Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система переноса генов в картофель и хлопчатник на базе опухолеродных бактерий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Система переноса генов в картофель и хлопчатник на базе опухолеродных бактерий"

«-». Д о.

АКАДЬМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

Макарова Ольга Евгеньевна

УД{ 577. '¿1

СИСТЕМА ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В КАРТ05ЕЛБ И ХЛОПЧАТНИК НА БАЗЕ ОПУХОЛЕРОДШХ БАКТЕРИЙ

03.00,03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1580

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растения Института молекулярной биологии АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор К.Г.Офябин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Я.И.Бурьянов, кандидат биологических наук Кирнос М.Д.

Ведущая организация: Институт физиологии растений им К.А.Тимирязева АН СССР

Защита диссертации состоится -fSC^Sit'^igaer.

часов на заседании Специализированного Ученого совета Д.002.79.'01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте молекулярной биологии АН СССР по, адресу,- 117984. Москва, ул. Вавилова, ц. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЫБ АН СССР.

Автореферат разослан

УЛ ¿¿¿-¿¿ ^ 19QQ Г|

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

Крйцын

ь

Актуальность темы.Скрещивание и разработанная в последнее время соматическая гибридизация били основными методами изменения генетического материала растений. Генетическая инженерия необычайно расширила арсенал методов оперирования с генами. Для растений до настоящего времени оставался нерешенным вопрос о переносе в геном требуемой информации. Для решения этих проблем в отношении двудольных растений создана оригинальная система переноса генетической информации, в которой используется свойство почвенных микроорганизмов Акго-Ьа<Пег1ит гшв!ао1епв передавать часть своей плазмвдной ДНК в хромосому растений. Первые работы по переносу чужеродных генов в растения, выполнены в основном на. модельных объек-""IX. Установлено стабильное состояние чужеродных генов, наследование определяемых ими признаков по Менделю; разработаны эффективные системы селекции.

Все это создает предпосылки для переноса "полезных" генов в растения, используемые в сельскохозяйственной практике. С другой стороны совершенствование технологии трансформации, сведение ее к высокоэффективной рутинной процедуре позволит изучать структуру и функции растительного генома.

Изучение механизмов трансформации, возможно, поможет преодолеть барьеры на пути к переносу генов в однодольные растения.

Цель и задачи работы. Цель работы - осуществление переноса гетерологичной генетической информации в геном растений, используемых в сельскохозяйственной практике. В соответствие с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

получить штаммы агробактерий, содержащих векторы рекомбинан-тного и бинарного типов, способные переносило в растения чужеродные гены; перенести с их помощью бактериальные гены в системе регенерированных протопластов и "дисков" табака, ;привести систему доказательств, подтверждающих трансформацию; найти штаммы агробактерий, и систему трансформации для переноса генов в геном картофеля и хлопчатника.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показана возможность применения бинарных векторов в системах заражения эксплантантов растительных органов, отличных от Nioptiana видов растений.

. Обнаружена способность штамма 1058 с Bini9 переносит!,ь Т-ДНК бинарного вектора в клетки N.tabacimi.

С использованием штамма 1058« Biiii9 получен перенос бактериального гена NPT11 в каллус картофеля и хлопчатника. Экспрессия гетерологичного гена In vivo тестирована по устойчивости кчеток к повышенным концентрациям канамицина и in vitro - по активности NPT11 в клеточном экстракте.

На примере штамма 1058 с Bini9 показана возможность использования онкогенных Ti-плазмид для активации переноса Т-ДНК бинарного вектора и получена регенерация побегов табака, зараженного таким штаммом.

Практическая ценность работы г-ключаетсь в том, что получена система переноса гетерологичной генетической информации в сельскохозяйственно важные растения - картофель и хлопчатник.

- э -

■ Обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора ' щтературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, ¡ыводов. Материал изложен на 90 страницах текста,-включает >2 рисунка и а таблицы. Список использованной литературы содержит 145 наименования.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на заседаниях отдела генетической инженерии и на конкурсе научных работ молодых ученых Института молекулярной биологии: материалы были представлены на те?латической выставке "Биотехнология - народному хозяйству" на ВДНХ СССР, Москва, 1985, на У Всесоюзном биохимическом съезде, Киев, 19в6.

- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались штаммы Escherichia coli НВЮ1, ¿grobacterium tumefaoiens LBA4404 , C58C1(pGV3850) , 1058.

Культуру E.coli выращивали в бульоне УЕВ ( 10 г/л пептона, Ю г/л дрожжевого экстракта, ь г/л хлорида натрия ).Культуру A.tumefaoiens выращивали в среде УЕВ или на минимальной среде А. Все культуры выращивали на чашках со средой УЕВ с 1,5 Я агаром.

Выделение плазмидных ДНК. Выделение плазмид из Е.оо-11 проводили щелочным методом. Плазмиды из агробактерий выделяли по методу Kacto and Lin (1981). После инкубирования в течение 24' часов клетки ресуспендировали в буфере, содержащем 40 мМ трис-ацетат, 2 мМ NaEDTA, рН 7.9 и добавляли 5 объемов .визирующей смеси: 50 мМ трис-HCL, 3% SDS, рН 12,6 , перемешивали и 20 минут выдерживали при 60°С. После

экстракции смесью фенола с хлороформом ДНК раздели * в о. 6* агарозном геле.

Гибридизацию ДНК колоний E.coli И Agrobaoteri-um проводили на нитроцеллюлозных фильтрах по методу Grun-etein and HognesB (1975).

Выделение тотальной растительной ДНК проводили методом фенольной депротеинизации по модифицированному методу мах— гаиг (1961).

«Дот"-гибридизацию проводили по модифицированной методике Keinkoth et el. (1984).

Коныогативный .перенос плазмид: а} из E.ooli в E.coli проводили в жидкой среде. С) из E.ooli в Agrobaoterium проводили на нитроцвллюлозных фильтрах на агаризированной среде.

Тестирование катаболизма нопалина и октопина агробакте-риями осуществляли в соответствии с методикой Hooukaas et al.(1979).

Активность неомицинфосфотрансферазы11 определяли по модифицированной методике, описанной Schrier et а!.(1985). Растительный материал. В работе использовались: a) Nicotiana tabaouai с. Висконсин 38 и с. Самсун. б.) Solanum tuberosum с.Весна. В) Gossipium arboreum С. 02906. Выращивание растительного матери...а. Растения табака с. Висконсин выращивали в оранжереях фитотрона в стандартных условиях , с.Самсун и культуры клеток - в асептических условиях. Стерильно выращенные растения табака размножали вегетативно.

Хлопчатник выращивали из семян в асептических условиях с климатической'камере при 28°С.

Культуральные среды. Для культивирования протопластов пользовались средой КЗ /Zambryski et al. 1984/

Для выращивания растений и каллуса использовали среду Мурашиге и Скуга (МС).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Маркером во всех экспериментах по трансформации служила устойчивость к канамицину, обусловленная экспрессией гена неомицинфосфотрансферазы11 под регуляторными областями: промотором и терминатором гена нопалинсинтазы нопалиновой плаз-мидо pTi058 - последовательность nos-NPTi1. Устойчивость к канамицину - удобный признак, позволяющий легко и быстро отбирать резистентные клетки, а промотор nos кон-ститутувно экспрессируется во всех тканях растения.

Создание штамма Agr-obakterium с вектором рекомбинэнтного типа

Для конъюгативного переноса вектора РЬ0У2Эпео, содержащего последовательность nos-NPT11, в Agrobaoterium мы воспользовались системой, предложенной Van Haute et al.(1983). Штамм HB101 0J23 содержит плазмида R64drdl1 (Тц) и pGJ28 ( КМ, Им), обеспечивавшие транспортные и мобилизационные функции для Со1В1 решшкона In trans, соответственно. R64drdi1 и pGJ28 были введены в штамм

E. ool i (pKV23neo) путем скрещивания в жидкой ск де с отбором трансконъюганчов на среде с антибиотиками Тц, Нм и Кб.

Полученный штамм E.ooli с тремя плазмидами использо вался как донорный в конъюгации с A.tumefaoiens (p«V3850). PQV3850 содержит последовательность рВЮ22 меаду левой и правой границами Т-ДНК. Плазмиды на основе СоШ репликона не способны реплицироваться в агробактериях и при соответствующей селекции будут отбираться только те клетки, где произошла интеграция вектора в pOV3850.

Так как было показано, что промотор гена пое может функционировать в агробактериях, устойчивость к Км может служить маркером переноса и интеграции pißV23neo. Уровень экспрессии в данном случае позволяет вести селекцию на среде с 25 мт/л Км. Скрещивание про во дали на нитроцеллюлозши фильтрах: о и -1 разведение высевали на селективные среды с Риф, Км. На чашках через сутки вырастали колоши е.coli, видимо, спонтанные мутанты по Риф и через двое суток - морфологически хорошо отличимые от Е.coli, гладкие белые колонии трансконъюгантов агробактерий, что подтверждалось ю ростом на чашках с агаром, где единственным источником азотг служил Нопалин, специфически утилизируемый нопалиновыш штаммами агробактерий.

Наличие гена NPT11 в агробактяриях проверяли гибридизацией колоний in situ с меченым фрагментом BatnHi-Sali из Тп5.

Трансформация нДаЪасит методом кокультивации агробактерий с регенерироввннами протопластами*

Трансформирующую способность полученного штамма проверяли в системе регенерированных протопластов двух сортов табака: с.Висконсин (оранжерейные растения ) и с.Свмсун ( асептически выращенные растения ). Преимущество такой технологии состоит в том, что она позволяет получать трансформированные растения и ткани, представляющие собой обычно клон клеток. Кроме того, в одном эксперименте может быть получено большое количество независимых трансформационных линий. Процедуры проводились с использованием опыта 1£агаЬгувК1 вг а1. (1984). Кусочки листьев помещали на поверхность ферментного раствора: 0.5 М Опогика 11-10, 0.256 Ыасеговугое Л-ю, 0.5Я сахароза, 55 мМ сас12 рН 5.6 и инкубировали ночь

при го°С. После завершения ферментации протопласты отмывали, высевали в чашки Петри- ( по 9 мл. плотностью 5хЮ клеток/мл ) и культивировали э дня в среде КЗ с 1 мг/л НУК, 0.1 мг/л кинетина, 0.1 мг/л ВА11Д4М сахарозой.

20 мкл суспензии агробактерий добавляли к протопластам в соотношении 200 : 1 и оставляли на з дня.На протяжении

»Первые этапы этой работы проводились в содружестве с отделом биологии клетки и биотехнологий института физиологии растений АН СССР ( зав. отделом член. корр. АН СССР Р.Г.Бутенко ) и отделом цито$изиологии и клеточной инженерш института ботаники им. Холодного К.Г. АН УССР (зав. отделом акад. АН УССР Ю.Ю.Глеба)

всего опыта велась '"штрольная линия протопластов, зараженных Xgrobaoterium (pGV3850).Через 3 дня растительные клетки отмывали и высевали на среду КЗ ( 5x1 о клеток/мл) с О.ь г/л цефотаксима дам предотвращения роста бактерий. Через г недели образовывались микроколонии, плотность которых уменьшали в 2 раза разбавлением суспензии путем добавления равного объема среды КЗ с о.гм сахарозой, о.2 мг/л БАП и ои мт/л НУК. Еде через 2 недели плотность микроколоний доводи-

3

ли той же средой до ю колоний/мл.

Для селекции трансформантов микроколонии распределяли

по поверхности среды МС с 0.8% агаром , 3% сахарозой, 0.2

мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК и 50 мг/л канамицина. Трансформанты

проявились через 4 недели как плотные зеленые быстрорастущие

-а

колонии (Рис.1) при частоте в среднем 5хю . в конт{Юльнои культуре, трансформированной Agrobacterium с p«V3850 все колонии принимали бурую окраску и прекращали рост.

Активно растущие колонии пересаживали на среду, индуцирующую органогенез: среда МС с 1.5 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК и 80 мг/л Км. Побеги укореняли на Оезгормональнои' среде с 1% сахарозой и 80 мг/л Км.

Доказательства, свидетельствующие о переносе генов в растения Первичной селекции, проводимо'4 на уровне микроколоний, недостаточно для достоверного установления переноса гона и его экспрессии в пассируемых каллусах и регенерированных растениях. Поэтому наличие чужеродных бактериальны« геноь и их экспрессия в трансформированных каллусах и растениях т«;-тиравали in vivo И in vitro.

Рис.1. Отбор Км-устойчивых колоний на среде с Км (80 мг/л) через 4 недели после высева на селективную среду. Регенерированные протопласты из мезофильных клеток табака были инфецированы Agrobaoterium С pGV3850:pLGV23neo. Образовавшиеся колонии, диаметром около 1 мм, высажены на среду для каллусообразо-вания с во мг/л канамицина.

г

Присутствие госледовательносри NPT11 определялось гибридизацией тотальной ДНК, выделенной из трансформированных растений с меченым Hindi n-Saii фрагментом Тп5. Во всех четырех тестированных растениях были обнаружены гибри-

дизационные сигналы и, следовательно, показано н. лчие искомой последовательности.

Было проведено тестирование для подтверждения экспре^ сии NPT11 в различных частях растения. Побеги трансформированных растений укореняли на среде, содержащей 80 мг/л КМ. Через 3 недели образовывались корни, однако на среде с Км корни образовывались значительно медленнее, чем на среде без антибиотика. Нетрансформированные побеги на среде с Км корней не образовывали.

Экспрессия бактериального гена в листьях проверялась по способности поврежденной листовой кромки образовывать каллус на среде с юомг/л Км. В отличае от контрольных, по всему срезу трансформированных листьев на среде с Км образовывался каллус. Влияние антибиотика на рост трансформированного каллуса , не столь значительно как в случае корнеобразования.

Прямое определение активности NPT11 в трансформированных каллусах и листьях осуществляли путем электрофоре-тического разделения белков растительных экстрактов в ПААГ и выявления ферментативной активности фосфорилирования антибиотика Км в присутствии 1у-1Р]кТР после переноса меченого ка-намицина ifa фосфоцеллюлозную бумагу Р81 и радиографии.Подвижность полосы ферментативной активности трансформантов соответствовала подвижности аналогичного фермента бактериального происхождения. Наличие эндогенных киняз, видимо, обеспечивает некоторый собственный уровень устойчивости растения к антибиотику.

Так как полученная рекомбинантная ТЫштмида могла

сдержать полный ген дадалинсинтазы, трансформированные кал-усы и растения тестировались на присутствие нопалина. 6 ис-ледованных растений и 15 колоний содержали нопалин, в 6 робах. результат был неоднозначным. '

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что бакте-шальные гены белков NPT11 и нопалинсинтазы перенесены и жспрессируются в двух сортах N.tabacum.

Трансформация листовых экспалантантов табака Agribaoterium с векторами бинарного и рекомбинантного типов

Описанный вариант переноса генов в растения, использующий коинтегратный вектор и систему совместной культивации агробактерий и протопластов, с последующей регенерацией трансформированных растений, занимает около 6 месяцев кропотливой работы. Поэтому в дальнейшем мы разрабатывали методы, упрощающие и ускоряющие некоторые этапы трансформационной технологии.

В ряде лабораторий были сконструированы бинарные вектора, позволяющие клонировать чужеродные гены непосредственно в трансформирующий вектор, избегая при этом стадии рекомбинации с Tl-плазмидой.В нашей работе мы воспользовались системой предложеной Bevan М.(1984).

Так как собственная частота конъюгации в E.coli для рНК2013 высока (85%), В1п19 был перенесен в штамм Agro-bacterium LBA4404 методом тройного скрещивания со штаммом E.coli НВЮ1 с плазмидой PRK2013, проводимого на нитро-

целлюлозных фильтрах с последующим отбором трансконыогантов на минимальной сред' с 50 мг/л Км. Наличие в трансконъюган-тах двух плазмид проверяли электрофоретическим разделением их в агарозном геле.

Трансформирующая способность такой векторной системы проверялась Беваном по способности кусочков стеблей И.рШт-Ъа£1па1о11а образовывать каллус на среде с Км. Мы применили этот метод на стеблях ИЛаЬасит с. Самсун и получили неоднозначный результат - редкие очаги каллуса возникали, но со временем погибали на селективной среде. В дальнейшем мы применили модифицирдванный метод трансформации кусочков листовых пластинок (дисков), впервые предложенный НогвМ еь а1. ( 1985) для рекомбинантной векторной системы.

В качестве объекта трансформации был взят асептически выращенный табак ЫЛаЬаоит с. Самсун. Листья стерильных растений нарезали на кусочки и на 5 минут погружали в ночную культуру агробактерий, росших в селективной среде. Диски промокали на фильтровальной бумаге и помещали на среду ЫС с 0.8$ агаром, ъ% сахарозой, 0.1 мг/л НУК, 0.5 мг/л БАЛ. Через 3 Дня листовые пластинки перекладывали на свежую среду того же состава с добавлением 0.5 г/л цефотаксима и 100 мг/л КМ или на среду для каллусообразования. Через 5 недель образовавшиеся побеги пересаживали на безгормональную среду для укоренения. Результары опыта показан на Рис.г.

При работе с Км в концентрации 50 мг/л, как для селекции колоний, наблюдался рост большого числа нетрансформиро-ванных побегов.

Было установлено, что оптимальное время роста в несе-

Рис.2. Листовые эксплантанты табака, обработаннае Ш4404 с В1п19, и трансформированный каллус и побеги на среда с Км (100 м /л) - а),б),на среде без антибиотика - в), необработанные агробактериями листья на среде с Км - г).

лект ных условиях - здня. При увеличении этого времени наблюдалось ухудшение образования трансформированного каллуса или образование нетрансформированных побегов.

Хорошо растущий на среде со 100 иг/л Км каллус, проверяли на способность расти к!ри больших концентрациях антибиотика: 150-, 180-, 200- и 400 мг/л КМ. При первых двух концентрациях различий в росте не наблюдалось,.в то время как на среда с гоо -, и 400 мг/л наблюдался дифференцированный рост - от полного ингибирования до нормального.

В трансформированных растениях-регенерантах экспрессия перенесенного гена в листьях определялась по способности к каллусообразованию ив среде с 100 иг/л Км. Фосфоршшрующуп активность кетп в листьях и каллусах определяли как в предыдущем случае.

Приведенная последовательность экспериментов, по нашему мнению, является наиболее удачной из-за быстроты и простоты выполняемых экспериментов. Транс^т чация листовых пластинок представляет собой ваишй метод передачи чужеродных генов в те растительнае виды, для которых не разработаны метода культуры клеток и/или не получена регенерация целых растений из отдельных клеток. Трансгенные растения, полученные этим методом в меньшей степени подвержены сомаклональной изменчивости, чем растения, регенерированные из протопластов.

По сравнению с методом совместной культивации агробак-терий с протопластами, система дисковой трансформации представляется, на первый, взгляд, скорее качественным, нежели количественным подходом. Однако, в работе НогзоЬ е1 а1.(1986) , выполненной на листовых дисках петунии исследовались ранние этапы проникновения и интеграции Т-ДНК. Ошшы определяли уже через 2 дня после заражения. Вполне разрешимым является вопрос и о подсчете эффективности при такой трансфармации. Уже через несколько дней может-быть применен биохимический тест типа определения опинов. При наличии устойчивости к антибиотику как маркера трансформации в случае очень редкого появления резистентного каллуса на дисках как в случае заражения АгаЫ<1орв1в можно считать одним трансформационным событием любой диск, где есть пролиферируицая

ткань на селективной среде . Когда трансформация более эффективна, i'.e. на каздг листе возникают очаги каллусооб-разования, которые могут перейти в сплошное кольцо на раневой поверхности диска, можно взвешивать образцы или выработать визуальные критерииь как в работе Horeoh et al. (1986).

ЭфЕективнось дисковои трансформации может быть повышена, как,было показано на томатах, путем выдерживания кусочков листьев перед заражением на слов кормящих клеток и

g

разбавлением культуры агробактерий до плотности 1 о кл/мл во избежании перерастания бактерий по кромке листа. ,

На отработанной нами системе дисковой трансформации та- -бака сравнивалась эффективность бинарных и рекомбинантных векторов. Для этого листовые пластинки заражались агробакте-риями с вектором pGV3850:pLGV23neo . При этом образовывались редкие очаги тран"Нормированного каллуса. Для более корректного сравнения необходимо было сопоставить векторные системы с одинаковы.' v ^районами, и поьтому В1шэ коныогировали в Agrobacterium с pGV3850. В этом случае такт наблюдали лишь редкие очаги Км-устойчивого каллуса,, на основании чего можно заключить, что вирулентные функции LBA4404 в нашей системе более эффективны, чем аналогичные функции pGV3850. Поэтому точное сравнение векторных систем потребовало бы значительной выборки.. ,

В работе Horsch et al.(1936), показано, что частоты трансформаций с использованием рекомбинантной и бинарной векторных систем, совпадают. В случае заражения экс-плантан-тов листьев томатов /Mccormick . et а.1.1986./ бинарный

с

- 16 -

вектор'оказался менее эффективен.чЕ1геп е\ а1.(198б) показали, что при инфецировании протопластов ЫЛаЬаоит агро-бактериями с бинарным вектором, содержащим интактную Т-ДНК, трансформанты появлялись 'чаще,' чем в случае собственной П-илазмвды. Таким образом, для получения максимал-

ьного выхода трансфэрмантов в кавдом конкретном случае необходим индивидуальный выбор системы векторов.

Увеличение каллусобразу. эй поверхности под действием электрического поля.

В трансформации дисков количество трансфор штов помимо эффективности самого переноса определяется также числом компетентных клеток, находящихся в зоне поранения. В раневую зону входят клетки, находящиеся в кромке среза листовой пластинки.

Обычна увеличение раневой поверхности достигается снятием верхнего эпидермиса листа наждачной бумагой, однако при этом существует большой риск полного разрушения тканей.

Нами был предложен способ увеличения поверхности листа, способной образовывать каллус, под действием электрического поля. Для этой цели было использовано сравнительно простое устройство на базе микрометрического винта. Кусочек листовой пластинки помещался между электродами, растояние между которыми можно было изменять вращением микровинта от о.З до 0.9 мм (нижняя граница лимитирована толщиной листа, верхняя -толщиной буферного слоя, способного удерживаться на поверхности катода силами поверхностного натяжения ). На электроды подавались прямоугольные импульсы напряжения величиной от 50 до по в и длительностью ю микросекунд. Листовые плас-

тинки, подвергнутые 10-кратному электроповреждению, помещали на среду МС «ля каллусооб' зования. Наилучшие результаты были получены при максимальном напряжении (110 в), что соответствует полю 2.8 - 3.7 кв/см. В этом случае через 3 недели поверхность образцов покрывалась обильным каллусом. Ориентировочный подсчет показ! зет, что таким методом по крайней мере в 20 раз увеличивается доступная бактериям поверхность. Однако, в дальнейшем необходимо выяснить, в какой степени такой способ поранения растительных клеток эффективен для активации вирулентного района и заражения.

*

Трансформация клубней картофеля и эксплантантов листьев хлопчатника А.гитеГас!еле 1058 С В:т19.

Мы применили разработанные на табаке подходы для трансформации таких важных сельскохозяйственных культур как картофель и хлопчатник. Хотя многие двудольные растения восприимчивы к агробактериап "й инфекции, спектр АёгоЬа<Нег1.ш1, вирулентных по отношению к данному растению может сильно, различаться. Даже в пределах одного рода для конкретного вида растений необходимо найти эффективно трансформирующий штамм.

Как показано в работе' Эргашева и'др.(1983), ягтамм ю58 вызывает опухоли на хлопчатнике О. Ыгб-и 1ит . Мы предложили использовать онкогенную Т1-плазмиду 1058 в бинарной векторной системе для заражения хлопчатника й.агЪо-геит. Мы определили тип онинов, утилизируемых этим штаммом. Оказалось, что 1058 принадлежит к октопиновнм плазмшшм, что

облегчило селекцию транснонъюгантов с В1п19 на среде с КМ уг окто1шном в качестве единственного источника азота.Трансформирующую способность штамма л<ггоЬа<^ег!ит с 1058 (В1П19). предварительно проверялась на табаке. Эффективность трасформации оказалась сравнимой с ЪВА4404 (В1п19).

В работе Ап еЬ а!.(1985) при заражении регенерированных протопластов табака агробактериями с бинарным вектором с последовательноатью пов-юти и о~хогенной Т1-плазмидой наблюдали частоту совместной трансформации генов гормоннеза-висимости после селекции на Км всего в 10-20? случаях. Мы попытались получить аналогичный результат при инфецированш дисков. Трансформированные каллусы высаживались на среду, не содержащую гормднов. Через 3 недели на некоторых каллусах появлялись побеги. Таким образом, показана принципиальная-возможность использования онкогенных !Г1-шгазмид в бинарной векторной системе применительно к дисковой трансформации. Это облегчает подбор наиболее инфекционных штаммов по отношению к данному виду растений и также не требует работы по "обезвреживанию" Т1-плазмиды. Не исключено, что часть Т-ДНК может содержаться в геноме таких растений, от которой

в некоторах случаях можно избавиться в процессе мейоза. л

В трансформации использовали семядольные листья

*На этом нтапе работы проводились совместно с лабораторией генно-клеточной- инженерной биотехнологии ( зав. лаб. проф. Абдукаримов A.A.) института биоорганической химии АН ' УаССР.

хлопчатника G.arboreum, широко используемого в практике селекционных работ. Кусс си листьев многократно надсекались и после 20-минутного контакта с згробяктериями раскладывали в чашки Петри на поверхность среди следующего состава:соли MC, О.ЭЯ глюкоза, 0.1 мг/л 2.4Д. 0.1 мг/л ПУК, 0.1 мг/л ВАП И 0.05 мг/л зеатина. врезки выдерживали на неселективной ' среде в течение нескольких дней. За это время в листовых пластинках закладывались очаги клеточной пролиферации в виде ярко-зеленых выпуклых участков с бархатистым налетом. В последующем, эксплантанты переносили на селективную среду исходного солевого и гормонального состава с добавление^ 125 мг/л Км и о.5г/л карбенициллдаа для освобождении от бакте-' рий. Пороговая доза канамиаина для клеток этого вида хлопчатника составляла 50 мг/л. Нэ ?о день роста на отрезках , листьев на селективной среде формовалась обильная мягкая быстрорастущая каллуснз <. ткьпь сытло-зеленого цвета, по внешнему виду сходная для эк'.шжштантов обработанных и необработанных агробакт-' . чми. Позднее, через 3 месяца, на эксплантантах формировались многочисленные очаги медленно рас-тцего плотного каллуса белою цвета, трансформированные клетки которого были способ ни рас-ТИ Р, присутствии 200 мг/л Км (Рис.3). Полученные ткани фепотипически отличались от ^трансформированного каЛпуса хлопчатника, а также приобретали способность расти HV«f.o;t'.¡ «ез гормонов, т.е. являлись опухолевыми.

Активность NPT11 в трансформированных каллусах хлопчатника показана на Рис.4. .

Таким образом продем-ж-.! ряу^тт трансформация океплан-

.ЯШ'!*

......

I ' % 4. Дт .

X. . *г,;Л> ■«

\У 4 «Г

Рис.Э. Образование трансформированного каллуса хлопчатника на листовых пластинах, обработанных 1058 с В1п19 на среде с Км (200 мг/л) - а), листовые пластины, необработанные агробактериями на той же Среде - б).

1 2 3 4 6 6 7 8 9 10 II 12

Г . — -

Рис.4. Определение активности датп в белковых экстрактах опухолевых каллусов, индуцированных 1058(В1дИ9 на эксплантантах семядольных листьев хлопчатника« 1 -нетрансфирмировашый каллус хлопчатника; 2-9 - трансформированный каллус хлопчатника; ю - нвтрансформи-рованный каллус табака; 11 - трансформированный каллус табака; 12 - Е.ооИ (В1л19).

о

тантов листьев хлопчатника и экспрессия бактериального гена. Поскольку регенерация хлопчатника представляет сложный процесс, для более эффективной работы с предложенной векторной системой желательно сконструировать неонкогенный вариант Ш-плазмида.

Недавно идаевк ег а1.(198б) опубликовали работу по заражению гипокотиля хлопчатника 0. sui.itт штаммом 1ВА4404 с бинарной векторной системой, где также показана

экспрессия NPT11 и получены раст^ния-транеформанты. При трансформации картофеля нами были апробированы три вышеописанных штамма агробактерий с вектором В1п19 и Ti-плазми-дами: PGV3850, pAL4404, Ю58: Агробактериями заражали срезы клубней площадью 1-2 см и толщиной 2-3 мм. После обработки Agrobaoterium кусочки высаживали на среду следующего состава: агар МС, 0.7М 2.4Л, и спустя 2 дня на ту же среду с добавлением 0.5 г/л цефотаксима и л ( 200-, 400-, 500- 800 мг/лJ. '1'олько при инфецировании клубней штаммом A tumefaci

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 XI 13

Рис.5.' Определение активности NPT11 в белковых экстрактах каллусов, индуцированных 1058 (В1п19) на кусочках клубней картофеля: 1,2 - нетрансформированный каллус картофеля; э-11 - трансформированный каллус картофеля; 12 - нетрансформированный каллус табака; 13-трансформированный каллус табака.

ens' 1058 через 8 недель был получен активно раступдай на сре-

де с 200-, 400-, и 500 мг/л Км белый плотный каллус, отличающийся Oi контрольное зеленого каллуса. В трансформированных тканях выявлена активность NPT11, что подтверждает экспрессию гена бактериального происхождения в клетках картофеля (Рис.5). Сильная экспрессия NRT11 в клоне N4, видимо, является следствиer интеграции Т-ДНК в активную регул- ' яторную зону, которую можно клонировать из библиотеки клонов ДНК, выделенной из этого каллуса.

После окончания нашей работы по трансформации картофеля появилось сообщение An et а1.(1986) о трансформации листьев картофеля геном NPT11 с помощью бинарной векторнрй системы.

ВЫВОДЫ

1.Получены штаммы агробактерий с рекомбинантной и бинарными векторными системами, способные вызывать трансформацию высших растений с передачей гена NPT11 , определяющего устойчивость к канами: тгу.

2.Показан перенос гена NPT11 в системе регенерированных протопластов и дисков табака. Продемонстрирована экспрессия гена в полученных трансгенных растениях.

3.Показана способность штамма 1058 с В1п19 осуществлять перенос генов'-в растения, с его помощью получен перенос гена NPT11 в составе бинарной векторной системы в геном картофеля и хлопчатника. Определена активность фермента в экстрактах каллусов картофеля и хлопчатника.

4.Показана возможность применения онкогенной Ti-плаз-миды в составе бинарной гэкторной системы при трансформации

- Й4

дисков. ^

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1, Захарьев Ü.M., Мурадов А.З., Смирнов О.Ю., Татпулатов А.Ш., Федорова/Макарова/ O.E., Скрябин К.Г., Баев A.A.. Создание промежуточных векторов экспрессии для растений. У Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы стендовых сообщений. М.: Наука К86, т.У, с.430

2. Кузнецова H.H., Федорова/Макарова/ O.E., Нуридканяк Ü.C., Джатаев O.A., Абдукаримов A.A., Скрябин К Садиков А. и. Трансформация листовых пластин хлопчатника/ G. ärbareum/ бинарной- векторной системой. ДАН УзССР, т.8, с.49-51

21.04,1968г.Т-03073 3.06.1968г.Зах.102б Тмр.100

UM* оперативно* полМафки W кмокитвЗБнЗЯ-

твхычх» МГИЮ МВД СССГул.ЛоО«чв»ского-7б