Трансформация растений осины (Populus tremula L. ) генами ugt и acb и излучение некоторых физиологических и биохимических параметров трансгенных растений

Чепинога, Анастасия Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансформация растений осины (Populus tremula L. ) генами ugt и acb и излучение некоторых физиологических и биохимических параметров трансгенных растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Трансформация растений осины (Populus tremula L. ) генами ugt и acb и излучение некоторых физиологических и биохимических параметров трансгенных растений"

На правах рукописи

^i&fULHsGt&s

ЧЕПИНОГА Анастасия Валерьевна

ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ ОСИНЫ (Populus trémula L.)

ГЕНАМИ ugt И acb И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 2003

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск

Научные руководители:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАН, профессор

Саляев Рюрик Константинович доктор биологических наук Рекославская Наталья Игоревна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Каранова Светлана Лаврентьевна кандидат биологических наук Донская Людмила Ивановна

Ведущее учреждение:

ИГУ, кафедра физико-химической биологии биолого-почвенного факультета, г. Иркутск

Защита состоится "4" ноября 2003 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу:

664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243, факс (3952) 510754, e-mail: matmod@sifibr.irk.ru.chepmoKa@sifibT.irk.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан "25" WM/nsSjtillWl г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

ТЩ?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

( { Актуальность темы исследования. Лесное хозяйство - перспективная область применения методов генной инженерии. Одной из основных проблем лесоводства является интенсификация процессов выращивания деревьев (Toivonen et al., 1994; Царев, Мироненко, 1997; Кулагин, Кагарманов, 1997; и др.), поэтому в настоящее время проблема управления ростом растений и поиск путей его ускорения относятся к числу наиболее важных.

Одну из систем регуляции и интеграции у целого растения представляет собой гормональная система. Процессы роста и развития в значительной мере связаны с гормональным балансом, или гормональным статусом, который складывается из содержания и соотношения различных фитогормонов. Установлено, что уровень эндогенных ауксинов и их метаболизм являются ключевым фактором органогенеза, регенерации, тропизмов, апикального доминирования, ризогенеза, дифференцировки ксилемы и др.

Известно, что существует положительная корреляция между концентрацией свободной индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и интенсивностью роста растений, плотностью сосудов и их размером, вплоть до определенного порогового уровня, выше которого ауксин оказывает ингибирующее действие. Это было установлено и для ряда древесных растений (Васильева, 1970; Федорова, 1982; Mirov, 1967; Zakrzewski, 1991; и др.). Попытки получить трансгенные растения гибридной осины, характеризующиеся повышенным содержанием свободного ауксина, путем переноса генов бактериального пути биосинтеза ИУК привели к созданию растений, имеющих аномальный фенотип, проявляющийся вследствие гиперауксиноза (Tuominen et al., 1995). Этот эффект связывают с отставанием процессов конъюгирования ауксина (его инактивации) от биосинтетических процессов, что способствовало накоплению ИУК в сверхоптимальных концентрациях (Sitbon et al., 1991; 19926).

Проводимая ранее трансформация ряда культурных растений с использованием гена ugt из кукурузы позволила получить растения с повышенным содержанием эндогенной ИУК и высокими ростовыми параметрами (Жукова и др., 1997; Рекославская и др., 1997а; 1999; и др.). Ген ugt кодирует УДФГ-трансферазу - фермент, катализирующий обратимое связывание ИУК с глюкозой с образованием лабильного копъюгата. Предполагают, что данная реакция является ключевым моментом в образовании различных конъюгированных форм ИУК, которые выполняют разнообразные функции: транспортную, защитную, инактивации гормона, запасания и его сохранения (Jackson et al., 2002). В связи с этим представлялось актуальным получить трансгенные растения осины, трансформированные геном ugt.

Использование для трансформации различных конструкций с геном acb из арабидопсиса также представляло интерес, поскольку функции белка, связывающего ацил-КоА, в растениях мало изучены, и введение дополнительной дозы гена "домашнего хозяйства" может оказать влияние на метаболизм липидов и связанные с ним процессы,- Грос. национальна* I

библиотека

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение влияния трансформации генетическими конструкциями, включающими гены ugt из кукурузы и acb из арабидопсиса, на физиологические и биохимические характеристики растений осины Populus trémula L.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Получить трансформированные растения осины, для чего было необходимо осуществить следующее:

а) подобрать условия клонирования in vitro растений осины;

б) провести трансформацию растений с помощью генетических конструкций на основе агробактериального вектора, включающих целевые гены ugt и ach, а также маркерные гены nptll и gus;

в) определить в растениях активность маркерных ферментов, а также проанализировать ДНК трансформированных растений на наличие трансгенов в геноме осины для подтверждения состоявшейся трансформации.

2. Изучить влияние трансформации данными генетическими конструкциями на содержание свободной ИУК и активность УДФГ-трансферазы. I

3. Изучить влияние трансформации на рост растений в условиях in vitro, при проведении вегетационного опыта и выращивании растений на полевой делянке.

Научная новизна работы. В работе впервые проведена трансформация древесных растений осины геном ugt кукурузы, кодируемый фермент которого контролирует ключевое звено в конъюгации свободной ИУК, регулируя соотношение свободного и связанного гормона. Для трансформации использовали также ген acb арабидопсиса; кодируемый им белок, связывающий ацил-КоА, в растениях начали изучать недавно и сведений о его функциях у растений относительно мало. Трансгенные растения имели нормальный фенотип; в них происходило повышение активности УДФГ-трансферазы, а также увеличение содержания свободной ИУК, что коррелировало с более высокими ростовыми параметрами этих растений по сравнению с нетрансформированными. Трансформация с использованием одновременно двух целевых генов позволила получить растения, имеющие более высокие ростовые параметры в условиях вегетационного опыта и в полевых условиях. Обнаружено, что использование для трансформации антисмысловой конструкции гена acb приводит к появлению растений, не способных выживать в условиях автотрофного питания. Оценено влияние различных вариантов трансформации на ростовые параметры растений, выращенных in vitro и в полевых условиях.

Практическая значимость работы. Приведенные данные показывают возможность изменения содержания свободного ауксина у древесных растений с помощью трансформации геном ugt, что коррелирует с изменением интенсивности ростовых процессов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование для трансформации генов ugt и acb (в смысловых ориентациях) позволило получить растения осины, характеризующиеся ускоренным темпом роста in vitro и в условиях открытого грунта, что может бьггь полезным при поиске путей ускорения роста растений. Сведения, полученные в настоящей работе, могут послужить основой для дальнейшей работы с древесными растениями

в целях получения форм с новыми полезными свойствами.

Публикации и апробация работы. По материалам работы опубликовано 18 работ. Результаты исследований были доложены и обсуждены на XXXVI Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 1998); конференции молодых ученых "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 1998); на П(Х) съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998); на всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999); на годичных собраниях Всероссийского общества физиологов растений (Москва, 1999; Уфа, 2001); на VII Международной молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2000), на международном симпозиуме "Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology" (Москва, 2001); на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск, 2000; 2002).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 наименований, из них 145 на иностранных языках. Работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 16 таблиц и 32 рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служили клонируемые in vitro растения осины (Populus trémula), полученные из семян. Растения выращивали на среде Мура-сиге и Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением 3% сахарозы, 0,1 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 2 мг/л глицина, 0,6 мг/л ИМК, 0,8% агара в сосудах Мажента или Фитакон около 1,5 месяцев при освещенности 2500 - 4000 люкс, температуре 26°С, 16-ти часовом световом дне. Для массового получения черенков побеги высаживали на среду с 0,5 мг/л БАП, на которой происходило интенсивное побегообразование.

Для создания условий постепенной адаптации к естественным условиям сосуды с выращенными in vitro растениями приоткрывали, постепенно увеличивая время контакта с воздушной средой. Одновременно питательная среда заменялась на воду. Через 2 месяца растения высаживали в сосуды с почвой и помещали в регулируемые условия фитотрона: освещенность 4 000 - 5 000 люкс, ночная и дневная температура соответственно 19°С и 25°С, 14-ти часовой день, поддерживая умеренное увлажнение. Летом растения переносили вначале в пленочную теплицу, а затем в условия открытого грунта на полевую делянку, находящуюся на территории института.

Для трансформации использовали следующие бактериальные штаммы:

- Agrobacterium tumefaciens 699 (обезоруженный штамм, агропиновый тип) с бинарным вектором pCNL65, содержащим маркерные гены nptll и gusA с интроном под контролем модифицированного 35S-npOMOTOpa;

- коллекция штаммов A. tumefaciens С58 с бинарным вектором рАА, в котором клонирован ген acb, любезно предоставленная Р. Паковски (Калифорнийская

сельскохозяйственная научно-исследовательская станция, США). Ген ach в разных штаммах находится в смысловой (асЬ302, асЬЗОЗ, ctcb304, acbSOl, acb502, асЬ504) или антисмысловой (асЬ402, асЬ404) ориентации, с одной или двумя дозами гена, с различной ориентацией к левой и правой границам ТДНК: рАА302 --LB—\\~3<—асЬ<—35S-35S—3' *—nptII*—35S—RB--рААЗОЗ -LB—35S-3 5S—>3'-35S-35 S—*acb—f3' -35 S—►»/>?//—>3' —II—RB--pAA304 —LB—35S-35S-*acb-+3'-3'<—acb*—35S35S--35S-+nptII-+3'~/l—RB-pAA402 -LB—\\—>acb-*3 5 S-35 S-3 5 S->nptII-*3' —RB--

pAA404 -LB—35S-35S<—acb<---*acb—*35S-35S--35S—wpitf—»3'-II—RB--

pAA501 --LB—3 5 S-35S—>асй—>3' -3'*-nptII*—35S—ll—RB--pAA502 -LB—W--31 *-acb<-35S-35S--35S—►«pf//—>T—RB--pAA504 -LB—3 5 S-3 5 S—*acb—>3 '-3' *—acb<—3 5 S-3 5 S--3' *-nptIl^-3 5S-//—RB-;

- Escherichia coli XLlBlue с клонированным в pBluescript геном ugt, кодирующим УДФГ-трансферазу из кукурузы;

- Е. coli К802 с плазмидой pRT104, содержащей gusA под 35S промотором;

Трехродительское скрещивание штаммов проводили по стандартному методу совместным инкубированием свежевыращенных штаммов A. tumefa-ciens (699 или С58) и двух штаммов Е. coli в течение 3-х суток на среде YPD без антибиотиков (Гловер, 1988). Трансконъюгант анализировали методами ПЦР и Саузерн блот гибридизации на наличие целевых генов ugt и acb, а также маркерного гена nptll. Полученный трансконъюгант использовали для трансформации растений.

Во избежание популяционного полиморфизма в эксперименте использовали микроклонально размноженное потомство растения, полученного из одного семени. Трансформацию проводили путем агроинфекции в пазушную почку. Подвергшиеся инфицированию растения выдерживали в темноте в течение трех суток. Затем их черенковали и в дальнейшем наблюдали регенерацию 1 - 3 побегов из пазушных почек. При бактериальном заражении в среду добавляли 500 - 700 мг/л карбенициллина. Примерно через 2 недели побеги черенковали для размножения. Каждый побег давал начало линии трансформированных растений, являвшихся предметом исследований. Растения, трансформированные одной агробактерией, обозначали A.t.699 или A.t.302. При обозначении растений, трансформированных трансконъюгантом трехродительского скрещивания, указывали использованные целевые гены ugt и/или acb (с указанием номера конструкции последнего).

Селекцию трансформированных растений проводили на среде, содержащей канамицин 10-50 мг/л, при этом каждые 10 дней растения переносили на свежую среду. Устойчивость к антибиотику определяли по способности черенков к корнеобразованию и росту побегов, а также отсутствию признаков хлороза. Как правило, эффективность трансформации составляла 5-10 %. Растения, прошедшие селекцию на канамицине,' клонировали in vitro и использовали для дальнейших экспериментов. Активность маркерного фермента ß-глюкуронидазы в трансформированных растениях определяли по методу Джефферсона (Jefferson et al., 1987).

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Для выделения растительной ДНК использовали стан' дартную методику с помощью ДСН и протеиназы К (Sambrook et al., 1989). Анализ плазмидной ДНК и ДНК растений осуществляли методом ГТЦР. Гибридизацию по Саузерну с помощью дот-блотов проводили по стандартному протоколу (Дрейпер, 1991). Выделение тотальной РНК из клонированных in vitro растений осины проводили согласно протоколу фирмы Promega (США). Точечный Нозерн-блоттинг проводили по стандартному методу (Дрейпер, 1991), модифицированному Плотниковым и др. (1991).

Для определения количества ИУК пользовались методом, опубликованным Рекославской и др. (1997). Активность УДФГ-трансферазы определяли по методу Ковальчик и Бандурски (Kowalczyk, Bandurski, 1991).

Биохимические эксперименты проводились не менее трех - пяти раз в трех биологических повторностях в каждом опыте. Данные морфометрических анализов представляют собой результаты одного из трех - пяти типичных неза-! висимых экспериментов, проведенных на 10-30 растениях. Варьирование ре-

зультатов в повторностях одного опыта оценивали путем вычисления средней статистической ошибки. Для сравнительной оценки средних величин использовали t-критерий Стьюдента (Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение трансконъюгантов и их анализ

Для получения трансформированных растений использовали трансконъ-югант трехродительского скрещивания A. tumefaciens 699 (pCNL65/np///, gus) или А tumefaciens С58 (рАА/лрГ//)и двух штаммов Е. coli: XLlBIue/wgi и K802/gwj. При выделении плазмидной ДНК из культуры трансконъюганта на электрофорезе наблюдали одну плазмиду, имеющую большой размер. С помощью ПЦР устанавливали присутствие генов nptll, ach, ugt в плазмидах трансконъюгантов. Полученный трансконъюгант, содержащий данные гены, использовали для трансформации.

2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности маркерных ферментов I» 2.1. Введение в культуру in vitro растений осины и трансформация

Исходно для стерилизации было взято около ста семян осины. После проращивания и подбора условий культивирования in vitro было получено два клона, которые имели морфологические отличия. Для исключения внутрипопу-ляционной изменчивости для трансформации использовали потомство одного клона.

На первых этапах введения растений осины в культуру in vitro черенки помещали на питательную среду MS с половинным составом минеральных солей и микроэлементов, где через 3-5 дней происходило образование корней. Затем растения переносили на полную среду MS. В дальнейшем, спустя не-

сколько месяцев после адаптации растений к условиям in vitro и выравнивания растительного материала, стало возможным клонирование в один этап на полной среде. При этом добавление в среду ИМК 0,6 мг/л способствовало образованию большего количества корней, что приводило к увеличению длины корневой системы растения примерно в 2 раза.

В процессе трансформации, заключающемся в инфицировании агробак-териальным вектором пазушных почек, контрольные растения также подвергали поранению стерильной иглой. При этом вследствие повреждения большая часть контрольных черенков теряла способность к регенерации. Регенерированные побеги не имели фенотипических отличий от побегов, регенерированных из почек, не подвергнутых поранению.

После трансформации клоны регенерированных растений размножали черенкованием in vitro. Полученные растения и стали предметом изучения.

2.2. Устойчивость трансформированных растений к канамицину

Селективная концентрация антибиотика была 15 мг/л канамицина. При I

этой концентрации у черенков контрольных растений через две недели наблюдали появление некрозов и дальнейшую их гибель. Черенки канамицин-устойчивых трансформированных растений оставались зелеными и были способны к образованию корней и побегов (Табл. 1). Растения с введенным геном acb в антисмысловой ориентации (ugt+acb402, ugt+acb404), напротив, приобретали более высокую чувствительность к антибиотику в сравнении с контролем, вероятно, вследствие супрессии собственного гена acb (в течение первых дней развивался сильный хлороз исходного черенка). Очевидно, более желательным будет помещение в данные кассеты генов другого гена-маркера, например, gus.

Таблица 1. Влияние канамицина 15 мг/л на рост трансформированных растений осины в течение 4-х недель

Вариант Суммарная длина корней Высота побега, мм

растения, мм

контроль 0 0

ugt 43,5 + 1,4 27,9 + 1,8

ugt+acb302 27,7 + 2,1 23,2+1,3

ugt+acb402* 0 . 0

ugt+acb404* 0 0

ugt+acb501 11,7 + 0,6 15,0 + 0,5

A.t.699 12,3 + 1,6 14,2 ±1,1

A.t.302 13,5 ±0,9 7,6 + 0,8

Примечание. *- Трансформированные растения с антисмысловой конструкцией гена

acb.

В то же время устойчивость к канамицину остальных опытных вариантов свидетельствовала о наличии в них активности неомицинфосфотрансферазы (Табл. 1).

2.3. Изучение активности маркерного фермента р-глокуронидазы

При флуориметрическом методе анализа интенсивную флуоресценцию наблюдали в образцах из всех вариантов трансформированных растений, прошедших селекцию на канамицине (оценивали визуально). Небольшое фоновое свечение отмечали в экстрактах из нетрансформированных растений и трансформированных Ал.302 (без гена £ы.у). Следует отметить что варианты опыта с антисмысловым геном асЬ также обладали высокой активностью р-глюкуронидазы, в то время как активность селективного фермента неомицинфосфотрансферазы оценить в них не удалось.

При измерении интенсивности флуоресценции на спектрофлуориметре активность Р-глюкуронидазы в трансгенных растениях превышала таковую в контрольных в 1,3-2,3 раза, при этом наиболее значимое увеличение значений активности наблюдали в листьях, что составляло 2,4 - 2,7 раза по сравнению с нетрансформированными растениями (Табл. 2).

Таблица 2. Активность р-глюкуронидазы в трансгенных растениях осины

Вариант Растительный материал Флуоресценция, усл. ед. Удельная активность, импульс/мг белка/ч

Контроль корни побеги листья 30,0+4,0 28,0+0,0 15,5+0,0 140,2+10,8 47,7+0,6 16,0+0,3

корни побеги листья 41,0+1,0 36,5+0,5 31,5+1,5 154,7+2,2 72,8+0,6 38,2+1,2

^1+асЬ302 корни побеги листья 39,5+1,5 28,0+0,0 30,5+0,5 346,5+7,6 68,8+2,0 42,1+0,4

ир+асЪ502 корни побеги листья 48,5+2,5 32,0+0,5 38,0+1,0 188,0+5,6 79,4+1,2 43,7+0,6

Таким образом, несмотря на то, что нетрансформированные растения осины проявляли активность в отношении флуоресценции, опытные растения обладали такой активностью в большей степени, поэтому полученные результаты определения активности маркерного фермента можно интерпретировать как свидетельство интеграции и экспрессии гена в трансгенных растениях.

3. Молекулярно-биологические доказательства трансформации 3.1. Доказательства интеграции гена асЬ в геном растений осины

Известно, что между генами асЬ из разных растений существует высокая степень гомологии (Расоуэку, 1996). Поэтому было проведено сравнение нук-леотидных последовательностей генов семейства асЬ различных видов растений, представленных в международной электронной базе данных ОепВапк (http://www.ncbi.nlm лнЬ.еоу/еп1ге2/диегу.Гсш?ёЬ=Ы^ео1{с1е) с использованием

пакета программ Vector NTI (InforMax, USA). Выравнивание показало высокую степень гомологии кодирующих областей гена, за исключением 3' -концевых участков. Основываясь на полученных данных можно предположить, что собственный ген acb у осины имеет высокую степень гомологии гену acb араби-допсиса, но отличия в последовательности на З'-конце гена (в районе, к которому подобран обратный праймер) должны позволить с помощью ПНР оценить присутствие гена арабидопсиса в геноме трансформированных растений осины.

При проведении ПЦР с праймерами к гену acb в образцах из трансгенных растений синтезировались фрагменты ДНК, соответствующие по размеру искомому гену (289 п.н.) (Рис. 1А, дорожки 3 - 5), которые при Саузерн-блоттинге гибридизовались с 32Р меченым зондом гена acb (Рис. 1Б, дорожки 2 - 4), что свидетельствовало о гомологии продуктов амплификации гену acb, клонированному в A. tumefaciens. В образцах ДНК из нетрансформированных растений синтез не происходил (Рис. 1А, дорожка 2) и сигналы гибридизации с меченым зондом отсутствовали (Рис. 1Б, дорожка 1).

А. Б.

Рис. 1. ПЦР ДНК трансгенных растений осины с праймерами к гену acb 289 п н. (А) и Саузерн-блот гибридизация с зондом гена acb (Б).

А. 1,8 - стандарт ДНК; 2 - ДНК нетрансформированного растения, 3 - 5 - ДНК трансгенных растений: 3 - ugt+acb302; 4 - ugt~acb404\ 5 - ugt-acb502, б - плазмидная ДНК A. tumefaciens С58 с клонированным геном асЬ302; 7 -ДНК pBL121 /асЬ302 Ecoh DHSa.

Б 1 - ДНК нетрансформированного растения, 2 - 4 - ДНК трансгенных растений: 2 -ugt~acb302; 3 - ugt < acb404\ 4 - ugt+acb502; 5 - плазмидная ДНК A. tumefaciens С58 с клонированным геном асЬ302, 6 -ДНК pBL121 /асЬ302 Exoli DHSa.

Таким образом, отличия в нуклеотидной последовательности гена acb на З'-конце и подбор праймеров к пограничным участкам позволили с помощью метода ПЦР оценить интеграцию гена acb из арабидопсиса в геном опытных вариантов растений, несмотря на высокую степень гомологии данного гена. Полученные результаты свидетельствовали об интеграции гена acb при транс- i

формации в геном растений осины.

3.2. Доказательства интеграции и экспрессии гена ugt в трансгенных растениях осины

По литературным данным известно, что между геном ugt из кукурузы и генами УДФГ-трансфераз из других растений наблюдается гомология (Szerszen et al., 1994). Но проведение сравнения имеющихся в международной электронной базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей у различных растений показало высокую дивергенцию генов УДФГ-трансфераз разных растений.

Для изучения переноса гена проводили гибридизацию по Саузерну с помощью дот-блотов (Рис. 2, Табл. 3). В образцах ДНК трансгенных растений (на Рис. 2 образец 5), и&+асЬ502 (6), и&+асЬ302 (7), и&+асЬ304 (9), и^+асЬЗОЗ (10), и$+асЬ504 (11) обнаружена высокая концентрация радиоактивно меченого зонда. Превышение уровня нетрансформированных растений по данным денситометрии составляет 1,2 - 2,4 раза, по результатам измерения радиоактивности - 2,2 - 14,1 раза. Это свидетельствует о наличии в

12 3 456 789 10 11

Рис 2. Дот-блот-гибридизация ДНК трансгенных растений осины с радиоактивно меченым зондом гена 1 - ДНК рШиевспр^и^/ (А1, Б1, В1 соответственно 0,1; 0,3 и 0,5 мкг). 2 - 11 - ДНК растений (А - 1 мкг; Б - 5 мкг; В - 10 мкг) 2 - ДНК нетрансформирован-ного растения; 3 - ДНК трансгенного растения варианта А. 1.302', 4 - Ал.б99\ 5 - б -и&+асЬ502; 7 - ир+асЬ302; 8 - и$+асЪ50Г, 9 - ир+асЬ304; 10 - ¡^1+асЬ303\ 11 - ир+асЬ504.

Таблица 3. Гибридизация по Саузерну дот-блотов тотальной ДНК трансгенных растений осины с Р меченым зондом гена

| Вариант Денситометрия по радиоавтографам ДНК-дот-блотов (10 мкг ДНК), ед. Радиоактивность, расп./мин

контроль 105,3±9,5 161,1+23,0

175,3±5,2 558,0±12,9

и&+асЬ302 122,9±5,7 1030,8±8,4

и&+асЬ303 218,7+4,3 1156,5±13,8

и$+асЬ304 •132,5±11,8 350;2±7,5

и&+асЬ501 101,4±6,0 113,2±5,4

и&+асЬ502 219,3±7,0 606,9±5,7

и$+асЬ504 249,7± 11,1 2278,0±0,0

АЛ.699 104,7±12,3 255,0±6,3

АЛ.302 94,8±22,9 170,1±10,5

рВ1т$спрг/и& 143,1±1,2 432,4±9,2

ДНК трансгенных растений фрагментов, гомологичных зонду гена В растениях, трансформированных одной агробактерией без использования гена (Ал.699 или АЛ.302), а также в варианте и$+асЬ501 не выявлено значимых отличий от нетрансформированных растений. В то же время, в растениях,

трансформированных генами ugt+acb501, обнаружена активность маркерных ферментов (Табл. 1; п. 2.3). Возможно, требуется проведение дополнительных экспериментов с ДНК этих растений.

При ПЦР с праймерами к фрагменту гена ugt 235 п.н. (с 567 по 801 п.н.) на ДНК из трансгенных растений происходил синтез данного фрагмента (Рис. 3, дорожка 2), в отличие от образцов ДНК из нетрансформированных растений, где амплификации не наблюдали (дорожка 1). Очевидно, что в ДНК осины присутствуют участки частичной гомологии к данным праймерам, поскольку как в контрольных, так и в трансгенных растениях обнаруживались неспецифичные продукты амплификации примерно в 150 п.н.

23S

Рис

1 2 3 1

3. ПЦР ДНК трансгенных растений

осины с праймерами к фрагменту гена ugt 235 п.н. 1 - ДНК нетрансформиро-ванного растения; 2 - ДНК трансгенного растения ugt, 3 - ДНК pBluescript/ugi Е coli DH5a\ 4 -стандарт ДНК.

Рис. 4. ПЦР ДНК трансгенных растений осины с праймерами к гену ugt (1800 п н). 1, 5 - ДНК маркер; 2- ДНК нетранс-формированного растения; 3 - ДНК трансгенного растения ugt\ 4 -ДНК pBluescript/Mg/ Е. coli DHSa

При амплификации полноразмерной последовательности гена ugt на ДНК трансгенных растений обнаружили синтез нескольких фрагментов, среди которых наиболее четко амплифицировался фрагмент размером около 1800 п.н., соответствующий размеру гена ugt (Рис. 4, дорожка 3). На ДНК нетрансформированных растений амплификации не наблюдали (дорожка 2). На плазмидной ДНК при условиях ПЦР, адаптированных к реакции с растительной ДНК (температура отжига праймеров 55°С, 2,5 мМ MgCl2, горячий старт), происходил синтез нескольких фрагментов, наиболее ярким среди которых был фрагмент размером 1800 п.н. (Рис. 4, дорожка 4). При изменении условий в сторону повышения специфичности реакции (отжиг праймеров при 58°С, 1,5 мМ MgCh) на плазмидной ДНК синтезировался четкий фрагмент размером 1800 п.н..

При выделении РНК из клонированных от vitro контрольных и опытных растений и проведении дот-блотгинга с зондом гена ugt была выявлена высокая интенсивность гибридизации в вариантах ugt и ugt+acb302 (Рис. 5, образцы 3; 5). По данным денситометрии радиоавтографов превышение значений по сравнению с контролем составляло 1,9 и 2,6 раза соответственно, по результатам измерения радиоактивности - 3,6 и 5 раз (Табл. 4). Это свидетельствует об экспрессии гена ugt кукурузы в трансгенных растениях осины.

Рис. 5. Дот-блот-гибридизация тотальной РНК трансгенных растений с радиоактивно меченым зондом гена А - 10 мкг, Б - 30 мкг. 1 - РНК трансгенного растения варианта АЛ.302; 2-Ал.699\ 3 - 4 - РНК нетрансформированного растения; 5 - РНК трансгенного растения варианта и&+асЬ302.

Таблица 4. Нозери-гибридизация дот-блотов РНК трансгенных растений осины с 32Р меченым зондом гена ugt

Вариант Денситометрия по радиоавтографам РНК-дот-блотов (30 мкг РНК), ед. Радиоактивность, расп./мин

контроль 87,1±17,3 114,5±12,2

ugt ■ 167,3+9,9 408,9±26,1

ugt+acb302 224,8±7,3 575,1±13,8

A.t.699 102,6±10,4 208,7±22,3

АЛ. 302 93,8±12,1 142,5+12,5

Необходимо отметить, что в растениях, трансформированных одной аг-робактерией (A.t.699 и Ал.302), наблюдали небольшое увеличение значений радиоактивности по сравнению с нетрансформированными растениями (в 1,1 раза по данным денситометрии и 1,2 {АЛ.302) и 1,8 раза (A.t.699) по радиоактивности). Это согласуется с тем, что у данных растений в течение первых месяцев после трансформации наблюдали интенсификацию ростовых процессов. Спустя полгода в условиях клонирования in vitro эти отличия от нетрансформированного контроля исчезли. Устойчивость данных растений к ка-намицину (Табл. 1), а у варианта A.t.699 также наличие активности р-глюкуронидазы (п.2.3.), позволяют сделать вывод о том, что трансформация состоялась. Это оказало влияние на метаболические процессы в данных растениях, но это воздействие с течением времени нивелировалось. Несколько повышенные значения радиоактивности по сравнению с контролем могут быть связаны с повышением уровня экспрессии собственного гена ugt. В то же время полученные результаты позволяют сделать вывод об экспрессии в растениях вариантов ugt и ugt+acb302 гена ugt кукурузы, введенного с помощью транс-конъюганта трехродительского скрещивания. При этом данные растения характеризовались существенными стабильными изменениями ростовых параметров.

Таким образом, с помощью методов ПЦР и гибридизации по Саузерну получены доказательства интеграции целевых генов ugt и acb в геном растений осины в результате трансформации. Результаты РНК-дот-блот-гибридизации свидетельствуют об экспрессии гена ugt из кукурузы в трансгенных растениях.

4. Биохимические подтверждения состоявшейся трансформации 4.1. Активность УДФГ-трансферазы в трансгенных растениях осины

Установлено, что активность УДФГ-трансферазы присуща и контрольным растениям осины, что, вероятно, связано с эффективной системой инактивации ксенобиотиков, определяющей и создающей признак неприхотливости к местам обитания этих растений (Седых и др., 2001). В то же время в трансгенных растениях обнаружена более высокая активность данного фермента (в 2,2 — 2,3 раза) по сравнению с нетрансформированными. Эта высокая активность была сосредоточена во фракции супёрнатанта, полученного после осаждения сульфатом аммония (Табл. 5). Именно в этой фракции у трансгенных растений картофеля обнаруживали УДФГ-трансферазу в предыдущих работах (Жукова и др., 1997; Рекославская и др., 1997а). Активность этого фермента была обнаружена также в созревающем эндосперме кукурузы (ЯекозЬузкауа, Вапс1иг8&, 1994).

Таблица 5. Активность УДФГ-трансферазы в растениях осины

Вариант Фракция осадка после осаждения сульфатом аммония, нмоль/мкг белка/ч Фракция супёрнатанта после осаждения сульфатом аммония, нмоль/мкг белка/ч Суммарная активность, нмоль/мкг белка/ч

контроль 3,3 19,2 22,5

ugt 1,6 44,0 45,6

ugt+acb404* 1,6 44,3 45,9

ugt+acb502 1,2 42,4 43,5

Примечание. * - Трансгенное растение с геном ach в антисмысловой ориентации.

Поскольку цифровые значения вариантов опыта были близки между собой, можно заключить, что использование при трансформации различных агро-бактериальных векторов (С58 и 699) и различных конструкций с геном acb, по всей вероятности, не оказало влияния на активность УДФГ-трансферазы.

Таким образом, в результате трансформации у растений осины происходило увеличение удельной активности УДФГ-трансферазы в два раза по сравнению с контрольными растениями. Проведенные молекулярно-генетические эксперименты на ДНК свидетельствуют о переносе гена ugt в геном трансформированных растений осины. С помощью дот-блот-гибридизации РНК установлена также экспрессия перенесенного трансгена. Это позволяет сделать вывод о том, что более высокая активность фермента в трансгенных растениях обусловлена интеграцией и экспрессией гена ugt из кукурузы.

4.2. Изучение влияния трансформации на содержание свободной ИУК в трансгенных растениях

УДФГ-трансфераза имеет тривиальное название ИУК-глюкозасинтаза, поскольку является ферментом, катализирующим обратимую реакцию связывания ауксина в конъюгат с глюкозой, и способствующим переводу гормона в лабильное неактивное состояние. При интенсивном росте ИУК высвобождается

в активном виде и может использоваться в ростовых процессах. Для оценки этого явления определяли содержание эндогенной ИУК в растениях, выращенных in vitro (Табл. 6).

Таблица 6. Содержание свободной ИУК в растениях осины

Вариант ИУК, нмоль/г сухого веса

контроль 2,01 + 0,14

ugt 5,64 + 0,61

ugt-i-acb302 9,36 + 0,59

ugt+acb404* 3,68 + 0,38

ugt+acb501 3,04 + 0,27

ugt+acb502 5,84 + 0,47

Примечание. * - Трансгенное растение с геном acb в антисмысловой ориентации

Как видим, во всех вариантах экспериментов, в которых был использован ген ugt, наблюдали значительное превышение содержания ИУК по сравнению с ^трансформированными растениями. Этот факт подтверждается данными, полученными другими авторами при создании трансгенных растений арабидопси-са, сверхэкспрессирующих ген ugt (Jackson et al., 2002), которые подтвердили, что увеличение активности УДФГ-трансферазы приводит к повышению содержания свободной ИУК в растениях. Эта зависимость также обнаруживалась в предыдущих работах по трансформации этим геном культурных растений (Рекославская и др., 1999; Рекославская и др., 2000). Наибольшее увеличение содержания свободного ауксина было характерно для опытных растений осины вариантов ugt, ugt+acb302 и ugt+acb502 (соответственно в 2,8; 4,7 и 2,9 раза), что коррелировало с более высокими ростовыми параметрами данных растений in vitro. Это согласуется с имеющимися в литературе данными о существовании для древесных растений положительной корреляции между концентрацией свободной ИУК и интенсивностью роста (Федорова, 1982; и др.).

У варианта ugt+acb404 (с геном acb в антисмысловой ориентации) также происходило увеличение содержания свободной ИУК по сравнению с нетранс-формированными растениями (в 1,8 раза), при этом их ростовые характеристики не отличались от контроля или имели более низкие значения. Одной из причин этого эффекта может являться внесение гена acb в антисмысловой ориентации и, как следствие, подавление экспрессии собственного гена acb. Очевидно, для объяснения данного факта необходимы дальнейшие исследования и более детальная проработка полученных результатов.

4.3. Влияние ИУК на рост трансгенных растений осины

Чтобы оценить влияние высокой концентрации ИУК на рост трансгенных растений, черенки растений помещали на обычную среду для клонирования (содержащую ИМК 0,6 мг/л), но с добавлением ИУК 15 мг/л. Это приводило к значительной стимуляции корнеобразования у черенков контрольных растений

(Табл. 7): в 1,5 недели наблюдали массовое образование корней, в то время как на обычной среде в это время происходили единичные случаи корнеобразова-ния (см. также Табл. 9). По-видимому, именно это способствовало более интенсивному их росту на среде с добавлением ИУК (Рис. 6). Так, в возрасте 4,5 недель увеличение средней суммарной длины корней растения на среде, содержащей ИУК 15 мг/л, составило 1,9 раза по сравнению с обычной средой для клонирования, а высоты побега - 2,1 раза.

Таблица 7. Влияние ИУК (15 мг/л), внесенной в питательную среду для клонирования, на корнеообразование черенков контрольных и трансгенных растений осины

вариант количество черенков, начавших корнеобразование, %

ИМК 0,6 мг/л ИМК 0,6 мг/л, ИУК 15 мг/л

1,5 недели 2,5 недели 1,5 недели 2,5 недели

контроль 20 30 70 80

ugt 100 ' 100 100 100

ugt+acb302 80 100 80 100

A.t.699 20 40 60 80

A.t.302 10 30 70 80

В то же время внесение ИУК не влияло на частоту корнеобразования у черенков трансформированных растений (Табл. 7). У растений варианта ugt+acb302 при этом наблюдали некоторое снижение интенсивности ростовых процессов, у растений варианта ugt, напротив, небольшое увеличение ростовых параметров (Рис. 6). Необходимо отметить, что реакция на внесение экзогенной ИУК у растений, трансформированных одной агробактерией (A.t.699 и АЛ.302), не отличалась от поведения нетрансформированных растений на этой среде.

Обнаружено, что внесение в среду ИУК 15 мг/л не вносило изменений в уровень свободного ауксина у трансгенных растений (Табл. 8). При этом в контрольных растениях происходило увеличение содержания ИУК более чем в 4 раза, что коррелировало с увеличением их ростовых параметров (Рис. 6). Вероятно, это может объясняться невосполненностью пула свободной ИУК в контрольных растениях в системе in vitro, поскольку известно, что недостаточный (сниженный) уровень гормона может приводить к задержке роста (Гуськов, 1991). Это подчеркивает преимущества трансформированных растений (например, варианта ugt), у которых вследствие трансформации происходило увеличение количества свободной ИУК, вследствие чего при обычных условиях клонирования наблюдался их быстрый рост, по показателям превышающий рост нетрансформированных растений на среде с ИУК и ИМК.

Таким образом, при клонировании трансгенные растения характеризовались повышенным содержанием свободной ИУК по сравнению с контрольными и значительным преимуществом в росте. Внесение высоких концентраций ИУК в среду приводило к 4-х кратному увеличению содержания эндогенной ИУК в

g. «0

I i30°

5 i

« 8 200 г

I 100

ИМК (0,6 мг/я)

ИМК(0/> иг/л)

fa й

пгяГ * -J ^

500 400 300 200 100 0

ко mp. ugt ugt+acb302 ИМК <0,6 мг/л), ИУК (15 мг/л)

контр ugt ugt+»cb302

t 30

в s 20

0Q 10

т I И

-- [i й

контр ugt ugt+acb302

ИМК (0/5 иг/л), ИУК (15 иг/л)

£ 40

и а> 30

« н 20

I 10

KOHIp.

ugt ugt+»cb302

Рис. 6 Корнеобразование (А) и рост побегов осины (Б) при выращивании их in vitro на питательной среде, содержащей ИМК (0,6 мг/л) и ИУК (15 мг/л). Представлена динамика морфометрических параметров с интервалом в одну неделю, начиная с возраста 1,5 недели

Таблица 8. Содержание свободной ИУК в растениях осины при выращивании их в течение 4,5 недель на питательной среде, содержащей ИМК (0,6 мг/л) и ИУК (15 мг/л)

Вариант ИУК, нмоль/г сухого веса

На среде с ИМК 0,6мг/л На среде с ИУК 15 мг/л, ИМК 0,6 мг/л

контроль 1,41 ±0,30 6,22 ±0,51

ugt 3,22 ±0,22 3,54 ± 0,64

ugt+acb302 4,33 ± 0,53 4,07 ± 0,74

нетрансформированных растениях. При этом происходило усиление регенерации стеблевых черенков этих растений (а также вариантов опыта А. 1.699 и Ал. 302) и развитие растений с более высокими ростовыми параметрами. Внесение в среду ИУК 15 мг/л не влияло на ее содержание у трансгенных растений. Поэтому можно предположить, что высокая активность привнесенного фермента УДФГ-трансферазы в трансгенных растениях способствовала стабилизации

пула свободной ИУК путем связывания экзогенного ауксина, и, согласно данным, полученным Джексоном с соавт-. (Jackson et al., 2002), приводила к изменению соотношения различных метаболических форм гормона.

5. Оценка физиологических параметров трансгенных растений 5.1. Рост трансгенных растений осины in vitro

При черенковании опытных растений отмечали больший процент черенков, способных к регенерации, по сравнению с черенками нетрансформирован-ных растений (Табл. 9). Наиболее активно процессы регенерации и роста происходили у растений варианта ugt. Трансгенные растения с геном acb в антисмысловой ориентации по этим показателям значительно уступали нетранс-формированным растениям. Растения, трансформированные одной агробакте-рией (At.699 и А. 1.302 (последние с геном acb)), как упоминалось выше, в течение первых шести месяцев после трансформации интенсивно росли и имели параметры, близкие к таковым трансгенных растений с генами ugt и acb в смысловой ориентации. Но при дальнейшем культивировании in vitro эти растения потеряли фенотипические отличия и по результатам морфометрического анализа не отличались от нетрансформированных растений (Табл. 9, 10). Таким образом, внесение одного целевого гена acb в смысловой ориентации (у растений A.t.302) не приводило к стабильному изменению ростовых параметров. Очевидно, трансформация оказала влияние на метаболические процессы в этих растениях (как и у варианта A.t.699), о чем свидетельствовал повышенный фон радиоактивности при проведении точечного Нозерн-блоттинга (Рис. 5, Табл. 4), но эти эффекты не были длительными. В то же время трансгенные растения, клонируемые in vitro в течение трех - четырех лет, сохраняли характеристики, приобретенные в результате трансформации. Очевидно, использование транс-конъюганта трехродительского скрещивания (включающего ген ugt) для трансформации явилось фактором, способствующим интенсификации ростовых процессов у трансгенных растений.

Трансгенные растения обладали более ранним корнеобразованием и побегообразованием (на 3 - 5 дней) (Табл. 9). Через одну - полторы недели после черенкования отмечали единичные случаи образования побегов и корней у контрольных черенков (17,8 и 7,6% соответственно) и массовое побего- и корнеоб-разование у черенков трансгенных растений (52,9 - 77,3% и 26,3 - 42,6% соответственно). В возрасте двух недель эта разница уменьшалась, но трансгенные растения имели значительное преимущество. Растения, трансформированные геном acb в антисмысловой ориентации, по этим показателям уступали другим опытным вариантам. У растений A.t.699 и A.t.302, как было сказано выше, наблюдали всплеск интенсивности ростовых процессов после трансформации и постепенное их выравнивание с нетрансформированными растениями при дальнейшем культивировании.

При черенковании контрольных растений было отмечено, что по мере удаления черенка от верхушки происходит уменьшение интенсивности процессов корне- и побегообразования, что отчетливо видно из Рис. 7. В случае транс-

Таблица 9. Частота корне- и побегообразования у черенков контрольных и трансгенных растений осины, клонированных in vitro в течение трех лет

вариант количество черенков, начавших рост, %

корнеообразование побегооб1 разование

1 неделя 2 недели 1 неделя 2 недели

контроль 7,6+1,9 73,2 ± 7,3 17,8 ±2,3 61,5 ±4,3

ugt 41,1 ±4,6 94,6 ± 2,8 74,8 ± 7,7 93,8 ± 3,2

ugt+acb302 26,3 ± 3,4 95,6 + 2,1 52,9 ± 8,6 66,7 ± 3,5

ugt+acb404* 15,0 ±2,0 63,3 ±6,1 21,3 ±6,5 42,4 ± 7,2

ugt+acb502 42,6 ± 4,9 85,4 ± 5,4 53,7 ± 7,4 72,1 ± 5,7

A.t.699 10,5 ± 2,6 65,3 ±4,1 23,8 ±2,1 60,9 ± 7,4

A.t.302 8,0 ±1,6 71,1 ±2,5 10,2 ±3,5 53,3 ± 5,8

Примечание. * - Трансгенное растение с геном асЪ в антисмысловой ориентации

генных растений такой закономерности не отмечали. Напротив, наблюдали тенденцию к увеличению ростовых параметров растений, регенерированных из черенков 3-го и 4-го ярусов. Очевидно, это явилось следствием изменения ауксинового баланса, поскольку для трансгенных растений отмечали повышение количества свободной ИУК в целом растении (Табл. 6), что должно приводить к ее перераспределению от верхушек растений, где происходит синтез ИУК (Полевой, Саламатова, 1991), в нижние органы. Можно предположить, что в результате базипетального транспорта ИУК происходило

коитро

Bgt+aeb302

контроль

4gt

ugt + асЬЗ 02

Г~Ч-» «рус Б

■ 2-й «ру е ЕЗЗ-й а рус В4-6 «рус |

Рис. 7. Ростовые параметры трансгенных растений осины, выращенных in vitro из черенков разных частей стебля, возраст 3 недели (1-й ярус соответствует верхушечному черенку, далее пронумерованы подверхушечные черенки). А. Высота побега растения при выращивании т vitro по ярусам. Б. Суммарная длина корней растения

обогащение нижних ярусов ауксином, который, в свою очередь, стимулировал регенерацию стеблевых черенков. Эти результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями на растениях арабидопсиса, сверхэкспрессирующих собственный ген ugt (Jackson et al., 2002). Эти авторы установили, что в трансгенных растениях по гену ugt наиболее высокое содержание свободной ИУК приходится на нижние ярусы и сравнительно низкое -на апекальные части и листовые примордии. Для нетрансформированных рас-

тений характерен противоположный этому, обычный градиент распределения свободного гормона в растении. Необходимо также отметить, что растения вариантов A.t.699 и A.t.302 в данном случае не имели отличий от нетрансфор-мированных растений.

В Табл. 10 представлены данные морфометрического анализа растений. Наибольшее преимущество в росте имели растения, для трансформации которых использовали конструкции с геном ugt: по высоте побега эти растения опережали контрольные в 3 раза и по развитию корневой системы в 5 раз. Использование для трансформации конструкций с геном acb в смысловой ориентации не усиливало какой-либо из этих морфометрических параметров и синергиче-ского эффекта использования конструкций с двумя целевыми генами, выраженного в ускоренном темпе роста, не наблюдали. Увеличение длины побега этих растений составляло 1,4 - 2,5 раза по сравнению с ^трансформированными растениями, а увеличение длины корневой системы - 1,5 - 3,6 раза. Трансформация геном acb в антисмысловой ориентации приводила к получению растений с замедленным ростом корневой системы по сравнению с нетрансформи-рованными растениями. Растения A.t.699 и A.t.302 по результатам морфометрического анализа не имели значимых отличий от нетрансформированных растений.

Таблица 10. Ростовые характеристики осины при выращивании in vitro в течение 4-х недель

Вариант Длина побега, мм Суммарная длина корней, мм

контроль 10,7 ±1,0 83,0 ± 3,2

ugt 31,3 ±1,0 468,6 ± 10,4

ugt+acb302 16,3±0,<S 121,3 ±5,6

ugt+acb303 15,0 ±3,0 147,3 ± 4,2

ugt+acb402* 7,8 ± 1,9 45,9 ± 1,6

ugt+acb404* 12,9 ± 1,0 56,1 ± 1,4

ugt+acb501 27,0 ± 1,1 299,7 ± 2,7

ugt+acb502 16,6 ±1,4 171,0 ±1,0

ugt+acb504 1QS + 1 г * ' — * 207,2 ±4,1

A.t.699 12,2 ± 1,8 92,1 ± 3,4

A.t.302 11,1 ±0,7 89,2 ± 6,7

Примечание. * - Трансгенные растения с геном acb в антисмысловой ориентации.

Таким образом, трансгенные растения с целевыми генами ugt и acb при клонировании in vitro имели фенотипические отличия от нетрансформированных растений. Наибольшая интенсивность роста была характерна для растений варианта ugt. У трансгенных растений с геном acb в смысловой ориентации также происходило увеличение ростовых параметров, но величины были менее значимыми. У растений с введенным геном acb в антисмысловой ориентации наблюдали отставание в росте по сравнению с контролем. Растения, трансформированные одной агробактерией, при клонировании постепенно утратили от-

личия от нетрансформированных растений. Приведенные данные свидетельствуют о стабильных изменениях, произошедших в результате трансформации с помощью трансконъюганта трехродительского скрещивания. Поэтому можно предположить, что решающее значение для фенотипических изменений, связанных с увеличением ростовых параметров трансгенных растений, имело использование целевого гена ugt.

5.2. Трансгенные растения в условиях фитотрона и на полевой делянке

Процесс переноса растений из условий in vitro в условия вегетационного опыта и в грунт сопровождается их резким подвяданием и гибелью вследствие слабого развития устъичного аппарата. Выживаемость трансгенных растений (варианты ugt, ugt+acb (смысловые конструкции гена acb)) была значительно выше, чем контрольных, составляя соответственно 52,6% и 31,3% (Табл. 11). При переносе в почву в условиях фитотрона преимущество в росте имели растения, при трансформации которых использовали конструкции с двумя целевыми генами (Рис. 8). При этом наблюдали полную нежизнеспособность вариантов с использованием антисмысловых конструкций acb.

Таблица 11. Выживаемость растений осины при переносе из условий т vitro в почву

вариант выживаемость, %

контроль 31,3

ugt 60,9

ugt+acb302 54,8

ugt+acb303 65,0

ugt+acb304 43,7

ugt+acb402* 0,0

ugt+acb404* 0,0

ugt+acb501 29,4

ugt+acb502 63,0

ugt+acb504 51,1

Примечание. *- Трансгенные растения с антисмысловыми конструкциями гена acb.

Рис. 8. Контрольные и трансгенные растения осины при выращивании в условиях фитотрона: нетрансформированное растение (слева); ир (в центре), и&+асЬ302 (справа).

Рост растений на полевой делянке наблюдали в течение 3-х лет (Табл. 12). Явные преимущества в росте в условиях открытого грунта, как и в условиях фитотрона, были отмечены у растений, при трансформации которых использовали конструкции с двумя целевыми генами. По высоте растения ugt+acb303 превосходили контрольные в 1,3 раза, по суммарной длине боковых побегов растения - в 2,6 раза.

Таблица 12. Ростовые характеристики трансгенных растений осины при выращивании на полевой делянке в течение 3-х лет

контроль п=2 ир п=3 асЬ302 д—1 асЬЗОЗ п=2 асЬ304 п=2 асЬ502 п=2 асЬ504 п=2

высота,см 133,0 + 2,5 160,3 + 4,3 178 177,8 ± 3,3 166,0 + 21,1 148,0 ± 31,1 126,5 + 1,5

диаметр ствола, мм 16,0 ± 0,4 23,7 ± 0,3 22 21,5 ±0,5 19,5 ±4,5 20,0 ±5,1 17,0 ± 1,0

кол-во однол. бок. побегов, шт. 12,0 ±6,0 10,7 ± 1,4 28 27,0 ± 2,0 26,0 ±1,0 26,0 ± 3,0 10,5 ±6,5

ср. длина однол. бок. побега, см 37,4 ± 7,4 60,9 + 2,4 34,9 ± 8,0 39,1 ±2,0 38,8 ± 9,0 35,6 ± 15,8 33,3 ± 0,3

суммарная длина однол. бок. побегов, см 403,5 ± 134,9 642,5 ± 75,7 978 1052,5 + 25,6 1000,0 ± 195,6 971,0 ± 518,5 350,5 ± 219,1

расст. между почками на верхних однол. бок. побегах, мм 26,1 ±2,6 31,9 + 1,2 24,5 ± 0,7 23,8 ± 0,6 21,7 ±2,2 22,5 ± 3,0 28,5 ±0,5

ср. площадь лист, пластинки, см2 16,4 ±0,4 26,0 ±3,1 13,3 ±2,0 14,1 ±3,2 15,4 ±8,6 9,8 ± 4,0 34,0 + 0,9

Примечание, п - Количество растений, произрастающих на полевой делянке.

Рис. 9. Распускание листьев у трансгенных растений осины: нетрансформированное растение (вверху слева); ир (внизу слева); и^+асЬЗОЗ (вверху справа), ир+асЬ502 (внизу справа) (23 мая 2001 г.).

Фенологические наблюдения в течение трех лет позволили установить, что растения разных вариантов опыта имели различия в наступлении фенологических фаз. Растения, трансформированные генами и&+асЬ502, характеризовались более длинным сроком вегетации (на 2-3 недели) по сравне-

нию с контрольными растениями. Распускание листьев весной у этих деревьев происходило раньше других (Рис. 9), а пожелтение и некрозы появлялись позднее.

Результаты настоящей работы могут быть использованы для дальнейших исследований по трансгенезу древесных растений, имеющих целью получение трансгенных форм, отличающихся более высокой интенсивностью роста, и послужить основой для изучения возможности целевого изменения свойств древесных растений методами генетической инженерии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведена трансформация растений осины генами ugt из кукурузы и асЬ из арабидопсиса. Трансформацию проводили методом in planta, исключающим этап культуры тканей и заключающимся во внесении агробактери-ального вектора с клонированными целевыми и маркерными генами при поранении пазушной почки растений и последующей регенерации побегов. Ранее этот метод использовался для трансформации травянистых растений. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что данный метод трансформации пригоден и для древесных растений. Результаты определения активности ферментов неомицинфосфотрансферазы и ß-глюкуронидазы подтвердили интеграцию и экспрессию маркерных генов nptll и gus в трансгенных растениях. С помощью молекулярно-генетических исследований установлена интеграция генов асЬ и ugt в геном трансгенных растений осины. Результаты РНК-дот-блот гибридизации и определения активности УДФГ-трансферазы свидетельствуют об экспрессии гена ugt в трансгенных растениях.

Трансформация с использованием трансконъюганта трехродительского скрещивания вызывала стабильные изменения морфометрических параметров трансгенных растений. С помощью конструкций с целевым геном ugt были получены трансгенные растения, характеризующиеся повышенной активностью УДФГ-трансферазы, увеличенным содержанием свободной ИУК и более высокими ростовыми параметрами в условиях in vitro, а также наибольшим диаметром ствола, длиной боковых ветвей и междоузлий при выращивании в полевых условиях. Введение при трансформации одновременно генов ugt и асЬ (в смысловой ориентации) не вызывало синергического эффекта, выраженного в увеличении ростовых параметров в условиях in vitro, но способствовало ускорению роста в условиях полевого эксперимента. При выращивании в полевых условиях эти растения по суммарной длине боковых побегов опережали нетранс-формированные в 2,5 раза. Полученные в результате трансформации антисмысловой конструкцией гена асЬ растения характеризовались замедлением ростовых процессов in vitro по сравнению с контролем, а также неспособностью их выживать в автотрофных условиях питания.

В трансгенных растениях происходило увеличение содержания свободной ИУК, что, вероятно, обусловило высокие ростовые параметры опытных растений вариантов ugt, ugt+acb302, ugt+асЬЗОЗ, ugt+acb304, ugt \-acb502. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти изменения связаны с экс-

прессией трансгена ugt в растениях осины, и согласуются с данными, полученными другими авторами.

Результаты данного исследования показали возможность регуляции роста древесных растений с помощью трансформации геном ugt. Сведения, полученные в настоящей работе, могут быть использованы при поиске новых подходов для создания быстрорастущих форм древесных растений.

Приведенные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что использование для трансформации древесных растений генетических конструкций, включающих гены ugt и acb (в смысловых ориентациях) позволило получить растения осины, характеризующиеся ускоренным темпом роста как в условиях in vitro, так и в условиях открытого грунта.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведена трансформация древесных растений генами ugt из кукурузы и acb из арабидопсиса (в смысловой и антисмысловой ориентациях).

2. Селекция на канамицине и активность Р-глюкуронидазы свидетельствовали J об интеграции и экспрессии маркерных генов в трансгенных растениях

осины.

3. С помощью молекулярно-генетических экспериментов установлена интеграция генов ugt и acb в геном растений осины в результате трансформации.

4. Результаты гибридизации РНК-дот-блотов и более высокая активность УДФГ-трансферазы в трансгенных растениях свидетельствовали об экспрессии гена ugt в трансгенных растениях.

5. Обнаружено, что трансгенные растения характеризовались увеличением содержания свободной ИУК, что обусловило отличия их. ростовых параметров от нетрансформированных растений.

6. Трансгенные растения, полученные путем введения генетической конструкции с геном ugt, имели наиболее высокую скорость роста по сравнению с контрольными растениями в условиях in vitro.

7. Трансформация генами ugt и acb в смысловой ориентации (асЬ302, асЬЗОЗ, асЬ304, асЬ502) позволила получить растения, характеризующиеся более высокими ростовыми параметрами по сравнению с нетрансформированными растениями при выращивании в условиях вегетационного опыта и в полевых условиях. '

8. У растений, подвергшихся трансформации генами ugt и acb в антисмысловой ориентации (acb402, асЬ404), происходило замедление процессов роста in vitro по сравнению с контролем и проявилась неспособность к выживанию на селективной среде и в условиях автотрофного питания.

9. Использование для трансформации древесных растений генетических конструкций, включающих гены ugt и acb, является перспективным для направленного изменения свойств древесных растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кузнецова Е.В., Жукова В.М., Чепинога A.B., Чеканова Е.Г., Корнева А.Г., Мншутина У.О., Брыкснна И.В. Перспективы использования генов, усиливающих гормональный гомеостаз, для получения высокопродуктивных видов трансгенных растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды // Тез. докл. Байкальского междунар. студ. форума "Безопасное развитие регионов". - Иркутск, 1997. - С. 264 - 266.

2. Чепинога A.B. Кузнецова Е.В., Чеканова Е.Г., Мишутина У.О., Брыксина И.В., Корнева A.B., Чепинога В.В. Получение трансгенных растений с улучшенным гормональным статусом с целью создания устойчивых трансгенных видов, отличающихся повышенной энергией роста в трудных экологических условиях // Тез. докл. Байкальского междунар. студ. форума "Безопас-

г ное развитие регионов". - Иркутск, 1997. - С. 236 - 237.

3. Чепинога A.B. Получение трансформированных растений осины (Populus trémula L.) с высокой энергией роста и повышенной устойчивостью к

I неблагоприятным воздействиям среды // Материалы XXXVI междунар. науч.

студ. конф. "Студент и научно-технический прогресс". - Новосибирск, 1998. -С. 108-109.

4. Чепинога A.B. Трансгенные тополевые для нужд целлюлозно-бумажной промышленности Восточной Сибири // Экология Байкала и Прибайкалья. Тез. докл., представленных на Всерос. науч.-практ. молодежный симпозиум. Иркутск, 1998.-С. 47-48.

5. Чепинога A.B., Высоцкая Е.Ф., Рекославская Н.И., Саляев Р.К., Паковски Р. Трансформация растений рода Populus L. генами ugt и acb II Тез. докл. междунар. конф. "Физиология растений - наука III тысячелетия". IV съезд общества физиологов растений России. - Т. 2. - М., 1999. - С. 731.

6. Рекославская Н.И., Саляев Р.К., Жукова В.М., Юрьева О.В., Мапелли С.П., Мишутина У.О., Чепинога A.B., Высоцкая Е.Ф., Корнева A.B. Генетически модифицированные растения как источники растительных ресурсов // Проблемы ботаники на рубеже XX - XXI веков: Тез. докл., представленных II (X) съезду Русского ботанического общества. - Т. 2. - СПб.: БИН РАН, 1998. -С. 376-377.

7. Рекославская Н.И., Саляев Р.К., Высоцкая Е.Ф., Гаманец JI.B., Еникеев А.Г., Чепинога A.B., Мапелли С.П., Садохина H.H., Безрукова Н.М., Будаев

' P.A., Паковски Р. Опыт получения трансгенных растений с целью регуляции

роста и продуктивности // Изучение генома и генетическая трансформация растений: Материалы Всерос. симпозиума. - Иркутск, 1999. - С. 12 - 13.

8. Чепинога A.B., Высоцкая Е.Ф., Кузнецова Е.В., Рекославская Н.И., Юрьева О.В., Саляев Р.К., Собенин A.M., Паковски Р. Совместное введение генов ugt и acb с целью ускорения роста трансгенных тополевых // Изучение генома и генетическая трансформация растений: Материалы Всерос. симпозиума. - Иркутск, 1999. - С. 32.

9. Саляев Р.К., Рекославская Н.И., Чепинога A.B., Высоцкая Е.Ф., Кузнецова Е.В., Мапелли С.П., Жукова В.М., Садохина H.H. Создание древесных растений для Байкальского региона, обладающих усиленным ростом и по-

вышенной устойчивостью к повреждающим факторам И Сибирский экологич. журнал. -1999. - № 6. - С. 605 - 611.

Ю.Чепинога А.В. Изучение физиолого-биохимических процессов в трансгенных растениях Populus tremula L. // Тез. VII Молодежной конф. ботаников в Санкт-Петербурге. - СПб., 2000. - С. 168.

11 .Чепинога А.В. Изучение влияния трансформации осины генами ugt и acb на физиологические и биохимические свойства растений // Экология Южной Сибири: Материалы Южно-Сибирской мевдунар. науч. конф. студентов и молодых ученых. - Т. 1. - Абакан, 2000. - С. 103 - 105.

12.Salyaev R.K., Chepinoga A.V., Mapelli S.P., Rekoslavskaya N.I., Vysotskaya E.F. and Pacovski R. Acceleration of growth of poplar using ugt and acb genes // 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology / Plant Physiology and Biochemistry. - 2000. - Vol. 38. - P. s99.

13.Саляев P.K., Чепинога A.B., Рекославская Н.И., Кузнецова Е.В., Высоцкая Е.Ф., Мапелли С.П., Паковски Р. Генно-инженерный способ получения трансгенных растений осины, обладающих ускоренным ростом // Материалы годичного собрания Всерос. общества физиологов растений / Вестник Башкир, ун-та.-№ 2(11). - 2001. - С. 40-42.

14.Rekoslavskaya N.I., Salyaev R.K., Kuznetsova E.V., Vysotskaya E.F., Kopytina T.V., Gamanetz L.V., Enikeev A.G., Yurieva O.V., Chepinoga A.V., Mishutina Y.O., Chekanova E.G., Korneva A.V. Transgenic plants as a tool to study IAA metabolism // Abstracts of International symposium "Signalling systems of plant cells". - Moscow, 2001. - P. 99 - 101.

15.Salyaev R.K., Chepinoga A.V., Rekoslavskaya N.I., Mapelli S., Kuznetsova E.V. Characteristics of transgenic poplar (Populus tremula L.) possessing of high growth with using the ugt and acb genes // International symposium "Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology". - Moscow-Minsk, 2001. - P. 252-253.

16.Рекославская Н.И., Саляев P.K., Высоцкая Е.Ф., Гаманец Л.В., Жукова В.М., Мапелли С.П., Мишутина У.О., Чепинога А.В., Кузнецова Е.В., Копытина Т.В., Чеканова Е.Г., Корнева А.В., Паковски Р., Еникеев А.Г., Донская Л.И., Музалевская О.В., Юрьева О.В. Использование целевых генов и их комплексов для генетической трансформации растений // Изучение генома и генетическая трансформация растений: Материалы Всерос. симпозиума (г. Иркутск). - Новосибирск: Наука, 2001. - С. 83 - 105.

17.Salyaev R.K., Rekoslavskaya N.I., Mapelli S., Korneva A.V., Stepanova E.G., Chepinoga A.V. The obtaining of transgenic agricultural plants with high productivity by means the transfer of the gene ugt from Zea mays L. and other target genes of plant origin // Abstracts of The 3rd International Iran and Russia conference "Agriculture and Narural Recourses". - Moscow, 2002. - P. 48 - 49.

18.Salyaev R.K., Rekoslavskaya N.I., Mapelli S., Korneva A.V., Stepanova E.G., Chepinoga A.V. The obtaining of transgenic agricultural plants with high productivity by means the transfer of the gene ugt from Zea mays L. and other target genes of plant origin // Proceedings of The 3 International Iran and Russia conference "Agriculture and Natural Recourses.". - Moscow, 2002. (in press).

Формат 60х84'/,6. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Гарнитура Тш1е8Ые\уКотап. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 4070.

Отпечатано с готового макета в Глазковской типографии. 664039, Иркутск, ул. Гоголя, 53. Тел. (3952) 38-78-40.

% 1 48 9 9

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чепинога, Анастасия Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Осина (Populus tremula L.) как объект исследований.

1.2. Клональное микроразмножение.

1.2.1. Этапы и факторы клонального микроразмножения.

1.2.2. Индукция развития пазушных меристем.

1.2.3. Растения рода Populus как объект для получения культуры тканей.:.

1.3. Создание трансгенных растений.

1.3.1. Методы переноса генетического материала.

1.3.1.1. Трансформация растений на основе агробактериального вектора.

1.3.1.2. Трансформация in planta.

1.3.2. Трансформации растений рода Populus.

1.4. Конъютирование ИУК.

1.4.1. Гликозильные конъюгаты ИУК.

1.4.1.1. УДФГ-трансфераза из кукурузы и ген ugt (iaglu), кодирующий этот фермент.1.

1.4.1.2. Трансформация растений геном ugt.

1.5. Гомеостаз ИУК.

1.5.1. Особенности инактивации ауксина в культуре клеток и тканей растений.

1.5.2. Гомеостаз ИУК на разных стадиях онтогенеза.

1.6. Растения с измененным ауксинсвым гомеостазом.

1.6.1. Мутантные растения арабидопсиса.

1.6.2. Трансформация растений генами бактериального пути биосинтеза ИУК.

1.7. Белки, связывающие ацил-Кофермент А.

1.7.1. Растительные белки, связывающие ацил-КоА.

2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Объекты исследований.

3.1.1. Растительный материал.

3.1.1.1. Стерилизация исходных эксплантов.

3.1.1.2. Условия клонального микроразмножения растений.

3.1.1.3. Условия выращивания растений на фитотроне и в открытом грунте.

3.1.2. Бактериальные штаммы.

3.1.2.1. Условия культивирования бактериальных штаммов.

3.1.2.2. Трехродительское скрещивание.

3.2. Трансформация растений.

3.2.1. Условные обозначения трансформированных растений.

3.3. Селекция трансформированных растений.

3.4. Выделение плазмидной ДНК.

3.5. Выделение растительной ДНК.

3.6. Выделение тотальной РНК из растений.

3.7. Полимеразная цепная реакция.

3.8. Саузерн блот гибридизация.

3.8.1. Приготовление ДНК-блотов по Саузерну.

3.8.2. Приготовление меченого зонда.

3.8.3. Гибридизация по Саузерну.

3.9. Гибридизация РНК.

3.10.Определение активности Р-глюкуронидазы.

3.11. Количественное определение содержания ИУК.

3.12. Определение активности УДФГ-трансферазы.

3.13. Статистическая обработка данных.

3.14. Использованные реактивы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Получение трансконъюгантов и их анализ.

4.2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности маркерных ферментов.

4.2.1. Введение в культуру in vitro растений осины.

4.2.1.1. Индукция корнеобразования у растений осины.

4.2.1.2. Влияние ИМК на корнеобразование осины.

4.2.1.3. Индукция развития пазушных меристем.

4.2.2. Устойчивость трансформированных растений к селективному антибиотику.

4.2.3. Изучение активности маркерного фермента р-глюкуронидазы в трансгенных растениях осины.

4.3. Молекулярно-биологические доказательства трансформации.

4.3.1. Доказательства интеграции гена acb в геном растений осины.

4.3.2. Доказательства интеграции и экспрессии гена ugt в трансгенных растениях осины.

4.4. Биохимические подтверждения состоявшейся трансформации.

4.4.1. Активность УДФГ-трансферазы в трансгенных растениях осины.

4.4.2. Изучение влияния трансформации на содержание свободной ИУК в трансгенных растениях.

4.4.3. Влияние ИУК на рост трансгенных растений осины.

4.5. Оценка физиологических параметров трансгенных растений.

4.5.1. Рост трансгенных растений осины in vitro.

4.5.2. Трансгенные растения в условиях фитотрона.

4.5.3. Рост трансгенных растений осины на полевой делянке.

4.5.4. Фенологические наблюдения за трансгенными растениями, произрастающими на полевой делянке.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансформация растений осины (Populus tremula L. ) генами ugt и acb и излучение некоторых физиологических и биохимических параметров трансгенных растений"

Генетическая инженерия растений открывает широкие возможности для изучения функционирования растительных организмов и регуляции протекающих в них биохимических и физиологических процессов. В перспективе это позволит влиять на свойства растений, изменять их характеристики или придавать новые свойства, включая самые разные направления: увеличение продуктивности, усиление резистентности к болезням, пестицидам, стрессам со стороны окружающей среды, качественные изменения состава плодов и семян и т.д. Сегодня накоплен большой опыт конструирования генетически модифицированных растений и имеются примеры успешного решения ряда задач (Кучук, 1997; Ку-рочкина, Картель, 1998; Hansen, Wright, 1999; Hammond et al., 2000; и др.).

Известно, что одну из систем регуляции и интеграции у целого растения представляет собой гормональная система (Полевой, Саламатова, 1991). Процессы роста и развития в целом, а также отдельные этапы онтогенеза и морфо-физиологические явления (регенерация, дифференцировка ксилемы, цветение, завязывание и рост плодов, образование клубней и луковиц) в значительной мере связаны с гормональным балансом, или гормональным статусом, который складывается из содержания и соотношения различных фитогормонов, ведущим из которых является ауксин (Гуськов, 1991).

Лесное хозяйство является перспективной областью применения методов генной инженерии. Одной из основных проблем лесоводства является интенсификация процессов выращивания деревьев (Sennerby-Forsse, 1986; Toivonen et al., 1994; Царев, Мироненко, 1997; Кулагин, Кагарманов, 1997; и др.). В настоящее время проблема управления ростом растений и поиск путей его ускорения относятся к числу наиболее важных.

С развитием технологии переноса генов в древесные растения, модификация баланса эндогенных фитогормонов с помощью генной инженерии является потенциальным инструментом для изучения гормональной регуляции роста, а также'для достижения желаемых модификаций свойств древесины.

ИУК является важным морфогеном в дифференциации сосудистой ткани, что было показано как в системе культуры клеток и тканей, так и в интактных растениях (Момот, Смирнова, 1978; Гамбург и др., 1990; Sachs, 1981; Jacobs, 1984; Aloni, 1987; Roberts et al., 1988; и др.). В древесных растениях полярный транспорт ИУК является критическим фактором для поддержания структуры и активности сосудистого камбия, который обусловливает вторичный рост стебля (Федорова, 1982; Меняйло, 1987). Известно также, что процесс ксилогенеза представляет собой одно из центральных по энергоемкости и аккумуляции органического вещества звеньев в онтогенезе древесного растения (Меняйло, 1987). Хотя молекулярные механизмы действия ИУК на эти процессы полностью не раскрыты, очевидно, что статус ИУК в древесных растениях является критическим фактором количества и качества образованной древесины (Tuomi-nenetal., 1995).

Ряд исследователей занимались изучением влияния фитогормонов на рост древесных растений, и была установлена прямая корреляция между интенсивностью роста и содержанием ауксина в органах древесных растений в физиологически оптимальных пределах (Mirov, 1967; Васильева, 1970; Федорова, 1982; Zakrzewski, 1991).

Рядом коллективов авторов были получены травянистые и древесные трансгенные растения, сверхэкспрессирующие гены бактериального пути биосинтеза ИУК (Пустовойтова и др., 2001; Klee et al., 1987; Sitbon et al., 1991; 1992a; 19926; Romano et al., 1993; Tuominen et al., 1995). Большинство полученных растений характеризовались высоким содержанием ИУК и аномальным фенотипом, проявляющимся вследствие гиперауксиноза. По предположению авторов, высокий уровень биосинтеза способствовал накоплению ИУК в токсических концентрациях вследствие того, что эффективность систем инактивации гормона (его конъюгирования) отставала от его биосинтеза.

Использование в данной работе для трансформации гена ugt из кукурузы представляло интерес в связи с тем, что кодируемый этим геном фермент УДФГ-трансфераза осуществляет обратимую реакцию конъюгирования ИУК с глюкозой, контролируя ключевой этап связывания свободного гормона. Интеграция в геном растений осины этого гена и его экспрессия должны приводить к изменению на определенных этапах метаболизма ауксина и оказать воздействие на пул свободной и конъюгированной ИУК, изменяя ауксиновый гомеостаз в растениях и регуляцию ростовых процессов.

Использование для трансформации различных генетических конструкций, содержащих ген acb из арабидопсиса, также представляет интерес, поскольку функции белка, связывающего ацил КоА, в растениях мало изучены, и введение дополнительной дозы гена "домашнего хозяйства" может оказать влияние на метаболизм липидов и связанные с ним процессы.

В данной работе представлены результаты трансформации растений осины генами ugt и acb. В полученных трансгенных растениях наблюдали увеличение активности УДФГ-трансферазы, содержания эндогенной ИУК, что коррелировало с более высокими ростовыми параметрами ряда вариантов опытных растений при выращивании in vitro и в полевых условиях. Представленные данные согласуются с данными других авторов по результатам получения трансгенных растений арабидопсиса, сверхэкспрессирующих собственный ген ugt (Jackson et al., 2002). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансформация с использованием данных конструкций генов приводит к изменению ауксинового статуса растений и вследствие этого изменению интенсив4 ности процессов роста.

Полученные в данной работе трансгенные растения могут являться модельными объектами для изучения влияния трансформации генами ugt и acb на древесные растения. Изучение физиологических и биохимических параметров трансформированных растений осины может способствовать пониманию роли белковых продуктов перенесенных трансгенов в метаболизме и процессах роста древесных растений, что обусловливает фундаментальное и прикладное значение работы. Полученные быстрорастущие растения осины могут использоваться для создания коротко-ротационных лесных плантаций. Накопленный опыт может послужить основой при дальнейшей работе с древесными растениями в целях получения форм с новыми полезными свойствами.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы члену-корреспонденту РАН доктору биологических наук Рюрику Константиновичу Саляеву, доктору биологических наук Наталье Игоревне Рекослав-ской за постоянное внимание, всестороннюю помощь в работе и ценные замечания при написании рукописи. Сердечная благодарность за обсуждение результатов, помощь в работе и доброжелательную атмосферу всем сотрудникам лаборатории физиологии трансгенных растений СИФИБР СО РАН.

В тексте диссертации использованы следующие сокращения: АБК - абсцизовая кислота БАП - 6-бензиламинопурин БСА - бычий сывороточный альбумин 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота ДСН - додецилсульфат натрия ИАГлю - ЬО-индол-З-ил-ацетил-р-Б-глюкоза ИАИноз - индолил-3-ацетил-мио-инозит ИМК - индолил-3-масляная кислота ИУК - индолил-3-уксусная кислота КоА - кофермент А МЭ - меркаптоэтанол НУК - а-нафтилуксусная кислота оксИУК - оксиндол-3-уксусная кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция ССР - стандартный солевой раствор УДФГ - уридин-5-дифосфат-глюкоза

УДФГ-трансфераза (ИУК-глюкозасинтаза) - УДФГ - индол-З-ил-ацетат-p-D-глюкозилтрансфераза

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АСВР - белок, связывающий ацил-Кофермент А (от англ. acyl СоА binding protein) acb - ген, кодирующий АСВР gus (uidA) - ген, кодирующий фермент р-глюкуронидазу iaaM (от indolyl acetic acid, или tmsl от tumour morphology shooty, или ген 1) -ген, кодирующий триптофан-2-монооксигеназу iaaH (tms2, или ген 2) - ген, кодирующий индолил-3-ацетамидгидролазу nptll - ген, кодирующий неомицинфосфотрансферазу ugt (iaglu) - ген, кодирующий УДФГ-трансферазу ДЭПК - диэтилпирокарбонат

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Чепинога, Анастасия Валерьевна

139 ВЫВОДЫ

2. Селекция на канамицине и активность P-глюкуронидазы свидетельствовали об интеграции и экспрессии маркерных генов в трансгенных растениях осины. .

5. Обнаружено, что трансгенные растения характеризовались увеличением содержания свободной ИУК, что обусловило отличия их ростовых параметров от нетрансформированных растений.

7. Трансформация генами ugt и acb в смысловой ориентации (асЬ302, асЬЗОЗ, асЬ304, асЬ502) позволила получить растения, характеризующиеся более высокими ростовыми параметрами по сравнению с ^трансформированными растениями при выращивании в условиях вегетационного опыта и в полевых условиях.

8. У растений, подвергшихся трансформации генами ugt и acb в антисмысловой ориентации {асЬ402, асЬ404), происходило замедление процессов роста in vitro по сравнению с контролем и проявилась неспособность к выживанию на селективной среде и в условиях автотрофного питания.

Использование для трансформации древесных растений генетических кон струкций, включающих гены ugt и acb, является перспективным для направ ленного изменения свойств древесных растений.

141

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведена трансформация растений осины генами ugt из кукурузы и acb из арабидопсиса. Трансформацию проводили методом in planta, исключающим этап культуры тканей и заключающимся во внесении агробактери-ального вектора с клонированными целевыми и маркерными генами при поранении пазушной почки растений и последующей регенерации побегов. Ранее этот метод использовался для трансформации травянистых растений. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что данный метод трансформации пригоден и для древесных растений. Результаты определения активности ферментов неомицинфосфотрансферазы и Р-глюкуронидазы подтвердили интеграцию и экспрессию маркерных генов nptll и gus в трансгенных растениях. С помощью молекулярно-генетических исследований установлена интеграция генов acb и ugt в геном трансгенных растений осины. Результаты РНК-дот-блот гибридизации и определения активности УДФГ-трансферазы свидетельствуют об экспрессии гена ugt в трансгенных растениях.

Трансформация с использованием трансконъюганта трехродительского скрещивания вызывала стабильные изменения морфометрических'параметров трансгенных растений. С помощью конструкций с целевым геном ugt были получены трансгенные растения, характеризующиеся повышенной активностью УДФГ-трансферазы, увеличенным содержанием свободной ИУК и более высокими ростовыми параметрами в условиях in vitro, а также наибольшим диаметром ствола, длиной боковых ветвей и междоузлий при выращивании в полевых условиях. Введение при трансформации одновременно генов ugt и acb (в смысловой ориентации) не вызывало синергического эффекта, выраженного в увеличении ростовых параметров в условиях in vitro, но способствовало ускорению роста в условиях полевого эксперимента. При выращивании в полевых условиях эти растения по суммарной длине боковых побегов опережали нетранс-формированные в 2,5 раза. Полученные в результате трансформации антисмысловой конструкцией гена acb растения характеризовались замедлением ростовых процессов in vitro по сравнению с контролем, а также неспособностью их выживать в автотрофных условиях питания.

В трансгенных растениях происходило увеличение содержания свободной ИУК, что, вероятно, обусловило высокие ростовые параметры опытных растений вариантов ugt, ugt+acb302, ugt+acb303, ugt+acb304, ugt+acb502. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти изменения связаны с экспрессией трансгена ugt в растениях осины, и согласуются с данными, полученными другими авторами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чепинога, Анастасия Валерьевна, Иркутск

1. Баврина Т.В., Ложникова В.Н., Махачкова И., Грянко Т.И. Трансформанты Табаков модель для изучения роли фитогормонов в цветении и плодоношении // Физиол. раст. - 1999. - Т. 46. - №. 2. - С. 226 - 230.

2. Баврина Т.В., Онджей М., Ложникова В.Н., Махачкова И., Дудка Н.Д. Крекуле Я. Трансгенные по цитокининам и ауксину растения длиннодневного табака сильвестрис {Nicotiana silvestris Spegar et Comes) // ДАН. 1996. - Т. 351.-№1.-С. 115-118.

3. Бакулин В.Т. Интродукция и селекция тополя в Сибири. Новосибирск, 1990.- 173 с.

4. Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с англ. В.И. Негрука. -М.: Агропромиздат, 1989. 280 с.

5. Бутенко Р.Г. Применение метода культуры изолированных верхушечных почек для изучения процесса роста и органогенеза растений // Физиол. раст. — 1960. Т. 7, № 6. - С. 715 - 723.

6. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологиина их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.4

7. Быченкова Э.А., Давид А. Каллусообразование й органогенез в тканях листа Populus balsamifera L., культивируемого in vitro // Физиол. раст. 1978. — Т. 25.-Вып. 2.-С. 274-282.

8. Васильева Н.П. Физиологически активные вещества тополя душистого и некоторых его гибридов // Сб. работ по лесному хозяйству ВНИИ лесоводства и механизации лесного хозяйства. М., 1970. - Вып. 52. - С. 112-119.

9. Ващук Л.Н. Лесной фонд Иркутской области: К 100-летию организации первых лесничеств и лесоустройства в Иркутской губернии). Иркутск, 1994. -112 с.

10. Высоцкий В.А., Поликарпова Ф.Я., Трушечкин В.Г. Использование 6-бензиламинопурина для размножения плодовых и ягодных культур // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. I Всесоюз. конф. М.: Наука, 1981. -С. 155-156.

11. Гамбург К.З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1976. - 272 с.

12. Гамбург К.З. Метаболизм ауксина и его действие на культуры изолированных клеток растений: Дисс. . д-ра биол. наук. Иркутск, 1980. - 333 с.

13. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука, 1990. - 243 с.

14. Гловер Д. (ред.) Клонирование ДНК. Методы (пер. с англ.). М.: Мир, 1988.-538 с.

15. Гуськов А.В. Метаболизм ауксинов в растениях и его регуляция // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Физиол. раст. 1991. - Т. 8. - 151 с.

16. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход (пер. с англ.). М.: Мир, 1985.-304 с.

17. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (ред.) Генная инженерия растений. Лабораторное руководство (пер. с англ.). -М.: Мир, 1991. 408 с. '

18. Дутина О.П. Тополь душистый (Populus suaveolens Fisch.) и перспективы введения его в культуру в условиях южной части Средней Сибири. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. - Иркутск, 1967. - 26 с.

19. Еникеев А.Г., Мишутина У.О., Паковски Р.С. Изучение функций растительных ацил-КоА связывающих белков методами генетической инженерии // Вестник Башкирского университета. 2000. - № 2(H). - С. 7 - 9.

20. Жукова В.М. Перенос и изучение экспрессии гена ugt (УДФГ-трансферазы) в растения картофеля. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. - Иркутск, 1999.-34 с.

21. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. -М.: Наука, 1983.-96 с.

22. Корзинников С.Н. Леса и лесная промышленность Иркутской области. -Иркутск: Иркут. обл. кн. изд-во, 1950. 94 с.

23. Кулагин А.Ю., Кагарманов И.Р. Рост тополей в условиях маточной плантации // Лесное хозяйство. -1997. - № 2. - С. 38.

24. Кулагин А.Ю., Кагарманов И.Р., Блонская Л.Н. Тополя в Предуралье: дендроэкологическая характеристика и использование. Уфа: Гилем, 2000. -124 с.

25. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 1973.264 с.

26. Культура тополей. Харьков, 1959. - 137 с.

27. Курочкина С.Д., Картель Н.А. Генетическая трансформация растений, процессы рекомбинации и регуляции экспрессии генов у трансгенных растений // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1998. - Т. 4. - С. 3 -12.

28. Кучук Н.В. Генетическая трансформация высших растений, опосредованная бактериями из рода Agrobacterium // Успехи современной биологии. 1997. - Т. 117. - Вып. 6. - С. 645 - 659.

29. Леса и лесное хозяйство Иркутской области / Л.Н. Ващук, Л.В. Попов, Н.М. Красный и др. / Под ред. Л.Н. Ващука. Иркутск, 1997. - 288 с.

30. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. - Т. 34.-№ 2. - С. 165 - 182.

31. Меняйло Л.Н. Гормональная регуляция ксилогенеза хвойных. Новосибирск: Наука, 1987. - 184 с.

32. Миляева Э.Л., Баврина Т.В., Гурко Н.А., Новикова Т.Б., Романов Г.А. Сравнительные характеристики трансгенных растений Табаков с разнойстепенью стерильности пыльцы // Вестник Башкирского университета. 2001. -№2. С. 20-21.

33. Момот Т.С., Смирнова A.M. Органогенез отдельных органов лиственницы сибирской и даурской (Larix sibirica and L. dahurica Turcz.) // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1978. - № 6. - С. 936 - 939.4

34. Николаевский B.C. Газоустойчивость растений. Новосибирск: Наука, 1980.-243 с.

35. Осипова Г.М. Рапс в Сибири (морфобиологические, генетические и селекционные аспекты). Новосибирск: Наука, 1998 - 168 с.

36. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988.-304 с.

37. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Ефимов В.А. Стабильность мРНК зеина кукурузы в условиях нормальной и высокой температур // Физиол. раст. — 1991. -Т. 38.-№5.-С. 981 -990.

38. Плохинский Н.А. Биометрия. 2-е изд. М.: Изд-во МГУ, 1970. - 368 с. Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции у растений. - JL: Наука. Ленингр. отд-ние, 1986. - 80 с.

39. Полевой В.В., Саламатова Т.С. Физиология роста и развития растений: Уч. пособие. JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1991. - 240 с.

40. Пустовойтова Т.Н., Баврина Т.В., Жданова Н.Е. Особенности водного режима и гормонального статуса трансгенных растений табака генами iaaM и iaaH биосинтеза ауксина // Известия Башкирского университета. 2001. - № 2. -С. 27-28.

41. Рекославская Н.И., Гамбург К.З. Метаболизм ИУК в нормальных и автономных культурах растительных тканей // Физиол. раст. 1975. - Т. 22. - № 5. -С. 1025- 1030.

42. Рекославская Н.И., Гамбург К.З., Гаманец JI.B. Влияние эндогенных и экзогенных полифенолов на метаболизм и активность ИУК в суспензионной культуре ткани табака // Физиол. раст. 1974. - Т. 21. -№ 4. - С. 721 - 727.

43. Рекославская Н.И., Жукова В.М., Чеканова Е.Г., Саляев Р.К., Мапелли С.П., Гаманец JI.B. Ауксиновый статус трансформированных растений Solanum в связи с устойчивостью к 2,4-Д и продуктивностью // Физиол. раст. 1999. - Т. 46. -№ 5. -С. 699-710.

44. Рекославская Н.И., Юрьева О.В., Шибанова JI.A., Саляев Р.К. Образование и физиологическая роль D-триптофана при прорастании у пшеницы // Физиол. раст. 19976. - Т. 44. -№ 2. - С. 227 - 234.

45. Родин А.Р., Калашникова Е.А. Методы культуры тканей: перспективы использования // Лесное хозяйство. 1995. -№3.-С. 9-11.

46. Романова Э.П., Куракова Л.И., Ермаков Ю.Г. Природные ресурсы мира. -М.: Изд-во МГУ, 1993. 304 с.

47. Седых В.Н., Бакулин В.Т., Тараканов В.В. Оценка толерантности сибирских тополей по прорастанию семян на загрязненных отходами бурения почвах // Лесоведение. 2001. - № 5. - С. 72 - 76.

48. Сергейчук С.А. Древесные растения и окружающая среда. Минск: Ураджай, 1985.-111 с.

49. Старова Н.В., Васютин О.В. Плантационное выращивание сортовых ив на кормовое и энергетическое сырье // Лесная генетика, селекция и физиология древесных растений. М., 1989. - С. 142 - 143.

50. Уткин А.И., Замолодчиков Д.Г., Честных О.В., Коровин Г.Н., Зукерт Н.В. Леса России как резервуар органического углерода биосферы // Лесоведение. -2001. -№ 5. С. 8-23.

51. Федорова А.И. Фитогормоны и рост дерева (на примере лиственницы). -Новосибирск: Наука, 1982.-248 с. 4

52. Херрингтон С., Макги Дж. (ред.) Молекулярная клиническая диагностика. Методы (пер. с англ.). М.: Мир, 1999. - 558 с.

53. Царев А.П., Мироненко С.С. Возможности энергетических плантаций тополя в Центральной лесостепи // Лесное хозяйство. 1997. - № 2. - С. 35 - 36.

54. Царев, А.П., Царева Р.П., Мироненко С.С. Отбор клонов тополя для ми-ниротационных плантаций // Отбор и его использование в улучшении лесных пород. Воронеж, 1994. - С. 28-32.

55. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. -Саратов: Слово, 2001. 256 с.

56. Яблоков А.С. Воспитание и разведение здоровой осины. М.-Л.: Гослес-бумиздат, 1949.-276 с.

57. Alho Н., Fremeau R.T., Tiedge Н., Vilcox J., Bovolin P., Brosius J., Roberts4

58. J.L., Costa E. Diazepam binding inhibitor gene expression: Localization in brain and peripheral tissues in rat // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1988. - V. 85. - P. 7018 -7022.

59. Aloni R. Differentiation of vascular tissues // Annu. Rev. Plant Physiol. -1987.-V. 38.-P. 179-204.

60. Andersen K.V., Ludvigsen S., Mandrup S., Knudsen J., Poulsen F.P. The secondary structure in solution of acyl-Coenzyme A binding protein from bovine liver using 1H nuclear magnetic resonans spectroscopy // Biochem. 1991. - V. 30 . - P. 10654-10663.

61. Andersen K.V., Poulsen F.M. Three dimensional structure of acyl-Coenzyme A binding protein from bovine liver // J. Mol. Biol. 1992. - V. 226. - P. 1131 -1141.

62. Bent A.F., Clough S.J. Agrobacterium germ-line transformation: transformation of Arabodopsis without tissue culture // Plant Mol. Biol. Manual B7. 1998. - P. 1-14.

63. Bhalerao R.P., Eklof J., Ljung K., Marchant A., Bennett M., Sandberg G. Shoot derived auxin is essential for early lateral root emergence in Arabidopsis seedings // Plant J. 2002. - V. 29. - P. 325 - 332.

64. Bialek L., Michalczuk L., Cohen J.D. Auxin biosynthesis during seed germination in Phaseolus vulgaris II Plant Physiol. 1992. - V. 100. - P. 509 - 517.

65. Boerjan W., Cervera M., Delarue M., Beeckman Т., Dewitte W., Bellini C., Caboche M., Van Onckelen H., Van Montagu M., Inze D. Superroot, a recessive mutation in Arabidopsis, conferns auxin overproduction // Plant Cell. 1995. - V. 7. -P. 1405-1419.

66. Bourque J.E. Antisense strategies for genetic manipulations in plants // Plant Sciens. 1995. - V. 103. - P. 123 - 149.

67. Bradshaw H.D., Gordon J., Gordon M.P. Wound-responsive gene espression in poplars // Woody Plant Biotechnology (ed. by M.R. Ahuja). New York, 1991. P. 265-268.

68. Brown A.P., Johnson P., Rawsthorne S., Hills M.J. Expression and properties of acyl-CoA binding protein from Brassica napus // Plant Physiol. Biochem. 1998. -V. 36.-P. 629-635.

69. Bytchenkova E.A. The study of proliferation of cambium and parenchyma of branches from trees in cultures in vitro II Biol. Plant. 1963. - V. 5. - № 4. - P. 302 -309.

70. Casimiro I., Marchant A., Bhalerao R.P., Beeckman Т., Dhooge S., Swarup R., Ghragam N., Inze D., Sandberg G., Casero P.J., Bennett M. Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation // Plant Cell. 2001. - V. 13. - P. 843 - 852.

71. Chalupa V. Control of shoot formation and production of trees from poplar callus // Biol. Plant. 1974. - V. 16. - № 4. - P. 316 - 320.

72. Chang S.S., Park S.K., Kim B.C., Kang B.J., Kim D:U., Nam H.J. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta //Plant J. 1994.-V. 5.-№4.-P. 551 -558.

73. Cheema. O.S. Somatic embryogenesis and plant regeneration from cell suspension and tissue cultures of mature Himalayan poplar (Populus ciliata) // Plant Cell Rep. 1989. - V. 8. - № 2. - P. 124 - 127.

74. Chen L., Mamey P., Taylor N.J., Brizard J.-P., Espinoza C., D'Cruz P., Huet H., Zhang S., Kochko A., Beachy R.N., Fauquet C.M. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nature biotechnology. 1998. - V. 16. - P. 1060 -1064.

75. Chisnell J.R., Bandurski R.S. Translocation of radiolabeled indole-3-acetic-acid and indole-3-acetyl-myo-inositol from kernel to shoot of Zea mays L. // Plant Physiol. 1988. - V. 86. - P. 79 - 84.

76. Chye M.-L. Arabidopsis cDNA encoding a membrane-associated protein with an acyl-CoA binding domain // Plant Mol. Biol. 1998. - V. 38. - P. 827 - 838.

77. Chye M.-L., Huang B.-Q., Zee S.Y. Isolation of a gene encoding Arabidopsis membrane-associated acyl-CoA binding protein and immunolocalization of its gene product // Plant J. 1999. - V. 18. - P. 205 - 214.

78. Chye M.-L., Li H.-Y., Yung. M.H. Single amino acid substitutions at the acyl-CoA-binding domain interrupt 14C.palmitoyl-CoA binding of ACBP2, an Arabidopsis acyl-CoA-binding protein with ankyrin repeats // Plant Mol. Biol. 2000. - V. 44. -P. 711 -721.

79. Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana II Plant J. 1998. - V. 16. - № 6. — P. 735-743.

80. Cohen J.D., Bandurski R.S. Chemistry and physiology of the bound auxins // Ann. Rev. Plant Physiol. 1982. - V. 33. - P. 403-430.

81. Coleman G.D., Ernst S.G. In vitro shoot regeneration of Populus deltoides: effect of cytokinin and genotype // Plant Cell Rep. 1989. - V. 8, № 8. - P. 459^162.

82. Confalonieri M., Balestrazzi A., Bisoffi S. Genetic transformation of Populus nigra by Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Rep. 1994. V. 13. - P. 256-261.

83. Delarue M., Prinsen E., Van Onckelen H., M. Caboche M., Bellini C. Sur2 mutations of Arabidopsis thaliana define a new locus involved in the control of auxin homeostasis // Plant J. 1998. - V. 14. - P. 603 - 611.

84. Domagalski W., Schulze A., Bandurski R.S. Isolation and characterisation of esters of indole-3-acetic acid from the liquid endosperm of the horse chestnut (Aes-cuius species) // Plant Physiol. 1987. - V. 84. - P. 1107 - 1113.

85. Douglas G.C. Formation of adventitious buds in stem internodes of Populus hybrid TT32 cultured in vitro: effects of sucrose, zeatin, IAA and ABA // J. Plant Physiol.- 1985.-V. 121.-№3.-P. 225-231.

86. Engeseth N.J., Pacovsky R.S., Newman Т., Ohlrogge J. Characterization of an Acyl-CoA-Binding protein from Arabidopsis thaliana II Arch. Biochem. Biophys. -1996.-V. 331.-P. 55-62.

87. Epstein E., Cohen J.D., Bandurski R.S. Concentration and metabolic turnover of indoles in germinating kernels of Zea mays L. // Plant Physiol. 1980. - V. 65. -P. 415-421.

88. Ernst S.G., Coleman G.D, The transition between shoot regeneration competence and callus determination in internodal stem explants of Populus deltoides II Woody plant Biotechnology (ed. by M.R. Ahuja). Plenum Press New York, 1991. -P. 23 - 29.

89. Feldmann K.A., Marks M.D. Agrobacterium-mQdizted transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non tissue culture aproach // Mol. G. Genet. 1987. - V. 208. - P. 1 - 9.

90. Fladung M. Gene stability in transgenic aspen (Populus). 1. Flanking DNA sequences and T-DNA structure // Mol. G. Genet. 1999. - V. 260. - P. 574 - 581.

91. Fladung M., Ahyja M.R. Excision of the maize transposable alement Ac in periclinal chimeric leaves of 35S-Ac-rolC transgenic aspen-Populus // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 33. - P. 1097 - 1103.

92. Frary A., Hamilton C.M. Efficiency and stability of high molecular meight DNA transformation: an analysis in tomato // Transgenic Res. 2001. - V. 10. - P. 121-132.

93. Gamburg K.Z. Interrelations between the uptake and metabolism of auxin and growth of plant tissue cultures // Physiology and biochemistry of auxins in plants. -Praha: Academia, 1988. P. 33 - 44.

94. Gaudin V., Vrain Т., Jouanin L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants // Plant Physiol. Biochem. 1994. - V. 32. - P. 11 - 29.

95. Gelvin S.B. Multigene plant transformation: More is better! // Nature biotechnology. 1998. - V. 16.-P. 1009-1010.

96. Gelvin S.B., Liu Ch.-N. Genetic manipulation of Agrobacterium tumefaciens strains to improve transformation of recalcitrant plant species // Plant Mol. Biol. Manual. 1994. - B4. - P. 1 - 13.

97. Grunwald C., Deutsch F., Eckstein D. Wood formation on rolC transgenic aspen trees // Trees. 2000. - V. 14. - P. 297 - 304.

98. Hammond J., McGarvey P., Yusibov V. Biotechnology: new products and applications. Berlin: Springer Verlag, 2000. - P. 196.

99. Hansen G., Wright M.S. Recent advances in the transformation of plants // Trends in plant science. 1999. - V. 4 (6). - P 226 - 231.

100. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., Grima-Pattenati J. Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase: Identification of new sites of promoter activity in transgenic poplar//Plant Physiol.-1997.-V. 113.-P.321 -325.

101. Hills M.J., Dann R., Lydliate D., Sharpe A. Molecular cloning of a cDNA from Brassica napus L. for a homologue of acyl-CoA-binding protein // Plant Mol. Biol. — 1994.-V. 25.-P. 917-920.

102. Jacobs W.P. Functions of hormone at tissue level of organization // TK Scott, ed, Hormonal regulation of development. II. Encyclopedia of Plant Physiology, New Series. V. 10. - Berlin: Springer Verlag, 1984. - P. 149 - 171.

103. Jackson R.G., Lim E.K., Li Y., Kowalczyk M, Sandberg G., Hoggett J., Ash-ford D.A., Bowles D.J. Identification and biochemical characterisation of an Arabidopsis indole-3-acetic acid glucosyltransferase // J. Biol. Chem 2001 - V. 276. - P. 4350-4356.

104. Jefferson R.A., Kavanagh T.A. Bevan M.W. GUS fusions: p-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants Л EMBO J. 1987. - V. 6. -№ 13. - P. 3901 -3907.

105. Karlin-Neumann G., Brusslan J., Tobin E. Phytochrome control of the tms2 gene in transgenic Arabidopsis: a strategy for selecting mutants in the signal transduction pathway // Plant Cell. 1991. - V. 3. - P. 573 - 582.

106. Keith C.S., Hoang D.O., Barret B.M., Feigelman В., Nelson M.C., Thai H., Baydorfer C. Partial sequence analysis of 130 randomy selected maize cDNA clones //Plant Physiol.-1993.-V. 101. P. 329 - 332.

107. Klee H.J., Horsch R.B., Hinchee M.A., Hein M.B., Hoffnam N.L. The effects of overproduction of two Agrobacterium tumefaciens T-DNA auxin biosynthetic gene products in transgenic petunia plants // Genes Dev. 1987. - V. 1. - P. 86 - 96.

108. Klopfenstein N.B., Thornburg R.W., McNabb H.S., Hall R.B., Hart E.R., Chun Y.W., Kernan A., Shi N.-Q. Transformation of Populus from system development to field plantings // Woody Plant Biotechnology (ed. by M.R. Ahuja). - New York, 1991.-P. 357-358.

109. Knudsen J. Acyl-CoA-binding protein (ACBP) and its relation to fatty acid-binding protein (FABP): An overview // Molec. Cell. Biochem. 1990. - V. 98. - P. 217-223.

110. Knudsen J., Mandrup S., Rasmussen J.T., Andreasen P.H., Poulsen F., Kris-tiansen K. The function of acyl-CoA-binding protein (ACBP)/diazepam binding inhibitor (DBI) // Molec. Cell. Biochem. 1993. - V. 123. - P. 129 - 138.

111. Kolmer M., Ross C., Tirronen M., Myohanen S., Alho H. Tissue-specific expression of the diazepam-binding inhibitor in Drosophila melanogaster: Cloning, structure and localization of the gene // Molec. Cell. Biol. 1994. - V. 14. - P. 6983 -6995.

112. Kowalczyk S., Bandurski R.S. Enzymic synthesis of l-o-(indol-3-yl acetyl) p-D-glucose. Purification of the enzyme from Zea mays, and preperation of antibodies to the enzyme // Biochem. J. 1991. - V. 279. - № 3. - P. 509 - 514.

113. Kowalczyk M, Sandberg G. Quantitative analysis of indole-3-acetic acid metabolites in Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 2001 - V. 127. - P. 1845 - 1853,

114. Kragelund B.B., Vilbour К., Madsen J.C., Knudsen J., Poulsen F.M. Three-dimensional structure of the complex between acyl-CoA binding protein and palmi-toyl-Coenzyme A // J. Mol. Biol. 1993. - V. 230. - P. 1260 - 1277.

115. Krasny M.E., Vogt K.A., Zasada J.C. Establishment of four Salicaceae species on river bars on interior Alaska // Holarctic ecology. 1988. - V. 11. - P. 210 - 219.

116. Magnus V., Nigovic В., Hangarter R.P. Good N.E. N-(indole-3-ylacetyl)amino acids as sources of auxin in plant tissue culture // Plant Growth Reg. 1992. - V. 11. -P. 19-28.

117. Mandrup S., Hummel R., Ravn S., Jensen G., Andreasen P.H., Gregersen N., Knudsen J., Kristiansen K. Acyl-CoA-binding protein/diazepam binding inhibitor gene and pseudogenes // J. Mol. Biol. 1992. - V. 228. - P. .1011 - 1022.

118. Marquardt H., Todaro G., Shoyab M. Complete amino acid sequences of bovine and human endozepines // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 9727 - 9731,

119. McCown B.H., McCabe D.E., Russell D.R., Robison D.J., Barton<K.A., Raffa K.F. Stable transformation of Populus and incorporation of pest resistance by electric discharge particle acceleration // Plant Cell Rep. 1991. - V. 19. - № 10. - P. 590 -594.

120. Michalczuk L., Ribnicky D.M., Cooke T.J., Cohen J.D. Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures // Plant Physiol. 1992. - V. 100.-P. 1346-1353.

121. Michalczuk L., Bandurski R. Enzymic synthesis of l-O-indol-3-ylacetyl-p-D-glucose and indol-2-ylacetyl-myo-inositol // Biochem. J. 1982. - V. 207. - P. 273 -281.

122. Mikkelsen J., Knudsen J. Acyl-KoA-binding protein from cow. Binding char-actreistics and cellular and tissue distribution // Biochem. J. 1987. - V. 248. - P. 709-714.

123. Mirov N.T. The Genus Pinus. N.Y., 1967. - 547 p.

124. Mocchetti I., Einstein R., Brosius J. Putative diazepam binding inhibitor peptide: cDNA clones from rat // Ргос/ Natl. Acad. Sci. (USA). 1986. - V. 83. - P. 7221 -7225.

125. Mudd J.B. Phospholipid biosynthesis // The biochemistry of plants / Ed. of P.K. Stumpf, E.E. Conn. New York: Academic Press, 1980. - V. 4. - P. 250 - 282.

126. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. - № 2. - P. 473 - 497.

127. Mysore K.S., Kumar C.T.R., Gelvin S.B. Arabidopsis ecotypes and mutants that are recalcitrant to Agrobacterium root transformation are susceptile to germ-line transformation // Plant J. 2000. - V. 21. - № 1. - P. 9 - 16.

128. Nikawa J., Tanabe Т., Ogiwara H., Shiba Т., Numa S. Inhibitory effects of long-chain acyl-Coenzyme A analogues on rat liver acetyl-Coenzyme A carboxylase // FEBS Lett. 1979. - V. 102. - P. 223 - 226.

129. Normanly J. Auxin metabolism // Physiol. Plant. 1997. - V. 100. - P. 431442.

130. Nowacki J., Bandurski R.S. Myo-inositol of indole-3-acetic acid as seed auxin precursors of Zea mays L. // Plant Physiol. 1980. - V. 65. - P. 422 - 427.

131. Ostin A., Kowalczyr M., Bhalerao R.P., Sandberg G. Metabolism of indole-3-acetic in Arabidopsis II Plant Physiol. 1998. - V. 118. - P. 285 - 296.

132. Ownes G., Sinha A., Sikela J., Hahn W. Sequence and expression of the murine diazepam binding inhibitor//Mol. Brain Res. 1989. - V. 6. - P. 101 - 108.

133. Pacovsky R.S. Arabidopsis thaliana acil-CoA binding protein: structure, function, genetics // A dissertation doctor of philosophy. Michigan State Univ. - 1996. -164 p.

134. Papadoupoulos V., Berkovich A., Krueger K.E. The role of diazepam binding inhibitor and its processing products at mitochondrial benzodiazepine receptors: regulation of steroid biosynthesis // Neuropharmacol. 1991. -V. 30 . - P. 1417 -1423.

135. Park J.G., Son S.H. In vitro shoot regeneration from leaf mesophyll protoplasts of hybrid poplar (Populus nigra x P. maximowiczii) // Plant Cell Rep. 1992. — V. 11.-P.2-6.

136. Pawlowski K., Kunze R., De Vries S., Bisseling T. Isolation of total, poly(A) and polysomal RNA from plant tissues // Plant Mol. Biol. Manual. 1994. - D5. - P. 1-13.

137. Poirier Y., Ventre G., Nawrath C. High-frequency linkage of co-expressing T-DNA in transgenic Arabidopsis thaliana transformed by vacuum-infiltration of Agro-bacterium tumefaciens II Theor. Ap. Genet. 2000. - V. 100. - P. 487 - 493.

138. Rasmussen J.T., Borchers Т., Knudsen J. Comparison of the binding affinities of acyl-CoA-binding protein (ACBP) and fatty acid dinding protein (FABP) for long-chain acyl-CoA esters // Biochem. J. 1990. - V. 265. - P. 849 - 855.

139. Rasmussen J.T., Rosendahl J., Knudsen J. Interactions of Acyl-CoA binding protein (ACBP) on processes for which asyl-CoA is a substrate, pruduct or inhibitor // Biochem. J. 1993. - V. 292. - P. 907 - 913.

140. Reddy A.S., Ranganathan В., Hailser R.M., Swize M.A. A cDNA encoding acyl-CoA-binding proteins from cotton // Plant Physiol. 1996. - V. 110: P. 2.

141. Rekoslavskaya N.I., Bandurski R.S. Indol as precursor of indol-3-acetic acid in Zea mays II Phytochemistry. 1994. - V. 35. - № 4. - P.905.

142. Rekoslavskaya N.I., Gamanezt L.V., Bryksina I.V., Mapelli S., Salyaev R.K. Obtaining transgenic tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) and potato (Solanum tuberosum L.) by transfer of the ugt gene from corn // TGC Report. 1998. - V. 48.

143. Ribnicky D.M., Cohen J.D., Hu W.-S., Cooke T.J. An auxin surge following fertilization in carrots: a mechanism for regulating plant totipotency // Planta. 2002. -214(4).-P. 505-509.

144. Riemenschneider D.E., Haissig B.E. Mediated by Agrobacterium tumefaciens C58: a summary of recent research // Woody Plant Biotechnology (ed. by M.R. Ahuja). New York, 1991. P. 247 - 263.

145. Roberts L.W., Gahan P.B., Aloni R. Vascular differentiation and plant growth regulators. Berlin: Springer Verlag, 1988.

146. Romano C.P., Cooper M.L., Klee H.J. Uncoupling auxin and ethylene effects in transgenic tobacco and Arabidopsis plants // Plant Cell. 1993. - V. 5. - P. 181 -189.

147. Rose T.M., Schultz E.R., Todaro G.J. Molecular cloning of the gene for the yeast homolog (ACB) of the diazepam binding inhibitor (endozepine) acyl-CoA binding protein//Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1992. - V. 89. - P. 11287 - 11291.

148. Rosendahl J., Ertbjerg P., Knudsen J. Characterization of ligand binding to acyl-CoA-binding protein // Biochem. J. 1993. - V. 290 . - P. 321 - 326.

149. Rutledge C.B., Douglas G.C. Culture of meristem tips and micropropagation of 12 commercial clones of poplar in vitro II Physiol. Plant. 1988. - V. 72. - № 2. - P. 367-373.

150. Sambrook J., E.F. Fritsch, T. Maniatis Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, 1989.

151. Schmit F., Oakeley E.J., Jost J.P. Antibiotics induce genome-wide hypermeth-ylation in cultured Nicotiana tabacum plants // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P. 1534- 1540.

152. Sennerby-Forsse L. Handbook for energy forestry. Sectoin for energy forestry; Department of ecology and enviromental research. Swedich University of Agricultural Sciences. UPsala, 1986. - 29 p.

153. Siren G., Sennerby-Forsse L., Ledin S., Energy plantations schort rotation forestry in Sweden // Boimass-regenerable energy. - Colchester. Wiley end Sons. 1987.-P. 119-143.

154. Sitbon F., Sundberg В., Olsson O., Sundberg G. Free and conjugated indoleacetic acid (IAA) contents in transgenic tobacco plants expressing the iaaM and iaaH4

155. A biosythesis genes from Agrobacterium tumefaciens II Plant Physiol. 1991. - V. 95.-P. 480-485.

156. Slovin J.P. Phytotoxic conjugates of indole-3-acetic acid. Potential agents for biochemical selection of mutants in conjugate hydrolisis // Plant Growth Regul. -1997. -V. 21.-P. 215 -221.

157. Snyder M.J., Feyereisen R. A diazepam-dinding inhibitor (DBI) homolog from the tobacco tornworm Manduca sexta II Mol. Cell. Endocrinol. 1993. - V. 94. - R1 -R4.

158. Szerszen J.B., Szczyglowski K., Bandurski R.S. iaglu, a gene from Zea mays involved in conjugation of growth hormone indole-3-acetic acid // Science. 1994. -V.265.-P. 1699-1701.

159. Tague B.W. Germ-line transformation of Arabidopsis lasiocarpa II Transgenic Research. 2001. - V. 10. - № 3. - P. 259 - 267.

160. Tam Y.Y., Epstein E., Normanly J. Characterisation of auxin conjugates in4

161. Arabidopsis. Low steady-state levels of indole-3-acetyl apartate, indole-3-acetyl-glutamate, and indole-3-acetyl-glucose // Plant Physiol. 2000. - V. 123. - P. 589 -595.

162. Taylor D.C., Weber N., Barton D.L., Underbill E.W., Hogge L.R., Weselake R.J., Pomeroy M.K. Triacylglycerol bioassembly in microspore-derived embryos of Brassica napus L. cv Reston // Plant Physiol. 1991. - V. 97: - P. 65 - 79.

163. Todaro G.J., Rose T.M., Shoyab M. Human DBI (endozepine): relationship to a homologous membrane associated protein (MA-DBI) // Neuropharmacol. 1991. — V. 30.-P. 1373-1380.

164. Topfer R., Marzeit V., Gronenborn В., Schell Jozef, Steinbiss H.-H. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions // Nucleic Acids Reserch. -1987.-V. 15.-№ 14.-P. 5890.

165. Tsai C.-J., Podila G.K., Chiang V.L. Agrobacterium-mediated transformation of quaking aspen (Populus tremuloides) and regeneration of transgenic plants // Plant Cell Rep. 1994. - V. 14. - P. 94 - 97.

166. Tsai C.-J., Popko J.L., Mielke M.R., Hu W.-J., Podila G.K., Chiang W.L. Sub-bression of O-methyltransferase gene by homologous sense transgene in quaking aspen causes red-brown wood phenotypes // Plant Physiol. 1998. 117. - P. 101 - 112.

167. Tzfira Т., Jensen C.S., Vainstein A., Altman A. Transformation and regeneration of transgenic aspen plants, via shoot formation from stem explants // Physiologia Plant. 1997. - V. 99. - P. 554 - 561.

168. Van de Loo F.J., Turner S., Somerville C. Expressed sequence tags from developing castor seeds // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1141 - 1150.

169. Webb N.R., Rose T.M., Malik N., Marquardt H., Shoyab M., Todaro G.J. Bovine and human cDNA sequences encoding a putative benzodiazepine recepter ligand //DNA. 1987. - V. 6. - P. 71 - 79.

170. Winton L.L. Plantlets from aspen tissue cultures // Science. 1968. - V. 160 — №14.-P. 1234-1235.

171. Winton L.L. Shoot and tree production from aspen tissue cultures // Am. J. Bot. 1970. - V. 57. - № 8.-P. 904 - 909.

172. Wolter K.E. Root and shoot initiation in aspen callus cultures // Nature. — 1968. V. 219. - № 3. - P. 509 - 510.

173. Yangibashi K., Ohno Y., Kawamura M., Hall P.F. The regulation of interacel-lular transport of cholesterol in bovine adrenal cells: Purification of a novel protein // Endocrinol. 1988. - V. 123. - P. 2075 - 2082.

174. Yamashita A., Watanabe M., Tonegawa Т., Sugiura Т., Waku K. Acyl-CoA binding and acylation of UDP-glucuronosyltransferace isoforms of rat liver: their effect on enzyme activity//Biochem. J.-1995. V. 312. - P. 301 - 308.

175. Ye G.-N., Stone D., Pang S.-Z., Creely W., Gonzalez K., Hinchee M. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation // The Plant J. 1999. - V. 19. - № 3. - P. 249 - 257.

176. Yisraeli J., Szyf M. Gene Methylation Patterns and Expression // DNA Meth-ylation. Biochemistry and Biological Significance (ed. by Ah. Razin et al.). Berlin etc.: Springer, 1984. 392 p.

177. Zakrzewski J. Hormonal control of cambial activity and vessel diffrentiation in Quercus robur I I Physiol. Plant. 1991. - V. 57. - P. 537 - 542.

Информация о работе

Чепинога, Анастасия Валерьевна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2003
ВАК 03.00.12

Диссертация

Трансформация растений осины (Populus tremula L. ) генами ugt и acb и излучение некоторых физиологических и биохимических параметров трансгенных растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы