Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК

Тутукина, Мария Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК"

00347ЭБ83

На правах рукописи

ТУТУКИНА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСАХ Е. соИ, СОДЕРЖАЩИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОМОТОРЫ ДЛЯ СИНТЕЗА АНТИСМЫСЛОВЫХ РНК

03.00.03 - Молекулярная биология

1 5 ОПТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2009

003479583

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики и клеточного стресса Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Озолииь Ольга Николаевна кандидат биологических наук Масулис Ирипа Станиславовна

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович кандидат биологических наук, Быстрова Марина Федоровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт белка РАН

Защита диссертации состоится «29» октября 2009 года в «14» часов 00 мин. н заседании диссертационного совета Д.002.038.01 в ИБК РАН по адресу: 142290 г Пущино Московской области, Институтская ул. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г Пущино.

Автореферат разослан «29» сентября 2009 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета, /^Ибт^У''' Т.И.Смолихина

кандидат биологических наук $

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на то, что механизмы регуляции экспрессии генов прокариот изучаются уже несколько десятилетий, все еще остается очень много непонятного в том, каким образом реализуется адаптация клеток к изменяющимся условиям внешней среды. В последнее время появилось много новых данных, которые меняют наше представление о способах опосредованного геномом переключения клеточного метаболизма и вносят значительные поправки в общую схему адаптивных реакций. Первым и, во многом, определяющим этапом реализации генетической информации, является транскрипция. Традиционно считается, что эффективность синтеза РНК контролируется белками — активаторами и репрессорами — общее число которых в бактериальной клетке может быть около 300 [Blattner 1997, Озолинь 2005]. Кроме того, существует еще один класс регуляторов - малые нетранслируемые РНК. Для E.coli в настоящее время изучено 87 регуляторных РНК, большая часть которых кодируется независимыми генами. Данные системного анализа позволяют предположить, что их в клетке гораздо больше, чем белковых регуляторов транскрипции [Argaman 2001, Saetrom 2005, Tjaden 2006]. Только 10 известных нетранслируемых РНК транскрибируются из кодирующих последовательностей в антисмысловом направлении. Образуя комплементарные дуплексы с мРНК вблизи инициирующего кодона, они влияют на их ассоциацию с рибосомами и, следовательно, модулируют синтез белкового продукта. При связывании с другими участками матричной РНК, антисмысловые РНК могут изменять их стабильность, поддерживая относительное содержание мРНК на оптимальном для клетки уровне [Storz 2005]. Очевидно, что для создания целостной картины клеточного метаболизма желательно иметь информацию обо всех генах, экспрессия которых может регулироваться по антисмысловому механизму. Однако перекрывание со смысловыми последовательностями затрудняет целенаправленный поиск мест кодирования антисмысловых РНК методами сравнительной геномики. В данном случае, перспективным может быть поиск по сигналам транскрипции, позволивший обнаружить большую часть известных нетранслируемых РНК в межгенных участках [Argaman 2001, Chen 2002].

Для поиска потенциальных промоторов для аРНК мы использовали разработанную в нашей лаборатории компьютерную программу PlatProm,

которая, кроме консервативных элементов, распознаваемых вегетативной а -субъединицей РНК-полимеразы, учитывает ряд других структурных особенностей промоторной ДНК, рассматривая ее как единую платформу для взаимодействия и с РНК-полимеразой, и с регуляторными белками [Brok-Volchanski 2005]. В результате сканирования обеих нитей геномной ДНК E.coli с помощь этого алгоритма оказалось, что 1706 генов имеют дополнительные сигналы внутри кодирующих последовательностей, а 997 содержат предсказанные промоторы с антисмысловой ориентацией. Ввиду возможного участия синтезируемых с них РНК в регуляции экспрессии генов, такие промоторы стали предметом первоочередного исследования.

Цель и задачи исследования

Основной целью данной работы было исследование транскрипционной активности в генетических локусах E.coli, содержащих предсказанные PlatProm промоторы для синтеза антисмысловых РНК.

Конкретными задачами были:

1. Оценка способности PlatProm предсказывать эффективность формирования РНК-полимераза-промоторных комплексов в стандартных условиях in vitro.

2. Информационный анализ, направленный на выбор репрезентативных промоторов для экспериментального тестирования.

3. Оценка способности отобранных промоторов к продуктивному взаимодействию с РНК-полимеразой in vitro.

4. Тестирование транскрипционной активности промоторов in vivo.

Научная новизна

Впервые установлено, что в гене hns может начинаться синтез антисмысловой РНК, внутриклеточное содержание который зависит от скорости роста, увеличиваясь при переходе к стационарной фазе. Впервые картировано 3 новых промотора перед генами, способных инициировать синтез bglG-, brnQ- и uxuR-мРНК. Обнаружена новая малая РНК (UxuT), транскрипция которой начинается в З'-нетранслируемом участке uxuR.

Научно-практическая ценность

В работе исследована транскрипционная активность 9 генетических локусов, содержащих в общей сложности 26 потенциальных промоторов. Впервые в одинаковых условиях была оценена эффективность комплексообразования с о70-РНК-полимеразой E.coli для 35 фрагментов ДНК, содержащих предсказанные PlatProm промоторы с различной локализацией. Величина коэффициента корреляции между максимальным показателем промотор-подобия и эффективностью взаимодействия с РНКП (0.63) говорит о высоком предсказательном потенциале алгоритма, и позволяет использовать его в качестве базовой программы для картирования потенциально транскрибируемых сайтов.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на международных конференциях "Genomes 2008: Functional genomics of microorganisms" (Paris, France, 2008, приз EMBO за лучший постерный доклад), "4th EMBO Conference: From Functional Genomics to Systems Biology" (EMBL Heidelberg, Germany, 2008), 34-м съезде FEBS (Prague, Czech Republic, 2009), 3-м конгрессе FEMS (Gothenburg, Sweden, 2009), "15 Conversation on Biomolecular Structure and Dynamics" (Albany, USA, 2007), "3rd International Moscow Conference on Computational Molecular Biology" (Москва, 2007), "5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure" (Новосибирск, 2006), школе-конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»

(Москва 2006, 2007, 2008) и на 10-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано -/^печатных работ, в том числе, & статей в реферируемых журналах и сборниках.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ^С^источников. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 55 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Компьютерные программы и алгоритмы. Для поиска потенциальных промоторов использовали алгоритм PlatProm [Brok-Volchanski 2005]. Особенности формирования вторичной структуры предполагаемых регуляторных РНК и наличие потенциальных терминаторов анализировали с помощью программы RNA-structure 4.3 [Mathews 2004]. Для поиска альтернативных рамок считывания вблизи предсказанных промоторов использовали сетевую программу ORF Finder [www.ncbi.nIm.nih.gov1. выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ClustalW2 [Larkin 2007].

Бактериальные штаммы и условия культивирования. Для выделения нуклеиновых кислот был использован стандартный штамм Escherichia coli К 12 (GenBank accession number: U00096.2). Клетки выращивали до ODe^O^ (экспоненциальная фаза) или 0.9 (стационарная фаза) при 37°С и постоянном перемешивании на среде LB или среде, обогащенной питательными веществами: 0.5% глюкоза, 0.2% казаминовые кислоты и 0.005% тиамин. Индукцию экспрессии hns Холодовым шоком проводили следующим образом: клетки растили при 37°С до OD600 = 0.6, быстро охлаждали до 15°С и выдерживали 1-3 часа при постоянном перемешивании [Вае 2000, La Теапа 1991]. Флуоресценцию рекомбинантного GFP измеряли с помощью микроскопа Leica (объектив Carl Zeiss 2.5х) в колониях клеток Escherichia coli Top 10 (Invitrogen, США), выращенных на стандартной среде LB Plates с добавлением канамицина (20 мкг/мл).

Оценка способности фрагментов ДНК к образованию комплексов с q70-PHK-полимеразой E.coli. Эффективность взаимодействия промотор-содержащих фрагментов ДНК с РНК-полимеразой оценивали с помощью метода задержки в геле (gel-mobility shift assay). Пробы, содержащие 1х транскрипционный буфер (5 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ MgCl2, 0.01 мМ EDTA, 25 мкг/мл В SA, 5 мМ NaCl ) и ~1 пмоль ДНК, предварительно уравновешивали при 37°С в течение 20 минут, после чего в опытные образцы добавляли 1-, 2- или 4- пмоль о70-РНК-полимеразы (Sigma, США) и инкубировали при той же температуре еще 20 минут для формирования комплексов. Для разрушения неспецифических контактов в пробы

добавляли гепарин (20 мкг/мл) и наносили образцы на прогретый до 37 °С 4% ПААГ. Процент связавшейся с ферментов ДНК определяли с помощью программы Intensity (автор - И.В. Архипов).

Локализация сайтов полнмераза-промоторного взаимодействия. Для

локализации мест связывания РНК-полимеразы с промоторной ДНК использовали методы футпринтинга ДНКазой I и перманганатом калия. Проба содержала 0.2-0.4 пмоль [у-32Р] промотор-содержащего фрагмента ДНК, 1х-транскрипционный буфер, 0.4-1.6 пмоль РНК-полимеразы (Sigma, США). После инкубации (37°С, 30 мин) в случае ДНКазного футпринтинга, к пробам добавляли панкреатическую ДНКазу I до концентрации 1 мкг/мл, выдерживали 25 секунд и останавливали реакцию равным объемом 8 М ацетата аммония. Продукты гидролиза осаждали 2.5V этанола, промывали 70% этанолом, высушивали, растворяли в 5 мкл формамидного буфера и анализировали в 8% денатурирующем полиакриламидном геле.

Футпринтинг перманганатом калия проводили по протоколу, предложенному [Zaychikov et а) 1997]. Гели калибровали с помощью продуктов гуанин-специфичного секвенирования соответствующих фрагментов ДНК по Максаму-Джилберту [Maniatis 1982, Maxam 1985] и стандартных наборов фрагментов ДНК (Fermentas), меченных [у-32Р] АТР.

Реакция удлинения праймера in vivo. Тотальную клеточную РЖ выделяли как описано в [Favre-Bonte 1999] Смесь РНК (20 мкг) с 32Р-меченным праймером (4 пмоль) выдерживали в течение 10 минут при 70°С, добавляли 8 мкл смеси, содержащей 5х реакционного буфера (Fermentas, 250 мМ Tris-HCl, pH 8.3, 250 мМ KCl, 20 мМ MgCl2 и 50 мМ DTT), dNTP до конечной концентрации 0.2мМ, и охлаждали на льду для предотвращения ренатурации образцов. После этого собирали конденсат со стенок коротким центрифугированием (1-2 секунды), добавляли 20 U M-MuLV обратной транскриптазы (Fermentas, Литва) и синтезировали кДНК при 42°С в течение 40 минут. Для инактивации фермента смесь прогревали 5 минут при 85°С. После этого пробы обрабатывали РНКазой А (10 U, 37°С, 30 минут), осаждали, растворяли в 5 мкл формамидного буфера и наносили на 8% ПААГ с 8М мочевиной.

Определение стартовых точек транскрипции проводили в соответствии с рекомендациями [Matz 2003].

Количественная ПЦР в реальном времени, к ДНК получали в соответствии с протоколом фирмы-производителя (Fermentas, Литва). Реакцию проводили на амплификаторе ДТ-322 (ДНК-Технология, Россия) с использованием интеркалирующего флуоресцентного красителя SYBR Green I (Sigma, США). Реакционная смесь (20мкл) содержала 2-4 мкл кДНК, по 4 пмоль каждого праймера, 0.1 мМ каждого dNTP, стандартный буфер (Евроген, Россия), 1 мкл SYBR Green I (разведение 1:3000) и 1 U Taq-полимеразы (Евроген, Россия). Программа амплификации для всех пар праймеров была следующей: предварительная денатурация при 94°С, 2 мин; далее 30 циклов: 94°С - 20 сек, 58°С - 20 сек, 72°С - 30 сек. Флуоресцентный сигнал регистрировали в конце каждого цикла в течение 15 секунд. В качестве позитивного контроля использовали пробы, содержащие геномную ДНК Е. coli (наблюдали только ожидаемый продукт), а в качестве негативного - пробы с РНК, проведенные

через реакцию обратной транскрипции без добавления фермента (синтез ампликонов отсутствовал). Качество ПЦР-продуктов оценивали электрофоретически в 5%-ом ПААГ (210В, ЮОмА). Количественный анализ уровня экспрессии проводили при помощи программы q_PCR (ДНК-Технология). Относительное количество синтезированных ампликонов рассчитывали по формуле 2Ш.

Northern-гибридизация. Суммарную клеточную РНК (30 мкг на дорожку) разделяли в 4% ПААГ с 8 М мочевиной. РНК переносили на нейлоновую мембрану Hybond N+ (Amersham, UK) в 20xSSC в соответствии со стандартным протоколом (Amersham). Для пришивки мембрану облучали ультрафиолетом (254нм) в течение 3 минут. Предгибридизацию и гибридизацию осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве зонда использовали 32Р-меченный и очищенный от свободной метки праймер. Для визуализации использовали сканер Bio-Rad Personal Molecular Imager FX (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Сравнительный анализ данных, полученных in silico, in vitro и in vivo.

Поскольку некоторые из промоторов, предсказанных алгоритмом PlatProm, могли оказаться «ложными позитивами», на первом этапе было необходимо оценить предсказательный потенциал этой компьютерной программы, в частности, его способности моделировать взаимодействие РНКП с предполагаемыми промоторами. Для этой цели очень полезными оказались результаты, полученные методом задержки в геле, которые отражают способность промоторов взаимодействовать с РНК-полимеразой in vitro, и информация о распределении сайтов связывания РНКП в геноме in vivo, полученная с помощью метода ChlP-on-chip [Herring 2005].

Способность связывать фермент in vitro была проверена для 35 фрагментов ДНК, содержащих предсказанные внутригенные промоторы. Для фрагментов ДНК, содержащих потенциальные антисмысловые промоторы, эффективность связывания с РНКП практически не отличалась от известных и сонаправленных промоторов как с точки зрения образования комплекса самого по себе, так и в процентном отношении связанной и несвязанной ДНК (Рис.1А). Процент ДНК, связанной с ферментом in vitro, хорошо коррелирует с максимальным показателем подобия идеальному промотору (скором, К) в данном фрагменте (Рис.1 В). Это свидетельствует о том, что промоторная модель, заложенная в алгоритм PlatProm, предсказывает эффективность образования бинарного комплекса с достаточно высокой степенью точности. Неожиданно мы обнаружили, что величина коэффициента корреляции для фрагментов ДНК, содержащих потенциальные промоторы для антисмысловой транскрипции, выше, чем для общего набора протестированных матриц (Рис. 1С). Поэтому была проанализирована корреляция между величиной скоров и эффективностью связывания РНКП in vivo, определенной методом ChIP-on-chip.

(M:M) lacZ antisense РНКП:ДНК - »I «■ Uli ДНК

rrnB-Pl

- 4:1 Я:!

Ims-P

- 2:1 J: I 8:1

г w j шШШШВШШ. + + + +

&W ■мн 2 * 3 Г.

FBI K=» «

p<0.00005 в=35

n=21 p<0.000003

[C]

[Al

(M:M) dps antisense РНКП:ДНК - 2:1 4:1 M ДНК

itxuR eodirected +antisense rcsA antisense

- 2:14=18:1 . 2:14:1 №1

12 14

Скоры (К)

+ г + + шшшя + + + + (JJI + + + + ФУ -

ItilMll ж1

ищи ШШ

R=O.S.i p<10"' n-663

[D]

и 14 Скоры (К)

Рис.1 [А]: Пример экспериментов по задержке в геле комплексов РНКП с фрагментами ДНК, содержащими известные промоторы (ггпВ и Ans); предсказанные промоторы для синтеза антисмысловых (в генах lacZ - пример отрицательного результата, dps и г es А) и сонаправлениых РНК-продуктов (в гене uxuR). [В] и [С]: Результаты сравнительного анализа данных, полученных in vitro и in silico. Представлена корреляция (R) эффективности связывания РНКП промотор-содержащего фрагмента ДНК (в виде процента связавшейся ДНК) и величины максимального для этого фрагмента коэффициента промотор-подобия (К). На панели [BJ показана корреляция для всего набора исследуемых участков, включая реальные промоторы перед генами и «сонаправленные» промоторы (для 8 из них данные получены К.С. Шавкуновым), а на панели [CJ: - для выборки фрагментов, содержащих антисмысловые промоторы. [D]: Корреляция между скорами предсказанных антисмысловых промоторов и максимальным значением 1о&(Су5/СуЗ), зарегистрированным на расстоянии +/-2S0 п.н. от наиболее вероятной точки инициации транскрипции.

Для компиляции известных промоторов не было обнаружено практически никакой корреляции, равно как и для выборки потенциальных сонаправлениых промоторов. Это вполне ожидаемо, так как алгоритм, адекватно моделирующий способность РНК-полимеразы взаимодействовать с промотором самим по себе, пока не может учесть характер регуляторного воздействия, оказываемого различными факторами транскрипции в клетке, а также локальные особенности структуры нуклеоида. При этом для потенциальных антисмысловых промоторов была получена статистически достоверная корреляция (Рис.Ш), что, возможно, свидетельствует об их меньшей зависимости от факторов, пока еще не учитываемых алгоритмом.

На самом деле, из всех промоторов для антисмысловой транскрипции, проверенных нами in vitro, только один - предсказанный в гене lacZ - оказался совершенно неспособным взаимодействовать с РНК-полимеразой. Об этом свидетельствуют не только результаты задержки в геле (Рис.1 А), но и данные перманганатного футпринтинга, не выявившие образования открытых

комплексов на анализируемом фрагменте ДНК. Внутри гена dps тоже предсказан только один потенциальный антисмысловой промотор (Рис.2А). В отличие от промотора в гене lacZ, участок, прилегающий к предсказанной стартовой точке, способен не только связываться с РНКП, но и формировать продуктивный транскрипционный комплекс (Рис.2В).

футпринтинг КМп04 РНКП:ДНК (М:М) - 4:1 8:1 ДНК G + + +

[А]

single-round

ips-f

1 i dps

f dpsjis'vv dps m ш

Hi 1

[ T

tip ¡_s_new dpsjs'

Ря

Расстояние относительно качала геиа dps, и.н.

Рис.2. [А]: Распределение промотор-подобных сигналов вблизи гена dps. Значения показателей подобия (К) отложены по оси ординат и обозначены столбиками. Значения скорое выше оси абсцисс соответствуют нити ДНК, на которой расположен основной ген, ниже - значения для антисмысловой нити. Прямоугольниками обозначены кодирующие области генов и праймеры, использованные в данном исследовании. [В]: Результаты футпринтинга перманганатом калия для фрагмента ДНК, амплифипированного с праймерами dps и dps_s, и однократной инициации транскрипции. Наличие фермента и молярное соотношение фермент:ДНК указаны над гелем. Дорожка 1: матрица была синтезирована с праймерами dps-dps_s; 2: с праймерами dps_new-dps_s, 3-dps-dps_s_new).

В результате перманганатного футпринтинга, было выявлено локальное плавление ДНК в области предполагаемого старта, а в реакции однократной инициации транскрипции синтезировался только один продукт, который удлинялся при продлении матрицы в направлении антисмысловой транскрипции и исчезал при использовании укороченного в upstream области фрагмента. Это значит, что в кодирующей области гена dps инициируется синтез антисмысловой РНК, по крайней мере, in vitro.

По такой схеме мы проверили транскрипционную активность 9 участков, содержащих один или несколько потенциальных стартов для антисмысловой транскрипции (Табл.1). 8 из них формируют комплексы с РНК-полимеразой.

Так как множественные промотор-подобные сигналы часто образуют симметричные кластеры на обеих нитях геномной ДНК, то кроме антисмысловых промоторов, в исследуемых участках были и потенциальные промоторы для синтеза РНК в обратном направлении. Несмотря на высокий коэффициент корреляции между эффективностью взаимодействия с РНК-полимеразой и показателем промотор-подобия для матриц, содержащих

-9-

антисмысловые промоторы, они формировали открытые комплексы только в четырех случаях из 14, в то время как все 11 «сонаправленных» промоторов оказались способными к продуктивному синтезу. Это хорошо согласуется с тем, что только 55% потенциальных антисмысловых промоторов ассоциировано с сайтами связывания РНКП с геномной ДНК in vivo, в то время как для других категорий промоторов этот процент был заметно выше (95% для известных промоторов, 77% для всех промоторов, имеющих К>7.44, и 75% для потенциальных «сонаправленных» промоторов). Можно предположить, что in vivo формирование транскрипционного комплекса на антисмысловом промоторе затруднено из-за наличия элонгирующего комплекса, ведущего встречный синтез РНК.

Таблица 1. Результаты тестирования способности исследуемых промоторов к _взаимодействию с РНКП in vitro._

Ген Функция Число промоторных кластеров Связывание с РНКП, % Число открытых комплексов Продуктивный синтез in vitro

а* со* а* со* а* со*

dps белок нуклеоида, бактериоферритин 1 25.7 1 1

hns белок нуклеоида 1 28.1 1 1

hns_galU межгенная область 1 30,2 - -

lacZ В-галактозидаза 1 0 - -

phoR регулятор рко-оперона, транспорт магния 2 4 85.7 1 4 1 4

phoU негативный ре1улятор />Ло-регулона 2 3 87.1 3 3(4?)

rcsA позитивный фактор транскрипции 2 1 35.71 ? ? ?

rho фактор терминации транскрипции 3 2 62.7 ? 1 1(2?)

uxuR регулятор ихи-регулона 1 1 82.4 а/со 1 1 1

"а" и "со"- потенциальные антисмысловые и «сонаправленные» промоторы, соответственно.

Несколько интересных фактов было обнаружено при исследовании межгенной области рИо1/^Ю (Рис.3). Ген bglG кодирует антитерминатор,

-10-

активирующий транскрипцию ¿gZ-оперона в стрессовых условиях. В норме его транскрипция на минимальном уровне обеспечивается промотором bglG-Po (Рис.3). Ему соответствует денатурированный участок и 2 синтезирующихся in vitro транскрипта, причем присутствие верхнего продукта может объясняться или особенностями инициации синтеза с Ро, или наличием дополнительного промотора, расположенного на 20 п.н. выше (Р2). В клетке синтез большей части транскриптов останавливается на терминаторе, расположенном перед кодирующей последовательностью bglG. В стрессовых условиях терминации не происходит благодаря антитерминатору - белковому продукту этого гена.

[А]

Футпринтнш КМпОл 2:1 4:1

G А+С + +

[В]

Single-round

РНКН.ДНК

ДНК 1 2 G

-200 О 200

Расстояние относительно промотора Ь^Ю-РО, п.н.

(* Показаны только К>7.5)

Рис. 3. [А]: Результат футпринтинга перманганатом калия (фрагмент ДНК рЬо11-рЬои_8*) и [В]: однократной инициации транскрипции для межгенной области рЛоШ^Я?. Дорожка 1 -матрица была амплифицирована с праймерами рЬо11-рЬои_8; 2 - phoU_new-phoU_s; [С]: Распределение промотор-подобных сигналов в локусе рАоИ/Ь^/б, полученное при сканировании генома алгоритмом Р1а1Ргот с достоверностью р<0.00004.

Базовый уровень его синтеза обеспечивается расположенным после терминаторной шпильки промотором, точная локализация которого до настоящего времени не была установлена. Футпринтинг перманганатом калия выявил несколько участков локального плавления ДНК (Рис. ЗА). Неспаренные тимины, относящиеся к промотору Ъ§Ю-Р1, находятся в позициях -10/-16 от АТв-кодона и на расстоянии 10-15 п.н. после конца терминаторной шпильки. С

-11 -

него начинается синтез 2-х продуктов размером -114 и 120 нт. Это позволяет предположить, что именно Р1 обеспечивает базовую транскрипцию ¿^/-оперона.

Структурно-функциональный анализ промотор-подобных сайтов, расположенных в гене hns.

Ген hns кодирует мажорный белок нуклеоида, который является модулятором транскрипции многих генетических локусов. Он транскрибируется с промотора Р/,,к, стартовая точка которого точно предсказывается PlatProm (Рис.4А).

12 1« -

i. 4

S и

у t i« и -

IAJ

hns

Pi*

Рз

-400

-200 0 200 400

Расстояние относительно начала гена hns, п.н.

и t"

1В|

смысловая транскрипция

ЩНГ Hfpm'l

аитиошсловай транскрипция ®

-400

-200 0 200 400

Расстояние относительно начала гена hns, п.н.

Рис. 4. (А]: Распределение промотор-подобных сигналов в локусе Ью/цаШ. Все обозначения аналогичны Рис. ЗС. Праймеры показаны белыми прямоугольниками. [В]: Результаты экспрессионного анализа, полученные в работе [Иеррав 2006]. В качестве показателя уровня экспрессии в каждом участке генома использован 10152 отношения интенсивности свечения кДНК, гибридизующейся с соответствующим зондом микроматрицы (Су5), и фрагментированной ДНК (СуЗ). Перекрывающиеся 50 нт зонды на каждой нити были сдвинуты относительно друг друга на 25 нт. Показана эффективность транскрипции в смысловом (черные столбики) и антисмысловом (серые столбики) направлениях.

С четырех дополнительных сигналов - двух внутригенных и двух межгенных - может начинаться синтез антисмысловых транскриптов. По данным экспрессионного анализа видно, что в этом генетическом локусе транскрипция идет в обоих направлениях (Рис.4В). И хотя преобладающим является синтез /гда-мРНК, по всей видимости, также образуются и антисмысловые транскрипты.

Они могут начинаться как с внутренних промоторов P/Pi*, так и с межгенных кластеров Р2 и/или Pj. В результате оценки способности предсказанных промоторов формировать комплексы с РНКП оказалось, что и внутригенный, и межгенный промотор-содержащие участки взаимодействуют с РНКП с образованием устойчивых к гепарину комплексов. Чтобы проверить их активность in situ, фрагменты были клонированы в плазмиду pET28b-EGFP, содержащую лишенный собственного промотора ген зеленого флуоресцирующего белка. Судя по интенсивности флуоресценции, уровень экспрессии повышался в том случае, если он находился под контролем внутригенных промоторов Pi/Pi* (относительная интенсивность флуоресценции (FI) 8.26±1.06) или всех трех промоторов (FI=9.26±1.39). При вставке в вектор только межгенной области заметной индукции синтеза GFP не происходило, и интенсивность флуоресценции (FI=6.47±0.78) оставалась практически на контрольном уровне (FI=5.31±1.04). Поэтому дальнейшие исследования были направлены на детальное изучение полимераза-промоторного взаимодействия в участке, содержащем только внутригенные промоторы.

Футпринтимг Футприитинг

ДНКат/ КМп04 КМп04

- - * ATP+CTP

Рис. 5. Результаты проверки функциональной активности промоторов I'/Pr in vitro. Радиоактивную метку (32Р) вводили в 5'-конец праймеров 1 (слева) или 2 (справа). Их расположение относительно Pi и /V приведено на схемах. На выносках слева и справа приведена последовательность нуклеотидов соответствующих нитей. Отмечены модифицированные КМи04 тимины. Волнистыми линиями показаны места в которых должны были бы находиться продукты гидролиза, если бы транскрипционные комплексы формировались на Р1. Предсказанная для Pi• стартовая точка транскрипции и направление синтеза РНК показаны стрелкой.

Результаты анализа транскрипционных комплексов, образующихся в этой области in vitro, оказались довольно неожиданными (Рис.5): несмотря на относительно низкий показатель промотор-подобия для Рц, футпринтинг

-13-

перманганатом калия выявил локальное плавление ДНК вблизи его -10 области. Предполагаемые инициирующие субстраты АТР+СТР стабилизировали открытое состояние именно этого комплекса, а в экспериментах по однократной инициации транскрипции был зарегистрирован только один продукт.

Его длина соответствует положению локально расплетенного участка, что подтверждает способность Рк продуктивному синтезу in vitro.

На следующем этапе с помощью обратной транскрипции с радиоактивно меченным праймером 1 и суммарной клеточной РНК E.coli Kl2 была получена кДНК, размер которой соответствует ожидаемому при инициации синтеза на /V (132 нт) (Рис.бА). Таким образом, P¡* обладает всеми свойствами активного промотора, тогда как активность находящегося на расстоянии 28 п.н. от него P¡, зарегистрировать не удалось.

mi 'S u "i 1'ис- Продукты обратной транскрипции, 1 J | 2 -§ полученные для Pj« и Рhns с (и н ) Л1 & S Й" 2 о использованием 32Р-меченных праймеров 1 и » « » о или у РНК была выделена из клеток, выращенных на обычной или обогащенной (reach) среде LB и остановленных во время экспоненциальной (ехр) или стационарной (stat) фаз роста. Дорожки 6 и 12 соответствуют РНК, полученной из клеток, подвергнутых холодовому шоку. Стрелками отмечены ожидаемые кДНК-продукты для аРНК (~130 нт) и A/ií-mPHK (68 нт). [С]: Northern-

[А]

(H.H.) М

л a S

V § о

Í S í

955 585 341

258

141

105

- •

: .... .

I ijjj

М:: Як

: : i&sn

4МЩ)

1 - 1. . Н1 .V

■

ПМ|

¡(■■I

гибридизация кР-меченного праймера 1 РНК E.coli Kl2.

(п.н.) м

50вВЦ 400 Л 30(1 200

[С]

7 8 9 10 11 12

Далее мы исследовали изменения в эффективности транскрипции с этого промотора в зависимости от условий роста. Оказалось, что количество антисмыслового транскрипта в бактериальных клетках зависит от условий роста, причем характер этой зависимости для аРНК и /шх-мРНК был противоположным, по крайней мере, при переходе клеток к стационарной фазе роста и в условиях холодового шока (Рис.6). Вполне вероятно, что это объясняется влиянием одной из РНК на стабильность другой, но нельзя исключить и возможность их независимой регуляции другими транскрипционными факторами. Эти результаты были проверены с помощью количественной ПЦР, и по данным 4 экспериментов, выполненных на разных препаратах РНК, оказалось, что отношение аРНК к мРНК основного гена при

переходе к стационарному росту в среднем увеличивается в 3,44 раза. Northern-гибридизация подтвердила наличие в бактериальных клетках РНК размером -130-140 нт (Рис.бС), что согласуется с присутствием на расстоянии 113-149 п.н. от ее стартовой точки классического р-независимого терминатора.

Таким образом, внутри кодирующей последовательности гена hns присутствует промотор, способный инициировать транскрипцию в антисмысловом направлении. При этом потенциальные промоторы, находящиеся в межгенной области hns/galU оказались неспособными к продуктивному взаимодействию с РНКП. Для того чтобы понять, является ли эта тенденция общей особенностью «плотно населенных» промотор-подобными сигналами межгенных участков, мы детально исследовали еще одну подобную область.

Структурно-функциональный анализ промотор-подобных сайтов, расположенных в локусе phoR/brnQ.

В конце гена phoR и в прилегающем к нему межгенном пространстве PlatProm обнаружил множество промотор-подобных сигналов (Рис.7А). Результаты сканирования очень хорошо согласуются с профилем гибридизации in vivo (Рис.7В).

14 -|

12 -

1(1

X 6

[А]

ркаВ

phoR

— П^ШЧГ^Ы ,ЗЛЯ Pi!*»!, Р.1 и Р.-

w» Íf;¡íH^írptí .¡Лй (í P&iat !

— ПраЯмеры дли клсшйрозаккй Pbt«$r

Partus! 1 12

Pactos!!

-11KKI -S00 -600 -400 -200 0 20(1 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1SOO 2000 220(1

Расстояние относительно начала гена^/юЯ, п.н.

1000 1?00 2000 Расстояние относительно начала rewip/ioR, п.н. Рис. 7. [А]: Распределение промотор-подобных сигналов в локусе phoR/brnQ [В]: Эффективность связывания геномной ДНК с РНКП in vivo [Reppas 2006]. Полимераза-промоторные комплексы после фрагментации нуклеоида были собраны с использованием антител к я-субъединице РНКП, а экстрагированные из них фрагменты ДНК амплифнцированы с введением метки Су5. Контролем служили ампликоны, полученные без специфической иммунопреципитации (СуЗ).

Эффективное взаимодействие РНКП с фрагментом ДНК, включающим всю межгенную область, было подтверждено методом задержки в геле, а футпринтинг перманганатом калия выявил более 5 транскрипционных вилок (Рис.8). Анализ in vitro однозначно свидетельствует о высокой активности промотора Ра2 - его открытый комплекс с РНКП является самым сильным и формируется уже при соотношении фермент:ДНК=0.5:1, а соответствующий ему продукт был зарегистрирован в реакции однократной транскрипции. Два других антисмысловых промотора оказались неспособными к продуктивному синтезу.

Single-round Футпринтинг КМп04

РНКП:ДНК (М:М) - - 05а 1:12:14:14:18:1

ДНК м ++ + ++++ + G

iilll

1676

EW>

tmm&

p.i,

■ 396

1301

¡251 [240

1206 1172

1132

, * .

■ *')7

I 88 £'»81

Рис. 8. Результаты проверки функциональной активности потенциальных промоторов, находящихся в области phoR/brnQ, in vitro. Дорожка 1 - матрица была синтезирована с праймерами 2-3, дорожка 2-е праймерами 1-3.

Все остальные модифицированные тимины относятся к комплексам, формируемым сонаправленными с геном промоторами - Pclustl, Р2, РЗ и PbrnQ. Под PbrnQ мы понимаем недавно картированную стартовую точку транскрипции этого гена, которая попадает в кластер промотор-подобных сигналов, предсказываемых нашим алгоритмом с относительно низким скором. С этого промотора синтезируются продукты ожидаемой длины (~210нт), но с

-16-

гораздо меньшей эффективностью, чем с других потенциальных стартовых точек. С другой стороны, наличие более сильных продуктов, укороченных всего на 20 нт, может говорить либо о преждевременной терминации синтеза, начинающегося на PbrnQ, либо о наличии дополнительного промотора, смещенного в downstream область {PbrnQ*). Наиболее мощный синтез РНК in vitro идет с Р2, a Pclustl и РЗ обладают примерно одинаковой активностью.

Таким образом, в данном участке один антисмысловой и все «сонаправленные» с геном промоторы, имеющие высокий скор, оказались активными in vitro. Это хорошо согласуется с гибридизационным профилем данной области, поэтому можно было ожидать, что все они в той или иной степени окажутся активными и in vivo. Однако при клонировании в вектор pET28b-EGFP индукция синтеза репортерного белка наблюдалась только в том случае, если он находился под контролем сонаправленных с геном промоторов. Это может говорить либо о низкой активности исследуемых антисмысловых промоторов, либо о каких-то структурных особенностях данного фрагмента ДНК, не позволяющих промоторам нормально функционировать в плазмиде. Наиболее активным является Р2/РЗ - уровень флуоресценции при его вставке превышал контрольный более, чем в 6 раз (Рис.9).

Футпринтинг

KMnOi

- !:1 Ы ИШЫНК

■f + щ

Обратная транскрипция

(¡rri* «FTJ*

ДНК

ÍF]

[С] Pclustl [ЩРе1,ш1+Р2+РЗ [Е]=\Ü\+Phr„<¿

№8.47*0.9» ш. ill FJ=34.08~2.7l 1

330п.н. 24*250 245нт

Шяш

1120 Ъ(32

150 132

Рис. 9. Флуоресценция клеток, несущих плазмиду pET28b-EGFP с делетированным промотором перед геном gfp [А]; с картированным ранее промотором PbrnQ |Gama-Castro 2008] [В]; с Pclustl [С]; с Pclustl, Р2 и Рз [D]; с Pclustl, . Pi и PbrnQ ]Е]. [F]: Результаты иерманганатного футпринтинга и обратной транскрипции с радиоактивно меченными праймерами к кодирующей последовательности gfp.

Чтобы определить, какой же из этих промоторов Р2 или РЗ — обеспечивает высокий уровень синтеза GFP, мы провели обратную транскрипцию с тремя праймерами из кодирующей последовательности gfp, меченными [у-32Р] АТР на 5'-конце (Phc.9F).

Из результатов данного анализа четко следует, что единственным промотором, с которого идет синтез РНК in vivo является Р2. Таким образом, in vitro РНК-полимераза взаимодействует практически со всеми промотор-подобными участками, a in vivo из всего их многообразия выбирает только один. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей выявил только одно

существенное отличие Р2 от остальных, менее активных, промоторов — наличие у него в позиции -3/-6 дискриминатора строгого контроля GCGC, присутствие которого характерно для сильных промоторов, функционирующих во время быстрого роста. Аналогичная избирательность была обнаружена и для обогащенного промотор-подобными сигналами участка в локусе uxuR.

Структурно-функциональный анализ промотор-подобных сайтов, расположенных в локусе uxuR.

Ген uxuR кодирует репрессор UxuR-регулона, который включает в себя ряд генов, кодирующих белки метаболизма гексуронатов и может выполнять функцию субстрат-зависимого метаболического переключателя между путем ЭД и гликолизом. Несмотря на очевидную значимость UxuR для выживания бактерий в стрессовых условиях, профиль его транскрипции практически не изучен.

Основные сайты связывания РНКП in vivo локализованы в области предполагаемого промотора uxuR, где алгоритм предсказывает кластер промотор-подобных точек с максимальным скором 7.4, и в межгенной области uxuR/yjiC, где обнаруживается несколько кластеров дивергентно расположенных промоторов (Рис.1 ОА и 10В).

[А] Р2

uxuA uxuB ц uxuR í ! |

яхчЛВр 14

/ .10 9 % í> í |i 5 Plj UP-elemeut приймеры 9-11 РНКЖШК - 2:1 4:1 ДНК + + + +UP-«lemeut 10-12 - 2:1 4:1 + + +

■ 1Ш 1*» i»»J ..,mhj 110« ■SSN) <> «И StW I2i»

Расстояние относительно начала uxuR, п.н.

-seen ¿IMMÍ lwHt к i««t

Расстояние относительно начала uxuR, и.н.

Рис. 10. (А]: Результаты компьютерного поиска промоторов вблизи гена uxuR. [В]: Гибридизационный профиль фрагментов ДНК, взаимодействующих с РНКП in vivo [Herring 2005]. Полимераза-нромоторные комплексы после фрагментации нуклеоида были собраны с использованием антител к р-субъединице РНКП. [С]: Результат задержки комплексов РНКП с фрагментами ДНК, содержащими потенциальный промотор uxuR.

Поскольку промотор uxuR до сих пор картирован не был, первоначальной задачей этой части исследования была оценка транскрипционной активности кластера промотор-подобных сайтов, предсказанных PlatProm перед геном. Для этой цели было синтезировано несколько матриц, охватывающих всю межгенную область uxuB/nxuR и различающихся по протяженности в upstream области. Данные, полученные с помощью задержки полимераза-промоторных комплексов в геле, однозначно говорят о высокой эффективности связывания

этого участка с РНКП (Рис. ЮС), причем матрица, не содержащая UP-элемента, взаимодействовала с РНК-полимеразой значительно хуже, чем полноразмерный промотор, что указывает на важность этого элемента для нормального функционирования PuxuR. Это наблюдение было полностью подтверждено с помощью однократной транскрипции in vitro (Рис. 11 А). Очевидно, что удлинение матрицы в upstream-область (праймеры 9-12) усиливает эффективность транскрипции.

При использовании матрицы, укороченной в downstream области, синтезируемый продукт также укорачивается и имеет размер около 190 нт, что соответствует кДНК, образующейся в реакции обратной транскрипции (Рис. 11В). Ее количество значительно увеличивается при индукции глюкуронатом.

[A] Single-round Обратная [В] Футпринтинг [С]

in vitro транскрипция КМп04 ДНКаза I

Рис. 11. Анализ транскрипционной активности PuxuR in vitro и in vivo.

Результаты топологического анализа (Рис.11С) однозначно свидетельствуют о формировании вокруг предполагаемого старта транскрипции uxuR единственного локально-расплетенного участка, что соответствует синтезу только одного продукта и говорит о наличии единственного промотора перед геном uxuR. Область -47/+10 была защищена от ДНКазного гидролиза. Таким образом, предсказанный PlatProm потенциальный промотор гена uxuR обладает высокой транскрипционной активностью in vitro и является зависимым от присутствия UP-элемента. Уровень флуоресценции клеток, содержащих плазмиду pET28b-EGFP со вставленным промотором uxuR, превышал контрольный в 3.8 раз (Рис. 12А и 12В), а при добавлении в среду роста глюкуроната продукция GFP увеличивается еще в 2 раза, что согласуется с индукцией синтеза гисиЛ-мРНК, зарегистрированной в реакции обратной транскрипции in vivo (Рис. 12В-С). Методом 5~-RACE с последующим прямым секвенированием впервые была картирована стартовая точка транскрипции uxuR.

Она находится в позиции 4552500 и точно предсказывается PlatProm, хоть и с невысоким скором (7.4).

На основании всех полученных данных, мы можем с уверенностью говорить о том, что uxuR транскрибируется со своего собственного промотора, находящегося на расстоянии 99 нуклеотидов выше ATG-кодона.

По данным количественной ПЦР (Рис. 12D) временная динамика накопления ихиЛ-мРНК отличалась от ихиАВ и проявляла зависимость от присутствия глюкуроната. По мере исчерпания глюкуроната продукт гена uxuR, по-видимому, начинает ингибировать транскрипцию ихиАВ, в результате чего содержание мРНК этого оперона падает практически до нуля, а собственная экспрессия uxuR возвращается на исходный уровень. Это является доказательством независимой транскрипции uxuR и предполагают его участие в переключении метаболизма бактериальных клеток. Поэтому большой интерес представляют возможные механизмы регуляции экспрессии самого uxuR.

Рис.12. Флуоресценция клеток, несущих плазмиду pET28b-EGFP с делетированным промотором перед геном gfp [А]; с PuxuR при росте на LB [В]; LB+0.2% gin [С].

ID]

[1>]: Результаты сравнительного анализа экспрессии ихиАВ и или Я при росте клеток на стандартной или обогащенной глюкуронатом среде ЬВ с помощью количественной ПЦР. Результаты получены в пяти независимых экспериментах (препараты РНК были выделены из трех независимо

выращенных бактериальных культур).

BjX'MH Р'и га. Ч

Уровень транскрипции uxuR может модулироваться, как минимум, посредством четырех белков (FNR,CRP,Cpx-R, UxuR [Rodionov 2000, Tan 2001, De Wulf 2002]). Так как основной целью данной работы было изучение регуляторного потенциала нетранслируемых РНК, нас заинтересовали промоторы, предсказанные PlatProm вблизи З'-конца uxuR и в межгенной области uxuR/yjiC (РисЛОА). Фрагмент ДНК, содержащий антисмысловой промотор PI и «сонаправленный» Р2, эффективно связывался с РНКП с образованием, как минимум, двух равнозначных комплексов. Футпринтинги перманганатом калия и ДНКазой I выявили образование преимущественно одного открытого промоторного комплекса, который может быть в равной степени отнесен как к PI, так и к Р2, поскольку у них полностью перекрывается

область -10. Для того, чтобы определить направление синтеза РНК было использовано несколько матриц удлиненных/укороченных в направлении смысловой или антисмысловой транскрипции с гена uxuR (Рис. 13)

Результаты этого эксперимента однозначно свидетельствуют о высокой транскрипционной активности in vitro обоих промоторов, хотя эффективность синтеза с промотора Р2 была все-таки лучше, указывая на то, что в условиях прямой конкуренции in vitro РНКП преимущественно выбирает Р2. Оба промотора имеют идеальный консенсус -10, но при этом у Р2 элемент -35 содержит всего 2 замены против четырех у антисмыслового, и он имеет идеальное расстояние от -10 области до точки старта (в которой стоит идеальный для промотора динуклеотид СА). Вполне возможно, что выбор РНК-полимеразы и определяется совокупностью всех этих преимуществ.

Драймеры 2-4 Длина матрицы 278 ян

Рнс. 13. Анализ

транскрипционной активности промоторов Р1 и Р2 in vitro с помощью

Р1

однократной инициации транскрипции. Праймеры, использованные для

получения фрагментов ДНК, и размер синтезированных матриц указаны над дорожками. Стрелками показаны продукты,

соответствующие ожидаемым при инициации синтеза на Р1 (сплошные стрелки) и Р2 (пунктирные стрелки). Под гелем показано

относительное расположение Р1 и Р2 в геноме Е. coli К12. pj -Жирным шрифтом выделены консенсусные элементы.

направление считывания ялий-мРНК

-». Р2

5\..с<хДЧ»вАТАмотстасасста£сттатТАТААТа^^

34..QCGJU:CTATTTCASCTGCGabCTGAATAAirATT&T'TOGCQTTCCCXTT(3CAAGGAACGC..5f

PI I

Оба предсказанных промотора для оценки их активности in situ.

были встроены в ОРР-содержащий вектор В этих условиях Р1 оказался совсем не -21 -

способным инициировать транскрипцию При этом клетки, содержащие плазмиду со встроенным Р2, эффективно продуцировали этот белок, и уровень флуоресценции превышал контрольный более чем в 10 раз (Рис.14).

Рис. 14. Флуоресценция клеток, несущих плазмиду pET28b-EGFP с

делетнрованным промотором перед геном gfp [А]; с промотором Р2 [В]

Способность Р2 инициировать синтез РНК in vivo была подтверждена с помощью обратной транскрипции с меченым праймером 4, при этом к ДНК, соответствующей антисмысловому продукту, зарегистрировано не было (Рис.15А).

[А]

М (Ü.M.)

ШШш

1141

litt

«78 ■75

(48

А-Т

[С]

Si-

UxuT

[В]

»■¡г»- -35

-10

TGGATA [nbpj TATA-AT4 тстгйиттййоаш^тсссадтсастдт ; ^ttgtt'í wxwS-terminator «дмГ-terminator

Рис.15. [А]: Проверка функциональной активности потенциальных промоторов для синтеза антисмысловой и укороченной РНК in vivo. [В]: Схематическое изображение терминаторных структур гена uxuR и исиГ-РНК. При определении местоположения терминатора ихиТ для обратной транскрипции использовали праймеры 4 и 5, а в качестве встречных к ним - праймеры 2 и 7 [С]: Вторичная структура малой РНК UxuT, рассчитанная с помощью программы RNA Structure 4.0 [Mathews 2004].

Синтезирующаяся с праймером 4 кДНК имеет длину около 60 нуклеотидов, что приблизительно соответствует ожидаемому продукту с Р2 (64 нт) и РНК, зарегистрированной в реакции однократной инициации транскрипции in vitro. Это значит, что синтез начинается в терминаторной шпильке uxuR. Стартовая точка Р2 была точно картирована методом 5'-RACE и полностью совпала с предсказанной алгоритмом (позиция 4553390). Через 28 п.н. за терминатором гена uxuR есть еще один практически идеальный р-независимый терминатор (Рис. 15В). Вероятно, именно он является стоп-сигналом для синтезирующейся с Р2 РНК.

Из проведенного анализа, можно заключить, что в З'-UTR гена uxuR с промотора Р2 идет синтез новой РНК (UxuT=uxu Terminator), длиной около 80 нуклеотидов. Она способна сворачиваться в устойчивую вторичную структуру, которая очень сходна со структурами известных малых регуляторных РНК (Рис.15С). Практически полностью перекрываясь со стоп-сигналом гена uxuR, UxuT может играть определенную роль в регуляции процесса терминации uxuR-мРНК. Не исключено также, что, формируя частично комплементарные дуплексы с 3'-концом uxuR- мРНК, этот короткий транскрипт может модулировать ее стабильность.

Таким образом, обнаружено, что потенциальные промоторы для антисмысловой транскрипции, обладая способностью связывать РНКП, часто не инициируют синтез РНК в результате конкурентного связывания РНК-полимеразы с соседними промотор-подобными участками. Механизмы селекции функционально активного промотора до конца неясны, и их выявление требует более строгого учета дифференциального вклада промоторных элементов. Тем не менее, сам факт взаимодействия фермента транскрипции с промоторами, предсказанными в антисмысловом направлении, может иметь регуляторное значение для синтеза РНК в прямом направлении, реализуемое через механизмы транскрипционной интерференции.

выводы.

1. Способность промотор-содержащих фрагментов ДНК формировать комплексы с РНК-полимеразой коррелирует с максимальным показателем промотор-подобия, рассчитанным для соответствующих областей компьютерной программой PlatProm. Величина коэффициента корреляции (0.63) свидетельствует о высоком предсказательном потенциале PlatProm и об адекватном моделировании им структурно-функциональной организации промотора.

2. Впервые установлено, что в гене hns может начинаться синтез антисмысловой РЖ, внутриклеточное содержание который зависит от скорости роста, увеличиваясь при переходе к стационарной фазе.

3. В конце гена phoR и прилегающей межгенной области phoR/brnQ обнаружено, по меньшей мере, 6 промоторов, способных формировать продуктивные комплексы с РНК-полимеразой и вести дивергентный синтез РНК in vitro. Однако в условиях in vivo из них выбирается только один (координата стартовой точки 418644 в геноме E.coli К12 U00096.2), который может принимать участие в инициации транскрипции гена brnQ-мРНК.

4. Впервые картирован промотор гена uxuR (координата стартовой точки 4552500) и изучены его структурно-функциональные свойства. Показано, что активность этого промотора зависит от наличия UP-элемента, т.е. модуля, взаимодействующего с а-субъединицами РНК-полимеразы.

5. Обнаружена новая малая РНК длиной -80 нуклеотидов, синтез которой начинается в терминаторной шпильке uxuR (координата стартовой точки 4553390).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи.

1. Озолинь О. Н., Шавкунов К. С., Тутукина М. Н. Регуляторы генной экспрессии у бактерий: белковые факторы транскрипции и нетранслируемые РНК // Вестник биотехнологии. — 2005. — Т.1, №1 - с. 5665.

2. Тутукина М. Н- Шавкунов К. С., Масулис И. С., Озолинь О. Н. Картирование промоторов для антисмысловой транскрипции в генах регуляторных белков Escherichia colill Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Вып.8. - Воронеж. — 2006. - с. 201206.

3. Tutukina M.N.. Masulis I. S., Ozoline О. N. Towards the identification of antisense RNAs within genes of transcription regulators // Bioinformatics on Genome Regulation and Structure.(ed. Kolchanov, Hofestaedt).- 2006. - 1, 188192.

4. MN Tutukina. KS Shavkunov, IS Masulis, ON Ozoline Intragenic promoter-like sites in the genome of Escherichia coli. Discovery and functional implication.// J. of Bioinformatics and Computational Biology -2007. - p. 549-560.

5. VI Lukyanov, MN Tutukina. KS Shavkunov, IS Masulis, ON Ozoline Deciphering antisense regulation in bacteria // J. of Biomolecular Structure and Dynamics. - 2007. - Vol.24, № 6. - p. 740-742

6. K.S. Shavkunov, I.S. Masulis, M.N.Tutukina. A.A. Deev, O.N.Ozoline Gains and unexpected lessons from genome-scale promoter mapping. // Nucleic Acids Res. - 2009. 37,4919-4931.

Тезисы докладов

1. Тутукина М. Н. Картирование промоторов для антисмысловой транскрипции в генах sapA и ybcZ E.coli II Материалы XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» - Москва. — 2006. - с. 16.

2. Тутукина М. Н.. Шавкунов К. С., Масулис И. С., Озолинь О. Н. Транскрипционный профиль генетического локуса E.coli, содержащего ген sapA II Материалы X международной конференции «Биология - наука XXI века»- Пущино. - 2006. - с.55.

3. Тутукина М. Н.. Шавкунов К. С., Масулис И. С., Озолинь О. Н. Поиск промоторов для антисмысловой транскрипции в генах регуляторных белков E.coli II Материалы X международной конференции «Биология — наука XXI века»- Пущино. - 2006. - с.56.

4. Тутукина М. Н. Оценка транскрипционной активности промоторов, расположенных в кодирующей части гена uxuR II Материалы XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» - Москва. - 2007.-c.45

-25-

5. IS Masulis, MN Tutukina, KS Shavkunov, VI Lukyanov, ON Ozoline RNA Polymerase resident sites in bacterial genomes: multiple occurrence and putative function // Proceedings of the 3rd International Moscow Conference on Computational Molecular Biology - 2007. - p. 199-201.

6. Тутукина M.H. Новый РНК-продукт в генетическом локусе uxuR. И Материалы XX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» - Москва. -2008. - с. 37.

7. Maria N. Tutukina. IS Masulis, ON Ozoline Transcription profile of the Escherichia coli uxuR gene // Proceedings of Genomes 2008: Functional genomics of microorganisms - Paris, France. - 2008. - p.212.

8. Tutukina MN. Masulis IS, Ozoline ON Wavering balance in the Escherichia coli uxuAB/uxuR transcription // Proceedings of 4th EMBO Conference "From Functional Genomics to Systems Biology" - EMBL Heidelberg, Germany. -2008.-p.142.

9. Tutukina MN. Masulis IS, Ozoline ON. Hns as a putative target for antisense regulation// Proceedings of 3rd FEMS Congress -Gothenburg, Sweden - 2009

10.Tutukina MN. Shavkunov KS, Ashikhmina AA, Masulis IS, Ozoline ON. Promoter mapping: in silico, in vitro and in vivo. II FEBS J. - 2009.-Vol.276. -p. 10.

Подписано в печать:

28.09.2009

Заказ № 2598 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тутукина, Мария Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы регуляции экспрессии бактериальных генов на уровне транскрипции.

1.1.1. Регуляторные белки прокариот.

1.1.2. Феномен малых РНК — зачем они нужны клетке?.

1.1.3. Методические подходы, использованные для поиска малых РНК.

1.2. Особенности структурной организации промоторов.

1.3. Общие представления о механизмах образования транскрипционного комплекса.

1.4. Основные критерии, заложенные в алгоритм поиска стартовых точек транскрипции PlatProm.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты и методы исследования.

2.1.1. Компьютерные программы и алгоритмы.

2.1.2. Бактериальные штаммы и условия культивирования.

2.1.3. Выделение геномной ДНК E.coli.

2.1.4. Получение радиоактивно меченных олигодезоксирибо-нуклеотидов.

2.1.5. Амплификация промотор-содержащих фрагментов участков для последующего анализа in vitro и in situ.

2.1.6. Фракционирование ДНК методом электрофореза в поли-акриламидном геле.

2.1.7. Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ.

2.1.8. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК по Максаму-Джилберту.

2.1.9. Оценка способности фрагментов ДНК к образованию комплексов с с70-РНК-полимеразой E.coli.

2.1.10. Локализация сайтов полимераза-промоторного взаимодействия.

2.1.11. Определение транскрипционной активности промоторов in vitro.

2.1.12. Клонирование промотор-содержащих фрагментов в вектор pET28b-EGFP.

2.1.13. Выделение суммарной клеточной фракции РНК.

2.1.14. Реакция удлинения праймера in vivo.

2.1.15. Картирование 5'-концов РНК-транскриптов (5'-RACE).

2.1.16. Количественная ПЦР.

2.1.17. Northern-гибридизация.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выбор генов для экспериментального тестирования.

3.2. Сравнительный анализ данных, полученных in silico, in vitro и in vivo.

3.3. Структурно-функциональный анализ промотор-подобных сайтов, расположенных в гене hns.

3.4. Структурно-функциональный анализ промотор-подобных сайтов в локусе phoR/brnQ.

3.5. Структурно-функциональный анализ промотор-подобных сайтов в локусе wcuR.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК"

Хорошо известно, что регуляция экспрессии бактериальных генов может осуществляться на нескольких функциональных уровнях. В первую очередь, в процессе инициации транскрипции. Традиционно считается, что эффективность синтеза РНК контролируется белками - активаторами и репрессорами - общее число которых в бактериальной клетке может быть около 300 [Blattner 1997, Озолинь 2005]. Кроме того, существует еще один класс регуляторов — малые нетранслируемые РНК. Их размер варьирует от 37 до 400 нуклеотидов, а механизмы действия очень разнообразны. Для E.coli в настоящее время изучено 87 регуляторных РНК, большая часть которых кодируется независимыми генами. Данные системного анализа позволяют предположить, что общее их количество в клетке гораздо больше, чем белковых регуляторов транскрипции [Argaman 2001, Saetrom 2005, Tjaden 2006]. При этом только 10 известных нетранслируемых РНК транскрибируются из кодирующих последовательностей в антисмысловом направлении (http ://bi ocvc. ora/ECQLI/). Образуя комплементарные дуплексы с мРНК вблизи инициирующего кодона, они влияют на их ассоциацию с рибосомами и, следовательно, модулируют синтез белкового продукта. При связывании с другими участками матричной РНК, антисмысловые РНК могут изменять их стабильность, поддерживая относительное содержание мРНК на оптимальном для клетки уровне [Storz 2005], Очевидно, что для создания целостной картины клеточного метаболизма желательно иметь информацию обо всех генах, экспрессия которых может регулироваться по антисмысловому механизму. Однако перекрывание со смысловыми последовательностями других генов затрудняет целенаправленный поиск мест кодирования антисмысловых РНК. Тем не менее, некоторые из них были обнаружены среди коротких РНК, а также РНК, взаимодействующих с шапероном Hfq [Zhang 2002, Vogel 2003, Kawano 2005]. Наряду с этим, перспективным может быть поиск по сигналам транскрипции, позволивший обнаружить большую часть известных нетранслируемых РНК в межгенных участках [Argaman 2001, Chen 2002].

Для поиска потенциальных промоторов для аРНК мы использовали разработанную в нашей лаборатории компьютерную программу PlatProm, которая, кроме консервативных

7ft элементов, распознаваемых о -субъединицей РНК-полимеразы, учитывает ряд других структурных особенностей промоторной ДНК, рассматривая ее как единую платформу для взаимодействия и с РНК-полимеразой, и с регуляторными белками [Brok-Volchanski 2006]. В результате сканирования генома E.coli было обнаружено около тысячи потенциальных стартовых точек антисмысловой транскрипции. Многие из них находятся в генах регуляторных белков [Ozoline 2006]. Так как синтезируемые с них РНК могут оказаться вовлеченными в регуляторные сети клетки, именно они стали предметом первоочередного исследования [Tutukina 2007].

1.ФАКТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ РНК КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ ЭКСПРЕССИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

Несмотря на то, что геномы бактерий организованы гораздо проще, чем у высших организмов, а механизмы регуляции экспрессии генов прокариот изучаются уже несколько десятилетий, все еще остается очень много непонятного в том, каким образом реализуется адаптация клеток к практически постоянно изменяющимся условиям внешней среды. Кроме того, подобная адаптация, как правило, затрагивает не одну, а сразу несколько регуляторных систем. В последнее время появилось много новых данных, которые не только меняют наше представление о способах опосредованного геномом глобального переключения клеточного метаболизма, но и вносят значительные поправки в общую схему адаптивных реакций. Долгое время основными регуляторами эффективности генной экспрессии считали специальные белки, однако, к настоящему моменту это утверждение уже не является абсолютно бесспорным и может быть пересмотрено. Первым и, во многом, определяющим этапом реализации генетической информации, является транскрипция.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тутукина, Мария Николаевна

выводы.

1. Способность промотор-содержащих фрагментов ДНК формировать комплексы с РНК-полимеразой коррелирует с максимальным показателем промотор-подобия, рассчитанным для соответствующих областей компьютерной программой PlatProm. Величина коэффециента корреляции (0.63) свидетельствует о высоком предсказательном потенциале PlatProm и об адекватном моделировании им структурно-функциональной организации промотора.

2. Впервые установлено, что в гене hns может начинаться синтез антисмысловой РНК, внутриклеточное содержание который зависит от скорости роста, увеличиваясь при переходе к стационарной фазе.

4. Впервые картирован промотор гена ихuR (координата стартовой точки 4552500) и изучены его структурно-функциональные свойства. Показано, что активность этого промотора зависит от наличия UP-элемента, т.е. модуля, взаимодействующего с а-субъединицами РНК-полимеразы.

5. Обнаружена новая малая РНК длиной ~80 нуклеотидов, синтез которой начинается в термипаторной шпильке iccuR (координата стартовой точки 4553390).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Сложившаяся к настоящему времени тенденция в аннотации вновь секвенированных геномов предполагает картирование генов вместе с их регуляторными элементами. Это значит, что наряду с компьютерными программами поиска генов, кодирующих белки и нетранслируемые ' РНК, необходимы эффективные алгоритмы для идентификации промоторных участков и сайтов связывания регуляторов. Уже создан целый ряд подобных алгоритмов, позволяющих обнаруживать промотор-подобные участки как в эукариотических, так и в прокариотических геномах. Они учитывают все известные особенности промоторной ДНК и имеют высокую чувствительность. Однако, при сканировании генома такие алгоритмы имеют тенденцию к генерации большого количества фальшивых позитивов, выбирая потенциальные точки старта транскрипции только по формальным критериям. Для того чтобы приблизить промоторную модель, заложенную в имеющиеся на данный момент алгоритмы, к реально работающей в клетке, необходимо иметь как можно больше экспериментально определенных стартовых точек транскрипции, а также данные об их возможной регуляции различными факторами. Уже сейчас предложено несколько способов [Gama-Castro 2008] тотального определения стартовых точек, но все они требуют дальнейшего усовершенствования. В данной работе было исследовано 9 генетических локусов, 2 из которых содержали ранее неизвестные промоторы перед генами (uxuR, phoR). Наряду с этим, был изучен межгенный участок, который помимо картированного промотора для синтеза bglG-мРНК, содержит еще несколько потенциальных стартовых точек, способных инициировать синтез укороченных РНК-продуктов in vitro. Всего было проверено 14 потенциальных промоторов для антисмысловой транскрипции и 11 - для синтеза РНК-продуктов в одинаковом с перекрывающимся или соседним геном направлении. Оказалось, что все 11 проверенных «сонаправленных» промоторов способны к образованию продуктивного комплекса с РНК-полимеразой, но только 4 из 14 промоторов для антисмысловой транскрипции могут формировать открытый комплекс с ферментом и инициировать синтез РНК in vitro. Это хорошо согласуется с результатом сравнительного анализа сканирования генома in silico и данных по связыванию РНКП in vivo, который показал, что только 55% потенциальных антисмысловых промоторов, предсказанных алгоритмом во внутригенных участках, ассоциированы с сайтами связывания РНКП. Можно предположить, что наличие элонгирующего комплекса, ведущего копирование противоположной нити, создает препятствия для образования транскрипционного комплекса на антисмысловом промоторе. Такая динамическая коллизия вполне вероятна, так как перед ферментом, ведущим синтез РНК, из-за необходимости локального расплетания двойной спирали, создается область положительной суперспирализации, которая затрудняет формирование нового транскрипционного комплекса [Liu 1987]. Понятно, что синтез антисмысловых РНК тоже может снижать эффективность нормальной транскрипции, но в естественных условиях преимущественное связывание РНК-полимеразы с нормальными промоторами могут обеспечить специальные факторы транскрипции, а в условиях in vitro — нет. Возможно, именно поэтому антисмысловой промотор из гена iixuR оказался активным только in vitro. При этом оба потенциальных антисмысловых промотора, расположенные в кодирующей последовательности гена (hns и dps), и не имеющие по соседству промотор-подобных сигналов на другой нити, образовывали продуктивный комплекс с РНКП.

Установлено, что в кодирующей последовательности гена hns может начинаться синтез антисмыслового транскрипта, предположительная длина которого составляет около 140 нуклеотидов. При этом содержание в клетках антисмысловой РНК увеличивается при переходе к стационарному росту, в то время как количество /шя-мРНК значительно снижается. Это предполагает существование регуляторного механизма, обеспечивающего такую негативную корреляцию. Не исключено, что в его основе лежит непосредственное взаимодействие аРНК с мРНК, результатом которого является стабилизация или дестабилизация одной из них.

Очень важные результаты получены при исследовании промоторов из генетического локуса гена phoR. В этой области предсказано много перекрывающихся промоторов и зарегистрировано, по крайней мере, 5 транскрипционных вилок, две из которых соответствуют антисмысловым промоторам и формируются с высокой эффективностью, но синтез РНК in vitro был зарегистрирован только для одного из этих промоторов, а в системе репортерной детекции с использованием плазмиды pET28b-EGFP оба эти промотора оказались неактивными. Таким образом, высокое сродство к РНК-полимеразе и даже способность формировать транскрипционно-компетентные комплексы совсем не гарантируют эффективность транскрипции в клетке.

Из двух дивергентных промоторов, расположенных в 3'- UTR гена uxuR, РНК-полимераза в условиях жесткой конкуренции in vivo выбирает только один — сонаправленный с геном. Он расположен в терминаторной шпильке uxuR и инициирует синтез короткой РНК размером 77-79 нт, которая останавливается на собственном р-независимом терминаторе.

Таким образом, в данной работе исследована транскрипционная активность 9 генетических локусов, содержащих в общей сложности 26 потенциальных промоторов. Впервые картировано 3 новых промотора перед генами, способных инициировать синтез bglG-, brnQ- и wcuR-мРНК. Обнаружена новая малая РНК - UxuT, транскрибирующаяся из З'-нетранслируемого участка iixuR.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тутукина, Мария Николаевна, Пущино

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование, М.:Мир,479.

2. Масулис И.С., Часов В.В., Костяницына Е.Г., Пуртов Ю.А. (2001) Детерминированные нуклеотидной последовательностью конформационные изменения промоторной ДНК1 при образовании транскрипционного комплекса, Мол.Биол., 35, 996-1000.

3. Озолинь О.Н., Деев А.А. (1998) Неканонические структурные элементы промоторной ДНК и их роль в комплексообразовании с РНК-полимеразой. Молек.быол.,32, 441-446.

4. Озолинь О.Н., Деев А.А., Масулис И.С., Часов В.В., Костяницына Е.Г., Пуртов Ю.А., Архипов И.В., Брок-Волчанский А.С. (2002). Уровни структурной организации промоторной ДНК Escherichia coli, .Биофизика, 47, 89-819

5. Озолинь О.Н., Шакунов К.С., Тутукина М.Н. (2005) Регуляторы генной экспрессии у бактерий: белковые факторы транскрипции и нетранслируемые РНК. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии,1, 56-65.

6. Часов В.В., Деев А.А., Масулис И.С., Озолинь О.Н. (2002) А/Т -треки в структуре промоторов Escherichia coli: характер распределения и функциональное значение, Мол.Биол., 36, 682-688.

7. Argaman L., Hershberg R., Vogel J., Bejerano G., Wagner E.G., Margalit H., Altuvia S. (2001) Novel small RNA-encoding genes in the intergenic regions of Escherichia coli. Curr. Biol., 11, 941-950.

8. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. (1999). Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.

9. J. Bacteriol. 181. 6361 6370.

10. Barne K.A., Bown J.A., Busby S.J., Minchin S.D. (1997). Region of Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 subunit is responsible for the recognition of the "extended -10" motif at promoters, The EMBO J.,16, 4034-4040.

11. Bae W., Xia В., Inouye M., Severinov K. (2000). Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7784-7789.

12. Bartlett M.S., Gourse R.L. (1994) Growth rate-dependent control of the rrnB PI core promoter in Escherichia coli. J. Bacteriol. 176. 5560 5564.

13. Blatter E.E., Ross W., Tang H., Gourse R.L., Ebright R.H. (1994) Domain organization of RNA polymerase a-subunit: C-terminal 85 amino acids constitute a domain capable of dimerization and DNA binding, Cell, 78, 889-896.

14. Blattner F.R., Punkett III G., Bloch C.A., et al. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K12. Science, 277, 1453-1462.

15. Borukhov S., Severinov K. (2002) Role of the RNA polymerase sigma subunit in transcription initiation, Res.Microbiol., 153, 557-562.

16. Boun J., Ваше K., Minchin S., Busby S. (1997). Extended -10 promoters, Nucl. Acids Mol.Biol., 11,41-52/

17. Brok-Volchanski A.S., Masulis I.S., Shavkunov K.S., Lukyanov Y.I., Purtov Yu. A., Kostyanicina E.G., Deev A.A., Ozoline O.N. (2005). Promoter-search software as a tool for prediction novel genes. Kluwer Academic Press

18. Buc H., McClure W.R. (1985) Kinetic of open complex formation between E.coli RNA polymerase and the lacUV5 promoter, Biochemistry, 24,2712-2723.

19. Burgess R.R., Authony L. (2001) How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does, Current Opinion Microbiol., 4, 126-131.

20. Burns, H. D., Belyaeva T. A., Busby S. J., Minchin S. D. (1996). Temperature- dependence of open-complex formation at two Escherichia coli promoters with extended -10 sequences. Biochem.J. 317,305-311.

21. Carter R. J., Dubchak I., Holbrook S. R. (2001) A computational approach to identify genes for functional RNAs in genomic sequences. Nucleic Acids Res., 29, 3928 3938.

22. Chan В., Busby S. (1989) Recognition of nucleotide sequences at the Escherichia coli galactose operon PI promoter by RNA polymerase. Gene,84,227-236

23. Chen S., Lesnik E. A., Hall T. A., Sampath R., Griffey R. H., Ecker D. J., Blyn L.B. (2002) A bioinformatics based approach to discover small RNA genes in the Escherichia coli genome. Biosystems, 65(2-3), 157-177.

24. Chen Chin-Yu, Ко Tzu-Ping, Lin Ting-Wan, Chou Chia-Cheng, Chen Chun-Jung, Wang Andrew H.-J. (2005) Probing the DNA kink structure induced by the hyperthermophilic chromosomal protein Sacld, Nucl.Acids Res., 33, 430-438.

25. Craig M.L., Suh W.-C., Record M.T.Jr. (1995) HO and Dnase 1 probing of Eo70 RNA polymerase-APR promoter open complex: Mg2+ binding and its structural consequences at the transcription start site, Biochemistry, 34, 15624-15632.

26. Darst S.A., Polyakov A., Pichter C., Zhang G. (1998). Insights into Escherichia coli RNA polymerase 2 to 16A resolution, Cell, 66, 121-128.

27. Davis C.A., Capp M.W., Record M.T., Saecker R.M. (2004) The effects of upstream DNA on open complex formation by Escherichia coli RNA polymerase, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 102, 285-290.

28. De Lay N., Gottesman S. (2009) The CRP-activated small noncoding regulatory RNA CyaR (RyeE) links nutritional status to group behavior, J.Bacteriol., 191, 461-476.

29. Delihas N., Rokita S.E., Zheng P. (1997) Natural antisense RNA/target RNA interactions: possible models for antisense oligonucleotide drug design. Nature, 15, 751-753.

30. De Wulf P., McGuire A.M., Liu X., Lin E.C.C. (2002) Genome-wide profiling of promoter recognition by the two-component response regulator CpxR-P in Escherichia coli., J.Biol.Chem., 277,26652-26661.

31. Donato G.M., Kawula Т.Н. (1998) Enhanced binding of altered H-NS protein to flagellar rotor protein FliG causes increased flagellar rotational speed and hypermotility in Escherichia coli. J.Biol.Chem., 273, 24030-24036.

32. Duval-Valentin G., Ehrich R. (1987) Dynamic and structural characterization of multiple steps during complex formation between E.coli RNA polymerase and the tetR promoter from pSClOl, Nucl.,.Acids Res., 15,575-594.

33. Eddy S.R. (1999) Noncoding RNA genes, Curr Opin.Genet Dev., 9, 695-699.

34. Ellinger Т., Behnke D., Bijard H., Gralla J.D. (1994) Stalling of Escherichia coli RNA polymerase at the +6 to +24 region in vivo is associated with tight binding to consensus promoter element, J.Mol.Biol.,239,455-465.

35. Estrem S.T., Gaal Т., Ross W., Gourse R.L. (1998). Identification of an UP-element consensus sequence for bacterial promoters, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 95, 9761-9766.

36. Favre-Bonte S., Joly В., Forestier Ch. (1999). Consequences of reduction of Klebsiella pneumoniae capsule expression on interactions of this bacterium with epithelial cells. Infect. Immun. 67, 554-561.

37. FujitaN., Ishihama А.(199б) Reconstitution of RNA polymerase, Methods Enzymol., 273, 121130.

38. Gaal Т., Ross W., Blatter E.E., Tang H., Jia X., Kristian V.V., Assa Munt N., Ebright R.H., Gourse R.L. (1996) DNA binding determinants of the alpha subunit of RNA polymerase: novel DNA-binding domain architecture, Genes Dev., 10, 16-26.

39. Giuliodori A.M., Brandi A., Gualerzi C.O., Pon S. (2004). Preferential translation of cold-shock mRNAs during cold adaptation. RNA. 10, 265-276.

40. Goldman S.R., Ebright R.H., Nickels В. E. (2009) Direct Detection of Abortive RNA Transcripts in Vivo Science, 324, 927 928.

41. Gorke B, Vogel J. (2008) Noncoding RNA control of the making and breaking of sugars, Genes Dev., 22, 2914-2925.

42. Gourse R.L., d'Boer H.A., Nomura M. (1986) DNA determinants of rRNA synthesis in E.coli: growth rate dependent regulation, feedback inhibition, upstream activation, antitermination, Cell, 44, 197-205.

43. Gruber T.M., Gross C.A. (2003) Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Anmt. Rev. Microbiol. 57,441-466.

44. Grimes E., Busby S., Minchin S. (1991). Different thermal energy requirementfor open complex formation by Escherichia coli RNA polymerase at two related promoters. Nucleic Acids Res. 19, 6113-6118.

45. Hatoum A., Roberts J. (2008) Prevalence of RNA polymerase stalling at E.coli promoters after open complex formation. Mol.Microbiol, 68,17-28.

46. Haugen S.P., Berkmen M.B., Ross W., Gaal Т., Ward C., Gourse R.L. (2006) rRNA promoter recognition by nonoptimal binding of a region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. Cell. 125, 1069-1082.

47. Hawley D.K. and McClure W.R. (1983). Compilation and analysis of E.coli promoter RNA sequences, Nucl.Acids Res, 11, 2237-2255.

48. Hawley D.K. and Reynolds R. (1987). Analysis of Escherichia coli promoter sequences, Nucl.Acids Res.,15,2343-2361.

49. Hershberger R., Altuvia S., Margalit H. (2003) A survey of small RNA-encoding genes in Escherichia coli, Nucl.Acids Res., 31, 1813-1820.

50. Hertz G. Z., Stormo G. D. (1996) Escherichia coli promoter sequences: analysis and prediction. Methods Enzymol, 273, 30-42.

51. Hochschild A. (2007) Gene-specific regulation by a transcript cleavage factor: facilitating promoter escape, J.Bacteriol., 189,24, 8769-8771.

52. Hook-Barnard I., Johnson X.B., Hinton D.M. (2006) Escherichia coli RNA polymerase recognition of cr70-dependent promoter requiring a -35 DNA element and an extended -10 TGn motif. J.Bacteriol., 188, 8352-8359.

53. Ilorwitz A.H., Morand C., Wilcox G. (1980). Deoxiribonucleic acid sequence of araBAD promoter mutants of E.coli, J.Bacteriol., 142, 659-662.

54. Huang X., Lopez de Saro F. J., Helmann J. D. (1997) sigma factor mutations affecting the sequence-selective interaction of RNA polymerase with -10 region single-stranded DNA Nucleic Acids Res., 25, 2603 2609.

55. Huerta A.M., Collado-Vides J. (2003) Sigma70 Promoters in Escherichia coli: Specific Transcription in Dense Region of Overlapping Promoter-like Signals, J.Mol.Biol., 333, 261278.

56. Ivanov V.I., Minchenkova L.E., Chernov B.K., McPhie P., Ryu S., Garges S. (1995) CRP-DNA complex: inducing the a-like form in the binding sites with an extended central spacer, J.Mol.Biol., 245,228-240.

57. Ishihama A., Yamada M. et al (2006) Nucleoids dynamic in Escherichia coli: a growth phase dependent process. Bangladesh J. Microbiol., 23, 81-88.

58. Kaplan C.D., Laprade L., Winston F. (2003) Transcription elongation factors repress transcription initiation from cryptic sites, Science, 301, 1096-1099.

59. Kawano M., Storz G., Rao B.S., Rosner J.L., Martin R.G. (2005) Detection of low-level promoter activity within open reading frame sequences of Escherichia coli, Nucl.Acids Res.,33, 6268-6276.

60. Kawano M., Reynolds A.A., Miranda-Rios J., Storz G. (2005) Detection of 5'- and 3'-UTR-derived small RNAs and c/s-encoded antisense RNAs in Escherichia coli, Nucl.Acids Res.,33, 1040-1050.

61. Kawano M., Aravind L., Storz G. (2007) An antisense RNA controls synthesis of an SOS induced toxin evolved from an antitoxin, Mol. Microbiol., 64,738-754.

62. Kimura M., Ishihama A. (1995) Functional map of the alpha subunit of Escherichia coli RNA polymerase: amino acids subsitution within the amino-terminal assembly domain, J.Mol.Biol.,254, 342-349.

63. Kimura M., Yamaguchi I. (1998) Convergent transcription units and their promoters at both ends of Pot2, an inverted repeat transposon from the rice blast fungus. J. Biochem., 124, 268273.

64. Knaus R. And Bujard H. (1988). Pi of coli phage lambda an alternative solution for anefficient promoter, The EMBO J.,1, 2919-2923.

65. Komissarova N. and Kashlev M. (1997). Transcription arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3'end of the RNA intact and extruded, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 94,1755-1760.

66. Koo H.-S., Wu H.-M., Crothers D.M. (1986) DNA bending at adenin-thymine tracts, Nature, 320, 501-506.

67. Koo H.-S., Crothers D.M. (1988) Calibration of DNA curvature and unified description of sequence-directadbending, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85,1763.

68. Koo H.S., Drak J., Rice J.H., Crothers D.M.(1990) Determination of the extend of DNA bending by an adenin-thymine tract, Biochemistry, 29, 4227-4234.

69. Krohn M., Wagner R.(1996) Transcriptional pausing of RNA polymerase in the presence of Guanosine tetraphosphate depends on the promoter and gene sequence, J.Biol., Chem.,271, 23884-23894.

70. Krummel В., Chamberlin M.J.(1989) RNA Chain Initiation by Escherichia coli RNA Polymerase. Structural Transition of the Enzyme in Early Ternary Complexes, Biochemistry, 28, 7829-7842.

71. Kubori Т., Shimamoto N. (1996). A brached pathway in the early stage of transcription by Ecoli RNA polymerase, J. Mol. Biol., 256, 449-457.

72. Lamond A.I., Travers A.A. (1985) Stringent control of bacterial transcription. Cell, 41, 6-8.

73. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. (2007) ClustalW and ClustalX version 2., Bioinformatics, 23(21), 2947-2948.

74. La Teana A., Brandi A., Falconi M., Spurio R., Pon C. L., Gualerzi C.O.(1991). Identification of a cold shock transcriptional enhancer of the Escherichia coli gene encoding nucleoid protein H-NS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 10907-10911.

75. Lavigne M., Kolb A., Buc H. (1992) Transcription activation by cAMP receptor protein (CRP) at the Escherichia coli galPl promoter. Crucial role for the spacing between the CRP binding site and the —10 region, Biochemistry, 31, 9647-9656.

76. Lease R.A., Cusick M.E., Belfort M. (1998) Riboregulation in Escherichia coli: DsrA acts by RNA:RNA interactions in multiple loci,, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, 12456-12461.

77. Leirmo S., Record M. (1990) Structural, Termodinamic and Kinetic studies of the Interaction of Eo70 RNA Polymerase with Promoter DNA, Nucleic Acids and Mol.BioX., 4, 123-150.

78. Lisser S., Margalit H. (1993) Compilation of E.coli mRNA promoter sequences. Nucleic Acids Res., 21, 1507-1516.

79. Liu C., Bai В., Skogerb0 G., Cai L., Deng W., Zhang Y., Bu Y., Zhao Y., Chen R. (2005) NONCODE: an integrated knowledge database of non-coding RNAs. Nucleic Acids Res., 33, D112 D115.

80. Liu L.F., Wang J.C. (1987) Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 7024-7027.

81. Liu Y., Kobayashi I. (2007) Negative regulation of EcoRI restriction enzyme gene is associated with intragenic reverse promoters. J.Bacteriol., 189, 6928-6935.

82. Maeda H., Fujita N., Ishihama A. (2000) Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: Relative binding affinities to the core RNA polymerase. Nucleic Acids Res., 28, 34973503.

83. Maki K., Uno K., Morita Т., Aiba H. (2008) RNA, but not protein partners, is directly responsible for translational silencing by a bacterial Hfq-binding small RNA, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 105, 10332-10337.

84. Mallik P., Paul B.J., Rutherford S.T., Gourse R.L., Osuna R. (2006) DksA is required for growth phase-dependent regulation, growth rate-dependent control, and stringent control offis expression in Escherichia coli. J.Bacteriol., 188, 5775-5782.

85. Mandin P., Gottesman S. (2009) A genetic approach for finding small RNAs regulators of genes of interest identifies RybC as regulating the DpiA/DpiB two-component system. Mol.Microbiol., 72. 551-565.

86. Maniatis Т., Frisch E.F., Sambrook J. (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab.

87. Marr M. T. Roberts J. W. (2000) Function of transcription cleavage factors GreA and GreB at a regulatory pause site. Mol Cell, 6, 1275-1285.

88. Masse E., Gottesman S. (2002) A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 99, 4620 4625.

89. Matz M., Alieva N., Chenchik A., Lukyanov S. (2003) Amplification of cDNA ends using PCR suppression effect and step-out PCR. Methods Mol Biol. 221,41-49.

90. Maxam A.M., Gilbert W. (1985) Sequencing andlabeled DNA with base-specific chemical cleavages, Methods Enzymol., 230, 679.

91. McFall S.M. (1997) Dnasel footprinting, DNA bending and in vitro transcription analysis of ClcR and CatR interactions with the clcABD promoter: evidence of a conserved transcription activation mechanism, 5, 965-976.

92. McNamara P.T., Bolshoy A., Trifonov E.N., Harrington R.E. (1990) Sequence-dependent kinks induced in curved DNA, J.Biomol. Struct.Dymanics.,8, 529-539.

93. Merrick M.J. (1993) In a class of its own the RNA polymerase sigma factor sigma 54 (sigma N). Mol.Microbiol., 10, 903-909.

94. Mills G.B., Hagerman P.J. (2004) Origin of the intrinsic rigidity of DNA, NucLAcids Res., 32,4055-4059.

95. Mitchell J. L., Zheng D., Busby J.W., Minchin S.D. (2003) Identification and analysis of extended -10 promoters in Escherichia coli. Nucleic Acids Res.,31, 4689-4695.

96. Mizuno Т., Chou M., Inouye M. (1984) A Unique Mechanism Regulating Gene Expression: Translational Inhibition by a Complementary RNA Transcript (micRNA). Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 81,1966- 1970. ,

97. Moller Т., Franch Т., Udesen С., Gerdes К., Valentin-Hansen P. (2002) Spot 42 RNA mediates discoordinate expression of the E. coli galactose operon Genes Dev., 16, 1696.чЛ

98. Mooney R.A., Landick R. (2003) Tethering a to RNA polymerase reveals high in vivo7П • •activity of с factors and о -dependent pausing at promoter-distal locations, Genes Dev., 17:2839-2851.

99. Mukheijee K., Chatterji D. (1997). Studies on the omega subunit of Escherichia coli RNA polymerase-its role in the recovery of denatured enzime activity, Eur.J.Biochem.,247,884-889.

100. Murakami K., Fujita N., Ishihama A. (1996) Transcription factor recognition surface on the RNA polymerase alpha subunit is involved in contact with the DNA enhancer element, The EMBOJ., 15,4358-4367.

101. Murakami K.S., Masuda S., Darst S. (2002). Structural Basis of Transcription Initiation:RNA polymerase Holoenzyme at 4A Resolution, Science, 296, 1280-1284.

102. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E., Muzzin O., Darst S. (2002). Structural Basis of Transcription Initiation: An RNA polymerase Holoenzyme-DNA Complex, Science, 296, 12851290.

103. Murakami K.S. and Darst S. (2003). Bacterial RNA polymerase: the whole story, Current Opinion in Structural Biology, 13, 31-39.

104. Naryshkin N., Reyakin А., Ют Yo., Mekler V., Ebright R.H. (2000) Structural organization of the RNA Polymerase-Promoter Open Complex, Cell, 101, 601-611.

105. Nelson H.C.M., Finch J.T., Luisi B.K., Klug A. (1987) The structure of an oligo(dA)oligo(dT)tract and its biological implications, Nature, 330,221-226.

106. Nickels B.E., Dove S.L., Murakami K.S., Darst S.A., Hochschild A. (2002) Protein-protein and protein-DNA interactions of sigma70 region 4 involved in transcription activation by Xcl. J.Mol.Biol., 324 17-34.

107. Nudler E., Avetissova E., Markovtsov V., Goldfarb A. (1996) Transcription processivity: protein:DNA interactions holding together elongation complex. Science, 273, 211-217

108. Nudler E. (1999). Transcription elongation: structural basic and mechanisms, J.Mol.Biol., 288,1-12.

109. Okamoto К., Hara S., Bhasin R., Freundlich M. (1998) Evidence in vivo for autogenous control of the cyclic AMP receptor protein gene (ctp) in Escherichia coli by divergent RNA. J. Bacteriol., 170, 5076-5079.

110. Oshima Т., Ishikawa S., Kurokawa K, Aiba H, Ogasavvara N. (2006) Escherichia coli histone-like protein H-NS preferentially binds to horizontally acquired DNA in association with RNA polymerase, DNA res.,\3,141-153.

111. Owens J.T., Miyake R., Chmura A.J., FujitaN., Ishihama A., Meares C.F. (1998). Mapping the o70 subunit contact sites on Escherichia coli RNA polymerase with a cf°- conjugated chemical protease, Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 95, 7670-7675.

112. Ozoline O.N., Tsyganov M.A. (1995). Structure of open promoter complexes with Escherichia coli RNA polymerase as revealed by the DNAsel footprinting technique: compilation analysis, Nuclleic Acids Res.,23, 4533-4541.

113. Ozoline O.N., Deev A.A and Archipova M.V. (1997) Non-canonical sequence elements in the promoter structure. Cluster analysis of pomoters recognized by Escherichia coli RNA polymerase, Nucl.Acids Res,25, 4703-4709.

114. Ozoline O., Deev A., Arkhipova M., Chasov V., Travers A. (1999a) Proximal transcribed regions of bacterial promoters have non-random distribution of A/T-tracts. Nucl.Acids Res., 27, 4768-4774

115. Ozoline O.N., Deev A.A., Trifonov E.N. (1999b) DNA bendability-a novel Feature in E.coli Promoter Recognition, J.Biol. Struc and Dyn., 16, 825-831.

116. Ozoline O.N., Fujita N., Ishihama A. (2000) Transcription activation mediated by the Carboxil-terminal domain of the RNA polymerase a-subunit, J. Biol. Chem.,215, 1119-1127.

117. Ozoline O.N., Fujita N., Ishihama A. (2001) Mode of DNA-protein interaction between the C-terminal domain of Escherichia coli RNA-polymerase a-subunit and T7D promoter UP element, Nncl., Acids Res.,29, 4909-4919.

118. Ozoline O.N., Fujita N., Ishihama A. (2002) Genome-wide expression profiling of Escherichia coli W3110: microarray and statistic analysis of heat shock regulons. In Bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk, 2, 189-191.

119. Parekli B.S., Hatfield G.W. (1996). Transcription activation by protein-induced DNA bending: evidence for a DNA structural transition model, Proc. Nad., Acad.Sci.USA, 93, 11731177.

120. Peekhaus N., Conway T. (1998) What's for dinner?: Entner-Doudoroff metabolism in Escherichia coli., J. Bacterioh, 180, 3495-3502.

121. Peretz-Martin J., Rojo F., deLorenzo V. (1994) Promoter responsive to DNA-bending: a common theme in procariotic gene expression, Microbiol Rev.,58, 268-290.

122. Perocchi F., Xu Z., Clauder-Miinster S., Steinmetz L.M. (2007) Antisense artifacts in transcriptome microaaray experiments are resolved by actinomycin D. Nucl. Acids Res., 35, el28.

123. Phadtare S., Severinov K. (2005) Extended -10 motif is critical for activity of cspA promoter but does not contribute to low-temperature transcription, J. Bacteriol., 187, 6584-6589.

124. Polyakov A., Severinova E., Darst S. A. (1995) Three-dimensional structure of E. coli core RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme. Cell, 83(3), 365-373.

125. Rasmussen A.A., Johansen J., Nielsen J. S., Overgaard M., Kallipolitis В., Valentin-Hansen P. (2009) A conserved small RNA promotes silencing of the outer membrane protein YbfM, Mol. Microbiol., 72, 566-577.

126. Repoila F., Gottesman S. (2003) Temperature sensing by the dsrA promoter. J. Bacteriol., 185, 6609-6614.

127. Reppas N., Wade J., Church G. and Struhl K. (2006). The transition between transcriptional initiation and elongation in E. coli is highly variable and often rate limiting. Mol. Cell. 24, 747757.

128. Ritzenthaler P., Mata-Gilsinger M. (1982) Use of in vitro gene fusions to study the uxuR regulatory gene in Escherichia coli K-12: direction of transcription and regulation of its expression. J. Bacteriol., 150, 1040-1047.

129. Rivas E., Eddy S. R. (2001) Noncoding RNA gene detection using comparative sequence analysis. BMC Bioinformatics, 2, 8.

130. Rivetti C., Guthold M., Bustamante C. (1999) Wrapping of DNA around RNA polymerase open complex, The EMBO J., 19, 4464-4475.

131. Rodionov D. A., Mironov A.A., Rakhmaninova A.B., Gelfand M.S. (2000) Transcriptional regulation of transport and utilization systems of hexuronides, hexuronates and hexonates in gamma purple bacteria, Mol.Microbiol., 38, 673-683.

132. Rosenberg S., Kadesh T.R., Chamberlin M.J. (1982) Binding of E.coli RNA polymerase holoenzyme to bacteriophage T7 DNA, J.Mol.Biol.,155,31-51.

133. Ross W., Gosink K.K., Salomon J., Igarashi K.,Zou C., Ishihama A., Severinov K., Gourse R.L. (1993). A third recognition element in bacterial pomoters. DNA binding by the a-subunit of RNA polymerase. Science,262,1407-1414.

134. Ross W., Aiyar S., Salomon J., Gourse R. (1998) Escherichia coli Promoters with UP Elements of Different Strengths: Modular Structure of Bacterial Promoters, J. Bacteriol., 180, 5375-5383.

135. Ross W., Ernst A., Gourse R.L.(2001) Fine structure of E.coli RNA polymerase-promoter interaction:alhpa subunit binding to the UP element minor groove, Genes Dev., 15, 491-506.

136. Saetrom P., Sneve R., Kristiansen K.I., Snove O., Grtinfeld Т., Rognes Т., Seeberg E. (2005) Predicting non-coding RNA genes in Escherichia coli with boosted genomic programming, Nucl.Acids Res.,33,3263-3270

137. Sanderson A., Mitchell J. E., Minchin S. D., Busby S. J. (2003) Substitutions in the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 factor that affect recognition of extended -10 elements at promoters. FEBS Lett, 544(1-3), 199-205.

138. Schaefer K.L., McClure W. (1997) Antisense RNA control of gene expression in bacteriophage p22.I. Structures of sar RNA and its target, ant mRNA. RNA, 3, 141-156.

139. Schnetz K., Rak B. (1988) Regulation of the bgl operon Escherichia coli by transcription antitermination. EMBOJ., 7, 3271-3277.

140. Shao X., Grishin N.V. (2000) Common fold in helix-haiprin-helix proteins, Nucl.,Acids Res.,28,2643-2650.

141. Selinger D. W., Cheung K., Mei R., Johansson E., Richmond C., Blattner F., Lockhart D., Church D. (2000) RNA expression analysis using a 30-base pair resolution Escherichia coli genome array. Nat. Biotech. 18, 1262-1268.

142. Selinger D.W., Saxena R.M., Cheung K.J., Church G.M., Rosenow C. (2003) Global RNA half-life analysis in Escherichia coli reveals positional partners of transcript degradation. Genome Res. 13, 216-223.

143. Sen R., Nagai H., Hernandez V.J., Sliimamoto N. (1998) Reduction in abortive transcription from the lambdaPR promoter by mutations in region 3 of the sigma70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase,/Biol Chem.,273,9872-9877.

144. Sen R, Nagari H., Shimomoto N. (2000). Polymerase Arrest at the APr Promoter during Transcripion Initiation, J. Biol. Chemistry, 275, 10899-10904.

145. Sen R, Nagari H., Shimomoto N. (2001). Conformational switching of Escherichia coli RNA polymerase-promoter binary complex is facilitated by elongation factor GreA and GreB, Genes Cell, 6, 389-401.

146. Severinov K.V. (2007) Interaction of bacterial DNA-dependent RNA polymerase with promoters. Mol.Biol. (Moscow) 41, 376-386.

147. Shavkunov K.S., Masulis I.S., Tutukina M.N., Deev A.A., Ozoline O.N. (2009) Gains and unexpected lessons from genome-scale promoter mapping. Nucleic Acids Res., 37, 4919-4931.

148. Spiegelman S., Burny A., Das M.R., Keydar J., Schlom J., Travnicek M., Watson K. (1970) DNA-directed DNA polymerase activity in oncogenic RNA viruses. Nature, 227, 1029-1031.

149. Storz G., Altuvia S., Wassarman К. M. (2005) An abundance of RNA regulators.// Annu.Rev.Biochem., 74, 199-217.

150. Suh W.C., Ross W., Record M. Т., (1993) Two open complexes and a requirement for Mg2+ to open the lambda PR transcription start site. Science, 259, 358 361.

151. Szarniecki D., Noel R.J., Raznikoff W.S. (1997) The ^5 of the Escherichia coli lac promoter: CAP-dependent and CAP-independent transcription, J.Bacteriol., 179,423-429.

152. Szoke P.A., Allen T.A., deHasseth P.L. (1987). Promoter recognition by Escherichia coli RNA polymerase. Effect of base substitution in the —10 and —35 regions, Biochemistry, 26,6188-6194.

153. Susa M., Sen R., Shimomoto N. (2002). Generality of the Branched Pathway in Transcription Initiation by Escherichia coli RNA polymerase, J. Biol. Chemistry, 18, 1540715412.

154. Susa M., Kubori Т., Shimamoto N. (2006) A pathway branching in transcription initiation in Escherichia coli. Mol Microbiol, 59(6), 1807-1817.

155. Tagami H. and Aiba H. (1998). A common role of CRP in transcription activation: CRP acts transiently to stimulate events leading to open complex formation at a diverse set of pomoters, The EMBO J., 17, 1759-1767.

156. Tagami H. and Aiba H. (1999). An inactive open complex mediated by an UP element at Escherichia coli promoters, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7202-7207.

157. Tan K., Moreno-Hagelsieb H., Collado-Vides J., Stormo G. (2001) A comparative genomics approach to prediction of new members of regulons. Genome Res., 11, 566-584.

158. Telart F., Bouche J-P. (1992) Regulation of the expression of the cell-cycle gene ftsZ by DicF antisense RNA. Division does not require a fixed number of FtsZ molecules. Mol. Microbiol., 6, 615-620.

159. Thieme D., Grass G. (2009) The Dps protein of Escherichia coli is involved in copper homeostasis. Microbiol.Res.

160. Thompson K.M., Rhodius V.A., Gottesman S. (2007) aE regulates and is regulated by a small RNA in Escherichia coli., J.Bacteriol., 189, 4243-4256.

161. Thouvenot F., Charpentier В., Branlant C. (2004) The strong efficiency of Escherichia coli gapA PI promoter depends on a complex combination of functional determinants. Biochem J., 383,371-382.

162. Tjaden В., Saxena R.M., Stolyar S., Haynor D.R., Kolker E., Rosenow C. (2002) Transcriptome analysis of Escherichia coli using high-density oligonucleotide probe arrays Nucleic Acids Res., 30, 3732 3738.

163. Tjaden В., Goodwin S. S., Opdyke J. A., Guillier M., Fu D.X., Gottesman S., Storz G. (2006) Target prediction for small, noncoding RNAs in bacteria. Nucleic Acids Research, 34(9), 2791-2802.

164. Travers A. (1987) Structure and function of E.coli promoter DNA. CRP. Biochem., 22,181219.

165. Travers A. (1991) DNA bending and kinking-sequence dependence of the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase, Current opinion in structural biology,1,114-122.

166. Travers A., Schneider R., Muskhelishvili G. (2001) DNA supercoiling and transcription in Escherichia coli: The FIS conncction,Bioche/n. ,83,213-817.

167. Tutukina M.N., Shavkunov K.S., Masulis I.S., Ozoline.O.N. (2007). Intragenic promoterlike sites in the genome of Escherichia coli. Discovery and functional implication. J. Bioinf. Compul. Biol. 5, 549-560.

168. Udekwu K.I., Darfeuille F., Vogel J., Reimegaard J., Holmkvist E., Wagner E.G.H. (2005) Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA, Genes Dev., 19, 2355-2366.

169. Urban J.H., Vogel J. (2008) Two seemingly homologous noncoding RNAs act hierarchically to activate glmS mRNA translation. PLoS Biol 6(3): e64. doi:10.1371/journal.

170. Urban J.H., Vogel J. (2007) Translational control and target recognition by Escherichia coli small RNAs in vivo, Nucl.Acids Res., 35,1018-1037.

171. Urbanowski M.L., Stauffer L.T., Stauffer G.V. (2000) The gcvB gene encodes a small untranslated RNA involved in expression of the dipeptide and oligopeptide transport systems in E.coli, Mol. Microbiol, 37, 856-868.

172. Vassylyev D., Sekine Shun-ichi, Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M.N., Borukhov S., Yokoyama S. (2002). Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6A resolution, Nature, 417, 712-719.

173. Vogel J., Bartels V., Tang Т.Н., Churakov G., Slagter-Jager J., Hiittenhofer A., Wagner E.G.H. (2003) RNomics in Escherichia coli detects new sRNA species and indicates parallel transcriptional output in bacteria., Nucl.Acids Res.,31, 6435-6443.

174. Werner M.H., Gronenborn A.M., Clore G.M. (1996) Intercalation, DNA kinking, and the control of transcription, Science, 271, 778-783.

175. Wilson C., Dombroski A.J. (1997) Region 1 of sigma 70 is requered for efficient isomerization and initiation of transcription by E.coli RNA polymerase, J.Mol.Biol., 267, 60-74.

176. Wada Т., Yamazaki Т., Kyogoku Y. (2000) The structure and the characteristic DNA binding property of the C-terminal domain of the RNA polymerase a-subunit from Thermus thermophilus, J. Bacteriol., 171, 4852-4861.

177. Wassarman K.M., Repoila F., Resenow C., Storz G., Gottesman S. (2001) Identification of novel small RNAs using comparative genomics and microarrays, Genes Dev., 15, 1637.

178. Wassarman K.M. , Storz G. (2000) 6S RNA regulates E. coli RNA polymerase activity. Cell, 101(6), 613-23.

179. Young M.A., Beveridge D.L (1998) Molecular Dynamics simulation of an oligonucleotide duplex with adenine tracts phased by a full helix turn, J.Mol. Biol., 281, 675-687.

180. Yura Т., Nagai H., Mori H. (1993) Regulation of the heat-shock response in bacteria. Annu.Rev.Microbiol., 47, 321-350.

181. Zaychikov E., Denissova L., Meier Т., Gotte M., Heumann H. (1997) Influence of Mg2+ and temperature on formation of the transcription bubble, J.Biol.Chem., 272, 2259-2267.

182. Zhang G., Campbell E.A. Minakin L„ Richter C., Severinov K., Darst S.A. (1999). Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3A resolution, Cell, 98, 811-824.

183. Zhang A., Wassarman K.M., Ortega J., Steven A.C., Storz G. (2002) The Sm-like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs. Mol Cell, 9(1), 11-22.

184. Zhang Y., Zhang Z., Ling L., Shi В., Chen R. (2002) Conservation analysis of small RNA genes in Escherichia coli, Bioinformatics, 20, 599-603.

185. Zhang A., Wassarman К. M., Rosenow C., Tjaden B.C., Storz G., Gottesman S. (2003) Global analysis of small RNA and mRNA targets of Hfq. Mol Microbiol, 50(4), 1111-1124.

186. Zhang Y., Xi Z., Hegde R.S., Shakked Z., Crothers D.M. (2004) Prediction indirect readout effects in protein-DNA interaction, Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 101, 8337-8341.

187. Zhao G., Ceci P., Ilari A. (2002) Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA binding protein from starved cells.// J.Biol.Chem., 277, 27689-27696.

188. Zhurkin V.B. (1983). Specific alignment of nucleosomes on DNA correlates with periodic distribution of purine-pyrimidine and pyrimidine-purine dimers, FEBS Lett., 158,:293-297.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

189. Я очень признательна Сергею Вячеславовичу Чернышеву и Валерию Александровичу Яшину за помощь в проведении экспериментов по оценке активности промоторов в репортерной системе.

Информация о работе

Тутукина, Мария Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы