уровень серотонмна во время генерализованных судорог не меняется. Значительное понижение вызванного судорогами выброса НА после перерезки восходящих норадренергических волокон указывает на то, что в интактном мозге, также как и предположительно в трансплантанте, ответ в значительной 1 степени зависит от активации нейронов синего пятна на уровне клеточных тел. Значение распространения импульсной активности по аксонам для наблюдаемых изменений в высвобождении нейромедиатора также подтверждается данными об увеличении частоты разрядов нейронов синего пятна во время экспериментальных судорог (Л|»агв5-В1%'вга.

»0155 , 1989; Ч'ативисЫ. Нокаувк!. 1987 ).

Внутригиппокампальные трансплантанты синего пятна в денервированной гнппокампальной формации формируют весьма схожую с нормальной норадренергическую сеть нервных окончаний (виогИиш! е! а 1., 1звь). Они образуют синаптические контакты с нейронами ггашокампа реципиента и получают инервацию от мозга реципиента (мигаIа о! а1.. 19зо). Этот афферентный вход от мозга реципуента предположительно может оказывать регуляторкое влияние на показанное в данной работе высвобождение НА из трансплантированных норадренергических нейронов синего пятна. Недавние анатомические исследования показали (Ааи>м^опоя. п/нк), что синее пятно получает весьма ограниченную прямую проекцию, основные из которых берут начало из двух ядер рострального продолговатого мозга парагигантоцелюлярного и препозитного подъязычного. Кажется весьма маловероятным, что интрагиппокампальные трансплантанты синего пятна активируются через эти нормальные анатомические пути. Регуляция пересаженных нейронов синего пятна в этом эктопическом положении, по

видимому, осуществляется системами, которые не имеет, или имеют весьма ограниченную проекцию в ядро синего пятна в ножке мозга. Схс .-эсть величины и временного течения процесса увеличения высвобождения НА в ответ, на судорожную активность в интактном и трансплантированном мозге указывает на сходство механизмов активации. Однако, следует учитывать, что пересаженные нейроны синего пятна, в отличие от неГфонов в интактном мозге, могут быть активированы другим путем, например, увеличением внеклеточной концентрации конов К+ во время развития судорог, или же непосредственным влиянием распространения токов от судорожно разряжающихся нейронов реципиента.

Таким образом, наш: данные указывают на принципиальную возможность специфического восстановления норадренергической нейропередачи в предварительно денервированнном гкппокампе. Такое патологическое явление, как эпилептическая судорога, воздействуя на мозг, может модулировать, схожим с нормальным механизмом, высвобождение нейромедиатора из внугримозгового трансплантанта нервной ткани.

Дальлнейшим подтверждением этого вывода могут служить наши данные о том, что скорость раскачки в трансплантированных животных с введением идазоксана, достоверно выше по сравнению с транс- | плантированнкми животными без применения идазоксана. Не было каких либо достоверных отличий между этими группами ни в пороге и длительности ПР, ни в степени норадренергической денервации переднего мозга вне гиштокампа, ни в колическтве катехоламинергических нейронов в трансплантантах, а также в распределении и степени норадре-нергаческой реинервации гиппокампа реципиента. Таким образом, наиболее приемлемым объяснением облегчения процесса раскачки в трансплантированной группе, а также в труппе нормальных животных, с применении идазоксана, представляется . блокирование альфа-2 норад-ренергических постсинаптических рецепторов (се1тап .и а1., 1зв7: см. раздел 1.4). Разрушение норадренергической системы и блокирование альфа-2 норадренергических постсинаптических рецепторов как в интактных, так и в трансплантированных животных имеют одинаковое облегчающее влияние на развитие раскачки. Это положение хорошо согласуется с данными Гельмана и соавт. (1987), которые показали, что введение идазоксана не вызывает дальнейшего значительного облегчения развития раскачки в амигдале у животных с предварительным разрушением

норадренергической системы введением dsp-4. По данным этих авторов (Geiomn et ai.. is87 ), введение блокзторов либо альфа-I, либо бета-адренергических рецепторов ни как не влияет на процесс раскачки. Таким образом, одинаковая скорость раскачки в группах трансплантированных и нормальных животных с введением идазоксана, свидетельствует об одинаковом специфическом эффекте НА, высвобождающегося как из внутренних, так и трансплантированных нейронов, т.е. посредством стимуляции альфа-2 подтипа адренергических рецепторов.

Для объяснения функциональных эффектов, наблюдаемых после пересадки эмбриональной нервной ткани в мозг взрослых реципиентов, выдвигается целый ряд предположительных механизмов (см. Bjorkiund et ai., 1987). В дополнение к восстановлению более или менее контролируемой синаптической нейропередачи в денервированной области мозга реципиента, предпологается воздействие дифузного, подобного гормональному, высвобождения активных компонентов из трансплантанта, или же трофического влияния эмбриональной ткани на нейроны реципиента.

Однако, представленные здесь данные свидетельствуют о том, что тормозящее влияние трансплантантов синего пятна на развитие судорожной активности при гиппокампальной раскачке осуществляется с участием норадренергаческих механизмов. Можно предположить, что это увеличение выброса НА как из интактных, так и из трансплантированных нейронов, дает функциональный эффект в раскачке посредства активации альфа-2 постсинаптических адренергических рецепторов. По-видимому, несмотря на свое эктопическое расположение в гиппокампе, трансплантированные норадренергические нейроны эмбрионального синего пятна анатомически, биохимически и функционально хорошо интегрируются в мозг взрослых реципиентов.

ВЫВОДЫ

I. Метод in vivo микродиализа мозга с последующим радиоферментативным анализом содержания НА в нервной ткани весьма удобен для исследования внеклеточной концентрации НА в гиппокампальной формации крыс как в нормальных условиях, так и при

развитии фокальных и генерализованных судорог. При этом, НА несомненно является нейронэльного происхождения, а изменение его коь_ентрации в микродиализных перфузатах птпокампа тесно связано с функционированием норадренергических синапсов и отражает изменения физиологической активности системы синего пятна крыс.

2. Норадренергическая система мозга обладает способностью с течением времени частично компенсировать дефицит НА, возникающий после нейротоксического разрушения катехоламинергических систем. Однако, при этом, ее реактивность на различные воздействия остается значительно пониженной и полного самостоятельного восстановления нарушенных функций не происходит.

3. Завершение генерализации эпилептических судорог не влияет на способность норадренергической системы синего пятна реагировать на их развитие повышением высвобождения НА в гигатокампе. Следует отметить, что при этом наблюдается значительное понижение фонового устойчивого уровня внеклеточного НА, что свидетельствует о некотором нарушении нормального функционирования норадренергической нейропередачи.

Понижение синаптической активности норадренергической системы может происходить во время самого процесса генерализации судорог, что хорошо видно на примере быстрой раскачки, хотя следует учитывать, что она несколько отличается от традиционной.

4. Во время развития генерализованных судорог в интактных животных регуляция высвобождения НА осуществляется в основном через активацию тел нейронов на уровне синего пятна и увеличение внеклеточного НА в гиппокампе находится в зависимости от афферентного притока импульсов по медиальному переднемозговому пучку.

5. Реиннервзция волокнами норадренергических нейронов эмбрионального агаего пятна области мозга, критической для процесса генерализации судорог (амигдалэ-пириформная кора), хотя и отдаленной от места их первоначального возникновения, является достаточным условием для значительного замедления раскачки у животных с предварительным разрушением катехоламинергических систем.

Унилатеральное восстановление норадренергической иннервации гиппокампа пересадкой эмбрионального синего пятна не в состоянии предотвратиь ускоренную генерализацию судорог, возникающих в гиппокампе.

6. Несмотря на более низкую 'Степень приживаемости, аллогенная

эмбриональная норадренергичеокая ткань воетаки способна в достаточной степени реиннервировать пшпокамп^ реципиента для устранения повышенной предрасположенности к генерализации судорог при быстрой раскачке, в животных с предварительным разрушением катехоламикерги-ческих систем.

7. Пересаженная эмбриональная ткань синего пятна оказывает свое тормозящее влияние на развитие генерализации судорог посредством восстановления нормального фонового уровня НА в гиппокампе (или аиигдала-пирифорыной коре) и механизма регулируемого высвобождения НА из эктопически расположенных норадренергических нейронов в ответ на различные воздействия, например такие, как эпилептические судороги:

8. Эмбриональная ткань синего пятна содержит различные типы нейронов и глиальных клеток, однако эффект торможения генерализации эпилептической активности при пересадке в мозг взрослых реципиентов, с предварительно разрушеными катехоламинергическими системами, непосредственно связан с деятельностью норадренергичесаких нейронов, поскольку он полностью устраняется при блокировании альфа-2 постисинаптических адренергических рецепторов.

Аналогичное блокирование норадренергичесакой нейропередачи на уровне альфа-2 постсинаптических рецепторов облегчает процесс быстрой раскачки в интактных животных.

9. Несмотря на свое эктопическое расположение в гиппокампе и амигдала-пириформной коре, трансплантированные норадренергические нейроны эмбрионального синего пятна анатомически, биохимически и функционально хорошо интегрируются в мозг взрослых животных и могут модулировать вызванную судорожную активность и процесс эпилептизации нервных элементов путем регулируемой синаптической активности, осуществляемой на основе тесной взаимосвязи между трансплантированной и реципиентной нервной тканью.

10. Результаты данной работы дают основание заключить, что пересадка эмбриональной мозговой ткани, наряду с применением для компенсации функций при таких неврологических нарушений, как болезни Паркинсона, Альцгеймера и Хантингтона, может быть в дальнейшем успешно применена в клинических условиях для модулирования возбудимости эпилептических очагов и, тем самым, для альтернативного медикаментозному лечения этого тяжелого недуга.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kokaia М., Bengzon J., Kaien P., Lindvall O. Noradrenergic mechanisms in hippocampal kindling with rapidly recurring seizures. Brain Res., 1989, 491, 398-402.

2. Kokaia M., Bengzon J., Brundin P., Lindvall O. Seizure suppression in kindling epilepsy by intrahippocampal locus coeruleus grafts: evidence for an alpha-2 adrenoreceptor mediated mechanism. Abstracts of 3rd International Symposium on Neural Transplantation: "Neural Transplantation: from Molecular Basis to Clinical Application", Cambridge, 1989, August 6-11, Restorative Neurology and Neuroscience, 1989, 8.

3. Kokaia M., Kalen P., Bengzon J., Lindvall 0. Noradrenaline and 5-hydroxytryptamine release in hippocampus during seizures -induced by hippocampal kindling stimulation: an in vivo mi сrodialysis study. Neurosci.. 1989, 32. 3, 647-656

4. Kokaia M.G., Kokaia Z.G., Tsaishvili Ts.S.. Godziashvili S.B. Effect of fotal locus coeruleus grafts on hippocampal kindling »ith rapidly recurribg seizures. ИЗВвСТИЯ АН ГруЗИИ, СврИЯ бИОЛОГИческая, 1991, 17, 3, в печати.

5. Bengzon J., Kokaia М., Kaien P., Lindvall О. Hippocampal noradrenaline and 5-hydroxytryptamine release during seizures induced by kindling stimulation in the hippocampus as studied by in vivo microdialysis. 12th Annual Meeting of ENA. Turin, Italy, September 3-7, 1989, European J. of Neuroscience. 1989, Suppl. No 2, 55.

6. Bengzon J.. Kokaia M.. Brundin P., Lindvall O. Seizure suppression in kindling epilepsy by intrahippocampal locus coeruleus grafts: evidence for alpha-2-adrenoreceptor mediated mechanism. Experimental Brain Res., 1990. 81. 433-437.

7. Bengzon J., Kokaia M.. Brundin P., Lindvall O. Reduction in

interictal noradrenaline release after kindline in the hippocampus. 13th ENA Meeting, Stockholm, Sweden. 1990, September, European J. of Neuroseience, 1990, suppl. No 3, 129.

8. Bengzon J., Kokaia M., Kalen P., Brundin P., Lindvall O. Noradrenaline release fron intrinsic and «rafted locus coeruleus neurons in response to seizures induced by hippocampal kindling stimulation. ETP in Brain and Behaviour, Autumn School. Caste1vecchio, Lucca, Italy, 1990, 22-29 September, Brain Damage and Repair. 1990, 55.

9. Kalen P., Kokaia U., Lindvall O.. Bjorklund A. Basic characteristic of noradrenaline release in hippocampus of intact and 6-hydroxytryptamine-1 esioned rats as studied by in vivo mic rod ialy s i s. Brain Res.. 1989, 474. 374-379.

10. Kalen P.. Kokaia U.. Lindvall O.. Bjorklund A. Basic characteristics of noradrenaline release in the rat hippocampus studied by intracerebral 'dialysis. 11th Annual Meeting of ENA, Zurich, FRG. 1988, September 4-8, European J. of Neuroseience, 1988, Suppl., 290.

11. Bengzon J,, Brundin P., Kalen P., Kokaia M. Lindvall 0. Host regulation of noradrenaline release from grafts ol seizure-suppressant locus coeruleus neurons. Experimental Neurology, 1991. Ill, 49-54.

t

12. Barry D.I., Wascher B., kragh J.. Bolwig T.G., Kokaia M.,Brundin P., Bjorklund A., Lindvall 0. Grafts of fetal locus coeruleus neurons in rat amygda1 a-piriform cortex suppross seizure development in hippocampal kindling. Experimental Neurology, 1989, 106. 125-132.

13. Bjorklund A., Kalen P., Strekcer R.E.. Rosengren E.. Kokaia M., Lindvall 0. Endogenous release of serotonin and noradrenaline in the rat as studied by intracerebral dialysis. 18th Annual Meeting of Society for Neuroscience, Toronto, Canada, 1988, November 13-18, 212.

rat 8-12