Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация растений табака и картофеля с помощью рекомбинантных плазмид

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Трансформация растений табака и картофеля с помощью рекомбинантных плазмид"

Российская академия наук Институт общей генетики им. H.H.Вавилова

На парвах рукописи УДК 575.11

ТЕВЕР0ВСК4Я Эмма Хаимовна

ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИИ ТАБАКА Н КАРТОФЕЛЯ С ПОНОЩЫО РЕКОМБННАНТНЫХ Ш1АЗМНД

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биолох-ических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории генетических методов селекции растений Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

В. А. Пухальский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.С.Бадаев

кандидат биологических наук В. М. Андрианов

Ведущая организация: НПО Картофелеводства РАСХН

Защита состоится " " 1993 г. в часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д 002.49.01 в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова по адресу: 117809, Москва, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института общей генетики.

Автореферат разослан " " 1993 г.

УченыЯ секретарь совета. кандидат биологических наук

Полу хина Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейших задач при осуществлении генетический трансформации растений является создание удобных векторов для введения и исследующей экспрессии чужеродных генов в растительных клетках. Возможность использования того или иного вектора определяется методом генетической трансформации, видом растения,, требованиями к акспрессии вводимого гена, способом селекции трансгенных растений и т. д. Поетому число разнообразных векторов постоянно увеличивается. Получены векторы на основе ДНК-содержащих [Be Zoeten et al., 1989; Ward et al., 1988 J и FHK- соде ржащих [Cakamatsu et al., 1987] вирусов, бактериальных плазмид, предназначенные для непосредственного введения в протопласты растений [Fromm et al., 1986] и для генетической трансформации с помощью агробактерий fHorsch et al., 1985]. Дня обеспечения экспрессии чужеродных генов в гетерологичном генетическом окружении используются различные промоторы: конститутивные и индуцируемые, тканеспецифичные и тканецезависимые, сильные и слабые и т. д. Расширяется перечень селективных маркеров, используемых в векторах.

Однако, по смотря на многочисленность появившихся в последнее время растительных векторов, многие из них недоступны из-за ограничений, связашшх с их коммерческим использованием, другие же предназначены для решения узких специальных задач. Поэтому по-прежнему актуальной остается проблема создания универсальных векторов с широким спектром применения. Цель и задами исследования. Целью данной работы являлось

создание новой векторной системы, осуществление с ее помощью трансформации растений табака и картофеля, и использование полученного вектора для введения в эти растения гена рекомбиаант— ного и-интерферона человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Сконструирован новый вксирэссионный вектор, позволяющий встраивать различные гены под контроль сильного конститутивного промотора 35S из генома вируса мозаика цветной капусты [Ргопш et al., 1986]. Полученный вектор несет селективный маркер устойчивости к канамиципу, что дает возможность вести прямой отбор трансгенных растений, а такли биохимическим методом определять наличие гена неомицинфосфотрацсфэразы [Reies et al., 1984]. Вшчешо и вектор правого и левого окаймляющих Т-ДНК повторов размером 20 пн обеспечивает возможность его использования с разными типами Ii-шшзмид агробактерий, что не исключает применение данного вектора для трансформации протопластов in vitro. Впервые осуществлено введение гена рекомбинантного а-интерферо-на человека в растения табака и картофеля и показана его акс-ирессия в трансгешшх растениях.

Полученные результаты могут быть использованы для конструирования устойчивых к вирусным заболеваниям важных сельскохозяйст-

■I

венных культур, в частности, картофеля.

Апробация работы. Результаты- работы были представлены на У Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнодогия" (Новосибирск, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), Симпозиуме Индийского общества генетиков и селекционеров рас-' тений (Ньм Дели, 1991).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 57 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 146 названий библиографии.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Иммунологическое определение продукции интерферона в трансг.енннх растениях проводилось совместно с сотрудником Института микробиологии и шшдемиологии им. Н.Ф.Гамалэи Д.Л.Беляевым.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Конструирование акспрессиоиного вектора pST 6.

Схема получения вектора pSI 6 представлена на рис. 1. Экс-ирессионная кассета, включающая промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты и сигнал терминации и полиадэнилирования из 3'-области гена ноиалинсинтазы, была получена из плазмида pCaMY N150 [Proгш et al., 1986], любезно предоставленной М.фроммом (США). С 8тоИ целью из плазмида pCaliV ЮЗО путем расцепления рестриктазой BamHI и последующего лигирования вырезали ген нео-мицинфосфотрансферазы II, из полученной в результате плазмида вырезали HintlIII-фрагмент размером 0,75 тпн, содержащий екс-прессионную кассету, и клонировали его в сайт HindlH плазмида pGV 928 [Andre et al., 1986], любезно предоставленной Д.Двдре' (Бельгия). Структуру полученной в результате плазмида рБС 6 и ориентации 35S промотора в ней проверили с помощью рестрикцион-ного анализа. В векторе рЗЗ? 6 имеется унккальный сайт BamHI для клонирования чужеродных генов в вкспрессионную кассету. Наличие гена неомицинфосфотрансферазы II под контролем промото-

t

pa P(jQS обеспечивает возможность селекции трансформированных растительных клеток и тканей на среде с канамицнном. Расположение левого и правого сигнальных повторов размером 25 пн, обуславливающих перенос заключенной между ними ДНК в растительные клетки, на плазмиде pSI 6 позволяет использовать в паре с втим вектором разные типы Ti-длазмид, независимо от присутствия в них сигнальных повторов размером 25 пн. Селекция коинтегратов pST 6 с Ii-илазмидой в клетках агробактерий осуществляется с помощью антибиотиков стрептомицина и спектиномицина. Эти свойства, а также относительно малый размер pSl 6 делает ее весьма удобным, на наш взгляд, вектором для трансформации растений.

Шшзмида pST 6 лишена собственного кокыагативного аппарата, а также способности автономно реплицироваться в клетках агробактерий. Поэтому ее передача в Agrotxicterium. timefaciens CI58 RiXU (pGV2260) из E. coli TGI (pSl6) осуществлялась путем мобилизации коныогативной плазмидой рБК 2013 в Е. coli С600 [Лихтенштейн и соавт., -1988]. В результате трехродательского скрещивания и последующей селекции трансконьшгантов на среде с рифамоицином, стрептомицином и спектиномицином были отобраны клоны агробактерий, получивших плазмиду pSI б. У некоторых

I

иолучешшх клонов исследовали структуру плазмидаой ДНК методом блот-гибридизации. Полученный- в результате штамм бактерий, содержащий коинтеграт нлазмид pST 6 и pGV 2260, использовали для инфицирования растительных клеток при трансфорции методом листовых дисков. 1

2. Трансформация растений табака методом листовых дисков. В работе использовали растения Ntcoticma tabacum, сорт Сам-

сун, и гибрид Терновского, полученные из семян и размножаемые черенкованием в стерильных условиях на агаризованной среде МС IMurasliige et al., 1962]. Растения выращивали при световом режиме 16 ч свет -8ч темнота при 24°С. Трансформацию листовых дисков проводили по методу [Horsch et al., 1985] с модификациями. После инфицирования листовой ткани агробакгериями и инкубирования ыа среде для органогенеза с канамицином в течение 3 недель наблюдалось образование канамицинустойчивых побегов. Количество этих побегов было в 20-50 раз меньше количества побегов, образующихся из такой а» листовой массы на среде без канамицина. Обычно с 1 г листовой ткани после инфекции агробак-терилми образовывалось 3-10 канамицинустойчипых побегов. В контрольных экспериментах без бактериальной инфекции образование побегов на среде с канамицином происходило в 10-20 раз реже. Образовавшиеся на селективной среде побеги вырезали и переносили на среду для укоренения, таюке содержащую канамицин. Через 3 недели более половины побегов, как правило, укоренялось. Укоренившиеся растения нормально росли на среде с канамицином и морфологически не отличались ,от исходных. При черенковании они сохрали способность укореняться и расти на селективной среде.

Кусочки листьев канамицинустойчивых регенерантов при помещении

1

на среду для каллусогенеза, содержащую 50 мг/л канамицина, формировали каллусы с такой жэ эффективностью, как и на среде без антибиотика. Кусочки листьев контрольных растений, не подвергавшихся трансформации, нормально формировали; каллус на среде без канамицина, но были неспособны к втому 'в присутствии антибиотика . ' При растирании листьев и стеблей растений-регенерантов и высеве

растительного сока на питательную среду для бактерий не наблюдалось бактериального роста при инкубации З-б дней при 30°С. Этот результат показывает, что регенерировавшие канамицину-стойчивые растения не содержат в своих тканях примеси агробак-терий. Таким образом, инфекция листовых дисков полученным

о

штаммом Л. tumefaclena CI58 М_Г , несущим коинтеграт плазмиды pSi' 6 с "разоруженной" Ti-плазмидой pGY 2260, сопровоадалось приобретением растениями-регенерантами признака устойчивости к канамицину.

Для доказательства трансгенной природы канамицинустойчивых ре-генерантов растений табака использовали метод дот-гибридизации и метод оцределения неомицинфосфотрансферазы. Как видно из результатов определения наличия фермента, представленных на рис. 2, из пяти проверенных растений все давали положительный сигнал. Полученные данные позволяют сделать вывод, что сконструированный експрессионпый вектор pSI 6 моаигт быть использован для получения трансгенных растений.

3. Клонирование гена рекомбниаитного а-интерфероиа человека в вектор psr е.Плазмида pIFLrA представляет собой вектор рВЙ 322, в котором малый PstI-EcoRI-фрагмент заменен на ген рекомби-ианташ'о a-интерфероиа человека, встроенного под контроль трип-тофанового промотора Е. coli [Pestka, 1983]. При етом инициирующий AIG кодон гена находится непосредственно за сайтом EcoRI.' Схема клонирования гена интерферона в вектор pSE 6 представлена на рис. 3. На первом етапе ген интерферона в составе 0,9 тпн Pstl- EcoRI-фрагмента был клонирован в плазмиде pUC 19 с под-страиванием к нему полилинкера из плазмиды pUC 19- В полученной плазмиде ген интерферона оказался между двумя сайтами

t

BaniHIT На следующем этапе этот ВamHI-фрагмент вырезали и клонировали в расщепленный ВашН1 вектор pSÜ 6. Ориентацию' вставки проверили с помощью рестрикционного анализа. В итоге была получена илазмида рЗТ 20, несущая ген интерферона человека, встроенный под контроль промотора 35S.

Передача илазмидн pST 20 в А. timefaclens CI58 HiX11 (pGV 2260) из Е. coli Tlil осуществлялась путем мобилизации конъшгативной нлазмидой pIUC '¿0\'J.

4. Трансформация растений табака .с помощью плазмиди pST 20.

Трансформацию листовых дисков табака проводили аналогично трансформации с применением вектора pSI 6. Образовавшиеся в результате трансформации канамицинустойчивиэ побеги переносили на среду для укоренения, содержащую канамицин, где через 3 недели более половины из них, как правило, укоренялось. Укоренившиеся растения нормально росли на среде с канамицином и при черенковании сохраияли способность укореняться и расти на селективной среде. Кусочки листьев канамицинустойчивых регенерантов при помещении на среду для каллусогенеза, содержащую 50 мг/л каиа-

мицина, формировали каллусы с такой асе еффективностью, как на

/ *

среде без антибиотика. Кусочки листьев контрольных растений, не

подвергавшихся трансформации, нормально формировали каллус на'

«

среде без канамицина, но были неспособны к атому в присутствии антибиотика.

При растирании листьев и стеблей растений-регенерантов и высеве раотительыого сока на питательную среду для бактерий не наблюдалось бактериального роста, что свидетельствует об отсутствии в тканях sтих растений примеси агрюбактерий. '

Таким образом, инфекция листовых дисков полученным штаммом А.

Сите/ас1ечз С158 Ш.Х®, несущим каинтеграт рвксшбишштной шшз-миди рЯС 20 с "разорулмнной" И-пшазмидой рСУ 2260, сопровождалась приобретением растенияыи-регеыарантами признака устойчивости к канамицину.

Для обнаружения вставки гена СЬгА в канамицинустойчивых реге-иерантах растений табака и доказательства тем самым их трансгенной природы использовали метод дот-гибридазадшг. На нейлоновый фильтр наносили по 30 мкг денатурированной ДНК и после

32

иммобилизации на фильтре гибридазовали с Р-мэ чаным РаИ-фраг-ментом илазмиды рис 19: :И?1«гА, содержащим ген интерферона. В качестве полонительного контроля использовали ДНК илазмиды рЗТ 20, расщепленную ВсоК1. Как видно из результатов гибридизации, представленных на рис. 4, из пяти проверенных растений только три давали положительный сигнал гибридизации с геном 1¥ЬгА. Два таких растения (Б1 и 58} относились к сорту Самсун, а одно - к гибриду Терновского (Н11). У растения Б8 гнбридаза-циошшЯ сигнал был более сильным, что, вероятно, указывает на встраивание в геном более . одной копии гена ЕЬтА. Два других растенил-регенеранта, одно из которых (Б12) относилось к сорту Самсун, в второе (Н9) - к гибриду Терновского, не содержали гена Интеле рода.

Способность к транскрипции у встроенного в растительный геном гена ЗИл'А определяли методом МоШегп-гибридазации. Полученные' результаты показали, что в трансгенных растениях табака гибрида Терновского (Н11) и сорта Самсун (Б1) синтезируются молекулы РНК, гомологичные гену интерферона.В контрольных растениях табака сорта Самсун подобных молекул РНК не обнаружено. Этот результат показывает, что ген человеческого интерферона, встровн-

в

ннй в геном растений, транскрибируется.

Для исследования синтеза белка, кодируемого геном интерферона в трансгешшх растениях, использовали метод флюоресцентного анализа. Моноклональные антитела против лейкоцитарного интерферона человека и меченные антитала против мыши были любезно предоставлены Д.Л.Беляевым (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР). На рис. 5 представлены результаты одного из трех експериментов, проведенных с трансгенными растениями, взятыми через три недели после укоренения. Эти аксперименты были поставлены с интервалами 1-2 дня и всюду были получены одинаковые результаты. Как видно из представленных данных, в трансгешшх растениях табака сорта Сомсун (31 и БЗ) и гибрида Терновского (Н11) синтезировались молекулы, реагирующие с моноклональними антителами против лейкоцитарного интерферона человека. В контрольных растениях табака подобные молекулы отсутствовали. Этот результат показывает, что п полученных трансгенных растениях со встроенного гена 1Р1огА осуществляется транскрипция мРНК, которая затем транслируется в белок интерферона с сохранением правильной рамки считывания.

Приведенные выше результаты исследования акспрессии гена интерферона человека били получены на молодых растениях-регенеран-тах, взятых через 3 недели после укоренения'. Повторный анализ тех же растений через 2 месяца показал, что количество продукта гена ХРЬгА в листьях, определенное иммунофяюоресцентным методом, существенно снизилось. Из одинаковой массы листьев выделяли приблизительно в 10 раз меньше интерферона, чем из листьев молодых регвнерантов (по результатам трех експериментов). Одновременно происходило снижение количества интерферонспецифичной

мРНК в растениях. Данный аффект наблюдался у всех проверенных растений.

5.Трансформация растений картофеля с помощью плазмнды рБТго.

Для трансформации растений картофеля сортов Лукьяновский, Голубизна и Приекульысий ранний использовали модифицированный метод листовых дисков и оригинальную высокоеффективную систему регенерации картофеля, сводящую к минимуму сомаклональыую вариабельность . .Использованная система позволяет в течение 3-4 недель получать в среднем до 10 растений-регенерантов на екс-плант. При отим практически отсутствует стадия развития каллуса. Трансформацию тканей картофеля проводили по схеме, изображенной на рис. б.

Дли выяснения присутствия вставки гена ХРЬгА в канамицинустой-чииых регенерат'ах растений картофеля и доказательства тем самым их трансгешюй природы использовали метод дот-гибридизации.

На нейлоновый фильтр наносили по 10 мкг денатурированной ДНК и

32

после иммобилизации на фильтре гибридазовали с Р-меченой ДНК фага М13шр18: сПЧа-А, содержащей ген интерферона. В качестве по-ло:кителыюго контрой использовали ДНК плазмиды рБТ 20, расщепленную ЕсоИХ. Как видно из результатов гибридизации, представленных на рис. 7, два растения-регенеранта давали положительный сигнал гибридизации с геном ГРЬгА. Таким образом, были получены трансгенные растения картофеля, несущие ген ГРЬгА.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сконструированный в настоящей работе ''експрессионный вектор рБТ б можно отнести к типу универсальных растительных векторов с широким спектрам применения. Наличие сильного конститу-

тивного промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты дает возможность использовать полученный вектор для клонирования различных чужеродных генов под контроль етого промотора. Наряду с акснрессиошшй кассетой вектор pSC б содержит експрессирую-щийся в растениях ген неомицинфосфотрансферазы XX бактериального транспозона !Гп 5. что позволяет вести селекцию трансформированных клеток и тканей растений на среде с канамицином, а также биохимическим методом определять наличие гена неомицин-фосфотрансферазы. Включение в вектор правого и" левого окаймляющих Т-ДШС новторов размером 25 пн обеспечивает возможность его использоиаш1Я с разными типами Ш1-плазмид агробактерий при инфекции растительных клеток, что тем не менее не исключает применение данного вектора для трансформации in vitro растительных протопластов. '

Вектор рЗТ G был использован для трансформации растений табака и картофеля. Возможность применения высоких концентраций кана-мицина в процессе селекции трансгенных растений свидетельствует о том, что сигнальные последовательности размером 25 пн не повреждены. Высокая эффективность трансформации позволяет сделать вывод о пригодности данного вектора для етой цели. В данной работе с помощью вектора рБ1 б была осуществлена передача гена рекомбинантного а-интерферона человека в растения табака и картофеля. Это позволило оценить пригодность вектора для' введения и экспрессии чужеродных генов в растительных клетках, а таклсе исследовать функционирование человеческого гена в гете-рологичном Х'енетическом окружении. '

Использованный нами ген интерферона представляет собой ген лейкоцитарного интерферона А человека с удаленной лидерной после-

дователыюстш. отвечающей за екскрецшэ молекулы из клетки. Инициирующий АМ-кодон в атом гене находится непосредственно перед кодоном, кодирующим первую аминокислоту - цистеин - в зрелой молекуле интерферона [PestJca, 1983L Ранее было показано нормальное функционирование этого гена под контролем тршггофа-нового промотора в клетках Е. coli, приводящее к синтезу белка, биохимически и иммунологически неотличимого от лейкоцитарного интерферона человека [Peatka, 1983]. При клонировании гена IfLi'A и вектор pST б использовали приемы, не нарушающие целостность кодирующей части х-ена. При отом било соблюдено условие, что ме:кду 35:1 промотором и инициирующим кодоном гена XPLrA отсутствовали бы другие А'Ги-кодоны. Это обеспечило соблюдение правильной рамки считывания при трансляции и синтез в трансгенных растениях белка, иммунологически сходного с лейкоцитарным интерфероном человека.

В рекомбинантной нлазмиде pSÜ 20 ген XFLz'A расположен непосредственно рядом с геном неошщшфосфотрансферазы II, кодирующим устойчивость к канамиципу. Однако не все канамициыустойчивые растения табака, образовавшиеся при трансформации, приобретали ген интерферона. Мы предполагаем, что вто могло быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, на среде с канамицином некоторые

I

растения могли вырасти не в результате генетической трансформации, а образоваться спонтанно, что, хотя и с низкой частотой,' наблюдалось в наших экспериментах. Во-вторых, причиной образования канамицинустойчивых растений, не содержащих ген интерферона, мох'ло быть нарушение сцепления генов'" КРТП и ГРЬгА при переносе из бактерий и встраившш в растительный геном. По-видимому , для установления причин появления растений такого типа

!

требуются дополнительные эксперименты.

В работе были получены канамицинустойчивые растения-регенеранты табака сорта Самсуа и гибрида Терновского, содержание ген интерферона человека. Анализ этих растений показал, что переданный в них из агробактерий ген IFLrA обусловливает синтез ин-тер1еронспецифичной мРНК, размер которой совпадает с ожидаемым. С данной мРНК транслировался белок, иммунологически сходный с лейкоцитарным интерфероном человека. Эти результаты свидетельствуют о нормальной экспрессии введенного в растительный геном гена человеческого интерферона.

Мы обнаружили, что количество транскриптов в регенерировавших растениях было небольшим, а также спустя некоторое время синтез интерферона в трансгенных растениях снижался. Видимо, имеет место некая система регуляции чужеродного гена. Трудно объясним низкий уриuoiib экспрессии, хотя присутствие белка интерферона в тканях трансгенных растений было установлено в ходе их исследования, и сдвига рамки считывания в процессе клонирования гена IíIitA не произошло. Уровень экспрессии оказался ниже ожидаемого на 2-3 порядка, что не характерно для такого сильного промотора как 355. Причины этого пока . неясны. Можно предположить,что

функционирование гена ГРЬгА оказывает отрицательное воздействие

i

на развитие растения, которое пытается тем или иным образом понизить уровень интерферона. Одной из таких возможностей являет-' ся подавление экспрессии гена, встроенного в растительный ге-иом. Ранее был описан случай ингибирования аксцрессии гена но-палинсинтазы, введенного в растительные клетки, в результате метилирования ДНК. Устранение метилирования с помощью 5-азаци-тядина приводило к появлению высокой активности нопалинсин-

i3

тазы LUepburn et al., 1983]. Можно предположить, что в нашем случае мы имеем дело с похожим явлением. В to м время есть дашше oö отсутствии какого-либо видимого аффекта на растения експрессии гена лейкоцитарного интерферона человека. При введе-нииотиго гена в растения Brassica гара в составе автономнореп-лицирующегося вирусного вектора наблюдалась его активная вкс-прессия в растительных клетках, которая тем не менее никак не отражалась на росте и развитии растений [De Zoeten et al., 1989]. Возможно, фушсционирование чужеродного гена в растениях может зависеть от способа введения и существования данного гена в растительных клетках.

Полученные нами в результате трансформации с помощью плазмиды pS'J? 20 трансгенные растения табака могут быть использованы как продуценты рекомбинантного а-интерферона человека. Эти растения способны нарабатывать порядка 1000 единиц интерферона на грамм сырой ткани. Такой уровень експрессии является достаточно высоким душ возможного промышленного использования полученных растений. Следует отметить ряд существенных преимуществ применения трапсгенных растений дня получения интерферона человека перед другими организмами - продуцентами етого белка. Во-первых, относительная дешевизна втого метода, поскольку для получения больших количеств биомассы растения-продуцента отсутствует необходимость . использования дорогостоящего специального оборудовался, помещений, ростовых сред, стерильных условий выращивания, а также высоко!свалифицированного персонала. Во- вторых, что особенно важно в'современных условиях, с использованием подобного метода полностью исключается возможность заражения препарата интерферона вирусом СПИДа, гепатита и т.п.

Успешно проведенная трансформация растений табака с помощью сконструированного нами вектора, несущего ген рекомбинантного а-инте!)ферона человека, побудила нас к попытке повторения всех этих экснериментов на картофеле ввиду огромного значения етой сельскохозяйственной культуры. В результате выполненной работы но трансформация картофеля с помощью вектора рБТ б и плазмиды 1>3'1! 20 били нолучены трансгешше растения со встроенным геном ХРЪгА.. В настоящее время эти растения находятся в процессе исследования экспрессии в них интерферона, а тагосе возможной их устойчивости к различным вирусам.

ВЫВОДЫ

1. Получен окспрессиошшй вектор рБТ б, позволяющий встраивать чужеродные гены под контроль сильного конститутивного промотора 353 из вируса мозаики цветной капусты.

1!. Осуществлена трансформация растений табака с помощью вектора рЗТ б и получены растения, способные расти на среде с канамицн-ном и вкснрессирующие неомицинфосфотрансферазу II.

3. Осуществлено клонирование гена а-интерферона человека в вкспрессиишшй вектор рЗТ б под контроль промотора 35Б из вируса мозашси цветной капусты.

I

4. С номощьи метода трансформации с использованием агробактерии ген человеческого а-интерферона введен в растения табака и картофеля .

5. Получена нормальная експрессия гена а-интерферона человека в растениях на уровне транскрипции и синтез 'белкового продукта,

I

иммунологически идентичного а-интерферону человека. '

Список работ, опубликованных по теме яиоовртацин.

1. Смирнов С.П., Крашенинникова Л.В., Теверовская Э.Х., Пухальский В.А. Новий интегративный вектор для трансформации двудольных растений. 1988, V Международная конференция "Биология культивируемых клеток и биотехнология", Новосибирск. Материалы, с. 1У5-196.

2. 'Геверовикая Э.Х., Крашенинникова Л.В., Смирнов С.П., Пухальский В.Л., Рассадина Г.В., Хромова Л.М. Генетическая трансформация растений, табака и картофеля с помощью нового експрессиошюго вектора pST б. 1990, VII Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 20-23 марта. Тезисы докладов, с. 179.

3. Смирнов С.П., Теверовская Э.Х., Крашенинникова Л.В., Эль-Хала^ави А.Х., Пухальский В.А. Введение гена рекомбинантно-го ч-иитерферона человека в растения табака. 1990, VII Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 20-23 марта. Тезисы докладов, с. 174-175.

4. Смирнов С.П., Теверовская Э.Х., Крашенинникова Л.В., Пухальский В.А. Создание експрессионного иптегративного вектора и его использование для введения в растения гена рекомбинантно-го альфа-интерферона человека.- 1990, Генетика, т. 26, К 12, с. 2111-2121.

I

5. Смирнов С.П., Теверовская Э.Х., Крашенинникова Л.В., Пухальский В.А. Рекомбинантная плвзмидаая ДНК рБ!Г20, кодирующая альфа-интерферон человека в растениях табака. Авторское свидетельство N 1751207 по заявке N 4817194, приоритет от 20.04.1990. Зарегистрировано в Гос. реестре 1.04.1991.

G. Siniriiov 3.1'., 'l'overovakaya E.G., Pukhalsky Y.A., Kj;-a3iteniruilkova L.V.. Kassadina G.V7, Khromova I.M. Introduction into the tobacco and potato plants o£ recombinant human alia-interferon gene. 1991, Genetic Research and Education: Current i'renda and the 'Next Fiity Years, Symposium oX Indian Society oJT Genetics and Breeding, New Dehli, p. 843844-

H'ntl Dl

CQHYJ53 pptMsmtp OlmHl

\B»mllI Cnat polf(A)

"•" itJaflu "•?"»»)

Bsmlll * .fiHrala

Hinda

Phcj. 1. CxeMa KoucrpyiipoBaHJifl BeKTopa pSS6.'

3 4

Рис. 2.Определение Iffi в растениях табака, трансформированных с помощью плазмиды pST6: 1 - экстракт Е. colt, 2 - экстракт не-трансформированного растения, 3-7 - экстракт трансгенных растем ниИ.

to>I "1—В

Ml М ItMl

I 1

I.«К!

НЫВ

Рис. 3. Схема клонирования гена рекоыбинантаюго а-интерферона человека в вектор pSl6. " ,

6

32

Рис. 4. Дот-гибридизация Р-меченой ДНК гена ZPLrA а: 1 ,2 — 10 и 100 пг рестрицированной EcoRI ДОК плазмида pST20; 3 - ДНК' из ^трансформированных растений табака сорта Самсун; 4,5 - ДНК из канамицинустойчивых регенерантов табака гибрида Терновского Н9 и Н11; 6-8 - ДНК из канамицинустойчивых регенерантов табака сорта Самсун SI, S8 и SI2. Взято по 30 мкг растительной ДНК.

i г з к s

Рис. 5. Иммунофлюоресцентяый анализ продукции интерферона в трансформированных растениях табака. Препараты получены из лейкоцитарного интерферона человека (500 ед.) (1), нетрансформиро-ванных растений табака гибрида Терновского (2), трансформированных растений табака H11 гибрида Терновского (3) и Б1 (4) и S8 (5) сорта Самсун.

j

Эксшланти (мвждоуалил) цробирочдых раотввий

Среда I: ЫН4Ш3; ОаО^; ИУК; ВАЛ. ^24 часа'

Среда XX: Ш-шш; сахароза; машштол; ИУК: БАС. 7 дива

Среда XXX: МС-соли; сахароза; £¿11; гжЗвреллсвал к-та. .

До образования побегов

I

Среда XV: МС-соли; сахароза; ИУК.

I"

Уиореыаииа Размиохеиие

Рис. б. Схема трансформации картофеля с помощью А. 4ше/а-с1епз, содержащих плазмиду рБТ20.

1 2 -5 4 5

Рис. 7. Дот-гибридизация Р-мвченой ДНК гена ХРЬгА 1 - ДНК из нетрансформированных растений картофеля сорта Лукьяновский; 2 - ДНК из ■ нетрансформированных растений картофеля сорта Ириекульский ранний; 3 - ДНК из нетрансформированных растений картофеля сорта Голубизна; 4,5 - ДНК из канамицинустойчивых регенерантов картофеля сорта Лукьяновский. Взято по 10 ыкг растительной ДНК.