Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскрипционные факторы семейства NF-kB/Rel: регуляция экспрессии генов локуса ФНО мыши и особенности взаимодействия с ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционные факторы семейства NF-kB/Rel: регуляция экспрессии генов локуса ФНО мыши и особенности взаимодействия с ДНК"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

РГ6 ОД именивлэнГЕЛЬГАрДтл

На правах рукописи

КУПРЛШ Дмитрий Владимирович

УДК 577.21

ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ СЕМЕЙСТВА ОТ-кВ/11е1: РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЛОКУСА ФНО МЫШИ И ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

1994

Работа выполнена в группе "Молекулярная биология цитокинов' Института молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта Российской Академии Наук (г.Москва) и в американском отделении совместно{ Российско-Американской лаборатории "Молекулярная биология цитокинов' (Национальный Раковый Институт США, г.Фредерик, цгг.Мериленд).

Научный руководитель:

доктор биологических наук С.А.Недоспасов

Официальные оппоненты:

доктор билогических наук, профессор П.М.Рубцов доктор биологических наук Н.И.Дризе

Ведущая организация: Институт биологии гена Российской Академии Наук.

Защита диссертации состоится 1994 г. в

часов на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институт! молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН по адресу: 117 984 Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан

1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

А.М.КРИЦЫН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Введение. Транскрипционный фактор NF-кВ был впервые описан в 1986 году как активирующий белковый комплекс В-клеток, специфически связывающийся с участком ДНК в энхансере легких цепей иммуноглобулинов (Sen and Baltimore, 1986). Неактивный NF-кВ удерживается в цитоплазме другим белком, 1кВ, а после активации клеток высвобождается и транслоцируется в ядро. После клонирования генов, кодирующих субъединицы NF-кВ р50 и р65, оказалось, что оба белка содержат участок высокой гомологии с клеточным онкогеном c-Rel, его вирусным аналогом v-Rel и морфогеном дрозофилы Dorsal. Было показано, что этот участок полипептидной цепи отвечает за димеризацию (с различной эффективностью образуются как гомо-, так и гетеродимеры), связывание с ДНК и с 1кВа, природным ингибитором NF-кВ. Впоследствии было проклонировано и охарактеризовано еще несколько генов, содержащих участок гомологии с Reí, и несколько генов, гомологичных 1кВа (Рис.1). Было показано, что онкоген с-Rel обладает ДНК-связывающими свойствами, а гены, кодирующие р65 и предшественник р52 (lyt-10), часто обнаруживаются в точках хромосомных

Рисунок 1. Схематическое изображение основных функциональных районов белков семейства ЫР-кВ/ге1. Зачерненными прямоугольниками показаны положения некоторых синтетических эпитопов, антитела к которым использовались для идентификации индивидуальных Ж-кВ/ге! белков в настоящей работе.

транслокаций в опухолевых клетках,, то есть являются потенциальными онкогенами. И действительно, аномальная экспрессия различных членов семейства ^-кВ часто обнаруживается в опухолевых клетках. Функциональные участки связывания ОТ-кВ были найдены в промоторах большого числа генов, вовлеченных в функционирование иммунной системы. ЫР-кВ также принимает участие в регуляции транскрипции вируса иммунодефицита человека, действуя через сайты связывания в длинном концевом повторе вируса. Консенсус участка связывания ЫБ-кВ имеет вид ОООЯЫМУУСС, однако последовательность некоторых функционально активных кВ сайтов может отличаться от консенсуса. Недавно предложена стандартизованная номенклатура белков ЫР-кВ/ге1 (Табл.1); в этой работе используются, как правило, исторически сложившиеся обозначения (такие, как Р50, р52, р65).

Сейчас известно, что белки семейства ЫР-кВ, первоначально обнаруженные в В-клетках, присутствуют в широком спектре клеток, как лимфоидных, так и нелимфоидных. В ответ на различные активирующие

1. Белки NF-кВ/ге!

Ген Белки Другие названия

njkbl NF-kB1, p50 или pl05 KBF1, EBP-1

nfkb2 NF-kB2, p52 или plOO p55, p50B, p49, lyt-10, H2TF1

c-rel Rel

relA RelA p65

relB RelB I-rel

dorsal dorsal

dif Dif, Cif dorsal-related immunity factor, cecropia immunoresponsive factor

2. IkB белки

Ikba 1кВ-а 37 kD, MAD-3, pp40

Ikbb IicB-ß 43 kD

nfkbl 1кВ-у 70 kD, carboxy-terminal region of pl05

bcl3 Bcl-3 46-56 kD

cactus cactus

Таблица 1. Номенклатура известных на сегодня белков семейства NF-KB/rel и их природных ингибиторов. (Nabel and Verma, 1993).

сигналы они транслоцируюгся в ядро, активируя гены, регуляторные элементы которых содержат кВ сайты. При этом действие ЫР-кВ обнаруживает высокую специфичность: в разных тканях активируются разные наборы генов. Вопрос о том, как контролируется эта специфичность, важен как для понимания фундаментальных закономерностей регуляции транскрипции у эукариот, так и для возможных практических подходов к лечению рака и СПИД. В научной литературе накоплено значительное количество данных в пользу того, что такой контроль может осуществляться на уровне (1) специфического воздействия активирующего сигнала на отдельные члены семейства ОТ-кВ, (2) избирательного узнавания ОТ-кВ белками кВ сайтов, имеющих вариации в нуклеотидной последовательности, (3) взаимодействия ОТ-кВ с другими ядерными факторами, (4) различий в пространственном расположении сайтов связывания ЫР-кВ и других транскрипционных факторов внутри данного промотора или энхансера. Однако общая модель действия факторов ЫР-кВ/ге1 пока не построена, поэтому каждая ОТ-кВ зависимая система требует отдельного исследования.

Модельная система: гены локуса ФИО мыши. Локус ФНО мыши содержит гены фактора некроза опухолей (ФНО), лимфотоксина (ЛТ-альфа) и лимфотоксина-бета (ЛТ-бета, о существовании которого стало известно только в 1993 году), разделенных короткими (порядка 1 т.п.н.) межгенными промежутками, содержащими несколько сайтов кВ (Рис.2). Для ФНО и ЛТ-альфа, первоначально охарактеризованных как цитотоксические факторы, продуцируемые, соответственно, активированными макрофагами и лимфоцитами, в настоящее время известен широкий спектр биологических активностей, включая активацию роста различных клеток. Считается, что эти два цитокина играют ключевую роль в функционировании и, возможно, развитии иммунной системы млекопитающих. Недавно открытый ЛТ-бета образует мембранный комплекс с ЛТ-альфа; о его функциях и регуляции известно значительно меньше.

Участие ОТ-кВ в регуляции транскрипции локуса ФНО было показано для

ЛТ-альфа

1 т.п.н.

г

2 2а

ФНО

ЛТ-бета

4+-

ЧНЙг

Рисунок 2. Карта локуса ФНО мыши. Показано положение сайтов связывания ЫР-кВ. Стрелками показаны направления транскрипции генов, угловыми стрелками показаны промоторы.

гена ФНО и для гена JIT-альфа. Таким образом, локус ФНО представляет собой модель для исследования действия NF-icB, интересную как с точки зрения фундаментальной науки, так и медицины.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью данного исследование явилось изучение роли отдельных белков NF-кВ в регуляции транскрипции генов локуса ФНО. Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику анализа тонкой структуры комплексов NF-кВ с ДНК.

2. Выяснить белковый состав комплексов NF-кВ, связывающихся с различными кВ сайтам из локуса ФНО в ядерных экстрактах из макрофагов и лимфоцитов - тканей, где дифференциально экспрессируются гены ФНО и JIT.

3. Функционально охарактеризовать индивидуальные кВ сайты, из локуса ФНО мыши по способности активировать ген-репортер в модельной системе.

4. Изучить влияние белков семейства NF-кВ на конформацию ДНК в участке связывания, рассматривая потенциальные изменения как компонент транскрипционной активации.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработана методика высокоразрешающих нуклеопротеиновых гелей, позволяющая разделять комплексы индивидуальных белков семейства NF-кВ с ДНК. Охарактеризованы NF-кВ комплексы, образующиеся на кВ сайтах из локуса ФНО мыши, и показано, что белковый состав комплексов сайт-специфичен. Функционально охарактеризован новый кВ энхансер, находящийся за 3'-нетранслируемой областью гена ФНО. При помощи набора элекгрофоретических методов исследованы конформационные изменения ДНК в участке узнавания и связывания NF-кВ. Показано, что разные NF-кВ белки в различной степени изменяют конформацию ДНК в участке связывания.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных симпозиумах: 2 Международной конференции по цитокинам (Хилтон Хэд, США, декабрь 1989); Советско-германском симпозиуме по молекулярной биологии (Иркутск, 1989); Симпозиуме Общества Биологии Лейкоцитов (Колорадо, США, 1991), Германско-российском симпозиуме по молекулярной биологии (Констанц, Германия, июнь 1991); Российско-Германском симпозиуме "ДНК-белковые взаимодействия: структурные и фармакологические аспекты" (С.-Петербург, август 1991); Кистоун Симпозиуме "Транскрипционная регуляция при развитии, дифференцировке и заболеваниях" (Тамаррон, США, январь 1992); Гордоновской конференции "Ядерные белки, регуляция экспрессии генов и структура хроматина" (Тилтон, США, июль 1992); 1 Международном Симпозиуме "СПИД, рак и ретровирусы человека" (С.-Петербург, ноябрь 1992); Кистоун Симпозиуме "Транскрипция: факторы, регуляция и дифференцировка" (Кистоун, США, январь 1993); 58 Колд Спринг Харбор Симпозиуме по количественной биологии (Кодц Спринг Харбор, США, июнь 1993); 2 Международном Симпозиуме "СПИД, рак и ретровирусы человека" (С.-Петербург, ноябрь 1993), а также докладывались на

семинаре "Хромосома" (1991 г.) и конкурсе научных работ Института Молекулярной Биологии им. Энгельгардта РАН (1994 г.).

Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных журналах и книгах, а также тезисы в материалах 4 международных конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, полученные результаты, обсуждение результатов, выводы, список литератур. Библиография включает

отечественных и зарубежных источника, работа проиллюстрирована рисунками и таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Рекомбинаитные плазмиды, использовавшиеся в работе, конструировались по стандартным протоколам (ЗатЬгоок е1 а1, 1989), все стыки клонирования проверялись двухцепочечным секвенированием. Пермугационный вектор рОепсЩ представляет собой модификацию вектора рВепс12, любезно

кВ проба кВ сайт из локуса ФНО Структура олигонуклсотидного дуплекса после застройки "утопленных" концов *

Н2ТР1 - ассятс^сттахюаттссссатстсасзст

18 - аскптсасак^астттсссасассасст

РБ - ...ттсозсааттссссас...

тЬТ сайт 0 ссссттакхзссттссссааоссссассссс

ЮТ»! сайт 1 ассттссотассазаатсс^тссаасасст

тар#2 сайт 2 асклтевтсххзебааттссса«юста5ст

сайт 2а ассттсстстс«юстассссатастасст

Т№#3 сайт 3 аасттааасавсссссптссстсстасст

шШР#48 сайг 4 асстс^сатсссааггтсссастсаасст

шШР#4 сайт 4 осстсгасасггсс^сатсссааттгсссастстссстстасассс

Таблица 2. Примеры синтетических кВ олигонуклеотидов, использованных в работе. Участки связывания ЫР-кВ подчеркнуты, отличия от консенсуса отмечены строчными буквами.

'Примечание: показана одна цепь дуплекса, последовательность РР> представляет собой участок, общий для все серии "фазирующих" олигонуклеотидов.

предоставленного Dr. S.Adhya (NIH, Bethesda, MD, USA). Конструкции, содержащие кВ сайт и внутренний стандарт изгиба, были приготовлены из вектора 11А17, любезно предоставленного Drs. J.Kahn and D.Crothers (Yale University, New Haven, CT, USA). Экспрессионные вектора были предоставлены: для человеческих р50 и р65 - Dr.P.Baeuerle (Ludwig-Maximilians-University, Martinsried, Germany), для человеческого р52 -Dr.A.Israel (Institut Pasteur, Paris, France), для химерного мышиного белка GST-р52 - Dr.B.Sha (RockfeUer University, New York, NY, USA).

Очищенный рекомбинантный человеческий белок p50-HIS был любезно предоставлен Dr.A.Israel и Dr.P.Baeuerle.

Радиоактивно меченые ДНК пробы для анализа готовились либо застраиванием "утопленных" З'-концов в синтетических олигонуклеотидных дуплексах, содержащих кВ сайты (Табл.2), либо полимеразной цепной реакцией (ПЦР) на плазмидах, содержащих исследуемые последовательности, с добавлением дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, меченых 32Р или 33Р, и с последующим расщеплением подходящей рестриктазой и самолигированем (для опытов с миникольцами). Все пробы для экспериментов по связыванию на последней стадии очищались из полиакриламидного геля. Меченые продукты ПЦР анализировались гидролизом специфическими эццонуклеазами, для подтверждения точности и полноты синтеза.

Электрофоретическое разделение нуклеопротеиновых комплексов в полиакриламидном геле проводилось по стандартной методике, с модификациями, описанными в следующем разделе (см. "Результаты и обсуждение"). Для изучения влияния связывания NF-кВ на подвижность комплекса применялись 8 % гели, в остальных опытах - 4-5%.

Моноспецифические антитела к белкам NF-xB/rel, представляющие собой высокоактивные кроличьи антисыворотки к синтетическим пептидам из различных участков белков семейства, были любезно предоставлены Dr.N.R. Rice (ABL-BRP, NCI-FCRDC, Frederick, MD, USA).

Культивирование клеточных линий и костномозговых макрофагов проводилось как описано в литературе, ядерные и суммарные белковые экстракты готовились по стандартным методикам мягкого лизиса клеток при помощи неионного детергента NP-40. Клеточная линия 293 из почек человека трансфецировалась при помощи кальций-фосфатного метода, остальные клетки - по модифицированному протоколу с использованием ДЕАЕ-декстрана.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка методики анализа тонкой структуры ДНК-белковых комплексов. Было замечено, что система электрофореза в полиакриламидном геле в низкоионном буфере, традиционно применяемая для анализа ДНК-белковых взаимодействий in vitro, не позволяет разделить индивидуальные NF-кВ комплексы, образующиеся на кВ сайтах в ядерных экстрактах из многих

клеток млекопитающих, в том числе из макрофагов мыши. Чтобы решить эту проблему, было применено несколько подходов.

Во-первых, была проведена оптимизация процедур подготовки полиакриламидного геля, мечения ДНК-пробы (в том числе, использование низкоэнергетического изотопа 33Р) и электрических параметров электрофореза. Была также оптимизована буферная система В лаборатории введена система использования электрофорезных аппаратов, исключающая их загрязнеие детергентами. Были внесены и другие технические улучшения. Весь этот комплекс мер позволил принципиально улучшить качество нуклеопротеиновых гелей, так что стало возможным различать тонкую структуру NF-kB-специфических полос.

Во-вторых, для идентификации индивидуальных членов кВ семейства к реакциям связывания добавлялись специфические антитела к уникальным синтетическим эпитопам NF-кВ белков (Рис.1), которые либо препятствовали образованию соответствующего комплекса, либо увеличивали его массу и тем самым эффективно уменьшали электрофоретическую подвижность. Для различения комплексов, имеющих одинаковую подвижность, применялись попарные комбинации антител. Этот компонент методики также потребовал дополнительной отработки: по неизвестной причине, антитела к белку c-Rel не давали воспроизводимых результатов в трис-боратных буферах, так что для надежной идентификации Rel-содержащих комплексов приходилось применять трис-глициновые гели, которые давали более низкое разрешение, чем трис-боратные, и поэтому для других целей не использовались.

2. Обнаружение нового кВ энхансера в локусе ФНО. Вывод об участии NF-кВ в регуляции транскрипции гена ФНО в мышиных макрофагах, сделанный в опубликованных работах (Shakhov et al, 1990, Drouet et al, 1991), основывался на том, что (1) при активации существует корреляция между индукцией мРНК ФНО и появлением в ядре ДНК-связывающей активности NF-kB; (2) промотор гена ФНО содержит несколько кВ и кВ-подобных сайтов, которые связывают NF-кВ in vitro; (3) делегирование или точечный мутагенез промотора, приводящее к удалению кВ сайтов одного за другим, приводит к постепенному падению активности гена-репортера в опытах по транзиторной трансфекции; (4) конструкции, в которых мультимеры кВ сайтов помещены перед минимальным промотором, активируются в ответ на ЛПС.

При скрининге нуклеотидной последовательности локуса ФНО мыши кВ консенсусом GGGRNNYYCC в 220 п.н. от сигнала полиаденилирования гена ФНО нами был обнаружен еще один потенциальный участок связывания NF-кВ, получивший обозначение "сайт 4" (Рис.2, табл.2). Проведенное сравнение нуклеотвдных последовательностей локусов ФНО человека и мыши показало, что сайт 4, также как и сайты 0, 2 и 2а, консервативен в эволюции. Это наблюдение, подтвержденное сравнением с опубликованными позже последовательностями ФНО локусов свиньи и лошади, а также описанная в литературе функциональная значимость З'-нетранслируемой области ФНО для

правильной тканеспецифической экспрессии гена, указывали на возможную функциональную значимость сайта 4.

3. Определение белкового состава индивидуальных NF-кВ комплексов. Олигонуклеотиды, содержащие кВ сайты из локуса ФНО (Табл.2), были исследованы на нуклеопротеиновых гелях с экстрактами из первичных костномозговых макрофагов мыши и из клеток ряда макрофагальных линий ANA-1, RAW- 264.7, PU-5 и сравнены с классическими кВ сайтами, хорошо

Проба:

mTNF«4

H2TF1

(л сл

а. а. < -1 2

Ядерный < < экстракт: < <

3CI

2С 1Е

ос

Щми

• " <ÜU

ууущ,^

1 2 3 4 5 6 7 • 9 10 11 12 13 14 15 16 17 И 19 20

Рисунок 3. Пример высокоразрешающего иуклеопротеипового гела с ядерными экстрактами из макрофагов мыши и лимфоцитов мыши и человека.

охарактеризованными в литературе. Сайты 1, 2 и 2а связывали NF-kB значительно слабее других; сродство сайтов 0, 3 и 4 к NF-kB было сравнимо со сродством сайтов H2TF1 и Ig, но соотношение интенсивностей полос отличалось (Рис. 3, показан пример геля с сайтами 4 и H2TF1). Белковый состав комплексов был выяснен с применением антител и ультрафиолетовых пришивок с модифицированными олигонуклеотидами. Согласно полученным данным, все NF-kB комплексы содержат гомо- или гетеродимеры различных членов семейства, по крайней мере, ни в одном опыте не наблюдалось комплекса, который реагировал бы более чем с двумя антителами или имел бы аномальную подвижность, хотя теоретически возможность участия других ядерных белков в формировании комплексов полностью исключить нельзя.

Картина полос на вновь охарактеризованном сайте 4 оказалась уникальной по сравнению с другими сайтами и отличалась повышенной представленностью неканонического комплекса 3, содержащего р65 и c-Rel, и представляющего собой, по-видимому, дублет близко бегущих комплексов р65-р65 и p65-c-Rel, имеющих близкие элекгрофоретические подвижности. Так как и р65, и c-Rel являются транскрипционными активаторами, то эти данные еще раз указали на возможную роль сайта 4 как регуляторного элемента. Картина ДНК-белковых комплексов, образующихся на сайте 4, также особенно резко оличает макрофагальные ядерные экстракты от ядерных экстрактов из Т и В лимфоцитов. Главными отличительными особенностями макрофагов с точки зрения представленности белков NF-kB в ядре являются повышенное количество ДНК-связывающих р65 и c-Rel (подтвержденное данными Вестерн-анализа), и почти полное отсутствие р52.

4. Сайт 4 из локуса ФИО функционирует как ЛПС- и NF-кВ-зависимый регуляторный элемент. Для прямой проверки функциональной роли сайта 4 были приготовлены тест-конструкции с геном CAT под контролем минимального ФНО промотора, содержащие несколько копий сайта 4 перед промотором. Предварительный анализ показал, что у конструкций, содержавших 1 или 2 копии NF-kB сайта, которые активировались ЛПС при трансфекции в клетки ANA-1, уровень активации был меньше, чем у конструкции, содержавшей полный промотор гена ФНО мыши, в то время как конструкция, содержавшая три копии сайта 4, активировалась ЛПС так же или сильнее, чем конструкция с полным промотором, - в соответствии с опубликованными ранее данными о необходимости нескольких кВ сайтов для полной активности промотора гена ФНО. Конструкция, содержащая 3 копии сайта 4, была взята в дальнейший анализ и сравнивалась в трансфекциях в клетки ANA-1 с аналогичными конструкциями, содержащими три копии кВ сайта 2, кВ сайта 3 или сайта H2TF1. В соответствии с опубликованными ранее данными, конструкции, содержащие сайты 2 и 3, слабо реагировали на ЛПС, в отличие от конструкции с сайтом 4, уровень активации которой был выше, чем у полного промотора гена ФНО. Таким образом, было показано, что сайт 4 может функционировать как ЛПС-зависимый регуляторный элемент. Попытки имитировать действие ЛПС котрансфекциями плазмид,

Активатор Сайт 4 H2TF1

ЛПС 199 Т 27 (11) 43 Т 10 (4)

р65 53 Т 23 (9) 12 Т 5 (5)

с-ге1 3.8 Т 1.6 (7) 0.6 Т 0.1 (4)

р50 0.09 Т 0.04 (4) 0.15 Т 0.09 (3)

Таблица 3. Активация NF-кВ зависимых тест-конструкций в мышиных макрофагах. Три копии соответствующего олигонуклеотида, были клонированы в CA Т-конструкцию с минимальным промотором гена ФНО мыши, которая трансфецировалась в клетки ANA-1. Активация белками семейства NF-tcB/rel достигалась котрансфекцией соответстующих экспрессирующих конструкций. Уровень активации определялся как отношение САТ-сигнала к неактивированному контролю, в скобках указано количество поставленных опытов.

экспрессирующих белки семейства КР-кВ/ге1, не привели к полному успеху, как в силу технических причин, так и вследствие наличия кВ сайтов в промоторах генов рЮ5, р65, с-Яе! и 1кВ, то есть во всех охарактеризованных на данный момент промоторах генов семейства КБ-кВ/ге!. Этот факт (не известный ко времени постановки описываемых опытов) может приводить к возникновению сложной сети взаимной регуляции генов семейства ЫР-кВ/ге1 на уровне транскрипции, так что суперпродукция одного из членов семейства не обязательно оказывается контролируемым однопараметрическим воздействием. Тем не менее, многочисленные опыты позволили достоверно установить показать, что регуляторная активность сайта 4 является ЫР-кВ-зависимой (Табл.3). Интересно, что р50 ингибирует (по-видимому, за счет конкуренции за сайт связывания) не только базальную активность конструкции с сайтом 3, но и активацию этой конструкции ЛПС, что также указывает на то, что действие ЛПС в этой системе опосредуется КР-кВ/ге1.

5. Уточненный делеционный анализ промотора гена ФНО. Чтобы более точно разобраться в роли отдельных кВ сайтов в регуляции транскрипции гена ФНО, был приготовлен дополнительный набор САТ- конструкций с промоторными делениями, аналогичными уже имевшимся (ЗИаЫюу й а1, 1990), но приготовленными методом ПЦР от кВ-специфических праймеров и поэтому начинающимися точно с кВ сайтов. Было обнаружено, что главное падение индуцируемосги промотора ФНО под действием ЛПС происходит в районе расположения сайтов 2 и 2а в 650 нуклеотидах перед началом транскрипции (рис.4). Это может быть объяснено, если предположить, что наблюдаемые соотношения интенсивносгей ОТ-кВ комплексов на сайтах 0-3 коррелирует с их функциональными свойствами. Все эти сайты имеют либо

Индуцируемость ЛПС

-1200-1100-1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -ЗОО -200 -100 О

Расстояние от точки начала транскрипции, п.н.

Рисунок 4. Профиль ЛПС-индуцируемости промоторных делеций гена ФИО мыши. Каждая вертикальная линия соответствует ¡'-концу одной делеции промотора ФИО. Черными прямоугольниками отмечены положения кВ сайтов.

низкое сродство ко всем ОТ-кВ комплексам (что справедливо для сайтов 1, 2 и 2а и объясняется отклонением их последовательностей от консенсуса (Табл.2)), либо высокое сродство к неактивирующему комплексу р50-р50, которым обладают сайты 0 и 3. Таким образом, все кВ сайты из промотора ФНО являются потенциально слабыми активирующими элементами. Отличие сайтов 2 и 2а от остальных заключается в том, что (1) они находятся на расстоянии 3 витков спирали ДНК друг от друга, что может обеспечивать кооперативность связывания белковых комплексов, и/или (2) с перекрывающимся с сайтом 2 участком нуклеогидной последовательности связывается дополнительного комплекса, не содержащего белков семейства ОТ-кВ/ге1 (комплекс 0, рис.3).

б. Изменяет ли №-кВ конформацию ДНК в участке связывания?

Вывод о том, что для полной активности промотора гена ФНО в макрофагах необходимо наличие нескольких кВ сайтов (один из которых находится позади гена ФНО), наводит на мысль, что контакты активирующих ДНК-белковых комплексов, образующихся на этих сайтах, с инициирующим комплексом, могли бы облегчаться в случае, если бы ЫР-кВ индуцировал изгиб в ДНК либо другие конформационные изменения, эффективно уменьшающие расстояние между дальними кВ сайтами и инициирующим

комплексом. Это предположение носит общий характер для эукариотических ядерных факторов, способных активировать транскрипцию на расстоянии.

Для проверки предположения о влиянии ОТ-кВ на конформацию ДНК было применено три родственных экспериментальных подхода, схематически проиллюстрированных на рисунке 5. Все три метода включают отделение ДНК-белкового комплекса от несвязавшейся ДНК при помощи электрофореза, и были выбраны потому, что малая доступность и сложность получения высокоочищенных препатаров белков ОТ-кВ/ге1 затрудняла для нас применение более прямых физических и физико-химических подходов. Ранее все эти методы были успешно применены к бактериальному белку САР и дали результаты, согласовавшиеся с данными рентгенострукгурного анализа.

Метод анализа циклически пермутированных проб (рис. 5а) основан на том, что изогнутая ДНК имеет аномально низкую подвижность в полиакриламидном геле, поэтому фрагмент, содержащий изгиб в середине, будет иметь подвижность, меньшую, чем идентичный по длине и нуклеотидному составу фрагмент с изгибом на конце, который мало отличается от фрагмента без изгиба. Ключевое допущение метода заключается в том, что вклад собственно белка в подвижность не зависит от его положения относительно конца фрагмента, и вся разница в подвижности приписывается изменению конформации ДНК. Недостаток метода состоит в том, что для белков большого размера это предположение не всегда выполняется.

Для фазового анализа применяется набор проб, содержащих, кроме сайта связывания, еще и внутренний стандарт изогнутой ДНК, расстояние до которого меняется с шагом в 1-2 нуклеотида, так что покрывется 1-1.5 периодов двойной спирали (рис.5б). Различие подвижностей в поли акрил амидном геле между комплексами, в которых два изгиба - реперный и опытный - направлены по одну или по разные стороны от оси ДНК, вызвано теми же причинами, что и эффект в пермутационном анализе, с той разницей, что положения белка относительно концов ДНК пробы почти не отличаются, что дает основания полагать, что весь эффект обусловлен геометрией ДНК. Если из пермутационного анализа определяется положение центра изгиба, то фазовый анализ позволяет определить его направление. И первый, и второй метод позволяет сделать оценку для величины угла изгиба (в предположении неизменного вклада белка в подвижность комплекса).

Изгиб ДНК белком означает, что комплекс, в котором ДНК изогнута, термодинамически более выгоден, чем комплекс с "прямым" сайтом. На этом положении (экспериментально подтвержденном для белка САР) основан метод связывания с миникальцами. Приготавливается набор меченых миниколец, содержащих внутренний стандарт изгиба, удерживающий ДНК от вращения вокруг своей оси, и сайт связывания на различных расстояниях от этого изгиба (рис. 5в). В этом случае оказывается, что относительно поверхности контакта с белком сайт предизогнут либо внутрь, либо наружу. Ожидается, что белок, чувствительный к геометрии ДНК, будет связываться с разными миникольцами из такого набора с различной аффинностью, имеющей модуляции с периодом двойной спирали ДНК.

а) пермутационный анализ |23 12 з

сз

б) фазовый анализ

1. Приготовление проб: метеный ПЦР па плазмидной матрице распепление эвдонуклеазама

Ода сайта смзииш на 5 и, приводит к повороту ■округ оса дойкой спирали ДНК яа 165 градусе!

2. Связывание с белком а иуклеопротеиновый гель

в) связывание с миникольцами

1. Расшепленне эцдонуклеазой в самолигированне

СО

3. Результат: определение положении пеитра изгиба по положению сайта связывания во фрагменте с минимально II подвижностью.

3. Результат: определение направления изгиба по ориентации сайта саазы-ванна во фрагменте с минимальной подвижностью.

3. Результат: определение предпочтительной и "неудобной" конформаций сайта связывания. Сродство образованна комплекса с югаикольпом определяется относительно сродства к линейной пробе.

Рисунок 5. Схематическая иллюстрация использованных в работе экспериментальных подходов к изучению геометрии ДНК-белковых комплексов.

<х) СакгЪ Сайт 0 Ca.ltг У

О

?65 -

'>ии"1 Уу ' У

Уймышш

ЧИНИ 1114 1171 13141(71

42 44 46 49 52 57

^ у 50__&<,Т~р52-__р6&

и И» •• I, ■ .. •« »« . ...

нНИ|.с <1 •

42 44 46 49 52 57 42 44 46 49 52 57 42 44 46 49 52 57

Расстояние о» реяерного , п.н. г

Рисунок 6. Анализ геометрии взаимодействия Ш-кВ с ДНК. (а) анализ циклически пермутированных фрагментов в ядерных экстрактах из клеток ВА)У-264Л. (б) фазовый анализ связывания белков р5^РкВ1), р 52 и р65, экспрессированных в клетках 293. (в) дифференциальное связывание р65 и вЗТ-р52 с миникольцами, содержащими кВ сайт и направленный изгиб ДНК.

Было приготовлено два набора плазмидных кострукций. Первый набор содержал различные кВ сайты из локуса ФИО в обрамлении тандемно повторенного полилинкера и позволял легко получать циклически пермутированные меченые пробы (Рис. 5а). Второй набор в качестве стандарта изгиба содержал 6 последовательностей (А)$( разделенных 4 или 5 О/С нуклеотидами, то есть со средним спейсингом в 10.5 нуклеотидов (такая последовательность изогнута на угол около 110 градусов), и на расстояниях от 42 до 57 нуклеотидов от нее - симметричный кВ сайт РО. Меченые пробы готовились методом ПЦР (рис. 56), и из них же после расщепления соответствующими эндонуклеазами и самолигирования получались меченые миникольца (рис. 5в). Длина циклически пермутированных проб составляла 154 п.н., проб для фазового анализа - 294 или 275 п.н., миниколец - 239 или 146 п.н.

Анализ проводился на препаратах белков, имеющих различную природу: на ядерных экстрактах из клеток АКА-1, активированных Л ПС; на экстрактах из целых клеток 293, трансфецированных соответствующими экспрессирующими векторами, а также на очищенном препарате р50. Иммунохимическая аутентичность белков проверялась при помощи Вестерн-блотинга. Попытки получить устойчивое связывание с ДНК белка с-Яе1 или его укороченного варианта не привели к успеху, хотя, по крайней мере, в клетках 293 с-Яе1 экспрессировался на уровне, сравнимом с остальными белками.

р50 р65 >50/ р65 р52 35ГГ р52

Мол. масса димера 100 кД 130 «Д 115 кД 100 «д 150 КЦ

Циклические пермугации • ++ ++ ++ ++ ++

Фазовый анализ _ _ ++ ++

Связывание с мингасольцами Аффинность - ++ + - ++

длина 146 пн Подвижность ++ - + ++ ++

Связывание с мингасольцами Аффинность - + н.о. - +

длина 239 пн Подвижность ++ - н.о. ++ ++

Таблица 4. Геометрические свойства №-кВ комплексов. Для наглядности количественные данные опытов разбиты на 3 класса: ++ сильный эффект , + -слабый эффект, обнаружимый только после статистической обработки, -эффект отсутствует, н.о. - не определялось.

Результаты опытов суммированы в таблице 4. Циклические пермутации и фазовый анализ дали резко отличающиеся результаты для разных белков: в то время как пермутационный анализ дал яркий эффект на всех исследованных комплексах и для всех исследованных кВ сайтов (рис. 6а), в фазовом анализе эффект был обнаружен только для двух вариантов белка р52 и отсутствовал (или был очень мал) для р50, р65 и гетеродимера р50/р65 (Рис. 66). Этот результат указывает на то, что для белков ЫР-кВ пермутационный анализ, скорее всего, отражает не геометрию ДНК, а стерический вклад собственно белка, который является доминирующим компонентом. Эксперименты с миникольцами, однако, продемонстрировали сильную разницу в аффинности как для ОБТ-р52, так и для р65, причем зги два эффекта находились в противофазе (рис. 6в). При увеличении длины кольца эффект исчезал или сильно ослаблялся. Мы интерпретируем эффект для р65 как чисто стерический феномен: белок "не помещается" внутрь миникольца и вынужден дополнительно изменять либо конформацию кольца, либо свою собственную. В пользу этого вывода говорит также тот факт, что для С8Т-р52 есть истинный эффект усиления связывания с оптимально изогнутым кольцом по сравнению с линейной пробой, а для рб5 происходит лишь ослабление связывания, причем именно те точки, в которых изгиб сайта предпочтителен для С5Т-р52, оказываются "неудобными" для р65.

Неожиданной оказалась впервые обнаруженная нами сильная зависимость подвижности комплекса от положения кВ сайта в миникольце, которую наиболее логично интерпретировать как изменение эффективного размера комплекса в зависимости от того, "спрятан" ли белок внутри кольца или находится снаружи. Отсутствие эффекта на подвижность для р65 косвенно подтвеждает предположение о том, что в случае, когда сайт связывания развернут так, что белок не может с ним связаться по стерическим причинам, он изменяет конформацию миникольца, не заходя в его плоскость, при этом эффективный размер комплекса и подвижность в электрофорезе меняются слабо. Будущие опыты с делеционными мутантами р65 и р52 помогут окончательно прояснить природу этого эффекта; в любом случае, ясно, что примененный нами набор непрямых методик, выявивших отличия между индивидуальными ЫР-кВ комплексами, может служить ценным дополнением к данным, полученным прямыми физическими методами.

Что касается участия NF-кB в изменении геометрической организации промотора гена ФНО мыши при его активации, то полученные данные делают такое участие маловероятным: именно р52, который предположительно вызывает изгиб в сайте связывания, отсутствует в ядре активированных макрофагов в заметном количестве, а с-11е1, данные по которому отутствуют, по структуре гораздо ближе к р65, чем к р52, и поэтому, скорее всего, имеет свойства, сходные с р65. Этот вывод, разумеется, не исключает роли геометрического фактора как такового: изменения геометрии промотора могут вызываться многими причинами, прежде всего, упаковкой ДНК в нуклеосомы и связыванием других специфических ДНК-связывающих белков.

выводы

1. На модели кВ энхансеров из локуса ФНО мыши отработана методика анализа тонкой структуры ДНК-белковых комплексов.

2. В ядерных экстрактах из макрофагов мыши идентифицированы индивидуальные гетеродимеры белков семейства NF-icB/rel, связывающиеся с кВ сайтами из локуса ФНО. Показана уникальность макрофагального спектра NF-кВ комплексов в сравнении с лимфоидными клеточными линиями.

3. Вблизи З'-нетранслируемой области гена ФНО обнаружен и функционально охарактеризован ранее не описанный кВ энхансер, обладающий повышенным сродством к активирующим димерам р65-р65 и р65-cRel и реагирующий на активирующее действие ЛПС.

4. Уточнено положение последовательностей, отвечающих на активацию ЛПС в макрофагах, в предпромоторной области гена ФНО мыши. Показана корреляция между наблюдаемым сродством кВ сайтов гена ФНО к различным NF-кВ комплексам, расположением этих сайтов в функционально значимых участках промотора ФНО, и активностью конструкций с геном-репортером.

5. Проведен анализ гомо- и гетеродимеров NF-KB/rel методами измерения электрофоретической подвижности в комплексе с длинными ДНК пробами. Показано, что из участвовавших в анализе белков р50, р52 и рб5, только р52 вносит направленный изгиб в ДНК.

6. Показано, что кВ сайт в составе миникольцевой ДНК с заранее заданным направлением изгиба способен эффективно отбирать из смеси отдельные NF-кВ комплексы на основе их геометрических характеристик.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Shakhov AN., Kuprash D.V., Azizov M.M. Jongeneel C.V., Nedospasov SA Structural analysis of the rabbit TNF locus, containing the genes encoding TNF-b (lymphotoxin) and TNF-a (tumor necrosis factor). Gene. 1990. 95, 215-221.

2. Shakhov AN., Turetskaya R.L., Kuprash D.V., Nedospasov SA, Collart M., Drouet C., Jongeneel C.V. Sequences involved in the regulation of TNF gene expression. In: Molecular and Cellular Biology of Cytokines (J.J. Oppenheim, CA Dinarcllo, M. Kluger, ed.), pp. 25-30, Wiley-Liss, 1990.

3. Kuprash, D.V. and Nedospasov,SA Protein-induced DNA bending by various forms of NF-кВ: implication for the regulation of gene expression. Abstract of the 28th Annual meeting of Society for Leukocyte Biology. J. Leuk. Biol. Suppl. 2:1-15 (1991), p. 108. 1991.

4. Nedospasov, S A and Kuprash, D.V. Multiple complexes formed by a family of NF-KB/Rel -related factors: strong protein-induced DNA bending and implication for the role in transcriptional control. Abstract of the Keystone Symposium "Transcriptional Regulation in Development, Differentiation and Disease". J. Cell. Biochem. Suppl. 16A. p. 76. 1992.

5. Купраш Д.В., Недоспасов С.А. Взаимодействие транскрипционных факторов семейства NF-icB/Rel с ДНК приводит к ее значительному изгибу в участке связывания. Доклады АН СССР. 1992. т. 322, с. 421-426.

6. Nedospasov, S.A., Shakhov, A.N., Kuprash, D.V., Udalova, I.A., Azizov, M.M., Seregina T.M., Mekshenkov M.I. and Turetskaya R.L. Genes, encoding tumor necrosis factors: genome organization, polymorphism and expression, in: Modern Trends in Human Leukemia IX (R.Neth, ed.) Springer-Verlag, Berlin, pp. 175-183. 1992.

7. Nedospasov, S.A., Udalova, LA., Turetskaya, R.L., Rice N.R., and Kuprash,

D.V. Multiplicity of nuclear NF-KB/Rel complexes: tissue-speciOcity, effects of the sequence context of the extended кВ site and relation to protein-induced DNA bending. Abstract of the Keystone Symposium "Transcription: Factors, Regulation and Differentiation". J. Cell. Biochem. Suppl. 17A. p. 147. 1993.

8. Kuprash, D.V., Turetskaya, R.L., Boldin, M.P., Udalova, LA.; Kistanova,

E.M., Smirnova, J.B., and Nedospasov, S.A. Structure and regulation of tumor necrosis factor genes at genomic loci. In: Tumor Necrosis Factor and Related Cytokines. (W. Fiers, W. Buurman, ed.) Karger, Basel, 1993, pp. 19-26.

9. Kuprash, D.V., Udalova, LA., Turetskaya, R.L., Rice N.R., Reeves, R. and Nedospasov, S.A. DNA-protein interactions at kappa-B enhancers involving NF-кВ/Rel family and HMG-I(Y). Abstract of the LVIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology "DNA and Chromosomes", Cold Spring Harbor Laboratory. 1993, p.99.