Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформирующий фактор роста бета и его роль в регуляции пролиферации клеток животных и человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Трансформирующий фактор роста бета и его роль в регуляции пролиферации клеток животных и человека"

АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ Б10Х1МП ¡м. О. В. ПАЛЛАД1НА

На правах рукопису

СТОЙКА Ростислав Степанович

ТРАНСФОРМУЮЧИЙ ФАКТОР РОСТУ р ТА ЙОГО РОЛЬ У РЕГУЛЯЦП ПР0Л1ФЕРАЩ1 КЛ1ТИН ТВАРИН I людини

03.00.04 — бюх1М1я

Автореферат дисертацм па здобуття паукового ступеня доктора бюлопчних наук

КиТв — 1992

Робота виконана у вщдш бюх1Ми кл1тинно1 диференщацП В1дд!лення регуляторних систем клтши 1нституту 610x11111 ¡м. О. В. Палладша АН Украши.

ОфщШн1 опоненти: член-кореспондент АН Украши, доктор бшлопчних наук ГУЛА Н. М„ доктор медичних наук, професоо БИКОР13 А. И., доктор бюлопчних наук БЕЗДРОБНИЙ Ю. В.

Пров1дна установа — 1нститут молекулярно! бюлогп 1 генетики АН Украши,

Захист В1дбудеться « 1993 р. о 14 год. на за-

Ыдашп спешал13овано! вченоТ ради Д 016.07.01 в 1пститут1 бкшмН ¡м. О. В. Палладша АН Украши за адресою: 252601, Кшв-30, вул. Леонто-вича,

3 дисерташею можна ознайомитись у б1блютещ 1нституту бюхшп ¡м. О. В. Палладша АН Украши.

Автореферат розкгланий < & з. &)__1993 г.

Вчений секретар спец1ал1зовано1 вчено1 рада, кандидат б'юлогйчних наук

О. В. КИРСЕНКО

IÄ ''"U j

Загальна характеристика робота

- Актуальнтсть проблеми. Трансформуячий фактор росту р /№Р-р/ - це <51олог1чно активний полхпептид, яку.Л регул»с не лиае npoii-ферац!» та дифгрекцхац1в кдхтин, аяе й прояв у них деяких *еноти-

гпчних ознак трансформац11, зокрема здатн1сть рости, незалсжно вз:д прикр:плення до су бстрату-гидкладки- (Roberts, Sporn, I?85). BiH впертие виявлений у 1981 poij (Hoberta '-t el., 19Ы) i очищения у 1983 poui (Anaano et al., I9S3), ТФР-д складаеться з двох однакових субодиниць з молекулярное масоо 12,5 к la кожиа, сполучеких Mis собой дису.подними з2"язками (Hoherts, s->om, ISZ5).

Необх1Дно вхдзначити, во м-РНК ТФР-р та специф!чн1 рецептори цього фактора росту виявлен1 у клхтинах вехх дослхджухзаних тканин ссав1пв (Derynck et al., 19в5, Boyd et al., 1990). Пераиншй структур! окремих 1зоформ ТФР-р хребетних тварин властиса висока ступень консервативности (Maas&gue, 1990). Ui та деяк1 i«ai особливостх дозволяить припускати, що ТФР-|1 мае важлкве значения у регуляцп кл1тинних npoaeciB.

Серед функцтоналъних особ яивостей ТФР-А сл:д, в перау чергу, ¡пдмхтити його неоднозначний зплив на прол1фератю клх тин-мхяеней. Показано, ао даний вплив мо*е бути не липе стимулйсчим, ал« Я ih-гчбуючим (Robert:;, Ззогп, 1?>35). Ця oiставима суттево /складное э"ясування спс*э*иьо1 рол! Тit'-/1 в органгзш тыдрин i лвдики.

Остановлено, ас ТФР-ft mov д!"ти не лиае in vitro, яле И in vivo, як iиг:С*тер n;\)5,vei»i ii кмтш бйгятьох тнгнь пухгин

(Roberta, ^¡Л1ГП. Гчч*> J , 5 ТЙХОЖ як с-имуднгор загосичя рин (Pierce st с2 . , I Пеплом!: ¡.;c,ci (:ioda, C'aaiiliare,

1989), тндуктор розпитку систем/, кровоносних судин (Roberta et nl., Г906)' та :муносугг;есор (?orre-A:".iorto et ii.. Г;',С >. Врахоиупчи lü дииi , дослЦнихи тднхмагть питания про гтрактичн« використаннл Tit'-fi у медицин! (Maaaague, 1990). Проте реал:эа-Ц1Я цих плвн1в суттсэо гельмусгься недостатки визченням факто-piв та умов, як! вплиаавть на скеропан!сть регулдторного вплль/ Ti>P.-|V на пролф"ря1:!г) к л i тик гЛзних тигиь. Молекумрк: исшт-ми, допоются «.».их дзгт iHtsi пол1пептидн1 (¡.актора росту (•Л 3 rieh, 3o!iio-jta,.;oy, 1Э50), э деяких причин не !Ндход*гь дл-5 noSriteH"4 особлияостсЯ р^гудяторко! fiii TiP-^.

I". д».»ичк, ы, прородклеся ;ania? j weroc iihü;,uv iar.TöjM га /мови, як1 пп.гнвичтj на характер д:1 Т1Р-(» на nроя!•■*,■• ;.at:iti, в iisbaocTJ l-ünu.'Kib оОмежуивлисм ол>им типом r.xzv.'.tt-Hi i/'чи

oAüi^r pery.^iTopiior. систписи, яка опосл:едчовус д:г uf.oro vi."cr<i;i

росту.'Тому доцгльним е проведения порхвняльних досгадяень э одночаснин використанням к1лькох тип1в кл1тик-и1шеней та вивчек- ■ кям у них деяких найбгльш важливих регуляторнях систеи, що локализован: у р1зних кл^тинних компартментах. Без результатов таких дослтджень вакко робити певнх узагальнення про фактори та умови, то визначають характер р1стрегулавчо1 дп ТФР-(5.

Ло недавнього часу залищалося невивченим питания про роль ТФР-л в enöpiorene3i, оскьчьки не було прямих експерияенталькмх дан их про наявнхсть ТФР-ß та його специф1чних рецептор1.в у oi-тинах зародк:в тварин. Слхд В1дзначити, ио tüki досл1дкешш а використанням кл1тин зародкхв представникхв такого великого кла-су хребетних тварин, як риби, зовс1м не проводилися.

Наканець, сл1д згадати i про надзвичайно високу варт1сть очицених препаратов ТФР-/5, що робигь його недоступним для акро-кого кола дослхдникхв, як! працюють в р1зних галузях öioiorii та медицини. Тому е вкрай необххдним вдосконалення метода зидх-лення та очистки ТФР-£ з метою його здевевлення.

Bei ui обставшш евхдчать про те, що розгортання науково*до-сл1дних poöiT, пов"язаних з використанням TiP-fr, s актуалькик i мае не лише теоретичне, але й практичне значения.

Мета та завдання дослхджвння. Головноп метов роботи було:

1. виявити меха|йзми, що мокуть визначати скерован!сгь' те зира-кенхеть регу ляторног дп ТФР-fl на пролхферашв нормальних i пухлинних кл1тин тварин i людини',

2. встаиовити, чи' пол1пептидн1 фактори з б^ологхчники властивос-тями ТФР-/1 можуть впливати на кл1тинн! Фунхцх: на печатковкх етапах ембрх онально. о розвитку тварин.

Для досягнення поставлено]! мети в poöoxi ставили так! основ-ni завдання:

1. отрямати високоочиценкй препарат ТФР-$;

2. п]йтестувати нормально, трансфориованг та пухлиши кл1тини рхзного походхення з метой виявлення кл1тиниих ainiR, asi наЯ-б1льш визначено реагуить на стимулвсчий або ¿нгхбувчий вплив ТФР-f» на кл1тинну промферацхю",

3. бийчкти вплив еп1дермального фактора росту /ЕФР/ та incysiHy на cxe;»Bnicxb та вирцжен1сть piстрегулюпчо? ДХ1 ТФР--*»',

4. виьчити вплив piзних умов культивування клп'ин на характер ix прол1фератнвно! вЦповш на д1ю Т§Р-Л» ЁФР та 1нсул1ну;

5. портмти особливост: функц^онувшшя деяких вцкливих ртуля-торних систем у кях-тиках, прол!фера1ЛЯ яхих стимул»егьсх чи iHnöyüTböi ТФР-А; . '

ь, тш w.v-i тп «О'ии очистите по пхпептялм! фактор-'

OTi'.>;ii KT'-j» ia эародк1в в"»ня- тл »станет.:-.; •; ■ ■.

pi;:;nuro;iis у ^p^itoas« .".."л tiduíx,

нсдг.чни сзбс-тк. ¿кяелеио, uto не лише ЕФР. але й

Л1Н може íw^st;- vr. Típ-/; i¡i;ry дягн-.я пр;:Ч/~ ;.::. р-

!т.Л')-1.к" i пух.«;;;!',» кл1?!;к т.ч\:1:я i ледг.ня. ТРх, !;:'•-;: р. с .....

г;-:.-'о г i а су «ином при стимуляци* суЛртртгчсглг? ¿то? • р_ ■•-',■ ■ . f:':"ii.'j С:Р 7 i, :¡e ч-мч, crio и i'!,: ■-: яч к tj '

, ■■:ч:-1'ь сео'.д '.ч:т;т одлого клону síhí: ПС-ЮЗ сарксмнох пухлини е tbkí , ао В1дрхзняються за скемяянтс™

Лм&ЛЛ н» »■»*> ""tp ,1. С„,;1 ь « ш ш»« «——у. »»»■ч-м ¡i ДС Г0Д1 Як íhbí - 1НГ1буатьоя.

^ено, во е уу.овах субстратзалежного росту клхтин на cxeposQ.il сть i вирзжекхсть Д1 х ТФР-А на бхосинтез Л1К суттсзс эпливае не лише тип кл1тин-м1шеней, але Я 'концентрещхя TíP-f. ra скроватг.й r.posi в оередовищ1, наявн1сть в ньому ЕФР i/чи/ ineyai-ну. грива Л1СГ& ди факторхв росту на кл1тини та кцльнхсть клхтии на субсграт1-п!дкладц1. В/.явлено також В1дм1шпсть в наслхдгсах Aix ТФР-fi на ппшферашп карцчкокних тин Jtt»'t «г,,.,

".ГЛ""" -¡кп;;:: гл, rvr' ,

■ Д!;'-.'.- ■ : -..-.■ ::v. vv1'"- /;¡>п" ' -d,•.■!■. ' >\-; ■ :р.' •. .

■■■•í р.-г'о-.':,-:. :. • ¡_____¡¡лиом*полид!оних протегназ у аабсапичен-

hí pÍ3Horo характеру ,aii ТФР-£ на пполь'вп<>чт«. р—-

. .!. . . ' ... ! 1 ... i и -ten КН Tft y¡/0»b!

^пстосусанпя ТФР-л пазиачавть окерованхеть прол1фератиь»01 í:Í;;ho-i дi хлхтин на дхя дано го фактора }»сту. . В'!-i;)птно noAicnivt« у Ае*м*х результату »» •••• •• - J - • :

...итгая и ИЛаЗШН.ОПО г. i Пии v

.... ______» .иjnoui оласгули т.кяв,*,».«i по/дпчп-

THAíli Р°М0ВИИИ, RIO ЬОТОДХПГЬ •¡•Í3HK0-*ÍMÍ4KHMH W, öi<>*ori'«M»^

»лзегимстяии. Ti-P-ß. У г.ni тинах гародк!э аього »ид/ ^'лдеглх рл'> 'Л'ихо.гяхнсГ! i cncüKí-i4hí pnicnro;..! 71-P-fi.

Практичне значения роботи. Модифхковано окрем! етапи вид1лен-ня та очистки ТФР-fi з тромйоцимв кров: cbhhî , во дозволило вдос-кокалити традиц1йниЯ метод очистки цього факторе росту, пхдвицив-ши вих1д К1нцевого продукта. Отрицаний нами препарат Т$Р-& вико-ристовувався в науково-досл:1дних роботах, як! проводилкся в Оститу« цитолог!! РАН /Санкт-Петербург/, 1нститут1 цитолог!: i генетики СВ РАН /Новосибхрськ/, 1нститу« канцерогенезу ОНЦ АМН Pi /Москва/, 1нститут: ÔioxiMiï АН Укрыни /Кихв/, 1нститутх проблем загально! патологй, онколоШ та paAioôioaoriï АН Украина /Mit/, Центральному 1нститут1 молекудярно1 dioxorix /Берл1н, Н1меччина/, Университет: м. Ростоха /Шмеччина/ та в !ноих наукових закладах. К pi м того, в:н вико ристовувався для викояання планових наукових Досл1джень у ВЪдоденн! регуляторних систем клхтани 1кститутубхо-xinix АН Украгни /1ьвхв/,

Узагальнекня отриманих в робом результате, «о враховують походження ктин-мхвеней, а також характеристики ïx окремих* регуляторних систем i* особливое« мкрооточення, дозволять* перед-бач..гк з великою ступхннп inoBipKocri скеровакгсгь вплаву ТФР-р "на проа1феративну активн1сть яормальних i пухлинних клхтин тварйн ' i людини. Ш данх необх!дно враховувати при розробш фармаколопч- • них препарагхв, у яких Т$Р-&'в поеднаннх з хншими факторами росту рекомендуеться для стимуляцН загоення ран та для пригнхчення' росту пухлинних к xi тик. •

Залролоновано використовувати визкачення в^дяошеиня BHyrpin-ньокдхтинних концентрата [camp] / [cGïïpJ при прогнозуванш пролх-феративнох активное« нормальних i пухлинних кл1тин тварда i лоди-ни. ■ • .

Выявления пол^пептидних речовин з властивостями ТФР-р, а також специфхчних peuenTOpiB цього факторе росту в кл1тинах зародив xocthctoï риби в"ена дозволяв эапропонувати цей об"ект в kkoctî альтернативно! експериментально! модел1 при вивченнз молекулярных механ!зм!в ембр!Онально]| ÎH4yxuiï мезодерми. Дания об"ект вимагас эньчно менвих витрат матер1бльних засоЛ'з та часу в порхвняннх з знании об"ехтами, во викориетовувться з uieo метов за кордоном.

Результата роботи викоркстовупться при читаннх спецкурсу "Мо-лгхулярш механизма регуляцП npoiiiiepadiï ть диференц^ацп клхтин" на xaiejpi 6ioxiuiï бходог^чато факультету Ль»1вського державного университету хмД.Франка. ÛKpeMi положения", ад витгкавть з рез^яь-ïtTib 1гроведсних досл1дхень, вклвче^ в опубд1ковану в спхвавторс-твд s професорон С.Й.Кусенем маногрвф!» "Молехулярные механизмы в действии полипептидних фаморо» poçTtt" /Ы., Наука, 1935; 236 е./.

Anpo6auifl робота та публ1каци. Основнх -результат дксертвцхй-HOI роботи допозхдалися та обговорювалися на УП Всесовзн1й нарадх ембр1олог!в /Лен1нград, 1985/, 1У Всесовзнону з"хзД1 онкологхв /Лен1нград, 196б/, У ГУ1 Украхнському б1ох1м1чному з"1зд1 Двано-Фрашйлськ, 1987, Кихв, 1992/, 17 з"хзд1 ендокринолог1в УРСР /ibsis, I98?/, Всесоюзному симпоз1ум1 "Молекулярнх та функцхональ-Hi механтзми онтогенезу" /Харкхв, 1967/, II i III Всесокзнхй робо-41Я нарадх по визченнз рол: иорфогенетично ~лтивних iasiopia у pi-зних процесах /Пудино, I9&S, 1992/, 1У Mi«Hftродному ¡co«rpeci з 1ШТИННОХ бхологх? /Монреаль, 1222/. Бсесоознгй нврадт "Ахтуаs.-„ui пктан.чл ;w",i Ти нн öi бхологхх" /Хе^нград, 1969/, Mirasродному симпо-siywi "Фактори росту: ix природа та роль в медицин^' /Берлхн, •1969/, 19 i 20 конференц1ях федераци европейських б1оххк1чних товариств /Рим, 1989, Будапешт, 1990/, Мхжнародному симпозиум; з иолекулярнох та клхгиннох онкобХологпЁ /Львхв, 1990/, Радянсько-фхнському симпстумх з б1ологхх розвитку /Суздаль, 1991/, Мхжнаро-дному симпоз1умх "Структура та функцхх регуляторних шшпеппдав" /Москва, 1992/, У1 з"хздх товариства геиетикхв i селекцхонерха iM.M.l.Baai лова /MiHCLK, 1992/,. пауковому ceninapi Центрального 1нституту иолекулярнох бхолог11 /Берлхк, 1990/, на засхданн: Ученох ради Институту öioxiMii АН Украхни /Кихз, 1939,1992/.

За материалами дисергаць1но1 роботи опублхковано 21 стаття, 2'i тези допов1деЯ та I моногрй-Ив /у cniBüaTOpcrBi/.

Структура п об"см роботи. Дисертащя складаеться зх зступу, огляду лттеретур! /6 ]х>эдх -'Лз/, опису матвр1алхв i методов /12 ро-здхлхв/, реэультптхв дослхдаеккп /12 рочлхлхэ/, обголорення результата /3 роздхли/, заключения, " га списку циграинох литератур-.! /365 джеред/. Робота викяадена на 274 сторхнках дру- • кованого тексту, 1ластрована 60 мггашсаин та 't таблиияии.

Матерхали та методи дослхдкання

В робот! використанх кл1тини таких Л1нхй: liiH-ЗТЗ i Swiao-313 з ембрхонхв мивл, ШК-49? хз нормально! нирки сура. CHG-7I9 13 яечниха китайського хом"ячка, ¡1T-IC80 хз фхброспркоми ждтм та A-43I э eMÖpioiAjtoi карциноми дядин.! /отриманх з кслекци г.й-■тинних культур при 1нститут1 цитолог!х РАЛ /Санкт-Петербург//, А-549 з аденокарциноми легень лвдики, CCI-61 13 караинами лег^нь норки /отриманх з колекцН култииних культур прм 1иститут1 канцерогенезу ОНИ АМН Р4 /Москва// та ПС-1СЗ /клони Збч/р i Эсб/ 1э сарксми, 1ндуковано! хмплантаще» полххлорвхнх ловох пластинки ки-вх лхнп СБА /лсб"язно наданх д.м.н. Ставровськов A.A./.

КJiiтини bcíx лтй, за винятком aiHiï ПОЮЗ. культивували в середовид! 1гла у модиф1кацп Дульбекко /середовите DUB, Flow lab., Великобританхя/ Í3 додачею 10? /за об"емэм/ сироватки icpOBi плодхв велико! рогато'1 худоби /"Диалек", Шнськ/. Клхтини л!нп Пр-103 культивували у медиальному середовиий 1гла (Plow Lab.) is додачев iOH сировагки кров! велико! poraroï худоби /Московсь-кий м"ясокомб1нат/.

Субстратнезалежну прол1фер&Ц1в кя1тин вивчали, використовувчи 40 ми пластиков! чаики Jlerpi, в як: заливали I мл середовища due, цо mí стило 10% сироватки кров! плод1в велико! рогато! худоби i 0,5% агару /Dlíco,США/. На таку гидкладку в кожну чашку вносили I мл GycneHsiï кл1тин /IoV, приготован1й в середовивц для культи-мування з додачев .0,332 агару. В залежное« в1д варианта досл!ду до суспензН додавали досл1джуван1 фактори росту. Чашки з кл1 тинами 1нкубували протягом 14 д1б в COg-TepMOCTa« в атмоофер1 5% COg i 95% пов!тря при 37° С i 1002 вологос«. Шсля завершения досл1-ду пхдраховували ылъысть кл!тинних коломй, вд мали в д1аметр! понад 50 мкм. •

1нтенсивн!сть субстрагзал?жного росту кл!тйн визначали в 24-лункових пластикових планшетах (Flow Lab.), до kokhoï лунки яких вносили I04 KJÍTviH в I мл середовица вые, но mí стило 10$ сироватки к ров i плод« велико! рогато! худоби. ni с ля прикр1плення та розпластування к*1тин /16 годии/ культуральне середовище míhh-ли на cBi*e, яке, в залежное« в!д BapiaiiTü до^ду,-mí стило до-сл1Д»уван! фактори росту i/чи/ písKi концентрац!! сироватки kpobí. Кл!тини !нкубували протягом 24 годин /або як вказано в умовах до-. ейщ/ в COg-TepMociaii. В ociaHHi 4 години ÎHKy6auiï в лунки додавали ^Н-тим!дин. PiseHb рад!оактивноск ДНК визначали, використовувчи загально прийнятий метод /Остерман, 1984/, не. сцинтиляц1-йному лхчильнику Marie III /Тгаког, Н1дерланди/.

Вид!лення та очистку ТФР-f» з тромбоцитов кров1 cbhhí зд1йснп-вали, використовувчи paHioe описаний метод (Roberts et al., 1984/ га наш! модиф!кацП окремих eianîj очистки. В результат! стримано препарат ТФР-р, гомоген«сть якого за даними електрофо-резу в пол!акрилам!дному гел: в присутснос« додецилсульфату нат-piс з барбуванням 6í*kíb азигнокислим ср!блом перевищуе 95$.

I-ТФР-р отримували, використовуочи хлорамин Т (Rufx, ríz-г!по, 1986). Рад!орецепторний анал!з, ковалентн? зв"язу5?,^1;я ^Г-ТФР-» з рецепторами, вивчення кооперативное« рецепторов TíP-Д » ÎX энижувчох регуляц!! (down regulation) здхйенввали

з допомогов загально прийнятих метод1в (Corin, Donner, I9S2, iiaasague, 19Б5, Scatchard, 1945, 'Snkofieia, 1927).

Процеси транспорту в кл1тинах вивчалп, використовувчи

клхтини, висхянх в 2**-луиочнх пластиков1 планвети.

Вмхсг cAMP i cGMP в клхтинах визначали з допомогов наборхв ф1рми АиегаЬая /Великобритания/.

Для отримання безсироваткових культура льних середовиц, кон-дицгяованих oi тинами, остакнх ви«пвали.у i лик: культуральнх флакони /"u.iciono, Данхя/ i ni едя доелгнення стану субконфлюенту культуральне середовиае видалядк, кл1тини 'пропивали дейдька раз безенроватколим середовкаеи i задавали ïx у ньому на Zh години. ni едя эамхни цього середовища кл1тини хнкубували .в безсироватково^ му середовиви на протязх 48 годин для кондицховання. •

Теплову обробку кл1тин здхйенввади при 44° С на прогяэх 30 1 хвилии. Збирали кондицхйозанх середовища, отриман1 через рхзнх i проыхжки часу /46, 24, 12, б, Ч, 3, 2 i Î година/ niew припинен-ия rinepTepMiï.

Едектрофорез у шшакрилан1диоиу геях в присутноси додецид-еульфату Harpie зд1йсяввали за иетодом'Лемиях (Laonmit, 1970) в пластинках геля з градхентои концеитрацН акридамхду а1д 7 до 11%.

Процеои б1осинтезу б1ДК1в у клх тинах визчали за вклячениян •^Н-лейцину в клхтитп бхлки або 35s- метпон1ну в ospeni бхлков! ^ракцхх, отримаигза допоиогов електрофорозу. В первому випадку рад1оактивн1оть проб визяачали, вккористоэуючи сцинтиляцхя.чиЯ л1чильник, а в другому - за оптичнов гут«нов рад: «автограф i я глектрофорегрзм.

Активнхстъ серинових прогехпаз у концеитрованих ультрафхльт-рацхев /Amlcon;,' США/ кондиц1йованих культуральних середовицах вязначали спокгрофотаметрячпо при довжи'нх xbiuî ')05 ни, ьикорис-товувчи синтетичной субстрат г&-йла-ала-фен-арг-параихтроанхлм /Дхагностикум; Москва/.

Визначенкя рхвня м-РНК протоонкогенгв c-nyc i c-îaa зд^скв-вали пхедя отримання суиарнох oîthhhoï РНК, використовувчи метод, описаний Б1рнбоймон (Birnboin, iges). РНК .вхддх ляли 31Д Х'Я ви-бхрковим осадженняи у cyMiai bici/етаноз. РНК, дензтурогану форы-вмхдом, наносили на пейлонову п!дкладку i "приаивам" з допомсгся опрон!нення ультрафхолетОЕ!« евхтдом. JUffi-проби,, ко ni стили гени с-тус чи v-fos i булп мхчеях ^-р, о^'римувади за допоногоа иего-ду випадкового праЯкера, використовувчи Ha6ip ф1рми лявгвйаа. Гхбрю'.звцхю 32Р-ЛК з РНК, ïmo6îлхзованов на нейлоновому ф!льгр1, здхИомпвали, використоаувчя эагвлько/'приЯнятиЯ метод/йанивгне та ;н.. I95V. Рад!оавтогра{и скануваля на лагерному дгисатомагр! '

СЗ-9000 /Shimadau, ffnOHis/.

Зародки в"юна отрииували за допомогов методу, запропоновано-го Нейфахом /1959/. 2ародки хнкубували при 20° С до досягнення ними потрхбно! стадт? розвитку. Прогеазочутлив! фактори з власти-востями ТФР-fc отримували за допомогов методу, описаного Роберте та спхвавтор^ми (Roberts et al., 1904). Б1одог1чну активн1сть ТФР-£-под1бних факторхв ig зародив в"вна визначали, використо-ВувЧИ КЛХТИНИ, чутлив! до pi стрегули)401 Д11 Tip-f

/ф1бробласти лги:! ffXB-ЗТЗ, карциио»ш кл1тини лхн1х А-5^9 х са-DKOMHi ХЛ1ГИНИ лхнхх ПС-ЮЗ /клон 364/5/. Специфхчне зв"язування

I-T$P-fb свинх клх тинами зародив в"вна вивчали за допомогов загально'П]мПнятих метод1в (Scatohard, 1949, Maeaague, 1935, Wakefield, 1907). •

Кожний експеримент повторпвали 2-Ц рази з 3-4 паралельними до-слхдами. Кокка точка наведених Д1аграм та ордината гхстограм bir-пов!дае середньому значению 3-4 виыхрввинь в одному з декхлькох однотипних експериментхв. По pi в пяты двох змхнних величин зд^-с-ниводи на ocHosi ь-критер1о Стьвдента. В дисертагиййа робом .говориться про зихни шае в тих.випидлах, коли Р<0,05.

. Осиовнх результати досдхджень I. Валив T§P-ü> на субстратнезалежну пролхферацхс кдхтин

Бхолопчну активность ТФР найчастхое визначавтъ, враховувчи ix ада mi сть 1ндукувати субстратнезазежну продхферацхю нормальних клхтип (Roberts, 'Sporn, X9S5). 3 цхев метою кл1тини-м1шен1 ih-• кубувть у капхврхдкому культуральному середовивх, цо н1сгигь 0,33% агару. За таких умов пролхферативну активах сть оцхнввть за кхльххст» холонхй, якх утворвються в результат! багатьох мхтотич-них подхлхв окргмих клхтин.

3 рисЛ видно, цо вех досл1дкувам нами клхтини» враховуочи характер ix пролхферативно! В1дповш на д1в.Т§Р-£, могева роздх-лити на три типи: I. псевдонормалы« фхбробласти та фхбробластнх клхтини /iiKii Й1Н-ЗГЗ. Swlso-зтз, СНО-719/, «о не

CMiHooTb пролхферативнох аг.тивностх П1Д впливом самого ТФР-р) 2. клхтини з саркоыних пухлш /лШх HT-iOSO i ШМСЗ /клони" 3SV5 i Зсб//, «о стицулввт-.ся ТФР-ц; 3.' о!тини з карциномно1 пухлини /iiHis А-549/, пролх^рацхя яких iHridycrbcfl

с розумх ло, цо in vivo доден з фактор!в росту( зклвч^ >',7т: не Ai« на кл1тини окречо в1д ihohx бхорегуляторхв.' йрахо-вувчи вироку розповсод'«н1сть в органхзмх соввщв ЕФР /Никольсь-кай : in.,, 1937/ та iHcyainy (Klss» Kein, 1935). ии виЬчили snsaa til TtP-jt разом a ЕФР i/чи/ хнеулхном на 1нтенсивн1сть йубо^рагнезалежлох npoiiiepami вндв/згаданмх к«тмн.

колони КД1ГИН

зсс

2СС

1СО

кокнп г.л1тин

600

5С0

СО .503

100

колонн кл1тин

700

I ; 600 500 400 300 200

100 -

I. 1_

-X.

С5 С.5 5.С 50.О

О 0,05 0,5 5,0 50,0

I

»

О с.с-з 0.5 5.0 50.0 тер-¡4 , нг/м*

РасЛ. Впдиз ?4?-ь на 1нте1!сигн1сть субстрагнезалехкох пролтферацЛ хл1тин рхзного походяення: а - псоэдокогиа.".ьн1 к .лги ян .(1 - ккк-49Г, 2 - :ин-ЗТЗ, 3 - Бъ^аэ-ЗТЗ, « - СНО-719) б - ."¡¿панк з саркокклх пухлкн /I - ПС-ЮЗ /клон 334/5/,. 2 - ПС-ЮЗ /клон Зсб/, 3 - НТ-1С8С/ » - к-ими з харцинонно! пухлимк /А-549/

ТФР-р, нг/мл

• Рис.2. Вплив ЕФР на 1нтенсивн1сть субстратнезалежно1 пролхфе-pauii" кл1тин л!Н11 NRK-49P /а/ та хнсулхну на 1нтен-сиенхсть субстратнезалежнох пролхферацп клгтин лхнп CH0-7I9 /б/

а - у вхдсутностх /I/ i в присутностх /2/ ЕФР /2,5 нг/мл/ б - у вхдсутност1 /I/ i в присутност1 /2/ 1нсул1ну /I мкг/мл/

Встановлено, то пролхферашя клхтин, ям не реагують на Д1в самого ИР-а. як правило, стимулпеться-при одночасмй Ai'i на них ее й ЕФР. Ha86iльи чхтко це виявляеться у випадку з кл^инами лхнН Ш1К-4911 /Рис. 2, а/. Виня ток станов лять кл1тини лШх CH0-7I9, як-i на масть специфхчних рецепторов, ЕФР (Todderud, Carpenter, 1909) i тому не зм1нввть своех прол1феративно1 активности у. при су тност1 cyMimi T5P-|J з EIP, але пом1тно п1двищують ii при д:х cyMiui ТФР-/& з 1нсул1ном /рис.Е.б/.

У тих випадках, коли сам ТФР-/ь стимулюе чи iHri6yc субстрат-незалсжний pi от /вхдповхднс клхтини з саркомиих та з карциномно'х пухлин/, характер дП ЕФР суттево залежить в1д концектрацхх ТФР-/4 у культуральному середовиди. $ цих клтнних системах ЕФР досто-вх рнс не впливае на регулятор« ефекти ТФР—/ь при концентрац1ях останньего 0,05-0,5 нг/мл, але перешкодкае прояву таких ейекттв, во хндукуЕТься T$P-/i ti концентрациях 5,0-50,0 нг/мл.

к0л0н11 кдхтин

500

600

«30

2

Рис.3. Вплив на хнтенсивнхсть

субстратнсзалежно! прол1фера-Ц11 клхгин лШх ПС-103 з сар-коми мишх

1 - клон Зсб

2 - вих!дний клон 384/5

3 - 'субклон клона 364/5

I

300

200

3

100

О 0,05 0,5 5,0 50,0

ТФР-р, нг/мл

При додач1 до кудьтурвльного середовица та хнсулхну зи-

яв лено, [До останн!й не впливае на дхв ТФР-/) У тих клхтинних системах, як: не змхнюать своех прсшфератипнох активное« в приеут-нос« самого ТФР-,4. Лиое клхшю; лхнхх СНО-719 стимулююгься до прол1феьац11 при сгидыиЛ дхх 1нсул1ну та ТФР-/» в копцентрацп 5,0-50,0 нг/мл /рис.2,6/. На р1 ст кл1г.1п, ;зо волод!ють чхтхо в^-раженоо прол1ф8рлти«ноп вхдповхддв ч» самого Т4Р-.Я /пухта:;::! клхтини лппй НТ-10Е0. ПС-ГОЗ, А-549/ сумхп п<сул1ну та ТФР-р впливае подхсно до того, як це роблть сунти Е5Р та Т*Р-р.

У випадку одночаснох дхх на .дослхджуванх хлхтини трьома факторами росту - ТФР-я, Е?Р те тмсулхном'- ефект в ко,«юну ок;«ко взятому вартан« досдгду е разним, хоч у бх лызос« зипадкхз я:« ясс А подхбнаЛ НО дго та ЕФР.

Бстановлено /Рис.3/, що пролхферацхя саркомних клхтин клоихв 384/5 I Зсб лги!! ПС-ЮЗ, шо характеризуются низькс» виххдиоь хнтзисивихсто субстратн»залечного росту, стинуг.пстьея Г',■?-■"■■ У той «е час ярол1;'ервц5л клхткн субклон», со от;.и*ан«'. ивчя •» ил 364/5 х х&рз*тв;я'зу«тьс& аасоков хнтенсивнгстр иь^го '-у, суттвво хнгхбуптьсл ли!!;«! фактора ¡юсту.

Таким чином, ьпмя К'Р-р на скероваи1сть та вирадел!сть «ро-(ср&тидио! вхдповхдх клхтин заложить не лиое вхд тканиниого, але Я вЦ клепального походдення кл1тин-м1аеиеЯ( а такол вхд одно-часнох ди на них 1нэих фактор1в росту, зикрвиа, Е$Р та хнеултну.

2. Вплив ТФР-рна хнтенсивнхсгь бтосинтез? IHK у к ai тинах

за ртзиих умов ix субстратзадекного росту

Для того, цоб з"ясуватй, як вплявавт» умови хультивування k*í-тки на скерованхсть та Еиражен1сть pi стрегухввчо! ñi'i T$P-f>, зру-чмве проводите дослхдкення а Бякористаикям ыоноаарових культур кмтик. У таких досидьх picTperymnsy д1ю.окреиих факторов росту, ях правило, оцхновтьза ххвпливомна вклачения %-тимхдану в ДНК клхтин-MÍneHea.

Встановлено. що вплив КР-р на tíiocKHrea ДНК в клхтинах мохе суттево залежаги В1д ix звбезпечевоотх факторами сиро ватки кров1, що додаеться до кульгурельного середовяца. Так, ТФР-f не впливае на хнтенсивнхсть цього пронесу в псевдонорнпльних oi тинах iíhíi 1.ПК-49Г при !х iwcydauii в середовицх. ао mí стить' 10% сироватки кров i плодхв велико! рогато! кудобн, аде стимуяое Boro в умовах ix го строго деф1циту /0,1%/• Карциномм кдхтияи л i nil А-5 49, помх-кенх в середовиие з 0Л% сироватки кровх, також стимуявються TSP-/J, хоч í в значво менмй Mipi, Hia кл*тшш ainií HRK-49P. Проте, на вхднхну в1д останнхх, карциномМ кл1ткни названо! niHÜ iHriöysib-ся Tä>?-fl при ix iHKyöauii в сервдовивгё, добре забезпеченому сиро-ваткоо KpoBi /10%/.

Звергае на себе тпкое уш"гу эначно мени ьир&жений хнпбуючий вплив ТФР-р на pier карциномних кдхтин nitííl'k-549 приüx кудьти-вуьанпх в MOHomapi'B порхвняних з тим, що спостерхгаетъся в умовах н&пхврхдко! культура.

. Зйбробз&сти si'ui« MIH-3T3 i ЗиПая-ЗТЗне рвагувть на дхв ТФР-р незалежяо вхд концентрацх! сироЕатки Kposi в культуральиому сэредо-вицх. Проте, коли на ixi кмтиии даятй ТЗР-Р У поеднанм з ЕФР í/чи/ хнеул^ом, то в окромих sapiauTax досл1ду все ж виявляеться регуляторами вплив Отже вхдеутнхеть впливу ТФР-А на бхосинтез ДНК в клхтинах га на ix пролхфврацхв це «е озвачае, ¡до Д1Я цього фактора росту не виявиться при шшшостхв середовицх íuümx öioperyjwro-• piB, якх, до реч1, самх no coói м^хуть бути неактивними.

Нами тако* вивчеио вплив ТвР-р то йиго поеднань з ЕФР i/чи/ хн-cyxiном на включения 3Н-тим1дину в ÍHK клхтин лЬпй HIH-3T3 ' та мнх-45? за умов pisHOi триьалос« !х BsaeMOÄÜ з цими клхтинами. {хбрэбластк лхнх! Kiil-ЗТЗ ^кубували прюгягом 2«» та 72 годан^в се-редовицх, «о mí стило 6Í сирог тки Kposi плодхв великох рогато! худоба. Показано, до ТФР-^ достоверно не впливае на 5хосинте$ з цих клешах, «о 1нкубувться гротягом 24 годин в присутносп Е$Р /рис. V. Проте ni едя збхльаенш часу 1нкубацй до 72 годан цей пронес суттсво iHriöj'ctbci.TSP-a. причому такий ефект mítko' виявляеть- , ел лизе при використанн! вхднссно внеокох концентрац1! Т5Р-р -. 50 нг/мл.' •

i «пульса за хвилину

Рис.'). Вплив ТФР-£ на 1нтенсивнхеть

TOCO

SOOO

'iOOQ

вквзчення -,Н-тим1дину в ДМ фхб-potíMiCTÍB лх нi i Я1Н-313 при хх ÍH«y6auií про тягом 2'» годии /I/ ra 72 годин /2/ в кульгуральнсну середовии1, wo mí стило 65» сирояа-тки кров! пюд1в велико'! рогатох худоби та ЕФР /2,5 нг/мл/

2000

.Í000

I

2

О 0.05 0,5 5,0 50,0 •

T5P-(i, нг/мл • : .

Кл1тини л1нхх ННК-49Р хнкубувади в середовиц!, що м!стило 0,1% сироватки Kposi, протягон 24, 46 та 86 годин. Показано, »о при iiwyúaulx цйх клхтик у присутностх Е$Р нас мхсцз

сти»у,пя'гм" впив T?r-jV на бз о синтез ДНК, я при бхльз триза&и т i; r-cyóR 'i i 'sx /'iS та К годин/ ТФ Р—не ВИЯ 2 ЛЯС тв кого впш/.

Прч одно час;:..! пхi' 1W-A та хнсудхну на илхтиия xi4i»i :;хн-;-тз та как-у деяких хшпздках хнтсксивнхсть сЯосиитазу )Ж та;:оп грива e-i si«-.- <•>»»" ;;;:хтин ч чагв&их::»

да морлг:.; росту,

Вогожплшо. КР-Г- Г<? гпя^пс ;п хитемсигнють úi о с:-; s-

тазу У ФюрЗластах aiuií Sür-t.j&-323s n¡o- Ьнгуоувтьса ьа умов xx píahi)i щ1льноот1 па субстратх-идклад!«.' У той se чао выявлено cyiTSBi BÍ»MÍ!»»»>eTÍ'5 «г.огл фактора росту njatyxivcji DP.i/•:;:/ ÍRcyaijsy :>.% укез pi/-ísíx /jo'® тин/2 с«2/ n 2.»<í¿<wi /I0J r»¡¡/'¿ cx'V ::;дмур. Так, у першому випадву WP-/» доэоза-лекно ÍBri6ye бхоскнтсз. ЛИК, ¿кдукований Е$Р. У другому внпадку ЕФР не гпливае т бхосинтоз ZHK, зата incyai« стимулас йсго, а T§2-¡i в концентрам? 5,0-50,0 trr/ил inmija сгимугмчу .гдг, су«:-r;i ÍKCjíiity tí K'iP.

Or-.e T'ÍP-,í •/.•ipjKvojaaycibce иадэвичайноо' pisHOMaxtrníers тр-явхв р! стрпгу itD40Í ,*_ix. Току с as рой необуДдиик проведет»« мое-.пдяснь, приезм-шках гивчгнкя .-»лхтшшкк регуяаторт састзк, ят О!юсарздковують-рхзння за скеро1>ан1стз впяия TíP-p на npojsiíopa-тивну ajcTHBHÍ сть хл1тин тзаркн i дздини.

3. Вплив ЕФР та iHcyr.iHy на специфике зв"язування ТФР-Р

Враховуючи данх про вхдмхиностх мхж кл1тинами в ix пролхфера-■гивмй В1ДП0Б1Д1 на ТФР-Р та про модуляц1ю ЕФР i/чи/ хнсул1ном Кого pic?peryjacD4oi дхх, ми вивчяла вплив наэванкх фактор1в росту на функцхокунания окремих регуляторних систем у рхзних типах ¡ш-тин-м1ыеней. В1домо, до (Иологхчна дхя ТФР-д,'як, до реч1, й Д1Я будь-якогохншого пол1пептидного фактора росту, починаеться вхд Пого зв"язування специф1чними рецепторами плазиагичноХ мембраии кл1тин-мхшеней. Ми дослхдили зв"язуванкя ТФР-р кдхтинами лхнхй КШС-49Р та А-549, мхж якими виявлено суттевх BijwiHHocii в ix прол1феративнхй в1Дпов1Д1 на дхю цього фактор росту.

3 табл.! видно-, що клхтини aiHii тгЮ£-49? мавть приблизно в 5 раз1в бхлыае рецептор1в Т$Р-> у порхвнятй з кл^инами лШх А-549. В кAiтинах nepmoi niHii iHcyniH збхльшуе кхлькхсгь центр1в зв"язування Т5Р-0 , а сум1ш хнсулхну з ЕФР зменшуе ii. У той же час у кл1 тинах друго1 л1Н11 законом1рностх smihh цього показника е зовсхм хншими. Тут ЕФР эбхльшуе кхлькхсть'рецептор1в Т§Р-/з,-а pisHi поеднання досл1джуваних фактор!в росту достовхрно не вплива-вть на нього. В ycix цих випадках к^ рецептор1в Т$Р-£ суттево не змхнветься. Таким чином, наведем дан1 свхдчать про 1снування В1д-мхнностей м1ж кланами лхнхй 1ШК-49У та А-549 в характер! транс-модуляцхх рецепторхв ТФР-Я п*Д вп'лнвом Е$Р 1/чи/1нсулхну.

В клхтинах лхнхх HRK-49? нами також виявлено знижуючу регуля-uii) (do*n regulation) кiлькocтi peuemopiB ТФР-я. Встановлено,' що прехнкубац1я цих кл1тин протягом 2 годин при 37° С в присутнос-тх немхченого Т§Р-£ викликае зниження на 47? рхвня специф!чного зв"язуванкя ^^-Т-ТФР-р. Цхкаво вхдзначити, що приблизно таке ж за величиною зниження рхвня 5виязування цього фактора росту спостерх-гаеться при дхЗё холерного токсину /10 нг/мл/..

Використовувчи метод, що заснований на визначеши Kiнетики ди-■ co4ia4ii зв"язаного Mi4eHoro лхганда в ггрисутностх та у в^сутнос-Ti немхченого л^анда в середовивл (сопл, Dormejc, 1902), ми ви~ кьили, до зв!льнення ^^I-TiP-p вхдзвмязку з рецепторами клхтин siHii КйК-49? вхдбуваеться бхлыа ¡нтенсчвно у першому випадку, нхж у другому. Максимальна рхзнкця досягае 15% i спостерхгаеться в пе-poi 5-50 хвилия хнкубацП oi ш. Ili дaнi вказуеть на зниження спорхдненостх рецепторхв до Т5Р-р за умов ix наси ;ння л1гандом, до дозюдяе лрипускати хснування явица негативно1 кооперативное« рецепторхв даного фактора росту.

Таблиц* I.

Зплидэ Е2Р х/чи/ !нсул1иу на кхлъкхсть центртв зв"яэу»ання

125

та ка рецептор!» ТФР-р. в к«тинах лШй -49? х А-349

Клхгини : Лодаи! £актари росту

лькхсть цент-: в зх)"язуьаиня:

:Кх

:шв

в

:клхтин1

К„,ПМ

-т ?с, '

+ ЕФР

5251-ТФР-.* • х псу и .ч

едзси ± ЗССО 27,3 ± 3,0

40900 ± бОСО 24,3 ± 5,0

61200 ± 90СС* 25,7 - 11,0

5?51-ТФР-» * + 1асулхн 31300 * 40С0* 23,6 * 6,0

• А-5 49 9700 + 7С0 27,0 ± 6,0

+ ЕФР 216 СО 900 * 32,7 £ 8,0

1251-Т$Р-|» + хнсулхн 13200 600 31.4 + 6,0

> Е§Р + хнсулхн 14400 ПСО 27,2 ± 5,0

4. Вплив ТФР-уа та ЕФР нз транспорт Са2* в шя тинах

ТИдоио, «о гре.е вадливу роль у г-обозпечснн: нормального

Фунмп онуьания <5агат»->' уиттево де«лнвкх процесхв у кпт/.ках тза-рин I С-тл-л::: ,.н\1, ХР'б 9). Тому було ;,сц1 ль:!/.» ьпвчи

та КИ* ¡¡я ьз-.и'-л с? ь проникиеияа Са""1" V клхтиии га зэ^дк.х с,-« ".кстгуц!! цьогп к': :•> о" : я поза.:;;! т^нич ^ярсдо! Э ВИХОрРСТЭНН*» ¡«л.'Г'.ч, г; о Хс1""Т'\г":'-V тьз,*; рх ■ пг" " V . чт дп'я!.;.^; ;;-.

гли И'?-л.

;•!:: об"!":;'.т ,т.м до ¡-.и орнстаг.и ;к>.'и."0!юр(!а;ЛН1 :<Л1'П!--

»:» :: 3 га «йк-45?» а та кож хорцшюмп кл1тл;ш лхнхй

Л-543 га СС1-64. Для клхтин Усхх цих лхн1я виявлено однакову законом! рнхсть, яка поквгле у п!в-,"''¡ниI овидлост! г.^оцигк«чнл С* ¡. ~лт ;лх и«, Гл7?-р чн При спхл.пы ,;:х а:

тори росту, >:й ирлвкло, зикликавть бхлыае зростаиня ввидкост! транспорту Са , 1пк при дхх колкого з них окрема.

Впг.ив ТФР-£ та Е$Р на екструзхв Са2+ ь позаквх тише середо: иге вивчали теля попехедиього "кгсзита кл! :г.а ^С*^*. Лохг.!.!.!.,,

«о для к/Л гйи х1нхк л р х А-549 характере ым-.,и-. •

ивидкооп ексгрузп Сас* гид вилааом сум1ги ИР-д та сФР . тол: ч'.< хлх тиии лхнхх ССЗ '» и« я род и ляг.ль тахох уа.гонснх рностх.

Зплив П'Р-а , КГ, тису ¿хну та м}льатли кров! на ли; ст сАМР та сС-:.:р в клхтпнвх

Результат» визничсння зпливу Т4Р-(Ь 1 р1зии< Я',;го посдаамь з Е!'Р та i¡^cyлiнoмJ и також скролагки крсв1 на ек1ст сА.4? та сймр

в карцнномних клхтинах лШ| А-549 i в псевдонормальних клтнах лхнхй HIH-ЭЕЗ i SSE-49Í' наведен! у вигляд! вхднооення виутрхш-ньоклхтинних концентраций [одш>]/[осар] /табл.2/. Та кип сналзз дозволив виявитк деякк uíkbbí закоиомхрност!. 3 табл.2 видно, цо в.слнчина [caüpJ /foGiipJ е значно бхльиов у псевдоноркальних клх-тинах лЫй 'HH-3S3 то ШС-49Р, н!к у карцнномних клхтштх ninií Л-549. Ця bíamíhhíсть Головины чином зумовлена суттсво виции вихс-тоа с cap в пухлинних клхтинах у порхвнянн! з псевдонормальнши кабинами. В ^лому, тшсий стан збе]рхгветься i пхсля дх| на клхти-ни piaiwMH факторами росту, хоч типи клхтин вхдрхзнявться мхж со, бос за виражекхсто впливу факторх» росту на вказоне вхдношення. Так, при досл1дкеннх карцикомних клхтин лхн!х А-549 нами не вияле-но впливу ТФР-р на величину вхдношення [aAns)/[cWí], тодх як ЕФР та iHcyaia, а'такогрхзнх поеднання названих фа к то pi в росту з T$P-|i викликшоть змениення даного показника. В той же час 20? си-роватка кровi хндукуе в цих kxíтинах збхльвення в1дношення [cAKPj/[cGiíPj.

1ниа картина спостер1гаеться для фхбробласмв hih-ЗТЗ.

• Тут вех фактори росту, що вмкористовувалися поодинц1 чи в рхзних поеднаннях, за винягком тих, до складу яких входив iнсуsiн, вик-ликали збхльшення в1днооеннл .[caupJ/IoGIO'J i лише дхя сироватки к ров i веха до його зменаення.

Д1вчи на кл!тини л!нхх HHK-49S» сам ТФР-р та сам ЕФР выкликали эб!льшення величина [ciUPj/foCHP}, тодх як pÍ3HÍ поеднання дослхджуваних фактор1в росту, в першу черту tí з них', до складу 1 яких входив 1нсул1н,вик ликам» змениення uici в ели чини. Як i у ви-падку з клх тинами ííhíí НХН-ЗТЗ,. 20% сироватка KpoBi в кл1 тинах дхнЦ • влк-49? зменшувала величину [oAkpJ/[cGifip].

Таким чином, нами виявденх суттевх bíamxhhoctí mík карциномни-ми клхтиныт »íhÜ А-549 та псевдонормадьними кл!тинами лхмй S1S-3T3 i HHK-49J не лише в загальному вмхетх в них сАМР та cGMJ1, ase i в характер! bmíh внутр!аньскйтинних концентрацхй цих щпшчних иухлеотид!» п!д впливом ТФР-р, ЕФР, ÍHcy«ÍHy та фак-Topie сироватки кров! плод!в велико! рогатой худоби.

6. Вивчення аутокриннох регуляцхх npoxiftepauií клхтин

Результати, наведем в рис.5, свЦчать про те, цо карциномнх клхтини л! их i А-549 кондицхю^ть безсироваткове середовище регуляторами росту xxíthh. niew 2-4-добового кондицхв^.ння в культура-лькому середовивх виявляються перевакно стимулятори росту. В той же час nica* б-добовог'о кондицхювання, коли виникавть умс^ до несприятливх дм kxíthhhoí npoíi$epauii /велика ихльнхеть kxíthh на субстрвт1-о1дк*адц1, эниження величини рН середовища/, в конди-

Таблиця 2.

Вгши Tí?~,3, ti?, ÍHcyjiiга еирвагкк кров! плодхз велико! рогато! худоби на величину в1дношення концентрата [сАМР]/;ссг;р! s к «i тинах разного походаення

.'ЛН1Я кл1г,;к [cAMPj /[comp]

' Л-549 3,4 3.1 : ?Д : 2,4 : 0,7 : 1,3 : 1,6 : '1,6 : 6 4

niü-3t3 34.7 oí ,6 : 9¡'.c ; 237.0 : 35,5 : 37,4 : 33,0 ■: 46,0 : 1 0

NHK-4 9F 103,7 ÏSC.0 : ¿50,0 : 2с.9 43,2 : 83,3 : 5.7 : . 0,3 : 21 6

!{?-£ ' - + - : + : + - + -

V* Р с - - * * ' t- : - : : : + : + : -

i ксулхн - : - : - : + :' + : + : + : -

ch;oestko кроь - - : : - • : - ' : : - ■ : +

250

200

150-

100

50

t

ib

fi

ib

i

íl

i

i

123 4567 8

Рио.5. Вплив ТФР-р га безсироват-кових кондиц1йованих'середовии, отрицании за рхзних умов культивуван-ня карциномних кл!тин лхн11 А-549, на íhtchchbhíсть вклочення -^H-thmí-дину в ДНК к ni тин uiex к aíhíí /по oci-ординат - % вхд контролю/

1 - контроль /CBÍxe безсироваткове середовище/

2 - 2-добове кондищйоване середо-вище /рН 7,2/

3 - 4-добове кондищйоване середо-вище /рН 6,9/

4 - б-добове кондищйоване середо-вище /рН'б','3/

5 - кондицхйоване середовище /рН 7;2/; закислене до рН 4,0 з до-поиогов пропускания СС^

6 - кондищйоване середовище /рН 7,2/, закислене до рН 2,0 з

допоиогос титрування НСГ

7 - кондищйоване середовище /рН 7,2/ з додачею ТФР-/5 /20 нг/мл/

8 - евхже безсироваткове' середовище-з додачев ТФР-jj /5 нг/мл/ /перед використанням- рй yoix культуральних середовищ доводили до 7,2/

цШованому середовищ1 виявлявться й хнгхбхтори росту. Деяк1 з цих XHri6iropÍ8j очевидно, наявнх в латентно формх та кож i в 2-добовоиу кондицхйованону середовищх. Адже показано, цотиича-сове закислення цього середовища перетворюе його з р1стстимулх>-вчого у р1стхнг1бувче.'

У безсироватковому кудьтуральному серёдовищх, кондицхйова-ному клхтинами лхни ПС-ЮЗ /клон 384/5/ з саркоми миш1, тако* виявленх речовини з властивостяии фачторхв росту. Вони частко-во очиден^ з допомогов гельфхльтрацН наколбшй, наповненхй бугелем Р-30, з елхдаев I М CHjCOOH. Отримащ речовини стиму-лвоть субстратнезалежну г|ролхферацхю-кл1тин лШх ННК-.49У i хояхурупть s за специфхчн1 рецепторы останнього на

клх тинах лх нi í A-43I.

У середовиви, кондишйованому псевдоноркальними ф1бробдас-тами xíhíx КШ-ЗГЗг мхегагься речовини, якх стимулюгл> си.чтсз J2K У цих кл1тинах то в карциномних кл1тинах лхнЙ л-549. Виявдено, по тимчасово закислення цього кондищйораного сере-

довища не змхнюе його р1сгрегулоючих властивостей по вхдноаеннв до кл^ин л1н1й яхн-ЗТЗ та А-549.

7. Вплив rinepTepMÍ4Hoí оброо'хи клхтин на íx аутокркннх функцхх

Виявлено, що гхпертермхчна обробка /44° С, 30 хвилин/ псевдо-нормалъних км тин júhíi та пухлинних кл1тин лх ftifl А-549

i ПС-ЮЗ /клон Зоб/ по р1зному впливас на j\ аутокриннх ií

/секрецхя речозин, якл регулоать Зхосинтчз .ДНК та бхлкхв у клхти-ках/. Найбхльш .суттевх змпш у виражвност1 цих фунюпй характернх для клхтин ninií А-549. Псглз&ио, то кондии^йовано серсдози^е, отримане через 46 годин nic.-.т пртаисшш *i'i теплового ¡соку на кл1тини flÍHii А-549, в 3,3 раз акгишпае стимулис бхосинтез Д1К, 'н1ж звичайне кондиц1Яоване серсдоаище. ni едя тимчасового закислен-ня р1стстимулюпча активнхсть цього кондиц1йованого середовища втрачаеться. Бхльше того, дане середовице набувае здатностх хнг1-бузати б1осинтез ДЖ в клхтинах ninii А-549.

Середовища, кондиц1йован1 клхтинаки лшП А-549 протягом 1-4 годин п1сля теплового поку, хнг1бувть синтез t5iлкхв у цих клейках, тод1 як T3KÍ я середоэиша, отринан1 протягом в, 12 та Í8 годин, стимулювть це:? процгс з 1,2-2,1 раз. Тимчасове закисле'ння визе названия середов;»:, викликае П1двишення хх здатностх с.тииулп-ьзти синтез кaíтанках бхлк!в.

Ауто.-сринн: íynic¡jir саркомних клхтин л1нхх ПС-ЮЗ /клон Зсб/ i псзвдопсрмальних ^'лОробластгз л i н i г ?гтт<.«»ч ni с ля íx Нппртермхч-Ho'i обробкк завчаяи ляяя а гокологхчних тест-скотинах, але я з використаниям ге?зр0Л0г1чк01 kjút«khoí система, а саме карциномпих клхтин jiíhíi а-549. Встановлено, ео фхбробласти jiíhx'í ::i:í-3tj . У nspaí години п1сля завершения теплового воку секретусть реч'ови-ни, akí ÍHri6ynTb бхосинтез £НК та"6íakíb у цих клхтиках та в клхтин ax jiíhíí А-549. У той яе чао саркомнх 'клхтнни ,nini'í ПСМОЗ /клан Зсб/ такими вкастиаостями не вoлoдiвrь. Kpi« того, показано, шо тимчасове закислення середовия, кондиахйоваиих клтшами лхнхх :шi-ЗТЗ. суттево не впливае на íx здатн1сть регулвлати iнтенсиа-híctb синтезу жк i 6ifiKÍB, tosí яг. тика обробка се радения, kohí::-. ц1я0ваних к л i тинами л1нп ПС-ЮЗ /клон Зсб/, эниеуе ix 6i о логх чиу актикнхсть ко до регуллци- назгаких процсс1в.

3. Вплир ИР та Г1лертери1чнох обробки ssxthh на

f.KTM3HÍCTb секретоввних ними' серинознх протехназ

Еилвлено /рис.б/, во карциномнг клхтини лхнх£ А-549, cep«o*hí клiтини *ÍHÍf'ПСИССЗ /клон Зсб/ те псевдонормальн! ííípodjsactk лх-híi :;1Н-ЗГЗ • секретурть'лротехиаэи у беасироваткове культу;адык

и

а

%

ч ж

и >» •

*

X

ЧЭ «

<9

Я •*-«

я

■А

I

X

70

60

50 ад

30

20 10

ш

РЗ

с /

^ ^

/

/ у" /

/

/ /

✓

✓

I ■

12 31 1-567 I 2 3 41 5 67

Ри-.б. Вплив ТФР-6 1/чи/ ЕФР / □ / та гхпертерм1чно1 обробки клхтин / 0 / лШх А-549 /а/, ПС-103 /клон Зсб/ /б/ I тн-этэ /в/ на активность плазмхноподхбних протехназ в безсироватковому культуральному середовищ1, кондицхйованому цими к Л1 тинами

/I - контроль, 2 - ТФР-р /10 нг/мд/, 3 - ЕФР /10 нг/ил/, 4 - ТФР-/5 + ЕФР, 5 - через 2 години хпсля теплового шоку, б - через 6 годин теля теплового шоку, 7 - через 1В годин П1сля теплового иоку клхтин/ .

середоБице. 2а данями прозеденого нами iKri6i горного анал1зу /хнгхбуьання актиБноот1 проте!каз у присутносгх бензакхдину, леи-пептину i апрогин1ну та зхдсуткхсть такого ефекту при дх; мопород оцтово1 кислоти тавпТА/ та за сгтециф!чихота г;:ко~ксганого субстрату /3d- ала-ала—$ен-арг-паран1 троанх лхд/ i виэысг» чуглиз: стт» до стимуляцХ1 ахтиэност1 в присутност! секрегованх фермента можна зарахугати до плази1нопод1бних серияояич про тех на?.

3 рис.б видно, с,о активнхсть серинових п?вте1каэ .у серед с?. кондихцйованому саркомними клхтинами, маЯже в 4 рази вица, His ix пктившстъ У такому т. середозад! га г.асздоногжалкни*

клхтин. ТФР-jri оссбхмзо"Е5Р зхкзвшшгь пгдзкценм активное*! про-те1наз у культуральному середовиц1,"кондицхйованому oi тинами л1-hii А-549. Под1бна картина спостерхгаеться П у випадкутестування ф1бробласт!в лхнН этн-313. У той жечэсдля саркомних" кл1тин л1Н1х ПС-ТОЗ /клон Зсб/ саме ТФР-р е найсилыйиим хндуктором пхд-вицення активное^ серинових протехназ, а дхя ЕФР у даному випад-ку не виявляеться.

Mi* саркомними та карцикомними'кл1тянами "дослхджуваних лтнтй 'заявлен! 3i дмхнкоcti в активност! сскретотену- гротехнаг i г:.с.-л rinepTepnisHox обробки кл!т:ш. Так, покоэч-io /рис-с , цо теплолг;': аок не впливае на актив«сть цкх проте!на? у сатжп'них K'liri'x, але хндукуе ii пхдБиаення у.карииномнпх кл1:«к.

9. Зплиз TjP-r> на синтез бхлкхд.у к-йтч.

Одном рк«.Я елоктрофорез б!;.хтв у no.-it-xp".эму гол: з cyTHOOTi додеиилсуг.ф*?у н«тр!в не аияздг суттс-сгс зализу Т'ГГ—Д /10 нг/мл/ на SMicT окремлх 6iдкових фракцЫ у рхйро'.лазллх л!.-.!: 1Ш1-ЗТЗ, а гакож У пухлинних клхтинах лхн11 А-549 з аденокарци-номи легень • ладини та лхнх1 НТ-Т080 з фтброср.рконп та,'":!'/. Т." к si тин перих даох наэьаних лхнхй не вилздено пг.щ\ i

йхосинтез 6i л«з, ¡до визначався за ькжчеш-им ними -""й- нехионх-ну.'Цей висновок вхрний як у випадку дхх ТФР-Э на клхтини, ко ху-льтизувалися в середовицх, яке м!стилоЮ£ сироватки кров! плод!з велико! рогато! худоби; так i у випадку ix }ккубаа15 ? йсзокгзгат-ковому середозиса. Io peni, П сама сирозатха к ре:. суттскс не впливае на якхсни»! ск;лд 5!лк1э, якх синтезу.)«.м в 1;д!г;;лах .¿iai.i WIH-353 та А-54Э.

Дхвчи на кл!тини лЫх HT-IC80, цо $;ульг.!зув?ься 2 беэспроьзг-ковому середовицх, ТФР-р !ндукуе в них синтез бхлка з молекулярное масою близько 48 кда /р48/. Синтез даного бхлка повнхств inrifiyc- ' ться йд впливом циклогекс!м!ду, але збер!гае?ься в присутностх актином!цину D. Встановлено, що синтез р48 хндукустьс; не лиге ТФР-ii, але й сироватков кров!. Результат« виэчення субклхтиннох

локалхзаци р48 свхдчать про його перевахне розмхщвння в клхгин-ному осад1, -о («стить ядра та велим фрагмента. кл1 тин.

20. Вплив ТФР-А, ЕФР та'г1пертерм1чно1 обробки клхтин на вм1ст м-РНК протоонкогенхв с-тус 1 с-Гов

3 рис.7 видно, що Е$Р, а також хх суихо 1ндукують

транскрипцхп протоонкогена с-тус у фхбробластах лхн1х 'ЯХН-ЗТЗ, хоч час досягне1шя максимального рхвня цього процесу пхд впливом ТФР-Р та ЕФР вхдр1зняеться. Тепловий шок викликае ивидке /через 0,5 годин/ припинення синтезу м-РНК гена с-тус, пхсля чого спо-' стерхгаеться його р1зке посилення, яке за 1цтенсивн1стю можна спхвсгавити з ефектами вхд ТФР-£ та ЕФР.

№я ТФР-& та ЕФР на клхтини Л1нп ШН-ЗТЗ спочатку викликае у них зниження 1итенсивностх транскрипцхх протоонкогена с-*оз, але через 1,5-3,0 годин вхдбувавться Н ^двищення, що особливо помхтне у-вкладку лИ на клхтини ЕФР /рис.7/. Подхбна дииам1ка тренскркпахх гена с-Гов виявлена також пхсля г1пертерм1чнох обробки Кл1тИН ЛХК11 ШН-ЗТЗ.

Дхвчи на саргсокнг клхтини лгни ПС-103 /клон 38^5/, ТФР-Д, Е$Р. та х); суьав пиукують зростання хнтенсивносп транскрипци прстооккогснг. с-туо /рис.8/. I! максимальний р1вень виявляеться через 1,5-3,0 годпп пхсля додачх фактор1в росту у середовище. .Геп-;\ова обробкв сиркоиккк клiтин також 1ндукув цей процео, причому Гюго максимум досягаеться вже через 0,5 годин.

Встаковлено , но транскрипцхя протоонкогена с-£оа у саркомних : кл1тш!г.х названо! лхнхх пхд впливои ТФР-р та ЕФР пом1тно эх: .куеть- • ся /рис.8/. Лише через 3 години П1сля додач1 факторхв росту виххд-шй' р1вень транскрипцхх цього гена частково в1дновлзеТься. У той х:е час г1пертермхчна об робка саркомних кл1тин хкдукуе транскрипцхв гена с-Хоз 1з максимумом через 1,5 години, а через 3 години п1сля припинення теплового иоку спостерхгаегься рхзке зниження 1нтенсив-ностх цього процесу, ,

При досяхдкеннх карциноиних к га тин Л1н1х А-5Ч9 нами виявлена вхдм1ннхсть у результатах дхх ТФР-£ на синтез М--РНК протоонкогена с-тус при хнкубсцхх клхтин у присутностх 10? сироватки кров1 пло-дхв велнко1 рогатох худоби та при 1нкубацп клхтин у хх в1дсутнос-т1 ./рис.9/. Так, у першоиу випадку Т$Р-£ 1ндукуе транскрипцхю гена с-цус В1г.г через 0,5 годин пхсля додач1 фактора росту, а в другому випадку вона зм1нвегься несуттево. ¿иммка 1нтенсивн0ст1 транскри-пци гена с-иус у клхтинах лхнн А-549, во п!ддавалися Г1лер1ерк1х, подобна до такох к уклхткнах при дх1 на них ТФР-/1 у присутност1 105 сироватки кров1 чи при дх.1 його сукхвх з ЕФР у в1дсутност1 сироватки КрОВ!. . '

3,0 6,0 II

0,5. -- î,5 5,0

Рис.7. Вплив полхпептидних факторхв росту /а/ /ТФР-,в ./—о—/,

EiP /-с*-/, T$P-/s+ Е5Р /-о-// та гтпертернхчно! обробки /б/ /*й° С, 30 хвилин/ на рхвень м-ГОК протоонкогемв -, с-туе /I/ та o-fos /II/ у ф1бробластах ainiï ::rj-3?3 /по oci ординат - в1дносна оптична густин., радхсавтогрг.; i в при 600 мм,

по oci абсцис - час, години/

-гч-

а б I

ки /б/ /44° С, 30 хьилин/ на рхвекь м-ИИ протоонкогешв

с /I/ га с-^з /II/ у саркомних клтшах ЛП1П ПС-ЮЗ /клон 364/5/ /по оо1 ординат - вхдкосна оптнчйа густина радхоавтогра$1в при 6С0 ни,. ,

по сс1 абоцис - час, годи ни/'

//-J

з.оЧо

3,0 б,о

0,5 î,5 3,0 .0,5 1.5

Рис.9. Вплив полхпептидних факторов росту /а/ /ТФР-р У без сурова-

тковому культу pes явному середозиах /-

"/.

tô о- с

У

ноет! ÏC,1 сироватки icposi плод1в великс рогатох ху„оои / —о—/„ £¡r /-а-/, Т*Р—jä + / -о-// та ипертермхчно'х обробки /б/ /'й0 С, 30 хвилин/ на pi лень м-р'К протоонко-генхв с-туо /I/ ra c-fos /II/ У карциномних кдх тинах _ JiiH«-Ä-5t9 _ /по oci ординат - В1Дносна оптична густина радхоавтографхя при 600 им,

по oci абсцис - час, години/

йк х у випьдку э саркомними клхтиками лхнх! ПС-ЮЗ /клон 384/5/, при дх Т5Р-£ га ЕФР на караиномнх кл1тини лхнхх А-549 спосхерхгабться шзидке /через 0,5 годин/ зниженкя хнтенсивност! гранокрипцхх гена е-Гоз /рис.9/. Через 1,5-3,0 години ця 1нтен-сипн1сгь частково вадювлюеться. Г1пертерм1я викликас незначн1 ко-ливання рхвня транскрипц!! гена с-£оо у клхтинах л1нх1 А-549 х лкае через 6 годин вхн пом1тко зни.куеться.

Таким чинок, нами виявлена досить складна динам1ка 1нтенсивно-стх' транскрипцх! протоонкогенхв с-гаус та с-Гоа у кл1тинах рхз-. него походження п!сля д1! на них ТФР-р Л/ч-л/ ЕФР. У бхлылост1 ви-падк1в не виявляеться принципово! рхзний мх'ж результатами впливу ТФР-^та Е$Р на хзмхст хпдповхдних м-РНК. Характер змхн хнтенсивно-стх транскркпцхх ген1в с-пус ! o-íos у дослЦжуваних клхтинах п1-сля хх гхпертерм.<нох обрэбки часто подхбний до того, що спостер1-гаеться п!д д1сс вище/'цазваних факгор1в росту.

•II. Виявлення та характеристика полтпе'птидних речовин -з властпзостями Т'1'Р-а У загюдках в"юна

Викорнстовуечи традицхйниЯ метод видхлення та очистки ТФР-^ (ПсЪег-Ья а1., 1934) та клхтиннх системи, що виявилися най-' • бхльв птадатними в насих умовах для бхотестування активностх цього фактора росту, кг. хшдхлили та дослхдили речовини з ехдпоехдники глзстивостями з зародкхв костисто! риби в"юна (Иагигаиа 1ова111з ъ.) на стад!! пхзньо! бластули. Показано, що Ц1 речовини е стхй-кими до дхх кислоти, В1дносно термостхйкими, але втрачають 610Л0-гхчку активнхеть пхеля дхх на них проте!назами - пепсином ч.. трипсином. Вони не конкурувть за специ^тчнх рецептор;: ЕФР у кл1тинах тлии А-431.

фраквдонузаиня препарату, отркманого з зародкхв в"ина, на кодо-нцх, напоьнонхй бхогедем Р-Ю, виявидо ТФР-^-под1бну р1стрегулюючу активнхеть /хнгхбуванкя субстратнезалежно! прол^ериЦх карцином-ких клхтин лхнхх А-549 та стимуляция цього пронесу в присутност1 Е$Р у ф!бробластхв лхнх! К1Н-313/ У зенх елвцх! СЬ-жхв з молекулярное иасои бдизько 5 та 12 кДа /рис.Ю/. У препарат!, отриианому з бластодсрки /клхтинна маса зародка/ виявляеться лисе одна бхоло-гхчко активна фре.кцхя з масов 12 кДа, а в такому препарат! з жов-гка- рхстрегулзвча акглвн1сть.притаманна фракцхх з масов 5 кДа.

'йх уке згадувадося виде,'колекулярна-иаса Т1>Р-£ становать 25 кДа. Тому наведен! нг.ми данх мояуть сахдчити про затримку елюцП з колонки з Догелем Р-Ю ТФР-р-подхбних речовин, отриманих !з зи-родкхв в"кка. Слхд вхдзначити, с,о явэде затри.мки и елпц1! ТФР-р з коленок, кзповнених б1оггляки Р-т;шу, Еьазастыл аого хагактерноо в.-лстивхсть. Зоао спостерхгалоЬя хнхеми автошин ,

10 20 -30 .ад 50 10 20-30 ад .50

Рис.10. §ракц1ояування препарату кислото-еганольного-екстракту, отриманого з зародив в"юна, на колонцх, наповнен1й бхогелем Р-20 /елюцхя 2 М"СН3С00Н/

а - бхотестузанвя ТФР-р-подтбнох активно з викорнс-танням ¿хбробластхв лхнхх ПЗ-З'ПЗ. цо хнхубу.оться в при су тно стх Е5Р /5 нг/мл/ 6 - бхотестузання Т$?-р-подано! üktiishocti з вилорс-

таннян карцинонних клхтнк r.inii А-549 /по oci ординат справа - шгенскзнхсть субстратаезале.*-нох промферацгх клгтнн v присутностх сшквот, Biдхбрдних 1з хроматограф1Чних rJpaKiuP.*, по oci абсцис - номер фракцпЧ/

(Roberto et ai., 1964), к тахож нами при вид1ленн1 та. очистцх T$F-|* 3 Тр0мб0ЦИТ1В ХрОЗХ СВИН1.

Результата-проведених досдхджень дозвояяить вз&кцти, а,з гло-теазочутлив1 речовини, отриман1 з зародив в"вна, налехать до ро-дини пол1пептидхв, ях1 спорхдней А ТФР-ji. Адке нами показано, що цх речовини дхють з тхев ж скерован1стю, чо й ТФР-е сзинх, в З-хрхзних клхтуних тест-системах. Так, гона сгкмулпзть су;о-тратнезалежну npOÄiiepauic сарконких клхтин mhÜ ПС-ЮЗ /клон ■384/5/ та фхброОластх^ дхнЦ щн-323 /останк!й »^ект вняв.-житься лише в присутностх ЕФР/, а такой хн^буить npoxiipepaaiü карцинонних к л i тин лпих А-5 /;9.

Т2„ Вяяплення та характеристика спец'лф1чиих рецепторов ТФР-Р у oiroiiax зародкхв в"виа

Показано, що г.кхтани зародглв в "она на стади nisHboi бласту-ли специф1чно зв"ягуоть свиих. Кхлькхсть в1дпов1дних

peuentopiB CTaKOEuvb 31300-5500 з розрлхукг.у на одну ихтику, а ix к4 дорхвнйе 70^5 пК. Ковалентне ихчения за допомогов дисук-цин1м1дилсуберагу г.омпс 1ентхв плазматичних мембран клгтин зародив в "она та хх наступке фракцхонування електрофорезом в пол1ак-риламхдноиу real в присутностх додецилсульфату кат pi и та 2-меркап-л'оетанолу показало, цо " I-ТФР-А специфично зв"язуеться з мемб-ранним б!лком, що мае нолекулярну масу близько 280 кда.

Таким чином, ттияи зародкхв костисто! риби в "сна не ливе м1стять ТФР-я>-под1бнх речовини," але R e компетонтними до Д1х цих речовин, оокхльки ¿они маать специ$1чн1 рецептори ТФР-р.

Обговорення результвтхв

Результаги проведснкх нами дослхдаень та Данх inmnx автор1в (Roberts et al., 1985. Couatin et al., 1986, Uassagua, 1990) свхдча'ть про те, ао моке не лише стимулввати, але й iHriCyBa-

ти пролхферзцхс нормальник i пухлинних к'лiтин тхтрин i л»дини. Характер р1стрегулпэчо!£ дН цього фактора росту в значив Mipi зале-жить зги тканинного походг;ення клхтин-мхшсией. стимулсе суб-

страгнезалеглу пролхфйрацхв клх'тин is саркончих пухлин, iHri6ye li у кдхтин iзкарцинокних пухлин i не впдате на цей процгс у псевдо-иормальнкх фхбробяхстних кл!тин.

Нами такоквстаиовдеио, то скерованхсть впливу ТФР-£ на npo«i-$cpauin коке залекати sir клонального походження клхтии. Серед сархомних кл1тик лхнхх ПС-ЮЗ виявлено такх, пролхферацхя яких не сгииулаеться, ь. П1гхбуегься пхд впливом ТФРНе - клхтини суб- • клону клоку 384/5, для яких характерна висока^нтенсивнхсть субс-тратнезалеккох nponi$epauil. Огяе nps! pospo6ui рекомендацхй по за-стосуваннв Т$Р-(> з метоа 1кг1буванкя пуххинного росту необххдно обов"язково вроховувати мокливхсть хснухзашш мхжооналымх вхдмхн-ностей Mix клхтикакк в хх чутливосп до рхсгрзгухьичох дп ТФР-А-

Cлiд В1дзначиг.'., по в лх Герату pi описанх мутанги херцином'них клхтин лхнхх 0(3-64, якх втратили здагнхсть 1нгхбуватися пхд впли-вом ТФР-?> (laiho et al., 1990). Таким чином, но лиге саркомнх. але й' карциноинх пухлини иокуть wicrMrti клхтини, ио характеризуемся рхзко змхиеноо чутливхсгв до ди даного фактора росту.

Loof ot al. (X9S6), викодячк з результатхв ¿ивчення дхх T$P-ji на ф'хбрсбласти ninil AKR-2B, ввакавгь, шо доний фактор росту стимулвс пролхферацхв лише у тих вияадках, коли вхн здатний

1ндукузати в кл1тннах-и1венях експресх» гена с-з1а, продуктом якого е сильний м1гоген - фактор росту э тромбоцимв. Якио ТФР-*

не володхе таков здатнхстя, то, на думку згаданих вчених, мокнь чекати його тнгтбувчого впливу на прюлхферашз клхтпн. Про.те пр;: використаннх !нших клттинних теет-систом цп модель не зав жди зна-ходить експернментальне П1дтверддення (Мйазазие, 1930). Тому дослхдження молекулярних нехшизмхв, як1 аизначавть сг.ерованхсть прол}феративно'1 вхдповш кл1тин на дхв ТФР-р, прсдовкупться.

Ни виявили залеааисть впливу ТФР-р на пиенсиргисть бхосипте-зу ДНК в!д концентрацхх сироватки кров! в середовицх, одночаснох д11 на клхтини хниях поятпептадгак: ф&ххор» сому, ао*п«мц ?®Р 1/чи/ 1 и су ¿пну, тривалостт ззъгнодх! росту э клхтинами-

м1шенями, ихльност1 розм1щення кл!тин на субстратх-пхдкладц! та ступеня прикр1плення кл1тин до цього субстрату.• Цх дан1 не виклв-чавть можливостх функцхонування моделх, запропоновано! ЬеоГ et а1. (1966). Разом з тим вони свхдчать про вакливу роль !нших регуляторних систем кл1тин-мхшенеЯ та клхтинного м1кроото-.чення у визначешп характеру дх! ТФР-Р на прол1ферац1в.

Нами проведене порхвняння функхпонування деяких регуляторних систем, ко локал1зозан!' ь головнях компартией»«* - у ялг.ямигичый мембр»нх, цитоплазм! та ядра - г.лхтии, як! Хйрй.чтерму.тьсл но» за скерованхстю та ви реши сто ара л!4е рпткзио» з! .-.поп? ".л д!в Т5Р-А- Одночасно були зилче;ц деяк! властячост* л-^й'глгйио гз середовхада цих клх тин, зохсрз» ипяхшсть у иьому сзкрсто ^нкх кзхтинеии факторхз росту та плаь.мтнополхпннх пртзпгез. 7г,йга до останкхх ¿уловлена тим, що еснл пок^т"-. брати учесть у про:®сек "декаекугашк" Т5Р-г л його латеншог Ферми (Луспс

Результати вивчення умов та факторхв, як1 ;.-окуть визиачатк характер рхстрегулпвчо! дП ТФР-? на нормаль« х пухлиннх клхтини тварин I лядиня, узлгальнон! в таблиц! 3. Врчхукмпч даних дозволяс передбпчити з ветекип ступччрм втисть впливу ТФР-(Ь на кяхтинну пролхферацхп. 6 пхдетавн вважа-ти, до ТФР-р стимулюе прол1ферац!в кл1тин, як1 походять !з мезе-нххмних тканин х мають вхдносно низьку пролхфератчзну активах >ть. Цх клхтини характер» •.. пться значноо к1лькхств /понял 10 тисяч/ специф1чних рецепторов Т'{■Р-/ь, серед лких перезалапть х:< вясокомо-лекуг.ярн1 форда. В даних клхтинах повинен експресуватися гротоон-коген о-:пус, а т<хкож геки мхтогенних факторхв х/чи/ IX реиептс-р1в. Стимул»:-)ч;;.'! пплив ТСТ-Д на прол1ферацхп иормалъиих хлхтин цього типу виявлгються лише за умов одночаентзх дхх на них ЕФР х/чи/ хнеулхну. Активн1сть плазм!коподхбиих проте!наз у позакл!-тинному середозпц! цих клх тин мохе буги досить високов. Для вияв-

Таблиця 3.

Уиови, цо впливають на скерозанхсть та вирепкенхсть р1стрегу лввчо'х дН Т$Р-£на клхтини-м1оеи1 -

;.;п/п: Умови, в!Д яких заложить характер впливу Т$Р-р на прол!ферац1в : Вплив ТФР-£ на : Джерело

: к аг тин : пролхфера!ив : цитування

I : 2 : 3 : Ч

I Походкення кл1тин-к1пеней:

а/ ткяншше: - мезенх1мн1 тканиии . СТИИуЛЯЦ1Я. нашх дан1,

- епхтелзвльнх тканин хнгхбування 2. .4, 7

6/ клональне:

- саркомнх клхтини з низьков пролхферативнов активн1ств СТИ«уЛЯЦ1Я наах данх

- соркоии клхтини з високов пролхферативнов активн1ств хнг1бування

2 Система кл1тинних реиепторхв ТФР-Д:

а/ кхлькхсгь рецепторхв у клхтинх: >10 тисяч сгимуляцхя наох данх, 8

<10 тисяч хнпбування

б/ переважавч1 молекулярн1 форми рецепторхв: >200 кДа сгимуляцхя Ч

<100 кДа - хнгхбувания

з" Функцхональиий стан <л1тин~м1пеней:

а/ пролхферативна активисты пом1ркована нема впливу або напх данх

стимулами

висока 1нг1бування

б/ е.кспрес1Я гена с-мус експресуеться стимуляц1я 9

/клхтини лхн11 СЗН/10Т1/2/ не експресуеться хнгхбування

див. продовження

I

2

ь/-.':;слргс1я м-РНК £акторхв росту чи IX пхд впливом КР-/ь

г/зхгко—!:.{Д внутр1_'ньокл1 ХИКЦЯХ концен. £ШР] / Гс^

4* Властахост! г.озэклхглнного середовияа: . а/:'.01ае:::гиц1Л Т§Р-р

/к-1г.::::: гладеньких и"яэЬ/ сироьпткл креэх 'клхтик'.; г.:и11'А-54Э/

¡¡/¡¡ия^нгегь хкеих фактэртв росту /псэзяоно г.ма льнх $1 бробласги/

г/нелвн1сгь полхненасячеких жирних кисло /карциноян1 клхтини лпах А-549/

д/активн1сть сскретованих кя1хинами п лаз М1 но под! б них про те х паз

е/влас ьосг! субстрату-гидкладки

3

4

I ндукуеться не хндукуеться

><10 <^0

>0,-1 нг/нл < ОД нг/мл .•102

ЕЗР х/чи/ хнсулш нема

нема

БИСОКВ ' низька

кол'ген нема колагену

схимуляцхя нема ефекту або 1нгхбуваннл нема ефекту хнг!бування

стимуляц1я'

нема ефекту

1нг1бування

стииуляц1я

стикуляц1я

нема ефекту

90-100^ хигчбуван-

ня

$.5-33% 1нг1бування стимуляцхя хнгсбуванвя або нема ефекту 1нгхбування слаба стимуляц!я

I. 3, ч

нашх дан!

нав1 данх

нашх дан1, 6 5

нашх данх

див. продовженкя

е/стугинь прикрхплення клхтин до субстрату П1дкладки /карцином« кл1тини л1ии

* А-549/

а/пхльнхсть клхтин в культур! /фх'бробласти 10^ клхтин/2 см^

• лхнхх 3WÍSS-3T3 б середовипи з 0Д£' , сиро ватки кров i та ЕФР/

Триваисть взасмодх! ТФР-/1 клхтинами ' /фхбробласти лхнп тн-зтз в середовицх з 6í сироватки кровх та ЕФР/

моноойрова. культура нагпврхдкий агар

ÍO*1 к ni тин/2 см2

24 години 72 години

$5% хнпбування 90% i Hrí бування

нема ефекту ÍHri6yвання

нема бфекту inriбування

• нашх дан!

нвшх данх

наш! дан!

* - мояливе виявлення íhsihx прикладхв неоднозначное^ рхсгрегулнвчо! дхz ТФР-jS /дхерела цитування: 1 - Battegay et al., 1990, 2 - Goustin et al., 1986, 3 - Leof et al,, 1986, 4 - Kassague, 1990, 5 - Sewman, 1990, 6 - Roberts, Sporn, 1985, 7 - Sporn et al., 1986, 8 - Wakefield et al'., 1987, Wenner et al., 1990)

vj r\>

лення залежностг впливу ТФР-р на пролхферацхс оётин вхд властиво-стей П1дкладки, ступеня прикрепления до нет клхтин-ы1пеней, ix ai-льностх з розрахунку на одиниш плосц nonepxiii пхдкладки та вхд грива лостх дй' TÍP-/1 на хштши, очевидно, необххднх додатковх до-слхдження.

Проведений нами анал1з дозволив таком внзначити mítkhii, про-Л1ферацхя яких хнгсбуеться пхд вплизон T?P-f>. Це - норна л ып та пухлиннх клхтини еп1тел1ального походженкя, а такогс саркомнх ктЛ-тини, ях1 характеризуются високов хнтенсивнхств субстратнезалеж-hoí пролхферецхх. Дан i клётини повиннх мати вхдносно мчлу гхль-к*сть./иеике, hík 10 тисяч/ eneuiiJi'iKax рецепгорхв ТФР-», серед яких перевакають хх низькомолекулярн1 форми. Шд дхею ТФР-Р екс-npecifl протоонкогена с-гаус у цих клётинах мо«е 1нгхбуватися, а експресхя м-РНК мётогенних факторёв i/чи/ хх peuenropiB не 1ндуку-еться. Вхдноаення внутрхшньоклхтинних концентрац1й [саш?]/[сСМр} не досягае тут великих значень через високий bmíct cGMP. luridy-ючий ефект ТФР-j» спостерхгаеться за- умов хорошох забезпеченост1 кл1тин сироватковими факторами росту, причому наявнхсть в середо-вии: пол1ненасичених жирних кислот суттево П1дсилге "ого вириде-нхсть. Активнасть плазмхноподхбних протехниз, що се^ретуиться цими клхтинами, е вхдносно ииэьхоо. Не можна повкхсто виг.лсчати значения й хнших умов у визначеннх скерованосхх ьзлкву на npo.úlepa тисну активность клхтг.н даного типу.

Виходячи з результатов проведених нами дослхду.енъ, кежна такол ввалати, цс бхологхчнх особливост! TíP-f- гозволяоть йону в залед-uoctí вхд обставин а ого д1'1 змпгах /и ок^ров-хнхоть впливу ни itposi-феративну активность тих сашх клхтйч-ьпяене:1,. Наприклад, показано, е\о за умов високох пролхферативнох акгивнос-ri клхтин ТФ?-|ь, як правило, ÍHri6ye рхст. У той самий час за умов, несприятливи- для про-глферацх! /яарциномкх клх тини лхнП А-549, помхценх в сегедови^е з дефицитом сироватки кров!/, цей фактор стимула е. бхосингез ДНК. Цх властивостх ТФР-(Ь слхд також вр&ховувати при розробц1 рекоменда-Ц1й по створеннв фар-!аколог1чних препаратёв, в яких ТФР-р у посд-наннх з деякими ёняшми факторами росту пропонует*оя для гшг'пстац-кя в медицин!.

Ми виявилк полхпептвдн! речовияи з зластивостямц ТФР-,ь у зарод-ках костисто* риби - b'Y.hü. К pin того, в кл1тинах слх зародкхг эка-йденх специфхчн1 рецептори TíP-p. Рантше у предстаснигЛв к.пасу гиб Т$Р-г> не виявляеся. Слхд також вхдзначити, цо наша робота с персоп, в як1й Тфр-'р-подёбнх речовини були знайден1 в зародках на так!й раннёй стад11 розвитку, як бластула. '

В ooaHni роки отринай дан£ про наявнхсть генхв Т§р-р, та ге-híb поддбних до нього речовин у птаххв (Roberts e-t al., T99I), aniidiil (Reboert et al., 1990) та комах /дрозоф:ла/ (Padgett et al., 1937). Показано, що ТФР-£2 иохе В1Д1гравати центральну роль у процесах хндукцН мезодерми та тканин, якх виникавть з не! у ам£хб1й (Rosa et al., 1988). Вважаеться, що норфогенетична активнхсть притаманна i поЛ1пептидному продукту гена, по виявлений у дрозофх ли i гомолог! ..«Я гену T$P-Aj лвдини (Massague, 1990).

Отасе ТФР-Р чи под1бн1 до нього полгпептиди мокуть викону-вати важливх регуляторнх функцхх пхд чао yoix етапхв онтогенезу не лише у ссавцхв та ниисчих хребетних, але й'у безхребетних твариц.

Висновки , ————~

1. ТФР-р стик. ше субстратнезалежну пронферацхв кл1тин 3Í са-• ркомних пухлин, ÍHri6ye Si у клхтин з карциномних пухлин та не впливае на нех у псевдонормальних фхбробластних клхтин. Виявлений субклон саркоми Л1н11 ПС-ЮЗ, рролхферацхя кл1тин якого ÍHri6yeib-СЯ П1Д впливом ТФР-(к.

2. Не ильки Е$Р, але fl хнсулхн моду лее вплив ТФР-jí на прол1-феративну активн1сть кл1тин. Пролхферацхя псевдонормальних клхтин Л1НХ1 CH0-7I9, що не мають специфхчних peuenropiB ЕФР, стимулветь-ся лиие тл час сп1льно1д« ТФР-£ та хнеулхну.

3. За умов моноша'рово! культури характер впливу ТФР-£ на 1нтен-сивнхсть бхосинтезу К залекить не лише В1д типу клхтин-мхшеней,' але й вхд концентрацхй ТФР-fs» та сироватки KpoBi в середовипц на-явноегх в ньому Е$Р i/чи/- 1нсул1ну, тривалос;и aí'í вказаних факто-

• рхв росту та щхльносп клхтин на субстратх-п1дклади1. Змхна навхть однхсх з перерахованих умов мохе впливати не лише на вираженхеть,.. але й на скерованхсть рхстрегулввчо1 дх!с ТФР-Д на клхтини-мЫенх. ■

4. Псевдонормалый клхтини ñtiii NRK-49P та карцином« кл1ти,-ни лхнхх А.-549 суттево вхдрхзиявться мхк собов не лише за ылыйс-тю специф1чних peuenropiB ТФР-/*, але й за характером трансмоду ля цх i цих peuenropiB nií впливом ЕФР iAn/incyfliHy. В к ni тинах першох з названих лiнiй хнеул^ пхдвиаус рхвень специфхчнохо зв"язуванря ТФР-л, a iHcyflÍH разом з £<5Р знижуе його. В клйинах друго! kíhíí Е$Р збхлыауе piBeHb зв"язування ТФР-f. Kd рецепторхв ТФР-р при цьо-му не 3MÍHBeibCH.

Ъ. BiAHoneHHfl внутр1шньокл^инних концентра^й [.cAMPj/jcGMP] можна використовувати.для прогнозувакня прол1феративно1 bktmjíiioctí норыальних та оухлишшх oíthh. У.карциномних клхтин ЛПП1 A--S49 цсЯ п'ог.азник дор1вквс 3.£í, тодх ик у псевдонормальних oítíih л i i i i й :Jlü-3T3 та imx-AS? - ьхдповхдно 34,7 та 103,6. TíP-ji несут гг.во

впливае на винооення [см&]у клхтин Л1Н1| А-549, але

значно пшицуе його у käithh Kiwiß SIH-3T3 та Ш1К-4ЭР.

6. Клхтини з рхзним характером прсшферативиох вхдповхд! иа_ fliu /карцинома лШ! к-549, саркома лхнГх ПС-ЮЗ /клон Зсб/ та псевдонормальнх ф1бробласти лхнхх KIK-ЗТЗ/ вхдрхзнявгься мхк собов за активностями секретованих ними факторов росту та плаамх-ноподхбних прохехназ. Активнхсть останнхх е найвищов з середови-rai, кондишйованому сйркомними клхтинами. ТФР-/5, Е$Р' та rinep-терм1я можуть впливати на да активмсть.

7. Ппертермтчнп обробка г:л:тип иодулзс Ix здатнхет* секрету ватя рачовини з властивостями фпкторхв росту. 7 пухлинних кл1тин ця аутокринна функцхя виражена сильнхше, Hia у псевдонормальних

КЛ1ТИН.

8. Г1пертерм1я впливае на вмхот м-РНК протоонкоген1в c-myc i c-foa . Змхни, що виявлявтьей при цьому, rioÄiÖHi яа тх, якх тн-дукуються в кл1тинах T§P-/i i/чи/ ЕФР. Характер цих знхн пхд впли-вом'ТФР-ß не в1добрахае ix прямо! кореляцГх з д1ев даного фактора

. росту на пролхфера^ю клхтин.

9. Проведене комплексне зивчення впливу ТФР-А на функцхонуван-ня регуляторних систем, то локалхзован! в плазматичнхЯ мембран!, цитоплазм! та"ядр1 псевдонормальних фхбробластхз, саркомних та ка~ рциномних клхтин. Огринанх результата дозволявть вважати, во про-Л1феративна в1дповхдь кл1т:ш на дхю ТФР-fi залеяить вхд ix морфо-функцттльного стану, особливостей м1крооточення та умов застосу-вання даного фактора росту.

IQ. 'iyüKiiii клхтин раннхх заро„.ав риб мокуть рвгуливатися T$P-j& або гомолог:чними факторами росту. На це вказус виявлення пол!пептидних речовин з властивостями ТФР-fr та специфхчних рецеп-TopiB даного фактора рссту в зародках костисто! риби в"»нп.

Список оопогних poöir, опублхкованих по тем! дисертаихх

1. Кусень С.И., Стоика P.C. Молекулярные механизмы в действии по-липептпдных факторов роста. - Москва: Наука, 1985. - 236 с.

2. Стойка P.C., Кусень С.И., ФедииинЯ.Я., Сусел'-пицкиЯ С.И. Чолн-пептидные факторы поста зародышей вьвна// УН Всесоюзное совещание эмбриологов: Тез. докл., 4.II, И., I9S6. - С.98.

3. Стойка P.C., Федижин а.Я., Сушельницький СЛ. пл \1пептидн1 фак-тори росту в ранньому е.чбр1огенезХ та при здоя:<i cnifl транс^ср-мылх клiтин// У Укр. öioxix. з"!зд: Тези допов., чЛ, - Кихв,. 1987. - C.149-150.

4. Сушельницький СЛ.,' Стойка P.C., Гаресько С.Я. Часткова очистка та деякх власгивостх /i-типу трансфорнувчого фактора росту тром-боциив езин:// Укр. öioxiM. з"!зд: Тези допов., ч.2, - Кихз.

1957. - С.249.

5. Кусень С.И , Стойка P.C. Современные представления о молекулярных механизмах действия инсулина на клетки животных и человека// 17 съезд эндокринологов Укр.ССР: Тез. докл. - Киев, 1987. - C.2I2-2I3.

6. Гойда Е.А., Медына И.Р., Стойка-P.C., Федишин Я.Я. Влияние полипептидных факторов роста из зародышей вьюна на ионную проводимость их клеточных мембран// 1У съезд эндокринологов Укр. ССР: Тез. докл. • - Киев, 1987. - С. 89.

7. Стойка P.C.,'Федавин Я .Я., Сушельницкий С.И., Гарасько С.И., Никитах Р. Г. "Полипептидные факторы-роста'в раннем эмбриогенезе животных//-Всесоюзный "симп.' "Молекулярные и функциональные механи-

• змы онтогенеза": Тез. докл. - Харьков, 1987..- C.I72-I73.

8. Стойка P.C., Ку^нь"С;И., Федишин Я.Я., Суаельницкий С.И. Полипептидные факторы роста зародышей вьюна на стадии.бластулы// Укр; биохим. к. - 1987. - 59, №5. - С.27-32. '

9. Стойка Р. С:," Суаельницкий С.И., Кусень С.И.4 Особенности регуля-торного действия трансформирующего фактора "роста р»// II Всесоюзное совещание по изучению* роли морфогенетически активных факторов в различных процессах: Пуяино, 1988: Онтогенез. - 1988. -19, );5. - С.552-553.

10.Стойка р;С., Кусень С.И. Трансформирующие факторы роста// Усп. совр: биол. - 1988.'- 106,'И/4/. - С.69-84;

11.Стойка'Р;С. . Кусень С.И. Полипептидные факторы роста в эмбриогенезе животных// Онтогенез; - 1988: -■19,'S3. - С.229-239.

12.Стойка P.C. Трансформирующий фактор роста р-типа// Укр. биохим. ж. - 1988. - 60, ЪЪ. - C.9I-I03.

I3.Stoi)ca H.S., SuslielnitaJcy S.I., Kusen S.l. Sho influence of transforming growth factor p, epidermal growth factor and insulin on cell proliferation in. the media with oeral3.olid a&ar// Fourth Internat. Congress of Coll Biologyi Abotr. - Montreal, Canada, ISÖ5. - P.108.

I4.Stoika H.3., Drobot L.3., Fedishin Ya.ia., Yurz1 "nko V.S., Кизеп S.I. Polypeptids growth factors fron loach епЪгуоз otinulate ty-rooine phosphorylation in membrane proteina// Fourth Internet. Con-reso of Cell Hiolosy: Abatr,-Montreal,' Canada,:I9G8.- P.IOS.

15.Стойка P. С., СушельницкиЯ С;И. , Кусень ,С.И. Влияние трансформи-' руюцего фактора ¡»ста эпидермального фактора роста л инсулина на пролифе^цив клеток'В среде с полужидким агаром// Биополимер« и клетка. - 1969. - 5, Я: - С.95-99.

16.Стойка P.C. $илогенетические особенности структуры и Функции по-.ткпептидиых факторов роста, локализованных в кровяных пластинках

млекопитающих// Ж. эвол. биохим. и фиэиол. - 1989. - 25, , Ю. - С.373-379.

17.Сушельницкий С.И.. Стойка P.C., Гарасько С.И., Иафранская Г.И., Кусень С.И. Влияние трансформирувщего фактора росте

(i-типа и его комбинаций с эпидермальным фактором ¡»ста и инсулином на субстратнезаЕисимуо пролиферации нормплышх и опухолевых клеток// Цитология. - 1989. - 31, S7. - С.767-774.

18.$едишин Я.Я., Стойка P.C., Кусень С.И. Обнаружение протеазочув-ствительных факторов со свойствами трансформирувщего фактора ', роста р-типа э ранних зародыяах вьюна// Онтогенез. - I99C. -21, И. - С.63-68. , .

19.Стойка P.C., Суаельницкий С.И.,'Кусень'С.И. Регуляторное действие трансформирувщего фактора роста ц на пролиферацию клеток в зависимости от условий тестирования его активности// Всесоюзное совещание "Актуальные вопросы клеточной биологии" /Ленинград,

.1989/: Цитология. * 1989. - 31, »9. - C.II27-II28.

20.Стойка P.C., $едишин"Я.Я;,' Кусень С.И. Факторы роста со свойст-

•. вами трансформирувщего фактора роста-;} в ранних зародысах вьюна

//Всесоюзное ссвеиание "Актуальные вопросы клетс ой биологии" /Ленинград, 1989/, Цитология. - 1989. - 31, й9. - C.II26.

21.Ставровская A.A., Стойка P.C., Стромская Т.П., Суиелышцкий С.И. Идентификация фактора роста, продуцируемого клеткам:! саркомы мыши, вызванной инородным телок// Всесоюзное совещание "Актуальные вопросы клеточной биологии" /Ленинград, 1989/, Цитология. - 1989. - 31, "»9. - С.И?6.

22.Суаельницкий ~.й., Стойки P.C. Изучение влияния эпидерма льного фактора роста и инсулина на специфическое связывание трансформирувщего фактора роста нормальными и опухолевыми клетками//' Зсесоюзкое совещание "Актуальные зопросы клеточной биологиг." /Ленинград, 1989/, Цитология. - 1969. - 31", №9. - С. Г129.

23.Стойка P.C. функпиональнве' особенности 'трансформирувщего'фактора роста /»//Всесоюзное совещание "Актуальные'вопросы клеточной биологии" /Ленинград, 1969/, Цитология.-19®. - 31. 49.- C.II27.

£4 . Ц t о lit а A.Z., l-'c J.i jhin Y.i.Ya. , Г.чзот. 'J.J ХУ;.с:ъ. -'ij'-i Ь);.:!. ' early embryoo ;ont.-iir. ."i:':iut tuice ч '.•i*'" v.' ■ v. :r..-:'-¡ ■■:

growth factor ß //I9th 51,BS Üeetinc» übstT.- Pone, П«)у, l'Qß9.

E'j.íuahílnitsky S.I. , JtoUi H.3., Kus-r, £.T. ..,> '.:•{■ ivc-t.-v oí «id insulin cu i'GF-fj ас i Ion оь ai

U-349) trnd nornal (:;RK~-492?) cello// 10th F£BS Uoctingt Abatr. -■Rone,- Italy, 1589. ' •

26.Стойка P.C., Суыелькицкий.С;И., Кусень С.И. Особенности регухд-торного действия трансформирующего фактора роста р//Мор£оген-r»i-

чески активные вещества /сборник/, Научный центр биол. исследований Ин-та биол, физики АН СССР, Пуиино, 1990. - C.I07-II3. .

27.С чвровская A.A., Строиская Т.П., Бродская P.M., Стойка P.C., Сушельницкий С.К., Гарасько С'.И., Шафран екая Г.И. Клетки мышиной саркоми, индуцированной полимерной пластинкой, секретирувт трансформирующий фактор роста с^-типа// Экспер. онкология. -т990. - 12, №2. - С.43-46.

28. Стойка P.C., Сушедьницкий С.И., Кусень С.И. Влияние трансформирующего фактора роста ß на интенсивность синтеза ДНК клеток в зависимости от их типа и условий культивирования// Цитология. - 1990. - 32, К2. - С.132-139.

29.Стойка P.C., Кусепь С 'Л. Трансформирувщий фактор роста ß - новый тиг ингибитора пролиферации нормальных и опухолевых клеток// Молек. биология. - 1990. - 24, »4. - С.897-908.

30.3toika 3.3., Suahelnitalcy. S.I. , Kusen 3.1. The regulation of proliferation of hume lung adenocarcinoma colls oi A-549 line by autocrine growth factors// 20th i'EBS Meeting: Abstr. -budupeat, Ilungnry, IS90. - K300.

31.Suahelnitalcy 3.1. , 3toikaR.3., Kuaen S.I. Tho regulation ot npecific binding oi transforming growth factor f> by the cells of nric-49P line-// 20th FEB3 tiae tings Abotr. - Budapeot, Hungary, 1990. - Г»303. ' ;

32." Сушедьницкий С.И;, "Стойка P.C. Изучение кинетических параметров специфического связывания трансформируемого фактора ростам клетками линии ИЛК-491' из нормальной почки крысы// Биол. мембраны. - 1991.' - 8, ¡¿6: - С.628-632.

33.Супельницкпй С.И., Стойка P.C., Кусень С.И. Влияние эпидермаль-ного фактора роста и инсулина на специфическое связывание трансформирующего фактора роста р, клетками линий }тк-49У и А-549// Цитологи;;. - 1991. - 33, Ю. - С.80-87.

34.Чупашко О.П., Воробец З.Д., Стойка P.C., Дичков ский Э.й. Модуля- ' ния транспорте» кальция ь мыииные фиброблистьг линии EIII-3T3 и клетки лини» А-549 ьденокарциноми легких человека трансформируь- , ■ ним фактором роста р я зпидермзлышк фактором роста// Доклады

■ АН 5 крайни, сер, Б. - 1991. - 1-7. - С Л 41-144.

35.iUoil:a R.S. , öujlit Inj. t=i:y S.I. , Ya'tiraovioh I.A., Pediohlr. Ya. . ■£a., Xuaon The. .(„.ctora wilh tu« ргорег'Л.а:: of tranoformin«;

gvowtb factor p "i.rui flb.-oblnet .'irov.lh factor in -ch? eorly Jonoh епог-усь// ¿ovi'ii-rimtish --> 1-U.n on DoTolopr.ioatal "lolo-

6У (CUiz-J/al, I39X), 0:;гога:ез. - Ю'Л. - 22, - С.',07.

3ö. Стойка P.C., Суюелышцкий С.И., йорчинокий А.Г. Изучение мехами ^моз. >s ¿¡ег'у.'яии- г;:я ,jv«u«ii

"Чорфег«!-?" /ГГупи-'с, I?0?/. Октогяг.з ■• •

С.зегз-Ж.

ЗУ.КорчинськиЯ О.Г., Стойка P.C., Гараоько С.Й., шафранська ГЛ.

>.yz:-'K i/rriiir. цх ^ оюгда-у.яу' .АН;' i . г:;рглд -йдглр-

■•es.'ji т-!ч ;iy:;xmfi r-i сгл •-••ty// '/I V-cu.

öioxiM. з"хэд: Тези допов. ч.1. - Kiüb, 1992. .- С.193.

hj. 1,1'ой к.п г.с. . t.wiiifi н ьнмцькми ih \ - . ikvohmk tl.ia. nn е. л т лж*. ннв un ti»_

чуля^кпх MexaHj»Mii» дхх трано^ормуочого '¿-актора росту р па тини тварин i лвдини// Укр. ÖioxiM. з"хэд: Тези допов. чЛ. -Кихв, 1992. - С.230. 39.Стойка P.C., Сушельницкий С.И., Гарасько С.И'., Шафран екая Г.Г., Кусень С.И. Аутокринная регуляция пролиферации клеток линии . А-549 из адеиокарциномы легких человека в условиях, способствующих закислении культура льной среды// Цитология. - 1992. - 3jt, - С. 96-93...........

••". 7 !!.'• . С'Г-У>ч-\ С, . 'ivcS:':'-. ?'. -itiL-, :

;•> ' ,< "Г: ¡'йЛгЛ - , 'HnTt; ;'1 : . -11.' ' , L ..

. сующего фактора роста р, впидермального "фахтора роста л инсули-

по ли меры и клетка. - 1992. - 8. К'4. - С.39-43. ¿S.stoika R.3., Antoniv -Т.Т., Sushelnltaky S.I. , Kurten S.I. The Influence of transforming .rrowth Xuctor f> (HOI?-ft} end epidermal

J .. ' i ... '.IK , .. ^ i . - - ■■■ ■■

- ад -

Стойка P.C., Антонив Т.Т. Влияние транофориируощего фактора роста fi 'Т§Р-/ь/ и эпидерма льного фактора роста /ЭФР/ на экспрессию протоонкогенов с-шус и c-ios в клетках, различающихся по направленности их пролиферативного ответа на действие T§P-/i// У1 съезд обчества генетиков и селекционеров им.Н.И.Вавилова: Материала съезда, чЛ. - Минск, 1992. - С.ЭО.

45.Корчинский А.Г., Стойка P.C., Кусень С.И. Тепловой иок модулирует способность клеток линии А-549 из аденокарциномы легких челозека аутокринно регулировать интенсивность биосинтеза ДНК и белков// Биохимия. - 1992. - 57, »II. - C.I642-I6V7.

46.Стойка P.C., Д робот Л.Б., Сушельницкий С.И., Юрженко B.C., Кошельник Ю.Р., Кусень С.И. Клетки ранних зародышей вьюка связывают трансформирующий фактор роста ^ // Онтогенез. -1993. - 24. П. - С.38-42. ~

/

Ш; писано до друку 21.12.92.0оршт 60x20/16. Друк.о£с.ПЫр офо. ;.друк.арк.2,32.Ум.фарб.в1Дб.2,54.0бл.-вид.арк-

1крлж 100 прим. 2üm.34o3.

Оола".н£ кшдасо*« др укорня,2900С0,-Льв!в,пул.Стйфл»мга,II.